MX2012013490A - Materiales biologicos relacionados con her3. - Google Patents

Materiales biologicos relacionados con her3.

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Bjoern Hock
Christine Knuehl
Gerald Beste
Hilde Adi Pierrette Revets
Frank Kamiel Delphina Verdonck
Sigrid Godelieve Victor Cornelis
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Abstract

La presente descripción se refiere a secuencias de aminoácidos que se dirigen contra (como se define en la presente) HER3, así como a compuestos o constructos, y en particular proteínas y polipéptidos, que comprende o consisten esencialmente de una o más de tales secuencias de aminoácidos (también referidas en la presente como "secuencias de aminoácidos de la invención", "compuestos de la invención", y "polipéptidos de la invención", respectivamente). La descripción también se refiere a ácidos nucleicos que codifican tales secuencias de aminoácidos y polipéptidos (también referidos en la presente como "ácidos nucleicos de la invención" o "secuencias de nucleótido de la invención"); a métodos para preparar secuencias de aminoácidos y polipéptidos; a células hospederas que expresan o son capaces de expresar tales secuencias de aminoácidos o polipéptidos; a composiciones, y en particular a composiciones farmacéuticas, que comprenden tales secuencias de aminoácidos, polipéptidos, ácidos nucleicos y/o células hospederas; y a usos de tales secuencias de aminoácidos o polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospederas y/o composiciones, en particular para propósitos profilácticos, terapéuticos o de diagnóstico, tal como los propósitos profilácticos, terapéuticos o de diagnóstico mencionados en la presente.

Description

MATERIALES BIOLÓGICOS RELACIONADOS CON HER3 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a secuencias de aminoácidos que se dirigen contra (como se define en la presente) HER3, asi como a compuestos o constructos, y en particular proteínas y polipéptidos , que comprenden o consisten esencialmente de una o más de tales secuencias de aminoácidos (también · referidas en la presente como "secuencias de aminoácidos de la invención" , "compuestos de la invención" , y "polipéptidos de la invención" , respectivamente) .
En algunos aspectos específicos, pero no limitantes (descritos en más detalle en la presente) , la invención proporciona : - secuencias de aminoácidos que se dirigen contra (como se define en la presente) HER3 y que son capaces de inhibir o bloquear (completamente o parcialmente, como se describe además en la presente) el enlace de HRG a HER3 (como se describe además en la presente); - secuencias de aminoácidos que se dirigen contra (como se define en la presente) HER3 y que son capaces de inhibir o bloquear (completamente o parcialmente, como se describe además en la presente) la heterodimerización de HER3 (como se describe además en la presente) ; - secuencias de aminoácidos que se dirigen contra (como se define en la presente) HER3 y que son capaces de enlaza al dominio II de HER3; y/o - secuencias de aminoácidos que se dirigen contra (como se define en la presente) HER3 y que son capaces de inhibir o bloquear (completamente o parcialmente, como se describe además en la presente) la fosforilación de HER3 (como se describe además en la presente) .
Como se describe además en la. presente, en un aspecto preferido especifico, pero no limitante, las varias secuencias de aminoácidos dirigidas contra HER3 que se describen en la presente (incluyen aquellas de acuerdo a aspectos específicos) son preferiblemente dominios variables sencillos de inmunoglobulina (también referidos en la presente como "ISV's"). Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina es una secuencia de aminoácidos que: - comprende un pliegue de inmunoglobulina o que, bajo condiciones adecuadas (tales como condiciones fisiológicas) es capaz de formar un pliegue de inmunoglobulina (esto es por plegado), esto es con objeto de formar un dominio variable de inmunoglobulina (tal como, por ejemplo, un dominio VH, VL o VHH) ; y que - forma (o bajo tales condiciones adecuadas es capaz de formar) un dominio variable de inmunoglobulina que comprende una actividad enlazada al antigeno funcional (en el sentido que no requiere una interacción con otro dominio de variable inmunoglobulina (tal como una interacción VH-VL) para formar un sitio enlazado al antigeno funcional).
Las secuencias de aminoácidos de la invención que son ISV's también se refieren en la presente como "ISV's de la invención" . Algunos ejemplos -preferidos de dominios variables sencillos de inmunoglobulina adecuados para uso en la invención se volverán claros de la descripción adicional en la presente, y por ejemplo comprenden VHH' s y/o (otros) Nanocuerpos (preferidos) tales como VHH' s humanizados o VH' s camelizados tales como VH de humano camelizado, dAb' s y anticuerpos de dominio (sencillo) .
También como se describe además en la presente, las varias secuencias de aminoácidos dirigidas contra HER3 que se describen en la presente (incluyen aquellas de acuerdo a aspectos específicos) pueden con ventaja usarse como bloques de construcción para proporcionar polipéptidos multivalentes (como se describe en la presente, tales como bi o trivalentes) , multiespecífieos (como se describe en la presente, tales como bi o triespecífieos ) o multiparatópicos (como se describe en la presente, tal como biparatópico) de la invención, y tales polipéptidos de la invención para aspectos preferidos adicionales¦ pero no limitantes de la invención. De nuevo, también en estos aspectos de la invención, las secuencias de aminoácidos de la invención presentes en tales polipéptidos son preferiblemente ISV's (y preferiblemente nanocuerpos como se describe en la presente) .
Por ejemplo y sin limitación, en un aspecto especifico de la invención, tal polipéptido puede comprender al menos un (tal como uno o dos) ISV's (y preferiblemente nanocuerpos) que se dirigen contra (como se define en la presente) HER3 y que son capaces de inhibir o bloquear (completamente o parcialmente, como se describe además en la presente) el enlace de HRG a HER3 (como se describe además en la presente) y al menos un (tal como uno o dos)' ISV's (y preferiblemente nanocuerpos) que se dirigen contra (como se define en la presente) HER3 y que son capaces de inhibir o bloquear (completamente o parcialmente, como se describe además en la presente) la heterodimerización de HER3 (como se describe además en la presente) . Estas y las otras secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención también puede haber sido proporcionada con una vida media incrementada in vivo, como se describe además en la presente.
Algunos ejemplos preferidos pero no limitantes de las varias secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención se volverán claros de la descripción adicional en la presente.
La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican tales secuencias de .aminoácidos y polipéptidos (también referidas en la presente como "ácidos nucleicos de la invención" o "secuencias de nucleótido de la invención"); a métodos para preparar tales secuencias de aminoácidos y polipéptidos; a células hospederas que expresan o son capaces de expresar tales secuencias de aminoácidos o polipéptidos; a composiciones, y en particular a composiciones farmacéuticas, que comprenden tales secuencias de aminoácidos, polipéptidos, ácidos nucleicos y/o células hospederas; y a usos de tales secuencias de aminoácidos o polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospederas y/o composiciones, en particular para propósitos profilácticos, terapéuticos o de diagnóstico, tales como los propósitos profilácticos, terapéuticos o de diagnóstico mencionados en la presente.
Otros aspectos, modalidades, ventajas y aplicaciones de la invención se volverán claros de la descripción adicional en la presente.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El HER3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 3) pertenece- a la subfamilia ErbB/HER de los receptores del factor, de crecimiento de polipéptido, que incluye el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (EGFR, ErbBl, HERI), el producto de oncogén neu (ErbB2, HER2), y las proteínas del receptor ErbB3, HER3 y ErbB4, HER4 identificadas más recientemente (ver, por ejemplo, Plowman et al. (1990), Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87, 4905-4909; Hynes et. al. (1994) Biochim. Biophys. Acta Rev. Cáncer 1198, 165-184). Se conoce que H-ER3 puede enlazar ligandos múltiples, tales como heregulina y las neuregulinas 1 y 2; pero que carece de actividad de tirosina cinasa intrínseca (y debido a que es cinasa inactiva, el receptor sólo puede iniciar la transducción de señal cuando se dimeriza con otro miembro de la familia HER, tal como HERI, HER2 o HER4 ) .
Más específicamente, HER3 es una proteína de enlace a la membrana y tiene un dominio enlazado a neuregulina pero no un dominio de cinasa activo. Por lo tanto puede enlazar este ligando pero no transportar la señal en la célula a través de la fosforilación de proteína. Sin embargo, esto forma heterodímeros con otros miembros de la familia del receptor EGF que no tienen actividad de cinasa. La heterodimerización lleva a la activación de trayectorias que llevan a la devisión celular, proliferación, diferenciación, migración y otros procesos celulares. La señalización de capa múltiple de complejo genera comunicación entre dos vías del receptor y la señalización lateral se vuelve evidente dentro de la familia EGFR y otro receptor de tirosina cinasas tipo MET (Engelmann et. al. (2007), Science 316, 1039-1043). La señalización desregulada, aberrante debido a la mutación, amplificación y presencia de rizos autocrinos activos puede participar en el desarrollo de cáncer y otras enfermedades. La amplificación de este gen y/o sobre expresión de su proteina se ha reportado en numerosos canceres, incluyendo tumores de próstata, vejiga, y mama (ver por ejemplo WO200810062 , WO2007077028, Horst et al. (2005) Int J Cáncer, 115, 519-527; Xue et al. (2006) Cáncer Res. 66, 1418-1426). HER3 también se conoce como LCCS2; ErbB-3; c-erbB3; erbB3-S; MDA-BF-l; MGC88033; c-erbB-3; p!80-ErbB3; p45-sErbB3; p85-sErbB3; ERBB3.
Cuando se trata de la función de HER3 en cáncer, se ha sugerido que HER3 puede ser necesario para tumorigénesis mediada por HER2, en el sentido que HER2 puede requerir HER3 con objeto de transformar las células normales en células de cáncer. Por ejemplo, se ha encontrado que la expresión incrementada de HER3 incrementa la potencia de señalización de HER2, mientras que la expresión HER3 disminuida resulta en la pérdida de actividad HER2. Esto ha llevado a la hipótesis de que HER3 puede involucrarse en tumorigénesis mediada por HER2 a través de dimerización con HER2.
También se ha sugerido que HER3 puede permitir el escape de la inhibición de otros receptores HER. Por ejemplo, la investigación preclinica ha mostrado que la sobre regulación de la actividad HER3 puede ser un mecanismo por el cual las células de tumor pueden escapar de la inhibición de tirosina cinasa de los receptores de la familia HER, y que las células de tumor pueden compensarse para la inhibición de tirosina cinasa de otros receptores HER al incrementar la expresión de HER3, que es cinasa ' inactiva . También se ha encontrado que en los heterodimeros HER2 : HER3 , HER2 transfosforila HER3.
HER3 también se ha encontrado para sobre expresarse en varios tipos de cáncer (incluyendo sin limitación cáncer de mama y pancreático) , y se ha encontrado que puede existir una correlación entre la expresión de HER2/HER3 y el progreso de una etapa' no invasiva a una invasiva (Baselga et al., 2009 Nature Reviews Cáncer 9, 463-475) .
Aunque, se ha implicado la función de HER3 en cáncer y señalización oncogénica (supra) , su importancia en un tratamiento anti-cáncer permanece no clara debido a la red ErbB de complejo en la cual HER3 es un componente de la misma. Las inmunoterapias actuales se enfocan principalmente en inhibir la acción de HER2 y, en particular, los heterodimerización de- los complejos HER2/HER3 (ver, por ejemplo, Sliwkowski et al. (1994) J. Biol . Chem. 269(20): 14661-14665) .
Es un objetivo de la presente invención proporcionar inmunoterapias mejoradas que inhiben efectivamente la señalización HER3, y pueden usarse para tratar y diagnosticar una variedad de cánceres.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN En la invención, un número de dominios variables sencillos de inmunoglobulina (como se describe además en la presente) se ha identificado y caracterizado (y donde sea apropiado humanizado y/o secuencia optimizada) que puede enlazar a HER3 (y en particular enlaza específicamente a HER3, como se define además en la presente) y que puede (usarse para) modular (como se define en la presente) señalización mediada por HER3 y/o modular (alguno o todos de) los efectos biológicos de HER3 y/o modular (alguno o todos de) los mecanismos/trayectorias biológicas en las cuales se involucra HER3 y/o señalización mediada por HER3. También se ha encontrado que los dominios variables sencillos de inmunoglobulina proporcionados por la presente invención no sólo pueden usarse en sí mismo por tal modulación, pero también puede con ventaja adicional ligarse a/combinarse uno con el otro (esto es a fin de proporcionar constructos multivalentes, multiespecífieos y/o biparatópicos , como se define además en la presente) y/o con otras porciones, dominios enlazados o unidades enlazadas para proporcionar proteínas, polipéptidos u (otros) compuestos o constructos que pueden usarse para tal modulación.
De esta manera, el uso de los dominios variables sencillos de inmunoglobulina (o "ISV's") proporcionado por la invención como "bloques de construcción" para proporcionar tales proteínas, polipéptidos u (otros) compuestos o constructos forma una ventaja y aspecto importante de la invención .
Por ejemplo, y con ventaja pero sin limitación, se ha encontrado que los varios dominios variables sencillos de inmunoglobulina o "ISV's" proporcionados por la invención pueden enlazarse en diferentes formas a HER3, y de esta manera proporcionar diferentes modos de acción en la forma en que interactúan con HER3 y/o modulan la señalización mediada por HER3. Por ejemplo, algunos de los ISV's proporcionados por la invención son capaces de inhibir el enlace de HRG a HER3, mientras que otros pueden enlazar al dominio II de HER3 y/o bloquear la transfosforilación de HER3. Aún otros pueden bloquear la dimerización de HER3 consigo mismo con otros miembros de la familia HER (tales como HERI, HER2 o HER3) . Por lo tanto, el aminoácido de la invención (o ISV) se considera un bloque de construcción.
De esta manera, la invención proporciona un intervalo de ISV's diferente que puede influir HER3, señalización mediada por HER3 y/o los efectos biológicos asociados con HER3 y/o con señalización mediada por HER3.
Además, cuando los ISV's proporcionados por la invención se usan o combinan adecuadamente como bloques de construcción para proporcionar proteínas, polipéptidos u (otros) compuestos o constructos adicionales, la invención por ejemplo hace posible, con ventaja, combinar diferentes interacciones con HER3 y/o diferentes modos de acciones en una molécula sencilla, compuesto, constructo, proteína o polipéptidos. Los ejemplos de los mismos se volverán claros de la descripción adicional en la presente.
Los efectos o influencia que los varios ISV's, proteínas, polipéptidos, compuestos y/o constructos que se proporcionan por la invención tienen un HER3 y señalización mediada por HER3 (incluyendo su modo/modos de acción) puede determinarse usando varios ensayos adecuados y modelos in vivo, tales como un ensayo de internalización HER3 (por ejemplo medir la reducción de expresión de la superficie HER3 en una célula adecuada tal como células MCF7 y MALME-3M) ensayos que bloquean el ligando (tales como ensayos FACS o Alphascreen de competencia HRG) ; ensayos de bloqueo de señalización HER3 inducido por HRG (tal como un ensayo que mide la inhibición de pHER3 en células MCF7 , CHO-HER2-HER3 , BT474 y MDA-MB468 estimuladas por el ligando HER3); ensayos que miden el bloqueo de heterodimerización (tal como bloqueo pHER3 de CH0-EGFR-HER3 estimulado por TGF-alfa, células MDA-MB468 estimuladas por ß-celulina) ; ensayo que mide la inhibición de la señalización' corriente abajo (tal como un ensayo que mide la señalización pAKT y/o pMAPK en células MCF7, A549 y BT474 estimuladas por ligando HER3); o ensayos de migración celular (tales como ensayos que miden la migración inducida por HRG de células A431) . Se hace referencia por ejemplo a la Sección Experimental y los resultados presentados en ella.
De esta manera, los ISV's, polipéptidos y composiciones de la presente invención generalmente pueden usarse para modular, y en particular' inhibir y/o prevenir, el enlace de HER3 a Heregulin y/o bloquear la heterodimerización con MET, EGFR o HER2 (ver por ejemplo Hsieh and Moasser, 2007, British Journal of Cáncer) , y de esta manera para modular, y en particular inhibir o prevenir, la señalización que se media por HER3 y/o Heregulin, para modular las trayectorias biológicas en las cuales HER3 y/o Heregulin se involucran, y/o para modular los mecanismos biológicos, respuestas y efectos asociados con tal señalización o estas trayectorias.
Como tales, los polipéptidos y composiciones de la presente invención pueden usarse para el diagnóstico y tratamiento (como se define en la presente) de una variedad de cánceres. Generalmente, "variedad de cánceres" puede definirse como enfermedades y trastornos que pueden prevenirse y/o tratarse, respectivamente, al administrar adecuadamente a un sujeto que necesita del mismo (esto es que tiene la enfermedad o trastorno o al menos un síntoma del mismo y/o en riesgo de atraer o desarrollar la enfermedad o trastorno) de cualquier polipéptido o composición de la invención (y en particular, de una cantidad farmacéuticamente activa de la misma) y/o de un principio activo conocido activo contra HER3 o una trayectoria biológica o mecanismo en el cual se involucra HER3 (y en particular, de una cantidad farmacéuticamente activa del mismo) . Los ejemplos de tal variedad de cánceres serán claros para la persona experimentada con base en la descripción en la presente, y por ejemplo incluye las siguientes enfermedades y trastornos: Cáncer (Sithanandam and Anderson review (2008) Cáncer Gene Therapy 15(7), 413-448; cáncer de mama (Lemoine et. al. (1992) Br J Cáncer 66, 1116-1121; Witton et al. (2003) J Pathol 200 (3) : 290-297; outras et al (2010) Crit Rev Oncol Hematol. 74 (2 ) : 73-78 ) ; cáncer pulmonar (Müller-Tidow (2005) Cáncer Res 65(5) : 1778-1782; Timotheadou et al., (2007) Anticancer Res. 27 ( 6C) : 481-4489) ; cáncer de ovarios (Tanner et. al. (2006) J Clin Oncol 24(26): 4317-4323); cáncer de próstata (Lozano et.al. (2005) BMC Genomics 6: 109; Soler et al., 2009. Int J Cáncer 125 (11) : 2565-2575) cáncer de vegija urinaria (Rajkumar et. al. (1996) J Pathol, 179 (4) : 381-385) ; cáncer de cerebro (Addo-Yobo et. al. (2006) J Neuropathol Exp Neurol 65 ( 8 ): 769-775, Andersson et. al. (2004) Acta Neuropathol, 108(2): 135-142); Retinoblastoma (Chakraborty et. al. (2007) Genomics 90 ( 3 ) : 344-353 ) ; melanoma (Segal et. al. (2003) J Clin Oncol.. 1 de Mayo 2003; 21(9): 1775-1781; Schaefer et. al. (2004) Cáncer Res 64:3395-3405; Reschke et al., 2008 Clin Cáncer Res. 14 (16) : 5188-97 ) ; cáncer colorectal (Grivas et. al. (2007) Eur J Cáncer 43(17): 2602-2611; Ciardiello et al. (1991) Proc Nati Acad Sci EUA. 88(17) :7792-7796); cáncer pancreático (Friess et. al. (1995) Clin Cáncer Res 1(11): 1413-20); Lemoine et al, 1992 J. Pathol.168: 269-273); cáncer gástrico (Sanidas (1993), Int J Cáncer 54(6): 935-40, Hayashi et. al. (2008) Clin Cáncer Res 14(23): 7843-7849; Hayashi et al., (2008) Clin Cáncer Res. 14(23): 7843-9); cáncer de cabeza y cuello (Funayama (1998) Oncology 55(2): 161-167, Erjala (2006) Clin Cáncer Res 12(13): 4103-4111); cáncer cérvico (Fuchs et al., 2007 Anticancer Res. 27 (2) : 959-63) ; cáncer de esófago (Wei et al., 2007 Int J Oncol. 31 (3) : 493-9. ) ; y/o regeneración del nervio (Lindholm et. al. (2002) Exp Brain Res) Enero 2002; 142 ( 1 ): 81-90.
En particular, los polipéptidos y composiciones de la presente invención pueden usarse para el diagnóstico y tratamiento de la variedad de cánceres que se caracterizan por señalización excesiva y/o no deseada mediada por la red ErbB de proteínas o en general por cualquiera de las trayectorias en las cuales se involucra HER3. Los ejemplos de tal variedad de cánceres de nuevo serán claros para la persona experimentada con base en la descripción en la presente.
De esta manera, sin limitarse a esto, también se vislumbra que los polipéptidos de la invención pueden usarse para prevenir y/o para, tratar todas las enfermedades y trastornos para los cuales el tratamiento con tales principios activos está actualmente siendo desarrollado, se ha propuesto, o se propondrá o desarrollará en el futuro. Además, se cree que, debido a sus propiedades favorables como se describe además en la presente, los polipéptidos de la presente invención pueden usarse para la prevención y tratamiento de otras enfermedades y trastornos que aquellos para los cuales estos principios activos conocidos se usan o se propondrán o desarrollarán; y/o que los polipéptidos de la presente invención pueden proporcionar nuevos métodos y regímenes para tratar las enfermedades y trastornos descritos en la presente.
Otras aplicaciones y usos de las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención se volverán claros para la persona experimentada de la descripción adicional en la presente.
Generalmente, es un objetivo de la invención proporcionar agentes farmacológicamente activos, así como composiciones que comprenden los mismos, que pueden usarse en el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de una variedad de cánceres y de las enfermedades y trastornos adicionales mencionados en la presente; y para proporcionar métodos para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de tales enfermedades y trastornos que involucran la administración y/o uso de tales agentes y composiciones.
En particular, es un objetivo de la invención proporcionar tales agentes farmacológicamente activos, composiciones y/o métodos que tienen ciertas ventajas comparadas con los agentes, composiciones y/o métodos que se usan y/o conocen actualmente en la técnica. Estas ventajas se volverán claras de la descripción adicional a continuación.
Más en particular, es un objetivo de la invención para proporcionar proteínas terapéuticas que pueden usarse como agentes farmacológicamente activos, así como composiciones que comprenden los mismos, para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de variedad de cánceres y de las enfermedades y trastornos adicionales mencionados en la presente; y para proporcionar métodos para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de tales enfermedades y trastornos que involucran la administración y/o el uso de tales proteínas y composiciones terapéuticas.
En consecuencia, es un objetivo especifico de la presente invención proporcionar secuencias de aminoácidos que se dirigen contra (como se define en la presente) HER3, en particular contra HER3 de un animal de sangre calienta, más en particular contra HER3 de un mamífero, y especialmente contra HER3 humano (SEQ ID NO: 1); y para proporcionar proteínas y polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente de al menos uno de tal secuencia de aminoácidos .
En particular, es un objetivo específico de la presente invención proporcionar tales secuencias de aminoácidos y tales proteínas y/o polipéptidos que son adecuadas para uso profiláctico, terapéutico y/o diagnóstico en un animal de sangre caliente, y en particular en un mamífero, y más en particular en un ser humano.
Más en particular, es un objetivo específico de la presente invención proporcionar tales secuencias de aminoácidos y tales proteínas y/o polipéptidos que pueden usarse para la prevención, tratamiento, alivio y/o diagnóstico de una o más enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con HER3' y/o mencionadas por HER3 (tales como las enfermedades, trastornos y afecciones mencionadas en la presente) en un animal de sangre caliente, en particular en un mamífero, y más en particular en un ser humano.
También es un objetivo especifico de la invención proporcionar tales secuencias de aminoácidos y tales proteínas y/o polipéptidos que pueden usarse en la preparación de composiciones farmacéuticas o veterinarias para la prevención y/o tratamiento de una o más enfermedades, trastornos o afecciones asociadas .con y/o mediadas por HER3 (tales como enfermedades, trastornos y afecciones mencionadas en la presente) en un animal de sangre caliente, en particular en un mamífero, y más en particular en un ser humano.
En la invención, generalmente, estos objetivos se alcanzan por el uso de las secuencias de aminoácidos, proteínas, polipéptidos y composiciones que se describen en la presente.
En general, la invención proporciona secuencias de aminoácidos que se dirigen contra (como se define en la presente) y/o pueden enlazar específicamente (como se define en la presente) a HER3; así como compuestos y constructos, y en particular proteínas y polipéptidos, que comprenden al menos una de tal secuencia de aminoácidos .
Como ya se mencionó, en algunos aspectos específicos, pero no limitantes (descritos en más detalle en la presente) , la invención proporciona: secuencias de aminoácidos que se dirigen contra (como se define en la presente) HER3 y que son capaces de inhibir o bloquear (completamente o parcialmente, como se describe además en la presente) el enlace del ligando, y en particular de inhibir o bloquear (completamente o parcialmente, como se describe además en la presente) el enlace de HRG a HER3 (como se describe además en la presente) . Estas secuencias de aminoácidos también .se refieren en la presente como "secuencias de aminoácidos que bloquean HRG" o "bloques de construcción que bloquean HRG". Preferiblemente, estas secuencias de aminoácidos que bloquean HRG son ISV's (como se describe en la presente) , en cuyo caso también se refieren como "ISV's que bloquean HRG". Preferiblemente, cualquiera de las secuencias de aminoácidos que bloquean HRG, bloques de construcción que bloquean HRG o ISV s que bloquean HRG son tales que tienen actividad de bloque, esto es HRG de bloque enlazado a HER3 parcialmente o completamente, que puede determinarse por cualquier ensayo adecuado conocido para la persona experimentada en la técnica, tal como, por ejemplo, por un ensayo Alphascreen o por un ensayo de competencia FACS (por ejemplo como se describe en la presente) . Preferiblemente, la actividad de bloqueo se determina por un ensayo de competencia FACS como se describe en el Ejemplo 9. Preferiblemente, la ISV tiene una actividad de bloqueo o capacidad de competencia en células CHO para bloquear o competir el enlace de HRGl-ß a HER3 con un IC50 de menos de 600 nM, pero preferiblemente, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM o incluso menos.
- Por ejemplo, la ISV tipo 04C07 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de competencia en este ensayo con un IC50 de menos de 100 nM, más preferiblemente, menos de 75 nM, 50 nM o incluso menos, tal como menos de 20 nM o 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM o 6 nM o aún más preferiblemente de menos de 5 nM. .
- Por ejemplo, la ISV tipo 17B05 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de competencia en este ensayo con un IC50 de menos de 150 nM, más preferiblemente, menos de 100 nM, 90 nM, 80 nM o incluso menos, tal como menos de 70 nM o 60 nM, 50 nM o 40 nM o aún más preferiblemente de menos de 35 nM.
- Por ejemplo, la ISV tipo 21F06 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de¦ competencia en este ensayo con un IC50 de menos de 100 nM, más preferiblemente, menos de 80 nM, 70 nM o incluso menos, tal como menos de 60 nM o 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM o 13 nM- o aún más preferiblemente de menos de 11 nM.
En un aspecto específico, pero no limitante, (algunas de las) "secuencias de aminoácidos que bloquean HRG" o bloques de construcción que bloquean HRG" pueden (y preferiblemente también son) ser tal que son capaces de inhibir o bloquear la señalización HER3 (ver Ejemplos 9 y 10) , por ejemplo en el ensayo de fosforilación usado en el Ejemplo 10. Preferiblemente, cualquiera de las secuencias de aminoácidos que bloquean HRG, bloques de construcción que bloquean HRG o ISV s que bloquean HRG son tales que tienen la actividad de bloqueo, esto es bloquean o inhiben la fosforilación HER3 mediada por HRG parcialmente o completamente, que puede determinarse por cualquier ensayo adecuado conocido para la persona experimentada en la técnica, tal como, por ejemplo, por cualquier ensayo de fosforilación adecuado, tal como, por ejemplo, un ensayo de fosforilación HER3, un ensayo de fosforilación AKT o ensayo de fosforilación ERKl/2 como se describe en la presente.
Preferiblemente, la actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de fosforilación ' se determina por un ensayo de fosforilación HER3 como se describe en el Ejemplo 10. Preferiblemente, la ISV tiene una actividad de bloqueo o una capacidad de inhibición de fosforilación pHER3 inducida por ligando (por ejemplo HRGl-ß?) en células MCF-7 con un IC50 de menos de 600 nM, pero preferiblemente, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM o incluso menos.
- Por ejemplo, la ISV tipo 04C07 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de competencia en este ensayo con un IC50 de menos de 100 nM, más preferiblemente, menos de 75 nM, 50 nM o incluso menos, tal como menos de 20 nM o 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM o 6 nM o aún más preferiblemente de menos de 5, 4, 3 o 2 nM.
- Por ejemplo, la ISV tipo 17B05 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de competencia en este ensayo con un IC50 de menos de 150 nM,¦ más preferiblemente, menos de 100 nM, 90 nM, 80 nM o incluso menos, tal como menos de 70 nM o 60 nM, 50 nM o 40 nM o aún más preferiblemente de menos de 35 nM, tal como menos de 20 nM o- 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM o 7 nM o aún más preferiblemente de menos de 6 nM .
- Por ejemplo, la ISV tipo 21F06 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de competencia en este ensayo con un IC50 de menos de 150 nM, más preferiblemente, menos de 100 nM, 90 nM, 80 nM o incluso menos, tal como menos de 70 nM o 60 nM, 50 nM o 40 nM o aún más preferiblemente de menos de 35 nM, tal como menos de 20 nM o 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM o aún más preferiblemente de menos de T nM.
Preferiblemente, la actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la señalización se determina por un ensayo de fosforilación AKT como se describe en Ejemplo 10.1. Preferiblemente, la ISV tiene una actividad de bloqueo o una capacidad de inhibición de fosforilación Akt inducida por ligando (por ejemplo HRGl-ß?) en células MCF-7 con un IC50 de menos de 600 nM, pero preferiblemente, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM o incluso menos.
- Por ejemplo, la ISV tipo 04C07 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de competencia en este ensayo con un IC50 de menos de 100 nM, más preferiblemente, menos de 80 nM, 70 nM o incluso menos, tal como menos de 60 nM o 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM o aún más preferiblemente de menos de 20 nM.
- Por ejemplo, la ISV tipo 17B05 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de competencia en este ensayo con un IC50 de menos de 150 nM, más preferiblemente, menos de 100 nM, 90 nM, 80 nM o incluso menos, tal como menos de 70 nM o 60 nM, 50 nM o 40 nM o aún más preferiblemente de menos de 35 nM, tal como menos de 20 nM o 15 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM o 9 nM o aún más preferiblemente de menos de 8 nM.
- Por ejemplo, la. ISV tipo 21F06 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de competencia en este ensayo con un IC50 de menos de 150 nM, más preferiblemente, menos de 100 nM, 90 nM, 80 nM o incluso menos, tal como menos de 70 nM o 60 nM, 55 nM o 50 nM o aún más preferiblemente de menos de 45 nM, tal como menos de 40 nM o 35 nM, 30 nM, 27.5 nM, 25 nM o aún más preferiblemente de menos de 24 nM.
Preferiblemente, la actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la señalización se determina por un ensayo de fosforilación ERK1/2 como se describe en Ejemplo 10.2. Preferiblemente, la ISV tiene una actividad de bloqueo o una capacidad de inhibición de fosforilación ERK1/2 inducida por el ligando (por ejemplo HRGl-ß?) en células MCF-7 con un IC50M de menos de 600 nM, pero preferiblemente, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 150 nM o incluso menos.
- Por ejemplo, la ISV tipo 04C07 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de competencia en este ensayo con un IC50 de menos de 150 nM, más preferiblemente, menos de 100 nM, 90 nM, 80 nM o incluso menos, tal como menos de 80 nM, 70 nM o 60 nM, 55 nM o 50 nM o aún más preferiblemente de menos de 45 nM, tal como menos de 40 nM o 35 nM o aún más preferiblemente de menos de 30 nM.
- Por ejemplo, la ISV tipo 17B05 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de competencia en este ensayo con un IC50 de menos de 150 nM, más preferiblemente, menos de 100 nM, 90 nM, 80 nM o incluso menos, tal como menos de 70 nM o 60 nM, 50 nM o 40 nM o aún más preferiblemente de menos de 35 nM, tal como menos de 20 nM o 15 nM, 10 nM, 7.5 nM, 5 nM o 4 nM o aún más preferiblemente de menos de 3 nM.
- Por ejemplo, la ISV tipo 21F06 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de competencia en este ensayo con un IC50 de menos de 150 nM, tal como preferiblemente menos de 120 nM .
Aún en otro aspecto específico pero no limitante, una secuencia de aminoácidos que bloquea HRG (o ISV que bloquea HRG) es una secuencia de aminoácidos (o ISV) que compite con ya sea la secuencia de aminoácidos 21F06 (SEQ ID NO: 22) y/o la secuencia de aminoácidos 04C07 (SEQ ID NO: 15) para enlazar a HER3 y/o que es capaz de bloquear cruzado (como se define en la presente) el enlace de 21F06 y/o de 04C07 a HER3, por ejemplo y en particular en el ensayo descrito en el Ejemplo 2 (sección 2.9) . Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de tales ISV s que bloquean HRG son las "secuencias tipo 21F06" y las "secuencias tipo 04C07" como se describe además en la presente. Algunas de las secuencias tipo 21F06 pueden ser ejemplos no limitantes de ISV's de la invención que son capaces de tanto bloquear/inhibir el enlace del ligando así como inhibir/bloquear la señalización. De forma similar, las secuencias tipo 17B05 descritas en la presente son ejemplos de ISV's de la invención que son capaces de tanto bloquear/inhibir la ( trans ) fosforilación así como el enlace al ligando/HRG.
La invención proporciona secuencias de aminoácidos que se dirigen contra (como se define en la presente) HER3 y que son capaces de inhibir o bloquear (completamente o parcialmente, como se describe además en la presente) ( hetero ) dimeri zación de HER3 (como se describe además en la presente), tal como (hetero) dimerizacion EGFR/HER1-HER3 (ver por ejemplo Ejemplos 13 y 16) y/o (hetero) dimerizacion HER-2/HER3), por ejemplo en el ensayo de (hetero) dimerizacion HER-1/HER3 usado en el Ejemplo 13. Estas secuencias de aminoácidos también se refieren en la presente como "secuencias de aminoácidos que bloquean la dimerizacion" o "bloques de construcción que bloquean la dimerizacion". Preferiblemente, estas secuencias de aminoácidos que bloquean la dimerizacion son ISV' s (como se describe en la presente), en cuyo caso también se refieren como "ISV s que bloquean la dimerizacion". Preferiblemente, cualquiera de las secuencias de aminoácidos que bloquean . la dimerizacion, bloques de construcción que bloquean la dimerizacion o ISV s que bloquean la dimerizacion son tales que bloquean o inhiben la (hetero) dimerizacion, esto es bloquear o inhibir la dimerizacion de HER3 con MET, EGFR y/o HER2 parcialmente o completamente, que puede determinarse por cualquier ensayo adecuado conocido para la persona experimentada en la técnica, tal como, por ejemplo, por un ensayo de transfosforilación (por ejemplo como se describe en la presente). Preferiblemente, el bloqueo o capacidad de inhibición se determina por un ensayo de transfosforilación como se describe en Ejemplo 10 o 13, por ejemplo, al determinar la transfosforilación HER3 inducida por el ligando EGFR (por ejemplo TGF-a) como se mide en el ensayo celular en células MDA MB468 o células CHO EGFR/HER3.
- Preferiblemente, la ISV tiene una actividad de bloqueo o inhibición de (hetero) dimerización en células CHO EGFR/HER3 de dimerización de bloqueo o inhibición de HER3 con EGFR con un IC50 de menos de 600 nM, pero preferiblemente, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM o incluso menos.
- Por ejemplo, la ISV tipo 17B05 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de inhibición en este ensayo con un IC50 de menos de 100 nM, más preferiblemente, menos de 75 nM, 50 nM o incluso menos, tal como menos de 20 nM o 15 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM o 2 nM o aún más preferiblemente de menos de 1 nM.
En un, aspecto especifico, . pero no limitante, (algunas de las) secuencias de aminoácidos que bloquean la dimerización o bloques de construcción que bloquean la dimerización pueden (y preferiblemente también son) tales que son capaces de inhibir o bloquear (completamente o parcialmente, como se describe además en la presente) el enlace del ligando, y en particular de inhibir o bloquear (completamente o parcialmente, como se describe además en la presente) el enlace de HRG a HER3. En un aspecto específico pero no limitante, una secuencia de aminoácidos que bloquea la dimerización (o ISV que bloquea la dimerización) es una secuencia de aminoácidos (o ISV) que compite con la secuencia de aminoácidos 17B05 (SEQ ID NO: 13) para enlazar a HER3 y/o que es capaz de bloquear cruzado, (como se define en la presente) el enlace de 17B05 a HER3, por ejemplo y en particular en el ensayo . descrito en el Ejemplo 2 (sección 2.9) y Ejemplo 8. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de tales ISV s que bloquean la dimerización son las "secuencias tipo 17B05" como se describe además en la presente. Al menos algunas de estas secuencias tipo 17B05 también son ejemplos no limitantes de ISV s de la invención que son capaces de tanto bloquear/inhibir la ( trans ) fosforilación así como el' enlace del ligando/HRG. La invención proporciona secuencias de aminoácidos que se dirigen contra (como sé define en la presente) HER3 y que son capaces de enlaza al dominio II de HER3. Estas secuencias de aminoácidos también se refieren en la presente como "secuencias de aminoácidos enlazadas al dominio II" o "bloques de construcción enlazados al dominio II". Preferiblemente, estas secuencias de aminoácidos enlazadas al dominio II son ISV s (como se describe en la presente), en cuyo caso también se refieren como "ISV's enlazados al dominio II". Preferiblemente, cualquiera de las secuencias de aminoácidos enlazadas al dominio II, bloques de construcción enlazados al dominio I-I o ISV's enlazados al dominio II son tales que enlazan al dominio II de HER3, que puede determinarse por cualquier ensayo adecuado conocido para la persona experimentada en la técnica, tal como, por ejemplo, por ensayos de intercambio de dominio o competencia de epitopo (por ejemplo como se describe en la presente) . Preferiblemente, la capacidad de enlace al dominio II se determina por enlace a proteínas HER3 quiméricas, como se describe en Ejemplo 8, por ejemplo, por dominios HER3 humanos de intercambio con dominios HER3 de pollo.
Las secuencias de aminoácidos enlazadas al dominio II/ISV s o bloques de construcción enlazados al dominio II/ISV's proporcionados por la invención también pueden tener un efecto (que puede estar limido/parcial o más pronunciado) en ya sea el enlace al ligando/HRG (en particular, que puede a una extensión limitada/parcial ser capaz de inhibir o bloquear el enlace de ligand/HRG a HER3) y/o en la (hetero) dimerización de HER3.
En un aspecto especifico, pero no limitante, (algunas de las) "secuencias de aminoácidos enlazadas al dominio II" o "bloques de construcción . enlazados al dominio II" pueden (y preferiblemente también son) ser tales que son capaces de inhibir o bloquear la fosforilación de HER3 (ver Ejemplo 10) , por ejemplo en el ensayo de fosforilación usado en el Ejemplo 10. Preferiblemente, cualquiera de las secuencias de aminoácidos enlazadas al dominio II o bloques de construcción enlazados al dominio II o ISV's enlazados al dominio II son tales que tienen actividad de bloqueo, esto es bloqueo o inhibición de la fosforilación HER3 mediada por HRG parcialmente o completamente, que puede determinarse por cualquier ensayo adecuado conocido para la persona experimentada en la técnica, tal como, por ejemplo, por cualquier ensayo de fosforilación adecuado, tal como, por ejemplo, un ensayo de fosforilación HER3, un ensayo de fosforilación AKT o ensayo de fosforilación ERK1/2 como se describe en la presente.
Preferiblemente, la actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación se determina por un ensayo de fosforilación HER3 como se describe en Ejemplo 10. Preferiblemente, la ISV tiene una actividad de bloqueo o una capacidad de inhibición del ligando (por ejemplo fosforilación pHER3 inducida por HRGl-ß? en células MCF-7 con un IC50 de menos de 600 nM, pero preferiblemente, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM o incluso menos.
- Por ejemplo, la ISV tipo 18G11 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de competencia en este ensayo con un IC50 de menos de 150 nM, más preferiblemente, menos de 100 nM, 90 nM, 80 nM o incluso menos, tal como menos de 70 nM o 50 nM, 50 nM o 40 nM o aún más preferiblemente de menos de 35 nM, tal como menos de 20 nM o 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM o aún más preferiblemente de menos de 11 nM.
- Por ejemplo, la ISV tipo 34C07 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de competencia en este ensayo con un IC50 de menos de 150 nM, más preferiblemente, menos de 100 nM, 90 nM, 80 nM o incluso menos, tal como menos de 70 nM o 60 nM, 50 nM o 40 nM o aún más preferiblemente de menos de 35 nM, tal como menos de 20 nM o 16 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM o aún más preferiblemente de menos de 12 nM.
Preferiblemente, la actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de fosforilación se determina por un ensayo de fosforilación AKT como se describe en Ejemplo 10.1. Preferiblemente, la ISV tiene una actividad de bloqueo o una capacidad de inhibición de fosforilación Akt inducida por el ligando (por ejemplo HRGl-ß?) en células MCF-7 con un IC50 de menos de 600 nM, pero preferiblemente, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 150 nM o incluso menos.
- Por ejemplo, la ISV tipo 18G11 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de competencia en este ensayo con un IC50 de menos de 150 nM, más preferiblemente, menos de 140 nM.
- Por ejemplo, la ISV tipo 3.4C07 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de competencia en este ensayo con un IC50 de menos de 150 nM, más preferiblemente, menos de 100 nM o 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM o aún más preferiblemente de menos de 50 nM.
Preferiblemente, la actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de fosforilación se determina por un ensayo de fosforilación ERK1/2 como se describe en Ejemplo 10.2. Preferiblemente, la ISV tiene una actividad de bloqueo o una capacidad de inhibición de fosforilación ERK1/2 inducida por el ligando (por ejemplo' HRGl-ß?) en células MCF-7 con un IC50M de menos de 600 nM, pero preferiblemente, 500 nM , 400 nM, 300 nM, 200 nM, 150 nM o incluso menos.
- Por ejemplo, la ISV tipo 34C07 tiene una actividad de bloqueo o capacidad de competencia en este ensayo con un IC50 de menos de 150 nM, tal como menos de 120 nM .
En un aspecto especifico pero no limitante, una secuencia de aminoácidos enlazada al dominio II (o ISV enlazado al dominio II) es una secuencia de aminoácidos (o ISV) que compite con la secuencia de aminoácidos 18G11 (SEQ ID NO: 16) y/o con la secuencia de aminoácidos 34C07 (SEQ ID NO: 18) para enlazar a HER3 y/o que es capaz de bloquear cruzado (como se define en la presente) el enlace de 18G11 y/o de 34C07 a HER3, por ejemplo y en particular en el ensayo descrito en el Ejemplo 2 (sección 2.9). También, en un aspecto especifico pero no limitante, una secuencia de aminoácidos enlazada al dominio II es capaz de inhibir o bloquear la fosforilación de HER3 (ver Ejemplos 9 y 10), por ejemplo en el ensayo de fosforilación usado en el Ejemplo 10, preferiblemente esencialmente sin bloquear o sustancialmente inhibir el enlace del ligando. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de tal ISV enlazado al dominio II' s son las "secuencias tipo 18G11" y las "secuencias tipo 34C07" como se describe además en la presente. De estas, algunas de las secuencias tipo 34C07 son ejemplos de ISV s de la invención que no sólo enlazan al dominio II, sino también a una extensión limitada/parcial que son capaces de inhibir el enlace al ligando/HER3.
También, en la presente descripción y reivindicaciones, los siguientes términos se definen como sigue: A) secuencias tipo 21F06: una "secuencia tipo 21F06", "ISV tipo 21F06" o "bloque de construcción tipo 21F06" se define como un ISV (como se describe en la presente) que comprende: a) una CDR1 que comprende o consiste esencialmente de ya sea (i) la secuencia de aminoácidos LNAMG (SEQ ID NO: 67) o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos LNAMG; y/o b) una CDR2 que . comprende o consiste esencialmente de ya sea (i) la secuencia de aminoácidos AIDWSDGNKDYADSVKG (SEQ ID NO: 97) o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos AIDWSDGNKDYADSVKG; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos AIDWSDGNKDYADSVKG; y/o c) una CDR3 que comprende o consiste esencialmente de ya sea (i) la secuencia de aminoácidos DTPPWGPMIYIESYDS (SEQ ID NO: 127) o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95%' de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos DTPPWGPMIYIESYDS; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos DTPPWGPMIYIESYDS; en el cual las ' secuencias de estructura presentes en tal ISV son como se describe además en la presente, y en las cuales CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 21F06 tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERKl/2, todo como se describe arriba.
También como se menciona en la presente, (algunas de las) secuencias tipo 21F06 pueden (y preferiblemente también son) se tal que son capaces de inhibir o bloquear la fosforilación de HER3 (ver Ejemplos 9 y 10) , por ejemplo en el ensayo de fosforilación usado en el Ejemplo 10. Preferiblemente, en tal secuencia tipo 21F06, CDR1 y CDR2 son como se definen bajo a) y b) , respectivamente; o CDR1 y CDR3 son como se definen bajo a) y c) , respectivamente; o CDR2 y CDR3 son como se definen bajo b) y e), respectivamente. Más preferiblemente, en tal secuencia tipo 21F06, CDR1, CDR2 y CDR3 son todas como se definen bajo a), b) y c), respectivamente. De nuevo, en tal secuencia tipo 21F06, CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 21F06 tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERKl/2, todo como se describe arriba.
Por ejemplo, en tal secuencia tipo 21F06: CDR1 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos LNAMG (con CDR2 y CDR3 siendo como se define bajo b) y c) , respectivamente) ; ylo CDR2 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos AIDWSDGNKDYADSVKG (con CDR1 y CDR3 siendo como se define bajo a) y c) , respectivamente) ; y/o CDR3 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos DTPPWGP IYIESYDS (con CDR1 y CDR2 siendo como se define bajo a) y b) , respectivamente) . Particularmente, cuando una secuencia tipo 21F06 es de acuerdo a este aspecto: CDR1 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos LNAMG y CDR2 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos AIDWSDGNKDYADSVKG (con CDR3 siendo como se define bajo c) de arriba) ; y/o CDR1 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos LNAMG y CDR3 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos DTPPWGPMIYIESYDS (con CDR2 siendo como se define bajo b) de arriba) ; y/o CDR2 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos AIDWSDGNKDYADSVKG y CDR3 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos DTPPWGPMIYIESYDS (con CDR1 siendo como se define bajo a) de arriba). De nuevo, en tales secuencias tipo 21F06, CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 21F06 tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe arriba. En un aspecto preferido específicamente, una "secuencia tipo 21F06", "ISV tipo 21F06" o "bloque de construcción tipo 21F06" es un ISV que comprende: d) una CDR1 que es ya sea (i) la secuencia de aminoácidos LNAMG o (ii). una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) -con la secuencia de aminoácidos LNAMG; y/o e) una CDR2 que es ya sea (i) la secuencia de aminoácidos AIDWSDGNKDYADSVKG o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos AIDWSDGNKDYADSVKG; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos AIDWSDGNKDYADSVKG; y/o f) una CDR3 que es ya sea (i) la secuencia de aminoácidos DTPPWGPMIYIESYDS o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos DTPPWGPMIYIESYDS; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 diferencias .de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos DTPPWGPMIYIESYDS; en el cual las secuencias de estructura presentes en tal ISV son como se describen además en la presente, y en las cuales CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 21F06 tiene actividad de- bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo · como se describe arriba. Preferiblemente, en una secuencia tipo 21F06 de acuerdo con este aspecto preferido específicamente, CDR1 y CDR2 son como se definen bajo d) y e), respectivamente; o CDR1 y CDR3 son como se definen bajo d) y f ) , respectivamente; o CDR2 y CDR3 son como se definen bajo e) y f ) , respectivamente. Más preferiblemente, en tal secuencia tipo 21F06, CDR1, CDR2 y CDR3 son todas como se definen bajo d) , e) y f) , respectivamente. De nuevo, en tal secuencia tipo 21F06, CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 21F06 tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo .o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe arriba.
Por ejemplo, en una secuencia tipo 21F06 de acuerdo con este aspecto preferido específicamente: CDR1 es la secuencia de aminoácidos LNAMG (con CDR2 y CDR3 siendo como se define bajo e) y f ) , respectivamente); y/o CDR2 es la secuencia de aminoácidos AIDWSDGNKDYADSVKG (con CDR1 y CDR3 siendo como se define bajo d) y f } , respectivamente); y/o CDR3 es la secuencia de aminoácidos DTPPWGPMIYIESYDS (con CDR1 y CDR2 siendo como se define bajo d) y e), respectivamente) . Particularmente, cuando una secuencia tipo 21F06 es de acuerdo a este aspecto: CDR1 es la secuencia de aminoácidos LNAMG y CDR2 es la secuencia de aminoácidos AIDWSDGNKDYADSVKG (con CDR3 siendo como se define bajo f) de arriba); y/o CDR1 es la secuencia de aminoácidos LNAMG y CDR3 es la secuencia de aminoácidos DTPPWGPMIYIESYDS (con CDR2 siendo como se define bajo e) de arriba); y/o CDR2 es la secuencia de aminoácidos AIDWSDGNKDYADSVKG y CDR3 es DTPPWGPMIYIESYDS (con CDR1 siendo como se define bajo d) de arriba) . De nuevo, en tales secuencias tipo 21F06, ' CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 21F06 tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe arriba.
En una secuencia tipo 21F06 preferida particularmente: CDR1 es la secuencia de aminoácidos LNAMG, CDR2 es la secuencia de aminoácidos AIDWSDGNKDYADSVKG; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos DTPPWGPMIYIESYDS .
En toda la secuencia tipo 21F06 descrita en este párrafo A) , las secuencias de estructura pueden ser como se describe además en la presente. Preferiblemente, las secuencias de estructura son de manera que las secuencias de estructura tienen al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90%, tal como al menos 95% de identidad de secuencia con las secuencias de estructura de 21F06 (que, por ejemplo, puede determinarse al · determinar el grado general de identidad de secuencia de, una secuencia dada con la secuencia de 21F06 sin tener en cuenta las CDR' s en el cálculo) . De nuevo, la combinación de CDR' s y estructuras presentes en una secuencia dada son preferiblemente de manera que la ISV tipo 21F06 resultante tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe arriba. En un aspecto especifico, una secuencia tipo 21F06 es un ISV que tiene al menos 70%, tal como al menos 80%, por ejemplo al menos 85%, tal como al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 21F06 (SEQ ID NO: 22). Por ejemplo, en una secuencia tipo 21F06 de acuerdo a este aspecto, las CDR' s pueden ser de acuerdo al aspecto preferido específicamente descrito arriba, y pueden en particular (pero sin limitación) ser LNAMG (CDR1); AI DWSDGNKDYADSVKG (CDR2); y DTPPWGPMIYIESYDS (CDR3). De nuevo, preferiblemente, la combinación de CDR' s y estructuras presentes en tal ISV tipo 21F06 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 21F06 resultante . tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe arriba.
En un aspecto particular, cualquier secuencia tipo 21F06 puede ser una secuencia humanizada y/o secuencia optimizada, como se describe además en la presente.
B) secuencias tipo 04C07 : una "secuencia tipo 04C07", "ISV tipo 04C07" . o "bloque de construcción tipo 04C07" se define como un ISV (como se describe en la presente) que comprende : a) una CDR1 que comprende o consiste esencialmente de ya sea (i) la secuencia de aminoácidos SYP S (SEQ ID NO: 60) o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos SYPMS; y/o b) una CDR2 que comprende o consiste esencialmente de ya sea (i) la secuencia de aminoácidos TVSPGGITTSYADSVKG (SEQ ID NO: 90) o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos TVSPGGITTSYADSVKG; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos TVSPGGITTSYADSVKG; y/o c) una CDR3 que comprende o consiste esencialmente de ya sea (i) la secuencia de aminoácidos DLNN (SEQ ID NO: 120) o (ii) una .secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50%, tal como al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos DLNN o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos DLNN; en el cual las secuencias de estructura presentes en tal ISV son como se describé además en la presente, y en las cuales las CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 04C07 tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/-o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de ' la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe arriba.
Preferiblemente, en tal secuencia tipo 04C07, CDR1 y CDR2 son como se definen bajo a) y b) , respectivamente; o CDR1 y CDR3 son como se definen bajo a) y c) , respectivamente; o CDR2 y CDR3 son como se definen bajo b) y c) , respectivamente. Más preferiblemente, en tal secuencia tipo 04C07, CDR1, CDR2 y CDR3 son todas como se definen bajo a), b) y e), respectivamente. De nuevo, en tal secuencia tipo 04C07, CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 04C07 tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERKl/2, todo como se describe arriba.
Por ejemplo, en tal secuencia tipo 04C07: CDRl puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos SYPMS (con CDR2 y CDR3 siendo como se define bajo b) y c) , respectivamente) ; y/o CDR2 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos TVSPGGITTSYADSVKG (con CDRl y CDR3 siendo como se define bajo a) y c) , respectivamente) ; y/o CDR3 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos DLNN (con CDRl y CDR2 siendo como se define bajo a) y b) , respectivamente) . Particularmente, cuando una secuencia tipo 04C07 es de acuerdo a este aspecto: CDRl puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos SYPMS y CDR2 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos TVSPGGITTSYADSVKG (con CDR3 siendo como se define bajo c)- de arriba); y/o CDRl puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos SYPMS y CDR3 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos DLNN (con CDR2 siendo como se define bajo b) de arriba) ; y/o CDR2 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos TVSPGGITTSYADSVKG y CDR3 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos DLNN (con CDR1 siendo como se define bajo a) de arriba) . De nuevo, en tales secuencias tipo 04C07, CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 04C07 tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe arriba.
En un aspecto preferido específicamente, una "secuencia tipo 04C07", "ISV tipo 04C07" o "bloque de construcción tipo 04C07" es un ISV que comprende: d) una CD 1 que es ya sea (i) la secuencia de aminoácidos SYPMS o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos SYPMS; y/o e) una CDR2 que es ya sea (i) la secuencia de aminoácidos TVSPGGITTSYADSVKG o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de ' aminoácidos TVSPGGITTSYADSVKG; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos TVSPGGITTSYADSVKG; y/o f) una CDR3 que es ya sea (i) la secuencia de aminoácidos DLNN o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50%, tal como al menos 75%, identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos DLNN; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos DLNN; en el cual las secuencias de estructura presentes en tal ISV son como se describe además en la presente, y en el cual CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 04C07 tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERKl/2, todo como se describe arriba.
Preferiblemente, en una secuencia tipo 04C07 de acuerdo con este aspecto preferido específicamente, CDRl y CDR2 son como se definen bajo d) y e), respectivamente; o CDRl y CDR3 son como se definen bajo d) y f ) , respectivamente; o CDR2 y CDR3 son como se definen bajo e) y f ) , respectivamente. Más preferiblemente, en tal secuencia tipo 04C07, CDR1, CDR2 y CDR3 son todas como se definen bajo d) , e) y f ) , respectivamente. De nuevo, en tal secuencia tipo 04C07, CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 04C07 tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe, arriba.
Por ejemplo, en una secuencia tipo 04C07 de acuerdo con este aspecto preferido específicamente: CDR1 es la secuencia de aminoácidos SYPMS (con CDR2 y CDR3 siendo como se define bajo e) y f ) , respectivamente); y/o CDR2 es la secuencia de aminoácidos TVSPGGITTSYADSVKG (con CDR1 y CDR3 siendo como se define bajo d) y f ) , respectivamente) ; y/o CDR3 es la secuencia de aminoácidos DLNN (con CDR1 y CDR2 siendo como se define bajo d) y e), respectivamente). Particularmente, cuando una secuencia tipo 04C07 es de acuerdo a este aspecto: CDR1 es la secuencia de aminoácidos SYPMS y CDR2 es la secuencia de aminoácidos TVSPGGITTSYADSVKG (con CDR3 siendo como se define bajo f) de arriba) y/o CDR1 es la secuencia de aminoácidos SYPMS y CDR3 es la secuencia de aminoácidos DLNN (con CDR2 siendo como se define bajo e) de arriba); y/o CDR2 es la secuencia de aminoácidos TVSPGGITTSYADSVKG y CDR3 es DLNN (con CDR1 siendo como se define bajo d) de arriba) . De nuevo, en tales secuencias tipo 04C07, CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 04C07 tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe arriba.
En una secuencia tipo 04C07 preferida particularmente: CDR1 es la secuencia de aminoácidos SYPMS, CDR2 es la secuencia de aminoácidos TVSPGGITTSYADSVKG; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos DLNN.
