CN110582293A - 合成因子组合物及使用方法 - Google Patents

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伊格纳西奥·莫拉加·冈萨雷斯
凯南·克里斯多夫·加西亚
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Abstract

本公开提供了工程化合成因子及其使用方法。

Description

合成因子组合物及使用方法
交叉引用
本申请要求2017年3月31日提交的美国临时专利申请第62/479,993号的权益，该临时专利申请通过引用整体并入本文。
背景技术
对细胞，特别是免疫细胞进行操纵，以分化、发展特化功能并在数量上扩增，具有重要的临床意义。许多影响这些活性的蛋白因子是本领域已知的，尤其包括细胞因子和趋化因子。然而，这些信号传导分子对未被靶向用于操纵的细胞也具有多效性，并因此需要在靶向细胞群中选择性激活信号传导的方法。
细胞因子、趋化因子、生长因子激动剂等通过使JAK/STAT；RTK连接的；或死亡结构域(TNF超家族)受体多聚化，例如生成同源或异源二聚体或高级寡聚体以通过细胞内反式磷酸化引发信号传导而激活所述受体。多聚体(例如二聚体或三聚体)内特异性受体链的特性决定了信号传导和功能响应。在细胞因子的情况下，它们充当双特异性配体，以通过与两个受体细胞外结构域中的每一个形成特异性接触来指定哪些受体包括在二聚体中，从而起到桥接或交联二聚体信号传导复合物的作用。细胞因子受体二聚化导致细胞内JAK/STAT信号传导途径的激活，该途径由四种Janus激酶(JAK1-3，TYK2)和七种信号转导因子及转录激活因子(STAT1-6)蛋白组成。
虽然配体对其受体的细胞外结构域具有特异性，但JAK/TYK/STAT信号传导模块在内源性受体信号传导复合物中以多种组合存在，并因此能够进行广泛的串扰(cross-talk)。RTK受体(诸如EGF、VEGF等)的配体也通过受体二聚化迫使信号传导，尽管分子机制可能与细胞因子截然不同。在两种情况下：JAK/STAT细胞因子和RTK配体，它们的作用是诱导其特异性受体亚基定位到二聚体中，使得细胞内激酶结构域处于能够使激酶和受体细胞内结构域两者反式磷酸化的取向和接近度。这些酪氨酸激酶的序列要求(即底物特异性)可以是相当简并的，从而提高了这些酶可以被替代性受体二聚化配体重定向，以使除了通常在自然界中与它们一起呈现的受体底物以外的受体底物磷酸化的可能性。
鉴于配体决定受体二聚体的组成，以及JAK/TYK和RTK酶的细胞内激酶简并性，自然界中存在的细胞因子和生长因子受体二聚体配对的数量仅占系统理论上允许的有信号传导能力的受体配对总数的一小部分。例如，人类基因组编码大约四十种不同的JAK/STAT细胞因子受体。原则上，可以产生大约1600个独特的同源和异源二聚体细胞因子受体对，具有通过不同的JAK/TYK/STAT组合进行信号传导的潜力。然而，人类基因组编码不到50种不同的细胞因子配体，将细胞因子受体二聚体的范围限制为可由天然配体组装的那些细胞因子受体二聚体。可以对RTK受体和配体家族进行类似论证。此外，鉴于已经证实死亡受体能够作为二聚体或三聚体进行信号传导，这个概念也可以扩展到这个家族。
选择性激活目标信号传导途径的能力是非常令人感兴趣的。本发明提供了用于该目的的组合物和方法。
发明内容
提供了工程化的合成信号分子，本文称为“合成因子(synthekine)”。合成因子是细胞表面受体的基因工程化、双特异性配体，其中合成因子以高亲和力与至少一种，常常两种不同的细胞表面受体多肽的细胞外结构域特异性结合。细胞表面受体的特征在于多聚化时激活信号传导。在一些实施方案中，通过与合成因子结合而生成受体多聚体导致受体的细胞内反式磷酸化。合成因子包括但不限于小的有机分子和多肽。
合成因子也可以是细胞表面受体的三特异性配体，或更高的特异性配体，其中合成因子以高亲和力与至少三种不同的细胞表面受体多肽的细胞外结构域特异性结合。细胞表面受体的特征在于多聚化时激活信号传导。在一些实施方案中，通过与合成因子结合而生成受体多聚体导致受体的细胞内反式磷酸化。合成因子包括但不限于小的有机分子和多肽。
在一些实施方案中，细胞表面受体多肽是以下的一种或多种：(i)激活细胞中的JAK/STAT途径的细胞因子受体；(ii)受体酪氨酸激酶；或(iii)TNFR超家族成员。在一些实施方案中，每种多聚体受体多肽均在靶向单细胞中自然表达。在一些实施方案中，将靶细胞工程化为表达所述一种或多种多聚体受体多肽。
在一些实施方案中，合成因子与两种或更多种不同的细胞因子受体特异性结合，细胞因子受体在通过多聚化而激活时，通过JAK/STAT和其他途径(包括但不限于ERK、AKT和其他信号传导信使)进行反式磷酸化和信号传导。在一些实施方案中，所述细胞因子受体选自但不限于βc、γc、IL-3Rα、βIL-3R、GM-CSFRα、IL-5Rα、CNTFα、CRLF1、LIFRα、gp130、IL-6Rα、IL-11Rα、OSMRβ、IL-2Rα、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-4Rα、IL-7Rα、IL-9Rα、IL-13Rα、IL-15Rα、IL-21Rα、IFNAR2、IL-23R、EpoR、IL-12Rβ、IFNAR1、IFNAR2、G-CSFR、c-MPLR。在一些具体实施方案中，合成因子与两种此类受体结合，并激活JAK/STAT信号传导。在一些具体实施方案中，合成因子与三种此类受体结合，并激活JAK/STAT信号传导。通常，合成因子激活的途径不同于天然细胞因子激活受体的途径。
在一些实施方案中，合成因子与两种或更多种不同的受体酪氨酸激酶蛋白结合，当蛋白质多聚化时，所述受体酪氨酸激酶蛋白通过反式磷酸化而激活。在所述一些实施方案中，RTK受体选自但不限于EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、InsR、IGF1R、InsRR、PDGFRα、PDGFRβ、CSF1R/Fms、cKit、Flt-3/Flk2、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、PTK7/CCK4、TrkA、TrkB、TrkC、Ror1、Ror2、MuSK、Met、Ron、Axl、Mer、Tyro3、Tie1、Tie2、EphA1-8、EphA10、EphB1-4、EphB6、Ret、Ryk、DDR1、DDR2、Ros、LMR1、LMR2、LMR3、ALK、LTK、SuRTK106/STYK1、激活素-R(Activin-R)、BMP-R、TGF-β-R、Noggin-R。在一些具体实施方案中，合成因子与两种此类受体结合，并激活信号传导。通常，合成因子激活的途径不同于天然配体激活受体的途径。
在一些实施方案中，合成因子与两种或更多种不同的TNFR超家族多肽结合，当蛋白质多聚化时TNFR超家族多肽被激活。在一些实施方案中，受体选自TNFR1(TNFRSF1A)、TNFR2(TNFRSF1B；TNFRSF2)、41-BB(TNFRSF9)、AITR(TNFRSF18)、BCMA(TNFRSF17)、CD27(TNFRSF7)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、死亡受体1(TNFRSF10C)、死亡受体-3(TNFRSF25)、死亡受体4(TNFRSF10A)、死亡受体5(TNFRSF10B)、死亡受体-6(TNFRSF21)、诱饵受体-3(TNFRSF6B)、诱饵受体2(TNFRSF10D)、EDAR、Fas(TNFRSF6)、HVEM(TNFRSF14)、LTβ-R(TNFRSF3)、OX40(TNFRSF4)、RANK(TNFRSF11A)、TACI(TNFRSF13B)、Troy(TNFRSF19)、XEDAR(TNFRSF27)、骨保护素(TNFRSF11B)、TWEAK受体(TNFRSF12A)、BAFF受体(TNFRSF13C)、NGF受体(TNFRSF16)。在一些具体实施方案中，合成因子与两种或更多种此类受体结合，并激活信号传导。通常，合成因子激活的途径不同于天然配体激活受体的途径。
在其他实施方案中，合成因子与两种或更多种混合类别的受体结合，例如JAK/STAT受体与TNFRSF和/或RTK受体组合；RTK受体与TNFRSF受体组合等。
在本发明的一些实施方案中，合成因子是多肽，该多肽可以包含与每个受体细胞外结构域(ECD)多肽结合的单独的或连续的结合结构域或元件。多肽合成因子可以是单链、二聚体或高级多聚体。每个受体的结合结构域/元件可以直接连接，或者可以被接头，例如多肽接头或非肽接头等分隔开。在一些实施方案中，合成因子不激活天然受体构型。例如，合成因子结合结构域可以结合天然受体的一条链，但是不能结合天然受体的第二条链。此类结合结构域包括但不限于细胞因子的显性负性突变体。
在多肽实施方案中，受体结合结构域可以选自以高亲和力结合所需受体细胞外结构域的任何结构域，所述高亲和力例如，Kd不超过约1x 10-7M，不超过约1x 10-8M，不超过约1x 10-9M，或不超过约1x 10-10M。合适的结合结构域包括但不限于从头设计的结合蛋白、抗体来源的结合蛋白，例如scFv、Fab等以及与一种或多种受体ECD序列特异性结合的抗体的其他部分；纳米抗体来源的结合结构域；基于打结素(knottin)的工程化支架；诺里蛋白(norrin)和源自诺里蛋白的工程化结合片段、自然存在的结合结构域等。通常将自然存在的结合结构域，诸如细胞因子、生长因子等工程化以防止激活天然受体的活性。可以对结合结构域进行亲和选择以增强与所需ECD的结合；和/或进行诱变以防止与不需要的ECD结合。
合成因子多肽可以与药剂融合、连接或替代性地共同施用以增强受体激活。合成因子可以与目标细胞因子、趋化因子或生长因子融合、连接或替代性地共同施用。
结合结构域可以在一个球状结构域内是连续的，或者被接头，例如多肽接头或非肽接头等分隔开。接头的长度以及因此结合结构域之间的间隔可用于调节信号强度，并且可根据合成因子的所需用途进行选择。结合结构域之间的强制距离可以变化，但在某些实施方案中可以小于约100埃、小于约90埃、小于约80埃、小于约70埃、小于约60埃或小于约50埃。
在一些实施方案中，接头是刚性接头，在其他实施方案中，接头是柔性接头。在接头是肽接头的情况下，接头的长度可为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸，并且具有足够的长度和氨基酸组成以强制实现结合结构域之间的距离。在一些实施方案中，接头包含一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸残基或由一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。
合成因子可以多聚化，例如通过Fc结构域，通过串接(concatenation)、卷曲螺旋、多肽拉链、生物素/抗生物素蛋白或链霉亲和素多聚化等。合成因子也可以与如本领域已知的部分诸如PEG、Fc等连接，以增强体内稳定性。
目标组合物包括但不限于有效剂量的在药学上可接受的赋形剂中的合成因子。组合物可包含其他药剂，例如佐剂等。合成因子可以合成产生；如本领域已知，通过各种合适的重组方法等产生。
在本发明的一些方面，提供了一种用于激活、增加或增强细胞中选择的JAK/STAT、DD和/或RTK信号传导的方法。在此类方法中，将表达目标合成因子的同源受体多肽的细胞与一定浓度的合成因子接触，该浓度的合成因子有效增加信号传导，例如相对于不存在合成因子时的信号传导，使信号传导增加25％、50％、75％、90％、95％或更多。此类信号传导激活可以诱导JAK/STAT或RTK信号传导途径，并且包括但不限于免疫响应、生长因子响应的调节、死亡结构域响应的诱导等。在一些方法中，在体外接触表达受体的细胞。在其他实施方案中，在体内接触表达受体的细胞。
在本发明的一些方面，提供了一种用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者提供有效量的合成因子。在特定实施方案中，受试者患有免疫疾病或功能障碍。
附图说明
在连同附图一起阅读下列详细说明时对本发明有最佳理解。需要强调的是，根据惯例，附图的各种特征部分不是按比例的。相反，为了清楚起见而任意扩大或缩小了各种特征部分的尺寸。附图中包括下列图片。
图1A-1B：工程化合成因子配体对非天然受体对的二聚化。图1A详细描述了合成因子对新细胞因子受体对的二聚化的示意图。假定的合成因子募集受体A和D形成与细胞因子X和Y形成的三元复合物不同的新三元复合物。图1B IL-1介导的IL-1R1和IL-1R1AcP嵌合受体复合的示意图。将右表中指定的细胞因子受体的细胞内结构域移植到IL-1R1或IL-1R1AcP细胞外结构域上。表中指定了每种受体所激活的JAK和STAT。
图2A-2I：非天然细胞因子受体对激活信号传导。图2A由图1B中描述的嵌合受体基质产生的100种不同细胞因子受体对组合激活的STAT分子的热图图示。在蛋白质印迹分析中，将结果二进制编码为1(存在条带)，或0(不存在条带)。图2B设计的IL-1诱导型嵌合受体的示意图(左)。在中心详细描述了EpoR近膜结构域的丙氨酸插入诱变。在R251之后插入丙氨酸残基(1A、2A、3A或4A)。右下方呈现了因丙氨酸残基添加而引入的成行扭曲的α-螺旋轮投影。每个残基增加109°旋转，插入3A残基使成行接近原始位置。图2C在表达指定嵌合受体对的受IL-1激活的Jurkat细胞中通过蛋白质印迹测量的磷酸-STAT3(pSTAT3)和pSTAT5水平。插入两个丙氨酸通过IL-1R1-EpoR/IL-1R1AcP-γc受体对恢复信号传导。TYK2的总水平作为上样对照呈现。呈现的蛋白质印迹是两个独立实验的代表性实例。图2D Jurkat细胞中嵌合受体的细胞表面表达。转染后24小时，Jurkat细胞中IL-1R1和IL-1R1Acp嵌合受体表面表达水平的流式细胞术点图。图2E Jurkat细胞中的嵌合受体激活的信号传导图谱。在表达指定嵌合受体对的受IL-1激活的Jurkat细胞中通过蛋白质印迹测量的pSTAT1、pSTAT2、pSTAT3、pSTAT4、pSTAT5和pSTAT6水平。TYK2的总水平作为上样对照呈现。图2F Jurkat细胞中EpoR嵌合受体的细胞表面表达。转染后24小时，Jurkat细胞中指定嵌合受体的细胞表面水平的流式细胞计数点图图示。图2G、图2H、图2I丙氨酸插入不能通过IL-23R-IL-12Rβ、IL-2Rβ-IL2Rβ和EpoR-EpoR嵌合受体恢复信号传导。(图2G、图2H、图2I)通过蛋白质印迹测量的IL-1刺激时的STAT激活(左图)和通过流式细胞术测量的Jurkat细胞中具有指定丙氨酸插入的嵌合受体的细胞表面表达(右图)。
图3A-3F：使非天然细胞因子受体对二聚化的合成因子激活信号传导。图3A合成因子的布局和复合物形成。两种显性负性细胞因子变体通过Gly4/Ser接头基因融合，产生诱导非天然细胞因子受体异源二聚体形成的新分子。图3B-3D通过流式细胞术测量的Hut78 T细胞中由IL-4、Super-2(IL-2的亲和力成熟变体)和IFNω细胞因子(图3B)、显性负性细胞因子变体IL-4DN、IL-2DN和IFNDN(图3C)或SY1 SL、SY1 LL和SY2细胞因子(图3D)激活的pSTAT1、pSTAT3、pSTAT5和pSTAT6水平。数据(平均值+/-SD)来自两个独立的重复。图3E、图3F。通过用Super-2/IL-4和IL-4/IFN细胞因子组合刺激而激活的信号传导图谱。(图3A-3B)通过流式细胞术测量的Hut78细胞中通过用指定浓度的Super-2/IL-4(图3A)和IL-4/IFN细胞因子组合刺激15分钟而诱导的pSTAT1、pSTAT3、pSTAT5和pSTAT6激活水平。数据(平均值+/-SD)来自三个独立实验。
图4A-4D：合成因子与基因组编码的细胞因子激活不同的信号传导程序。图4A在Hut78 T细胞中刺激15分钟、60分钟或120分钟后由指定配体激活的信号传导途径的气泡图图示。气泡的大小表示激活的信号强度。图4B在Hut78细胞中刺激15分钟后由基因组编码的细胞因子和合成因子激活的信号传导分子的填充雷达图图示。由配体激活的信号传导分子显示在圆周，它们各自的激活效力由圆的半径表示。不同配体所表现出的填充雷达图的不同形状定义了它们不同的信号传导特征。图4C Hut78细胞刺激15分钟后细胞因子和合成因子的STAT激活比率。每根柱均表示归一化至100％的每种配体的总STAT激活水平。相应地校正每个STAT的相对激活效力。各种配体的STAT激活水平的不同分布表明基因组编码的细胞因子与合成因子之间的差异性STAT使用。数据(平均值)来自两个独立的重复。图4D由细胞因子和合成因子参与的信号传导程序的无监督聚类。在Hut78细胞中刺激15分钟和60分钟后，由基因组编码的细胞因子和合成因子参与的信号传导程序的主成分分析(PCA)。基因组编码的细胞因子和合成因子特征在空间上以等距离分隔开，表明合成因子信号传导程序与亲本细胞因子就像它们彼此不同一样而不同。
图5A-5C：合成因子引发与基因组编码的细胞因子不同的细胞特征和免疫活性。图5A通过质谱流式细胞术(CyTOF)测量的由PBMC分析的29种免疫细胞类型中由饱和剂量的指定配体诱导的六种信号效应子的激活水平的热图图示。数据(平均值)来自两个独立的重复。图5B来自于用指定配体刺激的PBMC的63种细胞因子的分泌图谱的详细分析。标记了分泌超过本底2倍以上的细胞因子。数据(平均值+/-SD)来自两个独立的重复。图5C用于鉴定由细胞因子与合成因子激活的信号传导特征的免疫细胞图谱分析。质谱流式细胞术介导的对分离自全血的外周血单核细胞(PBMC)中的29种不同免疫细胞亚群的鉴定的门控方案，所述外周血单核细胞用于评估信号效应子对细胞因子与合成因子处理的激活响应。