En toda la secuencia tipo 04C07 descrita en este párrafo B) , las secuencias de estructura pueden ser como se describe además en la presente. Preferiblemente, las secuencias de estructura son de manera que las secuencias de estructura tienen al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90%, tal como al menos 95% de identidad de secuencia con las secuencias de estructura de 04C07 (que, por ejemplo, puede determinarse al determinar el grado general de identidad de secuencia de una secuencia dada con la secuencia de 04C07 sin tener en cuenta las CDR' s en el cálculo) . De nuevo, la combinación de CDR' s y estructuras presentes en una secuencia dada son preferiblemente de manera que la ISV tipo 04C07 resultante tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3 , y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe arriba.
En un aspecto especifico, una secuencia tipo 04C07 es un ISV que tiene al menos . 70%, tal como al menos 80%, por ejemplo al menos 85%, tal como al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia' con la secuencia de aminoácidos 04C07 (SEQ ID NO: 15) . Por ejemplo, en una secuencia tipo 04C07 de acuerdo a este aspecto, las CDR' s pueden ser de acuerdo al aspecto preferido específicamente descrito arriba, y pueden en particular (pero sin limitación) ser SYPMS (CDR1); TVSPGGITTSYADSVKG (CDR2); y DLNN (CDR3) . De nuevo, preferiblemente, la combinación de CDR' s y estructuras presentes en tal ISV tipo 04C07 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 04C07 resultante tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe arriba.
En un aspecto particular, cualquier secuencia tipo 04C07 puede ser una secuencia humanizada y/o secuencia optimizada, como se describe además en la presente.
C) Secuencias tipo 17B05 : una "secuencia tipo 17B05" , "ISV tipo 17B05" o "bloque -de construcción tipo 17B05" se define como un ISV. (como se describe en la presente) que comprende : a) una CDR1 que comprende' o consiste esencialmente de ya sea (i) la secuencia de aminoácidos LNAMA (SEQ ID NO: 58) o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos LNAMA; y/o b) una CDR2 que comprende o consiste esencialmente de ya sea (i) la secuencia de aminoácidos GIFGVGSTRYADSVKG (SEQ ID NO: 88) o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos GIFGVGSTRYADSVKG; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos GIFGVGSTRYADSVKG; y/o c) una CDR3 que comprende o consiste esencialmente de ya sea (i) la secuencia de aminoácidos SSVTRGSSDY (SEQ ID NO: 118) o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SSVTRGSSDY; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos SSVTRGSSDY; en el cual las secuencias de estructura presentes en tal ISV son como se describe además en la presente, y en el cual CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 17B05 tiene actividad de. bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de ( trans ) fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2 y/o tiene una actividad de bloqueo o inhibición de (hetero) dimerización como se determina por el ensayó de fosforilación HER3 inducido por el ligando EGFR (EGF) , todo como se describe arriba.
Como se menciona en la presente, (algunas de las) secuencias tipo 17B05 pueden ser (y preferiblemente son) de manera que son capaces de inhibir o bloquear (completamente o parcialmente, como se describe además en la presente) el enlace del ligando, y en particular de inhibir o bloquear (completamente o parcialmente, como se describe además en la presente) el enlace de HRG a HER3.
Preferiblemente, en tal secuencia tipo 17B05, CDR1 y CDR2 son como se definen bajo a) y b) , respectivamente; o CDR1 y CDR3 son como se definen bajo a) y c) , respectivamente; o CDR2 y CDR3 son como se definen bajo b) y c) , respectivamente. Más preferiblemente, en tal secuencia tipo 17B05, CDR1, CDR2 y CDR3 son todas como se definen bajo a) , b) y e), respectivamente. De nuevo, en tal secuencia tipo 17B05, CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 17B05 tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la (trans) fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3 , y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2 y/o tiene una actividad de bloqueo o inhibición de la (hetero) dimerización como se determina por el ensayo de fosforilación HER3 inducido por el ligando EGFR (EGF) , todo como se describe arriba.
Por ejemplo, en tal secuencia tipo 17B05: CDR1 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos LNAMA (con CDR2 y CDR3 siendo como se define bajo b) y e), respectivamente); y/o CDR2 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos GIFGVGSTRYADSVKG (con CDR1 y CDR3 siendo como se define bajo a) y e), respectivamente); y/o CDR3 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos SSVTRGSSDY (con CDR1 y CDR2 siendo como se define bajo a) y b) , respectivamente) . Particularmente, cuando una secuencia tipo . 17B05 es de acuerdo a este aspecto: CDR1 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos LNAMA y ' CDR2 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos GIFGVGSTRYADSVKG (con CDR3 siendo como se define bajo c) de arriba) ; y/o CDR1 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos LNAMA y CDR3 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos SSVTRGSSDY (con CDR2 siendo como se define bajo b) de arriba); y/o CDR2 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos GI GVGSTRYADSVKG y CDR3 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos SSVTRGSSDY (con CDR1 siendo como se define bajo a) de arriba) . De nuevo, en tales secuencias tipo 17B05, CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 17B05 tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la ( trans ) fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT , y/o ensayo de fosforilación ERK1/2 y/o tiene una actividad de bloqueo o inhibición de la ( hetero ) dimeri zación como se determina por el ensayo de fosforilación HER3 inducido por el ligando EGFR (EGF) , todo como se describe arriba.
En un aspecto preferido específicamente, una "secuencia tipo 17B05", "ISV tipo 17B05" o "bloque de construcción tipo 17B05" es un ISV que comprende: d) una CDRl que es ya sea (i) la secuencia de aminoácidos LNAMA o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos LNAMA; y/o e) una CDR2 que es ya sea (i) la secuencia de aminoácidos GI FGVGSTRYADSVKG o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos GIFGVGSTRYADSVKG; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos GIFGVGSTRYADSVKG; y/o f) una CDR3 que es ya sea (i) la secuencia de aminoácidos SSVTRGSSDY o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SSVTRGSSDY; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como . se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos SSVTRGSSDY; en el cual las secuencias de estructura presentes en tal ISV son como se describe además en la presente, y en el cual CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 17B05 tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la ( trans ) fos forilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2 y/o tiene una actividad de bloqueo o inhibición de la (hetero) dimerización como se determina por el ensayo de fosforilación HER3 inducido por el ligando EGFR (EGF) , todo como se describe arriba.
Preferiblemente, en una . secuencia tipo 17B05 de acuerdo con este aspecto preferido específicamente, CDR1 y CDR2 son como se definen bajo d) y e), respectivamente; o CDR1 y CDR3 son como se definen bajo d) y f ) , respectivamente; o CDR2 y CDR3 son como se definen bajo e) y f ) , respectivamente. Más preferiblemente, en tal secuencia tipo 17B05, CDR1, CDR2 y CDR3 son todas como se definen bajo d) , e) y f) , respectivamente. De nuevo, en tal secuencia tipo 17B05, CDRl, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 17B05 tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la ( trans ) fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2 y/o tiene una actividad de bloqueo o inhibición de la (hetero) dimerización como se determina por el ensayo de fosforilación HER3 inducido por el ligando EGFR (EGF) , todo como se describe arriba.
Por ejemplo, en una secuencia tipo 17B05 de acuerdo con este aspecto preferido- específicamente: CDRl es la secuencia de aminoácidos LNAMA (con CDR2 y CDR3 siendo como se define bajo e) y f ) , respectivamente) ; y/o CDR2 es la secuencia de aminoácidos GIFGVGSTRYADSV G (con CDRl y CDR3 siendo como se define bajo d) y f ) , respectivamente) ; y/o CDR3 es la secuencia de aminoácidos SSVTRGSSDY (con CDRl y CDR2 siendo como se define bajo d) y e), respectivamente) . Particularmente, cuando una secuencia tipo 17B05 es de acuerdo a este aspecto: CDRl es la secuencia de aminoácidos LNAMA y CDR2 es la secuencia de aminoácidos GIFGVGSTRYADSVKG (con CDR3 siendo como se define bajo f ) de arriba) ; y/o CDR1 es la secuencia de aminoácidos LNAMA y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SSVTRGSSDY (con CDR2 siendo como se define bajo e) de arriba); y/o CDR2 es la secuencia de aminoácidos GIFGVGSTRYADSVKG y CDR3 es SSVTRGSSDY (con CDR1 siendo como se define bajo d) de arriba) . De nuevo, en tales secuencias tipo 17B05, CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 17B05 tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la ( trans ) fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2 y/o tiene una actividad de bloqueo o inhibición de la ( hetero ) dimeri zación como se determina por el ensayo de fosforilación HER3 inducido por el ligando EGFR (EGF) , todo como se describe arriba.
En una secuencia tipo 17B05 preferida particularmente: CDR1 es la secuencia de aminoácidos LNAMA, CDR2 es la secuencia de aminoácidos GIFGVGSTRYADSVKG; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SSVTRGSSDY.
En toda la secuencia tipo 17B05 descrita en este párrafo C) , las secuencias de estructura pueden ser como se describe además en la presente. Preferiblemente, las secuencias de estructura son de manera que las secuencias de estructura tienen al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90%, tal como al menos 95% de identidad de secuencia con las secuencias de estructura de 17B05 (que, por ejemplo, puede determinarse al determinar el grado general de identidad de secuencia de una secuencia dada con la secuencia de 17B05 sin tener en cuenta la CDR' s en el cálculo) . De nuevo, la combinación de CDR' s y estructuras presentes en una secuencia dada son preferiblemente de manera que la ISV tipo 17B05 resultante tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la (trans ) fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2 y/o tiene una actividad de bloqueo o inhibición de la (hetero) dimerización como se determina por el ensayo de fosforilación HER3 inducido por el ligando EGFR (EGF), .todo como se describe arriba.
En un aspecto especifico, una secuencia tipo 17B05 es un ISV que tiene al menos 70%, tal ' como al menos 80%, por ejemplo al menos 85%, tal como al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 17B05 (SEQ ID NO: 13). Por ejemplo, en una secuencia tipo 17B05 de acuerdo a este aspecto, las CDR' s pueden ser de acuerdo al aspecto preferido específicamente descrito arriba, y pueden en particular (pero sin limitación) ser LNAMA (CDR1); GIFGVGSTRYADSVKG (CDR2). ; y SSVTRGSSDY (CDR3).
De nuevo, preferiblemente, la combinación de CDR' s y estructuras presentes en tal ISV tipo 17B05 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 17B05 resultante tiene actividad de bloqueo, por ejemplo enlace HRG de bloqueo a HER3 parcialmente o completamente como se describe arriba, y/o actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la ( trans ) fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2 y/o tiene una actividad de bloqueo o inhibición de la (hetero) dimerización como se determina por el ensayo de fosforilación HER3 inducido por el ligando EGFR (EGF) , todo como se describe arriba. .
En un aspecto particular, cualquier secuencia tipo 17B05 puede ser una secuencia optimizada y/o secuencia humanizada, como se describe además en la presente.
D) Secuencias tipo 18G11 : una "secuencia tipo 18G11" , "ISV tipo 18Gil" o- "¿logue de construcción tipo 18G11" se define como un ISV (como se describe en la presente) que comprende : a) una CDR1 que¦ comprende o consiste esencialmente de ya sea (i) la secuencia de aminoácidos INAMG (SEQ ID NO: 61) o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos INAMG; y/o b) una CDR2 que . comprende o consiste esencialmente de ya sea (i) la secuencia de aminoácidos LITSSDTTDYAESVEG (SEQ ID NO: 91) o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95% de identidad de ' secuencia con la secuencia de aminoácidos LITSSDTTDYAESVEG; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5,- 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos LITSSDT DYAESVEG; y/o c) una CDR3 que comprende o consiste esencialmente de ya sea (i) la secuencia de aminoácidos DHYSMGVPEKRVIM (SEQ ID NO: 121) o (ii) una secuencia de' aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95% de identidad' de secuencia con la secuencia de aminoácidos DHYSMGVPEKRVIM; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos DHYSMGVPEKRVIM; en el cual las secuencias de estructura presentes en tal ISV son como se describe además en la presente, y en el cual CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 18G11 tiene la actividad enlazada al dominio II, actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un- ensayo de fosforilación HER3 y/o ensayo de fosforilación pAKT, todo como se describe arriba.
Como se menciona en la presente, (algunas de las) secuencias tipo 18G11 pueden tener un efecto (que puede estar limitado/parcial o más pronunciado) en ya sea el enlace del ligando/HRG (en particular, que puede a una extensión limitada/parcial ser capaz de inhibir o bloquear el enlace del ligando/HRG a HER3) y/o en la (hetero) dimerización de HER3.
Preferiblemente, en tal secuencia tipo 18G11, CDR1 y CDR2 son como se definen bajo a) y b) , respectivamente; o CDR1 y CDR3 son como se definen bajo a) y c) , respectivamente; o CDR2 y CDR3 son como se definen bajo b) y c) , respectivamente. Más preferiblemente, en tal secuencia tipo 18G11, CDR1, CDR2. y CDR3 son todas como se definen bajo a), b) y e), respectivamente. De nuevo, en tal secuencia tipo 18G11, CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 18G11 tiene actividad enlazada al dominio II, actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3 y/o ensayo de fosforilación pAKT, todo como se describe arriba.
Por ejemplo, en tal secuencia tipo 18G11: CDRl puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos INA G (con CDR2 y CDR3 siendo como se define bajo b) y c) , respectivamente); ylo CDR2 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos LITSSDTTDYAESVEG (con CDR1 y CDR3 siendo como se define bajo a) y e), respectivamente); y/o CDR3 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos DHYSMGVPEKRVIM (con CDR1 y CDR2 siendo como se define bajo aj y b) , respectivamente) . Particularmente, cuando una secuencia tipo 18G11 es de acuerdo a este aspecto: CDR1 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos INAMG y . CDR2 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos LITSSDTTDYAESVEG (con CDR3 siendo como se define bajo c) de arriba); y/o CDR1 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos INAMG y CDR3 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos DHYSMGVPEKRVIM (con CDR2 siendo como se define bajo b) de arriba); y/o CDR2 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos LITSSDTTDYAESVEG y CDR3 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos DHYSMGVPEKRVIM (con CDR1 siendo como se define bajo a) de arriba) . De nuevo, en tal secuencia tipo 18Glls, CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 18G11 tiene actividad enlazada al dominio II, actividad de bloqueo o capacidad de inhibición' de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3 y/o ensayo de fosforilación pAKT, todo como se describe arriba.
En un aspecto preferido específicamente, una "secuencia tipo 18G11", "ISV tipo 18Gil" o "bloque de construcción tipo 18G11" es un ISV que comprende: d) una CDR1 que es ya sea (i) la secuencia de aminoácidos INAMG o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos INAMG; y/o e) una CDR2 que es ya sea (i) la secuencia de aminoácidos LITSSDTTDYAESVEG o (ii) una secuencia ¦ de aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos LITSSDTTDYAESVEG; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos LITSSDTTDYAESVEG; y/o f) una CDR3 que es ya sea (i) la secuencia de aminoácidos DHYSMGVPEKRVIM o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos DHYSMGVPEKRVIM; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos DHYSMGVPEKRVIM; en el cual las secuencias de estructura presentes en tal ISV son como se describe además en la presente, y en el cual CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 18G11 tiene actividad enlazada al dominio II, actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3 y/o ensayo de fosforilación pAKT, todo como se describe arriba. · Preferiblemente, en una secuencia tipo 18G11 de acuerdo con este aspecto preferido específicamente, CDR1 y CDR2 son como se definen bajo d) y e), respectivamente; o CDR1 y CDR3 son como se definen bajo d) y f ) , respectivamente; o CDR2 y CDR3 son como se definen bajo e) y f ) , respectivamente. Más preferiblemente, en tal secuencia tipo 18G11, CDR1, CDR2 y CDR3 son todas como se definen bajo d) , e) y f) , respectivamente. De nuevo, en tal secuencia tipo 18G11, CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 18G11 tiene actividad enlazada al dominio II, actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3 y/o ensayo de fosforilación pAKT, todo como se describe arriba. Por ejemplo, en una secuencia tipo 18G11 de acuerdo, con este aspecto preferido específicamente: CDR1 es la secuencia de aminoácidos INAMG (con CDR2 y CDR3 siendo como se define bajo e) y f ) , respectivamente) ; y/o CDR2 es la secuencia de aminoácidos LITSSDTTDYAESVEG (con CDR1 y CDR3 siendo como se define bajo d) y f ) , respectivamente); y/o CDR3 es la secuencia de aminoácidos DHYSMGVPEKRVIM (con CDR1 y CDR2 siendo como se define bajo d) y e), respectivamente). Particularmente, cuando una secuencia tipo 18G11 es de acuerdo a este aspecto: CDR1 es la secuencia de aminoácidos INAMG y CDR2 es la secuencia de aminoácidos LITSSDTTDYAESVEG (con CDR3 siendo como se define bajo f) de arriba); y/o CDR1 es la secuencia de aminoácidos INAMG y CDR3 es la secuencia de aminoácidos DHYSMGVPEKRVIM (con CDR2 siendo como se define bajo e) de arriba); y/o CDR2 es la secuencia de aminoácidos LITSSDTTDYAESVEG y CDR3 es DHYSMGVPEKRVIM (con CDR1 siendo como se define bajo ' d) de arriba) . De nuevo, en tales secuencias tipo 18G11, CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 18G11 tiene actividad enlazada al dominio II, actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3 y/o ensayo de fosforilación pAKT, todo como se describe arriba.
En una secuencia tipo 18G11 preferida particularmente: CDR1 es la secuencia de aminoácidos INAMG, CDR2 es la secuencia de aminoácidos LITSSDTTDYAESVEG; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos DHYS GVPEKRVI .
En toda la secuencia tipo 18G11 descrita en este párrafo D) , las secuencias de estructura pueden ser como se describe además en la presente. Preferiblemente, las secuencias de estructura son de manera que las secuencias de estructura tienen al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90%, tal como al menos -95% de identidad de secuencia con las secuencias de estructura de 18G11 (que, por ejemplo, puede determinarse al determinar el grado general de identidad de secuencia de una secuencia dada con la secuencia de 18G11 sin tener en cuenta la CDR' s en el cálculo) . De nuevo, la combinación de CDR' s y estructuras presentes en una secuencia dada son preferiblemente de manera que la ISV tipo 18G11 resultante tiene actividad enlazada al dominio II, actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3 y/o ensayo de fosforilación pAKT, todo como se describe arriba. En un aspecto especifico, una secuencia tipo 18G11 es un ISV que tiene al menos 70%, tal como al menos 80%, por ejemplo al menos 85%, tal como al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 18G11 (SEQ ID NO: 16). Por ejemplo, en una secuencia tipo 18G11 de acuerdo a este aspecto, las CDR' s pueden ser de acuerdo al aspecto preferido específicamente descrito arriba, y pueden en particular (pero sin limitación) ser INAMG (CDR1) ; LITSSDTTDYAESVEG (CDR2); y DHYSMGVPEKRVIM (CDR3). De nuevo, preferiblemente, la combinación de CDR' s y estructuras presentes en tal ISV tipo 18G11 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 18G11 resultante tiene actividad enlazada al dominio II, actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3 y/o ensayo de fosforilación pAKT, todo como se describe arriba.
En un aspecto particular, · cualquier secuencia tipo 18G11 puede ser una secuencia optimizada y/o secuencia humanizada, como se describe además en la presente.
E) Secuencias tipo 34C07: una "secuencia tipo 34C07" , "ISV tipo 34C07" o "bloque .de construcción tipo 34C07" se define como un ISV (como se describe en la presente) que comprende : a) una CDRl que comprende o consiste esencialmente de ya sea (i) la secuencia de aminoácidos INAMA (SEQ ID NO: 63) o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos INAMA; y/o b) una CDR2 que comprende o consiste esencialmente de ya sea (i) la secuencia de aminoácidos EITAGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 93) o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos EITAGGSTNYADSVKG; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5, 4, 3,. 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define . en la presente) con la secuencia de aminoácidos EITAGGSTNYADSVKG; y/o c) una CDR3 que comprende o .consiste esencialmente de ya sea (i) la secuencia de aminoácidos DHYTTWDRRSAY (SEQ ID NO: 123) o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos DHYTTWDRRSAY; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos DHYTTWDRRSAY; en el cual las secuencias de estructura presentes en tal ISV son como se describe además en la presente, y en el cual CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 34C07 tiene actividad enlazada, al dominio II, actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe arriba.
Como se menciona en la presente, (algunas de las) secuencias tipo 34C07 pueden tener un efecto (que puede estar limitado/parcial o más pronunciado) en ya sea el enlace del ligando/HRG (en particular, que puede a una extensión limitada/parcial se capaz de inhibir o bloquear el enlace del ligando/HRG a HER3) y/o en la. (hetero) dimerización de HER3. En particular, quje puede a una extensión limitada se capaz de inhibir el enlace del ligando/HRG a HER3.
Preferiblemente, en tal secuencia tipo 34C07, CDR1 y CDR2 son como se definen bajo a) y b) , respectivamente; o CDRl y CDR3 son como se definen bajo a) y c) , respectivamente; o CDR2 y CDR3 son como se definen bajo b) y c) , respectivamente. Más preferiblemente, en tal secuencia tipo 34C07, CDRl, CDR2 y CDR3 son todas como se definen bajo a) , b) y e), respectivamente. De nuevo, en tal secuencia tipo 34C07, CDRl, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 34C07 tiene actividad enlazada al dominio II, actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe arriba.
Por ejemplo, en tal secuencia tipo 34C07: CDRl puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos INAMA (con'CDR2 y CDR3 siendo como se define bajo b) y e), respectivamente); y/o CDR2 puede comprender o consistir esencialmente de ' la secuencia de aminoácidos EITAGGSTNYADSVKG (con CDR1 y CDR3 siendo como se define bajo a) y e), respectivamente); y/o CDR3 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos DHYTTWDRRSAY (con CDRl y CDR2 siendo como se define bajo a) y b) , respectivamente) . Particularmente, cuando una secuencia tipo 34C07 es de acuerdo a este aspecto: CDRl puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos INAMA y CDR2 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos EITAGGSTNYADSVKG (con CDR3 siendo como se define bajo c) de arriba); y/o CDRl puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos INAMA y CDR3 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de . aminoácidos DHYTTWDRRSAY (con CDR2 siendo como se define bajo b) de arriba) ; y/o CDR2 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos EITAGGSTNYADSVKG y CDR3 puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos DHYTTWDRRSAY (con CDRl siendo como se define bajo a) de arriba) . De nuevo, en tales secuencias tipo 34C07, CDRl, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 34C07 tiene actividad enlazada al dominio II, actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERKl/2, todo como se describe arriba.
En un aspecto preferido específicamente, una "secuencia tipo 34C07", "ISV tipo 34C07" o "bloque de construcción tipo 34C07" es un ISV que comprende: d) una CDR1 que es ya sea (i) la secuencia de aminoácidos INAMA o (di) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos INAMA; y/o e) una CDR2 que es ya sea (i) la secuencia de aminoácidos EITAGGSTNYADSVKG o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos EITAGGSTNYADSVKG; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos EITAGGSTNYADSVKG; y/o f) una CDR3 que es ya sea (i) la secuencia de aminoácidos DHYTTWDRRSÁY o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos DHYTTWDRRSAY; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos DHYTTWDRRSAY; en el cual las secuencias de estructura presentes en tal ISV son como se describe además en la presente, y en el cual CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 34C07 tiene actividad enlazada al dominio II, actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HÉR3 , y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe arriba.
Preferiblemente, en una secuencia tipo 34C07 de acuerdo con este aspecto preferido específicamente, CDR1 y CDR2 son como se definen bajo d) y e), respectivamente; o CDR1 y CDR3 son como se definen bajo d) y- f ) , respectivamente; o CDR2 y CDR3 son como se definen bajo e) y f ) , respectivamente. Más preferiblemente, en tal secuencia tipo 34C07, CDR1, CDR2 y CDR3 son todas como se definen bajo d) , e) y f) , respectivamente. De nuevo, en tal secuencia tipo 34C07, CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 34C07 tiene actividad enlazada al dominio II, actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe arriba.
Por ejemplo, en una secuencia tipo 34C07 de acuerdo con este aspecto preferido específicamente: CDR1 es la secuencia de aminoácidos INA A (con CDR2 y CDR3 siendo como se define bajo e) y f ) , respectivamente); y/o CDR2 es la secuencia de aminoácidos EITAGGSTNYADSVKG (con CDR1 y' CDR3 siendo como se define bajo d) y f) , respectivamente); y/o CDR3 es la secuencia de aminoácidos DHYTT DRRSAY (con CDR1 y CDR2 siendo como se define bajo d) y e), respectivamente). Particularmente, cuando una secuencia tipo 34C07 es de acuerdo a este aspecto: CDR1- es la secuencia de aminoácidos INAMA y CDR2 es la secuencia de aminoácidos EITAGGSTNYADSVKG (con CDR3 siendo como se define bajo f ) de arriba) ; y/o CDR1 es la secuencia de aminoácidos INAMA y CDR3 es la secuencia de aminoácidos DHYTTWDRRSAY (con CDR2 siendo como se define bajo e) de arriba); y/o CDR2 es la secuencia de aminoácidos EITAGGSTNYADSVKG y CDR3 es DHYTTWDRRSAY (con CDR1 siendo como se define bajo d) de arriba) . De nuevo, en tales secuencias tipo 34C07, CDR1, CDR2 y CDR3 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 34C07 tiene actividad enlazada al dominio II, actividad de bloqúeo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe arriba.
En una secuencia tipo 34C07 preferida particularmente: CDR1 es la secuencia de aminoácidos INAMA, CDR2 es la secuencia de aminoácidos EITAGGSTNYADSVKG; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos DHYT.TWDRRSAY .
En toda la secuencia tipo 34C07 descrita en este párrafo E), las secuencias de estructura pueden ser como se describe además en la presente. Preferiblemente, las secuencias de estructura son de manera que las secuencias de estructura tienen al menos 80%, tal- como al menos 85%, por ejemplo al menos 90%, tal como al menos 95% de identidad de secuencia con las secuencias de estructura de 34C07 (que, por ejemplo, puede determinarse al determinar el grado general de identidad de secuencia de una secuencia dada con la secuencia de 34C07 sin tener en cuenta la CDR' s en el cálculo) . De nuevo, la combinación de CDR' s y estructuras presentes en una secuencia dada son preferiblemente de manera que la ISV tipo 34C07 resultante tiene actividad enlazada al dominio II, actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe arriba.
En un aspecto especifico, una secuencia tipo 34C07 es un ISV que tiene al menos 70%, such al menos 80%, por ejemplo al menos 85%, tal como al menos 90% o más de 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 34C07 (SEQ ID NO: 18). Por ejemplo, en una secuencia tipo 34C07 de acuerdo a este aspecto, las CDR' s pueden ser de acuerdo al aspecto preferido específicamente descrito arriba, y pueden en particular (pero sin limitación) ser INAMA (CDR1) ; EITAGGSTNYADSVKG (CDR2); y DHYTTWDRRSAY (CDR3). De nuevo, preferiblemente, la combinación de CDR' s y estructuras presentes en tal ISV tipo 34C07 son preferiblemente de manera que la ISV tipo 34C07 resultante tiene actividad enlazada al dominio II, actividad de bloqueo o capacidad de inhibición de la fosforilación en un ensayo de fosforilación HER3, y/o ensayo de fosforilación pAKT, y/o ensayo de fosforilación ERK1/2, todo como se describe arriba.
En un aspecto particular, cualquier secuencia tipo 34C07 puede ser una secuencia optimizada y/o secuencia humanizada, como se describe adémás en la presente.
En un aspecto particular, cualquier secuencia tipo 34C07 puede ser una secuencia optimizada y/o secuencia humanizada, como se describe además en la presente.
Todas de las secuencias de aminoácidos de la invención como se describe en la presente (incluyen aquellas de acuerdo a aspectos específicos mencionadas en la presente, tal como los aspectos mencionados en el párrafo precedente) que puede enlazar a HER3 con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (actual o aparente), un valor KA (actual o aparente), una relación kon y/o una relación k0ff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente), que es como se define en la presente; asi como compuestos y constructos, y en particular proteínas y polipéptidos , que comprenden al menos una de tal secuencia de aminoácidos .
En particular, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención son preferiblemente de manera que : - enlazan a HER3 con una constante de disociación (KD) de 10"5 hasta 10"12 moles/litro o menos, y 10"7 hasta 10"12 moles/litro o menos y más preferiblemente 10"8 hasta 10"12 moles/litro (esto es con una constante de asociación (KA) de 105 hasta 1012 litro/moles o más, y preferiblemente 107 hasta 1012 litro/moles o más y más preferiblemente 108 hasta 1012 litro/moles); y/o de manera que: - enlazan a HER3 con una constante kon de entre 102 M"1s~1 hasta alrededor de 107 M"1s"1, preferiblemente entre 103 M"1s"1 y 107 M_1s_1, más preferiblemente entre 104 M^s"1 y 107 M~1s"1, tal como entre 105 M"1s"1 y 107 M~1s~1; y/o de manera que: - enlaza a HER3 con una constante kDff entre 1 s"1 (ti/2= 0.69 s) y 10"6 s"1 (proporcionando un complejo irreversible puro con una ti/2 de días múltiples), preferiblemente entre 10"2 s"1 y 10"6 s"1, más 'preferiblemente entre 10"3 s"1 y 10"6 s" \ tal como entre 10~4 s"1 y 10"6 s"1.
Preferiblemente, una secuencia de aminoácidos monovalente de la invención (o un polipéptido que contiene sólo una secuencia de aminoácidos de la invención) es de manera que enlazará HÉR3 con una afinidad menos de 500 nM, preferiblemente menos de 200 nM, más preferiblemente menos de 10 nM, tal como menos de 500 pM .
Algunos valores IC50 preferidos para enlace de las secuencias de aminoácidos o polipéptidos de la invención a HER3 se volverán claros de la descripción adicional y ejemplos en la presente.
Para el enlace a HER3, una secuencia de aminoácidos de la invención usualmente contendrá dentro de su secuencia de aminoácidos uno o más residuos de aminoácido o uno o más extensiones de residuos de aminoácido (esto es con cada "extensión" que comprende dos o más residuos de aminoácido que son adyacentes uno con el otro o en proximidad cercana uno con el otro, esto es en la estructura primaria o terciaria de la secuencias de aminoácidos) por medio de la cual la secuencia de aminoácidos de la invención puede enlazar a HER3, cuyos residuos de aminoácido o extensiones de residuos de aminoácido, de esta manera forman el "sitio" para enlazar a HER3 (también referido en la presente como el "sitio enlazado al antigeno") .
Las secuencias, de aminoácidos proporcionadas por la invención están preferiblemente en forma aislada esencialmente (como se define en la presente) , o forma parte de una proteina o polipéptido de la invención (como se define en la presente) , que puede comprender o consistir esencialmente de una o más secuencias de aminoácidos de la invención y que puede comprender además opcionalmente una o más secuencias de aminoácidos adicionales (todas ligadas opcionalmente por medio de una o más ligaduras adecuadas) . Por ejemplo, y sin limitación, una o más secuencias de aminoácidos de la invención pueden usarse como una unidad de enlace en tal proteina o polipéptido, que puede contener opcionalmente una o más secuencias de aminoácidos adicionales que pueden servir como una unidad de enlace (esto es contra uno o más objetivos diferentes de HER3), a fin de proporcionar un polipéptido monovalente, multivalente o multiespecifico de la .invención, respectivamente, todo como se describe en la presente. Tal proteina o polipéptido también puede estar en forma aislada esencialmente (como se define en la presente) .
Las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención como tales preferiblemente consisten esencialmente de una cadena de aminoácido sencilla que no se liga por medio de puentes de disulfuro a cualquier otra secuencia de aminoácidos o cadena (pero que puede o no puede contener uno o más puentes de disulfuro intramoleculares. Por ejemplo, se conoce que los¦ dominios variables sencillos de inmunoglobulina y/o Nanocuerpos - como se describe en la presente - pueden algunas veces contener un puente de disulfuro entre CDR3 y · CDR1 o FR2 ) . Sin embargo, debe señalarse que una o más secuencias de aminoácidos de la invención pueden ligarse una con la otra y/o a otras secuencias de aminoácidos (por ejemplo por medio de puentes de disulfuro) para proporcionar constructos de péptido que también pueden ser útiles en la invención (por ejemplo fragmentos Fab' , fragmentos F(ab' )2r constructos ScFv, "diacuerpos" y otros constructos multiespecificos . Se hace referencia por ejemplo a la revisión por Holliger and Hudson, Nat Biotechnol . Sep 2005; 23(9) : 1126-36) .
Generalmente, cuando una secuencia de aminoácidos de la invención (o un compuesto, constructo o polipéptido que comprende la misma) se pretende para la administración a un sujeto (por ejemplo para propósitos terapéuticos y/o de diagnóstico como se describe en la presente), es preferiblemente ya sea una secuencia de aminoácidos que no ocurre naturalmente en el sujeto; o, cuando ocurre naturalmente en el sujeto, en forma aislada esencialmente (como se define en la presente) .
También será claro para la persona experimentada que para uso farmacéutico,' las secuencias de aminoácidos de la invención (asi como compuestos, constructos y polipéptidos que comprenden las mismas) preferiblemente se dirigen contra HER3 humano; mientras que para propósitos veterinarios, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención preferiblemente se dirigen contra HER3 de la especie a tratarse, o en al menos- reactivo cruzado con HER3 de la especie a tratarse.
Adicionalmente, una secuencia de aminoácidos de la invención puede opcionalmente , y además para al menos un sitio de enlace enlazarse contra HER3, contiene uno o más sitios de enlace adicionales para enlazarse contra otros antígenos, proteínas u objetivos.
La eficacia de las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención, y de composiciones que comprenden la misma, puede probarse usando cualquier ensayo in vitro, ensayo basado en célula, ensayo in vivo y/o modelo animal adecuado conocido per se, o cualquier combinación de los mismos, dependiendo de la la enfermedad o trastorno específico involucrado. Los ensayos y modelos animal adecuados serán claros para la persona experimentada, y por ejemplo incluyen [fosforilación de HER3 dependiente del ligando (Wallasch et. Al. (1995) EMBO J 14(17) : 4267-4275), y modelos de tumor de xenoinjerto (Schoeberl et. al. (2009) Sci. Signal . 2(77): ra 31)], asi como los ensayos y modelos animal usados en la parte experimental abajo y en la técnica previa citada en la presente.
También, de acuerdo con la invención, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos que se dirigen contra HER3 de una primera especie de animal de sangre caliente, pueden o no pueden mostrar reactividad cruzada con HER3 de una o más de otra especie de animal de sangre caliente. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos dirigidas contra HER3 humano pueden o no pueden mostrar reactividad cruzada con HER3 de una o más de otra especie de primates (tal como, sin limitación, monos del género Macaca (tal como, y en particular, monos cynomolgus (Macaca fascicularis) y/o monos rhesus (Macaca mulatto) ) y babuino (Papio ursinus) ) y/o con HER3 de una o más especie de animales que se usan a menudo en modelos animal para enfermedades (por ejemplo ratón, rata, conejo, cerdo o perro) , y en particular en modelos animal para enfermedades y trastornos asociados con HER3 (tal como las especies y modelos animal mencionados en la presente) . En este sentido, será claro para la persona experimentada que tal reactividad cruzada, cuando se presenta, puede tener ventajas de un punto de vista en el desarrollo del fármaco, ya que permite a las secuencias de aminoácidos y polipéptidos contra HER3 humano tratarse en tales modelos de enfermedad.
Más generalmente, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención que son reactivos cruzados con HER3 de especies múltiples de mamífero usualmente serán ventajosos para uso en aplicaciones veterinarias, ya que permitirán que la same secuencia de aminoácidos o polipéptido a usarse atraviesen especies múltiples. De esta manera,, también se abarca dentro del alcance de la invención que las secuencias de aminoácidos y polipéptidos dirigidos contra HER3 de una especie de animal (tal como secuencias de aminoácidos y polipéptidos contra HER3 humano) pueden usarse en el tratamiento de otra especie de animal, siempre y cuando el uso de las secuencias de aminoácidos y/o polipéptidos proporcione los efectos deseados en la especie a tratarse.
La presente invención está en su sentido más amplio particularmente tampoco limitada a, o definida por un determinante antigénico, epítopo, parte, dominio, subunidad o confirmación específica (donde sea aplicable) de HER3 contra las cuales las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención se dirigen. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos pueden o no pueden dirigirse contra un "sitio de interacción" (como se define en la presente) . Sin embargo, generalmente se asume y prefiere que las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención preferiblemente se dirijan contra, un sitio de interacción (como se define en la presente), y en particular contra el sitio enlazado a Heregulin y/o sitio de heterodimerización (ver Hsieh y Moasser, supra) . De esta manera, como se describe además en la presente, en un aspecto preferido, pero no limitante, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención se dirigen contra el sitio enlazado al ligando HER3 y/o contra el sitio de heterodimerización de HER3, y son como se define además en la presente . Se señala que otros ligandos HER3 se han descrito además de Heregulin (Sithanandam and Anderson (2008) Cáncer Gene Therapy, supra) . De esta manera, en otro aspecto preferido, pero no limitante, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención se dirigen contra el sitio enlazado a Heregulin (también referido en la presente como "HRG") y/o contra el sitio de heterodimerización de HER3. Como se menciona arriba, las secuencias de aminoácidos de la invención que se dirigen contra el sitio enlaz'ado a HRG también se refieren en la presente como "secuencias de aminoácidos que bloquean HRG", "bloques de construcción que bloquean HRG" o, cuando son ISV's, "ISV's que bloquean HRG". Las secuencias de aminoácidos de la invención que se dirigen contra el sitio enlazado a HRG (y que más preferiblemente también son capaces de inhibir o bloquear la heterodimerización HER3, como se describe además en la presente) también se refieren en la presente como "secuencias de aminoácidos que bloquean la dimerización" , "¿logues de construcción que bloquean la dimerización" o, cuando son ISV's, "ISV's que bloquean la dimerización" .
Como se describe además en la presente, un polipéptido de la invención puede contener dos o más secuencias de aminoácidos de la invención que se dirigen contra HER3 y en un aspecto preferido contener dos secuencias de aminoácidos diferentes tales como dominios variables sencillos de inmunoglobulina que se dirigen contra HER3. Generalmente, tales polipéptidos enlazarán a HER3 con actividad incrementada comparada con . una secuencia de aminoácidos sencilla de la invención. Tal polipéptido puede por ejemplo comprender dos secuencias de aminoácidos de la invención que se dirigen contra el mismo determinante antigénico, epitopo, parte, dominio, subunidad o confirmación (donde sea aplicable) de HER3 (que · puede o no puede ser un sitio de interacción) ; o comprende al menos una "primera" secuencia de aminoácidos de la invención que se dirige contra un mismo primer determinante antigénico, epitopo, parte, dominio, subunidad o confirmación (donde sea aplicable) de HER3 (que puede por ejemplo ser el sitio de interacción de Heregulin) ; y al menos una "segunda" secuencia de aminoácidos de la invención que se dirige contra un segundo determinante antigénico, epitopo, parte, dominio, subunidad o confirmación (donde sea aplicable) diferente del primero (y que puede ser por ejemplo dirigirse contra el sitio de heterodimerización) . Preferiblemente, en tales polipéptidos "biparatópicos" de la invención, al menos una secuencia de aminoácidos de la invención se dirige contra un sitio de interacción (como se define en la presente) , aunque la invención en su sentido más amplio no se limite a esto.
En consecuencia, y como se describe además en la presente, en un aspecto ventajoso específicamente pero no limitante, la invención hace esto posible para proporcionar polipéptidos de la invención que tanto se dirigen contra el sitio enlazado a HRG como también son capaces de bloquear o inhibir la heterodimerización HER3, por ejemplo al combinar uno o más (tal como uno o dos) bloques de construcción que bloquean HRG con uno o más (tal como uno o dos) bloques de construcción que bloquean la dimerización en un polipéptido sencillo de la invención (que puede ser como se describe además en la presente) .
También, cuando el objetivo (esto es HER3) es parte de un par de enlace (por ejemplo, un par enlazado al receptor-ligando) , las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de manera que pueden competir con el compañero de enlace cognado (por ejemplo el ligando, receptor u otros compañero de enlace, como sea aplicable) para enlazar al objetivo, y/o de manera que (completamente o parcialmente) neutralizan el enlace del compañero de enlace al objetivo. En este sentido, debe de nuevo señalarse que, como se menciona arriba, otros ligandos HER3 se han descrito además de Heregulin (Sithanandam and Anderson (2008) Cáncer Gene Therapy, supra) , y las secuencias de aminoácidos de la invención pueden (también) competir con y/o (completamente o parcialmente) neutralizar el enlace de tales ligandos a HER3.
También está dentro del alcance de la invención que, donde sea aplicable, una secuencia de aminoácidos de la invención puede enlazar a dos o más determinante antigénicos, epitopos, partes, dominios, subunidad o confirmaciones de HER3. En tal caso, los determinantes antigénicos, epitopos, partes, dominios o subunidades de HER3 a las cuales las secuencias de aminoácidos y/o polipéptidos de la invención se enlazan pueden ser esencialmente¦ los mismos (por ejemplo, si HER3 contiene porciones estructurales repetidas u ocurre en una forma multimérica) o pueden ser diferentes (y en el último caso, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención pueden enlazar a tales determinantes antigénicos, epitopos, partes,- dominios, subunidades de HER3 diferentes con una afinidad y/o especificidad que puede ser la misma o diferente). También, por ejemplo, cuando HER3 existe en una conformación activada y en una conformación inactiva, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención pueden enlazar a ya sea una de esta confirmación, o pueden enlazar a ambas de estas confirmaciones (esto es con una afinidad y/o especificidad que puede ser la misma o diferente) . También, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención pueden enlazar a una conformación de HER3 en la cual se enlaza a un ligando pertinente, pueden enlazar a una conformación de HER3 en la cual no enlaza a un ligando pertinente, o pueden enlazar a ambas de tales conformaciones (de nuevo con una afinidad y/o especificidad que puede ser la misma o diferente) .
También se espera que las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención generalmente enlazarán a todos los análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos de HER3 que se presentan naturalmente o sintéticos; o al .menos a aquellos análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos de HER3 que contienen uno o más determinantes antigénicos o epitopos que son esencialmente los mismos como los determinantes antigénicos o epitopos a los cuales las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención se enlazan en HER3 (por ejemplo en HER3 de tipo natural) . De nuevo, en tal caso, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención pueden enlazar a tales análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos con una afinidad y/o especificidad que son la misma como, o que son diferente de (esto es mayor que o menor que), la afinidad y especificidad con las cuales las secuencias de aminoácidos de . la invención enlazan a HER3 (tipo natural) . También se incluye dentro del alcance de la invención que las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención enlazan a algunos análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos de HER3, pero no a otros.
Cuando HER3 existe en una forma monomérica y en una o más formas multiméricas , está dentro del alcance de la invención que las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención sólo enlazan a HER3 en forma monomérica, sólo enlazan a HER3 en forma, multimérica, o enlazan a tanto la forma monomérica como multimérica. De nuevo, en tal caso, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención pueden enlazar a la forma monomérica con una afinidad y/o especificidad que son la misma como, o que son diferente de (esto es mayor que o menor que) , la afinidad y especificidad con las cuales las secuencias de aminoácidos de la invención enlazan a la forma multimérica.
También, cuando HER3 puede asociarse con otras proteínas o polipéptidos para formar complejos de proteína (por ejemplo con MET , HERI, HER2 , o HER4 ) , está dentro del alcance de la invención que las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención enlazan a HER3 en s estado no asociado, enlazan a HER3 en su estado asociado, o enlazan a ambos, preferiblemente enlazan sólo o preferencialmente a su estado no asociado y se previene en cualquier evento de heterodimeri zación al menos parcialmente. En todos estos casos, las secuencias dé aminoácidos y polipéptidos de la invención pueden enlazar a tales multimeros o complejos de proteina asociados con una afinidad y/o especificidad que puede ser la misma como o diferente de (esto es mayor que o menos que) la afinidad y/o especificidad con las cuales las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención enlazan a HER3 en su estado monomérico y no asociado. También, como será claro para la persona experimentada, las proteínas o polipéptidos que contienen dos o más secuencias de aminoácidos dirigidas contra HER3 pueden enlazar con avidez superior a HER3 que las secuencias de aminoácidos monoméricas correspondientes. Por ejemplo, y sin limitación, las proteínas o polipéptidos que contienen dos o más secuencias de aminoácidos dirigidas contra diferentes epítopos de HER3 pueden (y usualmente) enlazarán con avidez superior que cada uno de los monómeros diferentes, y proteínas o polipéptidos que contienen dos o más secuencias de aminoácidos dirigidas contra HER3 pueden (y usualmente) enlazarán también con avidez superior a un multimero de HER3.
Generalmente, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención al menos enlazarán a aquellas formas de HER3 (incluyendo formas' monoméricas, multiméricas y asociadas) que son las más relevantes de un punto de vista biológico y/o terapéutico, como será claro para la persona experimentada y son en un aspecto preferido como se describe en la presente.
También está dentro del alcance de la invención usar partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivados de las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención, y/o usar proteínas o polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente de uno o más. de tales partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivados, siempre y cuando estos sean adecuados para los usos previstos en la presente. Tales partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivados contendrán usualmente (al menos parte de) un sitio enlazado a antígeno funcional para enlace contra HER3; y más preferiblemente será capaz de enlace específico a HER3, y aún más preferiblemente capaz de enlazar a HER3 con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (actual o aparente), un valor KA (actual o aparente), una constante kon y/o una constante koff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) que es como se define en la presente. Algunos ejemplos no limitantes de tales partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos, derivados, proteínas y/o polipéptidos se volverán claros de la descripción adicional en la presente. Los fragmentos o polipéptidos adicionales de la invención también pueden proporcionarse al combinar adecuadamente (esto es por ligadura o fusión genética) una o más (más pequeñas) partes o fragmentos como se describe en la presente.
En un aspecto específico, pero no limitante de la invención, que se describirá además en la presente, tales análogos, mutantes, variantes, alelos, derivados tienen una vida media incrementada en suero (como se describe además en la presente) comparada con la secuencia de aminoácidos de la cual se ha derivado. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de la invención puede ligarse (químicamente o de otra manera) a uno o más grupos o porciones que extienden la vida media (tal como PEG) , a fin de proporcionar un derivado de una secuencia de aminoácidos de la invención con vida media incrementada.
En un aspecto específico, pero no limitante, la secuencia de aminoácidos de la invención puede ser una secuencia de aminoácidos que comprende un pliegue de inmunoglobulina o puede ser una secuencia de aminoácidos que, bajo condiciones adecuadas (tales como condiciones fisiológicas) es capaz de formar un pliegue de inmunoglobulina (esto es por plegado) . Se hace referencia ínter alia a la revisión por Halaby et al., J. (1999) Protein Eng. 12, 563-71. Preferiblemente, cuando adecuadamente se pliega con objeto de formar un pliegue de inmunoglobulina, tal secuencia de aminoácidos es capaz de enlace específico (como se define en la presente) a HER3; y más preferiblemente capaz de enlazar a HER3 con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente con un. valor KD (actual o aparente), un valor K¾ (actual o aparente) , una constante kon y/o una constante k0ff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la .presente) que es como se define en la presente. También, las partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivados de tales secuencias de aminoácidos son preferiblemente de manera que comprenden un pliegue de inmunoglobulina o son capaces de formar, bajo condiciones adecuadas, un pliegue- de inmunoglobulina.
En particular, pero sin limitación, las secuencias de aminoácidos de la inrencion pueden ser secuencias de aminoácidos que consisten esencialmente de 4 regiones de estructura (FR1 hasta FR4 respectivamente) y 3 regiones que determinan la complementariedad (CDR1 hasta CDR3 respectivamente) ; o cualquier fragmento adecuado de tal secuencia de aminoácidos (que luego usualmente contiene al menos algunos de los residuos de aminoácido que forman al menos una de las CDR's, como se describe además en la presente) .
Las secuencias de aminoácidos de la invención pueden en particular ser una secuencia de inmunoglobulina o un fragmento adecuado de las mismas, y más en particular ser una secuencia dominio variable sencillo de inmunoglobulina o un fragmento adecuado de la misma, tal como secuencia de dominio variable de cadena ligera (por ejemplo una secuencia VL) o un fragmento adecuado de la misma; o una secuencia de dominio variable de cadena pesada (por ejemplo una secuencia VH) o un fragmento adecuado de la misma. Cuando la secuencia de aminoácidos de la invención es una secuencia de dominio variable de cadena pesada, puede ser una secuencia de dominio variable de cadena pesada que se deriva de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional (tal como, sin limitación, una secuencia VH que se deriva de un anticuerpo humano) o es una asi llamada secuencia VHH (como se define en la presente) que se deriva de uno asi llamado "anticuerpo de cadena pesada" de un animal de la familia de camélidos tal como por ejemplo una llama (como se define en la presente) .
Sin embargo, debe señalarse que la invención no se limita como el origen de la secuencia de aminoácidos de la invención (o de la secuencia de nucleótidos de la invención usada para expresarse) , ni como la forma que la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótido de la invención es (o se ha) generado u obtenido. De esta manera, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden ser secuencias de aminoácidos que se presentan naturalmente (de cualquier especie adecuada) o secuencias de aminoácidos sintéticas o semi-sintéticas . En un aspecto especifico pero no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos es una secuencia de inmunoglobulina que se presenta naturalmente (de cualquier especie adecuada) o una secuencia de inmunoglobulina sintética o semi-sintética, incluyendo pero no limitada a secuencias de inmunoglobulinas "humanizadas" (como se define en la presente) (tal como secuencias de inmunoglobulinas de ratón o conejo parcialmente o completamente humanizadas, y en particular secuencias VHH O Nanocuerpos parcialmente o completamente humanizadas), "camélidos" (como se define en la presente) , asi como secuencias de inmunoglobulina que se han optimizado en secuencia para expresión óptima y/o estabilidad y/o solubilidad, asi como secuencias de inmunoglobulina que se han obtenido por técnicas tal como maduración por afinidad (por ejemplo, partiendo de secuencias de inmunoglobulina sintéticas, aleatorias o que se presentan naturalmente), injerto CDR, restauración por canillas, combinación de fragmentos derivados. de diferentes secuencias de inmunoglobulina , ensamble PCR usando cebadores traslapados, y técnicas similares para preparar por ingeniería secuencias de inmunoglobulina bien conocidas para la persona experimentada; o cualquier combinación adecuada de cualquiera de los anteriores. Se ha referencia por ejemplo a los libros de texto estándares, así como a la descripción adicional y técnica previa mencioanda en la presente.
Similarmente, las secuencias de nucleótido de la invención pueden ser secuencias de nucleótido que se presentan naturalmente o secuencias sintéticas o semi-sintéticas, y pueden por ejemplo ser secuencias que se aislan por PCR de una plantilla que se presenta naturalmente adecuada (por ejemplo ADN o ARN asilado de una célula), secuencias de nucleótido que . se han aislado de una colección (y en particular, una colección de expresión) , secuencias de nucleótido que se han preparado al introducir las mutaciones en una secuencia de nucleótido que se presenta naturalmente (usando cualquier técnica adecuada conocida per se, tal como PCR de incompatibilidad) secuencia de nucleótido que se ha preparado por PCR usando cebadores traslapados, o secuencias de nucleótido que se' han preparado usando técnicas para síntesis de ADN conocidas per se.
La secuencia de aminoácidos de la invención puede en particular ser un dominio variable sencillo de inmunoglobulina (o un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que es adecuado para uso como un dominio variable sencillo de inmunoglobulina) , un anticuerpo de dominio (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como un anticuerpo de dominio) , un anticuerpo de dominio sencillo (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como un anticuerpo de dominio sencillo) , un "dAb" (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como un dAb) o un Nanocuerpo (como se define en la presente, e incluyendo pero no limitado a una secuencia VHH) otros dominios variables sencillos, o cualquier fragmento adecuado de cualquiera de uno del mismo. Para una descripción general de anticuerpos de dominio (sencillo) , también se hace referencia a la técnica previa citada arriba, asi como a EP 0 368 684. Para el término "dAb's", se hace referencia por ejemplo a Ward et al. (Nature, 12 de Octubre de 1989; 341 (6242) : 544-6), a Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(1 l) :484-490; asi como a por ejemplo WO 06/030220, WO 06/003388 y otras solicitudes de patente publicadas de Domantis Ltd. También debe señalarse que, aunque menos preferido en el contexto de la presente invención debido a que no son de origen mamífero, los anticuerpos de dominio sencillo o dominios variables sencillos pueden derivarse de ciertas especies de tiburón (por ejemplo, los asi llamados "dominios IgNAR", ver por ejemplo WO 05/18629)'.
En particular, la secuencia de aminoácidos de la invención puede ser un dominio variable sencillo de inmunoglobulina o Nanocuerpo (como se define en la presente) o un fragmento adecuado de las mismas. Tales Nanocuerpos dirigidos contra HER3 también se referirán en la presente como "Nanocuerpos de la invención" .
Para una descripción general de dominio variable sencillo de inmunoglobulina o Nanocuerpos (Nota: el término "dominio variable sencillo de inmunoglobulina" y "Nanocuerpos" se usan intercambiablemente en esta solicitud) , se hace referencia a la descripción adicional de abajo, asi como a la técnica previa citada en la presente. En particular, el término Nanocuerpo es como se define en WO 08/020079 o WO 09/068.627, y como se describe allí dentro generalmente se refiere a un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene las características funcionales y/o estructurales de un dominio VHH (por ejemplo un dominio VH de los anticuerpos "sólo de cadena pesada" que ocurren en Camélidos), y como tales pueden en particular ser un VHH (nativo) , un VHH humanizado o VH camélido, tal como un VH humano camélido.
En este sentido, debe sin embargo señalarse que esta descripción y la técnica previa principalmente describen Nanocuerpos de la así llamada "clase VH3" (esto es Nanocuerpos con un alto grado de homología de secuencia a las secuencia de línea germinal humana .de la clase VH3 tal como DP-47, DP-51 o DP-29), cuyos Nanocuerpos forman un aspecto preferido de esta invención. Debe sin embargo señalarse que la invención en su sentido más amplio generalmente cubre cualquier tipo dé Nanocuerpo dirigido contra HER3, y por ejemplo también cubre los Nanocuerpos que pertenecen a la así llamada "clase VH4" (esto es Nanocuerpos con un alto grado de homología de secuencia a las secuencias de línea germinal humana de la clase VH4 tal como DP-78), como por ejemplo descrita en WO 07/118670.
Generalmente, los Nanocuerpos (en particular secuencias VHH y Nanocuerpos parcialmente humanizados) pueden en particular caracterizarse por la presencia de uno o más "residuos estereotípicos" (como se describe en la presente) en una o más de las secuencias de estructura (de nuevo como se describe además en la presente) .
De esta manera, generalmente, un Nanocuerpo puede definirse como una secuencia de aminoácidos con la estructura (general) FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 en la cual FR1 hasta FR4 se refiere a regiones de la estructura 1 hasta 4, respectivamente, y en la cual CDR1 hasta. CDR3 se refiere a las regiones que determinan la complementariedad 1 hasta 3, respectivamente, y en la cual uno o más de los residuos estereotípicos son como se define además en la presente.
En particular, un Nanocuerpo puede ser una secuencia de aminoácidos con la estructura (general) FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 en la cual FR1 hasta FR4 se refiere a regiones de estructura 1 hasta 4, respectivamente, y en la cual CDR1 hasta CDR3 se refiere a las regiones que determinan la complementariedad 1 hasta 3, respectivamente, y en la cual las secuencias de estructura son como se define además en la presente.
Más en particular, un Nanocuerpo puede ser una secuencia de aminoácidos con la estructura (general) FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 en la cual FR1 hasta FR4 se refiere a regiones de estructura 1 hasta 4, respectivamente, y en la cual CDR1 hasta CDR3 se refiere a las regiones que determinan la complementariedad 1 hasta 3, respectivamente, y en la cual: i) preferiblemente uno o más de los residuos de aminoácido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo a la numeración Kabat se eligen de los residuos estereotípicos mencionados en la Tabla B-2 a continuación. En estos Nanocuerpos, las secuencias CDR son generalmente como se define además en la presente.
Tabla B-2 : Residuos estereotípicos en Nanocuerpos Como se describe además en la presente, cuando los ISV's son nanocuerpos, pueden contener secuencias de estructura que son generalmente como se describe en las páginas 258 hasta 297 de WO 09/068627 (incorporada en la presente como referencia) . Algunas secuencias de estructura preferidas especificas, pero no limitadas (y combinaciones preferidas de las mismas) serán claras para la persona experimentada con base en la descripción en la presente y por ejemplo incluye las secuencias FR1, FR2, FR3 y FR4 (y combinaciones de la mismas) que están presentes en los Nanocuerpos enlistados en la Tabla A-l (ver también Tabla B-l), o variantes de los mismos con sólo un número limitado (tal como menos de 5, por ejemplo 4, 3, 2 o sólo 1 por cada FR1, FR2 , FR3 o FR ) de diferencias de aminoácido' (como se define en WO 09/068627 y en WO 08/020079), que pueden por ejemplo ser sustituciones humanizadas y/u otras diferencias de aminoácido que se han introducido para el propósito de la optimización de secuencia (algunos ejemplos no limitantes de tanto el formador como el último será claro para la persona experimentada con base en la descripción en la presente y en WO 09/068627 y en WO 08/020079) .
De esta manera, la invención también se refiere a tales Nanocuerpos que pueden enlazar . a (como se define en la presente) y/o se dirigen contra HER3, a fragmentos adecuados de los mismos, asi como a polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente de uno o más de tales Nanocuerpos y/o fragmentos adecuados.
SEQ ID NO's: 12 hasta 26 (ver Tabla A-l) da las secuencias de aminoácidos de un número de dominios variables sencillos de inmunoglobulina que se han elevado contra HER3.
Tabla A-l: Dominios variables sencillos de inmunoglobulina preferidos o secuencias de Nanocuerpo (también referidos en la presente como una secuencia con un nombre particular o.SEQ ID NO: X, en donde X es un número que se refiere a la secuencia de aminoácido relevante) : En particular, la invención en algunos aspectos específicos proporciona: - secuencias de aminoácidos que se dirigen contra (como se define en la presente) HER3 y que tienen al menos 80%, preferiblemente al menos 85%, tal como 90% o 95% o más identidad de secuencia · con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 12 hasta 26 (ver Tabla A-l). Estas secuencias de aminoácidos pueden además ser de manera que neutralizan el enlace del ligando cognado a HER3 ; y/o compite con el ligando cognado para enlazar a HER3; y/o se dirigen contra el sitio de heterodimeri zación (como se define en la presente) en HER3; secuencias de aminoácidos que bloquean de forma cruzada (como se define en la presente) el enlace de al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 12 hasta 26 (ver Tabla A-l) a HER3 y/o que compite con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 12 hasta 26 (ver Tabla A-l) para enlazar a HER3. De nuevo, estas secuencias de aminoácidos pueden además ser de manera que neutralizan el enlace del ligando cognado a HER3; y/o compiten con el ligando cognado para enlazar a HER3; y/o se dirigen contra el sitió de heterodimerización (como se define en la presente) en HER3; cuyas secuencias de aminoácidos pueden ser como se describe además en la presente (y pueden por ejemplo ser Nanocuerpos) ; asi como polipéptidos de la invención que comprenden una o más de tales secuencias de aminoácidos (que pueden ser como se describe además en la presente, y pueden por ejemplo ser polipéptidos biespecificos y/o biparatópicos como se describe en la presente) , y secuencias de ácido nucleico que codifican tales secuencias de aminoácidos y polipéptidos . Tales secuencias de aminoácidos y polipéptidos no incluyen ninguno de los ligandos que se presentan naturalmente.
En algunos otros aspectos específicos, la invención proporciona: secuencias de aminoácidos de la invención que son específicas para HER3 comparadas con HERI, HER2 y/o HER4; cuyas secuencias de aminoácidos de la invención pueden ser como se describe además en la presente (y pueden por ejemplo ser Nanocuerpos ) ; así como polipéptidos de la invención que comprenden una o más de tales secuencias de aminoácidos (que pueden ser como se describe además en la presente, y pueden por ejemplo ser polipéptidos biespecífieos y/o biparatópicos como se describe en la presente), y secuencias de ácido nucleico que codifican tales secuencias de aminoácidos y polipéptidos. Tales secuencias de aminoácidos y polipéptidos no incluyen ninguno de los ligandos que se presentan naturalmente.
En consecuencia, algunos Nanocuerpos preferidos particularmente de la invención son nanocuerpos que pueden enlazar (como se define además en la presente) a y/o se dirigen contra HER3 y que: i) tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 12 hasta 26 (ver Tabla A-l) , en las cuales para los propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácido, los residuos de aminoácido que forman las secuencias CDR se ignoran. En este sentido, también se hace referencia a la Tabla B-l, que enlista las. secuencias de estructura 1 (SEQ ID NO's: 42 hasta 56), secuencias de estructura 2 (SEQ ID NO's: 72 hasta 86), secuencias de estructura 3 (SEQ ID NO's: 102 hasta 116) y secuencias de estructura 4 (SEQ ID NO's: 132 hasta 146) de los Nanocuerpos de SEQ ID NO's: 12 hasta 26 (ver Tabla A-l) (con respecto a los residuos de aminoácido en las posiciones 1 hasta 4 y 27 hasta 30 de las secuencias de estructura 1, también se hace referencia a los comentarios hechos abajo. De esta manera, para determinar el grado de identidad de aminoácido, estos residuos preferiblemente se ignoran) ; y en los cuales : ii) preferiblemente uno o más de los residuos de aminoácido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración Kabat se eligen de los residuos estereotípicos mencionados en la Tabla B-2 supra.
En estos Nanocuerpos, las secuencias CDR son generalmente como se definen además en la presente.
De nuevo, tales Nanocuerpos pueden derivarse de cualquier manera adecuada y de cualquier fuente adecuada, y pueden por ejemplo ser secuencias VHH que se presentan naturalmente (esto es de una especie adecuada de Camélido) o secuencias de aminoácidos sintéticas o semi-sintéticas, incluyendo pero no limitadas a Nanocuerpos "humanizados" (como se define- en la presente), secuencias de inmunoglobulina "de camélido" (como se define en la presente) (y en particular secuencias de dominio variable de cadena pesada de camélido) , asi como Nanocuerpos que se han obtenido por técnicas tal como maduración de afinidad (por ejemplo, iniciando de secuencias de inmunoglobulina sintéticas, aleatorias o que se presentan naturalmente) , injerto CDR, revestimiento, fragmentos combinados derivados de diferentes secuencias de inmunoglobulina, ensamble PCR usando cebadores traslapados, y técnicas similares para secuencias de inmunoglobulina preparadas por ingeniería bien conocidas para la persona experimentada; o cualquier combinación adecuada de cualquiera de los anteriores como se describe además en la presente. También, cuando un Nanocuerpo comprende una secuencia VHH, el . Nanocuerpo puede ser humanizado adecuadamente, como se describe además en la presente, a fin de proporcionar uno o más Nanocuerpos (parcialmente o completamente) humanizados adicionales de la invención. Similarmente, cuando un Nanocuerpo comprende una secuencia sintética o semisintética (tal como una secuencia humanizada parcialmente) , el Nanocuerpo puede opcionalmente humanizarse adecuadamente adicional, de nuevo como se describe en la presente, de nuevo a fin de proporcionar uno o más Nanocuerpos (parcialmente o completamente) humanizados adicionales de la invención.
En particular, los Nanocuerpos humanizados pueden ser secuencias de aminoácidos que son como generalmente se definen para los Nanocuerpos en los párrafos previos, pero en los cuales al menos un residuo de aminoácido está presente (y en particular, en al menos uno de los residuos de estructura) que es y/o que corresponde a una sustitución humanizante (como se define en la presente). Algunas sustituciones humanizantes preferidas, pero no limitantes (y combinaciones adecuadas de las mismas) se volverán claros para la persona experimentada con base en la descripción en la presente. Además, o alternativamente, otras sustituciones humanizantes útiles potencialmente pueden establecerse al comparar la secuencia de las regiones de estructura de una secuencia VHH que se presenta naturalmente con la secuencia de estructura correspondiente de una o más secuencias VH humanas relacionadas cercanamente,- después de lo cual una o más de las sustituciones humanizantes útiles potencialmente (o combinaciones de las mismas) de esta manera determinadas pueden introducirse en la secuencia VHH (en cualquier manera conocida per se, como se describe además en la presente) y las secuencia VHH humanizadas resultantes pueden probarse por afinidad para el objetivo, para estabilidad, para facilidad y nivel de expresión, y/o para otras propiedades deseadas. De esta forma, por medio de un grado limitado de prueba y error, otras sustituciones humanizantes adecuadas (o combinaciones adecuadas de las mismas) pueden determinarse por la persona experimentada con base en la descripción en la presente. También, con base en lo anterior, (las regiones de estructura de) un Nanocuerpo puede se parcialmente humanizado o completamente humanizado.
Algunos Nanocuerpos optimizados de secuencia preferida particularmente de la invención son variantes optimizadas de secuencia de los Nanocuerpos de SEQ ID NO's: 12 hasta 26 (ver Tabla A-l) son algunos ejemplos preferidos especialmente.
De esta manera, algunos otros Nanocuerpos preferidos de la invención son nanocuerpos que pueden enlazar (como se define además en la présente) a HER3 y que: i) son una variante humanizada de una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 12 hasta 26 (ver Tabla A-l); y/o ii) tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 12 hasta 26 (ver Tabla A-l), en los cuales para los propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácido, los residuos de aminoácido que forman las sequences CDR se ignoran; y en los cuales: i) preferiblemente uno o más de los residuos de aminoácido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración Kabat se eligen de los residuos estereotípicos mencionados en la Tabla B-2 supra .
De acuerdo con otro aspecto específico de la invención, la invención proporciona un número de extensiones de residuos de aminoácido (esto es péptidos pequeños) que son particularmente adecuados para enlazar a HER3. Estas extensiones de residuos de aminoácido pueden estar presentes en, y/o pueden incorporarse en, una secuencia de aminoácidos de la invención, en particular de tal manera que forman (parte de) el sitio enlazado al antígeno de una secuencia de aminoácidos de la invención. Ya que estas extensiones de residuos de aminoácido se generaron primero como secuencias CDR de anticuerpos de cadena pesada o secuencias VHH que se elevaron contra HER3 (p pueden ser con base en y/o derivarse de tales secuencias CDR, como se describe además en la presente), también generalmente se referirán en la presente como "secuencias CDR" (esto es como seuencias CDR1, secuencias CDR2 y secuencias CDR3, respectivamente) . Debe sin embargo señalarse que la invención en su sentido más amplio no se limita a un papel estructural especifico o función que estas extensiones de residuos de aminoácido pueden tener en una secuencia de aminoácidos de la invención, siempre y cuando estas extensiones de residuos de aminoácido permitan que la secuencia de aminoácidos de la invención enlace a HER3. De esta manera, generalmente, la invención en su sentido más amplio comprende cualquier secuencia de aminoácidos que es capaz de enlazar a HER3 y que comprende una o más secuencias CDR como se describe en la presente, y en particular una combinación adecuada de dos o más de tales secuencias CDR, que se ligan adecuadamente una con la otra por medio de una o más secuencias de aminoácidos adicionales, de manera que la secuencia de aminoácidos completa forma un dominio de enlace y/o unidad de enlace que es capaz de enlazar a HER3. Debe sin embargo también señalarse que la presencia de sólo una de tal secuencia CDR en una secuencia de aminoácidos de la invención puede por si mismo ya ser suficiente para proporcionar una secuencia de aminoácidos de la invención que es capaz de enlazar a HER3; de nuevo se hace referencia por ejemplo . a los asi llamados "fragmentos acelerados" descritos en la WO 03/050531 o WO2009/127691.
De esta manera, 'en otro aspecto especifico, pero no limitante, la secuencia de aminoácidos de la invención puede ser una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una secuencia de aminoácidos que se eliqe del grupo que consiste de las seuencias CDR1, secuencias CDR2 y secuencias CDR3 que se describen en la presente (o cualquier combinación adecuada de las mismas) . En particular, una secuencia de aminoácidos de la invención puede · ser una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un sitio enlazado al antigeno, en donde el sitio enlazado al antigeno comprende al menos una secuencia de aminoácidos que se elige del grupo que consiste de las seuencias CDR1, secuencias CDR2 y secuencias CDR3 que se describen en la presente (o cualquier combinación adecuada de las mismas ) .
Generalmente, en ' este aspecto de la invención, la secuencia de aminoácidos de la invención puede ser cualquier secuencia de aminoácidos que comprende al menos una extensión de los residuos de aminoácido, en los cuales la extensión de los residuos de aminoácido tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de al menos una de las secuencias CDR descritas en la presente. Tal secuencia de aminoácidos puede o no puede comprender un pliegue de inmunoglobulina . Por ejemplo, y sin limitación, tal secuencia de aminoácidos puede ser un fragmento adecuado de una secuencia de inmunoglobulina que comprende al menos tal secuencia CDR, pero que no es suficientemente grande para formar un pliegue (completo) de inmunoglobulina (de nuevo se hace referencia por ejemplo a los "fragmentos acelerados" descritos en WO 03/050531 o WO2009/127691) . Alternativamente, tal secuencia de aminoácidos puede ser un "pliegue de proteína" adecuado que comprende al menos una extensión de los residuos de aminoácido que corresponden a tal secuencia CDR (esto es como parte de su sitio enlazado al antígeno) . Los pliegues adecuados para presentar secuencias de aminoácidos serán claros para la persona experimentada, y por ejemplo comprenden, sin limitación, pliegues de enlace con base en o derivados de' inmunoglobulinas (esto es diferente a las secuencias de inmunoglobulina ya descritas en la presente) , pliegues de proteina derivadas de los dominios de proteína A (tal como Affibodies™) , tendamistat, fibronectina, lipocalina, CTLA-4, receptores de célula T, repeticiones de anquirina diseñadas, avímeros y dominios PDZ (Binz et al., Nat. Biotech 2005, Vol 23': 1257), y porciones de enlace con base en ADN o ARN incluyendo pero no limitado a aptámeros de ADN o ARN (Ulrich et al. Comb Chem High Throughput Screen 2006 9(8): 619-32) .
De nuevo, cualquier secuencia de aminoácidos de la invención que comprende una o más de estas secuencias CDR es preferiblemente de manera que puede enlazar específicamente (como se define en la presente) a HER3, y más en particular de manera que puede enlazar a HER3 con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (actual o aparente), un valor KA (actual o aparente), una constante kon y/o una constante koff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente), que es como se define en la presente.
Más en particular, las secuencias de aminoácidos de acuerdo a este aspecto de la invención pueden ser cualquier secuencia de aminoácidos que comprende al menos un sitio enlazado al antigeno, en donde el sitio enlazado al antígeno comprende al menos dos secuencias de aminoácidos que se eligen del grupo que consiste de las seuencias CDR1 descritas en la presente, las secuencias CDR2 descritas en la presente y las secuencias CDR3 descritas en la presente, de manera que (i) cuando la primera secuencia de aminoácidos se elige de las seuencias CDR1 descritas en la presente, la segunda secuencia de aminoácidos se elige de las secuencias CDR2 descritas en la presente o las secuencias CDR3 descritas en la presente; (ii) cuando la primera secuencia de aminoácidos se elige de las secuencias CDR2 descritas en la presente, la segunda secuencia de aminoácidos se elige de las seuencias CDR1 descritas en la presente o las secuencias CDR3 descritas en la presente; o (iii.) cuando la primera secuencia de aminoácidos se elige de las secuencias CDR3 descritas en la presente, la segunda secuencia de aminoácidos se elige de las seuencias CDRl descritas en la presente o las secuencias CDR3 descritas en la presente.
Aún más en particular, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden ser secuencias de aminoácidos que comprenden al menos un sitio enlazado al antigeno, en donde el sitio enlazado al antigeno comprende al menos tres secuencias de aminoácidos que se eligen del grupo que consiste de las seuencias CDRl descritas en la presente, las secuencias CDR2 descritas en la presente y las secuencias CDR3 descritas en la presente, de manera que la primera secuencia de aminoácidos se elige de las seuencias CDRl descritas en la presente, la segunda secuencia de aminoácidos se elige de las secuencias CDR2 descritas en la presente, y la tercera secuencia de aminoácidos se elige de las secuencias CDR3 descritas en la presente. Las combinaciones preferidas de CDRl, CDR2 y secuencias CDR3 se volverán claras de la descripción adicional en la presente. Como será claro para la persona experimentada, tal secuencia de aminoácidos es preferiblemente una secuencia de inmunoglobulina (como se describe además en la presente) , pero puede por ejemplo también ser cualquier otra' secuencia de aminoácidos que comprende un pliegue adecuado para presentar las secuencias CDR.
De esta manera, en un aspecto específico, pero no limitante, la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos dirigida contra HER3, que comprende una o más extensiones de residuos de aminoácido elegidas del grupo que consiste de: a) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; c) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; d) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; e) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's': 87 hasta 101; f) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; g) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; h) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; i) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de. SEQ ID NO's: 117 hasta 131; o cualquier combinación adecuada de las mismas.
Cuando una secuencia de aminoácidos de la invención contiene una o más secuencias de aminoácidos de acuerdo a b) y/o c) : i) cualquier sustitución de aminoácidos en tal secuencia de aminoácidos de acuerdo con b) y/o c) es preferiblemente, y comparado con la secuencia de aminoácidos correspondiente de acuerdo con a), una sustitución de aminoácido conservada, (como se define en la presente); y/o ii) la secuencia de aminoácidos de acuerdo con b) y/o c) preferiblemente sólo contiene sustituciones de aminoácido, y sin eliminaciones o inserciones de aminoácido, comparadas con la secuencia de aminoácidos correspondiente de acuerdo con a) ; y/o iii) la secuencia de aminoácidos de acuerdo con b) y/o c) puede ser una secuencia de aminoácidos que se deriva de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con a) por medio de maduración de afinidad usando una o más técnicas de maduración de afinidad conocidas per se.
Similarmente , cuando una secuencia de aminoácidos de la invención contiene una o más secuencias de aminoácidos de acuerdo con e) y/o f ) : i) cualquier sustitución de aminoácidos en tal secuencia de aminoácidos de acuerdo con e) y/o f) es preferiblemente, y comparada con la secuencia de aminoácidos correspondiente de acuerdo con d) , una sustitución de aminoácido conservada, (como se define en la presente); y/o ii) la secuencia de aminoácidos de acuerdo con e) y/o f) preferiblemente sólo contiene sustituciones de aminoácido, y sin eliminaciones o inserciones de aminoácido, comparada con la secuencia de aminoácidos correspondiente de acuerdo con d) ; y/o iii) la secuencia de aminoácidos de acuerdo con e) y/o f) puede ser una secuencia de aminoácidos que se deriva de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con d) por medio de maduración de afinidad usando una o más técnicas de maduración de afinidad conocidas per se.
También, similarmente,. cuando una secuencia de aminoácidos de la invención contiene una o más secuencias de aminoácidos de acuerdo con h) y/o i): i) cualquier sustitución de aminoácidos en tal secuencia de aminoácidos de acuerdo con h) y/o i) es preferiblemente, y comparada con la secuencia de aminoácidos correspondiente de acuerdo con g) , una sustitución de aminoácido conservada, (como se define en la presente); y/o ii) la secuencia de aminoácidos de acuerdo con h) y/o i) preferiblemente sólo contiene sustituciones de aminoácido, y no eliminaciones o inserciones de aminoácido, comparado con la secuencia de aminoácidos correspondientes de acuerdo con g) ; y/o iii) la secuencia de aminoácidos de acuerdo con h) y/o i) puede ser una secuencia de aminoácidos que se deriva de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con g) por medio de maduración de afinidad usando una o más técnicas de maduración de afinidad conocidas per se.
Debe entenderse que ' los últimos párrafos precedentes también generalmente aplican a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de la invención que comprenden una o más secuencias de aminoácidos de acuerdo con b) , c) , e) , f ) , h) o i), respectivamente.
En este aspecto específico, la secuencia de aminoácidos preferiblemente comprende una o más extensiones de residuos de aminoácido elegidas del- grupo que consiste de: i) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s : 57 hasta 71; ii) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; y iii) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; o cualquier combinación adecuada de las mismas.
También, preferiblemente, en tal secuencia de aminoácidos, al menos una de las. extensiones de residuos de aminoácido forma parte del sitio enlazado al antígeno para enlace contra HER3.
En un aspecto más específico, per de nuevo no limitante, la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos dirigida contra HER3, que comprende dos o más extensiones de residuos de aminoácido elegidos del grupo que consiste de: a) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71;. c) secuencias de aminoácidos, que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; d) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; e) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; f) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; g) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; h) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; i) secuencias de aminoácidos, que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos · con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; de manera que (i) cuando la primera extensión de residuos de aminoácido corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b) o c) , la segunda extensión de residuos de aminoácido corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con d) , e), f ) , g) , h) o i); (ii) cuando la primera extensión de residuos de aminoácido corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con d) , e) o f), la segunda extensión de residuos de aminoácido corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b) , c), g) , h) o i); o (iii) cuando la primera extensión de residuos de aminoácido corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con g) , h) o i), la segunda extensión de residuos de aminoácido corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con a) , b) , c) , d) , e) o f ) .
En este aspecto especifico, la secuencia de aminoácidos preferiblemente comprende dos o más extensiones de residuos de aminoácido elegidas del grupo que consiste de: i) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; ii) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; y iii) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; de manera que, (i) cuando la primera extensión de residuos de aminoácido corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71, la segunda extensión de residuos de aminoácido corresponde ' a una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101 o de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; (ii) cuando la primera extensión de residuos de aminoácido corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101, la segunda extensión de residuos de aminoácido corresponde a una de las secuencias de aminoácidos - de SEQ ID NO's: 57 hasta 71 o de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; o (iii) cuando la primera extensión de residuos de aminoácido corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131, la segunda extensión. de residuos de aminoácido corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71 o de SEQ ID NO's: 87 hasta 101.
También, en tal secuencia de aminoácidos, al menos dos extensiones de residuos ' de aminoácido de nuevo preferiblemente forman parte del. sitio enlazado al antigeno para enlace contra HER3 En un aspecto aún. más especifico, pero no limitante, la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos dirigida contra HER3, que comprende tres o más extensiones de residuos de aminoácido, en el cual la primera extensión de residuos de aminoácido se elige del grupo que consiste de: a) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; c) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; la segunda extensión de residuos de aminoácido se elige del grupo que consiste de: d) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; e) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; f ) secuencias de aminoácidos que tienen ' 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; y la tercera extensión de residuos de aminoácido se elige del grupo que consiste de: g) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; h) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; i) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131.
Preferiblemente, en este aspecto especifico, la primera extensión de residuos de aminoácido se elige del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s : 57 hasta 71; la segunda extensión de residuos de aminoácido se elige del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; y la tercera extensión de residuos de aminoácido se elige del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131.
De nuevo, preferiblemente, en tal secuencia de aminoácidos, al menos tres extensiones de residuos de aminoácido forman parte del sitio enlazado al antígeno para enlace contra HER3.
Las combinaciones preferidas de tales extensiones de secuencias de aminoácidos se volverán claras de la descripción adicional en la presente.
Preferiblemente, en tales secuencias de aminoácidos las secuencias CDR tienen al menos 70% de identidad de aminoácido, preferiblemente al menos 80% de identidad de aminoácido, más preferiblemente al menos 90% de identidad de aminoácido, tal como 95% de identidad de aminoácido o más o aún esencialmente 100% de identidad de aminoácido con las secuencias CDR de al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 12 hasta 26 (ver Tabla A-l). Este grado de identidad de aminoácido puede por ejemplo determinarse al determinar el grado de identidad de aminoácido (en una manera descrita en la presente) entre la secuencia de aminoácidos y una o más de las secuencias de SEQ ID NO' s : 12 hasta 26 (ver Tabla A-l), en las cuales los residuos de aminoácido que forman las regiones de estructura se ignoran. También, tales secuencias de aminoácidos de la invención pueden ser como se describe además en la presente.
También, tales secuencias de aminoácidos son preferiblemente de manera que pueden enlazar específicamente (como se define en la presente) a HER3; y más en particular enlazan a HER3 con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (actual o aparente), un valor KA (actual o aparente), una constante kon y/o constante k0ff, o alternativamente como un valor IC50/ como se describe además en la presente) que es como se define en la presente.
Cuando la secuencia de aminoácidos de la invención consiste esencialmente de 4 regiones de estructura (FR1 hasta FR4, respectivamente) y 3 regiones que determinan la complementariedad (CDR1 ' hasta CDR3, respectivamente) , la secuencia de aminoácidos de la invención es preferiblemente de manera que: - CDRl se elige del grupo que consiste de: a) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s : 57 hasta 71; b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s : 57 hasta 71; c) secuencias de' aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; y/o - CDR2 se elige del grupo que consiste de: d) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; e) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; f) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; y/o - CDR3 se elige del grupo que consiste de: g) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; h) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; i) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131.
En particular, tal secuencia de aminoácidos de la invención puede ser de manera que CDR1 se elige del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; y/o CDR2 se elige del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; y/o CDR3 se elige del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131.
En particular, cuando la secuencia de aminoácidos de la invención consiste esencialmente de 4 regiones de estructura (FR1 hasta FR , respectivamente) y 3 regiones que determinan la complementariedad (CDRl hasta CDR3, respectivamente), la secuencia de aminoácidos de la invención es preferiblemente de manera que: CDRl se elige del grupo que consiste de: a) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; c) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; y - CDR2 se elige del grupo que consiste de: d) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s : 87 hasta 101; e) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s : 87 hasta 101; f) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; y - CDR3 se elige del grupo que consiste de: g) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; h) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; i) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos ' con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; o cualquier fragmento adecuado de tal secuencia de aminoácidos.
En particular, tal secuencia de aminoácidos de la invención puede ser de .manera que CDRl se elige del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; y CDR2 se elige del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; y CDR3 se elige del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s : 117 hasta 131.
De nuevo, las combinaciones preferidas de las secuencias CDR se volverán claras de la descripción adicional en la presente .
También, tales secuencias de aminoácidos son preferiblemente de manera que pueden enlazar específicamente (como se define en la presente) a HER3; y más en particular enlazar a HER3 con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (actual o aparente) , un valor K¾ (actual o aparente), una constante kon y/o constante k0ff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) que es como se define en la presente.
En un aspecto preferido, pero no limitante, la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente de 4 regiones de estructura (FR1 hasta FR4 , respectivamente) y 3 regiones que determinan la complementariedad (CDR1 hasta CDR3, respectivamente), en el cual las secuencias CDR de la secuencia de aminoácidos tienen al menos 70% de identidad de aminoácido, preferiblemente al menos 80% de identidad de' aminoácido, más prefe iblemente al menos 90% de identidad de aminoácido, tal como 95% de identidad de aminoácido o más o aún esencialmente 100% de identidad de aminoácido con las secuencias CDR de al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 12 hasta 26 (ver Tabla A-l) . Este grado dé identidad de aminoácido puede por ejemplo determinarse al determinar el grado de identidad de aminoácido ¦ (en una manera descrita en la presente) entre la secuencia de aminoácidos y una o más de las secuencias de SEQ ID NO's: 12 hasta 26 (ver Tabla A-l), en las cuales los residuos de aminoácido que forman las regiones de estructura se ignoran. Tales secuencias de aminoácidos de la invención pueden ser como se describe además en la presente.
En tal secuencia de aminoácidos de la invención, las secuencias de estructura pueden ser cualquiera de las secuencias de estructura adecuadas, y los ejemplos de secuencias de estructura adecuadas serán claros para la persona experimentada, por ejemplo en la base de los manuales estándares y la descripción adicional y técnica previa mencionada en la presente'.
Las secuencias de estructura son preferiblemente (una combinación adecuada de) secuencias de estructura de inmunoglobulina o secuencias de estructura que se han derivado de secuencias de estructura de inmunoglobulina (por ejemplo, por humanización o camelización) . Por ejemplo, las secuencias de estructura pueden ser secuencias de estructura derivadas de un dominio variable de cadena ligera (por ejemplo una secuencia YL) y/o de un dominio variable de cadena pesada (por ejemplo una secuencia VH) . En un aspecto preferido particularmente, las secuencias de estructura son ya sea secuencias de estructura que se han derivado de una secuencia VHH (en la cual las secuencias de estructura pueden opcionalmente haber sido parcialmente o completamente humanizadas) o son secuencias VH convencionales que se han camelizado (como se define en la presente) .
Las secuencias de estructura son preferiblemente de manera que la secuencia de aminoácidos de la invención es un anticuerpo de dominio (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como un anticuerpo de dominio) ; es un anticuerpo de dominio sencillo (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como un anticuerpo de dominio sencillo) ; es un "dAb" (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como un dAb) ; o es un Nanocuerpo (incluyendo pero no limitado a secuencia VHH) · De nuevo, las secuencias de . estructura adecuadas serán claras para la persona experimentada, por ejemplo en la base de los manuales estándares y la descripción adicional y técnica previa mencionada en la presente.
En particular, las secuencias de estructura presentes en las secuencias de aminoácidos de la invención pueden contener uno o más de los residuos estereotípicos (como se define en la presente) , de manera que la secuencia de aminoácidos de la invención es un Nanocuerpo. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de (combinaciones adecuadas de) tales secuencias de estructura se volverán claras de la descripción adicional en la presente..
En particular, cuando los ISV's de la invención son Nanocuerpos (como se describe en la presente) las secuencias de estructura presentes allí pueden ser como se describen generalmente en las páginas 258 hasta 297 de WO 09/068627 (incorporada en la presente como referencia) . Por ejemplo, pueden contener una o más de las combinaciones de los residuos estereotípicos establecidos en la Tabla A-5 de WO 09/068627; y FR1, FR2 , FR3 y FR4 pueden contener los residuos de aminoácido establecidos en la Tabla A-6, Tabla A-7, Tabla A-8 y Tabla A-9 de WO 09/068627, respectivamente. También, cuando los ISV's de la. invención son nanocuerpos, que pueden pertenecer al grupo KERE (ver páginas 281 hasta 284 de WO 09/068627, con algunas secuencias FR1, FR2, FR3 y FR4 representativas para este grupo dadas en las Tablas A-ll/A-15, A-12,. A-13 y A-14 de WO 09/068627); al grupo GLEW (ver páginas 285 hasta 287 de WO 09/068627, con algunas secuencias FR1, FR2, FR3 y FR4 representativas para este grupo dado en las Tablas A-16/A-20, A-17, A-18 y A-19 de WO 09/068627); o al grupo P, R, S 103 (ver páginas 287 hasta 291 de WO 09/068627, con algunas secuencias FRl, FR2, FR3 y FR4 representativas para este grupo dadas en las Tablas A-21/A-25, A-22, A-23 y A-24 de WO 09/068627), que todas son como se describe en WO 09/068627, con algunas secuencias representativas para cada uno de estos grupos dados en la Tabla A-10 de 09/068627. También como se describe en WO 09/068627, estas secuencias de estructura pueden contener una o más sustituciones humanizantes adecuada u (otras) substituciones para optimizar la secuencia (ver también la descripción adicional en la presente) .
De nuevo, algunas secuencias FRl, FR2, FR3 y FR4 preferidas particularmente pero no limitantes (y combinaciones de las mismas) son aquellas descritas en la Tabla B-l, o variantes adecuadas de tales secuencias FRl, FR2, FR3 y FR4 , respectivamente (por ejemplo, con menos de 6, tal como 1, 2, 3, 4 o 5 diferencias de aminoácido adecuadas en tal FRl, FR2, FR3 o FR4 comparada con una secuencia de estructura mencionada en la Tabla B-l, en la cual las diferencias de aminoácido pueden ser como se describe en WO 09/068627) que todavía mantienen esencialmente las propiedades deseadas de Nanocuerpos.
De nuevo, como generalmente se describe en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención, también es posible usar fragmentos adecuados (o combinaciones de fragmentos) de cualquiera de los anteriores, tal como fragmentos que contienen una o más secuencias CDR, flanqueadas adecuadamente por y/o ligadas por medio de una o más secuencias de estructura (por ejemplo, en el mismo orden como estas CDR' s y las secuencias de estructura pueden ocurrir en la secuencia de inmunoglobulina de tamaño completo de la cual el fragmento se ha derivado) . Tales fragmentos también pueden de nuevo ser de manera que comprenden o pueden formar un pliegue de inmunoglobulina, o alternativamente ser de manera que no comprenden o no pueden formar un pliegue de inmunoglobulina.
En un aspecto especifico, tal fragmento comprende una secuencia CDR sencilla como se describe en la presente (y en particular una secuencia CDR3)', que se flanquea en cada lado por (parte de) una secuencia de estructura (y en particular, parte de las secuencias de estructura que, en la secuencia de inmunoglobulina de la cual el fragmento se deriva, son adyacentes a la secuencia CDR. Por ejemplo, una secuencia CDR3 puede precederse por (parte de) una secuencia FR3 y seguirse por (parte de) una secuencia FR ) . Tal fragmento también puede contener un puente de disulfuro, y en particular un puente de disulfuro que liga las dos regiones de estructura que preceden y siguen la secuencia CDR, respectivamente (para el. propósito de formar tal puente de disulfuro, residuos de cisteina que se presentan naturalmente en las regiones de estructura pueden usarse, o alternativamente los residuos de cisteina pueden sintéticamente agregarse ' a o introducir en las regiones de estructura) .
En otro aspecto, la invención se refiere a un compuesto o constructo, y en particular una proteina o polipéptido (también referido en la presente como un "compuesto de la invención" o "polipéptido de la invención", respectivamente) que comprende o consiste esencialmente de una o más secuencias de aminoácidos de la invención (o fragmentos adecuadas de líos mismos), y comprende además opcionalmente uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace. Como se volverán claros para la persona experimentada de la descripción adicional en la presente, tales grupos, residuos, porciones, .unidades de enlace o secuencias de aminoácidos adicionales pueden o no pueden proporcionar funcionalidad adicional a la secuencia de aminoácidos de la invención (y/o para el compuesto o constructo en el cual se presenta) y puede o no puede modificar las propiedades de la secuencia de aminoácidos de la invención.
Por ejemplo, tales, grupos, residuos, porciones o unidades de enlace adicionales pueden ser una o más secuencias de aminoácidos adicionales, de manera que el compuesto o constructo es una 'proteína (de fusión) o polipéptido (de fusión). En un' aspecto preferido pero no limitante, uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace son secuencias de inmunoglobulina, y en particular ISV's. Aún más preferiblemente, uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace se eligen del grupo que consiste de anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para uso como un anticuerpo de dominio, anticuerpos de dominio sencillo, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para uso como un anticuerpo de dominio sencillo, "dAb'^s, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para uso como un dAb, o Nanocuerpos.
Por ejemplo, uno o más (tal como uno o dos) ISV adicionales que están presentes en un polipéptido de la invención (esto es además de uno o más ISV's contra HER3 ) pueden dirigirse contra otro objetivo que HER3 a fin de proporcionar una proteína o polipéptido "biespecí fico" de la invención (esto es un polipéptido de la invención que contiene al menos uno - tal como uno o dos - dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se dirige contra HER3 y al menos uno - tal comó uno o dos - dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se dirige contra otro objetivo) .
Por ejemplo, de acuerdo con un aspecto específico pero no limtante, las secuencias de aminoácidos, constructos, proteínas o polipéptidos de la invención pueden haber sido proporcionadas con¦ una vida media incrementada (como se define en la presente, y comparadas con el mismo constructo pero sin las modificaciones hechas para proporcionar la pvida media incrementada, por ejemplo sin la funcionalización/pegilación o sin el dominio enlazado a o péptido enlazado a albúmina de suero/ISV) , por ejemplo por funcionalización adecuada (tal como pegilación) y/o al incluir en el constructo una porción o unidad de enlace que incrementa la vida media del constructo. Los ejemplos de tal funcionalización, porciones o unidades de enlace serán claros para la persona experimentada y pueden por ejemplo incluir pegilación, fusión a albúmina' de suero, o fusión a un péptido o unidad de enlace que puede enlazar a una proteína de suero tal como albúmina de suero.
En los últimos constructos (esto es constructos de fusión que comprenden al menos una - tal como una o dos -secuencia de aminoácidos de la invención y al menos un - tal como uno o dos - péptido o unidad de enlace que puede enlazar a una proteína de suero tal como albúmina de suero) , el dominio enlazado a o péptido enlazado a albúmina de suero puede ser cualquier dominio enlazado a o péptido enlazado a albúmina de suero adecuado capaz de incrementa la vida media del constructo (comparado con el mismo constructo sin el dominio enlazado a o péptido enlazado a albúmina de suero) , y puede en particular ser péptidos enlazados a albúmina de suero como se describe en WO 2008/068280 por el solicitante (y en particular WO 2009/127691 y la solicitud de E.U.A no prepublicada 61/301,819, ambas por el solicitante), o un dominio variable sencillo de inmunoglobulina enlazado a albúmina de suero (tal como un Nanocuerpo enlazado a albúmina de suero; por ejemplo Alb-1 o una versión humanizada de Alb-1 tal como Alb-8 (también referido en la presente como Alb-11 o ALB11), para el cual se hace referencia por ejemplo a WO 06/122787) .
Con respecto a la vida media, debe señalarse que en la invención, y al usar las varias técnicas que extienden la vida media descritas en la presente (por ejemplo, al elegir adecuadamente un péptido enlazado a albúmina de suero de acuerdo con. la WO 2008/068280, WO 2009/127691 y/o la solicitud de E.U.A. no prepublicada 61/301,819), la vida media de un constructo o polipéptido de la invención puede (y preferiblemente estar) "a la media" adecuadamente para la aplicación (terapéutica y/o diagnóstico) pretendida y/o para obtener el mejor balance entre el efecto terapéutico y/o farmacológico deseado y efectos colaterales no deseados posibles .
De esta manera, por ejemplo, y sin limitación, un aspecto preferido de la invención proporciona un polipéptido "biespecifico" que consiste esencialmente de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina dirigido contra HER3 humano (o, alternativamente, de dos dominios variables sencillos de inmunoglobulina dirigidos contra HER3 humano, que puede ser iguales o diferentes, esto es a fin de proporcionar - cuando son los · mismos o diferentes - un polipéptido "bivalente" de la invención, o - cuando son diferentes - polipéptido "biparatópico" de la invención) y un dominio variable sencillo de inmunoglobulina dirigido contra albúmina de suero humana ligada por una ligadura de péptido (como se define en la presente) , a fin de proporcionar un polipéptido biespecifico de la invención, respectivamente, todo como se describe en la presente. Tal proteina o polipéptido también puede estar en forma aislada esencialmente (como se define en la presente) .
En otro aspecto especifico, pero no limitante, una secuencia de aminoácidos (tal como un Nanocuerpo) de la invención o un polipéptido de la- invención (tal como un polipéptido bivalente, biparatópico o biespecifico de la invención) puede ligarse adecuadamente (de nuevo, químicamente o por medio de una o más ligaduras o espaciadores adecuados)' a una toxina o a un residuo, porción o carga ( cito) tóxica . Los ejemplos de porciones, compuestos, cargas o residuos ( cito) tóxicos adecuados que pueden ligarse a secuencias de aminoácidos o polipéptidos de la invención para proporcionar - por ejemplo - un compuesto citotóxico (esto es un conjugado de anticuerpo-fármaco o "ADC" con base en una secuencia de aminoácidos o polipéptido de la invención) serán claros para la persona experimentada. Se hace referencia por- ejemplo a la revisión por Ducry y Stump, Bioconjugate Chem., 2010, 21 (1), pp 5-13., Tales secuencias de aminoácidos o polipéptidos citotóxicos de la invención pueden en particular ser útiles/adecuados para aquellas aplicaciones en las cuales se pretende exterminar una célula que expresa el objetivo contra las cuales las secuencias de aminoácidos o polipéptidos de la invención se dirigen (por ejemplo en el tratamiento de cáncer), o para reducir o disminuir el crecimiento y/o proliferación tal como una célula. Usualmente, pero sin limitación, los polipéptidos ( cito ) tóxicos de la invención ya sea no extenderán la vida media ni tendrán sólo una extensión de vida media limitada y/o herméticamente controlada.
Alternativamente, uno o más grupos, residuos, porciones o unidades de enlace adicionales que pueden estar presentes en un polipéptido de la invención pueden por ejemplo ser grupos químicos, residuos, porciones, que pueden o no pueden por sí mismos ser biológicamente y/o farmacológicamente activos. Por ejemplo, y sin limitación, tales grupos pueden ligarse a una o más secuencias de aminoácidos de la invención a fin de proporcionar un "derivado" de una secuencia de aminoácidos o polipéptido de la invención, como se describe además en la presente.
También dentro del alcance de la presente invención están compuestos o constructos, que comprenden o consisten esencialmente de uno o más derivados como se describe en la presente, y opcionalmente comprenden además uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace, opcionalmente ligados por medio de una o más ligaduras. Preferiblemente, uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace son secuencias de aminoácidos.
En los compuestos o constructos descritos arriba, una o más secuencias de aminoácidos de la invención y uno o más grupos, residuos, porciones o unidades de enlace pueden ligarse directamente uno con el otro y/o por medio de una o más ligaduras o espaciadores adecuados. Por ejemplo, cuando uno o más grupos, residuos, porciones o unidades de enlace son secuencias de aminoácidos, las ligaduras también pueden ser secuencias de aminoácidos, de manera que el compuesto o constructo resultante e.s una (proteina) de fusión o (polipéptido de fusión)- .
Como será claro de la descripción adicional de arriba y en la presente, esto significa que las secuencias de aminoácidos de la invención pueden usarse como "bloques de construcción" para formar . polipéptidos de la invención, esto es al combinarlos adecuadamente con otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace, con objeto de formar compuestos o constructos como se describe en la presente (tal como, sin limitacións, los polipéptidos biparatópicos , bi/multivalentes y bi/multiespecificos de la invención descrita en la presente) que combinan dentro de una molécula una o más propiedades o funciones biológicas deseadas.
Algunos ejemplos específicos de polipéptidos de la invención son polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente de: dos secuencias de aminoácidos (y en particular y preferiblemente ISV's) dirigidas contra HER3, que pueden ser las mismas o diferentes, ligadas adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente); - dos secuencias de aminoácidos que bloquean HRG (como se define en la presente, y que pueden ser diferentes pero que son preferiblemente las mismas) , y en particular y preferiblemente dos ISV's que bloquean HRG (como se define en la presente, que de nuevo pueden ser diferentes pero que son preferiblemente las mismás), ligadas adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; dos secuencias de aminoácidos que bloquean la dimerización (como se define en la presente, y que pueden ser diferentes pero que son preferiblemente las mismas), y en particular y preferiblemente dos ISV s que bloquean la dimerización (como se define en la presente, que de nuevo puede ser diferente pero que son preferiblemente las mismas), ligadas adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; - dos secuencias de aminoácidos enlazadas al dominio II (como se define en la presente, y que pueden ser diferentes pero que son preferiblemente las mismas), y en particular y preferiblemente dos ISV enlazados al dominio II' s (como se define en la presente, que de nuevo pueden ser diferentes pero que son preferiblemente las mismas), ligadas adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; - una secuencia de aminoácidos que bloquea HRG (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV que bloquea HRG, también como se define en la presente) y otra secuencia de aminoácidos (y en particular y preferiblemente otro ISV) que se dirige contra HER3 (como se define en la presente) y que no es una secuencia de aminoácidos que bloquea HRG (o ISV) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando uná o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la. presente ) ; una secuencia de aminoácidos que bloquea la dimerización (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV que bloque la dimerización, también como se define en la presente) y otra secuencia de aminoácidos (y en particular y preferiblemente otro ISV) que se dirige contra HER3 (como se define en la presente) y que no es una secuencia de aminoácidos que bloquea la dimerización (o ISV), ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; - una secuencia de aminoácidos enlazada a dominio II (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV enlazado al dominio II, también como se define en la presente), y otra secuencia de aminoácidos (y en particular y preferiblemente otro ISV) que se dirige contra HER3 (como se define en la presente) y que no es una secuencia de aminoácidos enlazada al dominio II (o ISV) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; - una secuencia dé aminoácidos que bloquea HRG (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV que bloquea HRG, también como se define en la presente) y una secuencia de aminoácidos que bloquea la dimerizacion (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV que bloquea la dimerizacion, también como se define en la presente), ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; - una secuencia de aminoácidos que bloquea HRG (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV que bloquea HRG, también como se define en la presente) y una secuencia de aminoácidos enlazada a dominio II (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV enlazado al dominio II,' también como se define en la presente), ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; una secuencia de aminoácidos que bloquea la dimerizacion (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV que bloquea la dimerizacion, también como se define en la presente) y una secuencia de aminoácidos enlazada a dominio II (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV enlazado al dominio II, también como se define en la presente), ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente); y polipéptidos (de los cuales algunos ejemplos no limitantes serán claros para la persona experimentada con base en la descripción en la presente) forman aspectos adicionales de la invención.
También, como se menciona las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención (tal como los polipéptidos descritos arriba) pueden ser vida media extendida, por ejemplo por funcionalización adecuada y/o al incluir en el constructo una porción o unidad de enlace que incrementa la vida media del constructo. Donde la vida media de una secuencia de aminoácidos o polipéptido se extiende por fusión a un péptido o unidad de enlace que puede enlazar a una proteína de suero tal como albúmina de suero, el constructo/polipéptido resultante de la invención puede por ejemplo y sin limitación comprender o consistir esencialmente de: una secuencia de aminoácidos (y en particular y preferiblemente ISV) dirigida contra HER3 y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; - una secuencia de aminoácidos que bloquea a HRG (como se define en la presente) , y en particular y preferiblemente un ISV que bloquea HRG (como' se define en la presente), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteína de suero y en particular a albúmina de suero), ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; una secuencia de aminoácidos que bloquea la dimerización (como se define en la presente) , y en particular y preferiblemente un ISV que bloquea la dimerización (como se define en la presente), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; - una secuencia de aminoácidos enlazada al dominio II (como se define en la presente), y en particular y preferiblemente un ISV enlazado al dominio II (como se define en la presente) , y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) ,. ligada adecuadamente ya sea directamente o usando' una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; dos secuencias de aminoácidos (y en particular y preferiblemente ISV s) dirigidas contra HER3, que pueden ser las mismas o diferentes, y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la- presente) ; - dos secuencias de aminoácidos que bloquean HRG (como se define en la presente, y que pueden ser diferentes pero que son preferiblemente las mismas) , y en particular y preferiblemente dos ISV's que bloquean HRG (como se define en la presente, que de nuevo pueden ser diferentes pero que son preferiblemente las mismas) , y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente); dos secuencias de aminoácidos que bloquean la dimerización (como se define en la presente, y que pueden ser diferentes pero que son preferiblemente las mismas), y en particular y preferiblemente dos ISV s que bloquean la dimerización (como se define en la presente, que de nuevo pueden ser diferentes pero que son preferiblemente las mismas) , y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV qué se dirige a una proteína de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; - dos secuencias de aminoácidos enlazadas al dominio II (como se define en la presente, y que pueden ser diferentes pero que son preferiblemente las mismas) , y en particular y preferiblemente dos ISV enlazados al dominio II' s (como se define en la presente, que de nuevo pueden ser diferentes pero que son preferiblemente, las mismas), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina. de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente ) ; una secuencia de aminoácidos que bloquea a HRG (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV que bloquea HRG, también como se define en la presente) y otra secuencia de aminoácidos (y en particular y preferiblemente otro ISV) que se dirige contra HER3 (como se define en la presente) y que no es una secuencia de aminoácidos que bloquea a HRG (o ISV) , y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y- preferiblemente un ISV que se dirige a una proteína de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteína de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente); una secuencia de aminoácidos que bloquea la dimerización (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV que bloquea la dimerización, también como se define en la presente) y otra secuencia de aminoácidos (y en particular y preferiblemente otro ISV) que se dirige contra HER3 (como se define en la presente) y que no es una secuencia de aminoácidos que bloquea la dimerización (o ISV) , y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteína de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteína de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados ( como se describe en la presente); - una secuencia de aminoácidos enlazada al dominio II (como se define en · la presente, y en particular y preferiblemente un ISV enlazado a dominio II, también como se define en la presente) y otra secuencia de aminoácidos (y en particular y preferiblemente otro ISV) que se dirige contra HER3 (como se define en la presente) y que no es una secuencia de aminoácidos enlazada a dominio II (o ISV) , y un grupo, residuo, porción o . unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; - una secuencia de aminoácidos que bloquea a HRG (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV que bloquea HRG, también como se define en la presente) y una secuencia de aminoácidos que bloquea la dimerizacion (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV que bloquea la dimerizacion, también como se define en la presente), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; - una secuencia de aminoácidos que bloquea a HRG (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV que bloquea HRG, también como se define en la presente) y una secuencia de aminoácidos enlazada al dominio II (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV enlazado al dominio II, también como se define en la presente), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y pref riblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; una secuencia de aminoácidos que bloquea la dimerización (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV que bloquea la dimerización, también como se define en la presente) y una secuencia de aminoácidos enlazada al dominio II (como se define en la' presente, y en particular y preferiblemente un ISV enlazado al dominio II, también como se define en la presente) , y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos . (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; y tales polipéptidos (de los cuales algunos no limitantes serán claros para la persona experimentada con base en la descripción en la- presente - por ejemplo, algunos se enlistan en la Tabla A-2 a continuación) también forman aspectos adicionales de la invención.
De estos, preferidos particularmente son polipéptidos de la invención que ya sea : a) comprenden o consisten esencialmente de una secuencia de aminoácidos que bloquea a HRG (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV que bloquea HRG, también como se define en la presente) y una secuencia de aminoácidos que bloquea la dimerización (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV que bloquea la dimerización, también como se define en la presente), y que opcionalmente comprenden además un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero tal como Alb-8/Alb-ll, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y ' en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) . Tales polipéptidos pueden, por ejemplo y sin limitación, comprender una secuencia tipo 17B05, una secuencia tipo 21F06, y un ISV enlazado a albúmina de suero tal como Alb-8, opcionalmente ligado adecuadamente uno con el otro por medio de uno uno o más espaciadores o ligaduras adecuadas. Un ejemplo preferido especifico pero no limitante de tal polipéptido es HER3MS00135 (SEQ ID NO:282); o que b) comprenden o consisten esencialmente de una secuencia de aminoácidos que bloquea la dimerización (como se define en la presente, y en particular y preferiblemente un ISV que bloquea la dimerización, también como se define en la presente) y una secuencia de aminoácidos enlazada al dominio II (como se define en la .presente, y en particular y preferiblemente un ISV enlazado al dominio II, también como se define en la presente), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero tal como Alb-8 /Alb-11 , o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente). Tales polipéptidos pueden, por ejemplo y sin limitación, comprender una sécuencia tipo 17B05, una secuencia tipo 18G11, y un ISV enlazado a albúmina de suero tal como Alb-8, opcionalmente ligado adecuadamente uno con el otro por medio de uno o más espaciadores o ligaduras adecuadas. Dos ejemplos preferidos específicos, pero no limitados de tal polipéptido son HER3MS00212 (SEQ ID NO: 319) y HER3MS00215 ( SEQ ID NO:322).
Como también ya se mencionó en la presente, cuando uno de los polipéptidos de arriba: (i) contiene una secuencia de aminoácidos que bloquea HRG, es preferiblemente ya sea una secuencia tipo 21F06 (como se define en la presente) o una secuencia tipo 04C07 (también como se define en la presente); y/o (ii) contiene una secuencia que bloquea la dimerización, es preferiblemente una secuencia tipo 17B05 (como se define en la presente); y/o (iii) contiene una secuencia enlazada al dominio II, es preferiblemente ya sea una secuencia tipo 18G11 o una secuencia tipo 34C07. Algunos ejemplos específicos de tales polipéptidos de la invención son polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente de: dos secuencias tipo 21F06 (como se define en la presente, y que pueden ser las mismas o diferentes), ligadas adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente ) ; dos secuencias tipo 04C07 (como se define en la presente, y que pueden ser las mismas o diferentes), ligadas adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente ) ; dos secuencias, tipo 17B05 (como se define en la presente, y que pueden ser las mismas o diferentes), ligadas adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; dos secuencias tipo 18G11 (como se define en la presente, y que pueden ser las mismas o diferentes), ligadas adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; - dos secuencias tipo 34C07. (como se define en la presente, y que pueden ser las mismas o diferentes), ligadas adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; una secuencia tipo 21F06 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 04C07 (como se define en la presente), ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; una secuencia tipo 21F06 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 17B05 (como se define en la presente), ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; una secuencia tipo 21F06 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 18G11 (como se define en la presente), ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; una secuencia tipo 21F06 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 34C07 (como se define en la presente), ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente); una secuencia tipo 04C07 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 17B05 (como se define en la presente), ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; una secuencia tipo 04C07 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 18G11 (como se define en la presente) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; una secuencia tipo 04C07 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 34C07 (como se define en la presente) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente); una secuencia tipo 17B05 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 18G11 (como se define en la presente), ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o' espaciadores adecuados (como se describe en la presente);. una secuencia tipo 17B05 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 34C07 (como se define en la presente) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; una secuencia tipo 18G11 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 34C07 (como se define en la presente), ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; y tales polipéptidos (de los cuales algunos ejemplos no limitantes serán claros para la persona experimentada con base en la descripción en la presente - por ejemplo, algunos están enlistados en la Tabla A-2 a continuación) de nuevo forman aspectos adicionales de la invención.
También, de nuevo, tales polipéptidos pueden ser de vida media extendida, esto es por ejemplo por funcionalización adecuada y/o al incluir en el constructo una porción o unidad de enlace que incrementa la vida media del constructo. Donde la vida media de una secuencia de aminoácidos o polipéptido se extiende por fusión a un péptido o unidad de enlace que puede enlazar a una proteina de suero tal como albúmina de suero, el constructo/polipéptido resultante de la invención puede por ejemplo y sin limitación comprender o consistir esencialmente de: dos secuencias tipo 21F06 (como se define en la presente, y que pueden ser las mismas o diferentes), ligadas adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente ) ; dos secuencias tipo 04C07 (como se define en la presente, y que pueden ser las mismas o diferentes), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; - dos secuencias tipo 17B05 (como se define en la presente, y que pueden ser las mismas o diferentes), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; - dos secuencias tipo 18G11 (como se define en la presente, y que pueden ser las mismas o diferentes), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y -en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; - dos secuencias tipo 34C07 (como se define en la presente, y que puede ser la misma o diferente), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente ) ; una secuencia tipo '21F06 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 04C07 (como se define en la presente), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteína de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteína. de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; una secuencia tipo 21F06 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 17B05 (como se define en la presente), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; una secuencia tipo 21F06 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 18G11 (como se define en la presente), y un grupo; residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteína de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteína de suero y en particular a albúmina de suero), ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; una secuencia tipo 21F06 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 34C07 (como se define en la presente), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; una secuencia tipo 04C07 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 17B05 (como se define en la presente), y un grupo, residuo, .porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un . ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; una secuencia tipo 04C07 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 18G11 (como se define en la presente), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina .de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente); una secuencia tipo 04C07 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 34C07 (como se define en la presente), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteína de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteína de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente); una secuencia tipo 17B05 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 18G11 (como se define en la presente), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida, media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteína de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteína de suero y en particular a albúmina de suero), ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente); una secuencia tipo 17B05 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 34C07 (como se define en la presente) , y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente) ; una secuencia tipo 18G11 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 34C07 (como se define en la presente), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero, o un péptido que se dirige a una proteina de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presenté) ; y de nuevo tales polipéptidos (de los cuales algunos ejemplos no limitantes serán claros para la persona experimentada con base en la descripción en la presente - por ejemplo, algunos se enlistan en la Tabla A-2 a continuación) de nuevo forman aspectos adicionales de la invención.
Algunos polipéptidos preferidos específicamente, pero no limitantes de la invención comprenden o consisten esencialmente de: a) una secuencia tipo 21F06 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 17B05 (como se define en la presente) , y grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblémente un ISV que se dirige a una proteína de suero y en particular a albúmina de suero tal como Alb-8, o un péptido que se dirige a una proteína de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se. describe en la presente). Un ejemplo específico preferido pero no limitante de tal polipéptido es HER3MS00135 (SEQ ID NO:282); o b) una secuencia tipo 17B05 (como se define en la presente) y una secuencia tipo 18G11 (como se define en la presente), y un grupo, residuo, porción o unidad de enlace que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos (y preferiblemente un ISV qué se dirige a una proteína de suero y en particular a albúmina de suero tal como Alb-8, o un péptido que se dirige a una proteína de suero y en particular a albúmina de suero) , ligada adecuadamente ya sea directamente o usando una o más ligaduras o espaciadores adecuados (como se describe en la presente). Dos ejemplos preferidos específicos, pero no limitantes de tal polipéptido son HER3MS00212 (SEQ ID NO:319) y HER3MS00215 (SEQ ID NO:322) .