图6A-6G：使细胞因子受体和酪氨酸激酶受体二聚化的合成因子激活信号传导。图6A IL-1介导的IL1-R1-EGFR和IL-1R1AcP-细胞因子受体嵌合体复合的示意图。图6B在受IL-1激活的表达指定嵌合受体对的Jurkat细胞中通过蛋白质印迹分析测量的磷酸-EGFR(pY EGFR)、pSTAT3和pSTAT5水平。Erk的总水平作为上样对照呈现。呈现的蛋白质印迹是两个独立实验的代表性实例。图6C使细胞因子受体和酪氨酸激酶受体二聚化的合成因子的布局和复合物形成。分别结合细胞因子受体和酪氨酸激酶受体的两种scFv与酸性或碱性亮氨酸拉链基因融合，产生能够形成自然界中不存在的异源二聚体受体复合物的新分子。图6D在用使TpoR和cKit(SY3、SY4和SY5)二聚化的合成因子刺激指定时间段之后，在Mo7E细胞中通过蛋白质印迹测量的磷酸cKit Y703和pJAK2水平。Lamin的总水平作为上样对照呈现。呈现的蛋白质印迹是两个独立实验的代表性实例。图6E通过流式细胞术测量的，在Mo7e细胞中通过用指定剂量的SCF、TPO或指定合成因子刺激10分钟而激活的Erk(左图)和STAT5(右图)磷酸化。数据(平均值+/-SD)来自三个独立的重复。图6F、图6G酪氨酸激酶受体/细胞因子受体二聚化合成因子的功能表征。图6F表示转染后24小时Jurkat细胞中指定嵌合受体的表面表达水平的流式细胞术图。图6G通过流式细胞术测量的，在Mo7e细胞中对于用指定剂量的SCF、TPO和SY5+/-JAK2抑制剂刺激10分钟的Erk激活响应。数据(平均值+/-SD)来自三个独立实验。
图7A-7C：使细胞因子受体和酪氨酸激酶受体二聚化的合成因子激活与其天然配体不同的信号传导程序。图7A在Mo7e细胞中刺激10分钟、60分钟和120分钟后由指定配体激活的信号传导途径的气泡图图示。气泡的大小表示激活的信号强度。图7B在Mo7e细胞中刺激10分钟后SCF、TPO和SY5接合的信号传导分子的堆叠柱状图图示。对于每个分子，将三种配体的组合激活水平归一化至100％，并相应地校正每种配体的相对贡献。一些分子受SCF更好地激活，其他分子受TPO更好地激活，还有其他分子受SY5更好地激活。图A和图B中呈现的数据表示一式三份进行的两次独立实验的平均值。图7C刺激10分钟、60分钟和120分钟后，Mo7e细胞中由指定配体诱导的pPLCG2、pErk和pLCK水平。数据(平均值+/-SD)来自三个独立的重复。
图8：设计三聚合成因子(SY3)，通过gly4ser接头IL-2连接到与IL-4Rα特异性结合的scFv上。因此，三聚合成因子与3种受体多肽，γc、IL-2Rβ和IL-4Rα结合。
图9：三聚合成因子诱导与野生型对应物不同的pSTAT激活图谱。
图10：三聚合成因子表现出与野生型对应物不同的信号传导激活图谱。
图11：三聚合成因子诱导与野生型对应物非常不同的细胞因子分泌特征。
图12：三聚合成因子使单核细胞分化成先前未表征的树突细胞群。
图13：三聚合成因子分化的树突细胞表现出高度的吞噬作用。
图14：三聚合成因子分化的树突细胞表现出高度的吞噬作用。
图15：三聚合成因子分化的树突细胞上的分化标志物与天然细胞群不同。
图16。IL-2λ合成因子。合成因子(SY6)是一种使I型和III型IFN受体二聚的杂合干扰素。A)IFN受体、其相关JAK和受体二聚化时激活的STAT的表。B)SY6是一种使IFNAR1和IFNλR1受体及其相应的JAK二聚化的杂合干扰素。C)SY6的磷酸-STAT1激活的Emax与I型IFN的Emax相等并且是III型IFN诱导的信号的两倍。误差棒表示±SEM(n＝3)。D)SY6有效诱导抗增殖作用，而I型IFN、III型IFN或I型和III型IFN组合处理无效。误差棒表示±SEM(n＝3)。在对I型和III型IFN都具有天然响应性的Hap1细胞中进行磷酸-STAT1信号传导和抗增殖测定。
图17。IL-4DN-IFNβDN2(SY7)通过gly/ser接头将IL-4DN与IFNβ2DN2连接。从C57BL/6小鼠的脾脏/LN中分离淋巴细胞，并用平板结合的抗CD3(2.5μg/ml)+可溶性抗CD28(5μg/ml)激活48小时。然后将细胞在10IU/ml mIL2中静置过夜，然后血清饥饿4小时，之后用指定的细胞因子/合成因子刺激20'。终止细胞信号传导并将细胞用PFA固定，用PermIII缓冲液(BD)透化并用磷酸STAT6(Y641)抗体(BD)染色。序列作为SEQ ID NO:2提供。
具体实施方式
为了更容易理解本公开，下面以及整个说明书中定义了某些术语和短语。本文提供的定义是非限制性的，并且应该根据本领域技术人员在发明时知道的内容来阅读。
定义
在描述本发明的方法和组合物之前，应理解本发明不限于描述的特定方法或组合物，因而当然可以改变。还应理解，本文所用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而非旨在为限制性，因为本发明的范围将仅受所附权利要求限定。
在提供值的范围时，应当理解，除非上下文另外明确指出，否则还明确公开了介于该范围上限与下限之间的每个居中值(至下限单位的十分之一)。介于规定范围内的任何规定值或居中值与该规定范围内的任何其他规定值或居中值之间的每个较小范围均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除，并且在任一个限值、两个限值都不或两个限值都包括在较小范围内的情况下，每个范围也涵盖在本发明内，以规定范围内任何明确排除的限值为依据。当规定范围包括一个或两个限值时，排除了那些所包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的实践或试验，但现在描述的是一些潜在和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与所引用的出版物有关的方法和/或材料。应理解，在存在矛盾的方面来说，本公开取代所并入的出版物的任何公开内容。
必须注意，如本文和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“所述(该)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞，并且提及“该肽”包括提及一种或多种肽及其等同物，例如本领域技术人员已知的多肽，等等。
本文讨论的出版物仅仅是为了它们在本申请的提交日期之前的公开而提供的。本文的任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于此类出版物。此外，提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要独立确认。
“包含”意指组合物/方法/试剂盒中需要所列举的要素，但是也可以包括其他要素以在权利要求的范围内形成组合物/方法/试剂盒等。例如，包含wnt合成因子的组合物是除了合成因子之外还可以包含其他要素的组合物，所述其他要素例如与wnt合成因子结合(例如共价结合)的功能部分，诸如多肽、小分子或核酸；促进wnt合成因子组合物稳定性的药剂，促进wnt合成因子组合物溶解性的药剂，本领域中将容易理解的佐剂，但任何负面条件所涵盖的要素除外。
“基本上由......组成”意指所描述的组合物或方法的范围限制为指定的材料或步骤，这种限制不会实质性影响主题发明的基本和新颖特征。例如，“基本上由”公开序列组成的wnt合成因子基于它所来源的序列，具有公开序列的氨基酸序列加上或减去序列边界处的约5个氨基酸残基，例如比所列举的边界氨基酸残基少约5个残基、4个残基、3个残基、2个残基或约1个残基，或比所列举的边界氨基酸残基多约1个残基、2个残基、3个残基、4个残基或5个残基。
“由......组成”意指从组合物、方法或试剂盒中排除权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。例如，“由公开序列组成”的wnt合成因子仅由公开的氨基酸序列组成。
“功能部分”或“FM”意指赋予组合物功能活性的多肽、小分子或核酸组合物。功能部分的实例包括但不限于治疗部分、结合部分和成像部分。
“治疗部分”或“TM”意指赋予组合物治疗活性的多肽、小分子或核酸组合物。治疗部分的实例包括细胞毒素(例如小分子化合物)、蛋白类毒素和放射增敏部分(即本质上对细胞有害的放射性核素等)；改变细胞活性的药剂，例如小分子、肽模拟物、细胞因子、趋化因子；和靶向细胞的ADCC或CDC依赖性死亡的部分，例如免疫球蛋白的Fc组分。
“成像部分”或“IM”意指可用于使细胞(例如已经被主题申请的组合物靶向的细胞)定位并任选地使细胞可视化的非细胞毒性剂。
术语“治疗”等在本文中通常用于意指获得所需的药理学和/或生理学效应。这种效应就完全或部分预防疾病或其症状而言，可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的副作用而言，可以是治疗性的。如本文所用的“治疗”包括对哺乳动物中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易患该疾病但尚未诊断为患有该疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)缓解疾病，即引起疾病消退。治疗剂可以在疾病或损伤发生之前、期间或之后施用。在治疗稳定或减少患者的不良临床症状的情况下，对持续性疾病的治疗特别令人感兴趣。期望在受影响组织中完全丧失功能之前进行此类治疗。主题疗法可以在疾病症状期期间施用，并且在一些情况下在疾病症状期之后施用。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，特别是人。
分子和细胞生物化学中的一般方法可以在诸如以下的标准教科书中找到：Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版(Sambrook等人，CSH Laboratory Press2001)；Short Protocols in Molecular Biology，第4版(Ausubel等人编辑，John Wiley&Sons 1999)；Protein Methods(Bollag等人，John Wiley&Sons 1996)；Nonviral Vectorsfor Gene Therapy(Wagner等人编辑，Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift&Loewy编辑，Academic Press 1995；Immunology Methods Manual(I.Lefkovits编辑，Academic Press 1997)；及Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures inBiotechnology(Doyle&Griffiths,John Wiley&Sons 1998)，其公开内容通过引用并入本文。本公开中提到的用于遗传操作的试剂、克隆载体和试剂盒可从商业供应商获得，诸如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和ClonTech。
天然受体和配体对包括但不限于以下受体：
可以将合成因子工程化为结合上表中的任何受体多肽组合，但通常不会激活与以上所列天然配体相同的受体多肽组合。例如，当LIF激活LIFR和cd130的异源二聚体时，合成因子可能激活LIFR和γc，或LIFR和βc等。由合成因子激活的受体多肽组合可以在目标细胞中天然表达，或者可以将细胞工程化为表达所需的受体多肽组合。
JAK/STAT途径和受体。二聚化时激活JAK/STAT途径的受体包括但不限于βc、γc、IL-3Rα、βIL-3R、GM-CSFRα、IL-5Rα、CNTFα、CRLF1、LIFRα、gp130、IL-6Rα、IL-11Rα、OSMRβ、IL-2Rα、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-4Rα、IL-7Rα、IL-9Rα、IL-13Rα、IL-15Rα、IL-21Rα、IFNAR2、IL-23R、EpoR、IL-12Rβ、IFNAR1、G-CSFR、c-MPLR。
JAK-STAT信号传导途径将来自细胞外化学信号的信息传递到细胞核，引起涉及免疫、增殖、分化、凋亡和肿瘤发生的基因的转录和表达。JAK-STAT信号级联由三个主要组分组成：如以上所公开的细胞表面受体、Janus激酶(JAK)和两种信号转导因子及转录激活因子(STAT)蛋白。JAK-STAT功能受到破坏或失调可导致免疫缺陷综合征和癌症。
细胞因子与细胞表面上的受体结合导致受体相关酪氨酸激酶JAK的激活。一旦激活，JAK就相互反式磷酸化，从而产生信号转导因子及转录激活因子(STAT)分子的对接位点。在结合之后，STAT通过JAK介导的酪氨酸磷酸化激活并形成同源或异源二聚体，易位到细胞核，它们在细胞核中调控转录。存在四种不同的JAK激酶(JAK1、2、3和TYK2)以及七种不同的STAT蛋白(STAT1、2、3、4、5A、5B和6)。一种细胞因子可以激活一种以上的JAK，每种JAK靶向一种以上的STAT蛋白。这种多层复杂的激活模式有时会产生精细表型。对Jak-STAT信号传导的综述包括，例如Villarino等人(2017)Nat.Immunol.18(4):374-384；Majoros等人(2017)Front Immunol.8:29；Bannarjee等人(2017)Drugs 77(5):521-546’Pencik等人(2016)Cytokine 87:26-36，其各自通过引用明确并入本文。
受体酪氨酸激酶途径。RTK受体多肽包括但不限于EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、InsR、IGF1R、InsRR、PDGFRα、PDGFRβ、CSF1R/Fms、cKit、Flt-3/Flk2、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、PTK7/CCK4、TrkA、TrkB、TrkC、Ror1、Ror2、MuSK、Met、Ron、Axl、Mer、Tyro3、Tie1、Tie2、EphA1-8、EphA10、EphB1-4、EphB6、Ret、Ryk、DDR1、DDR2、Ros、LMR1、LMR2、LMR3、ALK、LTK和SuRTK106/STYK1。
受体酪氨酸激酶(RTK)是许多多肽生长因子、细胞因子和激素的高亲和力细胞表面受体。参见，例如，Robinson等人(2000).Oncogene 19(49):5548–57，其通过引用明确并入本文。人类有58种已知的RTK，它们属于二十个亚家族。所有RTK都具有相似的分子结构，具有细胞外结构域中的配体结合区，单跨膜螺旋，以及含有蛋白酪氨酸激酶(TK)结构域加上附加羧基(C-)末端和近膜调控区的胞质区。
一般而言，生长因子结合通过诱导受体二聚化来激活RTK，但是RTK的亚群甚至在不存在激活配体的情况下也形成寡聚体。配体结合通过稳定活性多聚体构型的各个受体分子来激活受体。通常，其中一条多肽链然后使一个或多个酪氨酸磷酸化，并且磷酸化的受体在组装和激活细胞内信号传导蛋白中具有活性。配体诱导的RTK胞外区的二聚化导致细胞内酪氨酸激酶结构域(TKD)的激活。
RTK磷酸化的第一主要底物是受体本身。激酶结构域中的自体磷酸化位点本身在大部分RTK中起重要的调控作用。然后在大部分RTK的其他胞质区部分中，另外的酪氨酸自体磷酸化。所产生的磷酸酪氨酸起到下游信号传导分子组装的特定位点的作用，所述下游信号传导分子募集到受体上并响应生长因子刺激而激活。自体磷酸化以反式进行，并且自体磷酸化位点按精确的顺序磷酸化。通过使顺式-自体抑制相互作用不稳定，每个连续事件对催化性质具有显著影响。
对RTK自体磷酸化的细胞响应是募集并激活许多下游信号传导分子。这些分子含有与磷酸酪氨酸特异性结合的SH2或PTB结构域。它们可以直接募集到受体中的磷酸酪氨酸中，或者它们可以通过结合与它们缔合的RTK磷酸化的对接蛋白而间接募集。这些对接蛋白包括FRS2、IRS1(胰岛素受体底物-1)和Gab1(Grb2相关结合蛋白)。对接蛋白通常在其氨基末端含有膜靶向位点，接着是一系列酪氨酸磷酸化位点，酪氨酸磷酸化位点用作不同组库的下游信号传导蛋白的结合位点。尽管许多对接蛋白(诸如Gab1)被多个RTK募集，但其他对接蛋白被限制到特定的受体亚群。在大多数受体中具有多个磷酸酪氨酸并且涉及许多对接蛋白，激活的RTK可以募集并影响大量不同的信号传导分子。信号传导途径的综述包括，例如，Lemmon和Schlesinger(2010)Cell 141(7):1117-34，其通过引用明确并入本文。
TNFRSF途径。TNFRSF多肽包括但不限于TNFR1(TNFRSF1A)、TNFR2(TNFRSF1B；TNFRSF2)、41-BB(TNFRSF9)、AITR(TNFRSF18)、BCMA(TNFRSF17)、CD27(TNFRSF7)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、死亡受体1(TNFRSF10C)、死亡受体-3(TNFRSF25)、死亡受体4(TNFRSF10A)、死亡受体5(TNFRSF10B)、死亡受体-6(TNFRSF21)、诱饵受体-3(TNFRSF6B)、诱饵受体2(TNFRSF10D)、EDAR、Fas(TNFRSF6)、HVEM(TNFRSF14)、LTβ-R(TNFRSF3)、OX40(TNFRSF4)、RANK(TNFRSF11A)、TACI(TNFRSF13B)、Troy(TNFRSF19)、XEDAR(TNFRSF27)、骨保护素(TNFRSF11B)、TWEAK受体(TNFRSF12A)、BAFF受体(TNFRSF13C)、NGF受体(TNFRSF16)。
肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族由29种跨膜受体组成，它们的细胞外结构域具有显著同源性，其特征在于存在多达6个富含半胱氨酸的结构域(CRD)，这限定了它们的配体特异性。该家族的成员是I型跨膜蛋白，具有C端细胞内尾、跨膜区和细胞外结合配体的N端结构域。TNFR的成员含有负责配体结合的细胞外结构域和介导信号传导途径激活的细胞内结构域。TNF同源结构域(THD)触发非共价同源三聚体的形成。TNFR可以分为两类：活化性受体和死亡受体(DR)。
DR包括八个成员，诸如TNFR1和Fas，这些成员在胞内区中具有称为死亡结构域(DD)的蛋白相互作用模块，该模块介导外在信号诱导的细胞死亡。与配体的结合导致受体聚集和衔接蛋白的募集，这转而通过募集和激活引发剂半胱天冬酶8和10来引发蛋白水解级联。死亡受体引发多个信号传导途径，包括调控细胞增殖和分化、趋化因子产生、炎性响应、凋亡和肿瘤促进活性。
死亡受体受其同源配体激活，同源配体是一类属于TNF蛋白家族的互补细胞因子。通过死亡受体进行的细胞毒性信号转导通过以下方式进行：1)与同源配体结合；2)募集衔接蛋白/对接蛋白，这转而募集引发剂半胱天冬酶8和10；和3)取决于各种衔接蛋白和半胱天冬酶8和10的化学计量以及细胞内化事件的离散信号传导途径。还可以涉及许多非细胞毒性信号传导途径，这些途径主要由来自受体/衔接蛋白复合物的核因子-κB(NF-κB)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活介导。
大多数TNF受体需要特定的衔接蛋白，诸如TRADD、TRAF、RIP和FADD用于下游信号传导，并且可能最终起到激活NF-κB的作用。例如，在与TNFα结合时，TNFR1的细胞内DD募集TNF受体相关DD蛋白(TRADD)，后者转而募集受体相互作用蛋白激酶1(RIP1)、细胞凋亡抑制蛋白1和2(cIAP1和2)和TNF受体相关因子2。TRADD对于TNF诱导的NF-κB信号传导途径很重要，因为在TRADD缺陷型MEF中，完全消除了IκB磷酸化和降解。
表达构建体：在本方法中，合成因子可以通过重组方法产生。可以将合成因子引入表达载体上进入待工程化的细胞中。编码合成因子的DNA可以从工程过程中设计的各种来源获得。
如本文所述，通过向编码序列引入适当的核苷酸变化来制备氨基酸序列变体。此类变体表示所述残基的插入、取代和/或指定缺失。产生插入、取代和/或指定缺失的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有如本文所定义的所需生物活性。
将编码合成因子的核酸插入可复制的载体中进行表达。许多此类载体可用。载体组件通常包括但不限于如下一种或多种：复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。载体包括病毒载体、质粒载体、整合载体等。
细胞因子不仅可以直接重组产生，而且还可以作为与异源多肽，例如信号序列或在成熟蛋白或多肽的N端具有特异性裂解位点的其他多肽的融合多肽产生。一般而言，信号序列可以是载体的组件，或者可以是插入载体中的编码序列的一部分。优选选择的异源信号序列是被宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶裂解)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可以使用天然信号序列，或者其他哺乳动物信号序列可能也是合适的，诸如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号序列。
表达载体通常含有选择基因，也称为选择标记。该基因编码在选择性培养基中生长的转化宿主细胞存活或生长所必需的蛋白。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在所述培养基中存活。典型的选择基因编码的蛋白质(a)赋予针对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性，(b)补充营养缺陷型缺陷，或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。
表达载体将含有被宿主生物识别并与合成因子编码序列可操作地连接的启动子。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5')(通常在约100至1000bp以内)的非翻译序列，该序列控制与之可操作地连接的特定核酸序列的转录和翻译。此类启动子通常分为两类，诱导型和组成型。诱导型启动子是响应于培养条件的一些变化，例如营养物的存在或不存在或温度变化，引发受其控制的DNA转录水平升高的启动子。大量被各种潜在宿主细胞识别的启动子是公知的。
例如，可以通过从病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒(诸如鼠干细胞病毒)、乙型肝炎病毒和最优选猿猴病毒40(SV40)的基因组，从异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子、PGK(磷酸甘油酸激酶)或免疫球蛋白启动子，以及从热休克启动子获得的启动子控制哺乳动物宿主细胞中从载体的转录，只要此类启动子与宿主细胞系统相容。SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地作为也含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段获得。
通过将增强子序列插入载体常常可以增加高等真核生物的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，作用于启动子以增加其转录。增强子相对与方向和位置无关，已经在转录单元的5'和3'，在内含子内以及在编码序列本身内发现。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)。然而，通常会使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点后侧的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以剪接到表达载体中编码序列的5'或3'位置，但优选位于启动子的5'位点。
用于真核宿主细胞的表达载体还将含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核生物或病毒DNA或cDNA的5'和偶尔3'非翻译区获得。含有一种或多种上述组件的合适载体的构建采用标准技术。
当与另一核酸序列处于功能关系时，核酸“可操作地连接”。例如，如果信号序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则信号序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接。如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则它与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的且处于阅读相。然而，增强子不必是连续的。
重组产生的合成因子可以作为分泌的多肽从培养基中回收，但是也可以从宿主细胞裂解物中回收。蛋白酶抑制剂，诸如苯基甲基磺酰氟(PMSF)也可用于抑制纯化期间的蛋白水解降解，并且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。各种纯化步骤是本领域中已知的并且可以使用，例如亲和色谱法。亲和色谱法利用通常存在于生物大分子中的高度特异性结合位点，根据其结合特定配体的能力来分离分子。共价键以明显地将配体呈现给蛋白质样品的方式将配体附接到不溶性多孔支撑介质上，从而使用一个分子物类的天然生物特异性结合从混合物中分离和纯化第二物类。抗体常用于亲和色谱法。也可以使用尺寸选择步骤，例如凝胶过滤色谱法(也称为尺寸排阻色谱法或分子筛色谱估法)用于根据蛋白质的大小来分离蛋白质。在凝胶过滤中，使蛋白质溶液通过填充有半透性多孔树脂的柱。半透性树脂具有一系列孔径，决定了可用柱分离的蛋白质的大小。还令人感兴趣的是阳离子交换色谱法。
最终合成因子组合物可以使用本领域已知的方法浓缩、过滤、透析等。对于治疗应用，可以将合成因子施用给包含受体多肽的适当组合的哺乳动物。施用可以作为团注或通过在一段时间连续输注而静脉施用。替代性施用途径包括肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。合成因子也适合通过肿瘤内、肿瘤周围、病灶内或病灶周围途径施用，或向淋巴施用，以发挥局部和全身治疗效果。
此类剂型涵盖生理上可接受的载体，该载体本身是无毒和非治疗性的。此类载体的实例包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(诸如人血清白蛋白)、缓冲物质(诸如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(诸如硫酸鱼精蛋白)、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质和PEG。用于局部或基于凝胶的多肽形式的载体包括多糖(诸如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、PEG和木蜡醇。对于所有施用而言，适合使用常规储库形式。此类形式包括，例如，微胶囊、纳米胶囊、脂质体、膏药、吸入形式、鼻喷雾剂、舌下片剂和持续释放制剂。通常将多肽以约0.1μg/ml至100μg/ml的浓度配制在此类载体中。
如果合成因子是“基本上纯的”，则可以是至少约60重量％(干重)的目标多肽(例如含有合成因子氨基酸序列的多肽)。例如，多肽可以是至少约75重量％、约80重量％、约85重量％、约90重量％、约95重量％或约99重量％的目标多肽。纯度可以通过任何适当的标准方法测量，例如柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。
在本发明的另一个实施方案中，提供了含有可用于治疗上述病状的材料的制品。该制品包括容器和标签。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可由多种材料形成，诸如玻璃或塑料。容器容纳治疗病状有效的组合物并且可以具有无菌接入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有皮下注射针头可刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂是合成因子。容器上或随附容器的标签表明该组合物用于治疗选择的病状。可以为制品提供其他容器，其可以容纳例如药学上可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。制品还可包括从商业和使用者角度来看合乎需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器以及含使用说明的包装说明书。
如本文关于多肽或DNA序列所用，术语“同一性”是指两个分子之间的亚基序列同一性。当两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基(例如，相同的氨基酸残基或核苷酸)占据时，则所述分子在该位置是相同的。两个氨基酸或两个核苷酸序列之间的相似性是相同位置数量的直接函数。一般而言，比对序列以便获得最高阶匹配。如有必要，可以使用公开的技术和广泛可用的计算机程序，诸如(Devereux等人，Nucleic Acids Res.12:387,1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人，J.Molecular Biol.215:403,1990)计算同一性。可以使用序列分析软件，例如威斯康星大学生物技术中心(University of WisconsinBiotechnology Center)(1710University Avenue,Madison,Wis.53705)的遗传学计算机组序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package of the Genetics ComputerGroup)以其默认参数来测量序列同一性。
术语“多肽”、“蛋白”或“肽”是指任何氨基酸残基链，无论其长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)如何。
本文中“蛋白变体”或“变体蛋白”或“变体多肽”意指由于至少一个氨基酸修饰而与野生型蛋白不同的蛋白。亲本多肽可以是自然存在的或野生型(WT)多肽，或者可以是WT多肽的修饰形式。变体多肽可以指多肽本身、包含该多肽的组合物，或编码该多肽的氨基序列。优选地，变体多肽与亲本多肽相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比具有约1至约10个氨基酸的修饰，优选约1至约5个氨基酸的修饰。
如本文所用的“亲本多肽”、“亲本蛋白”、“前体多肽”或“前体蛋白”意指未修饰的多肽，其随后经修饰以产生变体。亲本多肽可以是野生型(或天然)多肽，或野生型多肽的变体或工程化形式。亲本多肽可以指多肽本身，包含亲本多肽的组合物，或编码多肽的氨基酸序列。
本文中“野生型”或“WT”或“天然”意指在自然界中发现的包括等位基因变异在内的氨基酸序列或核苷酸序列。WT蛋白、多肽、抗体、免疫球蛋白、IgG等具有尚未经有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
术语“受者”、“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，特别是人。用于治疗目的的“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，诸如狗、马、猫、牛、绵羊、山羊、猪等。优选地，哺乳动物为人。
如本文所用，“治疗有效量”是指足以治疗或控制疾病或病症的治疗剂，例如过继性T细胞和正交细胞因子组合的量。治疗有效量可以指足以延迟或最小化疾病发作，例如延迟或最小化癌症扩散的治疗剂的量，或有效减少或增加来自目标受体的信号传导的量。治疗有效量还可以指在疾病的治疗或控制中提供治疗益处的治疗剂的量。此外，关于本发明治疗剂的治疗有效量意指单独或与其他疗法组合，在疾病的治疗或控制中提供治疗益处的治疗剂的量。
如本文所用，术语“预防”是指由于施用预防剂或治疗剂而对受试者中病症的一种或多种症状的复发或发作的预防。
如本文所用，术语“组合”是指使用一种以上的预防和/或治疗剂。术语“组合”的使用不限制将预防剂和/或治疗剂施用给患有病症的受试者的顺序。第一预防剂或治疗剂可以在向患有病症的受试者施用第二预防剂或治疗剂之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周前)、同时或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周后)施用。
组合物
提供了合成因子及其使用方法。合成因子引起靶向途径例如Jak/STAT、ERK、AKT、NF-κB等的信号传导水平可测量地增加，条件是相对于天然配体激活不同的信号谱。在阅读下面更全面描述的组合物和方法的详情后，本发明的这些和其他目的、优点和特征对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
合成因子分子通过其物理和生物学特性定义。主要特征是合成因子与细胞表面受体的一个或多个，通常是2个或更多个不同的细胞外结构域特异性结合，这些受体的特征在于通过配体诱导的多聚化(常常是配体诱导的二聚化)而激活，在许多情况下通过反式磷酸化而引起激活。合成因子激活受体的非天然组合，通常不会激活由天然(即基因组编码的)配体激活的受体组合。目标受体包括激活JAK-STAT信号传导的受体，以本文所述的细胞因子受体为例；受体酪氨酸激酶，以细胞因子和生长因子受体，以及TNF受体为例。
合成因子可以是具有所需结合特性的任何分子，例如蛋白或药物。可能小于约15Kd的小分子令人感兴趣并且可以通过如本文所述的化合物筛选来开发。多肽也令人感兴趣。另外，某些合成因子可包含多肽区或结构域和非多肽区或结构域两者。
合成因子可以是多肽，其中两个不同受体细胞外结构域的结合结构域是连接的。多肽合成因子可以是单链、二聚体或高级多聚体。结合结构域可以直接连接，或者可以被接头，例如多肽接头或非肽接头等分隔开。
在一些实施方案中，一个或所有结合结构域包含天然配体即IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-18、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-4、IL-15、IL-3、IL-5、GM-CSF、IL-6、IL-11、G-CSF、IL-12、LIF、OSM、IL-10、IL-20、IL-14、IL-16、IL-17、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、LT-β、TNF-α、TNF-β、4-1BBL、CD70、CD153、CD178、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、Epo、Tpo、Flt-3L、SCF、M-CSF、MSP的结合结构域；其中结合结构域不会激活配体的天然受体。例如，结合结构域可以包含靶向氨基酸取代，该靶向氨基酸取代导致缺乏与天然受体多肽中的一个而不是另一个的结合。许多此类经修饰的结合结构域是本领域已知的，并且可以例如产生相对于天然受体构型的显性负性突变。
在各种其他实施方案中，结合结构域可以是与受体的一条链特异性结合的抗体，或源自抗体的结合部分。
术语“特异性结合”是指在诸如酶/底物、受体/配体、抗体/抗原和凝集素/碳水化合物等配对物类之间发生的结合，这种结合可以通过共价或非共价相互作用或共价和非共价相互作用的组合介导。当两种物类的相互作用产生非共价结合的复合物时，发生的结合通常是静电、氢键键合或亲脂相互作用的结果。因此，“特异性结合”发生在配对物类之间，其中两者之间存在相互作用，产生具有抗体/抗原或配体/受体相互作用的特征的结合复合物。通过在体内施用后在功能测定中测定活性水平，可以确定组合物中wnt合成因子的生物活性，例如加速骨再生，增强干细胞增殖等，β-连环蛋白的核定位，wnt响应基因的转录增加；等等。