Algunos ejemplos preferidos específicamente, pero no limitantes de polipéptidos de la invención son HER3MS00135 (SEQ ID NO: 282), HER3MS00212 (SEQ ID NO: 319) y HER3MS00212 (SEQ ID NO: 322) . La invención de esta manera también se refiere a: a) el polipéptido HÉR3MS00135 (SEQ ID NO:282), así como a polipéptidos que tienen al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90%, y hasta 95% o más (tal como 98%, 99% o más) identidad de secuencia con HER3 S00135 (SEQ ID NO:282), en los cuales la secuencia tipo 21F06 y secuencia tipo 17B05 presente en tales polipéptidos son preferiblemente como se describe en la presente; b) el polipéptido HER3MS00212 ( SEQ ID NO:319), así como a polipéptidos que tienen al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90%, y hasta 95% o más (tal como 98%, 99% o más) identidad de secuencia con HER3MS00212 (SEQ ID NO: 319) , en los cuales la secuencia tipa 18G11 y secuencia tipo 17B05 ¦ presentes en tales polipéptidos son preferiblemente como se describe en la presente; c) el polipéptido HER3 S00215 (SEQ ID NO: 322), así como a polipéptidos que tienen al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90%, y hasta 95% o más (tal como 98%, 99% o más) identidad de secuencia con HER3MS00215 (SEQ ID NO:322), en los cuales la secuencia tipo 18G11 y secuencia tipo 17B05 presentes en tales polipéptidos son preferiblemente como se describe en la presente.
También se ha encontrado que algunos de los polipéptidos proporcionados por la invención ' pueden tener un efecto en internalización HER3, y e.n particular pueden incrementar la internalización del receptor HER3. Esto puede por ejemplo tiener el efecto de reducir el número de receptores HER3 presentes en la superficie de una célula, y de esta manera reducir la sensibilidad del ligando de la célula y/o reducir la señalización mediada por HER3 en/por la célula y/o modular otros efectos biológicos relacionados con HER3 de la célula. Se hace referencia por ejemplo al Ejemplo 17 a continuación. Este efecto en la internalización HER3 mostrado por los polipéptidos de la invención es sorprendente particularmente hsta ahora debido a que, ninguno de los bloques de construcción monovalentes correspondientes presentes en los polipéptidos que promueven la internalización se ha encontrado que tengan ' una influencia similar en la internalización HER3.
Será claro para la persona experimentada que para algunas aplicaciones de los polipéptidos de la invención, puede ser antaj oso usar un polipéptido de la invención que puede promover o incrementar la internalización HER3 de una célula que expresa HER3 que se expone a o está en contacto con tal polipéptido (por ejemplo, después de la administración del polipéptido a un paciente u otro sujeto) . De esta manera, en un aspecto, un polipéptido como se describe en la presénte (que puede contener cualquiera de los bloques de construcción/ISV s descritos en la presente y que pueden por ejemplo ser cualquiera de los polipéptidos descritos en las páginas previas) es- preferiblemente de manera que es capaz de promover o incrementar la internalización HER3 de una célula, por ejemplo por al menos 5%, tal como al menos 10%, por ejemplo al menos 25%, tal como 50% o aún 90% o más, como se mide usando un ensayo adecuado, por ejemplo el ensayo de los Ejemplos 17 y 20.
También será claro para la persona experimentada que para otras aplicaciones de los polipéptidos de la invención, puede ser ventajoso usar un polipéptido de la invención que esencialmente no altera, promueve o incrementa la internalización HER3 de una célula que expresa HER3 que se expone a o pone en contacto con tal polipéptido (por ejemplo, después de la administración del polipéptido a un paciente u otro sujeto) . De esta manera, en un aspecto, un polipéptido como se describe en la presente (que puede contener cualquiera de los bloques- de construcción/ISV s descritos en la presente y que pueden por ejemplo ser cualquiera de los polipéptidos descritos en las páginas previas) es preferiblemente de manera que no altera o afecte la internalización HER3 de una célula, como se mide usando un ensayo adecuado, por ejemplo el ensayo de los Ejemplos 17 y 20.
Los compuestos o polipéptidos de la invención pueden generalmente prepararse por un método que comprende al menos una etapa de ligar adecuadamente una o más secuencias de aminoácidos de la invención a uno o más grupos, residuos, porciones o unidades de enlace adicionales, opcionalmente por medio de una o más ligaduras adecuadas, a fin de proporcionar el compuesto o polipéptido de la invención. Los polipéptidos de la invención también pueden prepararse por un método que generalmente comprende al menos las etapas de proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, que expresa el ácido nucleico en una manera adecuada, y recubre el polipéptido expresado de la invención. Tales métodos pueden realizarse en una manera conocida per se, que serán claros para la persona experimentada, por ejemplo en la base de los métodos y técnicas descritas adicionales en la presente.
El proceso de diseñar/seleccionar y/o preparar un compuesto o polipéptido de la invención, iniciando de una secuencia de aminoácidos de la invención, también es referido en la presente como "formateo" de la secuencia de aminoácidos de la invención; y un aminoácido de la invención que se hace parte de un compuesto o polipéptido de la invención que es para ser "formateado" o para estar "en el formato de" el compuesto o polipéptido de' la invención. Los ejemplos de formas en las cuales una secuencia de aminoácidos de la invención puede formatearse y los ejemplos de tales formatos serán claros para la persona experimentada con base en la descripción en la presente; y tales secuencias de aminoácidos formateradas forman un aspecto adicional de la invención.
En un aspecto especifico de la invención, un compuesto de la invención o un polipéptido de la invención puede tener una vida media incrementada, comparado con la secuencia de aminoácidos correspondientes de la invención. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de tales compuestos y polipéptidos se volverán claros para la persona experimentada con base en la descripción adicional en la presente, y por ejemplo comprenden secuencias de aminoácidos o polipéptidos de la invención que se han modificado químicamente para incrementar la vida media de los mismos (por ejemplo, por medio de pegilación) ; secuencias de aminoácidos de la invención que comprenden al menos un sitio de enlace adicional para enlazar a una proteina de suero (tal como albúmina de suero) ; o polipéptidos de la invención que comprenden al menos una secuencia de aminoácidos de la invención que se lita a al. menos una porción (y en particular al menos una secuencia de aminoácidos) que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos de la invención. Los ejemplos de polipéptidos de la invención que comprenden tales porciones o secuencias de aminoácidos que extienden la vida media se volverán claros para la persona experimentada con base en la descripción adicional en la presente; y por ejemplo incluyen, sin limitación, polipéptidos en los cuales una o más secuencias de aminoácidos de la invención se ligan adecuadas a una o más proteínas de suero o fragmentos de los mismos (tal como albúmina de suero (humana) o fragmentos adecuados de la misma) o a una o más unidades de enlace que pueden enlazar a las proteínas de suero (tal como, por ejemplo, anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para uso como un anticuerpo de dominio, anticuerpos de dominio sencillos, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para uso como un anticuerpo de dominio sencillo, "dAb"'s, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para uso' como un dAb, o Nanocuerpos que pueden enlazar a las proteínas de suero tal como albúmina de suero (tal como albúmina de suero humana), inmunoglobulinas de suero tal como IgG, o transíerrina; se hace referencia a la descripción adicional y referencias mencionadas en la presente) ; polipéptidos en los cuales una secuencia de aminoácidos de la invención se liga a una porción Fe (tal como un Fe humano) o una parte adecuada o fragmento de la misma; o polipéptidos en los cuales una o más secuencias de aminoácidos de la invención se ligan adecuados a una o más proteínas o péptidos pequeños que pueden enlazar a proteínas de suero (tal como, sin limitación, las proteínas y péptidos descritos en WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489 y a la solicitud provisional EUA de Ablynx N.V. titulada "Péptidos capaces de enlazar a las proteínas de suero" de Ablynx N.V. presentada el 5. de Diciembre 2006 (también ver PCT/EP2007/063348) .
Generalmente, los compuestos o polipéptidos de la invención con vida media incrementada preferiblemente tienen una vida media que es al menos 1.5 veces, preferiblemente al menos 2 veces, tal como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la vida media de la secuencia de aminoácidos correspondiente de la invención per se. Por ejemplo, los compuestos o polipéptidos de la invención con vida media incrementada pueden tener una vida media que se incrementa con más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o aún más de 24, 48 o 72 horas, comparados con la secuencia de aminoácidos correspondientes de la invención per se. En un aspecto preferido, pero no limitante de la invención, los incrementos de arriba en vida media se logran en mamíferos tal como por ejemplo humano, esto es preferiblemente en humanos.
En un aspecto preferido, pero no limitante de la invención, tales compuestos o polipéptidos de la invención tienen una vida media de suero que se incrementa con más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o aún más de 24, 48 o 72 horas, comparados con la secuencia de aminoácidos correspondientes de la .invención per se. En un aspecto preferido, pero no limitante de la invención, los incrementos de arriba en la vida media se logran en maíferos tal como por ejemplo humano, esto es preferiblemente en humanos.
En otro aspecto preferido, pero no limitante de la invención, tales compuestos o polipéptidos de la invención muestran una vida media de suero en humano de al menos alrededor de 12 horas, preferiblemente al menos 24 horas, más preferiblemente al menos 48 horas, aún más preferiblemente al menos 72 horas o más. Por ejemplo, los compuestos o polipéptidos de la invención pueden tener una vida media de al menos 5 días (tal como alrededor de 5 hasta 10 días), preferiblemente al menos 9 días' (tal como alrededor de 9 hasta 14 días), más preferiblemente al menos alrededor de 10 días (tal como alrededor de 10 hasta 15 días), o al menos alrededor de 11 días (tal como alrededor de 11 hasta 16 días), más preferiblemente al menos alrededor de 12 días (tal como alrededor de 12 hasta 18 días o más), o más de 14 días (tal como alrededor de 14 hasta 19 días). En un aspecto preferido, pero no limitante de la invención, las vidas medias de suero de arriba se logran en mamíferos tal como por ejemplo humano, esto es preferiblemente en humanos.
En otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la invención o un polipéptido de la invención (o un fragmento adecuado de las mismas) . Tal ácido nucleico también se referirá en la presente como un "ácido nucleico de la invención" y puede por ejemplo estar en la forma de un constructo genético, como se describe además en la presente.
En otro aspecto, la invención se refiere a un hospedero o células hospedera que expresa (o que bajo circunstancias adecuadas es capaz de expresar) una secuencia de aminoácidos de la invención y/o un polipéptido de la invención; y/o que contiene un ácido nucleico de la invención. Algunos ejemplos preferidos pero no limitantes de tales hospederos o células hospederas se volverán claros de la descripción adicional en la presente.
La invención además se refiere a un producto o composición que contiene o que comprende al menos una secuencia de aminoácidos de la invención, al menos un polipéptido de la invención (o un fragmento adecuado de las mismas) y/o al menos un ácido nucleico de la invención, y opcionalmente uno o más componentes adicionales de tales composiciones conocidas per se, por ejemplo dependiendo del uso pretendido de la composición. Tal producto o composición puede por ejemplo ser una composición farmacéutica (como se describe en la presente) , una composición veterinaria o un producto o composición para uso de diagnóstico (también como se describe en la presente). Algunos ejemplos preferidos pero no limitantes de tales productos o composiciones se volverán claros de la descripción adicional en la presente.
La invención también se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos, Nanocuerpo o polipéptido de la invención, o de una composición que comprende la misma, en (métodos o composiciones para) modular HER3, ya sea in vitro (por ejemplo en un ensayo . in vitro o celular) o in vivo (por ejemplo en una célula sencilla o en un organismo multicelular, y en particular en un mamífero, y más en particular en un ser humano, tal como en un ser humano que está en riesgo de o padece de una variedad de cánceres) .
La invención también se refiere a métodos para modular HER3, ya sea in vitro (por ejemplo en un ensayo in vitro o celular) o in vivo (por ejemplo en una célula sencilla u organismo multicelular, y en particular en un mamífero, y más en particular en un ser humano, tal como en un ser humano que está en riesgo de o padece de una variedad de cánceres), cuyo método comprende al menos · la etapa de poner en contacto HER3 con al menos una secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención, o con una composición que comprende la misma, en una manera y en una cantidad adecuada para modular HER3, con al menos una secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención.
La invención también se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención en la preparación de una' composición (tal como, sin limitación, una preparación o composición farmacéutica como se describe además en la presente) para modular HER3, ya sea in vitro (por ejemplo en un ensayo in vitro o celular) o in vivo (por ejemplo en una célula sencila u organismo multicelular, y en particular en un mamífero, y más en particular en un ser humano, tal como en un ser humano que está en riesgo de o padece de una variedad de cánceres) .
En el contexto de la presente invención, "modular" o "para modular" generalmente singifica ya sea reducir o inhibir la actividad de, o alternativamente incrementar la actividad de, HER3, como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tal como aquellos mencionados en la presente). En particular, "modular" o "para modular" pueden significar ya sea reducid o inhibir la actividad de, o alternativamente incrementar, la actividad de HER3, como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tal como aquellos mencionados en la presente), por al menos 1%, preferiblemente al menos 5%, tal como al menos 10% o al menos 25%, por ejemplo por al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o 90% o más, comparado con la actividad de HER3 en el mismo ensayo bajo las mismas condiciones pero sin' la presente de la secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención.
Como será claro para la persona experimentada, "modular" también puede involucrar efectuar un cambio (que puede ya sea ser un incremento o una disminución) en afinidad, avidez, especificidad y/o selectividad de HER3 para uno o más de sus objetivos, compañeros de heterodimerización, ligandos o substratos; y/o efectuar un cambio (que puede ya sea ser un incremento o una disminución) en la sensibilidad de HER3 para una o más condiciones en el medio o alrededores en los cuales se presenta HER3 (tal como pH, resistencia al ión, la presencia de co-factores ,' etc.)/ comparado con las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoácido, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención. Como será claro para la persona experimentada, esto puede de nuevo determinarse de . cualquier manera adecuada y/o usando cualquier ensayo adecuado conocido per se, tal como los ensayos descritos en la presente o en la técnica previa citada en la presente.
"Modular" también significa efectuar un cambio (esto es una actividad como un agonista o como un antagonista, respectivamente) con respecto a uno o más mecanismos, efectos, respuestas, funciones, trayectorias o actividades biológicas o fisiológicas en las cuales se involucra HER3 (o en las cuales sus sustratos, ligandos o trayectorias se involucran, tal como su trayectoria de señalización o trayectoria metabólica y sus efecto biológicas o fisiológicos asociados) . De nuevo, como será claro para la persona experimentada, tal acción como un agonista o un antagonista puede determinarse en cualquier manera adecuada y/o usando cualquier ensayo adecuado (in vitro y usualmente celular o en ensayo in vivo) conocido per se, tal como los ensayos descritos en la presente o en la técnica previa citada en la presente. En particular, una acción como un agonista o antagonista puede ser de manera que una actividad biológica o fisiológica pretendida se incrementa o disminuye, respectivamente, por al menos 1%, preferiblemente al menos 5%, tal como al menos 10% o al menos 25%, por ejemplo por al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o 90% o más, comparada con la actividad biológica o fisiológica en el mismo esnayo bajo las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención.
Modular puede por ejemplo involucrar reducir o inhibir el enlace de HER3 a uno de sus sustratos o ligandos y/o compiten con un ligando natural, sustrato para enlazar a HER3. La modulación también puede involucrar activar HER3 o el mecanismo o trayectoria en la cual se involucra. La modulación puede ser reversible o irreversible, pero para propósitos farmacéuticos y farmacológicos usualmente será en una manera reversible.
La invención además se refiere a métodos para preparar o generar las secuencias de aminoácidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospederas, productos y composiciones descritas en la presente. Algunos ejemplos preferidos pero no limitantes de tales métodos se volverán claros de la descripción adicional en la presente.
Generalmente, estos métodos pueden comprender las etapas a) proporcionar un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos; y b) seleccionar el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos¦ para secuencias de aminoácidos que pueden enlazar a y/o tienen afinidad para HER3; y c) aislar las secuencias de aminoácidos que pueden enlazar a y/o tener afinidad para HER3.
En tal método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos puede ser cualquier conjunto, colección o biblioteca adecuada de secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos puede ser un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de inmunoglobulina (como se describe en la presente) , tal como un conjunto, colección o biblioteca sencillo de secuencias de inmunoglobulina; un conjunto, colección o biblioteca sintética o semi-sintética de secuencias de inmunoglobulina;. y/o un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de inmunoglobulina que se han sometido a maduración por afinidad.
También, en tal método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos puede ser un conjunto, colección o biblioteca de dominios variables de cadena pesada (tal como dominios VH o dominios VHH) o de dominios variables de cadena ligera. Por ejemplo, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos puede ser un conjunto, colección o biblioteca de anticuerpos de dominio o anticuerpos de dominio sencillo, o puede ser un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos que son capaces de funcionar como un anticuerpo de dominio o anticuerpo de dominio sencillo.
En un aspecto preferido de este método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos puede ser un conjunto, colección 'o biblioteca inmunitario de secuencias de inmunoglobulina, por ejemplo derivado de un mamífero que se ha inmunizado adecuadamente con HER3 o con un determinante antigénico adecuado- con base en ello o derivado del mismo, tal como una parte antigénica, fragmento, región, dominio, rizo u otro epítopo del mismo. En un aspecto particular, el determinante antigénico puede ser una parte, región, dominio, rizo extracelular u otros epítopos extracelulares .
En los métodos de arriba, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos puede exhibirse en un fago, fagemido, ribosoma o micro-organismo adecuado (tal como levadura), tal como para facilitar la selección. Los métodos, técnicas y organismos hospederos adecuados para exhibición y selección (un conjunto, colección o biblioteca de) secuencias de aminoácidos serán claros para la persona experimentada en la técnica, por ejemplo en la base de la descripción adicional en la presente. También se hace referencia a la revisión por Hoogenboom en Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005) .
En otro aspecto, el método para generar secuencias de aminoácidos comprende al menos las etapas de: a) proporcionar una colección o muestra de células que expresan secuencias de aminoácidos ; b) selecciona la colección o muestra de células para células que expresan una secuencia de aminoácido que puede enlazar a y/o tener afinidad para HER3; y c) ya sea (i) aislar la secuencia de aminoácidos; o (ii) aislar de la célula una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos, seguida por expresar la secuencia de aminoácidos.
Por ejemplo, cuando la secuencia de aminoácidos deseada es una secuencia de inmunoglobulina, la colección o muestra de células puede por ejemplo ser una colección o muestra de células B. También, en este método, la muestra de células puede derivarse de un mamífero que se ha inmunizado adecuadamente con HER3 o con un determinante antigénico adecuado con base en ello o derivado del mismo, tal como una parte, fragmento, región, dominio, rizo antigénico u otro epitopo de los mismos'. En un aspecto particular, el determinante antigénico puede ser una parte, región, dominio, rizo extracelular u otros epitopos extracelulares .
El método de arriba puede realizarse en cualquier manera adecuada, como será claro para la persona experimentada. Se hace referencia por' ejemplo a EP 0 542 810, WO 05/19824, WO 04/051268 y WO 04/106377. La selccion de la etapa b) se realiza preferiblemente usando una técnica de citometria de flujo tal como FACS. Para esto, se hace referencia por ejemplo a Lieby et al., Blood, Vol. 97, No. 12, 3820 (2001).
En otro aspecto, el método para generar una secuencia de aminoácidos dirigida contra HER3 puede comprender al menos las etapas de: a) proporcionar un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifica las secuencias de aminoácidos ; b) seleccionar el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico para secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia de aminoácidos que puede enlazar a y/o tiene afinidad para HER3; y c) aislar la secuencia de ácido nucleico, seguido por expresar la secuencia de aminoácidos .
En tal método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifica las secuencias de aminoácidos puede por ejemplo ser un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifican un conjunto, colección o biblioteca sencilla de secuencias de inmunoglobulina ; un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifican un conjunto, colección o biblioteca sintética o semi-sintética de secuencias de inmunoglobulina; y/o un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifican un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de inmunoglobulina que se han sometido a maduración por afinidad .
También, en tal método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico puede codificar un conjunto, colección o biblioteca de dominios variables de cadena pesada (tal como dominios VH o dominios VHH) O de dominios variables de cadena ligera. Por ejemplo, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico puede codificar un conjunto, colección o biblioteca de anticuerpos de dominio o anticuerpos de dominio sencillo, o un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos que son capaces de funcionar como un anticuerpo de dominio o anticuerpo de dominio sencillo.
En un aspecto preferido de este método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico puede ser un conjunto, colección o biblioteca inmunitaria de secuencias de ácido nucleico, por ejemplo derivadas de un mamífero que se ha inmunizado adecuadamente con HER3 o con un determinante antigénico adecuado con base en ello o derivado del mismo, tal como una parte, fragmento, región, dominio, rizo antigénico u otro epítopo del mismo. En un aspecto particular, el determinante antigénico puede ser una parte, región, dominio, · rizo extracelular u otros epítopos extracelulares .
El conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico puede por ejemplo codificar un conjunto, colección o biblioteca inmunitaria de dominios variables de cadena pesada o de dominios variables de cadena ligera. En un aspecto específico, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de nucleótido puede codificar un conjunto, colección o biblioteca de secuencias VHH.
En los métodos de arriba, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de nucleótido pueden exhibirse en un fago, fagemido, ribosoma o micro-organismo adecuado (tal como levadura), tal como para facilitar la selección. Los métodos, técnicas y organismos hospederos adecuados para exhibir y seleccinar (un conjunto, colección o biblioteca de) secuencias de nucleótido que codifican secuencias de aminoácidos serán claros pará la persona experimentada en la técnica, por ejemplo en la base .de la descripción adicional en la presente. También se hace referencia a la revisión por Hoogenboom en Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005) .
En otro aspecto, el método para generar una secuencia de aminoácidos dirigida contra HER3 puede comprender al menos las etapas de: a) proporcionar un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifica secuencias de aminoácidos ; b) seleccionar el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico para secuencias de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que puede enlazar a y/o tiene afinidad para HER3 y que se bloquea cruzado o está bloqueando cruzado un ISV o Nanocuerpo de la invención, por ejemplo SEQ ID NO: 12 hasta 26 (Tabla A-l), o un ISV humanizado o Nanocuerpo de la invención; y c) aislar la secuencia de ácido nucleico, seguido al expresar la secuencia de aminoácidos.
La invención también se refiere a secuencias de aminoácidos que se. obtienen por los métodos de arriba, o alternativamente por un método que comprende uno de los métodos de arriba y además al menos las etapas de determinar la secuencia de nucleótido o secuencia de aminoácidos de la secuencia de inmunoglobulina ; y de expresar o sintetizar la secuencia de aminoácidos en una manera conocida per se, tal como por expresión en una célula hospedera u organismo hospedero adecuado o por síntesis química.
También, siguiendo las etapas de arriba, una o más secuencias de aminoácidos de la invención puede estar humanizada adecuadamente (o camelizada alternativamente); y/o las secuencias de aminoácido de esta manera obtenidas pueden ligarse una con la otra o a una o más de otras secuencias de aminoácidos adecuadas (opcionalmente por medio de una o más ligaduras adecuadas) a fin de proporcionar un polipéptido de la invención. También, una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la invención puede estar humanizada adecuadamente (o camelizada alternativamente) y expresada adecuadamente; y/o una o más secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia de aminoácidos de la invención pueden ligarse una con la otra o a una o más secuencias de ácido nucleico que codifican otras secuencias de aminoácidos adecuadas (opcionalmente por medio de secuencias de nucleótido que codifican una o más ligaduras adecuadas), después de lo cual la secuencia de nucleótido de esta manera obtenida puede expresarse adecuadamente a fin de proporcionar un polipéptido de la invención.
La invención además se refiere a aplicaciones y usos de las secuencias de aminoácidos, compuestos, constructos, polipéptidos , ácidos nucleicos, células hospederas, productos y composiciones descritas en la presente, asi como a métodos para la prevención y/o tratamiento para enfermedades y trastornos asociados con HER3. Algunas aplicaciones y usos preferidos pero no limitantes se volverán claros de la descripción adicional en la presente.
La invención también se refiere a las secuencias de aminoácidos, compuestos, constructos, polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospederas, productos y composiciones descritas en la presente para uso en terapia.
En particular, la invención también se refiere a las secuencias de aminoácidos, compuestos, constructos, polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospederas, productos y composiciones descritas en la presente para uso en terapia de una enfermedad o trastorno que puede prevenirse o tratarse al administrar, a un sujeto que necesita del mismo, de (una cantidad farmacéuticamente aceptable de) una secuencia de aminoácidos, compuesto, , constructo o polipéptido como se describe en la presente.
Más en particular, la invención se refiere a las secuencias de aminoácidos, compuestos, constructos, polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospederas, productos y composiciones descritas en la presente para uso en terapia de la variedad de cánceres.
Otros aspectos, modalidades, ventajas y aplicaciones de la invención también se volverán claras de la descripción adicional en la presente, en las cuales la invención se describirá y discutirá en más detalle con referencia a los Nanocuerpos de la invención y polipéptidos de la invención que comprenden la misma, que forman algunos aspectos preferidos de la invención.
Como se volverán claros de la descripción adicional en la presente, los Nanocuerpos generalmente ofrecen ciertas ventajas (resumidas en la presente) comparados con "dAb' s" o anticuerpos de dominio similares (sencillos) o secuencias de inmunoglobulina , cuyas ventajas también se proporcionan por los Nanocuerpos de la invención. Sin embargo, serán claros para la persona experimentada que los aspectos más generales de la enseñanza a continuación también pueden aplicarse (ya sea directamente o análogamente) a otras secuencias de aminoácidos de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Secuencias de nucleótidos que codifican algunas de las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención .
Figura 2 : Datos de enlace FACS de Nanocuerpos específicos de HER3 y anticuerpos policlonales de control (PC) y monoclonales (MC) y un Nanocuerpo irrelevante (irr nb) para el HER3 de pollo extracelular de longitud completa o HER3 de pollo-humano quimérico.
Las Figuras 3A a 3D muestran curvas de enlace que muestran que los Nanocuerpos optimizados con secuencias multivalentes se enlaza a HER3 pero no a las otras proteínas HER (véase el Ejemplo 25) .
La Figura 4 da las secuencias de aminoácidos de algunas de las proteínas referidas en la presente especificación y en las reivindicaciones.
Las Figuras 5A y 5B muestran técnicas de Western Blot que muestran la inhibición de pHER3 y señalización cadena abajo en células de cáncer de mama BT-474 por Nanocuerpos optimizados con secuencias formateadas (Ejemplo 28) .
Las Figuras 6A a 6C muestran técnicas de Western Blot que muestran la inhibición de pHER3 y señalización cadena abajo en células de cáncer pancreático BxPC3 por Nanocuerpos optimizados con secuencias ' formateadas (Ejemplo 28).
Las Figuras 7A a 7C muestran la inhibición del crecimiento del tumor (volumen de tumor medio a través del tiempo) de tumores de xenoinjerto A549 tratados con Nanocuerpos HER3 S00135 (Figura 7A) HER3MS00212 (Figura 7B) , y HER3MS00215 (Figura 7C) , respectivamente.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la presente descripción, los ejemplos y reivindicaciones : a) A menos que se indique o defina de otra manera, todos los términos usados tienen su significado usual en la técnica, que serán claros para la persona experimentada. Se hace referencia por ejemplo a los manuales estándares mencionados en el párrafo a) en la página 46 de la WO 08/020079. b) A menos que se indique de otra manera, el término "dominio variable sencillo de inmunoglobulina" se usa como un término general para incluir pero no limitar a dominios enlazados a antigeno o fragmentos tales como dominios VHH O dominios VH o VL, respectivamente, como por ejemplo se describen en la presente. Los términos moléculas enlazadas al antigeno o proteina enlazada al antigeno se usan intercambiablemente e incluyen también el término nanocuerpos. Los dominios variables sencillos de inmunoglobulina además son secuencias de dominio variable de cadena ligera (por ejemplo una secuencia VL) , o secuencias de dominio variable de cadena pesada (por ejemplo una secuencia VH) ; más específicamente, pueden ser secuencias de dominio variable de cadena pesada que se derivan de un anticuerpo de cuatro cadenas convencionales o secuencias de dominio variable de cadena pesada que se derivan de un anticuerpo de cadena pesada. En consecuencia, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina pueden ser anticuerpos de dominio, o secuencias de inmunoglobulina que son adecuadas para uso como anticuerpos de dominio, anticuerpos de dominio sencillo, o secuencias de inmunoglobulina que son adecuadas para uso como anticuerpos de dominio sencillo, "dAbs", o secuencias de inmunoglobulina que son adecuadas para uso como dAbs, o nanocuerpos, o secuencias de inmunoglobulina que son adecuadas para uso como nanocuerpos, incluyendo pero no limitadas a secuencias VHH- La invención incluye secuencias de inmunoglobulina de diferente origen, que comprenden secuencias de inmunoglobulina de ratón, rata, conejo, burro, tiburón, humano y camélido. El dominio variable sencillo de inmunoglobulina incluye secuencias de inmunoglobulina completamente humanas, humanizadas, de otra manera optimizadas por secuencias, o quiméricas. El dominio variable sencillo de inmunoglobulina y estructura de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina pueden considerarse - sin embargo sin limitarse a esto - para estar comprendidos de cuatro regiones de estructura o "FR's", que se refieren en la técnica y en la presente como "Región de estructura 1" o "FR1"; como "Región de estructura 2" o "FR2 " ; como "Región de estructura 3" o "FR3" ; y como "Región de estructura 4" o "FR4", respectivamente; cuyas regiones de estructura se interrumpen por tres regiones que determinan la complementariedad o "CDR' s", que se refieren en la técnica como "Región que determina la complementariedad 1" o "CDR1"; como "Región que determina la complementariedad 2 " o "CDR2"; y como "Región que determina la complementariedad 3" o "CDR3", respectivamente. Se señala que los términos nanocuerpo o Nanocuerpos son marcas registradas de Ablynx N.V. y de esta manera también pueden referirse como Nanocuerpo® y/o Nanocuerpos®) . c) A menos que se indique de otra manera, los términos "secuencia de inmunoglobulina", ' "secuencia", "secuencia de nucleótido" y "ácido nucleico" son como se describe en el párrafo b) en la página 46 de WO 08/020079. d) A menos que se indique de otra manera, todos los métodos, etapas, técnicas y manipulaciones que no se describen específicamente en detalle pueden realizarse y se han realizado en una manera conocida per se, como será claro para la persona experimentada. Se hace referencia de nuevo por ejemplo a los manuales estándares y antecedentes generales mencionados en la presente y para las referencias adicionales citadas en ellos; así como a por ejemplo las siguientes revisiones Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6) : 640-56; Levin and eiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57; Irving et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45; Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Suppl . A, S106-12, Gonzales et al . , Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43, que describen técnicas para preparar por ingeniería la proteina, tal como maduración de afinidad y otras técnicas para mejorar la especificidad y otras propiedades deseadas de las proteínas tal como inmunoglobulinas . e) Los residuos de aminoácido se indicarán de acuerdo con el código de aminoácido de tres letras o una letra estándares. Se hace referencia a la- Tabla A-2 en la página 48 de la Solicitud International WO 08/020079 de Ablynx N.V. titulada "Amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with IL-6 mediated signalling" . f) Para los propósitos de comparar dos o más secuencias de nucleótido, el porcentaje de "identidad de secuencia" entre una primera secuencia de nucleótido y una segunda secuencia de nucleótido püede calcularse o determinarse como se describe en el párrafo e) en la página 49 de la WO 08/020079 (incorporada en la presente como referencia), tal como al dividir [el número de nucleótidos en la primera secuencia de nucleótido que son idénticos a los nucleótidos en las posiciones correspondientes en la segunda secuencia de nucleótido] por [el número total de nucleótidos en la primera secuencia de nucleótido] y multiplicar por [100%], en el cual cada eliminación, inserción, sustitución o adición de un nucleótido en la segunda secuencia de nucleótido - comparada con la primera secuencia de nucleótido - se considera como una diferencia en un nucleótido sencillo (posición) ; o usando una técnica o algoritmo de computadora adecuado, de nuevo como se describe en el párrafo e) en las paginas 49 de la O 08/020079 (incorporada en la presente como referencia) . g) Para los propósitos de comparar dos o más secuencias de aminoácidos, el porcentaje de "identidad de secuencia" entre una primera secuencia de aminoácidos y una segunda secuencia de aminoácidos (también referido en la presente como "identidad de aminoácido") puede calcularse o determinarse como se describe en el párrafo f) en las paginas 49 y 50 de la WO 08/020079 (incorporada en la presente como referencia), tal como al dividir [el número de residuos de aminoácido en la primera secuencia de aminoácidos que son idénticos a los residuos de aminoácido en las porciones correspondientes en la segunda secuencia de aminoácidos] por [el número total de residuos de aminoácido en la primera secuencia de aminoácidos] y multiplicar por [100%], en la cual cada eliminación, inserción, sustitución o adición de un residuo de aminoácido en la segunda secuencia de aminoácidos - comparada con la primera secuencia de aminoácidos - se considera como una diferencia en un residuo de aminoácido sencillo (posición) , esto es como una "diferencia de aminoácido" como se define en la presente; o usando una técnica o algoritmo de computadora adecuado, de nuevo como se describe en el párrafo f) en las páginas 49 y 50 de la WO 08/020079 (incorporada en la presente como referencia) .
También, al determinar el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos, la persona experimentada puede tomar en cuenta las asi llamadas sustituciones de aminoácido "conservadoras", como se describe en la página 50 de la WO 08/020079.
Cualquiera de las sustituciones de aminoácido aplicadas a los polipéptidos descritos en la presente también puede ser con base en los análisis de las frecuencias de las variaciones de aminoácido entre las proteínas homologas de diferentes especies desarrolladas por Schulz et al., Principies of Protein -Structure, Springer-Verlag, 1978, en los análisis de los potenciales que forman la estructura desarrollados por Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 and Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978, y en los análisis de los patrones de hidrofobicidad en proteínas desarrolladas por Eisenberg et al., Proc . Nad. Acad Sci. EUA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 198 1, y Goldman et al., Ann. Rev . Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986, todos incorporados en la presente en su totalidad .como referencia. La información en la estructura primaria, secundaria y terciaria de los Nanocuerpos se da en la descripción en la presente y en los antecedentes generales citados arriba. También, para este propósito, la estructura de cristal de un dominio VHH de una llama por ejemplo se da por Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol . 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757; y Decanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999). La información adicional alrededor de algunos de los residuos de aminoácido que en dominios VH convencionales forma la interfaz VH/VL y sustituciones camelizadas potenciales en estas posiciones pueden encontrarse en la técnica previa citadas arriba. h) Las secuencias de aminoácidos y secuencias de ácido nucleico son para ser "exactamente las mismas" si tienen 100% de identidad de secuencia (como se define en la presente) sobre su longitud completa. i) Cuando se comparan dos secuencias de aminoácidos, el término "diferencia de aminoácido" se refiere a una inserción, eliminación o sustitución de un residuo de aminoácido sencillo en una posición de la primera secuencia, comparada con la segunda secuencia; se entiende que dos secuencias de aminoácidos pueden contener una, dos o más de tales diferencias de aminoácido. j ) Cuando una secuencia de. nucleótido o secuencia de aminoácidos se dice que "comprende" otra secuencia de nucleótido o secuencia de aminoácidos, respectivamente, o "consiste esencialmente de" otra secuencia de nucleótido o secuencia de aminoácidos, esto tiene el significado dado en el párrafo i) en las páginas 51-52 de la WO 08/020079. k) El término "en forma aislada esencialmente" tiene el significado dado en el párrafo j) en las páginas 52 y 53 de la WO 08/020079. 1) Los términos "dominio" y "dominio de enlace" tiene los significados dados en el párrafo k) en la página 53 de la WO 08/020079. m) Los términos "determinante¦ antigénico" y "epitopo", que también pueden usarse intercambiablemente en la presente, tienen los significados dados en el párrafo 1) en la página 53 de la WO 08/020079. n) Como se describe además en el párrafo m) en la página 53 de la WO 08/020079, una secuencia de aminoácidos (tal como un Nanocuerpo, un anticuerpo, un polipéptido de la invención, o generalmente una proteina o polipéptido enlazado al antigeno o un fragmento dél mismo) que puede (específicamente) enlazar a, que ' tiene afinidad para y/o que tiene especificidad para un determinante antigénico, epitopo, antigeno o proteina especifica (o para al menos una parte, fragmento o epitopo del mismo) se dice que está "contra" o "dirigido contra" el determinante antigénico, epitopo, antigeno o proteina, o) El término "especificidad" tiene el significado dado en el párrafo n) en las páginas 53-56 de la WO 08/020079; y como se menciona en esto se refiere al número de tipos diferentes de antigenos o determinantes antigénicos para los cuales una molécula . enlazada al antigeno particular o molécula de proteina enlazada al antigeno (tal como un Nanocuerpo o un polipéptido de la invención) se puede enlazar. La especificidad de una proteina enlazada al antigeno puede determinarse con base en la afinidad y/o avidez, como se describe en las páginas 53-56 de la WO 08/020079 (incorporada en la presente como referencia), que también describe algunas técnicas preferidas para medir el enlace entre una molécula enlazada al antigeno (tal como un Nanocuerpo o polipéptido de la invención) y el antigeno pertinente. Típicamente, proteínas enlazadas al antígeno (tal como las secuencias de aminoácidos, Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención) enlazarán a su antígeno con una constante de disociación (KD) de 10"5 hasta 10~12 moles/litro o menos, y preferiblemente 10"7.hasta 10"12 moles/litro o menos y más preferiblemente 1CT8 hasta 10~12 moles/litro (esto es con una constante de asociación (KA) de 105 hasta 1012 litro/moles o más, y preferiblemente 107 hasta 1012 litro/moles o más y más preferiblemente 108 hasta 1012 litro/moles). Cualquier valor KD mayor que 104 mol/litro (o cualquier valor Kñ menor que 104 M"1) litros/mol se considera generalmente para indicar el enlace no especifico. Preferiblemente, una secuencia de inmunoglobulina monovalente de la invención enlazará al antigeno deseado con una afinidad menos de 500 nM, preferiblemente menos de 200 nM, más preferiblemente menos de 10 nM, tal como menos de .500 pM. El enlace especifico de una proteina enlazada al antigeno a un antigeno o determinante antigénico puede determinarse en cualquier manera adecuada conocida per se, incluyendo, por ejemplo, análisis Scatchard y/o ensayos dé enlace competitivos, tal como radioinmunoensayos (RIA) , inmunoensayos de enzima (EIA) y ensayos de competencia de intercalado, y las diferentes variantes de los mismos conocidos per se en la técnica; así como las otras técnicas mencionadas en la presente. Como será claro para la persona experimentada, y como se describe en las páginas 53-56 de O 08/020079, la constante de disociación puede ser . la constante de disociación actual o aparente. Los métodos para determinar la constante de disociación serán claros para la persona experimentada, y por ejemplo incluyen las técnicas mencionadas en las páginas 53-56 de la WO 08/020079. p) La vida medi-a de una secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido de la invención puede generalmente definirse como se describe en el párrafo o) en la página 57 de WO 08/020079 y como se menciona en ella se refiere al tiempo tomado por la concentración de suero de la secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido para reducirse al 50%, in vivo, por ejemplo debido a la degradación de la secuencia o compuesto' y/o autorización o secuestro de la secuencia o compuesto por mecanismos naturales . La vida media in vivo de una secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido de la invención puede determinarse en cualquiera manera conocida per se, tal como por análisis farmacocinético . Las técnicas adecuadas serán claras para la persona experimentada en la técnica, y pueden por ejemplo generalmente ser como se describe en el párrafo o) en la página 57 de la WO 08/020079. También como se menciona en el párrafo o) en la página 57 de la WO 08/020079, la vida media puede expresarse usando parámetros tales como la tl/2-alfa, tl/2-beta y el área bajo la curva (AUC) . Se hace referencia por ejemplo a la Parte Experimental a continuación, asi como a los manueales estándares, tal como Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a edición revisada (1982). Los términos "incrementar en vida media" o "vida media incrementada" como también se define en el párrafo o) en la página 57 de la WO 08/020079 y en particular se refiere a un incremento en el tl/2-beta, ya sea con o son un incremento en el tl/2-alfa y/o el AUC o ambos.
En el contexto de la presente invención, "que modula" o "para modular" generalmente significa ya sea reducir o inhibir la actividad de, o alternativamente incrementar la actividad de, un objetivo o antigeno, como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado. En particular, "que modula" o "para modular" puede significar ya sea reducir o inhibir la actividad de, o alternativamente incrementar una actividad biológica (relevante o pretendida) de, un objetivo o antigeno, como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (que usualmente dependerá del objetivo o atnigeno involucrado), por al menos 1%, preferiblemente al menos 5%, tal como al menos 10% o al menos 25%, por ejemplo por al menos 50%, al ménos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o 90% o más, comparado con la actividad del objetivo o antigeno en el mismo ensayo bajo las mismas condiciones pero sin la presencia del constructoo de la invención.
Como será claro para la persona experimentada, "que modula" también puede involucrar efectuar un cambio (que puede ya sea ser un incremento o una disminución) en afinidad, avidez, especificidad y/o selectividad de un objetivo o antigeno para uno o más de sus ligandos, compañeros de enlace, compañeros para asociación en una forma homomultimérica o heteromultimérica, o sustratos; y/o efectuar un cambio (que puede ya sea ser un incremento o una disminución) en la sensibilidad del objetivo o antigeno para una o más condiciones en el medio o alrededores en los cuales el objetivo o antigeno se presenta (tal como pH, resistencia al ión, la presencia de co-factores, etc.), comparadas con las mismas condiciones pero sin la presencia del constructoo de la invención .
Como será claro para la persona experimentada, esto puede de nuevo determinarse en cualquier manera adecuada y/o usando cualquier ensayo adecuado conocido per se, dependiendo del objetivo o antigeno involucrado.
"Que modula" también puede significar efectuar un cambio (esto es una actividad como un agonista, como un antagonista o como un agonista inverso, respectivamente, dependiendo del objetivo o antigeno y el efecto ' biológico o fisiológico deseado) con respecto a uno o más efectos, respuestas, funciones, trayectorias ó actividades biológicas o fisiológicas en las cuales se involucra el objetivo o antigeno (o en las cuales sus sustratos, ligandos o trayectorias se involucran, tal como, su trayectoria de señalización o trayectoria metabólica y sus efectos biológicos o fisiológicos asociados) . De nuevo, como será claro para la persona experimentada, tal acción como un agonista o un antagonista puede determinarse en cualquier manera adecuada y/o usando cualquier ensayo adecuado (in vitro y usualmente celular o en un ensayo) conocido per se, dependiendo del objetivo o antigeno involucrado. En particular, una acción como un agonista o antagonista puede ser de manera que una actividad biológica o fisiológica pretendida se incrementa o disminuye, respectivamente, por al menos 1%, preferiblemente al menos 5%, tal como al menos 10% o al menos 25%, por ejemplo por al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o 90% o más, comparada con la actividad biológica o fisiológica en el mismo ensayo bajo las mismas' condiciones pero sin la presencia del constructoo de la invención.
La modulación puede por ejemplo también involucrar modulación alostérica del objetivo o antigeno; y/o reducir o inhibir el enlace del objetivo o antigeno a uno de sus sustratos o ligandos y/o que compiten con un ligando, sustrato natural para enlazar al objetivo o antigeno. La modulación también puede involucra activar el objetivo o antigeno o el mecanismo o trayectoria en el cual se involucra. La modulación puede por ejemplo también involucrar efectuar un cambio en relación del plegado o confirmación del objetivo o antigeno, o en relación de la capacidad del objetivo o antigeno para plegarse, cambiarse su confirmación (por ejemplo, durante el enlace de un ligando), asociarse con otras (sub) unidades, o disasociarse .
La modulación puede por ejemplo también involucrar efectuar un cambio en la capacidad del objetivo o antigeno para transportar otros compuestos o para servir como un canal para otros compuestos (tal como iones) .
La modulación puede ser reversible o irreversible, pero para propósitos farmacéuticos y farmacológicos usualmente será en una manera reversible.
En relación a un objetivo o antigeno, el término "sitio de interacción" en el objetivo o antigeno significa un sitio, epitopo, determinante antigénico, parte, dominio o extensión de residuos de aminoácido en el objetivo o antigeno que es un sitio para enlazar a un ligando, receptor u otro compañero de enlace, un sitio catalítico, un sitio de desdoblamiento, un sitio para interacción alostérica, un sitio involucrado en multimerización (tal como homomerización o heterodimerización y es en particular heterodimerización) del objetivo o antígeno; o cualquier otro, epitopo, determinante antigénico, parte, dominio o extensión de residuos de aminoácido en el objetivo o antigeno que se involucra en una acción biológica o mecanismo del objetivo o antigeno. More generalmente, un "sitio de interacción" puede ser cualquier sitio, epitopo, determinante antigénico, parte, dominio o extensión de residuos de aminoácido . en el objetivo o antigeno al cual una secuencia de aminoácidos o polipéptido de la invención puede enlazarse de manera que el objetivo o antígeno (y/o cualquier trayectoria, interacción, señalización, mecanismo biológico o efecto biológico en el cual el objetivo o antigeno se involucra) se modula (como se define en la presente) . s) una secuencia de aminoácidos o polipéptido es para ser "específica para" un primer objetivo o antígeno comparado con un segundo objetivo o antígeno que se enlaza al primer antígeno con una afinidad (como se describe arriba, y expresada adecuadamente como un KD,. valor KA, constante Koff y/o constante Kon) que es al menos 10 veces, tal como al menos 100 veces, y preferiblemente al menos 1000 veces, y hasta 10.000 veces o más mejor que la afinidad con la cual la secuencia de aminoácidos o polipéptido enlaza al segundo objetivo o polipéptido. Por ejemplo, el primer antígeno puede enlazar al objetivo o antígeno con un valor KD que es al menos 10 veces menor, tal como al menos 100 veces menor, y preferiblemente al menos 1000 veces menor, tal como 10.000 veces menor o incluso menos que, que el KD con el cual la secuencia de aminoácidos o polipéptido enlaza al segundo objetivo o polipéptido. Preferiblemente, cuando una secuencia de aminoácidos o polipéptido es "específica para" un primer objetivo o antígeno comparado con un segundo objetivo o antígeno, es dirigida contra (como se define en la presente) el primer objetivo o antígeno, pero no dirigida contra el segundo objetivo o antígeno. t) Los términos "bloqueo cruzado", "bloqueado cruzado" y "que bloquea cruzado" se usan intercambiablemente en la presente para significar la capacidad de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina o polipéptido para interferir con el enlace directamente o indirectamente a través de modulación alostérica de otros dominios variables sencillos de inmunoglobulina o polipéptidos de la invención para un objetivo dado. La extensión a la cual un dominio variable sencillo de inmunoglobulina o polipéptido de la invención es capaz de interferir con el enlace de otro al objetivo, y por lo tanto si puede ser el bloqueo cruzado de acuerdo con la invención, puede determinarse usando ensayos de enlace de competencia. Un ensayo' de bloqueo cruzado cuantitativo adecuado particularmente usa un un enfoque basado en AlphaScreen o un FACS para medir la competencia entre el dominio variable sencillo de inmunoglobulina etiquetado (por ejemplo etiquetado His, biotinilado o etiquetado radioactivo) o polipéptido de acuerdo con la invención y el otro agente de enlace en términos de su enlace al objetivo. La parte experimental generalmente describe ensayos basados en FACS adecuados para determinar si una molécula de enlace se bloquea cruzado o es capaz de bloquear cruzado un dominio variable sencillo de inmunoglobulina o polipéptido de acuerdo con la invención. Se apreciará que el ensayo puede usarse con cualquiera de los dominios variables sencillos de inmunoglobulina u otros agentes de enlace descritos en la presente. De esta manera, en general, una secuencia de aminoácidos de bloque cruzado u otro agente de enlace de acuerdo con la invención es por ejemplo uno que enlazará al objetivo en el ensayo de bloqueao cruzado de arriba de manera que, durante el ensayo y en presencia de una segunda secuencia de aminoácidos u otro agente de enlace de la invención, el desplazamiento registrado del dominio variable sencillo de inmunoglobulina o polipéptido de acuerdo con la invención es hasta 100% (por ejemplo en ensayo de competencia basado en FACS) del desplazamiento teórico máximo (por ejemplo desplazamiento por dominio variable sencillo de inmunoglobulina frió (por ejemplo no etiquetado) o polipéptido que necesita ser de bloqueo cruzado) por el agente de bloqueo cruzado para ser probado potencialmente que se presenta en una cantidad de 0.4 m o menos (el agente de bloqueo cruzado puede ser otro anticuerpo monoclonal convencional tal como IgG, fragmento de anticuerpo monovalente clásicos (Fab, scFv) ) y/o variantes (incluyendo- pero no limitados a diacuerpos, triaccuerpos , minicuerpos, VHHs, dAbs, VHs, VLs de tipo natural o preparados por ingeniería) . En un aspecto preferido, no limitante, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina o polipéptidos de la invención, tienen un desplazamiento registrado (como se describe arriba) que está entre 10% y 100%, más preferiblemente entre 50% hasta 100%. u) Una secuencia de aminoácidos se dice que es "reactiva cruzada" para dos diferentes antígenos o determinantes antigénicos (tal como albúmina de suero de dos diferentes especies de mamífero, tal como albúmina de suero humano y albúmina de suero cyno) si es específico para (como se define en la presente) tantos estos diferentes antígenos como determinantes antigénicos . v) Como se describe además en la presente, el número total de residuos de aminoácido en un Nanocuerpo puede estar en la región de 110-130. Debe sin embargo señalarse que las partes, fragmentos, análogos o derivados (como se describe además en la presente) de un Nanocuerpo no se limitan particularmente en cuanto' a su longitud y/o tamaño, siempre y cuando tales partes, fragmentos, .análogos o derivados cumplan los requisitos adicionales resumidos en la presente y también son preferiblemente adecuados para los propósitos descritos en la presente; w) Como se describe además en el párrafo q) en las páginas 58 y 59 de la WO 08/020079 (incorporada en la presente como referencia) , los residuos de aminoácido de un Nanocuerpo se enumeran de acuerdo con la numeración general para los dominios VH dados por Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publicación No. 91), como se aplica a los dominios VHH de Camélidos en el articulo de Riechmann and Muyldermans, J. Immunol . Methods 23 -de Junio de 2000; 240 (1-2) : 185-195 (ver por ejemplo Figura 2 de esta publicación), y en consecuencia FR1 de un Nanocuerpo comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 1-30, CDR1 de un Nanocuerpo comprende los residuos 'de aminoácido en las posiciones 31-35, FR2 de un Nanocuerpo comprende los aminoácidos en las posiciones 36-49, CDR2 de un Nanocuerpo comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 50-65, FR3 de un Nanocuerpo comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 66-94, CDR3 de un Nanocuerpo comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 95-102, y FR4 de un Nanocuerpo comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 103-113. x) Las Figuras, Listado de Secuencias y la Parte Experimental/Ejemplos sólo se dan para ilustrar además la invención y no deben interpretarse o construirse como que limitan el alcance de la invención y/o de las reivindicaciones anexas de ninguna manera, a menos que se indique explícitamente de otra manera en la presente.
Para una descripción general de anticuerpos de cadena pesada y los dominios variables de los mismos, se hace referencia inter alia a la técnica previa citada en la presente, así como a la técnica previa mencionada en la página 59 de la WO 08/020079 y a la lista de referencias mencionadas en las páginas 41-43 de la solicitud Internacional WO 06/040153, cuya¦ técnica previa y referencia se incorporan en la presente como referencia.
De acuerdo con la- terminología usada en la técnica (ver las referencias de arriba) , los dominios variables presentes en los anticuerpos de cadena pesada que se presentan naturalmente también se referirán como "dominios VHH"/ con objeto de distinguirlos de los dominios variables de cadena pesada que se presentan en anticuerpo de 4 cadenas convencionales (que se referirán de aquí en adelante como "dominios VH") y de los dominios variables de cadena ligera que se presentan en anticuerpos de 4 cadenas convencionales (que se referirán de aquí en adelante como "dominios VL") .
Como se menciona en la técnica previa referida arriba, los dominios VHH tienen un número de propiedades funcionales y características estructurales- únicas que hace los dominios VHH aislados (así como Nanocuerpos basados en ellos, que comparten estas características estructurales y propiedades funcionales con los dominios VHH que se presentan naturalmente) y proteínas que contienen los mismos altamente ventajosas para uso como dominios enlazados a antígeno o proteínas funcionales. En particular, y sin limitarse a esto, los dominios VHH (que han sido "designados" por la naturaleza para enlazar funcionalmente a un antígeno sin la presencia de, y sin ninguna interacción con, un dominio variable de cadena ligera) y los Nanocuerpos pueden funcionar como una unidad, dominio proteína estructural enlazada al antígeno funcional, relativamente pequeña, sencilla. Esto distingue los dominios VHH de los dominios VH y VL de anticuerpos de 4 cadenas convencionales, que por sí mismos generalmente no son adecuados para aplicación práctica como proteínas o dominios enlazados al antígeno sencillos, pero necesitan combinarse de alguna forma u otra para proporcionar una unidad enlazada al antígeno funcional (como en por ejemplo fragmentos anticuerpo convencionales tal como fragmentos Fab; en fragmentos ScFv's, que consiste de un dominio VH ligado covalentemente a un dominio VL) .
Debido a estas propiedades únicas, el uso de dominios VHH e ISV's o Nanocuerpos como proteínas enlazadas al antígeno sencillas o como dominios enlazados a antígeno (esto es como parte de una proteína o polipéptido más grande) ofrecen un número de ventajas importantes sobre el uso de dominios VH y VL convencionales, scFv' s o ' fragmentos de anticuerpo convencionales (tal como fragmentos Fab o F(ab' )2) , incluyendo las ventajas que se enlistan en las páginas 60 y 61 de la WO 08/020079.
En un aspecto específico y preferido, la invención proporciona ISV's o Nanocuerpos contra HER3, y en particular ISV s o Nanocuerpos contra HER3 de un animal de sangre caliente, y más en particular ISV's o Nanocuerpos contra HER3 de un mamífero, y especialmente ISV s o Nanocuerpos contra HER3 humano; así como proteínas y/o polipéptidos que comprenden al menos uno de tal ISV o Nanocuerpo.
En particular, la invención proporciona ISV's o Nanocuerpos contra HER3, y proteínas y/o polipéptidos que comprenden los mismos, que tienen propiedades terapéuticas y/o farmacológicas mejoradas y/u otras propiedades ventajosas (tal como, por ejemplo, facilidad mejorada de preparación y/o costos reducidos de las mercancías), comparados con los anticuerpos convencionales contra HER3 o fragmentos de los mismos, comparados con constructos que pueden basarse en tales anticuerpos convencionales o fragmentos de anticuerpo (tal como fragmentos Fab' , fragmentos F(ab' )2, constructos ScFv, "diacuerpos" y otros constructos multiespeci fieos (ver por ejemplo la revisión por Holliger and Hudson, Nat Biotechnol. Septiembre 2005; 23(9): 1126-36)), y también comparados con los asi llamados "dAb' s" o anticuerpos de dominio similares (sencillos) que pueden derivarse de dominios variables de anticuerpos convencionales. Estas propiedades mejoradas y ventajosas se volverán claras de la descripción adicional en la presente, y por ejemplo incluyen, sin limitación, una o más' de: - afinidad y/o avidez incrementada para HER3, ya sea en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo en un formato bivalente) y/o en un formato multiespecifico (por ejemplo uno de los formatos multiespeci ficos descritos en la presente a continuación) ; mejor idoneidad para formateo en un formado multivalente (por ejemplo en un formato bivalente) ; mejor idoneidad para formateo en un formato multiespecifico (por ejemplo uno de los formatos multiespecificos descritos en la presente a continuación) ; idoneidad mejorada o susceptibilidad para sustituciones "humanizantes" (como se define en la presente); menos inmunogenicidad, ya sea en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo en un formato bivalente) y/o en un formato multiespecífico (por ejemplo uno de los formatos multiespecificos descritos en la presente a continuación) ; estabilidad incrementada, ya sea en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo en un formato bivalente) y/o en un formato multiespecifico (por ejemplo uno de los formatos multiespecificos descritos en la presente a continuación) ; - especificidad incrementada hacia HER3, ya sea en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo en un formato bivalente) y/o en un formato multiespecifico (por ejemplo uno de los formatos multiespecificos descritos en la presente a continuación) ; reactividad cruzada disminuida o donde se desee incrementada con HER3 de diferente especie; y/o una o más de otras propiedades mejoradas deseables para uso farmacéutico (incluyendo uso profiláctico y/o uso terapéutico) y/o para uso de diagnóstico (incluyendo pero no limitado a uso para propósitos de formación de imágenes), ya sea en un formato monovalente, en un . formato multivalente (por ejemplo en un formato bivalente) y/o en un formato multiespecifico (por ejemplo uno de los formatos multiespecífieos descritos en la presente a continuación) .