每个结合结构域可以是小分子或多肽，并且可以选自以高亲和力结合所需受体细胞外结构域的任何结构域，所述高亲和力例如，KD为至少约1x 10-7M，至少约1x 10-8M，至少约1x 10-9M，至少约1x 10-10M。合适的结合结构域包括但不限于从头设计的结合蛋白、抗体来源的结合蛋白，例如scFv、Fab等以及与一种或多种蛋白特异性结合的抗体的其他部分；纳米抗体来源的结合结构域；基于打结素的工程化支架；等等。
可以对结合结构域进行亲和选择以增强与所需细胞外结构域的结合。用于该目的的亲和选择方法可任选地利用通过以下方式进行的一轮或多轮选择：引入靶向氨基酸变化并产生候选编码序列文库来，用候选编码序列转化细胞群，例如转化到酵母细胞中，选择(例如使用顺磁性微珠)所需的特异性。通常会进行多轮选择，并且对所得载体进行测序并用作蛋白质工程的基础。例如，可以选择结合结构域，包括但不限于经修饰的细胞因子、抗体或纳米抗体来源的结构域、工程化蛋白等，以选择性地结合目标细胞外结构域。
变体。结合结构域还可以包括上述多肽的衍生物、变体和生物活性片段，例如天然配体的变体。“变体”多肽意指如下定义的与提供的序列具有小于100％的序列同一性的生物活性多肽。此类变体包括与提供的序列相比包含一个或多个氨基酸修饰(例如插入、缺失或取代)的多肽，例如，其中在天然序列的N端或C端或其内部添加了一个或多个氨基酸残基；约1至40个氨基酸残基缺失，任选被一个或多个氨基酸残基取代；和上述多肽的衍生物，其中氨基酸残基已共价修饰，使得所得产物具有非自然存在的氨基酸。通常，生物活性变体将具有与天然序列多肽具有至少约90％氨基酸序列同一性，优选至少约95％，更优选至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
序列的“功能衍生物”是与初始序列具有共同的定性生物学特性的化合物。“功能衍生物”包括但不限于序列的片段和序列的衍生物，条件是它们具有共同的生物学活性。术语“衍生物”涵盖多肽的氨基酸序列变体及其共价修饰。
可以使用普通分子生物学技术和合成化学法修饰用于主题组合物和方法中的结合结构域，以便改善其对蛋白质降解的抗性，或优化溶解性，或使其更适合作为治疗剂。此类多肽的类似物包括含有除了自然存在的L-氨基酸以外的残基(例如D-氨基酸或非自然存在的合成氨基酸)的类似物。D-氨基酸可以取代一些或所有氨基酸残基。
合成因子可以与另外的多肽序列融合或键合。实例包括将合成因子与免疫球蛋白序列特别是Fc序列组合的免疫粘附素，和包含与“标签多肽”融合的天然抑制剂多肽或其部分的表位标记多肽。标签多肽具有足够的残基来提供可以针对其产生抗体的表位，但是足够短以致其不会干扰天然抑制剂多肽的生物活性。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基，通常在约6-60个氨基酸残基之间。合成因子也可以在调配物中融合或组合，或与增强活性的药剂，例如细胞因子、生长因子、化学治疗剂、免疫抑制剂等共同施用。
接头。结合结构域可以被接头，例如多肽接头或非肽接头等分隔开。连接结构域的氨基酸接头可在多结构域蛋白的结构和功能中起重要作用。存在催化活性需要适当的接头组合物的蛋白质的许多实例。一般而言，已经证实改变连接结构域的接头长度会影响蛋白质稳定性、折叠率和结构域间定向(参见George和Hering(2003)Prot.Eng.15:871-879)。合成因子中接头的长度以及因此结合结构域之间的间隔可用于调节合成因子的信号强度，并且可以根据合成因子的所需用途进行选择。合成因子的结合结构域之间的强制距离可以变化，但在某些实施方案中可以小于约100埃、小于约90埃、小于约80埃、小于约70埃、小于约60埃，小于约50埃。
在一些实施方案中，接头是刚性接头，在其他实施方案中，接头是柔性接头。在一些实施方案中，接头部分是肽接头。在一些实施方案中，肽接头包含2至100个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99个但不超过100个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头长度为5至75、5至50、5至25、5至20、5至15、5至10或5至9个氨基酸。示例性接头包括具有至少两个氨基酸残基诸如Gly-Gly、Gly-Ala-Gly、Gly-Pro-Ala、Gly-Gl y-Gly-Gly-Ser的线性肽。合适的线性肽包括聚甘氨酸、聚丝氨酸、聚脯氨酸、聚丙氨酸以及由丙氨酰和/或丝氨酰和/或脯氨酰和/或甘氨酰氨基酸残基组成的寡肽。在一些实施方案中，肽接头包含选自Gly9、Glu9、Ser9、Gly5-Cys-Pro2-Cys、(Gly4-Ser)3、Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn、Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cy s-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn、Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys和Gly9-Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn的氨基酸序列。在一个实施方案中，接头包含氨基酸序列GSTSGSGKSSEGKG或(GGGGS)n，其中n为1、2、3、4、5等；然而许多此类接头是已知的并用于本领域中并且可以用于该目的。
合成因子可以以单链形式提供，这意味着结合结构域通过接头肽用肽键连接。在其他实施方案中，结合结构域是单个肽，并且可以通过非肽接头连接。
可用于连接结合结构域的化学基团包括如本领域已知的氨基甲酸酯；酰胺(胺加羧酸)；酯(醇加羧酸)、硫醚(卤代烷加巯基；马来酰亚胺加巯基)、席夫碱(胺加醛)、脲(胺加异氰酸酯)、硫脲(胺加异硫氰酸酯)、磺酰胺(胺加磺酰氯)、二硫化物；腙、脂质等。
结合结构域之间的连接可包括间隔区，例如烷基间隔区，间隔区可以是直链或支链，通常是直链，并且可以包括一个或多个不饱和键；通常具有1至约300个碳原子；更通常具有约1至25个碳原子；并且可以是约3至12个碳原子。这种类型的间隔区也可包含杂原子或官能团，包括胺、醚、磷酸二酯等。具体目标结构包括：(CH2CH2O)n，其中n为1至约12；(CH2CH2NH)n，其中n为1至约12；[(CH2)n(C＝O)NH(CH2)m]z，其中n和m为1至约6，且z为1至约10；[(CH2)nOPO3(CH2)m]z，其中n和m为1至约6，且z为1至约10。此类接头可包括可以是直链或支链的聚乙二醇。
结合结构域可以通过同或异双官能接头连接，所述接头在一端具有能够与亲水性头基形成稳定连接的基团，并且在相对端具有能够与靶向部分形成稳定连接的基团。说明性实体包括：叠氮基苯甲酰肼、N-[4-(对-叠氮基水杨基氨基)丁基]-3'-[2'-吡啶基二硫代]丙酰胺)、辛二酸二磺基琥珀酰亚胺酯、己二亚氨酸二甲酯、酒石酸二琥珀酰亚胺酯、N-γ-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯、N-琥珀酰亚胺基[4-叠氮基苯基]-1,3'-二硫代丙酸酯、N-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯、戊二醛、NHS-PEG-MAL；4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯；3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)；N,N'-(1,3-亚苯基)双马来酰亚胺；N,N'-亚乙基-双-(碘乙酰胺)；或4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)；间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)和4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)即MBS的扩链类似物。这些交联剂的琥珀酰亚胺基与伯胺反应，硫醇反应性马来酰亚胺与半胱氨酸残基的硫醇形成共价键。
用于该目的的其他试剂包括：p,p'-二氟-m,m'-二硝基二苯基砜(其与氨基和酚基形成不可逆的交联)；己二亚氨酸二甲酯(其对氨基具有特异性)；苯酚-1,4-二磺酰氯(其主要与氨基反应)；六亚甲基二异氰酸酯或二异硫氰酸酯，或偶氮苯-对二异氰酸酯(其主要与氨基反应)；双重氮基联苯胺(其主要与酪氨酸和组氨酸反应)；邻苯三唑基氧基四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、二环己基碳二亚胺、溴-三(吡咯烷基)溴化鏻(PyBroP)；N,N-二甲氨基吡啶(DMAP)；4-吡咯烷基吡啶；N-羟基苯并三唑；等等。同双官能交联剂包括双马来酰亚胺基己烷(“BMH”)。
抗体：如本文所用，术语“抗体”是指包括足以赋予与特定靶抗原的特异性结合的经典免疫球蛋白序列元件的多肽。如本领域已知的，自然界中产生的完整抗体是大约150kD的四聚体药剂，由两条相同的重链多肽(各约50kD)和两条相同的轻链多肽(各约25kD)组成，重链多肽和轻链多肽彼此缔合成通常称为“Y形”结构的物质。每条重链由至少四个结构域(各约110个氨基酸长)组成-氨基末端可变(VH)结构域(位于Y结构的顶端)，接着是三个恒定结构域：CH1、CH2和羧基末端CH3(位于Y茎的基部)。称为“开关”的短小区连接重链可变区和恒定区。“铰链”将CH2和CH3结构域连接到抗体的其余部分。该铰链区中的两个二硫键将完整抗体中的两条重链多肽彼此连接。每条轻链由两个结构域组成-氨基末端可变(VL)结构域，接着是羧基末端恒定(CL)结构域，通过另一个“开关”彼此分隔开。完整抗体四聚体由两个重链-轻链二聚体组成，其中重链和轻链通过单个二硫键彼此连接；另外两个二硫键将重链铰链区彼此连接，使得二聚体彼此连接并形成四聚体。自然产生的抗体通常在CH2结构域上也经糖基化。天然抗体中的每个结构域具有特征在于“免疫球蛋白折叠”的结构，所述“免疫球蛋白折叠”由彼此相对包装成压缩的反向平行β桶的两个β折叠(例如，3-、4-或5-链折叠)形成。每个可变结构域含有三个称为“互补决定区”(CDR1、CDR2和CDR3)的高变环和四个在某种程度上不变的“框架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成为结构域提供结构框架的β折叠，并且来自重链和轻链两者的CDR环区在三维空间中聚集在一起，使其产生位于Y结构顶端的单个高变抗原结合站点。
自然存在的抗体的Fc区与补体系统的元件结合，并且还与效应细胞(包括例如介导细胞毒性的效应细胞)上的受体结合。如本领域所知，Fc区对Fc受体的亲和力和/或其他结合属性可通过糖基化或其他修饰来调节。在一些实施方案中，根据本发明产生和/或利用的抗体包括糖基化Fc结构域，包括具有经修饰或工程化的此类糖基化的Fc结构域。
包含在天然抗体中发现的足够免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽复合物都可以称为和/或用作“抗体”，无论此类多肽是自然产生的(例如，由对抗原起反应的生物体生成的)，还是通过重组工程化、化学合成或其他人工系统或方法产生的。在一些实施方案中，如本领域已知，抗体序列元件可以是人源化的、灵长类化的、嵌合的，等等。
而且，如本文所用的术语“抗体”可以在适当的实施方案中(除非另有说明或从上下文中清楚)指任何本领域已知或开发的，以便在替代呈现中利用抗体结构和功能特征的构建体或形式。例如，实施方案，根据本发明利用的抗体的形式选自但不限于完整IgG、IgE和IgM，双特异性或多特异性抗体(例如，等)，单链Fv、Fab、小模块化免疫药物(“SMIPsTM”)、单链或串联双抗体VHH、微抗体(minibody)、锚蛋白重复蛋白或DART、TCR样抗体、微蛋白、和在一些实施方案中，抗体可缺乏在其自然产生时将会具有的共价修饰(例如，聚糖的附接)。在一些实施方案中，抗体可含有共价修饰(例如，聚糖、有效负载[例如，可检测部分、治疗部分、催化部分等]，或其他侧基[例如，聚乙二醇等]的附接。
在许多实施方案中，抗体药剂是或包含其氨基酸序列包括一个或多个本领域技术人员公认为互补决定区(CDR)的结构元件的多肽；在一些实施方案中，抗体药剂是或包含其氨基酸序列包括至少一个与参考抗体中发现的CDR基本上相同的CDR(例如，至少一个重链CDR和/或至少一个轻链CDR)的多肽。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本上相同，因为它与参考CDR相比在序列上相同或含有1-5个氨基酸取代。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本相同，因为它与参考CDR显示出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本相同，因为它与参考CDR显示出至少96％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本上相同，因为与参考CDR相比，所包括的CDR内的至少一个氨基酸是缺失的、添加的或经取代的，但是所包括的CDR具有其他方面与参考CDR的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本上相同，因为与参考CDR相比，所包括的CDR内的1-5个氨基酸是缺失的、添加的或经取代的，但是所包括的CDR具有其他方面与参考CDR相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本上相同，因为与参考CDR相比，所包括的CDR内的至少一个氨基酸是经取代的，但是所包括的CDR具有其他方面与参考CDR的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本上相同，因为与参考CDR相比，所包括的CDR内的1-5个氨基酸是缺失的、添加的或经取代的，但是所包括的CDR具有其他方面与参考CDR相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体药剂是或包含其氨基酸序列包括本领域技术人员公认为免疫球蛋白可变结构域的结构元件的多肽。在一些实施方案中，抗体药剂是具有与免疫球蛋白结合结构域同源或大部分同源的结合结构域的多肽蛋白。
小分子组合物。合成因子还包括有机分子，优选分子量大于50且小于约20,000道尔顿的小有机化合物。有用的合成因子通过例如筛选测定来鉴定，在筛选测定中测定了分子与一个或两个目标ECD的高亲和力结合。分子可以提供结合部分，该结合部分将与另一个结合部分连接，或者与如上文针对多肽药剂所描述的结合结构域连接。
候选合成因子包含与受体ECD进行结构相互作用，特别是氢键键合所必需的官能团，并且通常至少包括胺、羰基、羟基或羧基，优选至少两种化学官能团。候选合成因子常常包含被一个或多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构。在生物分子中也发现了候选药剂，包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合。
候选合成因子可从多种来源获得，包括合成或天然化合物文库。例如，许多方法可用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子，包括表达随机化寡核苷酸和寡肽。替代性地，可以获得或容易产生细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库。另外，天然或合成产生的文库和化合物易于通过常规的化学、物理和生物化学方法修饰，并且可用于产生组合文库。可以对已知的药理剂进行定向或随机化学修饰，诸如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，以产生结构类似物。可以从文库，诸如天然产物文库或组合文库中获得试验药剂。已经描述了许多不同类型的组合文库和用于制备此类文库的方法，包括例如PCT公布WO93/06121、WO 95/12608、WO 95/35503、WO 94/08051和WO95/30642，其各自通过引用并入本文。
在筛选测定是结合测定的情况下，可以使一种或多种分子连接到标签上，其中标签可以直接或间接提供可检测的信号。各种标签包括放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、特异性结合分子、颗粒(例如磁性颗粒)等。特异性结合分子包括诸如生物素和链霉亲和素、地高辛和抗地高辛等配对。对于特异性结合成员而言，通常将会根据已知程序用提供检测的分子标记互补成员。
筛选测定中可包括多种其他试剂。这些包括如盐、中性蛋白质(例如白蛋白)、洗涤剂等试剂，这些试剂用于促进最佳蛋白质-蛋白质结合和/或减少非特异性或背景相互作用。可以使用提高测定效率的试剂，诸如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物剂等。组分的混合物以任何提供必要结合的顺序添加。在任何合适的温度下进行孵育，通常在4至40℃之间。选择孵育周期以获得最佳活性，但也可以优化孵育周期以促进快速的高通量筛选。通常0.1至1小时就足够了。
可以通过筛选能够与目标受体多肽结合的化合物来进行初步筛选。结合测定通常涉及使受体ECD与一种或多种试验化合物接触，并且使蛋白质和试验化合物有足够的时间形成结合复合物。形成的任何结合复合物均可以使用许多已建立的分析技术中的任何一种来检测。蛋白质结合测定包括但不限于测量共沉淀、非变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的共迁移和蛋白质印迹上的共迁移的方法(参见，例如Bennet,J.P.和Yamamura,H.I.(1985)"Neurotransmitter,Hormone or Drug Receptor Binding Methods,"在NeurotransmitterReceptor Binding中(Yamamura,H.I.等人编辑)，第61-89页。
某些筛选方法涉及筛选调节信号传导活性的化合物。此类方法可以涉及进行基于细胞的测定，在该测定中使试验化合物与一种或多种细胞接触，表达然后检测响应基因表达的增加，检测各种衔接蛋白Jak、STAT等的变化。
可以将表达或活性的水平与基线值进行比较。如上所述，基线值可以是对照样品的值或代表对照群体的表达水平的统计值。也可以测定不表达受体的细胞的表达水平作为阴性对照。此类细胞另外通常基本上与试验细胞在遗传上相同。可以进行各种对照以确保观测到的活性是真实的，包括用缺乏报告基因构建体的细胞进行并行反应或不使携带报告基因构建体的细胞与试验化合物接触。还可以如下所述进一步验证化合物。
可以进一步测试最初通过任何前述筛选方法鉴定的化合物以验证表观活性。此类方法的基本形式涉及将初始筛选期间鉴定的先导化合物施用给动物或用作人类模型的细胞培养模型。验证研究中使用的动物模型通常是哺乳动物。合适动物的具体实例包括但不限于灵长类动物、小鼠和大鼠。
通过本文描述的筛选方法鉴定的活性试验药剂可以用作合成类似化合物的先导化合物。通常，将类似化合物合成为具有类似于先导化合物的电子构型和分子构象。可以通过使用诸如自洽场(SCF)分析、构型相互作用(CI)分析和正常模式动力学分析的技术来进行类似化合物的鉴定。可以使用用于实现这些技术的计算机程序。参见，例如，Rein等人，(1989)Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions(Alan Liss,New York)。
药物组合物
对于治疗应用，合成因子以生理学上可接受的剂型施用给哺乳动物(优选人)，所述剂型包括可以作为团注静脉施用给人或通过在一段时间内连续输注施用给人的那些剂型。替代性施用途径包括局部、肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。合成因子也适合通过肿瘤内、肿瘤周围、病灶内或病灶周围途径施用，或向淋巴施用，以发挥局部和全身治疗效果。
药物组合物还可包含本发明的分子与细胞的组合，所述细胞包括干细胞、祖细胞、免疫效应细胞等。在此类组合中，可以在使用前将细胞用本发明的分子预处理，例如用合成因子离体处理免疫效应细胞；细胞可以与本发明的分子一起在单独或组合调配物中同时施用；可以在用本发明的分子处理之前将细胞提供给个体，等等。
根据所需的调配物，药物组合物可包括药学上可接受的无毒稀释剂载体，其定义为通常用于配制用于动物或人类施用的药物组合物的媒介物。选择稀释剂以便不影响所述组合的生物活性。此类稀释剂的实例是蒸馏水、缓冲水、生理盐水、PBS、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克氏溶液(Hank's solution)。另外，药物组合物或调配物可包括其他载体、佐剂或无毒的非治疗性、非免疫原性稳定剂、赋形剂等。该组合物还可以包含接近生理条件的其他物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、润湿剂和洗涤剂。
该组合物还可包含任何各种稳定剂，例如抗氧化剂。当药物组合物包含多肽时，该多肽可以与各种公知的化合物络合，所述化合物增强多肽的体内稳定性，或以其他方式增强其药理学特性(例如，增加多肽的半衰期，降低其毒性，增强溶解度或摄取量)。此类修饰或络合剂的实例包括硫酸盐、葡糖酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐。组合物的多肽也可以与增强其体内属性的分子络合。此类分子包括，例如碳水化合物、聚胺、氨基酸、其他肽、离子(例如钠、钾、钙、镁、锰)和脂质。
关于适合各种施用类型的调配物的进一步指导可以在Remington'sPharmaceutical Sciences,Mace Publishing Company,Philadelphia,Pa.，第17版(1985)中找到。关于药物递送方法的简要综述，参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)。
可以施用药物组合物用于预防性和/或治疗性治疗。活性成分的毒性和治疗功效可在细胞培养物或实验动物中根据标准制药程序测定，包括例如测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比为治疗指数，并且它可以表示为LD50/ED50比率。优选表现出较大治疗指数的化合物。
从细胞培养和/或动物研究中获得的数据可用于配制用于人类的一系列剂量。活性成分的剂量通常在包括具有低毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可在该范围内变化，这取决于所采用的剂型和利用的施用途径。
对于口服施用，活性成分可以呈固体剂型施用，诸如胶囊、片剂和粉剂，或呈液体剂型施用，诸如酏剂、糖浆和混悬液。活性成分可与非活性成分和粉状载体一起包封在明胶胶囊中，粉状载体诸如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石粉、碳酸镁。可添加以提供所需颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散度或其他已知所需特征的其他非活性成分的实例是红氧化铁、硅胶、十二烷基硫酸钠、二氧化钛和可食用白墨。类似的稀释剂可用于制备压缩片剂。片剂和胶囊均可制成持续释放产品，以在数小时内提供药物的连续释放。压缩片剂可以有糖衣或薄膜包衣以掩盖任何令人不愉快的味道并保护片剂免受大气影响，或有肠溶包衣以在胃肠道中选择性崩解。用于口服施用的液体剂型可含有着色剂和调味剂以增加患者接受度。
单独的或与其他合适组分组合的活性成分可以制成要通过吸入施用的气溶胶调配物(即，它们可以“雾化”)。可以将气溶胶调配物置于加压的可接受推进剂，诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气中。
适于肠胃外，诸如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径施用的调配物，包括水性和非水性等渗无菌注射液，这些无菌注射液可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂以及使调配物与预期受者的血液等渗的溶质，并且所述调配物包括水性和非水性无菌混悬液，这些混悬液可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。
用于配制药物组合物的组分优选具有高纯度并且基本上不含潜在有害的污染物(例如，至少为国家食品(NF)级，通常至少为分析级，更通常至少为药用级)。而且，预期供体内使用的组合物通常是无菌的。在给定化合物必须在使用之前合成的意义上说，所得产物通常基本上不含在合成或纯化过程中可能存在的任何潜在毒性剂，特别是任何内毒素。用于肠胃外施用的组合物也是无菌的，基本上等渗并且是在GMP条件下制备的。
要给予特定患者的治疗组合物的有效量将取决于多种因素，其中几种因素将因患者而异。可以例如以单位剂量提供调配物。称职的临床医生将能够确定要施用给患者的治疗剂的有效量。合成因子的剂量将取决于治疗、施用途径、治疗剂的性质、疾病对治疗剂的敏感性等。利用LD50动物数据和其他可用信息，临床医生可以根据施用途径确定个体的最大安全剂量。从身体快速清除的组合物可以较高剂量或以重复剂量施用以维持治疗浓度。利用普通技术，称职的临床医生将能够在常规临床试验过程中优化特定治疗或成像组合物的剂量。通常，剂量为每千克受试者体重0.001至100毫克药剂。
可以不止一次向受试者施用组合物。对于治疗组合物，有时需要有规律地定期施用(例如每2-3天)，或者可能需要有规律地定期施用以降低毒性。对于将用于重复剂量方案中的治疗组合物，优选不引起免疫响应的部分。
在本发明的另一个实施方案中，提供了含有可用于治疗本文所述病状的材料的制品。该制品包括容器和标签。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可由多种材料形成，诸如玻璃或塑料。容器容纳治疗病状有效的组合物并且可以具有无菌接入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有皮下注射针头可刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂是合成因子。容器上或随附容器的标签表明该组合物用于治疗选择的病状。可以为制品提供其他容器，其可以容纳例如药学上可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。制品还可包括从商业和使用者角度来看合乎需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器以及含使用说明的包装说明书。
如本文所用，术语“治疗有效量”意指当根据治疗剂给药方案施用给患有或易患疾病、病症和/或病状的群体时，足以治疗所述疾病、病症和/或病状的量。在一些实施方案中，治疗有效量是降低疾病、病症和/或病状的一种或多种症状的发病率和/或严重程度，稳定其一种或多种特征和/或延迟其发作的量。本领域的普通技术人员将认识到，术语“治疗有效量”实际上不需要在特定个体中实现成功治疗。相反，治疗有效量可以是当施用给需要此类治疗的患者时在相当数量的受试者中提供了特定所需药理学响应的量。
例如，在一些实施方案中，术语“治疗有效量”是指当在本发明疗法的背景下施用给有需要的个体时，将会阻断、稳定、减弱或逆转在所述个体中发生的疾病过程的量。
使用方法
合成因子可用于预防和治疗目的。因此，如本文所用，术语“治疗”用于指疾病的预防和预先存在的病状的治疗。在某些情况下，预防指在被鉴定为有发展疾病或病状的风险的患者中抑制或延迟疾病或病状的发作。对持续性疾病的治疗，以稳定或改善患者的临床症状，是本发明所提供的特别重要的益处。期望在受影响组织中丧失功能之前进行此类治疗；因此，本发明所提供的预防性治疗益处也很重要。疗效的证据可以是疾病严重程度的任何降低。疗效可以根据临床结果来测量，或者可以通过免疫学或生物化学试验来测定。进行治疗的患者可以是哺乳动物，例如灵长类动物，包括人，可以是实验动物，例如兔子、大鼠、小鼠等，特别是针对疗法的评估而言，是马、狗、猫、农场动物等。
治疗调配物(例如药物组合物)的剂量可以广泛变化，这取决于病状的性质、施用频率、施用方式、药剂从宿主中的清除等。在特定实施方案中，初始剂量可以较大，接着是较小的维持剂量。在某些实施方案中，剂量可以每周或每两周一次不频繁地施用，或更经常分成较小剂量并且每天、每半周一次或根据需要以其他方式施用以维持有效剂量水平。
在本发明的一些实施方案中，通过局部施用来进行包含合成因子的组合物或调配物的施用。如本文所用，局限性施用可以指局部施用，但也指在治疗部位注射或以其他方式引入体内。此类施用的实例包括肌肉内注射、皮下注射、腹膜内注射等。在其他实施方案中，包含合成因子的组合物或调配物全身施用，例如口服或静脉内施用。在一个实施方案中，包含合成因子的组合物或调配物通过输注施用，例如在一段时间，例如10分钟、20分钟、3分钟、1小时、2小时、3小时、4小时或更长时间内连续输注。
在本发明的一些实施方案中，组合物或调配物在短期内施用，例如单次施用，或在例如1、2、3天或更多天，最多1或2周内进行一系列施用，以便获得快速、显著的活性增加。施用剂量的大小必须由医师确定，并且将取决于许多因素，诸如疾病的性质和严重性、患者的年龄和健康状况以及患者对药物本身的耐受性。
在本发明的某些方法中，将有效量的包含合成因子的组合物提供给细胞，例如通过使细胞与有效量的该组合物接触以达到所需效果，例如增强信号传导、扩散等。在特定实施方案中，接触在体外、离体或体内进行。在特定实施方案中，细胞源自或存在于需要增加信号传导的受试者中。
在本发明的一些方法中，提供有效量的主题组合物以增强细胞中的信号传导。从生物化学上来说，合成因子的有效量或有效剂量是使细胞中的信号传导相对于不存在合成因子时的信号传导增加至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的量。细胞活性的调节量可以通过生物学领域的普通技术人员已知的多种方式确定。
在临床意义上，合成因子组合物的有效剂量是向受试者施用一段合适的时间，例如至少约一周，可能约两周或更长时间，最多约4周、8周或更长时间时，将会在与缺乏信号传导相关的症状方面显示出改变的剂量。在一些实施方案中，有效剂量不但会减缓或停止疾病状况的进展，而且还会诱导病状逆转。本领域技术人员将理解，可以施用初始剂量持续此类时间段，接着施用维持剂量，在一些情况下，维持剂量将是减少的剂量。
待施用的合成因子组合物的有效量或有效剂量的计算在本领域普通技术人员的技术范围内，并且对于本领域技术人员而言将是常规的。不用说，最终施用量将取决于施用途径和待治疗的病症或病状的性质。
适合用于主题方法的细胞是包含一种或多种受体的细胞。待接触的细胞可以在体外，即在培养物中，或者它们可以在体内，即在受试者体内。细胞可以来自/处于任何生物体中，但优选来自哺乳动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园、实验室或宠物动物，诸如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔子、大鼠、小鼠、青蛙、斑马鱼、果蝇，蠕虫等。优选地，哺乳动物是人。细胞可以来自任何组织。细胞可以是冷冻的，或者可以是新鲜的。它们可以是原代细胞，或者可以是细胞系。细胞通常是体内使用的原代细胞，或在引入受者体内之前离体处理的原代细胞。
可以通过本领域许多公知方法中的任何一种使体外细胞与包含合成因子的组合物接触。例如，可以将组合物提供给正在培养主题细胞的培养基中的细胞。可以将编码合成因子的核酸在载体上在本领域公知的促进其摄取的条件(例如电穿孔、氯化钙转染和脂质转染)下提供给主题细胞或与主题细胞共培养的细胞。替代性地，可以通过病毒将编码合成因子的核酸提供给主题细胞或与主题细胞共培养的细胞，即使细胞与包含编码肽合成因子多肽的核酸的病毒颗粒接触。逆转录病毒，例如慢病毒，特别适于本发明的方法，因为它们可用于转染非分裂细胞(参见，例如，Uchida等人(1998)P.N.A.S.95(20):11939-44)。常用的逆转录病毒载体是“有缺陷的”，即不能产生生产性感染所需的病毒蛋白。相反，载体的复制需要在包装细胞系中生长。
同样，可以通过本领域中用于向受试者施用肽、小分子或核酸的许多公知方法中的任何一种使体内细胞与主题合成因子组合物接触。可以将合成因子组合物掺入各种调配物或药物组合物中，在一些实施方案中，将在不存在洗涤剂、脂质体等的情况下配制调配物或药物组合物，如已经针对全长蛋白的配制所描述的那样。
在一些实施方案中，施用本发明的化合物用于治疗患病或受损组织，用于组织再生和用于细胞生长和增殖，和/或用于组织工程化。具体而言，本发明提供了wnt合成因子或包含一种或多种根据本发明的合成因子的组合物，用于治疗由于衰老、创伤、感染或其他病理状况引起的组织损失或损伤。
在一些实施方案中，合成因子作用于免疫效应细胞，并调节免疫响应。例如，可以靶向涉及炎症性疾病的途径。炎症是免疫系统对感染或组织损伤作出响应的过程。炎症性疾病是由免疫系统的激活引起的，免疫系统的激活在没有感染或组织损伤的情况下，或者在引起疾患的响应水平上引起疾患。炎症性疾病包括自身免疫性疾病，自身免疫性疾病是由免疫引起的，在身体的健康细胞和/或组织中错误定向的任何疾病。自身免疫性疾病的特征在于T和B淋巴细胞异常靶向自身蛋白、多肽、肽和/或其他自身分子，导致身体内的器官、组织或细胞类型(例如，胰腺、脑、甲状腺或胃肠道)的损伤和/或功能障碍而引起疾病的临床表现。自身免疫性疾病包括影响特定组织的疾病以及可以影响多种组织的疾病，这部分取决于响应是针对限于特定组织的抗原还是广泛分布于体内的抗原。
免疫系统采用高度复杂的机制，该机制旨在产生响应以保护哺乳动物免受各种外来病原体的侵害，而同时防止对自身抗原的响应。除了决定是否起响应(抗原特异性)外，免疫系统还必须选择合适的效应子功能来处理每种病原体(效应子特异性)。目标炎症性疾病包括但不限于继发进展型多发性硬化(SPMS)；原发进展型多发性硬化(PPMS)；视神经脊髓炎(NMO)；银屑病；全身性红斑狼疮(SLE)；溃疡性结肠炎；克罗恩病(Crohn's Disease)；强直性脊柱炎(参见，例如，Mei等人(2011)Clin.Rheumatol.30:269-273；1型(IDDM)；哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；慢性肝炎；肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)；阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)；帕金森病(Parkinson’s Disease)；额颞叶变性(FTLD)；动脉粥样硬化/心血管疾病和肥胖/代谢综合征。
在其他实施方案中，合成因子激活免疫效应细胞以治疗癌症，或激活诱导癌细胞死亡或减少癌细胞生长的途径。如本文所用，术语“癌症”是指由异常、不受控制的细胞生长所引起的多种病状。能够引起癌症的细胞，称为“癌细胞”，具有特征性质，诸如不受控制的增殖、永生、转移潜能、快速生长和增殖速率，和/或某些典型的形态特征。可以以许多方式中的任何一种来检测癌症，包括但不限于检测一种肿瘤或多种肿瘤的存在(例如，通过临床或放射学手段)，检查肿瘤内或来自另一生物样品(例如，来自组织活检)的细胞，测量指示癌症的血液标志物，以及检测指示癌症的基因型。然而，一种或多种上述检测方法的阴性结果不一定表明不存在癌症，例如，已经对癌症治疗表现出完全响应的患者可能仍然患有癌症，如后续复发所证明的那样。