Como se describe generalmente en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención, los ISV's o Nanocuerpos de la invención están preferiblemente en forma aislada esencialmente (como se define en la presente) , o forman parte de una proteina o polipéptido de la invención (como se define en la presente) , que pueden comprender o consistir esencialmente de one o más ISV's o Nanocuerpos de la invención y que pueden opcionalmente comprender además una o más secuencias de aminoácidos adicionales (todas ligadas opcionalmente por medio de una o más ligaduras adecuadas) . Por ejemplo, y sin limitación, una o más secuencias de aminoácidos de la invención pueden usarse como una unidad de enlace en tal proteina o polipéptido, que puede contener opcionalmente una o más secuencias de aminoácidos adicionales que pueden servir como una unidad de enlace (esto es contra uno o más objetivos diferentes de HER3), a fin de proporcionar un polipéptido monovalente, multivalente o multiespecifico de la 'invención, respectivamente, todo como se describe en la presente. En particular, tal proteina o polipéptido puede comprender o consistir esencialmente de uno o más ISV s o Nanocuerpos de la invención y opcionalmente uno o más de (otros) ISV's o Nanocuerpos (esto es dirigidos contra otros objetivos que HER3), todos ligados opcionalmente por medio de una o más ligaduras adecuadas, a fin de proporcionar un constructo de Nanocuerpo o ISV monovalente, multivalente o multiespecifico, respectivamente, como se describe además en la presente. Tales proteínas o polipéptidos también pueden estar en forma aislada esencialmente (como se define en la presente) .
En un ISV o Nanocuerpo de la invención, el sitio de enlace para enlace contra HER3 preferiblemente se forma por las secuencias CDR. Opcionalmente, un ISV o Nanocuerpo de la invención puede también, y además para al menos un sitio de enlace para enlace contra HER3, contener uno o más sitios de enlace adicionales para enlace contra otros antígenos, proteínas u objetivos. Para los métodos y posiciones para introducir tales segundos sitios de enlace, se hace referencia por ejemplo a Keck and Huston, Biophysical Journal, 71, Octubre 1996, 2002-2011; EP 0 640 130; y WO 06/07260.
Como se describe generalmente en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención, cuando un ISV o Nanocuerpo de la invención (o un polipéptido de la invención que comprende los mismos) se pretende para la administración a un sujeto (por ejemplo para propósitos terapéuticos y/o de diagnóstico como se describe en la presente) , es preferiblemente dirigida contra HER3 humano; mientras que para propósitos veterinarios, es preferiblemente dirigida contra HER3 de la especie a tratarse. También, como con las secuencias de aminoácidos de la invención, un ISV o Nanocuerpo de la invención puede o no puede ser reactivo cruzado (esto es dirigido contra HER3 de dos o más especies de mamífero, tal como contra HER3 humano y HER3 de al menos una de las especies de mamífero mencionadas en la presente) .
También, de nuevo como se describe generalmente en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención, los ISV's o Nanocuerpos de la invención pueden generalmente dirigirse contra cualquier determinante antigénico, epítopo, parte, dominio, subunidad o confirmación (donde sea aplicable) de HER3. Sin embargo, se asume generalmente y prefiere que los ISV s o Nanocuerpos de la invención (y polipéptidos que comprenden los mismos) se dirigen contra el sitio enlazado a Heregulin (o "HRG") y el sitio de interacción de heterodimerización .
Como ya se describe en la presente, la secuencia de aminoácidos y estructura de un ISV o Nanocuerpo puede considerarse - sin embargo sin limitarse a esto - para comprenderse de cuatro regiones de estructura o "FR's" (o algunas veces también se refiere como "F 's"), que se refieren en la técnica y en la presente como "Región de estructura 1" o "FR1" como "Región de estructura 2" o "FR2"; como "Región de estructura 3" o " FR3" ; y como "Región de estructura 4" o "FR4", respectivamente; cuyas regiones de estructura se interrumpen por tres regiones que determinan la complementariedad o "CDR's", que se refieren en la técnica como "Región que determina la complementariedad 1" o "CDR1"; como "Región que determina la complementariedad 2" o "CDR2"; y como "Región que determina la complementariedad 3" o "CDR3", respectivamente. Algunas secuencias de estructura y CDR's preferidas (y combinaciones de las mismas) que se presentan en los ISV's o Nanocuerpos de la invención son como se describe en la presente. Otras secuencias CDR adecuadas pueden obtenerse por los métodos descritos en la presente.
De acuerdo con un. aspecto no limitante pero preferido de la invención, (las secuencias CDR presentes en) los ISV's o Nanocuerpos de la invención son de manera que: - los ISV's o Nanocuerpos pueden enlazar a HER3 con una constante de disociación (KD) de 10"5 hasta 10~12 moles/litro o menos, y preferiblemente 10~7 hasta 10~12 moles/litro o menos y más preferiblemente 1CT8 to 10~12 moles/litro (esto es con una constante de asociación (K¾) de 105 hasta 1012 litro/ moles o más, y preferiblemente 107 hasta 1012 litro/moles o más y más preferiblemente 108 hasta 1012 litro/moles) ; y/o de manera que: - los ISV s o Nanocuerpos pueden enlazar a HER3 con una contante kon de entre 102 M"1 s"1 hasta alrededor de 107 M"1s"1, preferiblemente entre 103 M"1s'1 y 107 M_1s_1, más preferiblemente entre 104 M"1s"1 y 107 M"1s"1, tal como entre 105 M'V1 y 107 M'V1; y/o de manera que: - los ISV s o Nanocuerpos pueden enlazar a HER3 con una constante Qff entre 1 s (ti2= 0.69 s) y 10"& s_i (proporcionando un complejo casi irreversible con un ti2 de múltiploes días), preferiblemente entre 10"2 s"1 y 10-6 s"1, más preferiblemente entre 10"3 s"1 y 10~6 s' 1 , tal como entre 10"4 s" 1 y 10'6 s-1.
Preferiblemente, (las secuencias CDR presentes en) los ISV's o Nanocuerpos de la invención son de manera que: un ISV monovalente o Nanocuerpo de. la invención (o un polipéptido que contiene sólo un ISV o Nanocuerpo de la invención) es preferiblemente de manera que enlazará a HER3 con una afinidad menos de 500 nM, preferiblemente menos de 100 nM, más preferiblemente menos de 10 nM, tal como menos de 5 nM.
La afinidad día ISV o Nanocuerpo de la invención contra HER3 puede determinarse en una manera conocida per se, por ejemplo usando las técnicas generales para medir KD, KA, k0ff o kon mencionados en la presente, asi como algunos de los ensayos específicos descritos en la presente.
Algunos valores IC50 preferidos para enlace de los ISV s o Nanocuerpos de la invención (y de polipéptidos que comprenden los mismos) a HER3 se volverán claros de la descripción adicional y ejemplos en la presente.
En un aspecto preferido pero no limitante, la invención se refiere a un ISV o Nanocuerpo (como se define en la presente) contra HER3, que consiste de 4 regiones de estructura (FR1 hasta FR4 respectivamente) y 3 regiones que determinan la complementariedad (CDRl hasta CDR3 respectivamente), en las cuales: - CDRl se elige del grupo que consiste de: a) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s : 57 hasta 71; b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; c) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; y/o - CDR2 se elige del grupo que consiste de: d) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 hasta 101; e) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s : 87 hasta 101; f) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s : 87 hasta 101; y/o - CDR3 se elige del grupo que consiste de: g) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; h) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; i) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; o cualquier fragmento adecuado de tal secuencia de aminoácidos.
En particular, de acuerdo con este aspecto preferido pero no limitante, la invención se refiere a un ISV o Nanocuerpo (como se define en la presente) contra HER3, que consiste de 4 regiones de estructura (FR1 hasta FR4 respectivamente) y 3 regiones que determinan la complementariedad (CDR1 hasta CDR3 respectivamente), en las cuales: - CDR1 se elige del grupo que consiste de: a) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 hasta 71; b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s : 57 hasta 71; c) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s : 57 hasta 71; y - CDR2 se elige de'l grupo que consiste de: d) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s : 87 hasta 101; e) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s : 87 hasta 101; f) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s : 87 hasta 101; y - CDR3 se elige del grupo que consiste de: g) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; h) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 hasta 131; i) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s : 117 hasta 131; o cualquier fragmento adecuado de tal secuencias de aminoácidos.
Como se menciona generalmente en la presente para las secuencias de aminoácidos, de la invención, cuando un ISV o Nanocuerpo de la invención contiene una o más seuencias CDR1 de acuerdo con b) y/o c) : i) cualquier sustitución de aminoácidos en tal CDR de acuerdo con b) y/o c) es preferiblemente, y comparada con la CDR correspondiente de acuerdo con a) , una sustitución de aminoácido conservada (como se define en la presente); y/o ii) la CDR de acuerdo con b) y/o c) preferiblemente sólo contiene sustituciones de aminoácido, y no eliminaciones o inserciones de aminoácido, comparada con la CDR correspondiente de acuerdo con a) ; y/o iii) la CDR de acuerdo con b) y/o c) puede ser una CDR que se deriva de una CDR de acuerdo con a) por medio de maduración de afinidad usando una o más técnicas de maduración de afinidad conocidas per se.
Similarmente, cuando un ISV o Nanocuerpo de la invención contiene una o más secuencias CDR2 de acuerdo con e) y/o f): i) cualquier sustitución de aminoácidos en tal CDR de acuerdo con e) y/o f) es preferiblemente, y comparada con la CDR correspondiente de acuerdo con d) , una sustitución de aminoácido conservada (como se define en la presente) ; y/o ii) la CDR de acuerdo con e) y/o f) preferiblemente sólo contiene sustituciones de aminoácido, y no eliminaciones o inserciones de aminoácido, comparada con la CDR correspondiente de acuerdo con d) ; y/o iii) la CDR de acuerdo con e) y/o f) puede ser una CDR que se deriva de una ' CDR de acuerdo con d) por medio de maduración de afinidad usando una o más técnicas de maduración de afinidad conocidas per se.
También, similarmente , cuando un ISV o Nanocuerpo de la invención contiene una o más secuencias CDR3 de acuerdo con h) y/o i) : i) cualquier sustitución de aminoácidos en tal CDR de acuerdo con h) y/o i) es preferiblemente, y comparada con la CDR correspondiente de acuerdo con g) , una sustitución de aminoácido conservada (como se define en la presente); y/o ii) la CDR de acuerdo con h) y/o i) preferiblemente sólo contiene sustituciones de aminoácido, y no eliminaciones o inserciones de aminoácido, comparada con la CDR correspondiente de acuerdo con g) ; y/o iii) la CDR de acuerdo con h) y/o i) puede ser una CDR que se deriva de una CDR de acuerdo con g) por medio de maduración de afinidad usando una o más técnicas de maduración de afinidad conocidas per se.
Debe entenderse que los . últimos tres párrafos generalmente aplican para- cualquier ISV o Nanocuerpo de la invención que comprend una o más seuencias CDR1, secuencias CDR2 y/o secuencias CDR3 de acuerdo con b) , c), e), f) , h) o i), respectivamente.
De los ISV's o Nanocuerpos de la invención, ISV s o Nanocuerpos que comprenden una o más de las CDR' s explícitamente enlistados arriba se prefieren particularmente; ISV's o Nanocuerpos que comprenden dos o más de las CDR' s explícitamente enlistados arriba son más preferidos particularmente; y ISV's o Nanocuerpos que comprenden tres de las CDR' s explícitamente enlistados arriba son més preferidos particularmente.
Algunas combinaciones preferidas particularmente, pero no limitantes de secuencias CDR, así como las combinaciones preferidas de secuencias CDR y secuencias de estructura, se mencionan en la Tabla B-l a continuación, que enlista las secuencias CDR y secuencias de estructura que se presentan en un número de ISV's o Nanocuerpos preferidos (pero no limitantes) de la invención. Como será claro para la persona experimentada, una combinación de CDR1, CDR2 y secuencias CDR3 que ocurren en el mismo clon (esto es secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 que se mencionan en la misma linea en la Tabla B-1) usualmente se preferirán (aunque la invención en su sentido más amplio no se limita a esto, y también comprenden otras combinaciones adecuadas de las secuencias CDR mencionadas en la Tabla B-l) . También, una combinación de secuencias CDR y secuencias de estructura que ocurren en el mismo clon (esto es secuencias CDR y secuencias de estructura que se mencionan en la misma linea en la Tabla B-l) usualmente se preferirán (aunque la invención en su sentido más amplio no se limita a esto, y también comprenden otras combinaciones adecuadas de las secuencias CDR y secuencias de estructura mencionadas en la Tabla B-l, asi como combinaciones de tales secuencias CDR y otras secuencia de estructura adecuadas, por ejemplo como se describe además en la presente) .
También, en los ISV s o Nanocuerpos de la invención que comprenden las combinaciones de CDR' s mencionadas en la Tabla B-l, cada CDR puede reemplazarse por una CDR elegida del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente al menos 99% identidad de secuencia (como se define en la presente) con las CDR' s mencionadas; en las cuales: i) cualquier sustitución de aminoácidos en tal CDR. es preferiblemente, y 'comparada con la secuencia CDR correspondiente mencionada en la Tabla B-1, una sustitución de aminoácido conservada (como se define en la presente) ; y/o ii) cualquiera de tal secuencia CDR preferiblemente sólo contiene sustituciones de aminoácido, y no eliminaciones o inserciones de aminoácido, comparada con la secuencia CDR correspondiente mencionada en la Tabla B-1; y/o iü) cualquiera de tal secuencia CDR es una CDR que se deriva por medio de una técnica para maduración de afinidad conocida per se, y en particular iniciando de la secuencia CDR correspondiente mencionada en la Tabla B-1.
Sin embargo, como será claro para la persona experimentada, las (combinaciones de) secuencias CDR, asi como (las combinaciones de) secuencias CDR y secuencias de estructura mencionadas en la Tabla B-1 generalmente se preferirán.
Tabla B-l: Combinaciones preferidas de secuencias CDR, combinaciones preferidas de secuencias de estructura, y combinaciones preferidas de estructura y secuencias CDR.
("ID" se refiere a la SEQ ID NO como se usa en la presente) De esta manera, en los Nanocuerpos de la invención, al menos una de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 presentes es adecuadamente seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, en listadas en la Tabla B-l; o del grupo de secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente al menos 99% "identidad de secuencia" (como se define en la presente) con al menos una de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-1 ; y/o del grupo que consiste de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen 3, 2 o sólo 1 "diferencia (s) de aminoácidos" (como se define en la presente) con al menos una de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-l.
En este contexto, por "adecuadamente seleccionada" se refiere a que, como sea aplicable, una secuencia CDR1 se elige de secuencias adecuadas CDR1 (esto es como se define en la presente) , una secuencia CDR2 se elige de secuencias CDR2 adecuadas (esto es como, se define en la presente), y una secuencia CDR3 se elige de secuencia CDR3 adecuada (esto es como se define en la presente), respectivamente. Más en particular, las secuencias CDR son preferiblemente seleccionadas de manera que los Nanocuerpos de la invención enlazan a HER3 con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (actual o aparente) , un valor Kft (actual o aparente), una constante kon y/o constante k0ff/ o alternativamente como un valor IC50 como se describe además en la presente) que es como se define en la presente.
En particular, en los Nanocuerpos de la invención, al menos la secuencia CDR3 presente es adecuadamente seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR3 enlistadas en la Tabla B-l o del grupo de secuencias CDR3 que tienen al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias CDR3 enlistadas en la Tabla B-l; y/o del grupo que consiste de las secuencias CDR3 que tienen 3, 2 o sólo 1 diferencias de aminoácidos con al menos una de las secuencias CDR3 enlistadas en la Tabla B-l.
Preferiblemente, en los Nanocuerpos de la invención, al menos dos secuencias de ' CDR1, CDR2 y CDR3 presentes son adecuadamente seleccionadas del grupo que consiste de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas eb la Tabla B-l o del grupo que consiste de secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-l; y/o del grupo que consiste de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen 3, 2 o sólo 1 "diferencia (s) de aminoácidos" con al menos una de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-l.
En particular, en los Nanocuerpos de la invención, al menos la secuencia CDR3 presente es adecuadamente seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR3 enlistadas en la Tabla B-l o del grupo de secuencias CDR3 que tienen al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias CDR3 enlistadas en la Tabla B-l, respectivamente; y al menos una de las secuencias CDR1 y CDR2 presente es adecuadamente seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR1 y CDR2, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-l o del. grupo de secuencias CDR1 y CDR2, respectivamente, que tienen al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias CDR1 y CDR2, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-l; y/o del grupo que consiste de las secuencias CDR1 y CDR2, respectivamente, que tienen 3, 2 o sólo 1 diferencias de. aminoácidos con al menos una de las secuencias CDR1 y CDR2, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-l.
Más preferiblemente,- en los Nanocuerpos de la invención, todas las tres secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 presentes son adecuadamente seleccionadas del grupo que consiste de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-l o del grupo que consiste de secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-l; y/o del grupo que consiste de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen 3, 2 o sólo 1 diferencias de aminoácidos con al menos una de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-l.
Aún más preferiblemente, en los Nanocuerpos de la invención, al menos una de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 presentes es adecuadamente seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-l. Preferiblemente, en este aspecto, al menos una o preferiblemente ambas de las otras dos secuencias CDR presentes son adecuadamente seleccionadas de secuencias CDR que tienen al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias CDR correspondientes, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-1; y/o del grupo que- consiste de las secuencias CDR que tienen 3, 2 o sólo 1 diferencias de aminoácidos con al menos una de las secuencias correspondientes, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-l.
En particular, en los Nanocuerpos de la invención, al menos la secuencia CDR3 presente es adecuadamente seleccionada del grupo que consiste de las CDR3 enlistadas en la Tabla B-l. Preferiblemente, en este aspecto, al menos una y preferiblemente ambas de las secuencias CDR1 y CDR2 presentes son adecuadamente seleccionadas de los grupos de secuencias CDR1 y CDR2, respectivamente, que tienen al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia con las secuencias CDR1 y CDR2, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-l; y/o del grupo que consiste de las secuencias CDR1 y CDR2, respectivamente, que tienen 3, 2 o sólo 1 diferencias de aminoácidos con al menos una de las secuencias CDR1 y CDR2, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-l.
Aún más preferiblemente, en los Nanocuerpos de la invención, al menos dos de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 son adecuadamente seleccionadas del grupo que consiste de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-l. Preferiblemente, en este aspecto, la secuencia CDR presente restante es adecuadamente seleccionada del grupo de secuencias CDR que tienen al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente al menos .99% de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias CDR correspondientes enlistadas en la Tabla B-l; y/o del grupo que consiste de secuencias CDR que tienen 3, 2 o sólo 1 diferencias de aminoácidos con al menos una de las secuencias correspondientes enlistadas en la Tabla B-l.
En particular, en los Nanocuerpos de la invención, al menos la secuencia CDR3 es adecuadamente seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR3 enlistadas en la Tabla B-l, y ya sea la' secuencia CDR1 o la secuencia CDR2 es adecuadamente seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDRl y CDR2, respectivamente, enlistada en la Tabla B-l. Preferiblemente, en este aspecto, la secuencia CDR restante es adecuadamente seleccionada del grupo de secuencias CDR que tienen al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias CDR correspondientes enlistadas en la Tabla B-l; y/o del grupo que consiste de secuencias CDR que tienen 3, 2 o sólo 1 diferencias de aminoácidos con las secuencias CDR correspondientes enlistadas en la Tabla B-1.
Aún más preferiblemente, en los Nanocuerpos de la invención, todas las tres secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 presentes son adecuadamente seleccionadas del grupo que consiste de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-l.
También, generalmente, se prefieren las combinaciones de las CDR' s enlistadas en la Tabla B-l (esto es aquellas mencionadas en la misma linea de la Tabla B-l) . De esta manera, se prefiere generalmente que, cuando una CDR en un Nanocuerpo de la invención es. una secuencia CDR mencionada en la Tabla B-l o es adecuadamente seleccionada del grupo de secuencias CDR que tienen al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia con una secuencia CDR enlistada en la Tabla B-l; y/o del grupo que consiste de secuencias CDR que tienen 3, 2 o sólo 1 diferencias de aminoácidos con una secuencia CDR enlistada en la Tabla B-l, que al menos una y preferiblemente ambas de las otras CDR' s son adecuadamente seleccionadas de las secuencias CDR que pertenecen a la misma combinación en la Tabla B-l (esto es menciona en la misma . linea en la Tabla B- 1) o son adecuadamente seleccionadas del grupo de secuencias CDR que tienen al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia (s) CDR que pertenecen a la misma combinación y/o del grupo que consiste de secuencias CDR que tienen 3, 2 o sólo 1 diferencias de aminoácidos con la secuencia (s) CDR que pertenecen a la misma combinación. También las otras preferencias indicadas en los párrafos de arriba aplican a las combinaciones de CDR' s mencionadas en la Tabla B-l.
De esta manera, por medio de ejemplos no limitantes, un Nanocuerpo de la invención puede por ejemplo comprender una secuencia CDR1 que tiene más de 80 % de identidad de secuencia con una de las secuencias CDR1 mencionadas en la Tabla B-l, una secuencia CDR2 que tiene 3, 2 o 1 diferencia de aminoácidos con una de las secuencias CDR2 mencionadas en la Tabla B-l (pero perteneciendo a una combinación diferente), y una secuencia CDR3.
Algunos Nanocuerpos preferidos de la invención pueden por ejemplo comprender: (1) una secuencia CDR1 que tiene más de 80 % de identidad de secuencia con una de las secuencias CDR1 mencionadas en la Tabla B-l; una secuencia CDR2 que tiene 3, 2 o 1 diferencia de aminoácidos con una de las secuencias CDR2 mencionadas en la Tabla B-l (pero que pertenece a una combinación diferente) ; y una secuencia CDR3 que tiene más de 80 % de identidad de secuencia con una de las secuencias CDR3 mencionadas en la Tabla B-l (pero que pertenece a una combinación diferente); o (2) una secuencia CDR1 que tiene más de 80 % de identidad de secuencia con una de las secuencias CDR1 mencionadas en la Tabla B-l; una secuencia CDR2, y una de las secuencias CDR3 enlistadas en la Tabla B-l; o (3) una secuencia CDRl; una secuencia CDR2 que tiene más de 80% de identidad de secuencia con una de las secuencias CDR2 enlistadas en la Tabla B-l; y una secuencia CDR3 que tiene 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos de la secuencia CDR3 mencionada en la Tabla B-l que pertenece a la misma combinación como la secuencia CDR2.
Algunos Nanocuerpos particularmente preferidos de la invención pueden por ejemplo comprender: (1) una secuencia CDRl que tiene más de 80 % de identidad de secuencia con una de las secuencias CDRl mencionadas en la Tabla B-l; una secuencia CDR2 que tiene 3, 2 o 1 diferencia de aminoácidos con la secuencia CDR2 mencionada en la Tabla B-l que pertenece a la misma combinación; y una secuencia CDR3 que tiene más de 80 % de identidad de secuencia con la secuencia CDR3 mencionada en la Tabla B-l que pertenece a la misma combinación; (2) una secuencia CDR1; una CDR2 enlistada en la Tabla B-l y una secuencia CDR3 enlistada en la Tabla B-l (en la que la secuencia CDR2 y la secuencia CDR3 pueden pertenecer a diferentes combinaciones) .
Incluso algunos Nanocuerpos más preferidos de la invención pueden por ejemplo comprender: (1) una secuencia CDRl que tiene más de 80 % de identidad de secuencia con una de las secuencias CDRl mencionadas en la Tabla B-l; la secuencia CDR2 enlistada en la Tabla B-l que pertenece a la misma combinación; y una secuencia CDR3 mencionada en la Tabla B-l que pertenece a una combinación diferente; o (2) una secuencia CDRl mencionada en la. Tabla B-l; una secuencia CDR2 que tiene 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos con la secuencia CDR2 mencionada, en la Tabla B-l que pertenece a la misma combinación; y una secuencia CDR3 que tiene más de 80% de identidad de secuencia con la secuencia CDR3 enlistada en la Tabla B-l que pertenece a la misma o una combinación diferente.
Los Nanocuerpos particularmente preferidos de la invención pueden por ejemplo comprender una secuencia CDRl mencionada en la Tabla B-l, una secuencia CDR2 que tiene más de 80 % de identidad de secuencia con la secuencia CDR2 mencionada en la Tabla B-l que pertenece a la misma combinación; y la secuencia CDR3 mencionada en la Tabla B-l que pertenece a la misma combinación.
En los Nanocuerpos más preferidos de la invención, las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 presentes son adecuadamente seleccionadas de una de las combinaciones de secuencias CD 1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla B-l.
De acuerdo con otro aspecto preferido, pero no limitante de la invención (a) CDR1 tiene una duración de entre 1 y 12 residuos de aminoácido, y usualmente entre 2 y 9 residuos de aminoácido, tal como 5, 6 o 7 residuos de aminoácido; y/o (b) CDR2 tiene una longitud de entre 13 y 24 residuos de aminoácido, y usualmente entre 15 y 21 residuos de aminoácido, tal como 16 y 17 residuos de aminoácido; y/o (c) CDR3 tiene una longitud de entre 2 y 35 residuos de aminoácido, y usualmente entre 3 y 30 residuos de aminoácido, tal como entre 6 y 23 residuos de aminoácido.
En otro aspecto preferido, pero no limitado, la invención se refiere a un Nanocuerpo en el que las secuencias CDR (como se define en la presente) tienen más de 80%, preferiblemente más de 90%, más preferiblemente más de 95%, tal como 99% o más identidad de secuencia (como se define en la presente) con las secuencias CDR de al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s : 12 hasta 26 (ver Tabla A-l) .
Generalmente, los Nanocuerpos con las secuencias CDR de arriba pueden ser como se describe además en la presente, y preferiblemente tienen secuencias de estructura que son también como se describe además en la presente.
Por ejemplo, como ya se mencionó, las secuencias de estructura presentes en los Nanocuerpos puede ser como generalmente se describe en las páginas 258 a 297 de WO 09/068627 (incorporada en la presente como referencia). Por ejemplo, pueden contener una o más de las combinaciones de residuos estereotípicos establecidos en la Tabla A-5 de WO 09/068627; y FR1, FR2 , FR3 y FR4 pueden contener los residuos de aminoácido establecidos en la Tabla A-6, Tabla A-7, Tabla A-8 y Tabla A-9 de WO 09/068627, respectivamente. También, cuando los ISV's de la invención son nanocuerpos, pueden pertenecer al grupo KERE (ver páginas 281 a 284 de WO 09/068627, con algunas secuencias representativas FR1, FR2 , FR3 y FR4 para este grupo dado en las Tablas A-l l/A-15, A-12, A-13 y A-14 de WO 09/068627); al grupo GLEW (ver páginas 285 hasta 287 de WO 09/068627, con algunas secuencias representativas FR1 , FR2, FR3 y FR4 para este grupo dado en las Tablas A-16/A-20, A-17, A-18 y A-19 de WO 09/068627); al grupo P,R,S 103 (ver páginas 287 a 291 de WO 09/068627, con algunas secuencias representativas FRl, FR2, FR3 y FR4 para este grupo dado en las Tablas A-21/A-25, A-22, A-23 y A-24 de WO 09/068627), que son todas como se describe en WO 09/068627, con algunas secuencias representativas para cada uno de estos grupos dados en la Tabla A-10 de WO 09/068627. Como también se describe en WO 09/068627, estas secuencias de estructura pueden contener una o más sustituciones adecuadas humanizantes o (otras) sustituciones para optimizar la secuencia (ver también la descripción adicional en la presente) .
De nuevo, algunas secuencias particularmente preferidas pero no limitantes FR1, FR2, FR3 y FR4 (y combinaciones de las mismas) son ' aquellas descritas en la Tabla B-l, o variantes adecuadas de secuencias FR1, FR2 , FR3 y FR , respectivamente (por ejemplo, con menos de 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5 diferencias de aminoácido adecuadas en tal FR1, FR2 , FR3 o FR4 comparada a una secuencia de estructura mencionada en la Tabla B-l, en la que las diferencias de aminoácido pueden ser como se describe en WO 09/068627) que aún retienen esencialmente las propiedades deseadas de los Nanocuerpos.
De esta manera, por ejemplo y como se menciona en la presente, tales Nanocuerpos puede ser de aparición natural Nanocuerpos (de cualquier especie adecuada), secuencias VHH de aparición natural (esto es de una especie adecuada de Camélidos) o secuencias sintéticas o semi-sintéticas de aminoácidos o Nanocuerpos, incluyendo pero no limitado a Nanocuerpos o secuencias VHH parcialmente humanizadas, Nanocuerpos o secuencias VHH completamente humanizadas, secuencias de dominio variable de cadena pesada camelizadas, asi como Nanocuerpos que se han obtenido por medio de técnicas mencionadas en la presente.
De esta manera, en un aspecto especifico, pero no limitante , la invención se · refiere a un Nanocuerpo humanizado, que consiste de 4 regiones de estructura (FR1 a FR4 respectivamente) · y 3 regiones que determinan la complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente) , en el que CDRl a CDR3 son como se define en la presente y en el que dicho Nanocuerpo humanizado comprende al menos una sustitución de humanización (como se define en la presente), y en particular al menos una sustitución de humanización en al menos una de sus secuencias de estructura (como se define en la presente) . También, . además de las sustituciones humanizantes como se describe en la presente, los ISV's y en particular Nanocuerpos de la invención puede contener una o más sustituciones otras/adicionales. De nuevo, algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de sustituciones otras/adicionales se volverán claros de la descripción adicional en la presente, y por ejemplo pueden incluir (y preferiblemente esenciálmente consistir de) una o más de las siguientes sustituciones: (a) una o más sustituciones conservadoras de aminoácido; y/o (b) una o más sustituciones en las que los residuos de aminoácidos "camélido"' en una cierta posición es remplazada por un residuo de aminoácido "camélido" diferente que ocurre en dicha posición, para la que se hace referencia por ejemplo a las Tablas A- 6 a A-9 de PCT/EP2008/066365 (publicado el 4 de Junio, 2009 como O 09/068627), que menciona los varios residuos Camélido que ocurren como cada posición de aminoácido en las VHH de' tipo natural. Tales sustituciones pueden incluso comprender sustituciones adecuadas de un residuo aminoácido que ocurre en una posición Hallmark con otro residuo de aminoácido que ocurre en una posición Hallmark en una VHH de tipo salvaje (para la que se hace referencia por ejemplo a las Tablas A- 6 a A-9 de PCT/EP2008/066365) ; y/o (c) una o más sustituciones . que mejoran las (otras) propiedades de la proteina, tal como sustituciones que mejoran la estabilidad a largo plazo y/o propiedades bajo almacenamiento de. proteina. Estas pueden por ejemplo y sin limitación ser sustituciones que prevengan o reduzcan los casos de oxidación (por ejemplo, de residuos de metionina) ; que prevengan o reduzcan la formación de piroglutamato; y/o que prevengan o reduzcan · la isomerización o deaminación de ácidos aspárticos o asparaginas (por ejemplo, de restos DG, DS, NG o NS) . Para tales sustituciones, se hace referencia por ejemplo a la solicitud internacional WO 09/095235, que está generalmente dirigida a los métodos para estabilizar los dominios de variable de inmunoglobulina sencilla por medio de tales sustituciones, y también da ejemplo especifico de sustituciones adecuadas (ver por ejemplo páginas 4 y 5 y páginas 10 a 15) . Un ejemplo de tal sustitución puede ser remplazar un resto NS en las posiciones 82a y 82b con un resto NN .
En otro aspecto preferido, pero no limitante, la invención se refiere a un Nanocuerpo en el que las secuencias CDR tienen al menos 70% de identidad de aminoácido, preferiblemente al menos 80% de identidad de aminoácido, más preferiblemente al menos 90% de identidad de aminoácido, tal como 95% de identidad de aminoácido o más o aún esencialmente 100% de identidad de aminoácido con las secuencias CDR de al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 12 hasta 26 (ver Tabla A-l). Este grado de identidad de aminoácido puede por ejemplo determinarse al determinar el grado de identidad de aminoácido (en una manera descrita en la presente) entre dicho Nanocuerpo y una o más de las secuencias de SEQ ID NO's.: 12 hasta 26 (ver Tabla A-l), en la que los residuos de aminoácido que forman las regiones de estructura se ignoran. Tales Nanocuerpos pueden ser como se describe además en la presente.
En otro aspecto preferido, pero no limitante, la invención se refiere a un Nanocuerpo con una. secuencia de aminoácidos que se elige del grupo que consiste de SEQ ID NO' s : 12 hasta 26 (ver Tabla A-l) o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen más de 80%, preferiblemente más de 90%, más preferiblemente más de 95%, tal como 99% o más identidad de secuencia (como se define en la presente) con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 12 hasta 26 (ver Tabla A-l).
Otro aspecto preferido, pero no limitado de la invención se refiere a variantes humanizadas de los Nanocuerpos de SEQ ID NO's: 12 hasta 26 (ver Tabla A-l), ' que comprenden, comparado a la secuencia VHH nativa correspondiente, al menos una sustitución de humanización (como se define en la presente), y en particular al menos una sustitución de humanización en al menos una de sus secuencias de estructura (como se define en la presente) .
Los polipéptidos de la invención comprenden o consisten esencialmente de al menos un Nanocuerpo de la invención. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de polipéptidos de la invención se dan en SEQ ID NO's: 147 a 327, más preferiblemente HER3MS00135 (SEQ ID NO:282), HER3MS00212 (SEQ ID NO:319) o HER3MS00215 (SEQ ID NO:322) (ver Tabla A-2). Debe de observarse que algunas de las secuencias enlistadas en la' Tabla a continuación (SEQ ID NO's: 224-231, 241-281, 318 y SEQ ID NO's: 323-327) contiene una etiqueta término C (por ejemplo una etiqueta His de 6H) . En práctica, estos polipéptidos también pueden usarse (y se usan por ejemplo para procesos terapéuticos preferiblemente) sin la etiqueta (término C) , y la etiqueta (término C) también debe ignorarse para los propósitos de determinación del grado de identidad de secuencia a cada una de estas secuencias .
Tabla A-2: Secuencias de polipéptido o compuesto preferidas (también referidas en la presente como una secuencia con un nombre particular o SEQ ID NO: X, en donde X es un número que se refiere a la secuencia relevante de aminoácidos) : Será claro para la persona experta que los Nanocuerpos que se mencionan en este documento como "preferidos" (o "más preferidos", "aún más preferidos", etcétera) también son más preferidos (o más preferidos, o aún más preferidos, etcétera) para el uso en los polipéptidos descritos en este documento.
De esta manera, los polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente de uno o más anocuerpos "preferidos" de la invención se preferirán en general, y los polipéptidos que comprenden o que consisten esencialmente de uno o más Ñanocuerpos "más preferido" de la invención serán más preferidos en general, etcétera.
En general, las proteínas o polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente de un Nanocuerpo individual (tal como un Nanocuerpo individual de la invención) se referirán en este documento como proteínas o polipéptidos "monovalentes" o como ' "constructos monovalentes". Las proteínas y polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente de dos o más Ñanocuerpos (tales como por lo menos dos Ñanocuerpos de la invención o por lo menos un Nanocuerpo de la invención y por lo menos otro Nanocuerpo) se referirán en este documento como proteínas o polipéptidos "multivalente" o como "constructos multivalentes" , y estos pueden proporcionar ciertas ventajas comparadas con los Ñanocuerpos monovalentes correspondientes de la invención. Algunos ejemplos no limitantes de tales constructos multivalentes serán claros a partir de la descripción adicional en este documento.
De acuerdo con un -aspecto específico, pero no limitante, un polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de por lo menos dos Nanocuerpos de la invención, tales como dos- o tres Nanocuerpos de la invención. Como se describe adicionalmente en este documento, tales constructos multivaléntes pueden proporcionar ciertas ventajas comparadas con una proteina o polipéptido que comprende o consisten esencialmente de un Nanocuerpo individual de la invención, tal como una avidez muy mejorada para HER3. Tales constructos multivaléntes serán claros para la persona experta con base en la descripción en este documento; algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de tales constructos de Nanocuerpo multivalente son los constructos de SEQ ID NO 1 s : 147 a 327, de manera más preferente HER3 S00135 (SEQ ID NO:282), HER3MS00212 (SEQ ID NO:319) o HER3MS00215 (SEQ ID NO:322) . De acuerdo con otro aspecto especifico, pero no limitante, un polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de por lo menos un Nanocuerpo de la invención y por lo menos otra unidad de enlace (es decir dirigida contra otro epitopo, antigeno, objetivo, proteina o polipéptido), que es de manera preferente también un Nanocuerpo. Tales proteínas o polipéptidos también son referidos en este documento como proteínas o polipéptidos "multiespecí fieos" o como "constructos multiespecíficos", y estos pueden proporcionar ciertas ventajas comparados con los Nanocuerpos monovalentes correspondientes de la invención (como será claro a partir del planteamiento adicional en este documento de algunos constructos multiespecificos preferidos, pero, no limitantes). Tales constructos multiespecificos serán claros para la persona experta con base en la descripción en este documento; algunos ejemplos preferidos, pero limitantes de tales constructos de Nanocuerpo multiespecifico son los constructos de SEQ ID NO's: 147 a 327, de manera más preferente HER3MS00135 (SEQ ID NO:282), HER3MS00212 (SEQ ID NO:319) o HER3MS00215 (SEQ ID NO:322).
De acuerdo con todavía otro aspecto específico, pero no limitante, un polipéptido de la' invención comprende o consiste esencialmente de por lo menos un Nanocuerpo de la invención, opcionalmente uno o más Nanocuerpos adicionales, y por lo menos otra secuencia de aminoácidos (tal como una proteína o polipéptido) que confiere por lo menos una propiedad deseada al Nanocuerpo de la invención y/o a la proteína de fusión resultante. Nuevamente, tales proteínas de fusión pueden proporcionar ciertas ventajas comparados con los Nanocuerpos monovalentes correspondientes de la invención. Algunos ejemplos no limitantes de tales secuencias de aminoácidos y tales constructos de fusión serán claros a partir de la descripción adicional en este documento.
También es posible combinar dos o más de los aspectos anteriores, por ejemplo para proporcionar un constructo biespecífico trivalente que comprende dos Nanocuerpos de la invención y otro Nanocuerpo, y opcionalmente una o más de otra secuencia de aminoácidos. Ejemplos no limitantes adicionales de tales constructos, asi como también algunos constructos que se prefieren particularmente dentro del contexto de la presente invención, serán claros a partir de la descripción adicional en este documento.
En los constructos anteriores, el uno o más Nanocuerpos y/u otras secuencias de aminoácidos se pueden enlazar directamente entre si y/o enlazar adecuadamente entre si a través de una o más secuencias enlazadoras. Algunos ejemplos adecuados pero no limitantes de tales enlazadores serán claros a partir de la descripción adicional en este documento .
En un aspecto especifico de la invención, un Nanocuerpo de la invención o un compuesto, constructo o polipéptido de la invención que comprende por lo menos un Nanocuerpo de la invención puede tener una vida media incrementada, comparada con la secuencia de aminoácido correspondiente de la invención. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de tales Nanocuerpos, compuestos y polipéptidos serán claros para la persona experta con base en la descripción adicional en este documento, . y por ejemplo comprenden secuencias de Nanocuerpos o polipéptidos de la invención que se han modificado químicamente para incrementar la vida media de los mismos (por ejemplo, por medio de pegilación) ; secuencias de aminoácido de la invención que comprenden por lo menos un sitio de enlace adicional para enlazarse a una proteína en suero (tal como albúmina de suero, véase por ejemplo el documento EP 0 368 684 Bl, página 4); o polipéptidos de la invención que comprenden por lo menos un Nanocuerpo de la invención que se enlaza a por lo menos una porción (y en particular por lo menos una secuencia de aminoácidos) que incrementa la vida media de Nanocuerpo de la invención. Los ejemplos de polipéptidos de la invención que comprenden tales porciones extendedoras de vida media o secuencias de aminoácidos serán claros para la persona experta con base en la descripción adicional en este documento; y por ejemplo incluyen, sin limitación,' polipéptidos en los cuales el uno o más Nanocuerpo de la invención se enlazan adecuadamente a una o más proteínas en suero o fragmentos de las mismas (tal como albúmina de suero o fragmentos adecuados de la misma) o a una o más unidades de enlace que se pueden enlazar a las proteínas en suero (tales como, por ejemplo, Nanocuerpos o anticuerpos de dominio (individual) que se pueden enlazar a las proteínas en suero tal como albúmina de suero, inmunoglobulinas en suero tales como IgG, o transferrina) ; polipéptidos en los cuales un Nanocuerpo de la invención se enlaza a una porción Fe tal como, una Fe humana) o una parte adecuada o fragmento de la misma; o polipéptidos en los cuales el uno o más Nanocuerpo de la invención se enlazan adecuadamente a una o más proteínas o péptidos pequeños que se pueden enlazar a las proteínas en suero.
Nuevamente, como será claro para la persona experta, tales Nanocuerpos, compuestos, constructos o polipéptidos pueden contener uno o más grupos adicionales, residuos, porciones o unidades de enlace, tales como una o más secuencias de aminoácidos adicionales y en particular uno o más Nanocuerpos adicionales (es decir no dirigidos contra HER3 ) , para proporcionar un constructo de Nanocuerpo tri- o multiespecífico .
En general, los Nanocuerpos de la invención (o compuestos, constructos .o polipéptidos que comprenden los mismos) con vida media incrementada tienen de manera preferente una vida media que es por lo menos 1.5 veces, de manera preferente por lo menos 2 veces, tal como por lo menos 5 veces, por ejemplo por lo menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la vida, media de la secuencia de aminoácidos correspondiente de la invención en sí. Por ejemplo, los Nanocuerpos, compuestos, constructos o polipéptidos de la invención con vida media incrementada pueden tener una vida media que se incrementa con más de 1 hora, de manera preferente más de 2 horas, de manera más preferente más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o aún más de 24, 48 o 72 horas, comparado con la secuencia de aminoácido correspondiente de la invención en si.
En un aspecto preferido, pero no limitante de la invención, tales Nanocuerpos, compuesto, constructos o polipéptidos de la invención muestran una vida media en suero en humanos de por lo menos ' aproximadamente 12 horas, de manera preferente por lo menos 24 horas, de manera más preferente por lo menos 48 horas, de manera aún más preferente por lo menos 72 horas o más. Por ejemplo, los compuestos o polipéptidos de la invención puede tener una vida media de por lo menos 5 días (tal como aproximadamente 5 a 10 días), de manera preferente por lo menos 9 días (tal como aproximadamente 9 a 14 días), de manera más preferente por lo menos aproximadamente 10 dias (tal como aproximadamente 10 a 15 días), o por lo menos aproximadamente 11 dias (tal como aproximadamente 11 a 16 dias), de manera más preferente por lo menos aproximadamente 12 dias (tal como aproximadamente 12 a 18 dias o más) , o más de 14 dias (tal como aproximadamente 14 a 19 dias). Tales constructos de vida media prolongada serán claros para la persona experta con base en la descripción en este documento; algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de tales constructos de Nanocuerpo multiespecifico son los constructos de SEQ ID NO's: 147 a 327, de manera más preferente HER3 S00135 (SEQ ID NO:282), HER3MS00212 ('SEQ ID NO:319) o HER3MS00215 (SEQ ID NO: 322) .
En particular, los polipéptidos que comprenden uno o más Nanocuerpos de la invención son de manera preferente tal que: se enlazan a HER3 con una constante de disociación (KD) de 10~5 a 10~12 moles/litro o menos, y de manera preferente de 1CT7 a 10"12 moles/litro o menos y de manera más preferente de 10"8 a 10~12 moles/litro ( es decir, con una constante de disociación (KA) de 105 a 1012 litro/moles o más, y de manera preferente de 107 a 1012 litro/moles o más y de manera más preferente 108 a 1012 litro/moles) ; y/o tal que: se enlazan a HER3 con una velocidad kon de entre 102 M_1s" 1 a aproximadamente 107 M~1s~1, de manera preferente entre 103 M"1s"1 y 107 "1s"1, de manera más preferente entre 104 M"1s"1 y 107 M'V1, tal como entre 105 M'V1 y 107 M'V1; y/o tal que: se enlazan a HER3 con una velocidad Koff entre 1 s"1 (tl/2=0.69 s) y 10"6 s"1 (proporcionando un complejo casi irreversible con un tl/2 de múltiples días) , de manera preferente entre 10"2 s"1 y 10~6 s"1, de manera más preferente entre 10"3 s"1 y 10"6 s"1, tal como entre 10"4 s"1 y 10"6 s"1 .
De manera preferente, un polipéptido que contiene solo una secuencia de aminoácidos de la invención es de manera preferente tal que se enlazará a HER3 como una afinidad menor que 500 nM, de manera preferente menor que 200 nM, de manera más preferente menor que 10 nM, tal como menor que 1 nM. En este aspecto, será claro para la persona experta que un polipéptido que contiene dos o más Nanocuerpos de la invención se puede enlazar a HER3 con una avidez incrementada, comparada con un polipéptido que contiene solamente una secuencia de aminoácidos de la invención.
Algunos valores IC50 preferidos para el enlace de las secuencias de aminoácidos o polipéptidos de la invención a HER3 será claro a partir de la descripción adicional y ejemplos en este documento.
Otros polipéptidos de acuerdo con este aspecto preferido de la invención se puede elegir por ejemplo del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen más de 80%, de manera preferente más de 90%, de manera más preferente más de 95%, tal como 99% o más "identidad de secuencia" (como se define en este documento) con una o más de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 147 a 327, de manera más preferente HER3MS00135 (SEQ ID NO:282), HER3MS00212 (SEQ ID NO:319) o HER3MS00215 (SEQ ID NO:322) (véase la Tabla A-2), en la cual los Nanocuerpos comprendidos dentro de la secuencia de aminoácidos son de- manera preferente como se definen adicionalmente en este documento.
Otro aspecto de esta invención se refiere a un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la invención (tal como un ISV o Nanocuerpo de la invención) o un polipéptido de la invención que comprende los mismos. Nuevamente, como se escribe en general en este documento para los ácidos nucleicos de la invención, tal ácido nucleico puede estar en la forma de un constructo genético, como se define en este documento.
Otros ácidos nucleicos de acuerdo con un aspecto preferido de la invención se pueden elegir por ejemplo del grupo que consiste de secuencias de ácidos nucleicos que tienen más de 80%, de manera preferente más de 90%, de manera más preferente más de 95%, tal como 99% o más de "identidad de secuencia" (como se define en este documento) con una o más de las secuencias de ácidos nucleicos de SEQ ID NO's: 27 a 41 (véase la Figura 1) .
En otro aspecto, la invención se refiere a un hospedero o célula hospedera que expresa o que es capaz de expresar una secuencia de aminoácidos (tal como un Nanocuerpo) de la invención y/o un polipéptido de la invención que comprende la misma; y/o que contiene un ácido nucleico de la invención. Algunos ejemplos preferidos pero no limitantes de tales hospederos o células hospederas serán claros a partir de la descripción adicional en este documento.
Otro aspecto de la invención se refiere a un producto o composición que contiene o que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos de la invención, por lo menos un polipéptido de la invención y/o por lo menos un ácido nucleico de la invención, y opcionalmente uno o más componentes adicionales de tales composiciones conocidas en si, es decir, dependiendo del uso propuesto de la composición. Tal producto o composición puede ser ejemplo una composición farmacéutica (como se describe en este documento) , una composición' veterinaria o un producto o composición para uso de diagnóstico (tal como se describe en este documento). Algunos ejemplos preferidos pero no limitantes de tales productos o composiciones serán claros a partir de la descripción adicional en este documento.
La invención se refiere adicionalmente a métodos para preparar o generar las secuencias de aminoácidos, compuestos, constructos, polipéptidos , ácidos nucleicos, células hospederas, productos y composiciones descritas en este documento. Algunos ejemplos preferidos pero no limitantes de tales métodos serán claros a partir de la descripción adicional en este documento.
La invención se refiere además a aplicaciones y usos de las secuencias de aminoácidos, compuestos, constructos, polipéptidos , ácidos nucleicos, células hospederas, productos y composiciones descritas en este documento, asi como también a métodos para la prevención y/o tratamiento para enfermedades y trastornos asociados con HER3. Algunas aplicaciones y usos preferidos pero no limitantes serán claros a partir de la descripción adicional en este documento .
Otros aspectos, modalidades, ventajas y aplicaciones de la invención también serán claras a partir de la descripción adicional en este documento a continuación.
En general, se debe observar que el término Nanocuerpo como se usa en este documento en su sentido más amplio no se limita a una fuente biológica especifica o a un método de preparación especifico. Por ejemplo, como se planteará con más detalle a continuación, los Nanocuerpos de la invención se pueden obtener en general mediante cualquiera de las técnicas (1) a (8) mencionadas en las páginas 61 y 62 del documento 08/020079, o cualquier otra técnica adecuada conocida en si. Una clase preferida de Nanocuerpos corresponde a los dominios VHH de anticuerpos de cadena pesada de origen natural dirigidos contra HER3. Como se describe adicionalmente en este documento, tales secuencias VHH se pueden genera u obtener generalmente al inmunizar adecuadamente una especie de Camélido con HER3 (es decir, para elevar una respuesta inmune y/o anticuerpos de cadena pesada dirigidos contra HER3), al obtener una muestra biológica adecuada del Camélido (tal como una muestra de sangre, muestra de suero o muestra de células B) , y al generar secuencias VHH dirigidas contra HER3, comenzando desde la muestra, usando cualquier técnica adecuada conocida en si. Tales técnicas serán claras para la persona experta y/o se describen adicionalmente en este documento.
Alternativamente, tales dominios VHH de origen natural contra HER3, se pueden obtener de bibliotecas sin tratar de secuencias VHH de Camélido, por ejemplo al clasificar tal biblioteca usando HER3, o por lo menos una parte, fragmento, determinante antigénico o epitopo del mismo usando una o más técnicas de clasificación conocidas en si. Tales bibliotecas o técnicas se describen por ejemplo en los documentos WO 99/37681, WO 01/90190, . WO 03/025020 y WO 03/035694. Alternativamente, las bibliotecas sintéticas o semi-sintéticas mejoradas derivadas de bibliotecas VHH sin tratar se pueden usar, tales como bibliotecas VHH obtenidas de bibliotecas VHH sin tratar mediante técnicas tales como mutagénesis aleatoria y/o transposición de CDR, como por ejemplo descritas en el documento WO 00/43507.
De esta manera, en otro aspecto, la invención se refiere a un método para generar Nanocuerpos, que se dirigen contra HER3. En un aspecto, el método comprende por lo menos las etapas de: a) proporcionar un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de Nanocuerpos; y b) clasificar el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de Nanocuerpos para secuencias de Nanocuerpos que se enlazan a y/o tienen afinidad para HER3; y c) aislar el Nanocuerpo a¦ Nanocuerpos que se pueden enlazar a y/o tienen afinidad para HER3.
En tal método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de Nanocuerpos puede ser un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de Nanocuerpos sin tratar; un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de Nanocuerpos sintéticos o semi-sintéticos ; y/o un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de Nanocuerpos que se han sometido a maduración por afinidad.
En un aspecto preferido de este método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de Nanocuerpos puede ser un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de Nanocuerpos inmunes, y en particular un conjunto, colección o biblioteca de secuencias VHH inmunes, que se han derivado de una especie de camélido que. se ha inmunizado adecuadamente con HER3 o con un determinante antigénico adecuado con base en el mismo o derivado del mismo, tal como una parte, fragmento, región, dominio, rizo antigénico u otro epítopo de los mismos. En un aspecto particular, el determinante antigénico puede ser una parte, región, dominio, rizo extracelular u otro epitopo(s) extracelular .
En los métodos anteriores, en conjunto, colección o biblioteca de secuencias de Nanocuerpos o VHH se pueden expresar en un fago, fagémido, ribosoma o micro-organismo adecuado (tal como levadura), tal como para facilitar la clasificación. Los métodos adecuados, técnicas y organismos hospederos para expresar y clasificar (un conjunto, colección o biblioteca de) secuencias de Nanocuerpos será claro para la persona experta en la técnica, por ejemplo sobre la base de la descripción adicional en este documento. La referencia también se hace a la revisión por Hoogenboom in Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005) .
En otro aspecto, el método para generar secuencias de Nanocuerpos comprende por lo menos las etapas de: a) proporcionar una colección o muestra de células derivadas de una especie de Camélido que expresa secuencias de inmunoglobulina; b) clasificar la colección o muestra de células para (i) células que expresan una secuencia de inmunoglobulinas que se pueden enlazar a y/o tener afinidad para HER3; y (ii) células que expresan anticuerpos de cadena pesada, en los cuales las subetapas (i) y (ii.) se pueden llevar a cabo esencialmente como una sola etapa de clasificación o en cualquier orden adecuado en os etapas de clasificación separadas, para proporcionar por lo menos una célula que exprese un anticuerpo de cadena pesada que se enlaza a y/o tiene afinidad para HER3; y c) ya sea (i) aislar de la célula la secuencia VHH presente en el anticuerpo de cadena pesada; o (ii) aislar de la célula una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia VHH presente en el anticuerpo de cadena pesada, seguido al expresar el dominio VHH- En el método de acuerdo con este aspecto, la colección o muestra de células puede ser por ejemplo una colección o muestra de células B. también, en este método, la muestra de células se puede derivar .de un Camélido que se ha inmunizado adecuadamente con HER3 o un determinante antigénico adecuado basado en el mismo o derivado del mismo, tal como una parte, fragmento, región, dominio, rizo antigénico u otro epitopo de los mismos. En un aspecto particular, el determinante antigénico puede ser una parte, región, dominio, rizo extracelular u otro epitopo(s) extracelular.
El método anterior se puede llevar a cabo en cualquier manera adecuada, como será claro para la persona experta. Se hace referencia por ejemplo a los documentos EP 0 542 810, WO 05/19824, WO 04/051268 y WO 04/106377. La clasificación de la etapa b) se lleva a cabo de manera preferente usando una técnica de citometria de flujo tal como FACS. Para esto, la referencia se hace por ejemplo a Lieby y colaboradores, Blood, Vol. 97, No. 12, 3820. Se hace referencia particular a la técnica llamada de esta manera "NanocloneMR" descrita en la solicitud Internacional WO 06/079372 por Ablynx N.V.
En otro aspecto, el método para generar una secuencia de aminoácidos dirigida contra HER3 puede comprender por lo menos las etapas de: a) proporcionar un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleicos que codifican anticuerpos de cadena pesada o secuencias Nanocuerpos ; b) clasificar el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos para las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo de cadena pesada o una secuencias de Nanocuerpos que se enlazan a y/o tienen afinidad para HER3 y c) aislar la secuencia de ácido nucleico, seguido al expresar la secuencia VHH . presente en el anticuerpo de cadena pesada o al expresar la secuencia de Nanocuerpos, respectivamente.
En tal método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos de cadena pesada o secuencias de Nanocuerpos pueden ser por ejemplo un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos que codifican' un conjunto, colección o biblioteca sin tratar de anticuerpos de cadena pesada o secuencias de VHH un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un conjunto, colección o biblioteca sintética o semi-sintética de secuencias de Nanocuerpos; y/o un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicc-s que codifican un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de Nanocuerpos que se han sometido a maduración por afinidad.
En un aspecto preferido de este método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos pueden ser un conjunto, colección o biblioteca inmunitaria de secuencias de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de cadena pesada o secuencias de VHH derivados de un Camélido que se ha inmunizado adecuadamente con HER3 o con un determinante antigénico adecuado basado en el mismo derivado del mismo, tal como una parte, fragmento, región, dominio, rizo antigénico u otro epitopo dé los mismos. En un aspecto particular, el determinante antigénico puede ser una parte, región, dominio, rizo extracelular u otro epitopo (s) extracelular.
En los métodos anteriores, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de nucleótidos se puede expresar en un fago, fagémido, ribosoma u microorganismo adecuado (tal como levadura), tal como para facilitar la clasificación. Los métodos, técnicas y organismo hospederos adecuados para expresar y clasificar (un conjunto, colección o biblioteca de) secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos serán claros para la persona experta en la técnica, por ejemplo sobre la base de la descripción adicional en este documento. También se hace referencia al documento WO03054016 y a la revisión por Hoogenboom in Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005) .
Como será claro para la persona experta, la etapa de clasificación de los métodos descritos en este documento también se puede llevar a cabo como una etapa de selección. Por consiguiente el término "clasificación" como se usa en la presente descripción, puede comprender la selección, clasificación o cualquier combinación adecuada de técnicas de selección y/o clasificación. También, cuando un conjunto, colección o biblioteca de secuencias se usa, puede contener cualquier número adecuado de secuencias, tal como 1, 2, 3 o aproximadamente 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 104 , 105 , 106 , 107 , 108 o más secuencias.
También, una o más de todas las secuencias en el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos anterior se puede obtener o definir por procedimientos racionales, o semi-empíricos tales como técnicas de modelación por computadora o técnicas bioestáticas o minería de datos.
Adicionalmente, tal conjunto, colección o biblioteca pueden comprender una, dos o más secuencias que son variantes una de la otra (por ejemplo con mutaciones puntuales diseñadas o composiciones aleatorizadas ) , secuencias múltiples comprometidas derivadas de un conjunto diverso de secuencias naturalmente diversificadas {por ejemplo, una biblioteca inmunitaria) , o cualquier otra fuente de secuencias diversas (como se describe por ejemplo por Hoogenboom y colaboradores, Nat Biotechnol 23: 1105, 2005 y Binz y colaboradores, Nat Biotechnol 2005, 23: 1247). Tal conjunto, colección o biblioteca de secuencias se puede expresar sobre la superficie de una partícula fago, un ribosoma, una bacteria, una célula de levadura, una célula de mamífero, y se enlaza a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos dentro de estos portadores. Esto hace factibles al conjunto, colección o biblioteca para procedimientos de selección para aislar las secuencias de aminoácidos deseadas de la invención. Más en general, cuando una secuencia se expresa sobre un hospedero adecuado o célula de hospedero, también es posible (y acostumbrado) primero aislar del hospedero o célula hospedera una secuencia de nucleótidos que codifique la secuencia deseada, ¦ y posteriormente obtener la secuencia deseada al expresar adecuadamente la secuencia de nucleótidos en un organismo hospedero ádecuado. Nuevamente, esto se puede llevar a cabo en cualquier manera adecuada conocida en si, como será claro para la persona experta.
La invención también se refiere a las secuencias VHH O secuencias de Nanocuerpos que se obtienen por los métodos anteriores, o alternativamente por un método que comprende el uno de los métodos anteriores y además por lo menos las etapas para determinar las secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos de la secuencia VHH O secuencia de Nanocuerpos; y de expresar o sintetizar la secuencia VHH o secuencia de Nanocuerpos en una manera conocida en si, tal como la expresión en una célula hospedera adecuada u organismo hospedero o por síntesis química.
Como se menciona en este documento, una clase particularmente preferida de Nanocuerpo de la invención comprende Nanocuerpos con una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de un dominio VHH de origen natural, pero que ha sido por ejemplo, "humanizado" o de otra manera secuencia optimizada en vista de mejores rendimientos de producción o mejor estabilidad, es decir al reemplazar uno o más residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la secuencia VHH de origen natural (y en particular en las secuencias de estructura) por uno o más de los residuos de aminoácido que se presentan en la posición (es) correspondiente en un dominio VH de un anticuerpo de 4 cadenas convencional de un ser humano (por ejemplo, indicado en lo anterior), como se describe adicionalmente, y usando las técnicas mencionadas en, página 63 del documento O 08/020079. Otra clase particularmente preferida de Nanocuerpo de la invención comprende Nanocuerpos con una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de un dominio VH de origen natural, pero que se ha "camelizado", es decir, al reemplazar uno o más residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH de origen natural de un anticuerpo de 4 cadenas convencional por uno o' más de los residuos de aminoácido que se presentan en la posición (es) correspondiente en un dominio VHH de un anticuerpo de cadena pesada, como se describe adicionalmente, y usando las técnicas mencionadas en, página 63 del documento WO 08/020079.
Otros métodos y · técnicas adecuados para obtener los Nanocuerpos de la invención y/o ácidos nucleicos que codifican los mismos, comenzando desde las secuencias VH de origen natural o de manera preferente secuencias VHH, será claro para la persona experta, y puede incluir por ejemplo las técnicas que se mencionan en' la página 64 del documento WO 08/00279AS mencionados . en este documento, los Nanocuerpos en particular se pueden caracterizar por la presencia de uno o más "Residuos distintivos" (como se describe en este documento) en una o más de las secuencias de estructura.
La invención en su sentido más amplio también comprende derivados de los Nanocuerpos de la invención. Tales derivados se pueden obtener en general mediante la modificación, y en particular mediante modificación química y/o biológica (por ejemplo enzimática), de los Nanocuerpos de la invención y/o de uno o más de los residuos de aminoácido que forman los Nanocuerpos de la invención.
Los ejemplos de tales modificáciones, así como también ejemplos de residuos de aminoácido dentro de la secuencia de Nanocuerpos que se pueden modificar de tal manera (es decir, ya sea en la cadena principal de la proteína pero de manera preferente en una cadena lateral), métodos y técnicas que se pueden usar para introducir tales modificaciones y los usos potenciales y ventajas de tales modificaciones serán claras para la persona experta.
Por ejemplo, tal modificación puede implicar la introducción (por ejemplo, mediante enlace covalente o en otra manera adecuada) de uno o más grupos funcionales, residuos o porciones en o sobre el Nanocuerpo de la invención, y en particular de uno o más grupos funcionales, residuos o porciones que confieren una o más propiedades deseadas o funcionalidades al Nanocuerpo de la invención. Ejemplos de tales grupos- funcionales serán claros para la persona experta.
Por ejemplo, tal modificación puede comprender la introducción (por ejemplo, mediante enlace covalente o en cualquier otra .manera adecuada de uno o más grupos funcionales que incrementan la vida media, la solubilidad y/o la absorción de un Nanocuerpo de la invención, que reducen la inmunogenicidad y/o la toxicidad del Nanocuerpo de la invención, y/o que eliminan o atenúan cualquier efecto secundario indeseable del Nanocuerpo de la invención, y/o que confieren otras propiedades ventajosas para y/o reducir las propiedades indeseadas.de los Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención; o cualquier combinación de dos o más de lo anterior. Los ejemplos de tales grupos funcionales y de técnicas para introducirlos serán claras para la persona experta, y pueden comprender en general todos los grupos funcionales y técnicas mencionadas en la técnica antecedente general citada en este documento anteriormente asi como también los grupos funcionales y técnicas conocidas en si para la modificación de proteínas farmacéuticas, y en particular para la modificación de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (incluyendo ScFv y anticuerpos de dominio individual), por lo cual la referencia se hace por ejemplo a Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Tales grupos funcionales por ejemplo se pueden enlazar directamente (por ejemplo covalentemente ) a un Nanocuerpo de la invención, u opcionalmente a través de un enlazador espaciador adecuado, como nuevamente será claro para la persona experta.
Una de las técnicas más ampliamente usadas para incrementar la vida media y/o reducir la inmunogenicidad de las proteínas farmacéuticas comprende la unión de un polímero farmacológicamente aceptable adecuado, tal como poli (etilenglicol ) (PEG) o derivados del mismo (tal como metoxipoli (etilenglicol ) o mPEG) . En general, cualquier forma adecuada de pegilación se puede usar, tal como la pegilación usada en la técnica para anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (incluyendo pero no limitado a anticuerpos de dominio (individual) y ScFv's); se hace referencia por ejemplo a Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); por Veronese y Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), por Harris y Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) y en el documento WO 04/060965. Varios reactivos para la pegilación de las proteínas también son comercialmente disponibles, por ejemplo de Nektar Therapeutics, EUA.
De manera preferente, se usa la pegilación dirigida al sitio, en particular a través de un residuo de cisterna (véase por ejemplo Yang y colaboradores, Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003) . Por ejemplo, para este propósito, el PEG se puede unir a un residuo de cisterna que se presenta naturalmente en un Nanocuerpo de la invención, un Nanocuerpo de la invención se puede modificar para introducir adecuadamente uno o más residuos de cisteína para la unión del PEG o cualquier secuencia de aminoácidos que comprende uno o más residuos de cisteína para la unión del PEG se puede fusionar a la N- y o C-terminal de un Nanocuerpo de la invención, todos usando técnicas de ingeniería de proteínas conocidas en sí por la persona experta.
De manera preferente, para los Nanocuerpos y proteínas de la invención, se usa un PEG con un peso molecular de más de 5000, tal como más de 10,000 y menor que 200,000, tal como menor que 100,000; por ejemplo en el intervalo de 20,000-80,000.
Otra modificación usualmente menos preferida comprende glicosilación enlazada a N o enlazada a 0, usualmente como parte de la modificación o traduccional y/o postraduccional , dependiendo de la célula hospedera usada para la expresión del Nanocuerpo o polipéptido de la invención.
Todavía otra modificación puede comprender la introducción de una o más etiquetas detectables u otros grupos o porciones generadores de señal, dependiendo del uso propuesto de Nanocuerpo etiquetado. Las etiquetas y técnicas adecuadas para unir, usar y detectarlas será claro para la persona experta, y por ejemplo incluyen, pero no se limitan a, las etiquetas fluorescentes, etiquetas fosforescentes, etiquitas quimioluminiscentes , etiquetas bioluminiscentes , radioisótopos, metales, quela os de metal, cationes metálicos, cromóforos y enzimas, tales como aquellos mencionados en la página 109 del documento O 08/020079. Otras etiquetas adecuadas serán claras para la persona experta, y por ejemplo incluyen porciones que se pueden detectar usando espectroscopia RMN o ESR.
Tales Nanocuerpos y polipéptidos etiquetados de la invención se pueden usar por ejemplo para ensayos in vitro, in vivo o in situ (incluyendo inmunoensayos conocidos en sí tales como ELISA, RIA, EIA u otros "ensayos de emparedado", etcétera) así como también diagnóstico in vivo y propósitos de formación de imágenes, dependiendo de la elección de la etiqueta específica.
Como será claro para la persona experta, otra modificación puede implicar, la introducción de un grupo quelante, por ejemplo para quelar uno de los metales o cationes metálicos referidos en lo anterior. Los grupos quelantes adecuados incluyen por ejemplo, sin limitación, ácido dietil-entriaminpentaacético (DTPA) o ácido etilendiamintetraacético (EDTA) .
Todavía otra modificación puede comprender la introducción de un grupo funcional que es una parte de un par de enlace específico, tal como el par de enlace de biotina (estrept ) avidina . Tal grupo funcional se puede usar para enlazar el Nanocuerpo de la invención a otra proteína, polipéptido o compuesto químico que se enlaza a otra mitad del par de enlace, es decir a través de la formación del par de enlace. Por ejemplo, un Nanocuerpo de la invención se puede conjugar a biotina, y enlazar a otra proteína, polipéptido, compuesto o portador conjugado para avidina o estreptavidina . Por ejemplo, tal Nanocuerpo conjugado se puede usar como un reportero, en un sistema de diagnóstico donde un agente productor de señal detectable se conjuga a avidina o estreptavidina . Tales pares de enlace también se pueden usar por ejemplo para enlazar el Nanocuerpo de la invención a un portador, incluyendo portadores adecuados para propósitos farmacéuticos. Un ejemplo no limitante son las formulaciones liposomales descritas por Cao and Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000). Tales pares de enlace también se pueden usar para enlazar un agente terapéuticamente activo al Nanocuerpo de la invención.
Para algunas aplicaciones, en particular para aquellas aplicaciones en las cuales se propone exterminar una célula que expresa en objetivo contra el cual el Nanocuerpo de la invención se dirige (por ejemplo, en el tratamiento de cáncer), o de reducir o disminuir el crecimiento y/o proliferación de tal célula, los Nanocuerpos de la invención también se pueden enlazar a una toxina o a un residuo o porción tóxica. Los ejémplos de porciones, compuestos o residuos tóxicos que se pueden enlazar a un Nanocuerpo de la invención para proporcionar - por ejemplo - un compuesto citotóxico serán claros para la persona experta y se pueden encontrar por ejemplo en la técnica anterior citada en lo anterior y/o en la descripción adicional en este documento. Un ejemplo es la tecnología así llamada ADEPTMR descrita en el documento WO 03/055527.
Otras modificaciones químicas y enzimáticas potenciales serán claras para la persona experta. Tales modificaciones también se pueden introducir para propósitos de investigación (por ejemplo, para estudiar las' relaciones de función-actividad) . La referencia se hace por ejemplo a Lundblad y Bradshaw, Biotechnol. Appl . Bíochem. , 26, 143-151 (1997).
De manera preferente, los derivados son tales que se enlazan a HER3 con una afinidad (medida y expresada adecuadamente como un¦ valor KD (actual o evidente), un KA (actual o evidente) , una velocidad kon o una velocidad k0ff o alternati amente como un valor IC50, como se describe adicionalmente en este documento) que se define en este documento para los Nanocuerpos de la invención.
Como se menciona en lo anterior, la invención también se refiere a proteínas . o polipéptidos que consisten esencialmente de o comprenden de por lo menos un Nanocuerpo de la invención. Por "consiste esencialmente de" se propone que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención ya sea es exactamente la misma como la secuencia de aminoácidos o Nanocuerpo de la invención o corresponde a la secuencia de aminoácidos de un Nanocuerpo de la invención que tiene un número limitado de residuos de residuos de aminoácido, tal como de 1-20 residuos de aminoácido, por ejemplo 1-10 residuos de aminoácido y de manera preferente de 1-6 residuos de aminoácido, tal como 1, 2, 3, 4, 5 o 6 residuos de aminoácido, agregados en el extremo amino terminal, en el extremo carboxi terminal, o en tanto el extremo amino terminal como el extremo carboxi terminal de la secuencia de aminoácidos del Nanocuerpo.
Los residuos de aminoácido pueden o no cambiar, alterar o de otra manera afectar las propiedades (biológicas) del Nanocuerpo y pueden o no agregar funcionalidad adicional al Nanocuerpo. Por ejemplo, tales residuos de aminoácido: - pueden comprender un residuo Met N-terminal, por ejemplo como resultado de la expresión en una célula hospedera heterologa u organismo hospedero; pueden formar una secuencia señal o secuencia lider que dirige la secreción de un Nanocuerpo de una célula hospedera en la síntesis. Los péptidos líderes secretores adecuados serán claros para la persona experta, y pueden ser como se describe adicionalmente en .este documento. Usualmente, tal secuencia líder se enlazará a la N-terminal del Nanocuerpo, aunque la invención en su sentido más amplio no se limita al mismo; puede formar una secuencia o señal que permite que el Nanocuerpo se dirija hacia y/o penetre o entre en los órganos, tejidos, células, específicos o partes o compartimientos de las células, y/o que permita que un Nanocuerpo penetre o cruce una barrera biológica tal como una membrana celular, una capa celular tal como una capa de células epiteliales, un tumor, incluyendo tumores sólidos, o la barrera hematoencefálica . Ejemplos de tales secuencias de aminoácidos serán claros para la persona experta e incluyen ¦ aquellos mencionados en el párrafo c) en la página 112 del documento WO 08/020079; pueden formar una' "etiqueta", por ejemplo una secuencia de aminoácidos o residuo que permite o facilita la purificación de Nanocuerpo, por ejemplo usando técnicas de afinidad dirigidas contra la secuencia o residuo. Después, la secuencia o residuo se pueden remover (por ejemplo, mediante escisión química o enzimática) para proporciona la secuencia de Nanocuerpo (para este propósito, la etiqueta se puede usar opcionalmente a la secuencia de Nanocuerpos a través de una secuencia enlazadora escindible o contiene un motivo escindible) . Algunos ejemplos preferidas, pero no limitantes de tales residuos son residuos de histidina múltiples, residuos de glutationa y una etiqueta myc (véase por ejemplo SEQ ID NO: 31 del documento WO 06/12282); puede ser uno o más residuos de aminoácido que se han funcionalizado y/o que pueden servir como un sitio para la unión de los grupos funcionales. Los residuos de aminoácido adecuados' y grupos funcionales serán claros para la persona experta e incluyen, pero no se limitan a, los residuos de aminoácido y grupos funcionales mencionados en este documento para los derivados de los Nanocuerpos de la invención.
De acuerdo con otro aspecto, un polipéptido de la invención comprende un Nanocuerpo de la invención, que se fusiona en su extremo amino terminal, y su extremo carboxi terminal, o tanto en su extremo amino terminal como su extremo carboxi terminal a por lo menos una secuencia de aminoácidos adicional, es decir, para proporcionar una proteina de fusión que comprende el Nanocuerpo de la invención y la una. o más secuencias de aminoácidos adicionales. Tal fusión también se referirá en este documento como una "fusión de Nanocuerpo".
La una o más secuencia de aminoácidos adicional puede ser cualquier secuencia de aminoácidos adecuada y/o deseada. Las secuencias de aminoácidos · adicionales pueden o no cambiar, alterar o de otra manera afectar las propiedades (biológicas) del Nanocuerpo, y pueden o no agregar funcionalidad adicional a Nanocuerpo del polipéptido de la invención. De manera preferente, la secuencia de aminoácidos adicional es tal que confiere una o más propiedades o funcionalidades deseadas al Nanocuerpo o el polipéptido de la invención.
Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos adicional también puede proporcionar un segundo sitio de enlace, el sitio de enlace que se puede dirigir contra cualquier proteína deseada, polipéptido, antígeno, determinante antigénico o epítopo (incluyendo pero no limitado a la misma proteína, polipéptido, antígeno, determinante antigénico o epítopo contra los cuales el Nanocuerpo de la invención se dirige, o una proteína diferente, polipéptido, antígeno, determinante antigénico o epítopo) .
Ejemplo de tales secuencias de aminoácidos serán claros para la persona experta, y pueden comprender en general todas las secuencias de aminoácidos que se usan en las funciones de péptido con base en los anticuerpos convencionales y fragmentos de los mismos (incluyendo pero no limitado a ScFv's y anticuerpos de dominio individual). La referencia se hace por ejemplo a la revisión por Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005) .
Por ejemplo, tal secuencia de aminoácidos puede ser una secuencia de aminoácidos que incremente la vida media, la solubilidad, o la absorción, reduzca la inmunogenicidad o la toxicidad, elimine o atenúe efectos secundarios indeseables, y/o confiera otras propiedades ventajosas a y/o reduzca las propiedades indeseadas de los polipéptidos de la invención, comparada con el Nanocuerpo de la invención en si. Algunos ejemplos no limitantes de tales secuencias de aminoácidos son proteínas en suero, tales como albúmina de suero humano (véase por ejemplo el documento WO 00/27435) o moléculas hapténicas (por ejemplo haptenos que son reconocidos por anticuerpos circulantes, véase por ejemplo el documento WO 98/22141) .
En particular, se ha descrito en la técnica que los fragmentos de enlace de las inmunoglobulinas (tales como dominios VH) a la albúmina de suero o a fragmentos de la misma se pueden usar para incrementar la vida media. La referencia se hace para los documentos WO 00/27435 y WO 01/077137. De acuerdo con la invención, el Nanocuerpo de la invención se enlaza de manera preferente ya sea directamente a una albúmina de suero (o a un fragmento adecuado de la misma) o a través de un enlazador adecuado, y en particular a través de un péptido adecuado enlazado de modo que el polipéptido de la invención se pueda expresar como una fusión genérica (proteína) . De acuerdo con un aspecto específico, el Nanocuerpo de la invención se puede enlazar a un fragmento de albúmina de suero que comprende por lo menos el dominio III de la albúmina de suero o parte de la misma. La referencia se hace por ejemplo al documento WO 07/112940 de Ablynx N.V.
Alternativamente, la secuencia de aminoácidos adicional puede proporcionar un segundo sitio de enlace o unidad de enlace que se dirige contra una proteina en suero (tal como, por ejemplo, albúmina de suero humano u otra proteina en suero tal como IgG) , para proporcionar la vida media incrementada en el suero. Tales secuencias de aminoácidos por ejemplo incluyen los Nanocuerpos descritos a continuación, asi como también los péptidos pequeños y proteínas de enlace descritos en los documentos WO 91/01743, WO 01/45746 y WO 02/076489 y los dAb ' s descritos en los documentos WO 03/002609 y WO 04/003019. También se hace referencia a Harmsen y colaboradores, Vaccine, 23 (41); 4926-42, 2005, así como también el documento EP 0 368 684, así como también a los documentos WO 08/028977, WO 08/043821, WO 08/043822, WO 2008/068280 y WO 2009/127691).
Tales secuencias de aminoácidos se pueden dirigir en particular contra la albúmina de suero (y más en particular a la albúmina de suero humano) y/o contra IgG (y más en particular a IgG humana) . Por ejemplo, tales secuencias de aminoácidos pueden ser secuencias de aminoácidos que se dirigen contra la albúmina de suero (humano) y secuencias de aminoácidos que se enlazan a residuos de aminoácido en albúmina de suero (humano) que no se implican el enlace de la albúmina de suero a FcRn (véase .por ejemplo el documento WO 06/0122787) y/o secuencias de aminoácidos que son capaces de enlazarse a residuos de aminoácidos en albúmina de suero que no forman parte del dominio III de la albúmina de suero (véase nuevamente por ejemplo el documento WO 06/0122787) ; secuencias de aminoácidos que tienen o pueden proporcionar una vida media incrementada (véase, por ejemplo el documento WO 08/028977 por Ablynx N.V.); secuencia de aminoácidos contra la albúmina de suero humano que son de reactividad cruzada con la albúmina de suero de por lo menos una especie de mamífero, y en particular con por lo menos una especie de primate (tal como, sin limitación, monos del género Macaca (tal como, y en particular, monos cynomolgus (Macaca fascicularis) y/o monos rhesus [Macaca mulatto) ) y babuino [Papio ursinus) , se hace nuevamente referencia al documento WO 08/028977; secuencia de aminoácidos que se pueden enlazar a la albúmina en suero en una manera independiente de pH (véase por ejemplo el documento WO .08/043821 por Ablynx N.V. titulado "Secuencia de aminoácidos que enlazan a proteínas en suero en una forma que es. esencialmente independiente del pH, compuestos que comprenden las mismas, y usos de los mismos") y/o secuencias de · aminoácidos que son enlazadores condicionales (véase por ejemplo el documento WO 08/043822 por Ablynx N.V. titulado "Secuencias de aminoácidos que enlazan a una molécula deseada en una forma condicional") .
De acuerdo con otro aspecto, la una o más secuencias de aminoácidos adicionales puede comprender una o más partes, fragmentos o dominios de anticuerpos de 4 cadenas convencionales (y en particular anticuerpos humanos y/o para anticuerpos de cadena pesada. Por ejemplo, aunque usualmente menos preferido, un Nanocuerpo de la invención se puede enlazar a un dominio VH o VL convencional (de manera preferente humano) o a un- análogo natural o sintético de un dominio VH o VL, otrá vez opcionalmente a través de una secuencia enlazadora (incluyendo pero no limitado a otros anticuerpos de dominio (individual), tales como los dAb 1 s descrito por Ward y colaboradores, supra) .
El por lo menos un Nanocuerpo también se puede enlazar a uno o más dominios CH1, CH2 y/o CH3 (de manera preferente humano), opcionalmente a través de una secuencia enlazadora. Por ejemplo, un Nanocuerpo enlazado a un dominio CH1 adecuado por ejemplo se podría usar - junto con cadenas ligeras adecuadas - para generar fragmentos/estructuras de anticuerpos análogos a los fragmentos Fab convencionales o fragmentos F(ab')2f pero en los cuales uno o (en caso de un fragmento F(ab')2) uno' o ambos de los dominios VH convencionales se han reemplazado por un Nanocuerpo de la invención. También, los Nanocuerpos se podrían en lazar a un dominio CH3 (opcionalmente a través de un enlazador) para proporcionar un constructo con vida media incrementada in vivo.
De acuerdo con un aspecto especifico de un polipéptido de la invención, uno o más Nanocuerpo de la invención se pueden enlazar ( opcionalmente a través de un enlazador adecuado o región bisagra) a uno o más dominios constantes (por ejemplo, 2 o 3 dominios constantes que se pueden usar como parte de/para formar una porción Fe), a una porción Fe y/o a una o más partes de anticuerpos, fragmentos o dominios que confieren una o más funciones efectoras al polipéptido de la invención y/o pueden conferir la capacidad de enlazarse a uno o más receptores Fe. Por ejemplo, para este propósito, y sin que se limite a lo mismo, la una o más secuencias de aminoácidos adicionales pueden comprender uno o más dominios CH2 y/o CH3 de un anticuerpo, tal como de un anticuerpo de cadena pesada (como se describe en este documento) y de manera más preferente de un anticuerpo de 4 cadenas humano convencional; y/o pueden formar (parte de) y región Fe, por ejemplo de IgG (por ejemplo, de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4), de IgE o de otro Ig humana tal como IgA, IgD o IgM. Por ejemplo, el documento WO 94/04678 describe anticuerpos de cadena pesada que comprenden un dominio VHH Camélido o un derivado humanizado del mismo (es decir, un Nanocuerpo) , en el cual el dominio CH2 y/o CH3 Camelizado · se ha reemplazado por dominios CH2 y CH3 humano, para proporcionar una inmunoglobulina que consiste de dos cadenas pesadas que comprenden cada una un Nanocuerpo y dominio CH2 y CH3 humano (pero no el dominio CH1), la inmunoglobulina que tiene la función efectora proporcionada por los dominios. CH2 y CH3 y la inmunoglobulina que puede funcionar sin la presencia de ninguna cadena ligera. Otras secuencias de aminoácidos que se pueden enlazar adecuadamente a los Nanocuerpos de la invención para proporcionar una función efectora serán claros para la persona experta, y se pueden elegir sobre la base de la función(es) efectora deseada. Se hace referencia por ejemplo a los documentos WO 04/058820, WO 99/42077, WO 02/056910 y WO 05/017148,' asi como también a la revisión por Holliger y Hudson, supra; y a la solicitud provisional de EUA no pre-publicada por Ablynx N.V. titulada "Constructos que comprenden dominios variables sencillos y una porción Fe derivada de IgE" que tiene una fecha de presentación del 4 de Diciembre de 2007. El acoplamiento de un Nanocuerpo de la invención a una porción Fe también puede conducir a una vida media incrementada, comparado con el Nanocuerpo correspondiente de la invención.' Para algunas aplicaciones, el uso de una porción Fe y/o de dominios constantes (es decir, dominios CH2 y/o CH3) que confieren vida media incrementada sin ninguna función efectora biológicamente significativa también pueden ser adecuados o aún preferidos. Otros constructos adecuados que comprenden uno o más Nanocuerpos y uno o más dominios constantes con vida media incrementada in vivo serán claros para la persona experta, y por ejemplo pueden comprender dos Nanocuerpos enlazados a un dominio CH3, opcionalmente a través de una secuencia enlazadora. En general, cualquier proteina de fusión derivados con vida media incrementada tendrán de manera preferente un peso molecular de más de 50 kD, el valor de corte para la absorción renal.
En otro aspecto especifico, pero no limitante, a fin de formar un polipéptido de la invención, una o más secuencias de aminoácidos de la invención se pueden enlazar (opcionalmente a través de un enlazador adecuado o región bisagra) a dominios constantes de origen natural, sintéticos o semi-sintéticos (o análogos, variantes, mutantes, partes o fragmentos de los mismos.) que tienen una tendencia reducida (o esencialmente nada) auto-asociarse en dimeros (es decir, comparados con los dominios constantes que se presentan naturalmente en los anticuerpos de 4 cadenas convencionales) . Tales variantes de cadena Fe monomérica (es decir, que no se auto-asocian) , o fragmentos de los mismos, serán claros para la persona experta. Por ejemplo, Helm y colaboradores, J Biol Chem 1996 271 7494, describen variantes de cadena Fce monoméricos que se pueden usar en las cadenas de polipéptido de la invención.
También, tales variantes de cadena Fe monoméricas son de manera preferente tal que aún son capaces de enlazarse al complemento o al receptor (es) Fe relevante (dependiendo de la porción Fe de la cual se derivan), y/o tal que aún tienen algo o todas las funciones efectoras de la porción Fe de la cual se derivan (o en un nivel reducido aún adecuado para el uso en propuestos) . -Alternativamente, en tal cadena de polipéptido de la invención, la cadena Fe monomérica se puede usar para conferir vida media incrementada en la cadena de polipéptido, coso en el cual la cadena Fe monomérica también puede no tener o esencialmente ninguna función efectora.
Los polipéptidos bivalentes/multivalentes , bispecificos/multispecificos o biparatópicos/multiparatópicos de la invención también se pueden enlazar a las porciones Fe, a fin de proporcionar constructos de polipéptido del tipo que se describe en la solicitud provisional de EUA no pre-publicada 61/005,331 titulada "immunoglobulin construets" presentada el 4 de Diciembre de 2007.
Las secuencias de aminoácidos adicionales también pueden formar una secuencia señal o secuencia líder que dirige la secreción del Nanocuerpo o el polipéptido de la invención de una célula hospedera en la síntesis (por ejemplo para proporcionar una pre-, pro- o prepro-forma del polipéptido de la invención, dependiendo de la célula hospedera usada para expresar el polipéptido de la invención) .
La secuencia de aminoácidos adicional también puede formar una secuencia señal que permite que el Nanocuerpo o polipéptido de la invención de la invención se dirija hacia y/o penetre o entre en los órganos, tejidos, células, específicos, o partes o compartimientos de células y/o que permite que el Nanocuerpo o polipéptido de la invención penetre o cruce una barrera biológica tal como una membrana celular, una capa celular tal como una capa de células epiteliales, un tumor incluyendo tumores sólidos, o la barrera hematoencefálica . Ejemplos adecuados de tales secuencias de aminoácidos serán claros para la persona experta, y por ejemplo incluyen, pero no se limitan a, aquellos mencionados en la página 118 del documento O 08/020079. Para algunas aplicaciones, en particular para aquellas aplicaciones en las cuales se propone exterminar una célula que exprese el objetivo contra el cual el Nanocuerpo de la invención se dirige (por ejemplo, en el tratamiento de cáncer), o para reducir o disminuir el crecimiento y/o proliferación de tal célula, los Nanocuerpos de la invención también se pueden enlazar a una proteína o polipéptido (cito) tóxico . Los ejemplos de tales proteínas y polipéptidos tóxicos que se pueden enlazar a un Nanocuerpo de la invención para proporcionar - por ejemplo - un polipéptido citotóxico de la invención será claro para la persona experta y se pueden encontrar por ejemplo en la técnica anterior citada en lo anterior y/o en la descripción adicional en este documento. Un ejemplo es la tecnología así llamada ADEPTMR descrita en el documento WO 03/055527.
De acuerdo con un aspecto preferido, pero no limitante, la una o más secuencias de aminoácidos adicionales comprenden por lo menos un Nanocuerpo adicional, para proporcionar un polipéptido de la invención que comprende por lo menos dos, tal como tres, cuatro, cinco o- más Nanocuerpos, en los cuales los Nanocuerpos se pueden enlazar opcionalmente a través de una o más secuencias enlazadoras (como se define en este documento) . Como se describe en las páginas 119 y 120 del documento WO 08/020079, los polipéptidos de la invención que comprenden dos o más Nanocuerpos, de los cuales por lo menos uno es un Nanocuerpo de la invención, también se referirán en este documento como polipéptidos "multivalentes" de la invención, y los Nanocuerpos presentes en tales polipéptidos también se referirán en este documento por estar en un "formato multivalente" . Por ejemplo, polipéptidos "bivalentes" y "trivalentes" de la invención pueden ser como se describe adicionalmente en las páginas 119 y 120 del documento WO 08/020079.
Los polipéptidos de. la invención que contienen por lo menos dos Nanocuerpos, en los cuales por lo menos un Nanocuerpo se dirige contra un primer antigeno (es decir, contra HER3, ) y por lo menos un Nanocuerpo se dirige contra un segundo antígeno' (es decir, diferente de HER3, ) , también se referirán como polipéptidos "multiespecífieos" de la invención, y los Nanocuerpos presentes en tales polipéptidos también se referirán en ' este documento por estar en un "formato multiespecífico" . De esta manera, por ejemplo, un polipéptido "biespecífico" de la invención es un polipéptido que comprende por lo menos un Nanocuerpo dirigido contra un primer antígeno (es . decir, HER3, ) y por lo menos un Nanocuerpo adicional dirigido contra un segundo antígeno (es decir, diferente de HER3, ) , mientras que un polipéptido "triespecí fico" de la invención es un polipéptido que comprende por lo menos un Nanocuerpo dirigido contra un primer antígeno (es decir, HER3 , ) ·, por lo menos un Nanocuerpo adicional dirigido contra un segundo antígeno (es decir, diferente de HER3, ) y · por lo menos un Nanocuerpo adicional dirigido contra un tercer antígeno (es decir, diferente de tanto HER3, como el segundo antígeno); etcétera.
Por consiguiente, en su forma más simple, un polipéptido biespecifico de la invención es un polipéptido bivalente de la invención (como se define en este documento) , que comprende un primer Nanocuerpo dirigido contra HER3, y un segundo Nanocuerpo dirigido contra un segundo antigeno, en el cual el primero y segundo Nanocuerpo se puede enlazar opcionalmente a través de una secuencia enlazadora (como se define en este documento) ; mientras que un polipéptido triespecifico de la invención en su forma más simples es un polipéptido trivalente de la invención (como se define en este documento) , que comprende un primer Nanocuerpo dirigido contra HER3, un segundo Nanocuerpo dirigido contra un segundo antigeno y un tercer Nanocuerpo dirigido contra un tercer antigeno, en el cual el primero, segundo o tercer Nanocuerpo se pueden enlazar opcionalmente a través de una o más, y en particular una y más, en particular dos, secuencias enlazadoras.
Sin embargo, como será claro a partir de la descripción anteriormente en este documento, la invención no se limita a la misma, en el sentido que un polipéptido multiespecifico de la invención puede comprender por lo menos un Nanocuerpo contra HER3 , y cualquier número de Nanocuerpos dirigidos contra uno o más antigenos diferente de HER3.
Adicionalmente, aunque se abarca dentro del alcance de la invención que el orden especifico o arreglo de los diversos Nanocuerpos en los polipéptidos de la invención pueden tener alguna influencia en las propiedades del polipéptido final de la invención (incluyendo pero no limita a la afinidad, especificidad o avidez para HER3, o contra el uno o más de otros a.ntigenos), el orden o arreglo no es usualmente critico y se puede elegir adecuadamente por la persona experta, opcionalmente después de algunos experimentos de rutina limitados con base en la descripción en este documento. De esta manera, cuando se hace referencia a un polipéptido multivalente especifico o multiespecifico de la invención, se debe observar que esto abarca cualquier orden o arreglos de los Nanocuerpos relevantes, a menos que se indique explícitamente de otra manera.
Finalmente, también está dentro del alcance de la invención que los polipéptidos de la invención contienen dos o más Nanocuerpos y una o más secuencias de aminoácidos adicionales (como se menciona en este documento) .
Para polipéptidos multivalentes y multiespecificos que contienen uno o más dominios VHH y su preparación, se hace referencia también a Conrath y colaboradores, J. Biol. Chem. , Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001) , 277-302; así como también a por ejemplo los documentos WO 96/34103 y WO 99/23221. Algunos otros ejemplos de algún polipéptido específico y/o multivalente específico de la invención se pueden encontrar en las solicitudes por Ablynx N.V. referidas en este documento.
Un ejemplo preferido, pero no limitante de un polipéptido multiespecí fico de la invención comprende por lo menos un Nanocuerpo de la invención y por lo menos un Nanocuerpo que proporciona una vida media incrementada. Tales Nanocuerpos por ejemplo pueden ser Nanocuerpos que se dirigen contra una proteína en suero, y en particular una proteína de suero humano, tal como albúmina de suero humano, proteína de enlace a tiroxina, transferrina (humana) , fibrinógeno, una inmunoglobulina tal como IgG, IgÉ o IgM, o contra una de las proteínas en suero listadas en el documento WO 04/003019. De estos, los Nanocuerpos que se pueden enlazar a la albúmina de suero (y en particular albúmina de suero humano) o a IgG (y en particular IgG humana, véase por ejemplo el Nanocuerpo VH-1 descrito en la revisión por Muyldermans, supra) se prefieren particularmente (aunque por ejemplo, para experimentos en ratones o primates, los Nanocuerpos contra o de reacción cruzada dentro de la albúmina de suero de ratón (MSA) o albúmina de suero del primate, respectivamente, se pueden usar. Sin embargo, para uso farmacéutico, los Nanocuerpos contra la albúmina de suero humano o IgG humana se preferirán usualmente) . Los Nanocuerpos que proporcionan vida media incrementada y que se pueden usar en los polipéptidos de la invención incluyen los Nanocuerpos dirigidos contra la . albúmina de suero que se describen en el documento WO 04/041865, en WO 06/122787 y las solicitudes de patente adicionales por Ablynx N.V., tales como aquellas mencionadas en lo anterior.
Por ejemplo, algunos Nanocuerpos preferidos que proporcionan vida media incrementa para el uso en la presente invención incluyen Nanocuerpos que se pueden enlazar a residuos de aminoácido en la albúmina de suero (humano) que no se implican en el enlace de la albúmina de suero a FcRn (véase por ejemplo la WO 06/0122787); los Nanocuerpos que son capaces de enlazarse a residuos de aminoácido en la albúmina de suero que no forman parte del dominio III de la albúmina de suero (véase por ejemplo WO 06/0122787) ; los Nanocuerpos que tienen o pueden proporcionar una vida media incrementada (véase por ejemplo WO 08/028977 por Ablynx N.V mencionada en este documento) ; los Nanocuerpos contra la albúmina de suero humano que son de reacción cruzada con la albúmina de suero de por lo menos una especie de mamífero, y en particular con por lo menos una especie de primate (tal como, sin limitación, monos del género Macaca (tal como, y en particular, monos cynomolgus {Macaca fas cicularis) y/o monos rhesus {Macaca mulattó)) y babuino {Papio ursinus)) (véase por ejemplo WO 08/028977 por Ablynx N.V)); Nanocuerpos que se pueden enlazar a albúmina de suero en una manera independiente de pH (véase por ejemplo WO2008/043821 por Ablynx N.V. mencionado en este documento) y/o Nanocuerpos que son enlazadores condicionales (véase por ejemplo WO 08/043822 por Ablynx N.V. ) .
Algunos Nanocuerpos particularmente preferidos que proporcionan vida media incrementada y que se pueden usar en los polipéptidos de la invención incluyen los Nanocuerpos ALB-1 a ALB-10 dados a conocer en WO 06/122787 (véase las Tablas II y III) de las cuales ALB-8 (SEQ ID NO: 62 en WO 06/122787, véase también SEQ ID NO: 11 de esta solicitud) se prefiere particularmente..
Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de polipéptidos de la invención que comprenden por lo menos un Nanocuerpo de la invención y por lo menos un Nanocuerpo que proporciona vida media incrementada se proporcionan en SEQ ID NO's 147 a 327, de manera más preferente HER3MS00135 (SEQ ID NO:282), HER3MS00212 (SEQ ID NO:319) o HER3MS00215 (SEQ ID NO:322) .
De acuerdo con un aspecto especifico, pero no limitante de la invención, los polipéptidos de la invención contienen, además de uno o más Nanocuerpos de la invención, por lo menos un Nanocuerpo contra albúmina de suero humano.
En general, cualquiera de los polipéptidos de la invención con vida media incrementada que contienen uno o más Nanocuerpos de la invención, y cualquier derivados de Nanocuerpos de la invención o de tales polipéptidos que tienen una vida media incrementada, tienen de manera preferente una vida media que es por lo menos 1.5 veces, de manera preferente por lo menos 2 veces, tal como por lo menos 5 veces, por ejemplo por lo menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la vida media del Nanocuerpo correspondiente de la invención en si. Por ejemplo, tal. derivado o polipéptidos con vida media incrementada pueden tener una vida media que se incrementa con más de una hora, de manera preferente más de 2 horas, de manera más preferente más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o aún más de 24, 48 o 72 horas, comparado con el Nanocuerpo correspondiente de la invención en sí.
En un aspecto preferido, pero no limitante de la invención, tales derivados o polipéptidos pueden mostrar una vida media en suero en un humano de por lo menos aproximadamente 12 horas, de manera preferente por lo menos 24 horas, de manera más preferente por lo menos 48 horas, de manera aún más preferente por lo menos.72 horas o más. Por ejemplo, tales derivados o polipéptidos pueden tener una vida media de por lo menos 5 días (tal como aproximadamente 5 a 10 días), de manera preferente¦ por lo menos 9 días (tal como aproximadamente 9 a .14 días), de manera más preferente por lo menos aproximadamente 10 días (tal como aproximadamente 10 a 15 días), o por lo menos aproximadamente 11 días (tal como aproximadamente 11 a 16 días), de manera más preferente por lo menos aproximadamente 12 días (tal como aproximadamente 12 a 18 días o más), o más de 14 días (tal como aproximadamente 14 a 19 días) .
De acuerdo con un aspecto de la invención los polipéptidos son capaces de enlazarse a una o más moléculas que pueden incrementar la vida media del polipéptido in vivo.
Los polipéptidos de la invención se estabilizan in vivo y su vida media se incrementa al enlazarse a las moléculas que resisten la degradación y/o eliminación o secuestro. Típicamente, tales moléculas son proteínas de origen natural que por sí mismas tienen una vida media prolongada in vivo.
En los polipéptidos de la invención, el uno o más Nanocuerpos y el uno .o más polipéptidos se pueden enlazar directamente entre sí (como se describe por ejemplo en WO 99/23221) y/o se pueden enlazar entre sí a través de uno o más espaciadores o enlazadores adecuados, o cualquier combinación de los mismos .
Los espaciadores o enlazadores adecuados para el uso en polipéptidos multivalentes y multiespecificos serán claros para la persona experta, y pueden ser en general cualquier enlazador o espaciador usado' en la. técnica para enlazarse a las secuencias de aminoácidos.. De manera preferente, el enlazador o espaciador es adecuado para el uso en la construcción de proteínas o polipéptidos que se proponen para uso farmacéutico.
Algunos espaciadores particularmente preferidos incluyen los espaciadores y ligaduras que se usan en la técnica para enlazar fragmentos de anticuerpo o dominios de anticuerpo. Estos incluyen las ligaduras mencionadas en la técnica antecedente general citada en lo anterior así como también por ejemplo ligaduras que se usan en la técnica para construir diacuerpos o fragmentos ScFv (en este aspecto, sin embargo, se debe observar que, mientras que en los diacuerpos y en los fragmentos ScFv, la secuencia de ligadura usada debe tener una longitud, un grado de flexibilidad y otras propiedades que permiten . a los dominios VH y VL pertinentes llegar juntos para formar el sitio de enlace a antígeno completo, no hay limitación particular en la longitud o la flexibilidad de la ligadura usada en el polipéptido de la invención, puesto que cada Nanocuerpo por sí mismo forma un sitio de enlace a antígeno completo) .
Por ejemplo, una ligadura puede ser una secuencia de aminoácidos adecuada,' y en particular secuencias de aminoácidos de entre 1 y 50, de manera preferente entre 1 y 30, tal como entre 1 y 10 residuos de aminoácido. Algunos ejemplos preferidos de tales secuencias de aminoácidos incluyen ligaduras (gly-ser por ejemplo del tipo (glyxsery)z, tal como (por ejemplo (gly<¡ ser)3 o (gly3ser2 ) 3 , como se describe en WO 99/42077 y las ligaduras GS30, GS15, GS9 y GS7 descritos en las solicitudes por Ablynx mencionadas en este documento (véase por ejemplo WO 06/040153 y WO 06/122825), asi como también regiones similares a bisagra, tal como las regiones bisagra de anticuerpos de cadena pesada de origen natural o secuencias similares (tal como describe en WO 94/04678) .
Algunas otras ligaduras particularmente preferidas son poli-alanina (tal como AAA) , ' asi como también las ligaduras GS30 (SEQ ID NO: 85' en WO 06/122825) y GS9 (SEQ ID NO: 84 en WO 06/122825) .
Otras ligaduras . adecuadas comprenden en general compuestos o polímeros orgánicos, en particular a aquellos adecuados para el uso en proteínas para uso farmacéutico. Por ejemplo, las porciones de poli (etilenglicol) se han usado para enlazar dominios de anticuerpo, véase por ejemplo WO 04/081026.
Se incluye dentro del alcance de la invención que la longitud, el grado de flexibilidad y/u otras propiedades de la(s) ligadura (s) usadas (aunque no critico, como es usualmente para las ligaduras usadas en los fragmentos ScFv) pueden tener alguna influencia en las propiedades del polipéptido final de la invención, incluyendo pero no limitado a la afinidad, especificidad o avidez para HER3, o para uno o más de los otros antigenos. Con base en la descripción en este documento, la persona experta será capaz de determinar la ligadura (s) óptima para el uso en un polipéptido especifico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos de rutina limitados.
Por ejemplo, en los polipéptidos multivalentes de la invención que comprenden nanocuerpos dirigidos contra un antigeno multimérico (tal como un receptor multimérico u otra proteina), la longitud y flexibilidad de la ligadura son de manera preferente tal que permiten que cada Nanocuerpo de la invención presente en el polipéptido se enlace al determinante antigénico en cada una de las subunidades del multimero. Similarmente , en un polipéptido multiespecífico de la invención que comprende Nanocuerpos dirigidos contra dos o más determinantes antigénicos diferentes en el mismo antigeno (por ejemplo contra diferentes epitopos de un antigeno y/o contra subunidades diferentes de un receptor multimérico, canal o proteina, la longitud y flexibilidad en el ligadura son de manera preferente tal que permiten que cada Nanocuerpo se enlace a su determinante antigénico propuesto. Nuevamente, con base en la descripción en este documento, la persona experta será capaz de determinar la(s) ligadura (s) óptimas para el uso en un polipéptido específico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos de rutina limitados .
También está dentro del alcance de la invención que la(s) ligadura (s) usada confiere una o más de otras propiedades favorables o funcionalidad a los polipéptidos de la invención, y/o proporciona uno o más sitios para la formación de derivados y/o para la unión de grupos funcionales (por ejemplo, como se describe en este documento para los derivados de los Nanocuerpos de la invención) . Por ejemplo, las ligaduras que contienen uno o más residuos de aminoácidos cargados (véase la Tabla A-2 en la página 48 de la solicitud Internacional WO 08/020079) pueden proporcionar propiedades hidrofílicas mejoradas, mientras que las ligaduras que forman o contienen epítopos o etiquetas pequeñas se pueden usar para los propósitos de detección, identificación y/o purificación. Nuevamente, con base en la descripción en este documento, la persona experta será capaz de determinar las ligaduras óptimas para el uso en un polipéptido específico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos de rutina' limitados .
Finalmente, cuando dos o más ligaduras se usan en los polipéptidos de la invención, estas ligaduras pueden ser iguales o diferentes. Nuevamente con base en la descripción en este documento, la persona experta será capaz de determinar las ligaduras óptimas para el uso en un polipéptido específico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos de rutina limitados.
Usualmente, para facilidad de expresión y producción, un polipéptido de la invención será un polipéptido lineal. Sin embargo, la invención en su sentido más amplio no se limitan al mismo. Por ejemplo, cuando un polipéptido de la invención comprende tres de más de Nanocuerpos, es posible enlazarlos mediante el uso de una ligadura con tres o más "brazos", que cada "brazo" que se enlaza a un Nanocuerpo, para proporcionar un constructo "en forma, de estrella". También es posible, aunque usualmente menos preferido, usar constructos circulares .
La invención también comprende derivados de los polipéptidos de la ' invención, que pueden ser esencialmente análogos a los derivados de los Nanocuerpos de la invención, es decir, como se describe en este documento.
La invención también comprende proteínas o polipéptidos que "consisten esencialmente" de un polipéptido de la invención (en el cual la palabra "consiste sencillamente de" tiene esencialmente el mismo significado como se indica en lo anterior) .
De acuerdo con un aspecto de la invención, el polipéptido de la invención es una forma esencialmente aislada, como se define en este documento.
Las secuencias de · aminoácidos, Nanocuerpos, polipéptidos y ácidos nucleicos de la invención se pueden preparar en una manera conocida en sí, como será claro para la persona experta a partir de la descripción adicional en este documento. Por ejemplo, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden preparar de cualquier manera conocida en sí para la preparación de .anticuerpos y en particular para la preparación de fragmentos de anticuerpo (incluyendo pero no limitado a anticuerpos de dominio (individual) y fragmentos ScFv) . Algunos métodos preferidos, pero no limitantes para preparar las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos, polipéptidos y ácidos nucleicos incluyen los métodos y técnicas descritos en este documento.
Como será claro par la persona experta, un método particularmente útil para · preparar una secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo y/o a polipéptido de la invención comprenden en general las etapas de: i) la expresión, en una célula hospedera adecuada u organismo hospedero (también referido en este documento como un "hospedero de la invención") o en otro sistema de expresión adecuado de un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención (también referido en este documento como un "ácido nucleico de la invención"), seguido opcionalmente por: ii) aislar y/o purificar la secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención de esta manera obtenido .
En particular, tal método puede comprender las etapas de: i) cultivar y/o mantener un hospedero de la invención bajo condiciones que son tales que el hospedero de la invención expresa y/o produce por lo menos una secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo y/o polipéptido de la invención; seguido opcionalmente por: ii) aislar y/o purificar la secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención de manera obtenidos .
Un ácido nucleico de la invención puede estar en la forma de un DNA de hebra individual o doble hebra o RNA, y es de manera preferente en la forma de DNA de doble hebra. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden ser DNA genómico, cDNA o DNA sintético (tal como DNA con un uso de codón que se ha adaptado específicamente para la expresión en las célula hospedera propuesta u organismo hospedero) .
De acuerdo con un aspecto ¦ de la invención, el ácido nucleico de la invención está en forma esencialmente aislada, como se define en este documento.
El ácido nucleico de la invención también puede estar en la forma de, está presente en y/o ser parte de un vector, tal como por ejemplo un plásmido, · cósmido o YAC, que nuevamente puede estar en forma esencialmente aislada.
Los ácidos nucleicos de la invención se pueden preparar u obtener en una forma conocida en sí, con base en la información en la secuencia de aminoácidos para los polipéptidos de la invención proporcionado en este documento, y/o se pueden aislar a partir de una fuente natural adecuada. Para proporcionar análogos, secuencias de nucleótidos que codifican dominios VHH de origen natural pueden por ejemplo ser sometidas a mutagénesis dirigida al sitio, para proporcionar un ácido nucleico de la invención que codifica el análogo. También, cómo será claro para la persona experta, para preparar un ácido nucleico de la invención, también varias secuencias de nucleótidos, tal como por lo menos una secuencia de nucleótidos- que codifica un Nanocuerpo y por ejemplo ácidos nucleicos que codifican una o más ligaduras se pueden enlazar conjuntamente de una manera adecuada.
Las técnicas para generar los ácidos nucleicos de la invención serán claras para la persona experta y por ejemplo pueden incluir, pero no se limitan a, síntesis de DNA automatizada; mutagénesis dirigida al sitio; combinar dos o más secuencias de origen natural y/o sintéticas (o dos o más partes de la misma) , introducción de mutaciones que conducen a la expresión de un producto de expresión truncado; introducción de uno o más sitios de restricción (por ejemplo, para crear casetes y/o regiones que se pueden digerir y/o ligar fácilmente usando enzimas de restricción adecuadas), y/o la introducción de mutaciones por medio de una reacción PC usando uno o más cebadores "no coincidentes", usando por ejemplo una secuencia de una forma de origen natural de HER3 como una plantilla. Estas y otras técnicas serán claras para la persona experta, y se hace nuevamente referencia a los manuales estándares, tal como Sambrook y colaboradores, y Ausubel y colaboradores, como se menciona en lo anterior, así como también a los Ejemplos posteriores.
El ácido nucleico de la invención también puede estar en la forma de, estar presente en y/o ser parte de un constructo genético, como será claro para la persona experta en la técnica y como se describe en las páginas 131-134 del WO 08/020079 (incorporado en este documento a manera de referencia) . Tales constructos genéticos comprenden en general por lo menos un ácido nucleico de la invención que se enlaza opcionalmente a uno o más elementos de constructos genéticos conocidos en si, tal como por ejemplo uno o más elementos reguladores adecuados (tal como un promotor (es ) , adecuado, potenciador (es ) , terminador (es ) , etcétera) y los elementos adicionales de los constructos genéticos referidos en este documento. Tales constructos genéticos que comprenden por lo menos un ácido nucleico de- la invención también se referirán en este documento como "constructos genéticos de la invención" .
Los constructos genéticos de la invención pueden ser DNA o RNA, y son de manera preferente DNA de doble hebra. Los constructos genéticos de la invención también pueden estar en una forma adecuada para transformación de la célula hospedera propuesta u organismo hospedero en una forma adecuada para la integración en el DNA genómico de la célula hospedera propuesta o en una forma adecuada para la replicación independiente, mantenimiento y/o herencia en el organismo hospedero propuesto. Por ejemplo, los construidos genéticos de invención pueden estar en la forma de un vector, tal como por ejemplo un plásmido, cósmido, YAC, un vector viral o transposón. En particular, el vector puede ser un vector de expresión, es decir un vector que se puede proporcionar para la expresión in vitro y/o in vivo (por ejemplo, en una célula hospedera adecuada, organismo hospedero y/o sistema de expresión .
En un aspecto preferido pero no limitante, un constructo genético de la invención comprende i) por lo menos un ácido nucleico de la invención; conectado operablemente a ii) uno o más elementos reguladores, tal como un promotor y opcionalmente un terminador adecuado; y opcionalmente también; iii) uno o más elementos adicionales de constructos genéticos conocido en si; en los cuales los términos "operablemente conectado" y "operablemente enlazado" tienen el significado dado en las páginas 131-134 de WO 08/020079; y en las cuales los "elementos reguladores", "promotor", "terminador" y "elementos adicionales" son como se describen en las páginas 131-134 de WO 08/020079; y . en los cuales los constructos genéticos pueden ser adicionalmente como se describen en las páginas 131-134 de WO 08/020079.
Los ácidos nucleicos de la invención y/o los constructos genéticos de la invención se pueden usar para transformar una célula hospedera u organismo hospedero, es decir para expresión y/o producción de la secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención. Hospederos adecuados o células hospederas serán claras para la persona experta, y por ejemplo pueden ser cualquier célula fúngica, procariótica o eucariótica adecuada o linea de células o cualquier organismo fúngico, procariótico o eucariótico fúngico, por ejemplo aquellos descritos en las páginas 134 y 135 de WO 08/020079; asi como también todos los otros hospederos o células hospederas conocidas en si para la expresión y producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (incluyendo pero no- limitado a anticuerpos de dominio (individual) y fragmentos ScFv) , que serán claros para la persona experta. Se hace también referencia a la técnica antecedente general citada anteriormente en este documento, asi como también por ejemplo los documentos WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken y colaboradores, (1998), supra; Riechmann and Muyldermans, (1999), supra; van der Linden, (2000), supra; Thomassen y colaboradores, (2002), supra; Joosten y colaboradores, (2003), supra; Joosten y colaboradores, (2005), supra; y las referencias adicionales citadas en este documento.
Las secuencias de aminoácidos, Nanocuerpos y polipéptidos de la invención también se pueden introducir y expresar en una o más células, tejidos u órganos de un organismo multicelular, por ejemplo para propósitos profilácticos y/o terapéuticos (por ejemplo, como una terapia génica) , como se describe adicionalmente en las páginas 135 y 136 del documento WO 08/020079, y en las referencias adicionales citadas en WO 08/020079.
Para la expresión día ISV o Nanocuerpos en una célula, también se pueden expresar como los asi llamados "intracuerpos", como . se describe por ejemplo en los documentos WO 94/02610, WO 95/22618 y US-A-7004940 WO 03/014960; in Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag ; and in Kontermann, Métodos 34, (2004), 163-170.