如本文所用的术语“癌症”包括癌，(例如，原位癌、浸润性癌、转移癌)和恶变前病状，即与其组织学起源无关的新生形变化。术语“癌症”不限于受影响组织或细胞聚集的任何阶段、等级、组织形态学特征、浸润性、侵袭性或恶性。具体而言，包括0期癌症、I期癌症、II期癌症、III期癌症、IV期癌症、I级癌症、II级癌症、III级癌症、恶性癌症和原发性癌。
可以治疗的癌症和癌细胞包括但不限于：血液学癌症，包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，以及实体癌，包括例如脑肿瘤(成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤)、癌(例如肺癌、肝癌、甲状腺癌、骨癌、肾上腺癌、脾脏癌、肾癌、淋巴结癌、小肠癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、乳房癌、子宫内膜癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、皮肤癌、头颈癌和食道癌)。
本发明的合成因子还在非治疗方法，例如体外研究方法中具有广泛的应用。合成因子可以直接施用至体内细胞，经口服、静脉内或通过本领域已知的其他方法施用给患者，或施用至离体细胞。在将本发明的合成因子施用至离体细胞的一些实施方案中，可以在施用合成因子之前、之后或期间将这些细胞移植到患者体内。
现在全面描述了本发明，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下可以进行各种变化和修改。
实验
合成因子：通过非天然受体二聚体迫使信号传导的合成细胞因子和生长因子激动剂
细胞因子和生长因子配体通常经由JAK/TYK或RTK介导的反式磷酸化通过同源或异源二聚体细胞表面受体进行信号传导。然而，在自然界中发生的此类受体配对的数量限于由我们的基因组内编码的内源性配体驱动的那些。我们已经工程化了合成细胞因子(合成因子)，其驱动不是由内源细胞因子所形成的细胞因子受体配对的形成，并且激活不同的信号传导程序。我们证实，广泛的非天然细胞因子受体异源二聚体能够进行信号传导。我们工程化的合成因子组装并非自然存在的IL-2Rβ/IL-4Rα或IL-4Rα/IFNAR2受体异源二聚体，触发与天然IL-2、IL-4和IFN细胞因子激活的信号传导和功能响应不同的信号传导和功能响应。此外，用受体酪氨酸激酶(RTK)使JAK/STAT细胞因子受体二聚化的杂合合成因子配体也引发信号传导输出。合成因子代表一个新的合成“孤儿”配体家族，以开拓人类基因组内编码的二聚体信号传导受体的完整组合范围。
对于JAK/STAT细胞因子受体，先前已在几个系统中证实，其中细胞因子受体的细胞外结构域(ECD)已融合到无关受体的细胞内结构域(ICD)上的经遗传修饰的嵌合受体以配体依赖性方式激活信号传导。然而，为了使这个概念在实践上有用，需要可选配内源性受体并在未修饰的细胞和组织上组装非天然二聚体的可溶性配体。这可以通过驱动不是由天然内源细胞因子形成的细胞因子受体对的形成的合成细胞因子或合成因子来实现。
与基因组编码的细胞因子相比，合成因子可以激活新的信号传导程序并引发独特的免疫调节活性，从而提供具有新功能的几乎无限的配体供给。先前的研究已经报道了细胞因子变体的工程化，细胞因子变体通过使两个细胞因子经由多肽接头进行遗传融合来促进新的活性，从而产生天然受体信号传导二聚体的二聚体。对这种方法的一个重要声明是两个连接的细胞因子本身是完全有活性的，并且产生两个天然细胞因子信号传导二聚体的加和性组合。因此，它们可以在仅表达一对同源受体的细胞中以及在表达由两个细胞因子接合的四个受体亚基的细胞中激活信号传导，从而产生混合表型。因此，这些连接的配体表现出差异性活性的分子基础尚不清楚。
工程化在响应细胞表面以典型的分子限定的1:1化学计量二聚化两种不同细胞因子受体的细胞因子配体(合成因子)，提供了将会产生独特的而非加和性的信号传导输出的替代方法。形成限定的二聚体复合物，如由基因组编码的细胞因子形成的复合物，允许精确机械地洞察引发由这些配体参与的新信号传导程序和活性的信号传导复合物的性质。由合成因子引发的信号传导将比连接的细胞因子更均匀和更有靶向性，从而降低了由脱靶效应引起的多效性和潜在毒性。合成因子方法允许人们探索非天然细胞因子受体对并确定它们是否激活信号传导。
为了探索这一观点的普遍性，我们使用正交细胞外结构域作为与细胞因子受体细胞内结构域融合的共同二聚化单元，表达并表征嵌合细胞因子受体对的10×10矩阵，从而允许评价100种不同细胞因子受体二聚体的信号传导。在该嵌合受体矩阵中取样的大多数细胞因子受体对都激活了信号传导。在第二步中，我们将两种拮抗剂形式的IL-2、IL-4和干扰素(IFN)与多肽接头基因融合，以工程化使细胞表面上的非天然细胞因子受体对二聚化的合成因子。用工程化合成因子刺激细胞系和外周血单核细胞(PBMC)显示出与亲本细胞因子不同的信号传导和细胞特征。
我们将合成因子概念扩展为二聚化c-kit(一种酪氨酸激酶受体)和血小板生成素受体(TpoR)(一种JAK/STAT细胞因子受体)，这样产生可测量的信号传导输出，其在性质上不同于它们各自的内源性配体所诱导的信号传导输出。我们的结果证明了这一概念，即非天然JAK/STAT和RTK受体对的二聚化是产生新的信号传导程序和活性的可行方法，可以探索新的信号传导程序和活性的功能性结果，就好像它们是新发现的孤儿细胞因子配体一样。
由嵌合细胞因子受体诱导的信号激活。首先我们希望确定大量强制性非天然细胞因子受体二聚体之间JAK/STAT串扰的潜力(图1A)。我们产生了一系列嵌合受体，其中IL-1受体(IL-1R1和IL-1R1Acp)的细胞外结构域(ECD)与十种不同细胞因子受体的跨膜(TM)和细胞内结构域(ICD)融合，产生可能受体对组合的10·10矩阵(图1B)。我们使用IL-1系统有两个原因：1)IL-1以非常高的亲和力与其受体结合，即使在低受体表达水平下也允许进行信号激活；和2)IL-1不通过经典JAK/STAT途径进行信号传导，消除了由内源性IL-1受体二聚化产生的本底活性。表达所有JAK和除STAT4之外的STAT的Jurkat细胞用指定嵌合受体的组合进行电穿孔，并通过流式细胞术分析IL-1R1和IL-1R1Acp表面表达(图2D)，并通过蛋白质印迹分析IL-1依赖性信号激活(图2A和图2E)。
虽然大多数IL-1受体组合表现出稳健的细胞表面表达，但对于一些受体对而言检测到极低水平的表达，但是这并不显著影响对IL-1刺激引起的信号传导的检测(图2E)。图2A中呈现了描绘六种STAT的磷酸化的二元热图。红色方块表示信号传导，黑色方块表示无信号传导。正如所预期的，由于在Jurkat细胞中STAT2表达低和缺乏STAT4表达，STAT2和STAT4未被任何受体组合激活(图2A)。STAT1和STAT6蛋白仅分别由含有IFNAR2和IL-4Rα的嵌合受体对激活，与IFN及IL-4和IL-13细胞因子对这两种STAT的特异性激活一致(图2A)。
相反，STAT3和STAT5蛋白受许多嵌合受体对组合激活，与细胞因子对这两种STAT的更多效性使用一致(图2A)。虽然大多数受体对组合激活了信号传导，但我们也发现了尽管表面表达稳健，也并未诱导生产性信号传导的受体对(图2D)，诸如IL-2Rβ同源二聚体和IL-13Rα1同源二聚体(图2A和图2E)。总体而言，我们的数据显示测试的大多数受体二聚体组合激活了STAT蛋白，揭示了细胞因子-细胞因子受体系统的高可塑性。
通过JAK2/JAK3细胞因子受体对实现的信号激活。我们的嵌合受体研究的一个惊人观测结果是，嵌合受体组合配对JAK2和JAK3(即促红细胞生成素受体(EpoR)/γc和IL-23R/γc)不能激活信号传导。有趣的是，在自然界中没有发现JAK2/JAK3配对，这提出了下述问题，缺乏该配对导致的信号激活是否可能是由于这两种激酶分子之间的将会防止交叉激活的空间碰撞或不相容的几何结构而引起的。
为了验证这一假设，我们在EpoR的近膜结构域中插入了丙氨酸残基，已证实这会通过改变受体近膜区的成行来调节信号传导。具体地说，在EpoR ICD上的R251之后插入1至4个丙氨酸(图2B)。将这些EpoR突变体与IL-1R1 ECD融合，并在Jurkat细胞中用IL-1R1Acp-IFNAR2(阳性对照)或IL-1R1Acp-γc共转染(图2F)。在EpoR的近膜结构域中插入一个、三个或四个丙氨酸不影响其与IFNAR2配对时的信号传导能力，但插入两个丙氨酸阻止了该受体对的信号传导(图2C)。在EpoR的近膜结构域中插入一个或三个丙氨酸并未恢复EpoR/γc(JAK2/JAK3)受体对的信号传导，插入四个丙氨酸或多或少恢复了信号传导，并且插入两个丙氨酸使该受体对的信号活性完全恢复(图2C)。
这些结果表明JAK2和JAK3之间存在结构限制，这种结构限制阻止这两种激酶在我们的嵌合受体系统中触发信号传导。然而，该实验清楚地表明，使用JAK2和JAK3改变非天然受体对中的配体-受体几何结构是恢复信号传导的可行选择。
先前我们已经证实，用合成因子配体改变EpoR的二聚体几何结构会导致差异性信号传导输出，所以合成因子也可以利用该参数。除JAK2/JAK3配对外，我们还观测到不能激活信号传导的其他嵌合受体对。我们询问是否在近膜结构域中插入丙氨酸也会恢复这些受体进行的信号传导。在IL-2Rβ、IL-12Rβ和EpoR的近膜结构域中插入丙氨酸并未恢复IL-2Rβ-IL-2Rβ、IL-12Rβ-IL-23R和EpoR-EpoR对进行的信号传导(图2G)。
引人注目的是，IL-12Rβ-IL-23R和EpoR-EpoR对分别代表IL-23和EPO接合的受体二聚体。我们认为最有可能IL-1受体细胞外取向和接近度对某些天然和非天然细胞因子受体对不利。这是我们使用的嵌合受体策略的技术限制，并且一些配对的信号传导的缺乏不是由于特定JAK/TYK/STAT组合本身不能起作用而引起的。嵌合IL-1受体实验的集中结果是，许多(如果不是大多数)非天然细胞因子受体对可以通过一个或多个STAT进行信号传导，但某些对将具有必需的不同的二聚体取向和接近度，这将取决于合成因子。
由合成因子诱导的信号激活图谱。我们希望探索合成因子对非天然细胞因子受体对的二聚化是否会激活未修饰细胞中的信号传导(图3A)。我们使用双特异性策略，其中我们将两个细胞因子融合在一起，每个细胞因子只能与其两种受体中的一种结合，从而产生限定的1:1受体二聚体。为了实现这种方法，我们工程化了IL-4、IL-2和IFN的拮抗剂或“显性负性(DN)”形式，这些形式保持与其高亲和力受体亚基(对于IL-4而言为IL-4Rα，对于IL-2而言为IL-2Rβ，并且对于IFN而言为IFNAR2)的结合，但为此而破坏了与其低亲和力受体亚基(对于IL-4而言为L-13Rα1和γc，对于IL-2而言为γc，并且对于IFN而言为IFNAR1)的结合。这些“DN”细胞因子起到高亲和力结合模块的作用，它们本身没有信号传导活性。正如预期的那样，野生型细胞因子激活Hut78 T细胞系中的信号传导(图3B)，但显性负性突变体不能促进指定Super-2，其对IL-2Rβ受体亚基具有增强200倍的亲和力(图3B)。
然后我们将显性负性细胞因子突变体对经Gly4/Ser接头遗传融合，以产生诱导IL-2Rβ-IL-4Rα和IL-4Rα-IFNAR2非天然受体二聚体形成的新配体(图3A)。当添加到未修饰的细胞系中时，这些双特异性DN合成因子激活的信号传导图谱在性质和量上不同于由亲本细胞因子诱导的信号传导图谱(图3D)。
用促进IFNAR2和IL-4Rα二聚化的SY1 SL刺激Hut78细胞，引起STAT5和STAT6激活(图3D)。值得注意的是，将连接这两种显性负性蛋白的多肽接头延长10个残基(SY1LL)增加了该合成因子所表现出的信号传导效力(图3D)。用使IL-2Rβ和IL-4Rα二聚化的SY2合成因子刺激Hut78细胞，引起STAT1激活和较弱的STAT3、STAT5和STAT6激活(图3D)。在所有情况下，合成因子引起的最大响应(Emax)都显著低于由基因组编码的细胞因子所激活的那些。
重要的是，由合成因子激活的不同信号传导程序不仅仅是来自两种亲本细胞因子的加和效应的结果，因为通过同时添加亲本细胞因子对所诱导的信号传导程序与由相应合成因子所诱导的信号传导程序不同(图3E)。为了确定合成因子激活的信号传导程序是否与IL-2、IL-4和IFN激活的信号传导程序不同，我们在CD4+T细胞系Hut78中通过磷酸流式细胞术研究了120种不同信号传导分子的激活(图4)。在研究的120种分子中，有20种被配体激活。天然细胞因子图谱如预期的那样：Super-2强烈激活STAT5和PI3K途径(图4A和图4B)；IL-4刺激稳健诱导STAT6和PI3K途径激活(图4A和图4B)；以及IFN导致所有STAT分子的强烈激活(图4A和图4B)。
当用不同合成因子刺激Hut78细胞时，我们可以检测到这些工程化配体所参与的新信号传导程序。用SY1 LL(本文称为SY1)刺激强烈激活STAT5和STAT6，并且也在较低程度上刺激STAT1和STAT3(图4A和图4B)。另外，该合成因子诱导PI3K途径(即GSK3B、Akt、RPS6)的强烈激活(图4A)。SY2刺激导致总体上弱于其他配体的信号，优先激活STAT1(图4A和图4B)。而且，由细胞因子和合成因子引发的STAT激活比率显著不同，SY1表现出STAT5/STAT6偏好，并且SY2表现出STAT1偏好(图4C)。由基因组编码的细胞因子和合成因子引发的信号传导程序的主成分分析进一步证实，合成因子激活不同的信号传导程序，而不仅是亲本细胞因子参与的原始程序的子集(图4D)。
由合成因子诱导的细胞和信号传导特征。我们通过质谱流式细胞术(CyTOF)分析了从人PBMC进行谱分析的31个细胞群中对合成因子处理的响应(图5A和图5C)。天然细胞因子表现如预期的那样：Super-2强烈激活STAT5，并且也在较小程度上，激活STAT1、STAT3、Erk和S6R，表现出明显的T细胞偏好(图5A)；IL-4刺激产生STAT6的有效激活以及T细胞和单核细胞的同源信号传导轨迹，与IL-4Rα和γc受体亚基的普遍表达一致(图5A)。用IFN刺激促进STAT5和STAT6的强烈激活以及STAT1和STAT3的较弱激活，与先前的观测结果一致(图5A)。IFN诱导的STAT激活图谱作图至两个不同的细胞簇，其中T细胞诱导较强烈的STAT5和STAT6激活，并且B细胞和单核细胞表现出强烈的STAT6激活但是表现出弱的STAT5激活(图5A)。由合成因子引发的细胞信号传导模式与内源细胞因子引发的细胞信号传导模式不同(图5A)。SY1合成因子在T细胞中诱导强烈的STAT5激活，但未能激活NK、B细胞和单核细胞中的信号传导(图5A)。SY2合成因子引发在所有细胞群中研究的每种信号效应物的弱信号激活，对STAT1激活具有小的偏向(图5A)。
由合成因子诱导的细胞因子分泌图谱。在配体刺激后，细胞外环境中分泌的细胞因子水平通常用于定义由给定细胞因子产生的免疫响应的性质。我们研究了合成因子对比天然细胞因子诱导的细胞因子分泌特征。用IL-2、IL-4、IFN或合成因子刺激PBMC，并且在刺激24小时后通过基于珠粒的免疫测定测量63种不同分析物的水平(图5B)。Super-2和两种合成因子使细胞因子分泌增加，IFN具有中性作用，并且IL-4使PBMC分泌的细胞因子的量减少(图5B)。
更详细的数据分析揭示，正如预期的那样，用Super-2刺激PBMC促进高水平LIF、IL-13和IFNγ的分泌(图5B)。另外，Super-2导致PBMC分泌IL-22和CD40L(图5B)。此外，与先前的报道一致，IFN刺激诱导IL-27的分泌，而IL-4刺激导致静息PBMC分泌的细胞因子的下调，其中IFNγ是最有效的下调细胞因子(图5B)。两种合成因子的刺激图谱与天然细胞因子诱导的刺激图谱不同。SY1刺激诱导许多细胞因子的分泌：IL-17F、IL-27、IL-13、IL17A、IFNγ、BDNF、IL-23、FGFβ、PDGFBB和ENA78，并且SY2刺激导致边际水平的嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、BDNF和PDGFBB分泌(图5B)。
使RTK与JAK/STAT受体二聚化的合成因子激活信号传导。JAK/STAT细胞因子受体仅代表通过二聚化诱导的激酶激活进行信号传导的跨膜受体亚群。受体酪氨酸激酶(RTK)(例如EGFR[表皮生长因子受体]、c-Kit等)代表另一个大的二聚体细胞表面受体家族，这些二聚体细胞表面受体通过其细胞内激酶结构域的反式磷酸化进行信号传导。我们想知道我们是否可以将合成因子的范围扩展为包括将会迫使JAK/STAT细胞因子受体和RTK之间的异源二聚化和激活的分子。
为了评估JAK/STAT受体与RTK串扰的可能性，我们将表皮生长因子受体(EGFR)的TM和ICD与IL-1R1的ECD融合，并将该构建体与我们的一组IL-1R1AcP-细胞因子受体ICD一起在Jurkat细胞中转染(图6A和图6B)。所有10种细胞因子受体/EGFR配对在Jurkat细胞表面上表达(图6F)。用IL-1刺激导致不同程度的EGFR磷酸化，并且在较小程度上导致STAT3和STAT5蛋白的磷酸化(图6B)，证明这些细胞因子和酪氨酸激酶受体在通过强制接近而迫使时能够进行反式磷酸化。这与先前的研究一致，表明在天然细胞上可以发生此类串扰存在的实例。然而，对这些嵌合受体研究的一个声明是，激酶连接受体的过表达可导致异常的、假象磷酸化事件。因此，我们试图在没有过表达的情况下，使用合成因子配体，强制在天然细胞上正常表达的JAK/STAT和RTK介导的受体的异源二聚化。
我们产生了一种合成因子来迫使cKit(一种酪氨酸激酶受体)和血小板生成素受体(TpoR)(一种细胞因子受体)的二聚化。为了产生合成因子双特异性配体，我们鉴定了以高亲和力与cKit或TpoR ECD结合的抗体的序列。我们将它们重新格式化为单链可变片段(scFv)，并通过将每一个与互补的酸性和碱性亮氨酸拉链融合(图6C)并将其施加于已知会表达cKit和TpoR的急性巨核细胞白血病Mo7e细胞来强制其异源二聚化。SY4和SY5合成因子在Mo7e细胞中诱导高于本底的cKit适度磷酸化，但只有SY5诱导高于本底(尽管非常弱)的TpoR相关JAK2的可检测磷酸化(图6D)。SY5诱导可测量的Erk激活(与天然配体干细胞因子[SCF]相比50％Emax)但仅诱导弱的STAT5激活，这与cKit高于TpoR的表观不对称激活一致(图6E)。实际上，使用JAK2小分子抑制剂抑制JAK2导致SY5对Erk的激活丧失，表明这些合成因子参与的信号传导程序至少部分地依赖于JAK2活性(图6G)。因此，在TpoR/cKit异源二聚体内反式磷酸化的效率似乎存在不对称性。我们进行了基于高通量磷酸化流式细胞术的研究，以分析受刺激的Mo7e细胞中120种信号传导分子的信号传导响应。