Las secuencias de aminoácidos, ISV, Nanocuerpos y polipéptidos de la invención también se pueden producir por ejemplo en la leche de mamíferos transgénicos, por ejemplo en la leche de conejos, vacas, cabras u ovejas (véase por ejemplo US-A-6, 741 , 957 , US-A-6, 30 , 89 y US-A-6, 849, 992 para técnicas generales para introducir transgenes en mamíferos), en plantas o partes de plantas incluyendo pero no limitado a sus hojas, flores, frutas, semillas, raíces o tubérculos (por ejemplo en tabaco, maíz, soja o alfalfa) o en por ejemplo pupa del gusano de seda Bombix mori.
Adicionalmente, las secuencias de aminoácidos, ISV, Nanocuerpos y polipéptidos de la invención también se pueden expresar y/o producir en sistemas de expresión sin células, y ejemplos adecuados de tales, sistemas serán claros para la persona experta. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes incluyen expresión en el sistema de germen de trigo; en lisados de reticulocitos de conejo; o en el sistema E. coli Zubay. ' Como se menciona en lo anterior, una de las ventajas de uso de ISV o Nanocuerpos es que los polipéptidos basados en los mismos se pueden preparar a través de la expresión en un sistema bacteriano adecuado, y sistemas de expresión bacterianos adecuados, vectores, células hospederas, elementos reguladores, etcétera., serán claros para la persona experta, por ejemplo a partir de las referencias usadas en lo anterior. Sin embargo se debe observar que la invención en su sentido más amplio no se limita a la expresión de sistemas bacterianos.
De manera preferente, en la invención, se usa un sistema de expresión (in vivo o in vitro) , tal como un sistema de expresión bacteriano, que proporciona los polipéptidos de la invención en una forma que es adecuada para el uso farmacéutico, y tales sistemas de expresión nuevamente serán claros par la persona experta. Como también será claro para la persona experta, los polipéptidos de la invención adecuados para el uso farmacéutico se pueden preparar usando técnicas para síntesis de péptidos .
Para la producción a escala industrial, los hospederos heterólogos preferidos para la producción (industrial) de ISV's, Nanocuerpos o terapéuticos de proteína que contiene Nanocuerpos incluyen cepas de E. coli, Pichia pastoris , S. cerevisiae que son adecuadas para la expresión/producción/fermentación a gran escala, y en particular para expresión/producción/fermentación farmacéutica a gran escala (es decir, grado GMP) . Ejemplos adecuados de tales cepas serán claros para la persona experta. Tales cepas- y sistemas de producción/expresión también son disponibles por compañías tales como Biovitrum (Uppsala, Suiza) .
Alternativamente, las líneas de célula de mamífero, en particular células de ovario de hámster Chino (CHO) , se pueden usar para expresión/producción/fermentación, y en particular para expresión/producción/fermentación farmacéutica a gran escala. Nuevamente, tales sistemas de expresión/producción también se hacen disponibles por algunas de las compañías mencionadas en lo anterior.
La elección del sistema de expresión especifico dependería en parte en el requisito para ciertas modificaciones postraduccionales, ' más específicamente glicosilación. La producción de una proteína recombinante que contiene ISV o Nanocuerpo por el cual la glicosilación se desea o se requiere necesitaría el uso de hospederos de expresión de mamífero que tiene la capacidad de glicosilar la proteína expresada. En este aspecto, será claro para la persona experta que el patrón de glicosilación obtenida (es decir, la clase, número y posición de los residuos unidos) dependerá en la célula o línea de células que se usan para la expresión. De manera preferente, ya sea que se use una célula humana o una línea de células (es decir, conduciendo una proteína que tiene esencialmente un patrón de glicosilación humano) o se use otra línea de células de mamífero que pueda proporcionar un patrón de glicosilación que es esencialmente y/o funcionalmente el .mismo como la glicosilación humana o por lo menos imite la glicosilación humana. En general, las células procarióticas tales como E. coli no tienen la capacidad de glicosilar proteínas, y el uso de eucariotas inferiores tal como levadura conduce usualmente a un patrón de glicosilación que difiere de la glicosilación humana. No obstante, se debe entender que todas las células hospederas y sistemas de expresión anteriores se pueden usar en la invención dependiendo de la secuencia de aminoácidos deseada, e ISV, Nanocuerpo o polipéptido para ser obtenidos.
De esta manera, de acuerdo con un aspecto no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención se glicosila. De acuerdo con otro aspecto no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención no se glicosila.
De acuerdo con un aspecto preferido, pero no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención se produce en una célula bacteriana, en particular una célula bacteriana adecuada para la producción farmacéutica a gran escala, tales como células de las cepas mencionadas en lo anterior.
De acuerdo con otro aspecto preferido, pero no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención se produce en una célula de levadura, en particular una célula de levadura adecuada para producción farmacéutica á gran escala, tales como células de las especies mencionadas en lo anterior.
De acuerdo con todavía otro aspecto preferido pero no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de .la invención se produce en una célula de mamífero, en particular en una célula humana o una célula de una linea de -células humana, y más en particular en una célula humana o en una célula de una linea de células humanas que es adecuada para la producción farmacéutica a gran escala, tal como la linea de células mencionadas en este documento en lo anterior.
Como se describe adicionalmehte en las páginas 138 y 139 de WO 08/020079, cuando la expresión en una célula hospedera se usa para producir las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y los polipéptidos de la invención, las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden producir ya sea intracelularmente (por ejemplo, en el citosol, en el periplasma o en cuerpos de inclusión) y posteriormente se aisla de las células hospederas y se purifica adicionalmente de manera opcional; o se puede producir extracelularmente (por ejemplo, en el medio en el cual las células hospederas se cultivan) y posteriormente se aislan del medio de cultivo y se purifican adicionalmente de manera opcional. De esta manera, de acuerdo con un aspecto no limitante de la invención la secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención es una secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido que se ha producido intracelularmente y que se ha aislado de la célula hospedera y en particular de una célula bacteriana o de un cuerpo de inclusión en una célula bacteriana. De acuerdo con otro aspecto no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención es una secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido que se ha producido extracelularmente, y que se ha aislado del medio en el cual la célula hospedera se cultiva.
Algunos promotores preferidos, pero no limitantes para el uso con estas células hospederas incluyen aquellos mencionados en las páginas 139 y 140 del documento WO 08/020079.
Algunas secuencias secretoras preferidas, pero no limitantes para el uso con estas células hospederas incluyen aquellas mencionadas en la página 140 del documento WO 08/020079.
Técnicas adecuadas para transformar un hospedero o célula hospedera de la invención serán claras para la persona experta y pueden depender de la célula hospedera/organismo propuesto y el constructo genético que se usa. Se hace referencia nuevamente a los manuales y solicitudes de patentes mencionadas en lo anterior.
Después de la transformación, una etapa para detectar y seleccionar aquellas células hospederas u organismos hospederos que se han transformado exitosamente con la secuencia de nucleótidos/constructo genético de la invención se puede llevar a cabo. Esto puede por ejemplo ser una etapa de selección basada en un marcador seleccionable presente en el constructo genético de la invención o una etapa que implica la detección de la secuencia de aminoácidos de la invención, por ejemplo, usando anticuerpos específicos.
La célula hospedera transformada (que puede estar en la forma de una línea de células estables) u organismos hospederos (que pueden estar en la forma de una línea de mutantes estables o cepa) de aspectos adicionales de la presente invención.
De manera preferente, estas células hospederas u organismos hospederos son tales que expresan, o son capaces (por lo menos) de expresar (por ejemplo, bajo condiciones adecuadas), una secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención (y en caso de un organismo hospedero: en por lo menos una célula, parte, tejido u órgano del mismo) . La invención también incluye generaciones adicionales, progenie y/o descendientes de la célula hospedera u organismo hospedero de la invención, que por ejemplo se pueden obtener mediante división celular o mediante reproducción sexual o asexual.
Para producir/obtener expresión de las secuencias de aminoácidos de la invención, la célula hospedera transformada u organismo hospedero transformado se puede mantener en general, y/o cultivar bajo condiciones tales que la secuencia de aminoácidos (deseada) , ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención se expresa/produce. Condiciones adecuadas serán claras para la persona experta y dependerán usualmente de la célula hospedera/organismo hospedero usado, asi como también en los elementos reguladores que controlan la expresión de la secuencia de nucleótidos (relevante) de la invención. Nuevamente, se hace referencia a los manuales y solicitudes de patente mencionados en lo anterior en los párrafos de los constructos genéticos de la invención.
En general, las condiciones adecuadas pueden incluir el uso de un medio adecuado, la presencia de una fuente adecuada de alimento y/o nutrientes adecuados, el uso de una temperatura adecuada, y opcionalmente la presencia de un factor de inducción adecuado o compuesto (por ejemplo, cuando las secuencias de nucleótidos de la invención están bajo el control de un promotor inducible) ; todos de los cuales se pueden seleccionar por la persona experta. Nuevamente, bajo tales condiciones, las secuencias de aminoácidos de la invención se pueden expresar en una manera constitutiva, en una manera transiente, o solamente cuando se inducen adecuadamente.
También será claro para la persona experta que la secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención se pueden generar (primero) en una forma inmadura (como se menciona en lo anterior) , que posteriormente se puede someter a modificación post-traduccional , dependiendo de la célula hospedera/organismo hospedero usado. También, la secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención se pueden glicosilár, dependiendo nuevamente de la célula hospedera/organismo hospedero usado.
La secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención posteriormente se puede aislar de la célula hospedera/organismo hospedero y/o del medio en el cual la célula hospedera u organismo hospedero se cultivó, usando técnicas de aislamiento, y/o purificación de proteínas conocidas en sí, tal como cromatografía (preparativa) y/o técnicas de electroforesis , técnicas de precipitación diferencial, técnicas de afinidad (por ejemplo, usando una secuencia de aminoácidos escindible, específica fusionada con la secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención) y/o técnicas inmunológicas preparativas (es decir, usando anticuerpos contra la. secuencia de aminoácidos que se aisla ) .
En general, para uso farmacéutico, los polipéptidos de la invención se pueden formular como una preparación o composiciones farmacéuticas que comprenden por lo menos un polipéptido de la invención y por lo menos un portador, diluyente o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente uno o más de polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Por medio de ejemplos no limitantes, tal formulación puede estar en una forma adecuada para la administración oral, para administración parenteral (tal como por inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea o infusión intravenosa) , para administración tópica, para administración por inhalación, por un parche cutáneo, por un implante, por un supositorio, etcétera. Tales formas de administración adecuadas - que pueden ser sólidas,- semi-sólidas o liquidas, dependiendo de la manera de administración - asi como también métodos y portadores para- el uso en la preparación del mismo, será claro para la persona experta, y se describe adicionalmente en este documento.
De esta manera, en un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene por lo menos un aminoácido- de la invención, por lo menos un ISV de la invención, por lo menos un Nanocuerpo de la invención o por lo menos un polipéptido de la invención y por lo menos un portador, diluyente o excipiente adecuados (es decir, adecuados para el uso farmacéutico) , y opcionalmente una o más sustancias activas adicionales .
En general, las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden formular y administrar en cualquier manera adecuada conocida en si, por lo cual se hace la referencia por ejemplo a la técnica antecedente general citada en lo anterior (y en particular a los documentos WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041867 y WO 08/020079) asi como también a los manuales estándares, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 the Ed., Mack Publishing Company, EUA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams y Wilkins (2005); o el manual of Therapeutic Anticuerpos (S. Dubel, Ed. ) , Wiley, Weinheim, 2007 (véase por ejemplo las páginas 252-255) .
Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden formular y administrar en una manera conocida en si para anticuerpos convencionales y fragmentos de anticuerpos (incluyendo ScFv's y diacuerpos) y otras proteínas farmacéuticamente activas. Tales formulaciones y métodos para preparar los mismos serán claros para la persona experta, e incluyen por ejemplo preparaciones adecuadas para administración parenteral (por ejemplo administración intravenosa, intraperitoneal , subcutánea, intramuscular, intraluminal , intra-arterial o intratecal) o para administración tópica (es decir, transdérmica o intradérmica ) ..
Las preparaciones para la administración parenteral pueden ser por ejemplo soluciones estériles, suspensiones, dispersiones, o emulsiones que son adecuadas para infusión o inyección. Portadores o diluyentes adecuados para tales preparaciones incluyen por ejemplo, sin limitación, aquellos mencionados en la página 143 del documento WO 08/020079. Usualmente, las soluciones o suspensiones acuosas serán preferidas.
Las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y polipéptidos de la ' invención también se pueden administrar usando métodos de terapia génica de suministro. Véase por ejemplo, la patente de E.U.A No. 5,399,346, que se incorpora a manera de referencia en' su totalidad. Usando un método de terapia génica de suministro, las células primarias trans fectadas con el gen que codifica una secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención se pueden transfectar adicionalmente con promotores específicos de tejido a organismos específicos objetivo, tejido, injerto, tumores, o células y se pueden transfectar adicionalmente con secuencias señal y de estabilización para la expresión subcelularmente localizada.
De esta manera, la secuencia de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden administrar sistémicamente, por ejemplo, oralmente, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. También se pueden encerrar en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, se pueden comprimir en tabletas, o se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta del paciente. Para administración terapéutica oral, las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden combinar con uno o más excipientes y usar en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarbes, obleas, o similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener por lo menos 0.1% de la secuencia de aminoácidos, Nanocuerpo o polipéptido de la invención. Su porcentaje en las composiciones y preparaciones se puede, por supuesto, variar y puede convenientemente estar entre aproximadamente 2 a aproximadamente 60% del peso de una forma de dosificación unitaria dada. La cantidad de la secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención en tales composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá un nivel de dosificación efectivo.
Las tabletas, trociscos, pastillas, cápsulas, y similares también pueden contener aglutinantes, excipientes, agentes desintegrantes, lubricantes y agentes edulcorantes o saborizantes , por ejemplo aquellos mencionados en las páginas 143-144 del documento WO 08/020079. Cuando la forma de dosificación unitaria es una. cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador liquido, tal como un aceite vegetal o un polietilenglicol . Varios otros materiales pueden estar presentes como recubrimientos o para modificar de otra manera la forma física de la forma de dosificación unitaria sólida. Por ejemplo, las tabletas, pastillas, o cápsulas se pueden recubrir con gelatina, cera, goma laca o azúcar y similar. Un jarabe o elíxir puede contener la secuencia de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y polipéptidos de la invención, sacarosa o fructosa como un agente edulcorante, metilo y propilparabenos como conservadores, un tinte y saborizante tal como sabor de cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier forma de dosificación unitaria debe ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden incorporar en preparaciones y dispositivos de liberación sostenida.
Las preparaciones y formulaciones para la administración oral también se pueden proporcionar con un recubrimiento entérico que permitirá a los constructos de la invención resistir al entorno gástrico y pasar en los intestinos. Más en general, las preparaciones y formulaciones para la administración oral se pueden formular adecuadamente para el suministro en cualquier parte deseada del tracto gastrointestinal. Además, se pueden usar supositorios adecuados para el suministro en el tracto gastrointestinal.
Las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y polipéptidos de la invención también se pueden administrar intravenosa o intraperitonealmente mediante infusión o inyección, como se describe adicionalmente en las páginas 144 y 145 del documento WO 08/020079.
Para la administración tópica, las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden aplicar en forma pura, es decir, cuando son líquidos. Sin embargo, será en general deseable administrarlos a la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un portador dermatológicamente aceptable, que puede ser un sólido o un líquido, como se describe adicionalmente en la página 145 del documento WO 08/020079.
En general, la concentración de las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y polipéptidos de la invención en una composición liquida, tal como una loción, será de aproximadamente de 0.1-25% en peso, de manera preferente de aproximadamente 0.5-10% en peso. La concentración en una composición semi-sólida o sólida tal como un gel o un polvo será de aproximadamente 0.1-5% en peso, de manera preferente de aproximadamente 0.5-2.5% en peso.
La cantidad de la secuencia de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y polipéptidos de la invención requeridos para el uso en el tratamiento variará no solo con la secuencia de aminoácidos particular, ISV, Nanocuerpo o polipéptido seleccionados sino también con la vía de administración, el carácter de la condición que se trata y la edad y condición del paciente y será finalmente en la discreción del médico y especialista clínico que atiende. También la dosificación de las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y polipéptidos de la invención varía dependiendo de la célula objetivo, tumor, tejido, injerto u órgano.
La dosis deseada se puede presentar convenientemente en una sola dosis o como dosis dividida administrada en intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más sub-dosis al día. La sub-dosis misma se puede dividir adicionalmente por ejemplo, en un número de administraciones libremente espaciadas discretas; tales como inhalaciones múltiples de un insuflador o mediante la aplicación de una pluralidad de gotas .en los ojos.
Un régimen de administración podría incluir tratamiento diario, a largo plazo. Por "a largo plazo" se propone por lo menos dos semanas y de manera preferente varias semanas, meses, o años de duración. Las modificaciones necesarias en este intervalo de dosificación se pueden determinar por una persona de experiencia ordinaria en la técnica usando solo experimentación de rutina dada las enseñanzas en este documento. Véase Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co . , Easton, PA. La dosificación también se puede ajustar por el médico individual en caso de cualquier complicación.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para la prevención y/o tratamiento de por lo menos una variedad de cánceres, el método que comprende administrar, a un sujeto en necesidad del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un ISV de la invención, de un Nanocuerpo de la invención, de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende los mismos.
En el contexto de la presente invención, el término "prevención y/o tratamiento" no solo comprende prevenir y/o tratar la enfermedad, sino también comprende en general prevenir el inicio de la enfermedad, disminuir o revertir el progreso de la enfermedad, prevenir o disminuir el inicio de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, reducir y/o aliviar uno o más síntomas asociados con la enfermedad, reducir la gravedad y/o la duración de la enfermedad y/o de cualquier síntoma asociado con . la misma y/o prevenir un incremento adicional en la gravedad de la enfermedad y/o de cualquier síntoma asociado con la misma, prevenir o reducir o revertir cualquier daño fisiológico provocado por la enfermedad, y en general cualquier acción farmacológica que es benéfica al paciente que se. trata.
El sujeto que se trata puede ser cualquier animal de sangre caliente, pero es en particular un mamífero, y más en particular un ser humano. Como será claro para la persona experta, el sujeto que se trata será en particular una persona que sufre de, o en riesgo de, las enfermedades y trastornos mencionados en este documento.
La invención se refiere a un método para la prevención y/o tratamiento de por lo menos una enfermedad o trastorno que se asocia con HER.3, con su actividad biológica o farmacológica, y/o con las rutas biológicas o señalización en las cuales HER3 se · implica, el método que comprende administrar, a un sujeto en necesidad del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un ISV de la invención, de un Nanocuerpo de la invención, de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende la misma. En particular, la invención se refiere a un método para la prevención y/o tratamiento de por lo menos una enfermedad o trastorno que se puede tratar al modular HER3, su actividad biológica o farmacológica, y/o las rutas biológicas o señalización en las cuales HER3 se implica, el método que comprende administrar, a un sujéto en necesidad del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un ISV de la invención, de un Nanocuerpo de la invención, de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende la misma. En particular, la cantidad farmacéuticamente efectiva puede se runa cantidad que sea suficiente para modular HER3, su actividad biológica o farmacológica, y/o las rutas biológicas o señalización en las cuales HER3 se implica; y/o una cantidad que proporcione un nivel de la secuencia de aminoácidos de la invención, de un ISV de la invención, de un Nanocuerpo de la invención, de un polipéptido de la invención en la circulación que es suficiente para modular HER3, su actividad biológica o farmacológica, y/o las rutas biológicas o señalización en las cuales se implica el HER3-.
La invención se refiere adicionalmente a un método para la prevención y/o tratamiento de por lo menos una enfermedad o trastorno que se puede prevenir y/o tratar al administrar una secuencia de aminoácidos de la invención, de un ISV de la invención, a Nanocuerpo de la invención o un polipéptido de la invención a un paciente, el método que comprende administrar, a un sujeto en necesidad del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un ISV de la invención, de un Nanocuerpo de la invención, de un polipéptido de la invención, y/o de un composición farmacéutica que comprende la misma.
Más en particular, la invención se refiere a un método para la prevención y/o tratamiento de por lo menos una enfermedad o trastorno elegido del grupo que consiste de las enfermedades y trastornos listados en este documento, el método que comprende administrar, a un sujeto en necesidad del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un ISV de la invención, de un Nanocuerpo de la invención, de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende la misma.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para inmunoterapia , y en particular inmunoterapia pasiva, el método que comprende administrar, a un sujeto que sufre de o en riesgo de las enfermedades y trastornos mencionados en este documento, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un ISV de la invención, de un Nanocuerpo de la invención, de un polipéptido de la invención, ' y/o de una composición farmacéutica que comprende la misma.
En los métodos anteriores, las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprende los mismos se pueden administrar en cualquier manera adecuada, dependiendo de la formulación farmacéutica especifica o composición que se usa. De esta manera, las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprende los mismos se pueden administrar por ejemplo oralmente, intraperitonealmente (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscularmente, o a través de cualquier otra vía de administración que evite el tracto gastrointestinal), intranasalmente, transdérmicamente, tópicamente, por medio de un supositorio, mediante inhalación, nuevamente dependiendo de la formulación o composición farmacéutica especifica que se usa. El especialista clínico será capaz de seleccionar una vía de administración adecuada y una formulación o composición farmacéutica adecuada que se usa en tal administración, dependiendo de la enfermedad o trastorno que se previene o trata y otros factores bien conocidos por el especialista clínico.
Las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprende los mismos se administran de acuerdo con un régimen de tratamiento que es adecuado para prevenir y/o tratar la enfermedad o trastorno que se previene o trata. El especialista clínico en general será capaz de determinar un régimen de tratamiento adecuado, dependiendo de los factores tales como enfermedad o trastorno que se previenen o tratan, la gravedad de la enfermedad que se trata y/o la gravedad de los síntomas de la misma, la secuencia de aminoácidos específica, ISV, Nanocúerpo o polipéptido de la invención que se usa, la vía de administración específica y formulación o composición farmacéutica que se usa, la edad, género, peso, dieta, condición general del paciente, y factores similares bien conocidos por el especialista clínico.
En general, el régimen de tratamiento comprenderá la administración de una o más secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención, o de una o más composiciones que comprende la misma, en una o más cantidades o dosis farmacéuticamente efectivas. La cantidad (es) específica o dosis que se administran se pueden determinar por el especialista clínico, nuevamente con base en los factores citados en lo anterior.
En general, para la prevención y/o tratamiento de las enfermedades y trastornos mencionados en este documento y dependiendo de la enfermedad o trastorno específico que se trata, la potencia de la secuencia de aminoácidos específica, SV, Nanocuerpo y polipéptido de la invención que se usa, la vía de administración específica y la formulación o composición farmacéutica específica usada, las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se administrarán en general en una cantidad entre 1 gramo y 0.01 miligramos por kg de peso corporal al día, de manera preferente entre 0,1 gramo y 0.01 miligramo por kg de peso corporal por día, tal como aproximadamente 0.1, 1, 10, 100 o 1000 miligramos por kg de peso corporal por día, ya sea continuamente (por ejemplo, por infusión), como una sola dosis diaria o como múltiples dosis divididas durante el día. El especialista clínico será capaz en general de determinar una dosis diaria adecuada, dependiendo de los factores mencionados en este documento. También será claro que en los casos específicos, el especialista clínico puede elegir desviarse de estas cantidades, por ejemplo sobre la base de los factores citados en lo anterior y su juicio experto. En general, alguna guía en las cantidades que se administra se puede obtener de las cantidades administradas usualmente para anticuerpos convencionales comparables o fragmento de anticuerpo contra el mismo objetivo administrados a través de esencialmente la misma vía, · tomando en cuenta sin embargo diferentes en afinidad/avidez eficacia, biodistribución, vida media y factores similares bien conocidos por la persona experta.
Usualmente, en el método anterior, una sola secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención se usará. Sin embargo, está, dentro del alcance de la invención usar dos o más secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención en combinación.
Los ISV's, Nanocuerpos, secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención también se pueden usar en combinación con uno o más compuestos o principios farmacéuticamente activos, es decir como un régimen de tratamiento combinado, que puede o no conducir a un efecto sinérgico. Nuevamente, el especialista clínico será capaz de seleccionar tales compuestos o principios adicionales, así como también un régimen de tratamiento combinado adecuado, con base en los factores citados en lo anterior y en su juicio experto.
En particular, las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden usar en combinación con otros compuestos o principios farmacéuticamente activos que están o se pueden usar para la prevención y/o tratamiento de las enfermedades y trastornos citados en este documento, como resultado del cual un efecto sinérgico puede o no ser obtenido. Ejemplos de tales compuestos y principios, así como también vías, métodos y formulaciones o composiciones farmacéuticas para administrarlos serán claros para el experto clínico.
Cuando dos o más sustancias - o principios se van a usar como parte de un régimen de tratamiento combinado, se pueden administrar a través de la misma vía de administración o a través de vías diferentes de administración, esencialmente el mismo tiempo o en diferentes tiempos (por ejemplo, esencialmente de manera simultánea, consecutivamente, o de acuerdo con un régimen alternante) . Cuando las sustancias o principios se van a administrar simultáneamente a través de las mismas vías de administración, se pueden administrar como formulaciones o composiciones farmacéuticas diferentes o parte de una formulación o composición farmacéutica combinada, como será claro para la persona experta.
También, cuando dos o más sustancias o principios activos se van a usar como parte de un régimen de tratamiento combinado, cada una de las sustancias o principios se pueden administrar en la misma cantidad y de acuerdo con el mismo régimen como se usa cuando el compuesto o principio se usa en si, y tal uso combinado puede o no conducir a un efecto sinérgico. Sin embargo, cuando el uso combinado de las dos o más sustancias activas o principios conduce a un efecto sinérgico, también puede ser posible reducir la cantidad de uno, más o todo de las sustancias o principios que se administran, mientras que logra aún la acción terapéutica deseada. Esto puede ser útil por ejemplo para evitar, limitar o reducir cualquier efecto secundario indeseado que se asocia con el uso de una o más de las sustancias o principios cuando se usan en sus cantidades usuales, mientras que aún se obtiene el efecto farmacéutico o terapéutico deseado.
La efectividad del régimen de tratamiento usado de acuerdo con la invención se puede determinar y/o seguir de cualquier manera conocida en si para la enfermedad o trastorno implicado, como será claro para el experto clínico. El experto clínico también será capaz, donde sea apropiado y en una base de caso por caso, cambiar o modificar un régimen de tratamiento particular, para lograr el efecto terapéutico deseado, para evitar, limitar o reducir efectos secundarios indeseado, y/o para lograr un equilibrio apropiado entre lograr el efecto terapéutico ' deseado por una parte y evitar, limitar o reducir lós efectos secundarios indeseados por otra parte .
En general, el régimen de tratamiento se seguirá hasta que el efecto terapéutico deseado se logre y/o siempre y cuando el efecto terapéutico deseado se mantenga. Nuevamente, esto puede ser determinado por el experto clínico.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención en la preparación de una composición farmacéutica para prevención y/o tratamiento de por lo menos una variedad de cánceres; y/o para el uso en uno o más de los métodos de tratamiento mencionados en este documento.
El sujeto que se trata puede ser cualquier animal de sangre caliente, pero es en particular un mamífero, y más en particular un ser humano. Como será claro para la persona experta, el sujeto que se trata será en particular una persona que sufre de, o en riesgo de, las enfermedades y trastornos mencionados en este documento.
La invención también se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de por lo menos una enfermedad o trastorno que se puede prevenir y/o tratar al administrar una secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención a un paciente .
Más en particular, la invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos, ISV, Nanocuerpo o polipéptido de la invención en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o. tratamiento de una variedad de cánceres, y en particular para la prevención y tratamiento de una o más de las enfermedades y trastornos listados en este documento .
Nuevamente, en tal composición farmacéutica, la una o más secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos o polipéptidos de la invención también se pueden combinar adecuadamente con uno o más de' otros principios activos, tales como aquellos mencionados en este documento.
Finalmente, aunqué el uso de los ISV's o Nanocuerpo de la invención (como se define en este documento) y de los polipéptidos de la invención es muy preferido, será claro que sobre la base de la descripción en este documento, la persona experta también será capaz de diseñar y/o generar, en una manera análoga, otras secuencias de aminoácidos y en particular anticuerpos de dominio (individual) contra HER3, asi como también polipéptidos que comprenden tales anticuerpos de dominio (individual).
Por ejemplo, también será claro para la persona experta que puede ser posible "injertar" uno o más de las CDR's mencionadas en lo anterior para los Nanocuerpos de la invención sobre tales anticuerpos de dominio (individual) u otros andamios de proteina, incluyendo pero no limitado a andamios humanos o andamios no de inmunoglobulina . Los andamios adecuados y técnicas para tal injerto de CDR será claro para la persona experta y son bien conocidos en la técnica, véase por ejemplo aquellos mencionados en el documento WO 08/020079. Por ejemplo, las técnicas conocidas en si para injertar CDR's de ratón o rata en estructuras y andamios humanos se pueden usar en una manera análoga para proporcionar proteínas quiméricas que comprenden uno o más de las CDR's de los Nanocuerpos de la invención y uno o más de las regiones o secuencias de estructura humanas.
Se debe observar que, cuando los Nanocuerpos de la invención contienen uno o más de otras secuencias CDR que las secuencias CDR preferidas mencionadas en lo anterior, estas secuencias CDR se pueden obtener en cualquier manera conocida en sí, por ejemplo usando una o más de las técnicas descritas en el documento WO 08/020079.
Los usos adicionales de las secuencias de aminoácidos, ISV's, Nanocuerpos, · polipéptidos, ácidos nucleicos, constructos genéticos y hospederos y células hospederas de la invención serán claros para la persona experta con base en la descripción en este . documento. Por ejemplo, y sin limitación, las secuencias de aminoácidos de' la invención se pueden enlazar a un portador adecuado o soporte sólido para proporcionar un medio que se pueda usar de una manera conocida en si para purificar el HER3 de las composiciones y preparaciones que los comprenden. Los derivados de las secuencias de aminoácidos de la invención que comprenden una etiqueta detectable adecuada también se puede usar como marcadores para determinar (cualitativa o cuantitativamente) la presencia de HER3 en una composición o preparación o como un marcador para detectar selectivamente la presencia de HER3 sobre la superficie de' una célula o tejido. (Por ejemplo, en combinación con técnicas de clasificación de células adecuadas ) .
La invención ahora se describirá por medio de los siguientes aspectos, ejemplos y figuras preferidas no limitantes : Aspectos Preferidos : Aspecto A-l: Un dominio variable individual de inmunoglobulina que se dirige contra y/o que puede enlazarse específicamente a HER3.
Aspecto A-2 : Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con el Aspecto A-l, que está en forma esencialmente aislada.
Aspecto A-3: Un . dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con los Aspectos A-l o A-2, para la administración a. un sujeto, en donde el dominio variable individual de inmunoglobulina no se presenta naturalmente en el sujeto.
Aspecto A-4 : Un dominio variable individual de inmunoglobulina que puede enlazarse específicamente a HER3 con una constante de disociación (KD) de 1CT1 a 10"12 moles/litro o menos, ' y de manera preferente 10~7 a 10~12 moles/litro o menos y de manera más preferente 1CT8 a 10~12 moles/litro. Tal dominio variable individual de inmunoglobulina puede ser en particular un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores .
Aspecto A-5: Un dominio variable individual de inmunoglobulina que puede enlazarse específicamente a HER3 con una velocidad de asociación (velocidad de kon) de entre 102 M"1s"1 a aproximadamente 107 M_1s_1, de manera preferente entre 103 M"1s"1 y 107 M"1s"1, de manera más preferente entre 104 M^s-1 y 107 M_1s_1. Tal dominio variable individual de inmunoglobulina puede ser en particular un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores.
Aspecto A-6: Un dominio. variable individual de inmunoglobulina que puede enlazarse específicamente a HER3 con una velocidad de disociación (velocidad de koff) entre 1 s"1 y ÍO'V1 de manera preferente entre 102 s 1 y 106 s-i de manera más preferente entre 10"3 s 1 y 106 s -i tal como entre 10"" s"1 y 10"6 s-1. Tal dominio variable individual de inmunoglobulina puede ser en particular un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores .
Aspecto A-7 : Un dominio variable individual de inmunoglobulina que puede enlazarse específicamente a HER3 con una afinidad menor que 500 nM, de manera preferente menor que 200 nM, de manera más preferente menor que 10 nM, tal como menor que 1 nM . Tal dominio variable individual de inmunoglobulina puede ser en particular un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores.
Aspecto A-8 : Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, que es un dominio variable individual de inmunoglobulina de origen natural (de cualquier especie adecuada) o un dominio variable individual de inmunoglobulina sintético o semi-sintético .
Aspecto A-9: Uñ dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, que comprende un pliegue de inmunoglobulina o que bajo condiciones adecuadas es capaz de formar un pliegue de inmunoglobulina .
Aspecto A-10: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, que consiste esencialmente de 4 regiones de estructura (FR1 a FR4 respectivamente) y 3 regiones de terminación de complementariedad (CDRl a CDR3 respectivamente).
Aspecto A-ll: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, que es una secuencia de inmunoglobulina.
Aspecto A-12: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, que es una secuencia de inmunoglobulina de origen natural (de cualquier especie adecuada) o una secuencia de inmunoglobulina sintética o semi-sintética .
Aspecto A-13: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores que es una secuencia de inmunoglobulina humanizada, una secuencia de inmunoglobulina camelizada o una secuencia de inmunoglobulina que se ha obtenido mediante técnicas tal como maduración por afinidad.
Aspecto A-14: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, que consiste esencialmente de una secuencia de dominio variable de cadena ligera, (por ejemplo, una secuencia VL) ; o de una secuencia de dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia VH) .
Aspecto A-15: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, que consiste esencialmente de una secuencia de dominio variable de cadena pesada que se deriva de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional o que consiste esencialmente de una secuencia de dominio variable de cadena pesada que se deriva de un anticuerpo de cadena pesada.
Aspecto A-16: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, que consiste esencialmente de un anticuerpo de dominio (o un dominio variable individual de inmunoglobulina que es adecuado para el uso como un anticuerpo de dominio) , de un anticuerpo de dominio individual (o un dominio variable individual de inmunoglobulina que es adecuado para el uso como un anticuerpo de dominio individual) , de un "dAb" (o un dominio variable individual de inmunoglobulina que es adecuado para el uso como un dAb) o de un dominio variable individual (incluyendo pero no limitado a una secuencia VHH) · Aspecto A-17: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, que consiste esencialmente de un dominio variable individual de inmunoglobulina .
Aspecto A-18: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, que consiste esencialmente de un dominio variable individual de inmunoglobulina que tiene de manera preferente uno o más de los residuos de aminoácido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat elegida de los residuos distintivos mencionados en la Tabla B-2.
Aspecto A-19: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, que consiste esencialmente de un polipéptido que i) tiene por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ .ID NO's: 12 a 26, en los cuales para el propósito de determinar el grado de identidad de aminoácido, los residuos de aminoácido que forman las secuencias CDR se descartan; y en el cual: ii) de manera preferente uno o más de los residuos de aminoácido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla B-2.
Aspecto A-20: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, que consiste esencialmente de un dominio variable individual de inmunoglobulina que i) tiene por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO ' s : 12 a 26, en los cuales para el propósito de determinar el grado de identidad de aminoácido, los residuos de aminoácido que forman la secuencia CDR se descartan; y en los cuales: ii) de manera preferente uno o más de los residuos de aminoácido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla B-2.
Aspecto A-21: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, que consiste esencialmente de un dominio variable individual de inmunoglobulina optimizado con una secuencia humanizada o cualquier otra.
Aspecto A-22: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, que además de por lo menos un sitio de enlace para enlazarse contra/a HER3, contiene uno o más de sitios de enlace adicionales para enlazarse contra/a otros antigenos, proteínas u objetivos.
Aspecto B-l: Un dominio variable individual de inmunoglobulina que se dirige contra y/o que se puede enlazar específicamente a HER3, y que comprende uno o más estiramientos de residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste de: a) las secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 a 71; b) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80% de identidad de' aminoácido con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 a 71; c) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 a 71; d) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 a 101; e) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 a 101; f) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 a 101; g) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 a 131; h) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 a 131; i) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 a 131; o cualquier combinación adecuada de los mismos .
Tal dominio variable individual de inmunoglobulina puede ser en particular un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo, con cualquiera de los aspectos A-l a A-22.
Aspecto B-2 : Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con el Aspecto B-l, en el cual por lo menos uno de los estiramientos de residuos de aminoácido forma parte del sitio de enlace a antigeno para enlazarse contra /a HER3.
Aspecto B-3: Una . secuencia de dominio variable individual de inmunoglóbulina que se dirige contra y/o que se puede enlazar específicamente a HER3 y que comprende dos o más estiramientos de residuos de aminoácido elegido del grupo que consiste de: a) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 a 71; b) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80% de identidad de- aminoácido con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 a 71; c) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 una diferencia de aminoácido con por lo menos un de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 a 71; d) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 a 101; e) las secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 a 101; f) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 a 101; g) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO 1 s : 117 a 131; h) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 a 131; i) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 a 131; tal que (i) cuando el primer estiramiento de residuos de aminoácido corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b) o c) , el segundo estiramiento de los residuos- de aminoácido corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con el d) , e) , f ) , g) , h) o i); (ii) cuando el primer estiramiento de los residuos de aminoácido corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con el d) , e) o f ) , el segundo estiramiento de los residuos de aminoácido corresponde a uno de la secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b) , c) , g), h) o i); o (iii) cuando el primer estiramiento de los residuos de aminoácido corresponde. a una las secuencias de aminoácidos de . acuerdo con el g) , h) o i) , el segundo estiramiento de . los residuos de aminoácido que corresponde a una de las de secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b) , c) , d) , e) o f ) .
Tal dominio variable individual de inmunoglobulina puede ser en particular un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22, B-l o B-2.
Aspecto B- : Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con el Aspecto B-3, en el cual por lo menos dos estiramientos de los residuos de aminoácido forma parte del sitio de enlace a antigeno para enlazarse contra HER3.
Aspecto B-5: Una . secuencia de dominio variable individual de inmunoglobulina que se dirige contra y/o que se puede enlazar específicamente a HER3 y que comprende tres o más estiramientos de residuos de aminoácido, en los cuales el primer estiramiento de los residuos de aminoácido se seleccionan del grupo que consiste de: a) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 a 71; b) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 a 71; secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 57 a 71; el segundo estiramiento de los residuos de aminoácido se selecciona del grupo que consiste de: las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 a 101; secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 a 101; secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 una diferencia de aminoácido con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 87 a 101; y el tercer estiramiento de residuos de aminoácido se elige del grupo que consiste de: las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 a 131; secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 117 a 131; i) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO ' s : 117 a 131.
Tal dominio variable individual de inmunoglobulina puede ser en particular un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22 y/o B-l a B- 4.
Aspecto B-6: Un . dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con el Aspecto B-5, en el cual por lo menos tres estiramientos de los residuos de aminoácido forma parte del sitio de enlace a antigeno para enlazarse contra/a HER3.
Aspecto B-7 : ¦ Un dominio variable individual de inmunoglobulina que se dirige contra y/o que se puede enlazar específicamente a HER3 en el cual la secuencia CDR del dominio variable individual de inmunoglobulina tiene por lo menos 70% de identidad de aminoácido, de manera preferente por lo menos 80% de identidad de aminoácido, de manera más preferente por lo menos 90% de identidad de aminoácido, tal como 95% de identidad de aminoácido o más o aún esencialmente 100% de identidad de aminoácido con la secuencia CDR de por lo menos uno de los dominios variable individual de inmunoglobulinas de SEQ ID NO's: 12 a 26. Tal dominio variable individual de inmunoglobulina puede ser en particular un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22 y/o B-l a B-6.
Aspecto C-l: Un dominio variable individual de inmunoglobulina que se dirige contra HE 3 y que bloquea en forma cruzada el enlace de por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 12 a 26 a HER3. Tal dominio. variable individual de inmunoglobulina puede ser en particular un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los Aspectos A-l a A-22 y/o de acuerdo con el Aspectos B-l a B-7. También, de manera preferente, tal dominio variable individual de inmunoglobulina es capaz de enlazarse específicamente a HER3.
Aspecto C-2: Un dominio variable individual de inmunoglobulina que se dirige contra HER3 y que bloquea en forma cruzada el enlace a HE.R3 mediante por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 12 a 26. Tal dominio variable individual de inmunoglobulina puede ser en particular un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los Aspectos A-l a A-22 y/o de acuerdo con el Aspectos B-a a B-7. También, de manera preferente, tal dominio variable individual de inmunoglobulina es capaz de enlazarse específicamente a HER3.
Aspecto C-3: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos C-l o C-2, en donde la capacidad del dominio variable individual de inmunoglobulina para bloquear en forma cruzada o para ser bloqueado en forma cruzada se detecta en un ensayo de competición FACS, por ejemplo, como se describe en la parte experimental .
Aspecto C-4 : Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos C-a a C-3, en donde la capacidad del dominio variable individual de inmunoglobulina para bloquear en forma cruzada o para ser bloqueado en forma cruzada se detecta en un ensayo ELISA.
Aspecto D-l : Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-l a B-7 o C-l a C-4, que está en forma esencialmente aislada.
Aspecto D-2 : Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-l a B-7, C-l a C-4, y/o DI para la administración a un sujeto, en donde el dominio variable individual de inmunoglobulina no se presenta naturalmente en el sujeto.
Aspecto D-3: . Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-1 a B-7, C-l a C-4, y/o Di a: D-2 que puede enlazarse específicamente a HER3 con una constante de disociación (KD) de 10"5 a 10"12 moles/litro o menos, y de manera preferente 10" 7 a 10"12 moles/litro o menos y de manera más preferente 10"8 a 1CT12 moles/litro.
Aspecto D-4: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-1 a B-7, C-l a C-4, y/o D-l a D-3 que puede enlazarse específicamente a HER3 con una velocidad de asociación (velocidad de kon) de entre 102 M"1s~1 a aproximadamente 107 M" ^-1, de manera preferente entre 103 ^s"1 y 107 M^s-1, de manera más preferente entre 104 M^s-1 y 107 M"1s"1.
Aspecto D-5: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-1 a B-7, C-l a C-4, y/ó D-l a D-4 que puede enlazarse específicamente a HER3 con una velocidad de disociación (velocidad de koff) entre 1 s"1 y 10"6 s"1 de manera preferente entre 10"2 s"1 y 10"6 s"1, de manera más preferente entre 10"3 s" 1 y 10"6 s"1, tal como entre 10~4 s"1 y 10"6 s"1.
Aspecto D-6: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-1 a B-7, C-l a C-4, y/o D-l a D-5 que puede enlazarse específicamente a HER3 con una afinidad menor que 500 nM, de manera preferente menor que 100 nM, de manera más preferente menor que 10 nM, tal como menor que 1 nM.
Los dominios variables individuales de inmunoglobulina de acuerdo con los Aspectos D-l a D-6 puede ser en particular un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los Aspectos A-1 a A-22.
Aspecto E-1: Un . dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-1 a B-7, C-l a C-4 y/o 'DI a D-6, que es un dominio variable individual de inmunoglobulina de origen natural (de cualquier especie adecuada) o un dominio variable individual de inmunoglobulina sintético o semi-sintético .
Aspecto E-2 : Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-1 a B-7, C-l a C-4, Di a D-6, y/o E-1 que comprende un pliegue de inmunoglobulina o que bajo condiciones adecuadas es capaz de formar un pliegue de inmunoglobulina.
Aspecto E-3: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-1 a B-7, C-l a C-4, DI a D-6, y/o D-l o D-2, que es una secuencia de inmunoglobulina.
Aspecto E-4: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-1 a' B-7, C-l a C-4, DI a D-6, y/o E-l a E-3, que es una secuencia de inmunoglobulina de origen natural (de cualquier especie adecuada) o una secuencia de inmunoglobulina sintética o semi-sintética .
Aspecto E-5: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-1 a B-7, C-l a C-4, DI a D-6, y/o E-l a E-4 que es una secuencia de inmunoglobulina humanizada, una secuencia de inmunoglobulina camelizada o una secuencia de inmunoglobulina que se ha obtenido mediante técnicas tal como maduración por afinidad.
Aspecto E-6: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-1 a B-7, C-l a C-4, DI a D-6, y/o E-l a E-5 que consiste esencialmente de una secuencia de dominio variable de cadena ligera (por ejemplo, una secuencia VL) ; o de una secuencia de dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia VH) .
Aspecto E-7 : Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-1 a B-7, C-l a C-4, Di a D-6, y/o E-l a E-6, que consiste esencialmente de una secuencia de dominio variable de cadena individual de cadena pesada que se deriva de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional o que consiste esencialmente de una secuencia de dominio variable de cadena pesada que se deriva de un anticuerpo de cadena pesada.
Aspecto E-8 : Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-1 a B-7, C-l a C-4, DI a D-6, y/o E-l a E-7, que consiste esencialmente de un anticuerpo de dominio (o un dominio variable individual de inmunoglobulina que es adecuado para el uso como un anticuerpo de dominio) , de un anticuerpo de dominio individual (o un dominio variable individual de inmunoglobulina que es adecuado para el uso como un anticuerpo de dominio individual)-, de un "dAb" (o un dominio variable individual de inmunoglobulina que es adecuado para el uso como un dAb) o de un dominio variable individual de inmunoglobulina (incluyendo pero no limitado a una secuencia VHH) .
Aspecto E-9: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-1 a B-7, C-l a C-4, DI a D-6, y/o E-l a E-8 que consiste esencialmente de un VHH O VHH diseñado.
Aspecto E-10: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-1 a B-7, C-l a C-4, DI a D-6, y/o E-l a E-9 que consiste esencialmente de un VHH o VHH diseñado que tiene de manera preferente uno o más de los residuos de aminoácido en las posiciones 11, 37, 44, 45, .47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla B-2.
Aspecto E-ll: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-1 a B-7, C-l a C-4, DI a ¦ D-6, y/o E-l a E-10, que consiste esencialmente de un VHH O VHH diseñado que i) tiene por lo' menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 12 a 26, en los cuales para los propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácidos, los residuos de aminoácido que forman la secuencia CDR se descartan'; y en los cuales ii) de manera preferente uno o más de los residuos de aminoácido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, .104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla B-2.
Aspecto E-12: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos B-1 a B-7, C-l a C-4, DI a D-6, y/o E-l a E-ll que consiste esencialmente de un VHH O VHH diseñado.
Aspecto E-13: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los Aspectos B-1 a B-7, C-l a C-4, DI a D-6, y/o E-l- a E-ll, que además de por lo menos un estiramiento de los residuos de aminoácido o sitio de enlace para el en lace formado por la secuencia CDR, contiene uno o más sitios de enlace adicionales para el enlace contra los antígenos, proteínas u objetivos.
Los dominios variables individuales de inmunoglobulina de acuerdo con los Aspectos E-l a E-13 pueden ser en particular un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los Aspectos A-l a A-22.
Aspecto F-l: Un dominio variable individual de inmunoglobulina que consiste, esencialmente de 4 regiones de estructura (FR1 a . FR4 , respectivamente) y 3 regiones de terminación de complementariedad (CDRl a CDR3, respectivamente), en las cuales: CDRl se elige del grupo que consiste de: a) los dominios- variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO ' s : 57 a 71; b) dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulinas de SEQ ID NO' s: 57 a 71; dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO 1 s : 57 a 71; y/o CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 87 a 101; los dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 87 a 101; los dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 87 a 101; y/o CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: los dominios variables individuales inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 117 a 131; h) los dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 117 a 131; i) los dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 117 a 131.
Tal dominio variable individual de inmunoglobulina se dirige de manera preferente contra HER3 y/o un dominio variable individual dé inmunoglobulina que puede enlazarse específicamente a HER3. También, tal dominio variable individual de inmunoglobulina es de manera preferente un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los Aspectos A-l a A-22, C-l a C-4, DI a D-6 y/o E-l a E-13.
Aspecto F-2 : Un dominio variable individual de inmunoglobulina que consiste esencialmente de 4 regiones de estructura (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones de terminación de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en los cuales: CDR1 se selecciona del grupo que consiste de: a) los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 57 a 71; b) los dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO' s : 57 a 71; c) los dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 57 a 71; y - CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: d) los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 87 a 101; e) los dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 87 a 101; f) los dominios variables individuales de inmunoglobulina. que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 87 a 101; y CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: g) los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 117 a 131; h) los dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 117 a 131; i) los dominios ' variables individuales de inmunoglobulina que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 117 a 131.
Tal dominio variable individual de inmunoglobulina se dirige de manera preferente contra HER3 y/o un dominio variable individual de inmunoglobulina que puede enlazarse específicamente a HER3. También, tal dominio variable individual de inmunoglobulina e.s de manera preferente un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los Aspectos A-l a A-22, C-l a C-4, DI a D-6 y/o E-l a E-13.
Aspecto F-3: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 y F-2, en los cuales las secuencias CDR del dominio variable individual de inmunoglobulina tiene por lo menos 70% de identidad de aminoácido, de manera preferente por lo menos 80% de identidad de aminoácido, de manera más preferente por lo menos 90% de identidad de aminoácido, tal como 95% de identidad de aminoácido o más o aún esencialmente 100% de identidad de aminoácido con las secuencias CDR de por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO'.s: 12 a 26.
Tal dominio variable individual de inmunoglobulina se dirige de manera preferente contra HER3 y/o un dominio variable individual de inmunoglobulina que puede enlazarse específicamente a HER3. También, tal dominio variable individual de inmunoglobulina es de manera preferente un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los Aspectos A-l a A-22, C-l a C-4, DI a D-6 y/o E-l a E-13.
Aspecto F-4: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 ato F-3 que se dirige contra HER3 y que bloquea en forma cruzada el enlace de por lo menos uno de los dominios variables individuales dé inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 12 a 26.
Aspecto F-5: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 a F-3 que se dirige contra HER3 y que se bloquea en forma cruzada de HER3 mediante por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 12 a 26.
Aspecto F-6: .Dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-4 o F-5 en donde la capacidad del dominio variable individual de inmunoglobulina para bloquear en forma cruzada o ser bloqueado en forma cruzada se detecta en un ensayo de competición FACS como se muestra por ejemplo en la parte experimental .
Aspecto F-7 : . Dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F4 o F-5 en donde la capacidad del dominio variable individual de inmunoglobulina para bloquear en forma cruzada o ser bloqueado en forma cruzada se detecta en un ensayo ELISA.
Aspecto F-8: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 a F-7, que está en forma esencialmente aislada. 4 i 8 Aspecto F-9: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 a F-8, para la administración a un sujeto, en donde el dominio variable individual de inmunoglobulina no se presenta naturalmente en el sujeto.
Aspecto F-10: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 a F-9, que puede enlazarse específicamente a HER3 con una constante de disociación' (KD) de 10"5 a 10~12 moles/litro o menos, y de manera preferente de 10"1 a 10"12 moles/litro o menos y de manera más preferente 10"8 a 1CT12 moles/litro.
Aspecto F-ll: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 a F-10, que puede enlazarse específicamente a HER3 con una velocidad de asociación (velocidad de kon) de entre 102 M"1s"1 a aproximadamente 107 M_1s_1, de manera preferente entre 103 M" 1s~1 y 107 M"1s"1, de manera más preferente entre 104 M"1s"1 y 107 M'V1, tal como entre 105 M^s"1 y 107 M_1s_1.
Aspecto F-12: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 a F-ll, que puede enlazarse específicamente a HER3 con una velocidad de disociación (velocidad de k0ff) entre 1 s"1 y 10"6 s"1 de manera preferente entre 10"2 s"1 y 10"5 s-1, de manera más preferente entre 10"3 s"1 y 10"6 s"1, tal como entre 10~4 s_1 y 10"6 s"1.
Aspecto F-13: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 a F-12, que puede enlazarse específicamente a HER3 con una afinidad menor que 500 nM, de manera preferente menor que 200 nM, de manera más preferente menor que 10 nM, tal como menor que 1 nM.
Aspecto F-14: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 a F-13, que es un dominio variable individual de inmunoglobulina de origen natural (de cualquier especie adecuada) o un dominio variable individual de inmunoglobulina sintético o semi-sintético.
Aspecto F-15: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 a F-14, que comprende un pliegue de inmunoglobulina o que bajo condiciones adecuadas es capaz de formar un pliegue de inmunoglobulina.
Aspecto F-16: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdó con cualquiera de los aspectos F-1 a F-15, que es una secuencia de inmunoglobulina.
Aspecto F-17: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 a F-16, que es una secuencia de inmunoglobulina de origen natural (de cualquier especie adecuada) o una secuencia de inmunoglobulina sintética o semi-sintética .
Aspecto F-18: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 a F-17, que es una secuencia de inmunoglobulina humanizada, una secuencia de inmunoglobulina camelizada o una secuencia de inmunoglobulina que se ha obtenido mediante técnicas tal como maduración por afinidad.
Aspecto F-19: Un dominio .variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 a F-19, que consiste esencialmente de una secuencia de dominio variable de cadena ligera (por ejemplo, una secuencia VL) ; o de una secuencia de dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia VR) .
Aspecto F-20: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 a F-19, que consiste esencialmente de una secuencia de dominio variable de cadena pesada que se deriva de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional o que consiste esencialmente de una secuencia de dominio variable de cadena pesada que se deriva de un anticuerpo de cadena pesada.
Aspecto F-21: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 a F-20, que consiste esencialmente de un anticuerpo de dominio (o un dominio variable individual de inmunoglobulina que es adecuado para el uso como un anticuerpo de dominio) , de un anticuerpo de dominio individual (o un dominio variable individual de inmunoglobulina que es adecuado para el uso como un anticuerpo de dominio individual) , de un "dAb" (o un dominio variable individual de inmunoglobulina que es adecuado para el uso como un dAb) o de un VHH O VHH diseñado.
Aspecto F-22: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 a F-21, que consiste esencialmente de un VHH O VHH diseñado.
Aspecto F-23: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 a F-22, que consiste esencialmente de un VHH o VHH diseñado que tiene de manera preferente uno o más de los residuos de aminoácido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla B-2.
Aspecto F-24: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos F-1 a F-23, que consiste esencialmente de un dominio variable individual de inmunoglobulina que i) tiene por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO 1 s : 12 a 26, en los cuales para los propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácido, los residuos de aminoácido que forman la secuencia CDR se descartan; y en los cuales: ii) de manera preferente uno o más de los residuos de aminoácido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla B-2.
Aspecto F-25: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo, con cualquiera de los aspectos F-1 a F-24, que consiste- esencialmente de una secuencia VHH optimizada .
Aspecto G-l: Un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, que además de por lo menos un sitio de enlace para el enlace formado por la secuencia CDR, contiene uno o más sitios de enlace adicionales para enlazarse contra otro antigeno, proteina u objetivo..
Aspecto H-l: VHH que se dirige contra y/o que puede enlazarse específicamente a HER3.
Aspecto H-2: VHH de acuerdo con el Aspecto H-l, que está en forma esencialmente aislada.
Aspecto H-3: VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-2, que puede enlazarse específicamente a HER3 con una constante de disociación (KD) de 10"5 a 10"12 moles/litro o menos, y de manera preferente de 10~7 a 10"12 moles/litro o menos y de manera más preferente de 10"8 a 1CT12 moles/litro.
Aspecto H-4 : VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-3, que puede enlazarse específicamente a HER3 con una velocidad de asociación (velocidad de kon) de entre 102 M"1s"1 a aproximadamente 107 M"1s"1, de manera preferente entre 103 M"1s"1 y 107 "1s~1, de manera más preferente entre 104 M"1s"1 y 107 M"1s"1.
Aspecto H-5: VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-4, que puede enlazarse específicamente a HER3 con una velocidad de disociación (velocidad de k0ff) entre 1 s"1 y 10~ss"1, de manera preferente entre 1CT2 s"1 y 10~° s"1, de manera más preferente entre 10"3 s"1 y 10"6 s-1, tal como entre 10"4 s"1 y 10"6 s"1.
Aspecto H-6: VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-5, que puede enlazarse específicamente a HER3 con una afinidad menor que 500 nM, de manera preferente menor que 200 nM, de manera más preferente menor que 10 nM, tal como menor que 500 pM.
Aspecto H-7 : VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-6, que es un VHH de origen natural de (de por ejemplo, una llama) o VHH sintético o semi-sintético .
Aspecto H-8: VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos a H-l a H-7, que es una secuencia VHH, una secuencia VHH parcialmente humanizada, una secuencia VHH completamente humanizada, un dominio variable de cadena pesada camelizado o un VHH que se ha obtenido mediante técnicas tal como maduración por afinidad.