如图7A所示，120种不同信号传导分子中有54种被不同配体激活高于显著性阈值。有趣的是，SY5引发的信号传导特征似乎会引起与SCF、TPO或这两种配体的组合在性质上不同的输出；这取决于所研究的途径效应物(图7B和图7C)。嵌合受体和合成因子研究共同显示，虽然与其天然配体相比效率低，但JAK/TYK和RTK介导的信号传导受体能够进行串扰，这与先前的研究一致，表明JAK和RTK组分能够使彼此的天然底物磷酸化。
在这项研究中，我们使用可以不精确地类推到“孤儿”或“合成因子”细胞因子的合成配体来扩展天然细胞上激酶连接的二聚体受体信号传导的范围。该方法可以利用JAK/TYK/STAT和RTK通过受体二聚体进行信号传导的完全组合潜力。我们探索这种方法的一个令人信服的理由是，尽管它们具有免疫治疗潜力，但相对较少的细胞因子在临床上是有用的，这在很大程度上是由于它们的多效性和脱靶效应。近年来，已经工程化了具有更明确的活性和降低的毒性的细胞因子变体。然而，这种方法的固有限制是工程化的细胞因子在亲本细胞因子所占据的生物活性空间内表现出一部分活性。
我们已经进行了一系列概念验证实验，以证实通过工程化使非天然细胞因子受体对二聚化的合成细胞因子(合成因子)可以实现不同信号传导程序的激活并且引申开来，可以实现免疫活性的激活。合成因子可以利用细胞因子受体配对的高可塑性以引发新的信号传导活性，为“设计者”配体特异性靶向与健康和疾病相关的生物过程铺平了道路。我们的数据显示合成因子激活不同的和新的信号传导程序并诱导受刺激的PBMC分泌新的细胞因子特征标记。
首先，虽然大多数合成因子引发部分类似于亲本细胞因子的信号的信号，但激活的STAT的比率在细胞因子和合成因子之间显著不同。例如，SY1引发STAT6>STAT5>STAT1>STAT3模式而不是用IL-4加上IFN所见到的STAT6>STAT1>STAT3>STAT5模式，而SY2引发STAT1>STAT6>STAT5>STAT3模式而不是用IL-4加上IL-2所见到的STAT6>STAT5>STAT3>STAT1模式。STAT激活比率的变化可以改变细胞因子诱导的生物响应。
其次，鉴于合成因子诱导非天然存在的细胞因子受体对的二聚化，它们还可以改变STAT异源二聚体的丰度并诱导新的STAT异源二聚体配对的形成，导致对全新基因表达程序和活性的诱导。可以在小鼠系统和疾病模型中测试合成因子生物学。
合成因子的生理作用的复杂程度将不亚于天然细胞因子，但了解用于形成非天然二聚体的亲本受体链的活性可以预测合成因子的活性。例如，我们预计在一些情况下，生理作用和疾病应用可能与亲本受体链之一的那些相似或相关，而在其他情况下则完全不同。
合成因子设计范例涵盖几个关键考虑因素：1)选择在相同细胞中同时表达的两种细胞因子受体亚基。对细胞因子的细胞响应受细胞因子受体亚基的表面表达模式的严格调控。因此，存在许多细胞因子受体对组合，尽管与信号传导相容，但由于缺乏同时表达两种受体亚基的自然存在的细胞亚群而不具有体内相关性。2)选择待通过合成因子二聚化的细胞因子受体亚基类型。从我们的嵌合受体研究中，我们推断大多数细胞因子受体对组合将在一定程度上激活信号传导。然而，诸如结构特性的其他参数可能影响信号传导激活的程度和性质。例如，细胞因子受体可以基于ICD长度细分为两类。具有长ICD的受体通常以高亲和力结合其配体，与JAK1或JAK2配对，编码STAT结合位点，并驱动信号激活。相反，具有短ICD的受体通常以较低的亲和力结合其配体，与TYK2或JAK3配对，并且最小程度地促成STAT募集和激活。
有趣的是，在我们的嵌合受体研究中并未激活信号传导的许多受体对包含短ICD受体，表明使两个短ICD受体亚基二聚化的合成因子将会引发比那些使长ICD受体亚基二聚化的细胞因子更弱且多样性更低的信号激活程序。另外，我们的结果显示，可以产生使来自两个不同细胞表面受体家族(特别是细胞因子受体和酪氨酸激酶受体家族)的受体二聚化的合成因子。
我们已经工程化的合成因子的一个非常重要的方面是它们使细胞因子受体对二聚化成限定的1:1分子实体，这使得能够将信号传导途径明确归因于受体二聚体。通过工程化配体形成分子限定的表面复合物对于表征由这些配体激活的信号传导和表型程序，以及对于预测由脱靶效应和/或细胞相互作用引起的潜在毒性至关重要。先前尝试通过连接全功能细胞因子来工程化具有新型活性的合成配体产生了可以形成多种独立作用的受体复合物的配体，受体复合物的范围从二聚体到四聚体，这取决于给定细胞类型表达的受体亚基的丰度和相对比率。虽然这些配体引发了新的生物活性程序，但它们形成的复合物的异质性使得很难将信号传导或活性特征分配给特定复合物或预测可能由全身性施用而引起的毒副作用。
相比之下，我们使用显性负性细胞因子突变体使表面受体二聚化的靶向方法允许我们查询特定二聚体对的活性。我们研究的一致结论是，与亲本基因组编码的细胞因子相比，工程化的合成因子在激活信号传导方面效率相对较低；我们最多可以检测到60％由IL-2、IL-4或IFN诱导的信号传导振幅。引起来自cKit/TpoR异源二聚体的信号传导的合成因子表现出甚至更弱的激活特性。
对该观测结果的一种解释是细胞因子-受体复合物的结构是信号效力的决定因素。可能由工程化合成因子诱导的受体结合拓扑结构是次优的，并且可以通过改变这些分子的构造来改善信号传导强度。
材料与方法
蛋白质表达和纯化。使用杆状病毒表达系统表达和纯化人IL-4、Super-2、IFN显性负性细胞因子和合成因子，如(Laporte等人，2005)中所述。在(Levin等人，2012)中提供了IL-2的Super-2变体的序列。通过使IL-4DN和IFNDN蛋白经由单个(SY1 SL)或两个(SY1 LL)Gly4Ser接头遗传融合而产生SY1 SL和LL合成因子。通过使IL-2DN和IL-4DN蛋白经由Gly4Ser接头遗传融合而产生SY2合成因子。通过在位点II上引入先前描述的R121D/Y124D突变产生IL-4DN，所述突变破坏了与常见γ链的结合(Wenzel S等人，The Lancet,2007)。通过在IFN-IFNAR1结合界面上引入突变F63A和R120E，破坏与IFNAR1的结合，产生IFNDN。IL-2DN(也称为IL-2RETR)先前在Mitra等人，Immunity,2015中进行了描述。用于工程化SY3、SY4和SY5的单链可变片段(scFv)通过将其可变区转移到具有N端gp67信号肽和C端六组氨酸标签的pAcGP67A载体(BD Biosciences)中在杆状病毒系统中类似地表达和纯化。表达其可变重(VH)链和可变轻(VL)链被与酸性或碱性亮氨酸拉链融合以进行二聚化的12-氨基酸(Gly4Ser)3接头分隔开的scFv。所有蛋白均含有C端六组氨酸标签，并通过镍色谱法分离，并在10mM HEPES(pH7.3)和150mM NaCl中平衡的Superdex 200柱(GE Healthcare)上通过尺寸排阻色谱法进一步纯化至均一性>98％。
嵌合受体产生。为了产生10x10信号传导矩阵，将10种不同亲本细胞因子受体的ICD与IL-1R1和IL-1R1Acp ECD融合。在IL-1R1 ECD形式中，将编码HA标签的核苷酸序列插入天然信号序列的末端与IL-1R1 ECD的第一残基之间。每个ICD均与IL-1R1序列的3'末端融合。除了使用V5标签外，以相同的方式克隆IL-1R1Acp嵌合体。使用SignalP和TMHMM网络服务器描画成熟蛋白和跨膜跨度的边界。用于IL-1R1的DNA序列经密码子优化以在作为生物体(jcat.de)的智人(Homo sapiens)中表达并合成(Integrated DNA Technologies)。使用NheI和KpnI限制性位点(NEB)将嵌合受体克隆到pcDNA3.1+载体(Invitrogen)中。
组织培养。将Jurkat细胞在DMEM完全培养基(补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素(Gibco)的DMEM培养基)中培养。将Hut78细胞在RPMI完全培养基(补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素(Gibco)的RPMI 1640培养基)中培养。将Mo7e细胞在IMEM完全培养基(补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、10nM GM-SCF和青霉素-链霉素(Gibco)的IMEM培养基)中培养。在刺激之前，将Mo7e细胞在缺乏FBS和GM-CSF的改良生长培养基中饥饿过夜。在37℃下将所有细胞系保持在含有5％CO2的潮湿气氛中。
Hut78和Mo7e细胞内信号传导研究。将每孔大约3·105Hut78或Mo7e细胞置于96孔板中，用PBSA缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.2，1％BSA)洗涤，并重新悬浮于含有指定配体的连续稀释液的PBSA中。将细胞在37℃下刺激规定的时间并立即通过添加甲醛至1.5％、接着在室温下孵育10分钟来固定。然后将细胞用100％冰冷的甲醇在4℃下透化30分钟。将固定和透化的细胞用PBSA洗涤两次，并与稀释于PBSA中的荧光22标记的检测抗体在室温下孵育1小时。pSTAT3、pSTAT5和pSTAT6抗体购自BD Biosciences。pSTAT1、pErk、pcKit、pEGFR抗体购自Cell Signaling Technology。然后将细胞在PBSA缓冲液中洗涤两次，并在Accuri C6流式细胞仪上定量平均荧光强度(MFI)。将剂量-响应曲线拟合至逻辑模型，并且在减去未刺激细胞的MFI并归一化至由野生型细胞因子刺激诱导的最大信号强度后，在GraphPad Prism数据分析软件中计算EC50值。
从人全血中分离外周血单核细胞(PBMC)。使用一个梯度的Ficoll-Paque Plus(GEHealthcare)，根据制造商的方案从人全血(Stanford Blood Bank)分离外周血单核细胞(PBMC)。将新鲜分离的PBMC用于质谱流式细胞术研究和基于珠粒的免疫测定。在刺激之前，将PBMC在37℃、5％CO2下在RPMI完全培养基中静置1小时。
质谱流式细胞术免疫细胞信号传导分析。该测定在斯坦福大学的人体免疫监测中心(Human Immune Monitoring Center)进行。将新鲜分离的PBMC按每孔5·105个细胞接种在96孔板中，并用指定配体在完全RPMI中的连续稀释液在37℃、5％CO2下刺激20分钟。然后在室温下通过在多聚甲醛(1.5％最终浓度)中孵育10分钟来固定细胞。洗涤细胞并在室温下使其重新悬浮于含有金属螯合聚合物标记的抗表面抗原抗体的CyFACS缓冲液(补充有2％BSA、2mM EDTA和0.1％叠氮化钠的PBS)中30分钟。将抗体从来自BD Biosciences、Biolegend或Cell Signaling Technology的纯化未缀合的、不含载体蛋白的原液中标记，并且聚合物和金属同位素来自DVS Sciences。将细胞在CyFACS缓冲液中洗涤一次，然后在-80℃下在甲醇中透化过夜。第二天，将细胞在CyFACS缓冲液中洗涤一次，并在室温下使其重新悬浮于含有金属螯合聚合物标记的抗细胞内抗原抗体的CyFACS缓冲液中30分钟。将细胞在PBS(磷酸盐缓冲盐水pH 7.2)中洗涤两次，重新悬浮于含铱的DNA嵌入剂(在PBS中1:200稀释，DVS Sciences)中并在冰上孵育20分钟。然后将细胞在MilliQ水中洗涤三次，然后以700μL的总体积稀释于MilliQ水中，然后注入CyTOF仪器(DVS Sciences)。使用FlowJo(CyTOF装置)通过基于来自嵌入剂的铱同位素对细胞进行门控，然后基于一种嵌入剂铱同位素相对于细胞长度的线图对完整单峰进行门控，接着进行细胞亚群特异性门控来进行数据分析。将每种条件的信号强度报告为第90个百分位强度减去未刺激的对照样品的强度。使用TM4微阵列软件套件(Dana-Farber Cancer Institute)(Saeed等人，2003)产生对每种处理的最大浓度的响应的热图，其中信号强度归一化至每种细胞类型中的最大信号效应物响应。进行两次独立的质谱流式细胞术实验重复，得到了类似的结果。
基于珠粒的免疫测定细胞因子分泌研究。该测定在斯坦福大学的人体免疫监测中心进行。在完全RPMI中在1μg/mL植物血凝素(PHA)的存在下，用所示配体刺激新鲜分离的PBMC(每孔1.5·105个)，并在37℃、5％CO2下孵育24小时。然后通过离心使细胞团块化，并使用平台(Luminex Corporation)收获上清液进行基于珠粒的免疫测定分析。人63-plex试剂盒购自eBiosciences/Affymetrix，并根据制造商的推荐，做如下所述的修改使用。简言之：将珠粒添加到96孔板中并在Biotek ELx405洗涤器中洗涤。将收获的上清液添加到含有混合抗体连接的珠粒的平板中，并在室温下孵育1小时，接着在4℃下振荡培养过夜。在定轨摇床上以500-600rpm进行低温和室温孵育步骤。过夜孵育后，将板在BiotekELx405洗涤器中洗涤，并添加生物素化检测抗体，在室温下边振荡保持75分钟。如上所述再次洗涤板并添加链霉亲和素-PE(Invitrogen)。在室温下孵育30分钟后，如上进行最后的洗涤，并向孔中添加读取缓冲液。在200仪器上对板进行分析，每个样品每种细胞因子的珠粒下限为50个。向所有孔中添加定制测定对照珠粒(Radix Biosolutions)。一式两份测量每个样品，并且从两次重复中取原始MFI的平均值。将结果呈现为相对于仅用PHA刺激的对照细胞，经处理细胞的MFI的倍数变化。
Primity Bio途径表型分型。用饱和浓度的所示配体刺激Hut78或Mo7e细胞15、60和120分钟，并在室温下用1％PFA固定10分钟。根据标准方案(Krutzik和Nolan，2003)制备固定的细胞用于抗体染色。简言之，将固定的细胞在90％甲醇中透化15分钟。然后用一组对指定标志物有特异性的抗体(Primity Bio Pathway Phenotyping service)对细胞染色，并在LSRII流式细胞仪(Becton Dickinson,San Jose,CA)上进行分析。计算受刺激样品的MFI除以未刺激对照样品的log2比率作为响应的量度。
蛋白质印迹分析。将细胞在1％NP-40裂解缓冲液中裂解，并将30μg蛋白如(Marijanovic等人，2007)中所述进行分析。使用以下多克隆抗体：抗磷酸Tyk2、抗磷酸STAT1；抗磷酸STAT2；抗磷酸STAT3；抗磷酸STAT4；抗磷酸STAT5；抗磷酸STAT6；抗磷酸EGFR；抗磷酸cKit pY703(Cell Signaling Technology,Beverly,MA)。用ECL增强的化学发光蛋白质印迹试剂即Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus(PerkinElmer)显示信号。
电穿孔。将15-20x106个维持在0.5-1.0·106个细胞/ml的密度的Jurkat细胞用RPMI培养基(无菌)洗涤两次，并使其重新悬浮于0.25ml的Ingenio电穿孔溶液(Mirusbio)中。将5-30μg DNA(不超过总体积的15％)添加到重新悬浮的Jurkat细胞中，并将混合物转移到4mm间隙比色皿(Invitrogen)中并在室温下孵育15-20分钟。将细胞在设定为0.28kV和960μF的Biorad电穿孔仪中进行电穿孔。电穿孔后，将细胞转移至预先温热的培养基(不含青霉素/链霉素)并正常培养。24小时后监测蛋白质表达。
细胞表面受体染色。如(Marijanovic等人，2007)所述，使用对HA和V5标签有特异性的荧光标记的单克隆抗体(Cell Signaling Technology)监测表面受体水平。将电穿孔的Jurkat细胞重新悬浮于含有3％胎牛血清的冷PBS中，并与指定抗体一起孵育1小时。在Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences)上分析样品。
实施例2
三聚合成因子
使用Gly/Ser多肽接头，将细胞因子(IL-2)与结合IL-4Rα的scFv(单价抗体)连接。这种新的分子实体与3种细胞因子受体多肽结合：γc、IL-2Rβ和IL-4Rα。三聚合成因子引发的信号传导特征不同于IL-2、IL-4或IL-2和IL-4处理的组合所激活的信号传导特征。另外，这种新的细胞因子诱导单核细胞分化为具有高吞噬活性的未表征的树突细胞亚群，如图8-15所示。在一些实施方案中，提供了新型合成因子的组合物。在一些实施方案中，在体外或体内使单核细胞群与有效剂量的三聚合成因子接触。在一些实施方案中，提供了用三聚合成因子由单核细胞分化的吞噬细胞群。
实施例3
使I型和III型IFN受体二聚化的合成因子。
产生包含IFNλR1结合序列(H11DN)和IFNAR1结合序列(IFNWDN2)的合成因子(SY6)。完整的合成因子序列在SEQ ID NO:1中提供。因此产生的合成因子是一种使IFNAR1和IFNλR1受体及其相应的JAK二聚化的杂合干扰素。如图15所示，SY6的磷酸-STAT1激活的Emax与I型IFN的Emax相等并且是III型IFN诱导的信号的两倍。误差棒表示±SEM(n＝3)。重要的是，如图15D所示，SY6有效诱导抗增殖作用，而I型IFN、III型IFN或I型和III型IFN组合处理无效。误差棒表示±SEM(n＝3)。在对I型和III型IFN都具有天然响应性的Hap1细胞中进行磷酸-STAT1信号传导和抗增殖测定。
同样重要的是要注意，I型和III型干扰素的组合不提供这种活性，除非在杂合多肽诸如SY6中连接。合成因子的活性和特异性提供了抗增殖和抗病毒活性的有效试剂，其提供了作用选择性并从而避免了I型干扰素的不良副作用。
实施例4
mIL4DN-mIFNβDN2合成因子
该合成因子(SY7)是通过使小鼠IL-4DN和mIFNβDN2蛋白经由Gly4Ser接头遗传融合而产生的。序列如图16所示。从C57BL/6小鼠的脾脏/LN中分离淋巴细胞，并用板结合的抗CD3(2.5μg/ml)+可溶性抗CD28(5μg/ml)激活48小时。然后将细胞在10IU/ml mIL2中静置过夜(O/N)，然后血清饥饿4小时，之后用指定的细胞因子/合成因子刺激20'。终止细胞信号传导并将细胞用PFA固定，用PermIII缓冲液(BD)透化并用磷酸STAT6(Y641)抗体(BD)染色。
表1
实验产生的合成因子
工程化了IL-4、IL-2和IFN的拮抗剂或“显性负性(DN)”形式，这些形式保持与其高亲和力受体亚基(对于IL-4而言为IL-4Rα，对于IL-2而言为IL-2Rβ，并且对于IFN而言为IFNAR2)的结合，但为此而破坏了与其低亲和力受体亚基(对于IL-4而言为L-13Rα1和γc，对于IL-2而言为γc，并且对于IFN而言为IFNAR1)的结合。这些“DN”细胞因子起到高亲和力结合模块的作用，它们本身没有信号传导活性。成对的显性负性细胞因子突变体经Gly4/Ser接头融合，以产生诱导IL-2Rβ-IL-4Rα和IL-4Rα-IFNAR2非天然受体二聚体形成的新配体，如上表针对SY1和SY2所示。通过在位点II上引入先前描述的R121D/Y124D突变产生IL-4DN，所述突变破坏了与常见γ链的结合(Wenzel S等人，The Lancet,2007)。通过经由在IFN-IFNAR1结合界面上引入突变F63A和R120E来破坏与IFNAR1的结合，从而产生IFNDN。IL-2DN(也称为IL-2RETR)先前在Mitra等人，Immunity,2015中进行了描述。
表达用于工程化SY3、SY4和SY5的单链可变片段(scFv)，其可变重(VH)链和可变轻(VL)链被与酸性或碱性亮氨酸拉链融合以进行二聚化的12-氨基酸(Gly4Ser)3接头分隔开。SY4和SY5构建体利用以高亲和力与cKit或TpoR ECD结合的抗体。我们将它们重新格式化为单链可变片段(scFv)，并通过使每一个与互补酸性和碱性亮氨酸拉链融合来强制其异源二聚化。
SY3蛋白使用Gly/Ser多肽接头，以将细胞因子(IL-2)与结合IL-4Rα的scFv(单价抗体)连接。这种新的分子实体与3种细胞因子受体多肽结合：γc、IL-2Rβ和IL-4Rα。
SY6序列作为SEQ ID NO:1提供，包含来自人IFNλ变体形式的残基1-163，在对应于参考人IFNλ3序列(Genbank参考XP_005258822.1)的Q26A、Q99A、H102A、H131R、T161A和V174E的残基处具有氨基酸取代，其中变体序列因缺失参考IFNλ3蛋白的残基1-11而被截短。残基164-168是gly/ser接头，并且残基169-342包含人IFNω的变体形式。
SY7序列作为SEQ ID NO:2提供，其中残基1-17是信号肽，残基18-138是mIL-4DN，在对应于Q116D和Y119D的残基处具有氨基酸取代，如图17所示；残基139-143是gly/ser接头；并且残基144-304对应于mIFNβDN2，在对应于R15A、L30A、R33A、R147A的残基处具有氨基酸取代。
序列表
<110> 小利兰•斯坦福大学托管委员会(The Board of Trustees-Leland StanfodJunior University)
伊格纳西奥•莫拉加•冈萨雷斯(Gonzalez, Ignacio Moraga)
凯南•克里斯多夫•加西亚 (Garcia, Kenan Christopher)
<120> 合成因子组合物及使用方法
<130> STAN-1402WO
<150> 62/479,993
<151> 2017-03-31
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 1
Ala Arg Gly Cys His Ile Ala Gln Phe Lys Ser Leu Ser Pro Ala Glu
1 5 10 15
Leu Gln Ala Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu
20 25 30
Leu Lys Asp Cys Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp
35 40 45
Leu Arg Gln Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu
50 55 60
Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro
65 70 75 80
Ala Leu Gly Asp Val Leu Asp Ala Pro Leu Ala Thr Leu His His Ile
85 90 95
Leu Ser Gln Leu Arg Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro
100 105 110
Arg Thr Arg Gly Arg Leu His Arg Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala
115 120 125
Pro Lys Lys Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn
130 135 140
Leu Phe Arg Leu Leu Ala Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala Ser Gly Asp
145 150 155 160
Leu Cys Glu Gly Ser Gly Ser Gly Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Asn
165 170 175
His Gly Leu Leu Ser Ala Asn Thr Leu Val Leu Leu His Gln Met Arg
180 185 190
Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys Ala Lys Asp Ala Arg Asp Phe Arg Phe
195 200 205
Pro Gln Glu Met Val Lys Gly Ser Gln Leu Gln Lys Ala His Val Met
210 215 220
Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Ser Leu Phe His Thr
225 230 235 240
Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gln Leu His
245 250 255
Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Gln His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gln
260 265 270
Val Val Gly Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Ser Pro Ala Leu
275 280 285
Thr Leu Arg Arg Tyr Phe Gln Gly Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys
290 295 300
Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Met Glu Ile Met Ala
305 310 315 320
Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gln Glu Arg Leu Arg Ser Lys Asp
325 330 335
Arg Asp Leu Gly Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His
340 345 350
<210> 2
<211> 313
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 2
Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Val Phe Ala
1 5 10 15
Gly Ser His Ile His Gly Cys Asp Lys Asn His Leu Arg Glu Ile Ile
20 25 30
Gly Ile Leu Asn Glu Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Cys Thr Glu Met
35 40 45
Asp Val Pro Asn Val Leu Thr Ala Thr Lys Asn Thr Thr Glu Ser Glu
50 55 60
Leu Val Cys Arg Ala Ser Lys Val Leu Arg Ile Phe Tyr Leu Lys His
65 70 75 80
Gly Lys Thr Pro Cys Leu Lys Lys Asn Ser Ser Val Leu Met Glu Leu
85 90 95
Gln Arg Leu Phe Arg Ala Phe Arg Cys Leu Asp Ser Ser Ile Ser Cys
100 105 110
Thr Met Asn Glu Ser Lys Ser Thr Ser Leu Lys Asp Phe Leu Glu Ser
115 120 125
Leu Lys Ser Ile Met Asp Met Asp Asp Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ile
130 135 140
Asn Tyr Lys Gln Leu Gln Leu Gln Glu Arg Thr Asn Ile Ala Lys Cys
145 150 155 160
Gln Glu Leu Leu Glu Gln Leu Asn Gly Lys Ile Asn Ala Thr Tyr Ala
165 170 175
Ala Asp Phe Lys Ile Pro Met Glu Met Thr Glu Lys Met Gln Lys Ser
180 185 190
Tyr Thr Ala Phe Ala Ile Gln Glu Met Leu Gln Asn Val Phe Leu Val
195 200 205
Phe Arg Asn Asn Phe Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Val
210 215 220
Arg Leu Leu Asp Glu Leu His Gln Gln Thr Val Phe Leu Lys Thr Val
225 230 235 240
Leu Glu Glu Lys Gln Glu Glu Arg Leu Thr Trp Glu Met Ser Ser Thr
245 250 255
Ala Leu His Leu Lys Ser Tyr Tyr Trp Arg Val Gln Arg Tyr Leu Lys
260 265 270
Leu Met Lys Tyr Asn Ser Tyr Ala Trp Met Val Val Arg Ala Glu Ile
275 280 285
Phe Ala Asn Phe Leu Ile Ile Arg Arg Leu Thr Arg Asn Phe Gln Asn
290 295 300
Ala Ala Ala His His His His His His
305 310

Claims (23)

1.一种用于选择性激活细胞中受体多肽的非天然组合的方法，所述组合物包含合成因子，所述合成因子结合至呈非天然组合的两种或更多种受体多肽的细胞外结构域，从而引起所述受体多肽的多聚化和信号传导的激活。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述合成因子包含多肽。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述受体多肽是以下的一种或多种：(i)激活所述细胞中的JAK/STAT途径的细胞因子受体；(ii)受体酪氨酸激酶；或(iii)TNFR超家族成员。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述细胞因子受体选自βc、γc、IL-3Rα、βIL-3R、GM-CSFRα、IL-5Rα、CNTFα、CRLF1、LIFRα、gp130、IL-6Rα、IL-11Rα、OSMRβ、IL-2Rα、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-4Rα、IL-7Rα、IL-9Rα、IL-13Rα、IL-15Rα、IL-21Rα、IFNAR2、IL-23R、EpoR、IL-12Rβ、IFNAR1、G-CSFR、c-MPLR。
5.如权利要求4所述的方法，其中合成因子结合至两种此类受体，并激活JAK/STAT信号传导。
6.如权利要求4所述的方法，其中合成因子结合至三种此类受体，并激活JAK/STAT信号传导。
7.如权利要求3所述的方法，其中所述受体酪氨酸激酶蛋白选自EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、InsR、IGF1R、InsRR、PDGFRα、PDGFRβ、CSF1R/Fms、cKit、Flt-3/Flk2、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、PTK7/CCK4、TrkA、TrkB、TrkC、Ror1、Ror2、MuSK、Met、Ron、Axl、Mer、Tyro3、Tie1、Tie2、EphA1-8、EphA10、EphB1-4、EphB6、Ret、Ryk、DDR1、DDR2、Ros、LMR1、LMR2、LMR3、ALK、LTK、SuRTK106/STYK1。
8.如权利要求7所述的方法，其中合成因子结合至两种此类受体，并激活信号传导。
9.如权利要求3所述的方法，其中所述TNFR超家族成员选自TNFR1(TNFRSF1A)、TNFR2(TNFRSF1B；TNFRSF2)、41-BB(TNFRSF9)、AITR(TNFRSF18)、BCMA(TNFRSF17)、CD27(TNFRSF7)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、死亡受体1(TNFRSF10C)、死亡受体-3(TNFRSF25)、死亡受体4(TNFRSF10A)、死亡受体5(TNFRSF10B)、死亡受体-6(TNFRSF21)、诱饵受体-3(TNFRSF6B)、诱饵受体2(TNFRSF10D)、EDAR、Fas(TNFRSF6)、HVEM(TNFRSF14)、LTβ-R(TNFRSF3)、OX40(TNFRSF4)、RANK(TNFRSF11A)、TACI(TNFRSF13B)、Troy(TNFRSF19)、XEDAR(TNFRSF27)、骨保护素(TNFRSF11B)、TWEAK受体(TNFRSF12A)、BAFF受体(TNFRSF13C)、NGF受体(TNFRSF16)。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述合成因子结合至两种或更多种此类受体并激活信号传导。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述合成因子包含对权利要求3中阐述的受体的两个不同细胞外结构域具有高亲和力的结合结构域。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述结合亲和力小于约1x 10-7M。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述结合结构域直接连接。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述结合结构域通过接头连接。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述结合结构域是突变形式的天然配体。
16.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述结合结构域是从头设计的结合结构域。
17.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述结合结构域是抗体来源的结合蛋白。
18.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述结合结构域是纳米抗体来源的结合结构域。
19.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述结合结构域是打结素工程化支架。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述结合结构域通过包含2-100个氨基酸的肽接头连接。
21.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述结合结构域通过非肽接头连接。
22.一种用于如权利要求1-21中任一项所述的方法中的合成因子。
23.一种药物组合物，其包含如权利要求22所述的合成因子和药学上可接受的赋形剂。
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