Aspecto H-9: VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-8, que tiene de manera preferente uno o más de los residuos de aminoácido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103-, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla B-2.
Aspecto H-10: VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-9, que i) tiene por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO 1 s : 12 a 26, en los cuales para propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácido, los residuos de aminoácido . que forman la secuencia CDR se descartan; y en los cuales: ii) de manera preferente uno o más de los residuos de aminoácido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla B-2.
Aspecto H-ll: VHH de acuerdo con cualquiera de los ectos H-l a H-10, en que: CDR1 se selecciona del grupo que consiste de: a) los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 57 a 71; b) dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 57 a 71; c) los dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 57 a 71; y/o CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 87 a 101; los dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables · individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 87 a 101; los dominios variables individuales de inmunoglobulinas que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 87 a 101; CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 117 a 131; los dominios variables individuales de inmunoglobulinas que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 117 a 131; los dominios variables individual de inmunoglobulina que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 117 a 131.
Aspecto H-12: VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l 'a H-ll, en los cuales: CDR1 se selecciona del grupo que consiste de: a) los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 57 a 71; b) los dominios variables individual de inmunoglobulina que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 57 a 71; c) los dominios variables individual de inmunoglobulina que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 57 a 71; y CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: d) los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 87 a 101; e) los dominios variables individual de inmunoglobulina que tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido- con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO ' s : 87 a 101; los dominios variables individual de inmunoglobulina que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 87 a 101; CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 117 a 131; los dominios variables individual de inmunoglobulina que. tienen por lo menos 80% de identidad de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 117 a 131; los dominios variables individual de inmunoglobulina que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 117 a 131. cto H-13: VHH de acuerdo con cualquiera de los H-l a H-12, en los cuales las secuencias CDR tienen por lo menos 70% de · identidad de aminoácido, de manera preferente por lo menos 80% de identidad de aminoácido, de manera más preferente por lo menos 90% de identidad de aminoácido, tal como 95% de identidad de aminoácido o más o aún esencialmente 100% de identidad de aminoácido con las secuencias CDR de por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO 1 s : 12 a 26.
Aspecto H-14: VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-13, que es un VHH parcialmente humanizado.
Aspecto H-15: VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-14, que es un ' VHH completamente humanizado.
Aspecto H-16: VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-15, que se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 12 a 26 o del grupo que consiste de los dominios variables individual de inmunoglobulina que tienen más de 80%, de manera preferente más de 90%, de manera más preferente más de 95%, tal como 99% o más identidad de secuencia (como se define en este documento) con por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 12 a 26. ' Aspecto H-17: VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-16, que es un VHH humanizado.
Aspecto H-18: VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-17, que se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO ' s : 12 a 26.
Aspecto H-19: VHH dirigido contra HER3 que bloquea en forma cruzada el enlace de por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 12 a 26 a HER3.
Aspecto H-20: VHH dirigido contra HER3 que se bloquea en forma cruzada del enlace a HER3 mediante por lo menos uno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 12 a 26.
Aspecto H-21: VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-19 o H-20 ¦ en donde la capacidad del VHH para bloquear en forma cruzada o para ser bloqueado en forma cruzada se detecta en un ensayo de competición FACS, por ejemplo, como se describe en la parte experimental.
Aspecto H-22: VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-19 a H-21 en donde la capacidad del VHH para bloquear en forma cruzada o para ser bloqueado en forma cruzada se detecta en ün ensayo ELISA.
Aspecto K-l: Polipéptido que comprende o consiste esencialmente de uno o más dominios variables individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-1 a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25, G-l y/o uno o más VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22, y comprende adicionalmente de manera opcional uno o más ligaduras peptidicos y/o uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace.
Aspecto K-2: Polipéptido de acuerdo con el Aspecto -l, en el cual la una o más unidades de enlace son secuencias de inmunoglobulina, y en particular ISV's.
Aspecto K-3: Polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l o K-2, en los cuales el uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace se eligen del grupo que consiste de anticuerpos de dominio, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un anticuerpo de dominio, anticuerpos de dominio individual, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un anticuerpo de dominio individual, "dAb"'s, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un dAb, o VHHs .
Aspecto K-4: Polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-3, en los cuales el uno o más dominios variables individuales de inmunoglobulina de la invención son secuencias de inmunoglobulina.
Aspecto K-5: Polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-4, en los cuales uno o más dominios variables individuales de inmuno-globulina de la invención se eligen del grupo que consiste de · anticuerpos de dominio, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso · como un anticuerpo de dominio, anticuerpos de dominio individual, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un anticuerpo de dominio individual, "dAb"'s, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un dAb, o VHHs .
Aspecto K-6: Polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-5, que comprende o consiste esencialmente de uno o ¦ más Nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22 y en los cuales una o más de otras unidades de enlace son Nanocuerpos .
Aspecto K-7: Polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-6, en donde por lo menos una unidad de enlace es un constructo multivalente .
Aspecto K-8: Polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-7, en donde por lo menos una unidad de enlace es un constructo de multiparatópico .
Aspecto K-9: Polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-8, en donde por lo menos una unidad de enlace es un constructo multiespecifico .
Aspecto K-10: Polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-9, que tiene una vida media incrementada, comparado con el dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-1 a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l en si o VHH de acuerdo con · cualquiera de los aspectos H-l a H-22 en si, respectivamente.
Aspecto K-ll: Polipéptido de acuerdo con el Aspecto K-10, en que la una o más de otras unidades de enlace proporcionan el polipéptido con vida media incrementada, comparado con el dominio variable individual de inmunoglobulina correspondiente de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-1 a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l en si o VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22 en si, respectivamente.
Aspecto K-12: Polipéptido de acuerdo con el Aspecto K-10 o K-ll, en los cuales la una o más de otras unidades de enlace que proporciona el polipéptido con vida media incrementada se elige del grupo que consiste de proteínas en suero o fragmentos de las mismas, unidades de enlace que se pueden enlazar a proteínas en suero, y porción Fe, y proteínas o péptidos pequeños que se pueden enlazar a las proteínas en suero.
Aspecto K-13: Polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-10 a K-12, en los cuales la uno o más de otras unidades de enlace que proporcionan el polipéptido con vida media incrementada se eligen del grupo que consiste de albúmina de suero humano o fragmentos de la misma.
Aspecto K-14: Polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-10 a K-13, en los cuales la una o más de otras unidades de enlace que proporciona el polipéptido con vida media incrementada se eligen del grupo que consiste de unidades de enlace que se pueden enlazar a la albúmina de suero (tal como albúmina de suero humano) o una inmunoglobulina en suero (tal como IgG) .
Aspecto K-15: Polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-10 a K-14, la una- o más de otras unidades de enlace que proporcionan . el polipéptido con vida media incrementada se eligen' del grupo que consiste de anticuerpos de dominio, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un anticuerpo de dominio, anticuerpos de dominio individual, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un anticuerpo de dominio individual, "dAb"'s , dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un dAb, o VHHs que se pueden enlazar a una albúmina de suero (tal como albúmina de suero humano) o una inmunoglobulina en suero (tal como IgG) .
Aspecto K-16: Polipéptido de acuerdo con el Aspecto K-10 a K-15, en los cuales la una o más de otras unidades de enlace que proporcionan el polipéptido con vida media incrementada es un VHH que se pueden enlazar a la albúmina de suero (tal como albúmina de suero humano) o una inmunoglobulina en suero (tal como IgG) .
Aspecto K-17: Polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-10 a K-16, que tienen la vida media en suero que es por lo menos 1.5 veces, de manera preferente por lo menos 2 veces, tal como por lo menos 5 veces, por ejemplo por lo menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la vida media de el dominio variable individual de inmunoglobulina correspondiente de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-1 a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l en si o un VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22 en si, respectivamente.
Aspecto K-18: Polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-10 a K-17, que tienen una vida media en suero que se incrementa con más de 1 hora, de manera preferente más de 2 horas, de manera más preferente más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o aún más de 24, 48 o 72 horas, comparado con el dominio variable individual de inmunoglobulina correspondiente de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-1 a A-22, B-l a B-7, C-r a C- 4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l en si o un VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22 en si, respectivamente.
Aspecto K-19: Polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-18, que tiene una vida media en suero en un humano de por lo menos aproximadamente 12 horas, de manera preferente por lo menos 24 horas, de manera más preferente por lo menos 48 horas, de manera aún más preferente por lo menos 72 horas o más; por ejemplo, de por lo menos 5 días (tal como aproximadamente 5 a 10 días), de manera preferente por lo menos 9 días (tal como aproximadamente 9 a 14 días) , de manera más preferente por lo menos aproximadamente 10 días (tal como aproximadamente 10 a 15 días), o por lo menos aproximadamente 11 días (tal como aproximadamente 11 a 16 días), de manera más preferente por lo menos aproximadamente 12 días (tal como aproximadamente 12 a 18 días o más) , o más de 14 días (tal como aproximadamente 14 a 19 días) .
Aspecto L-l: Compuesto o constructo, que comprende o consiste esencialmente de uno o más dominios variables individuales de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-1 a A-22, B-l a. B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l y/o uno o más VHHs de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22, y comprende opcionalmente además uno o más de otro grupos, residuos, porciones o unidades de enlace, enlazados opcionalmente a través de uno o más ligaduras.
Aspecto L-2: Compuesto o constructo de acuerdo con el aspecto L-l, en el cual el uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace son dominios variables individuales de inmunoglobulina.
Aspecto L-3: Compuesto o constructo de acuerdo con los aspectos L-l o L-2, en los cuales el uno o más ligaduras, si están presentes, son uno o más de dominios variables individuales de inmunoglobulina .
Aspecto L-4: Compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-l a L-3, en los cuales el uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace son secuencias de inmunoglobulina.
Aspecto L-5: Compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-l a L-4, en los cuales el uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace se eligen del grupo que consiste de anticuerpos de dominio, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un anticuerpo de dominio, anticuerpos de dominio individual, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un anticuerpo de dominio individual, "dAb"'s, dominios variables individuales de' inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un dAb, o VHHs .
Aspecto L-6: Compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-1 a L-5, en los cuales el uno o más dominios variables, individuales de inmunoglobulina de la invención son secuencias de inmunoglobulina.
Aspecto L-7 : Compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-1 a L-6, en los cuales el uno o más dominios variables individuales de inmunoglobulina de la invención se eligen del grupo que consiste de anticuerpos de dominio, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un anticuerpo de dominio, anticuerpos de dominio individual, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un anticuerpo de dominio- individual, "dAb"'s, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un dAb, o VHHs.
Aspecto L-8: Compuesto o constructo, que comprende o consiste esencialmente de un.o o más VHH ' s o Nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22 y en los cuales el uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace son VHHs .
Aspecto L-9: Compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-l a L-8, que es un constructo multivalente .
¦ Aspecto L-10: Compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-l a L-9, es un constructo multiespecifico .
Aspecto L-ll: Compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-l a L-10, que tiene una vida media incrementada, comparado con el dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-1 a A-22, B-l a B-7, C-l a C- 4, D-l a D-6, E-1 a E-13, F-l a F-25 o G-l en si o VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-1 a H-22 en si, respectivamente.
Aspecto L-12: Compuesto o constructo de acuerdo con el Aspecto L-l a L-ll, en los cuales el uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace proporcionan el compuesto o constructo con vida media incrementada, comparado con el dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-1 a A-22, B-l a B-7, C~l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l en sí o VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-1 a H-22 en sí, respectivamente.
Aspecto L-13: Compuesto o constructo de acuerdo con el Aspecto L-12, en los cuales el uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace que proporcionan el compuesto o constructo con vida media incrementada se selecciona del grupo que consiste de proteínas en suero o fragmentos de las mismas,' unidades de enlace que se pueden enlazar a proteínas en suero, una porción Fe, y proteínas o péptidos pequeños que se pueden enlazar a proteínas en suero .
Aspecto L-14: Compuesto o constructo de acuerdo con el Aspecto L-12 o L-13, en los cuales el uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace que proporcionan el compuesto o constructo con vida media incrementada se selecciona del grupo que consiste de albúmina de suero humano o fragmentos de la misma.
Aspecto L-15: Compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-12 a L-14, en los cuales el uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace que proporcionan el compuesto o constructo con vida media incrementada se eligen del grupo que consiste de unidades de enlace que se pueden enlazar a una albúmina de suero (tal como albúmina de suero humano) o una inmunoglobulina en suero (tal como IgG) .
Aspecto L-16: Compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-12 a L-14, en los cuales el uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace que proporcionan el compuesto o constructo con vida media incrementada se eligen del grupo que consiste de anticuerpos de dominio, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un anticuerpo de dominio, anticuerpos de dominio individual, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un anticuerpo de dominio individual, "dAb"'s, dominio variable individual de inmunoglobulinas que son adecuados para el uso como un dAb, o VHHs que se pueden enlazar a una albúmina de suero (tal como albúmina de suero humano) o una inmunoglobulina en suero (tal como IgG) .
Aspecto L-17: ' Compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-12 a L-14, en los cuales el uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace que proporcionan él compuesto o constructo con vida media incrementada es un VHH que se pueden enlazar a una albúmina de suero (tal como albúmina de suero humano) o una inmunoglobulina en suero (tal como IgG) .
Aspecto L-18: Compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-12 a L-17, que tiene una vida media en suero que es por lo menos 1.5 veces, de manera preferente por lo menos 2 veces, tal como por lo menos 5 veces, por ejemplo por lo menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la vida media del dominio variable individual de inmunoglobulina correspondiente de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-1 a E-13, F-l a F-25 o G-l en sí o VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22 en si, respectivamente.
Aspecto L-19: Compuesto o constructo de acuerdo' con cualquiera de los aspectos L-12 a L-18, que tiene una vida media en suero que se incrementa con más de 1 hora, de manera preferente más de 2 horas, de manera más preferente más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o aún más de 24, 48 o 72 horas, comparado con el dominio variable individual de inmunoglobulina correspondiente de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l en sí o VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22 en sí, respectivamente .
Aspecto L-20: Compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-12 a L-19, que tiene una vida media en suero en un humano de por lo menos aproximadamente 12 horas, de manera preferente por lo menos 24 horas, de manera más preferente por lo menos 48 horas, de manera aún más preferente por lo menos 72 horas o más; por ejemplo, de por lo menos 5 días (tal como aproximadamente 5 a 10 días), de manera preferente por lo menos 9 días (tal como aproximadamente 9 a 14 días) , de manera más preferente por lo menos aproximadamente 10 días (tal como aproximadamente 10 a 15 días), o por lo menos aproximadamente 11 días (tal como aproximadamente 11 a 16 días), de manera más preferente por lo menos aproximadamente 12 días (tal como aproximadamente 12 a 18 días o más) o más de 14 días (tal como aproximadamente 14 a 19 días) .
Aspecto L-21: Constructo monovalente, que comprende o consiste esencialmente de un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l y/o un VHH de . acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22.
Aspecto L-22 : Constructo monovalente de acuerdo con el Aspecto L-21, en el cual dominio variable individual de inmunoglobulina de la invención se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos de dominio, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un anticuerpo de dominio, anticuerpos de dominio individual, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un anticuerpo de dominio individual, "dAb"'s, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para el uso como un dAb, o VHHs.
Aspecto L-23: Constructo monovalente, que comprende o consiste esencialmente de un VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22.
Aspecto M-l: Secuencia de ácidos nucleicos o nucleótidos, que codifica un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-1 a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l, un VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H- 1 a H-22, a compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos que es tal que se puede obtener mediante la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos o nucleótidos que codifican el mismo; por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos o nucleótidos que tiene por lo menos 70% identidad de secuencia, de manera preferente por lo menos 80% identidad de secuencia, de manera más preferente por lo menos 90% identidad de secuencia, tal como 95% identidad de secuencia o más o aún esencialmente 100% identidad de secuencia con las secuencias de por lo menos una de las secuencias de ácidos nucleicos o nucleótidos de SEQ ID NO's: 27 a 41.
Aspecto M-2 : Secuencia de ácidos nucleicos o nucleótidos de acuerdo con el aspecto M-l, que está en la forma de un constructo genético.
Aspecto N-l: Hospedero o célula hospedera que expresa, o que bajo circunstancias adecuadas es capaz de expresar, un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l, un VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22, un polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-19, un compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-l a L-21 que es tal que se puede obtener mediante la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos o nucleótidos que codifican el mismo, o un constructo monovalente de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-22 o L-23; y/o que comprende a secuencia de ácidos nucleicos o nucleótidos de acuerdo con el Aspecto M-l o un constructo genético de acuerdo con el Aspecto M-2.
Aspecto 0-1: Composición que comprende por lo menos un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l, un VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22, un polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-19, un compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-1 a L-21, constructo monovalente de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-22 o L-23, o una secuencia de ácidos nucleicos nucleótidos de acuerdo con el Aspectos M-l o -2.
Aspecto 0-2: Composición de acuerdo con el Aspecto 0-1, que es una composición farmacéutica.
Aspecto 0-3: Composición de acuerdo con el Aspecto 0-2, que es una composición farmacéutica, que comprende además por lo menos un portador, diluyente o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable, y que comprende opcionalmente uno o más de polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente actives adicionales.
Aspecto P-l: Método para producir un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l, un VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22, un polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-19, un compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-1 a L-21 que es tal que se puede obtener mediante la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos o nucleótidos que codifican el mismo, o un constructo monovalente de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-22 o L-23, el método que comprende por lo menos las etapas de: a) expresar, en una célula hospedera adecuada u organismo hospedero o en otro sistema de expresión adecuado, una .secuencia de ácidos nucleicos o nucleótidos de acuerdo con el Aspecto M-l, o un constructo genético de acuerdo con el Aspecto M-2; seguido opcionalmente al: b) aislar y/o purificar el dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D- 6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l, un VHH de acuerdo con cualquiera de- los aspectos H-l a H-22, un polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-19, un compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de ' los aspectos L-l a L-21, o un constructo monovalente de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-22 o L-23 de esta manera obtenidos .
Aspecto P-2: Método para producir un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l á F-25 o G-l, un VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22, un polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-1 a K-19, un compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-l a L-21 que esta tal que se puede obtener mediante la expresión de un secuencia de ácidos nucleicos o nucleótidos que codifican el mismo, o un constructo monovalente de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-22 o L-23, el método que comprende por lo menos las etapas de: a) cultivar y/o mantener un hospedero o célula hospedera de acuerdo con el Aspecto NI, bajo condiciones que son tales que el hospedero o célula hospedera expresa y/o producto por lo menos un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l, un VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H- 22, un polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-1 a K-19, un compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-l a L-21, o constructo monovalente de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-22 o L-23; seguido opcionalmente por: b) aislar y/o purificar el dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos ?-l a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D- 6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l, VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22, un polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-19, un compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-l a L-21, o constructo monovalente de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-22 o L-23 de esa manera obtenidos.
Aspecto Q-l: Método para clasificar dominios variables individuales de inmunoglobulina dirigidos contra HER3 que comprende por lo menos las etapas de: a) proporcionar un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos que codifican dominios variables individuales de inmunoglobulina; b) clasificar el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos para secuencias de ácidos nucleicos que codifican un dominio variable individual de inmunoglobulina que se puede enlazar a y/o tiene afinidad para HER3 y que se bloquea en forma cruzada o bloquea en forma cruzada un dominio variable individual de inmunoglobulina de la invención, por ejemplo, SEQ ID NO: 12 a 26 (Tabla- A- 1), o un dominio variable individual de inmunoglobulina humanizado de la invención, o un polipéptido o constructo de la invención, por ejemplo, SEQ ID NO: 147 a 327, de manera más preferente HER3MS00135 (SEQ ID NO: 282), HER3MS00212 (SEQ ID NO:319) o HER3MS00215 (SEQ ID NO:322). (véase la Tabla A- 2); y c) aislar la secuencia de ácido nucleico, seguido por la expresión del dominio variable individual de inmunoglobulina .
Aspecto R-l: Método para la prevención y/o tratamiento de por lo menos una variedad de cánceres, el método que comprende administrar, a un sujeto en necesidad del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de por lo menos un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l, VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22, polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-19, compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-1 a L-21, constructo monovalente de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-22 o L-23; o composición de acuerdo con el Aspecto 0-2 o 0-3.
Aspecto R-2: Método para lá prevención y/o tratamiento de por lo menos una enfermedad o trastorno que s asocia con HER3, con su actividad biológica o farmacológica, y/o con las rutas biológicas o señalización en las cuales HER3 se implica, el método que comprende administrar, a un sujeto en necesidad del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de por lo menos un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l, VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-1 a H-22, polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-19, compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-l a L-2.1, constructo monovalente de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-22 o L-23; o composición de acuerdo con el Aspecto 0-2 o 0-3.
Aspecto R-3: Método para la prevención y/o tratamiento de por lo menos una enfermedad o trastorno que se puede prevenir y/o tratar, al administrar, a un sujeto en necesidad del mismo, por lo menos un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l, VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-1 a H-22, polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-19, compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-l a L-21, constructo monovalente de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-22 o L-23; o composición de acuerdo con el Aspecto 0-2 o 0-3, el método que comprende administrar, a un sujeto en necesidad del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de por lo menos un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l, VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-1 a H-22, polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-1 a K-19, compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-1 a L-21, constructo monovalente de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-22 o L-23; o composición de acuerdo con los Aspectos 0-2 o 0-3.
Aspecto R-4: Método para inmunoterapia, el método que comprende administrar, a un sujeto en necesidad del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de por lo menos un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l, VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-1 a H-22, -polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-1 a K-19, compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-1 a L-21, constructo monovalente de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-22 o L-23; o composición de acuerdo con los Aspectos 0-2 o 0-3.
Aspecto R-5: Uso de un dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos ?-1 a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-l a F-25 o G-l, un VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22, a polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-19, a' compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-l a L-21, o un constructo monovalente de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-22 o L-23 en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de por lo menos una variedad de cánceres; y/o para uso en uno o más de los métodos de acuerdo con los Aspectos R-l a R-3-.
Aspecto R-6: Dominio variable individual de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos A-l a A-22, B-l a B-7, C-l a C-4, D-l a D-6, E-l a E-13, F-1 a F-25 o G-l, VHH de acuerdo con cualquiera de los aspectos H-l a H-22, polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos K-l a K-19, compuesto o constructo de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-l a L-21, constructo monovalente de acuerdo con cualquiera de los aspectos L-22 o L-23; o composición de acuerdo con los Aspectos 0-2 o 0-3 para la prevención y/o tratamiento de por lo menos una variedad de cánceres.
PARTE EXPERIMENTAL Ejemplo 1: Materiales 1.1 hHER3 ECD (=dominio extracelular HER3 humano) - SEQ ID NO: 4.
El gen que codifica el dominio extracelular HER3 humano se generó por síntesis in vitro. La estructura de lectura abierta que contiene la secuencia de codificación del péptido de señal cognado del gen HER3 seguido por 624 aminoácidos del dominio extracelular (ECD) , y una etiqueta 6His de terminal C (ver SEQ ID NO: 4) . El gene se clonó en el vector de expresión pEAK12d (Edge Biosystems) . HER3 ECD se produjo por transfección transitoria de células HEK293-EBNA ( Invitrogen) . Brevemente, las células adaptadas para crecimiento en suspensión en medio DMEM:F12 que contiene 4 ml/L de suplemento Insulina-Transferrina-Selenio-X y Suero de Bovino Fetal al 1% (todos de Invitrogen) se incubaron con una mezcla de ADN plásmido y Poli-Etilenlmina (PEI, PolySciences ) . Después de 90 min, las ' células transfectadas se diluyeron 1:1 en medio Freestyle (Invitrogen) y se coloca en un agitador orbital a 3.7 °C en un incubador de C02 al 5% bajo agitación a 160 rpm. El sobrenadante se cosechó después de 6 días y se filtra de forma estéril a través de un cartucho de membrana de 0.22 µp? (Millipore) . La proteína recombinante se purificó en una columna de cromatografía de afinidad de quelado de metal Poros 20 C (Applied Biosystems) cargada con iones Ni, seguido por cromatografía de exclusión de tamaño en PBS en una columna HiLoad Superdex 75 grado prep 16/60 de GE Healthcare . 1.2 cHER3 ECD (= Dominio extracelular HER3 de Maccaca fascicularis = cyno HER3 ECD) - SEQ ID NO: 3 La secuencia cyno HER3 se determinó por RT-PCR y procesado por secuencia de cADN . La estructura de lectura abierta que contiene la secuencia de codificación del péptido de señal cognado del gen cHER3 seguido por 624 aminoácidos del dominio extracelular (ECD) y una etiqueta 6His de terminal C (SEQ ID No: 3) . El gen se clonó en el vector de expresión pEAK12d (Edge Biosystems) .
El HER3 ECD se produjo por transfección transitoria de células HEK293-EBNA (Invitrogen) . Brevemente, las células se adaptan para crecimiento en suspensión en medio DMEM:F12 que contiene 4 ml/L de suplemento Insulina-Transferrina-Selenio-X (todos de Invitrogen) se incubaron con ADN plásmido y Poli-Etilenlmina (PEI, PolySciences ) sin mezclado previo. Después de 150 min, las células transíectadas se diluyeron 1:3 en medio Freestyle (Invitrogen) y colocan en un agitador orbital a 37 °C en un incubador de C02 al 5% bajo agitación a 80 rpm (radio 2.5 cm) . Se disminuyó la temperatura hasta 34 °C después de incubación de 24 h. El sobrenadante se cosechó después de 5 días y se filtra de forma estéril a través de un cartucho de membrana de 0.22 m (Millipore). La proteina recombinante se purificó en columna de cromatografía de afinidad de quelado de metal HisTrap HP (GE Healthcare) cargada con iones Ni, seguido por diálisis contra PBS. 1.3 Secuencia de longitud completa hHER3 - SEQ ID NO: 1 La secuencia HER3 humana (SEQ ID No: 1) se produjo y clonó sintéticamente en pcDNA3.1 y pcDNA5/FRT (Invitrogen) respectivamente. El plásmido de expresión final pcADN3.1-hHER3 se usó para generar líneas celulares transfectadas que expresan HER3. 1.4 Generación de transfectantes que expresan HER3 Se transfectaron transitoriamente células HEK 293T (DSMZ) con pcADN3. l-hHER3 usando Fugene HD (Roche) como agente de transfección . Las células transfectadas se usaron para inmunizar llamas. Se transfectaron células de ovario de hámster Chino (ATCC) con pcADN3. l-hHER3 , se seleccionaron y clasificaron células ¦ sencillas para expresión alta y homogénea de HER3 al teñir las células usando un anticuerpo monoclonal específico de HER3 (R&D Systems) y análisis FACS. Se seleccionó y transfectó un clon con HER2 humano que codifica pcADN3.1-higro (SEQ ID NO: 9) para obtener células transfectadas dobles- HER2/HER3. Las células fueron clasificadas en célula sencilla y se seleccionó un clon con expresión alta y homogénea de HER2 al teñir las células usando un anticuerpo monoclonal especifico de HER2 (R&D Systems) y análisis FACS . Estas células se usaron en experimentos de unión y competencia.
Se transfectaron células Flpln CHO (Invitrogen, #R-758-7) con plásmido pcADN5/FRT-hHER3 y hacen crecer bajo selección de higromicina.
Una linea de célula de camello (CAKI; Nguyen et al. 2001. Adv. Immunol. 79: 261-296) se transfectó con pcADN3.1-hHER3 (SEQ ID NO: 1) y un clon clasificado de célula sencilla se seleccionó y usó en experimentos de selección.
Ejemplo 2: Identificación de anocuerpos específicos de HER3 2.1 Inmunizaciones Después de la aprobación del Comité Ético de la Facultad de Medicina Veterinaria (University Ghent, Bélgica) , se inmunizaron 8 llamas, de acuerdo con protocolos estándar. Tres llamas (340, 34'2, 345) reciben 4 inyecciones intramusculares en intervalos cada dos semanas de HER3-ECD hechas en casa (ECD: dominio extracelular) SEQ ID NO: 4 con una dosis de 100, 50, 25 y 25 microgramos. Cinco llamas (419, 420, 421, 429, 430) que recibe 4 inyecciones subcutáneas a intervalos cada dos semanas de 2xl07 células HEK293-HER3 transfectadas transitorias. 2.2 Evaluación de respuestas inducidas en llama Al final del procedimiento de inmunización, se colectaron muestras de suero de todos los animales para evaluar la inducción de respuestas inmunitarias contra HER3 por ELISA. En corto, se inmovilizaron HER3 humano/Fc quimera recombinante en una placa Maxisórp de 96 pozos (Nunc, iesbaden, Alemania) . Después del bloqueo y adición de diluciones de suero, ' se detectaron inmunoglobulinas específicamente unidas usando anticuerpos monoclonales específicos para IgGl, IgG2 o IgG3 de llama y conjugado de peroxidasa de rábano gigante anti-ratón de conejo. Se observó una respuesta inmunitaria específica HER3 importante en todos los animales. Se montó la respuesta al anticuerpo tanto por los repertorios convencionales y de célula B de anticuerpo sólo de cadena pesada ya que las inmunoglobulinas unidas específicamente podrían detectarse con anticuerpos que reconocen específicamente los anticuerpos IgGl de llama convencionales o los anticuerpos IgG2 e IgG3 de llama sólo de cadena pesada.
Tabla C-l: Revisión de las concentraciones en suero especificas de HER3. Las concentraciones en suero se definen como la dilución en suero más alta que resulta en una señal a ruido 1=2 1Señal a ruido se define como la relación de absorciones OD450nm de colección sanguínea diaria después de inmunización (día 49, 50 o 64) contra muestra de suero pre-inmunitario (día 0) . 2.3 Construcción de bibliotecas Se prepararon células mononucleares de sangre periférica a partir de las muestras sanguíneas usando Ficoll-Hypaque de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total extraído de estas células y de ganglios linfáticos se usó como material de partida para ' RT-PCR para amplificar fragmentos de genes que codifican Nanocuerpos . Estos fragmentos se clonaron en vector pAX50 fagémido. Se preparó fago de acuerdo con protocolos .estándar (Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press; Ia edición (28 octubre 1996) ) y se clasifica después de la esterilización por filtro a 4°C hasta el uso adicional. En total, se construyeron 8 bibliotecas de fago (340, 342, 345, 419, 420, 421, 429 y 430), con tamaños de biblioteca entre 3xl08 y 8.5xl08, y un porcentaje de inserto en el intervalo desde 91 hasta 100%. 2.4 Selecciones en búsqueda de Nanocuerpos específicos de HER3 Para identificar Nanocuerpos que reconocen HER3 humano, se incubaron las bibliotecas de fagos con HER3-ECD biotinilado soluble (SEQ ID NO: 4). La proteina se produjo como se describe en Ejemplo 1 y se biotinila usando Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce). Los complejos de HER3 y fago biotinilado se capturaron de la solución en perlas magnéticas cubiertas con estreptavidina . Después de un lavado extensivo con PBS/Tween20 al 0.05%, se eluyeron el fago enlazado por la adición de 1 mg/ml de tripsina o 1 µ? HRG ( R&D systems) . Las bibliotecas de fago 340, 342 y 345 se incubaron con HER3-ECD humano biotinilado soluble (0.1-100 nM) ; las bibliotecas de fago 419, 420, 421, 429 y -430 con HER3-ECD humano biotinilado soluble (1-10-100-1000' nM) en dos rondas consecutivas. Los resultados de estas selecciones se analizaron para factor de enriquecimiento (número de fago presente en el eluido con relación a controles) y se tomaron clones individuales de estos primeros resultados de rondas. Todas las bibliotecas de fago también se incubaron con una linea de célula de ovario de hámster chino (ATCC) o camello (células CAKI; Nguyen et al. 2001. Adv. Immunol . 79: 261- 296)) transíectadas con hHER3 (hHER3 = HER3 humano = SEQ ID NO: 1) o con hHER2 y hHER3 (hHER2 = HER2 humano = SEQ ID NO: 9) (células 5xl06) en dos rondas consecutivas. Una tercera estrategia de selección consiste de placas recubiertas con un Nanocuerpo especifico de HER3 (04CQ7 y 21F06; 10 ug/ml ), capturado de HER3-ECD (5-100 nM) y además de las bibliotecas de fago con objeto de enriquecer fagos unidos, a diferentes epitopos. Se usó tripsina para eluir fagos y se usaron los resultados como una entrada para una segunda ronda de selección en placas cubiertas con el mismo Nanocuerpo o alternativo. Se tomaron clones individuales de las condiciones de selección diferentes .
Todos los clones individuales se hicieron crecer en placas de 96 pozos profundos (1 mi de volumen). Se indujo la expresión de Nanocuerpo .al agregar IPTG hasta una concentración final de 1 mM. Se prepararon extractos periplásmicos al congelar los peletizados celulares y disolverlos en 100 µ? de PBS . Se removió los residuos celulares por centrifugación. 2.5 Selección para Nanocuerpos que enlazan hHER3 Para determinar la capacidad de unión de Nanocuerpos a hHER3, se seleccionaron extractos periplásmicos en un ensayo FACS de unión basado en célula (Configuración FACS, BectonDickinson) . Se incubaron las muestras con células de ovario de hámster chino transíectadas con hHER3 o hHER2/hHER3, lavadas con solución amortiguadora FACS y se detectó la unión de los Nanocuerpos usando un anticuerpo especifico anti-c-myc (Serotec) . Se identificaron los Nanocuerpos unidos a hHER3. 2.6 Selección para Nanocuerpos que compiten con unión HRGl-ß? Para determinar la capacidad de bloqueo HRGl-ß? (hHRG = Heregulina humana) de los Nanocuerpos, se seleccionaron extractos periplásmicos en un ensayo de competencia basado en célula usando la tecnología FMAT (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Se etiquetó HRGl- i-EGF (R&D Systems, #396-HB, # de acceso NP_039250) con A647 e incubó con células de ovario de hámster chino transfectadas con hHER2/hHER3 en presencia de Nanocuerpos. La reducción en señales FL1 totales indica que el enlace de HRGl-ß? etiquetado está bloqueado por el Nanocuerpo presente en el extracto periplásmico . Los Nanocuerpos se identificaron con diferentes niveles de bloqueo de la interacción ligando-receptor, en el intervalo desde 100% bloqueado a no bloqueado. Con base en la selección de unión de HER3 y competencia de HRGl-ß?, se seleccionó y procesó por secuencia un conjunto de Nanocuerpos HER3. El análisis de secuencia revela 204 familias diferentes de Nanocuerpos específicos de HER3. 2.7 Análisis de Resonancia de Plasmón de Superficie de extractos periplásmicos en hHER3 Se midieron las relaciones de salida de los extractos periplásmicos que contienen Nanocuerpos anti-HER3 por Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR, por sus siglas en inglés) usando urt instrumento Biacore T100. Se unió covalentemente HER3-ECD humano (SEQ ID NO: 4) a una superficie de microplaqueta detectora CM por medio de acoplamiento amina usando EDC/NHS para activación y etanolamina HC1 para desactivación. Los extractos periplásmicos que contienen Nanocuerpos específicos de HER3 se inyectaron por 2 minutos a una velocidad de flujo de 45 µ?/min para permitir, la unión al antígeno unido a la microplaqueta. A continuación, se envió solución amortiguadora de unión sin extractos periplásmicos sobre la microplaqueta a la misma velocidad de flujo para permitir la disociación espontánea ' del Nanocuerpo unido. De los sensogramas obtenidos de los diferentes extractos periplásmicos se calcularon los valores koff (kd). 2.8 Selección para Nanocuerpos que inhiben la fosforilación de HER3 dependiente ' del ligando Para identificar Nanocuerpos específicos de HER3 con una capacidad para bloquear la fosforilación HER3, se incubaron extractos periplásmicos con células MCF-7 desprovistas de suero seguido por estimulación 5nM HRGl-pi-EGF por 15 minutos. Se hicieron los lisados celulares y la fosforilación de HER3 se midió usando el ELISA DuoSet IC humano fosfo-HER3 (R&D systems, DYC 1769-2) . Los Nanocuerpos se identificaron con diferentes niveles de inhibición de pHER3 que induce ligando, en el intervalo desde 100% de bloqueo hasta sin inhibición. 2.9 Clasificación por epítopo de Nanocuerpos Se biotinilaron seis . Nanocuerpos específicos de HER3 y usaron en ensayos de selección alfa y/o de competencia FACS para el grupo de familias de Nanocuerpo en selecciones de epitopo diferentes. En el ensayo FACS, los extractos periplásmicos que contienen Nanocuerpos específicos de HER3 se incubaron en presencia de uno de los seis Nanocuerpos biotinilados (las concentraciones usadas se indican en la Tabla C-2) . Las mezclas de incubación se agregaron subsecuentemente a células CHO transfectadas con HER2/HER3. Después de 90 minutos de incubación, se lavaron las células y se detectó la unión- del Nanocuerpo biotinilado usando estreptavidina-PE . La señal fluorescente obtenida se compara con la señal obtenida de una condición donde el Nanocuerpo biotinilado se agregó a las células sin Nanocuerpo de extracto periplásmico .
Para el ensayo de competencia de selección alfa, se capturó HER3-FC (R&D Systems, 348-RB) en perlas aceptoras conjugadas al Nanocuerpo Fe anti-humano que se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante ( PerkinElmer ) . Para evaluar la capacidad de bloqueo de los Nanocuerpos anti-HER3, se agregaron diluciones de los extractos periplásmicos a uno de los Nanocuerpos biotinilados (ver Tabla C-2) . A esta mezcla, se agregaron perlas HER3-Fc-Aceptor humano e incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, se agregaron perlas Donadoras acopladas a estreptavidina y se incuban además por 1 hora a temperatura ambiente. La fluorescencia se midió usando el Lector de Placa de Etiqueta Múltiple En Vision (PerkinElmer) usando una longitud de onda de excitación de 680 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm.
Tabla C-2 : Concentraciones de Nanocuerpos biotinilados usados en FACS de competencia de epitopo y selección alfa y concentraciones de HER3-FC humano usadas en selección alfa. NA: no aplica Se agruparon Nanocuerpos no de competencia en grupos de epitopos diferentes. Se identificaron cinco diferentes grupos con base en la selección alfa y resultados de competencia FACS .
Ejemplo 3: Expresión y purificación de Nanocuerpos específicos de hHER3 Con base en los ensayos de selección descritos, se seleccionaron 15 Nanocuerpos para caracterización adicional. Estos Nanocuerpos pertenecen .a 13 familias diferentes y cinco uniones de epitopo diferentes. Las secuencias se muestran en la Tabla A-l (SEQ ID NOs : 12 hasta 26).
Los Nanocuerpos se expresaron en células TG1 de E. coli como c-myc, las proteínas se etiquetan con His6 en un volumen de cultivo de 500 mL. Se indujo la expresión por la adición de IPTG 1 mM y se permite que continúe por 3h a 37 °C. Después de revolver los cultivos celulares, se prepararon los extractos periplásmicos al congelar-descongelar los peletizados y volver a' suspender en dPBS . Estos extractos se usaron como material de partida por cromatografía de afinidad inmovilizada en metal (IMAC) usando columnas de Histrap FF crudo (GE Healthcare). Los Nanocuerpos se eluyeron de la columna con imidazol 250 mM y posteriormente se desalan hacia dPBS (Solución Salina Amortiguada en Fosfato de Dulbecco) .
Ejemplo 4: Capacidad de unión de Nanocuerpos purificados para hHER3 en ELISA La capacidad de unión de 14 Nanocuerpos purificados que pertenece a 5 uniones de epítopos diferentes se determinó en ELISA. Se recubrieron placas de 96 pozos se cubrieron con hHER3-ECD (1 g/ml) . Se probó una dilución en serie de cada Nanocuerpo partiendo desde 500 nM bajando gasta 6 pM y detectó usando anti c-myc de ratón (Roche) y anti-ratón-HRP (citomación Dako) . Todos los Nanocuerpos unidos a hHER3-ECD y los valores EC50 obtenidos se muestran en la Tabla C-3.
Tabla C-3: Valores EC50 para varios Nanocuerpos anti-HER3 para hHER3-ECD y sus intervalos del 95% de confianza (CI) como se determina por ELISA Ejemplo 5: Afinidad de Nanocuerpos purificados Se realizaron medidas de afinidad usando un instrumento Biacore T100 al recubrir anticuerpo Fe anti-humano (GE Healthcare) a una superficie de una microplaqueta de detección C por medio d.e acoplamiento amina usando EDC/NHS para activación y HC1 etanolamina para desactivación. Se inyectó HER3-Fc (R&D systems, 348-RB 5 ug/ml; 120 s; 10 µ?/min) para permitir la captura por el anticuerpo anti-Fc recubierto. Luego, se inyectaron Nanocuerpos purificados por 2 minutos a una velocidad de flujo de 10 µ?/min para permitir la unión al antigeno unido a la microplaqueta . A continuación, la solución amortiguadora de unión sin Nanocuerpos se envió sobre la microplaqueta a la misma velocidad de flujo para permitir la disociación espontánea del Nanocuerpo unido. Los parámetros cinéticos valores kon (ka), valores k0ff (kd) y KD se calcularon de los sensogramas obtenidos de los diferentes Nanocuerpos (Tabla C-4) .
Tabla C-4: Parámetros cinéticos para Nanocuerpos específicos de HER3.
* Curva heterogénea: resultados de la interacción principal (89%) presentada ** Curva heterogénea: resultados de la interacción principal (84%) presentada Ejemplo 6: Capacidad de unión de Nanocuerpos purificados para cynoHER3 en ELISA La capacidad de unión de los Nanocuerpos purificados seleccionados se determinó en ELISA. Se recubrieron placas de 96 pozos con CHER3-ECD (1 ug./ml) (SEQ ID NO: 4) . Se probó y detectó una dilución en serie de cada nanocuerpo iniciando desde500 nM bajando hasta 6 pM usando anti c-myc de ratón (Roche) y anti-ratón-HRP (Dako cytomation) . Todos los Nanocuerpos están unidos a cyno HER3-ECD y los valores EC50 obtenidos se muestran en la Tabla C-5.
Tabla C-5: Valores EC50 para varios Nanocuerpos anti-HER3 para cyno HER3-ECD y sus intervalos de confianza al 95% como se determina por ELISA Ejemplo 7: Especi icidad HER-3 de Nanocuerpos purificados Se evaluó el enlace fuera de objetivo de los Nanocuerpos HER3 al medir su capacidad de unión para células de ovarios de hámster chino (CHO)' transfectadas con HERI humano (SEQ ID NO: 8), HER2 humano (SEQ ID NO: 9) o HER4 humano (SEQ ID NO: 10) por FACS. Las células no transfectadas se usaron para revisar la unión a la columna de la célula. Se agregaron Nanocuerpos específicos de HER3 purificados (2000-666-222 nM) a células 2xl05, se incuba 30 minutos a 4°C y se detecta usando anti-c-myc de ratón (Serotec) y anti-ratón-PE de cabra (Jackson Immuno-Research Laboratories) . La unión de anticuerpos policlonales (anti-HERl, R&D Systems AF231; anti-HER2, R&D Systems AF1129; anti-HER4, R&D Systems AF1131) se usaron como control ' positivo . Se observaron bajos niveles de unión para el Nanocuerpo 21B02 a HER2, mientras que los otros Nanocuerpos purificados no unen a células HERI, HER2 y HER4 transfectadas (Tabla C-6) .
Tabla C-6: Unión de Nanocuerpos purificados y anticuerpos policlonales de control a células de ovarios de hámster chino transfectados con HERI, HER2 o HER4 como se determina por FACS (los datos representan valores MCF) . 5 10 Ejemplo 8: Mapeo de Epitopo del panel de Nanocuerpo purificado La clasificación de Nanocuerpos en las diferentes uniones de epitopo fue un criterio importante para seleccionar Nanocuerpos para purificación y caracterización adicional (ver Ejemplos 2.9 y 3) . El ensayo de competencia FACS usando los Nanocuerpos biotinilados 04C07 (también denotado como 4C07), 21B02, 23F05, 18E08, 17C08 y 04F10 (también denotado como 4F10) se repitió con tres diferentes concentraciones de 14 Nanocuerpos purificados seleccionados (400, 100 y 25 nM) . Los Nanocuerpos que pertenecen al grupo 1 y grupo 2 son muy similares pero diferentes en su capacidad para competir con el Nanocuerpo 04F10 (Tabla C-7). Los Nanocuerpos del grupo 3 y grupo 4 son muy similares pero diferentes en su capacidad para competir con 04F10 y 17C08. Los Nanocuerpos clasificados en un grupo epitopo se considera que se unen a epitopos idénticos, mientras que los Nanocuerpos de diferentes grupos epitopo se considera que se usen a epitopos parcialmente traslapados (grupo 1-2 y grupo 3-4) o no traslapados.
Tabla C-7 : Competencia de Epitopo FACS de 14 Nanocuerpos purificados seleccionados contra Nanocuerpos biotinilados . Los datos representan el porcentaje de competencia en una concentración de 400 nM del Nanocuerpo no biotinilado. ND: no determinado .
Para obtener el mayor entendimiento en los epitopos reconocidos por los Nanocuerpos purificados seleccionados, se produjeron por ingeniería varias proteínas quiméricas HER3 humano-pollo, con base, en la división del dominio extracelular HER3 en cuatro dominios distintos. Los plásmidos se construyeron de forma que codifiquen las regiones de transmembrana y extracelulares del HER3 de pollo (con base en el no. de acceso al Genbank: DQ358720) y las variantes con dominios individuales de HER3 humano se intercambian en andamiaje de pollo pero usando la- secuencia de señal humana: - Her3 de pollo: AA1-25 humano, AA26-642 pollo (SEQ ID NO: 2) Her3 de pollo quimérico - dominio 1 humano: AA 1-206 humano, AA207-642 pollo (SEQ ID NO: 5) - Her3 de pollo quimérico- dominio 2 humano: AA1-25 humano, AA26-206 pollo, AA207- 328 humano, AA329-642 pollo (SEQ ID NO: 6) - Her3 de pollo quimérico - dominio 4 humano: AA1-25 humano, AA26-495 pollo, AA496-642 humano (SEQ ID NO: 7) .
Se produjeron sintéticamente fragmentos que codifican HER3 y clonaron en pcADN3.1 ( Invitrogen) . Las células HEK293 (DSMZ) se transfectaron transitoriamente con constructos HER3 de pollo o quiméricos. La expresión de superficie de los constructos se confirmó usando un anticuerpo policlonal anti-hHER3 de cabra (R&D systems). Los Nanocuerpos se incubaron con las células transfectadas transitorias y la unión se detectó usando anti-c-myc y anti-ratón-PE de cabra. El resultado del estudio de unión se muestra en la Figura 2. En resumen, los Nanocuerpos 17B05, 17E08, 18B05, 18F05 y 04C07 (grupos de epitopo 1 y 2) reconocen el dominio 1 humano mientras que los Nanocuerpos 18E08 y 18G11 (grupo epitopo 3) se unen al dominio 2 humano. El Nanocuerpo 17C08 (grupo epítopo 4) reconoce tanto el dominio 1 como el dominio 2. Tres Nanocuerpos (21B02, 21F06 y 23F05 (grupo epítopo 5)) muestra reactividad cruzada de pollo, por lo tanto los epítopos correspondientes no podrían mapearse a un dominio HER3 humano específico.
El Dominio 1 está involucrado en la unión del ligando mientras que el rizo de dimerización involucrado en la dimerización de HER se localiza en el dominio 2 (Baselga and Swain, 2009 Nature Reviews Cáncer. Vol 9, p 463-475) . Por lo tanto, el modo de acción de los Nanocuerpos unidos al dominio 1 pudiera relacionarse con la inhibición del ligando unido y la de los Nanocuerpos unidos al dominio 2 pudiera relacionarse con la dimerización HER bloqueada.
Ejemplo 9: Capacidad de competencia HRGl-ß? de Nanocuerpos purificados en FACS La capacidad de competencia HRGl-ß? de Nanocuerpos específicos HER3 se determinó en un experimento de competencia FACS usando células de ovario de hámster chino (CHO Flpln, Invitrogen) transfectadas con hHER3. Se agregaron una serie de dilución de cada Nanocuerpo iniciando desde 600 nM bajando hasta 0.03 nM y 0..8 nM HRGl^l-EGF (R&D systems, #396-HB) a las células (2xl05) e incubaron durante 90 minutos a 4°C. Después de lavar las células con solución amortiguadora FACS, se realizó la detección usando anti-HRG ECD de cabra (R&D systems) y anti-cábra PE de burro (Jackson ImmunoResearch Laboratories) . Los Nanócuerpos muestran una competencia completa con HRG1~ 1-EGF para unión HER3, excepto para Nanócuerpos 18E08 y. 18G11 que no compiten y Nanocuerpo 17C08 que sólo bloquea parcialmente (75%) a una concentración de Nanocuerpo de 600 nM. Los valores IC50 obtenidos se muestran en la Tabla C-8. La capacidad de bloqueo de HRGl-ß? más baja de los Nanócuerpos pertenece al grupo de epitopo 3 y en menor extensión también el grupo 4 está de acuerdo con su unión al dominio 2 y bloquea la transfosforilación HER como modo de acción.
Tabla C-8 : Valores IC50 para competencia entre HRGl-pi-EGF y varios Nanocuerpos anti-HER3 para células CHO transfectadas con HER3 y sus intervalos de confidencia al 95% como se determina por FACS. NA: no aplicable.
Ejemplo 10: Inhibición de HER3 , Akt y ERK1/2 fosforilación por Nanocuerpos purificados Para determinar la potencia de Nanocuerpos monovalentes para inhibir la fosforilación HER3 inducida por ligando y la señalización cadena abajo. Se probaron los Nanocuerpos se probaron en ensayos basados en célula como se describe a continuación .
La inhibición de pHER3 inducida por ligando ( fosfoHER3 ) en células MCF-7 (ensayo de electroquimioluminiscencia basada en célula (ECLA) ) : las células MCF-7 (ATCC HTB 22) se privaron de suero y se incuban previamente con Nanocuerpos (diluciones en serie, concentración inicial 666nM) en medio libre de suero por 60min a 37 °C, CO2 al 5%. Las células se estimularon con 50ng/ml de dominio HRGl-ß? EGF (R&D Systems, #396-HB) por 10 min, se descartaron los sobrenadantes y las células se Usaron en solución amortiguadora de lisis NP-40 fría (NP-40 al 1%, Tris 20mM, pH8.0, NaCl 137m , glicerol al 10%, EDTA 2mM, conjunto de cóctel de inhibidor de proteasa III (Calbiochem) , conjunto de cóctel de inhibidor de fosfatasa II (Calbiochem) ) . Se bloquearon placas de 96 pozos MA6000 (MSD, # L15XB) con bloque A al 3% (MSD) en PBS, pH7.4, Tween20 al 0.05% y recubren con anticuerpo de captura especifico HER3 (R&D Systems, # MAB3481) . Se agregaron lisados celulares e incubaron durante 2h a temperatura ambiente (TA) . Se usaron anticuerpo de tirosina anti-fosfo biotinilado (R&D Systems, # BAM1676) y reactivo de estreptavidina de etiqueta sülfo (MSD, #R32AD) para detección (Tabla C-9) . 10.1 Inhibición de señalización cadena abajo (pAkt/pERKl/2) : Se incubaron previamente células MCF-7 con Nanocuerpos y estimulan como se describe arriba. Los lisados celulares se probaron en Kit de Lisado de Célula Entera Fosfo-Akt (Ser473) (MSD, # K151CAD) y Kit de Lisado de Célula Entera Fosfo-ERK1/2 (MSD, # K111DWD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tabla C-10) . 10.2 Inhibición de transfosforilación EGFR/HER3 y HER2/HER3: Se privaron de suero células MDA MB468 (ATCC HTB 132) y CHO HER2/HER3 y se tratan como se describe arriba (estimulación MDA MB468 con 50ng/ml dé dominio HRGl-ß? EGF; células CHO HER2/HER3 estimuladas con 100ng/ml de dominio HRGl-ß? EGF) . Los lisados celulares se probaron en pHER3 ECLA (Tabla C- 9 ) .
Tabla C-9 Inhibición de fosforilación dependiente de HRGl-ß? de HER3 por Nanocuerpos purificados <50% = menos de 50% de inhibición Tabla C-10: Inhibición de pAKT y pERKl/2 inducida por HRG1- <50% = menos de 50% de inhibición Los Nanocuerpos purificados inhiben de forma potente la fosforilación de HER3 inducida por HRGl-ß? en células MCF-7, y células que expresan EGFR/HER3 (MDA MB468) o HER2/HER3 respectivamente (CHO HER2/HER3) con las excepciones de 18E08, 05?09, 21B02, y 17C08 que- muestran menos de 50% de inhibición de pHER3 en células CHO HER2/HER3. La inhibición de trayectoria PBCinasa (pAkt) podría detectarse con todos los Nanocuerpos. En un menor grado, la señalización cadena abajo a través de pERKl/2 pudiera bloquearse por Nanocuerpos.
Los datos descritos en los Ejemplos 9 y 10 sugieren que los Nanocuerpos del grupo 3 bloquean la transfosforilación de HER3 sin bloquear la unión del ligando.
Ejemplo 11: Capacidad de bloqueado de migración de Nanocuerpos purificados La capacidad de los Nanocuerpos para inhibir la migración celular dependiente de HRGl-ß? se evaluó en el siguiente ensayo. Las células A431 (CRL 1555) se sembraron en insertos de placa de 96 pozos ' HTS Fluoroblok (BD Falcon #351164) en presencia de- Nanocuerpos (diluciones en serie; iniciando en 666nM) . Se agregó medio más dominio extracelular HRGl-ß? 500nM (R&D Systems, #377-HB) al fondo de los pozos. Se tiñeron las células migradas con CalceinAM y la fluorescencia se detecta por lector de placa. Los Nanocuerpos que inhiben la migración de célula de cáncer dependiente del ligando podrían identificarse (Tabla C-ll) .
Tabla C-ll: Inhibición de migración celular inducida por HRGl-ß? <50 = menos de 50% de inhibición Ejemplo 12: Generación de- Nanocuerpos formateados El requerimientos estructural para multi-especificidad es fusionar dos o más dominios de unión juntos, con flexibilidad suficiente para permitir uniones simultáneas a diferentes epitopos objetivo y/o combinar dominios de unión con un modo de acción diferente (bloqueo de unión de ligando y bloqueo de dimerizacion HER) en una molécula.
Los Nanocuerpos unidos a diferentes epitopos se combinaron en una molécula y fusionaron a un Nanocuerpo unido a anti-albúmina para' incrementar la vida media de la molécula. Los ligado-res GS se insertaron entre los bloques de construcción de Nanocuerpo. La unión de los dos bloques de construcción de Nanocuerpo especifico de HER3 simultáneamente sin un pérdida importante de entropía incrementa la afinidad de unión al objetivo, lo que resulta en potencia más alta y/o especificidad más alta. ¦ La selección cuidadosa de los epítopos dirigidos en el antígeno y diseño óptimo de los ligadores para permitir la flexibilidad máxima de los dominios de unión resulta en el bloqueo de dos o más sitios críticos del objetivo. La secuencia de aminoácidos de constructos de Nanocuerpo formateados seleccionados se muestran en la Tabla A-2.
Ejemplo 13: Análisis de la capacidad de bloqueo de heterodimeri zación HER1-HER3 del Nanocuerpo monovalente 17B05 Para determinar la potencia de Nanocuerpos monovalentes para inhibir la fosforilación HER3 inducida por el ligando EGFR se probaron los Nanocuerpos en ensayos basados en células como se describe a continuación.
La inhibición de pHER3. inducida por ligando EGFR ( fosfoHER3 ) en células CHO EGFR/Her3 (ensayo electroquimioluminiscente basado en célula (ECLA) ) : CHO EGFR/Her3 se privaron de suero e incubaron previamente con Nanocuerpos o anticuerpo EGFR cetuximab (diluciones en serie, concentración iniciando de 666nM o 167n ) en medio libre de suero por 60min a 37°C, C02 al 5%. Las células se estimularon con 100ng/ml de rhTGFa (R&D Systems, #239-A) , EGF (Sigma#E-9644), o rh epiregulina (R&D Systems, #1195EP) respectivamente por 10 mins, se descartaron los sobrenadantes y las células se lisaron en solución amortiguadora de lisis NP-40 fría (NP-40 al 1%, Tris 20mM, pH8.0, NaCl 137mM, glicerol al 10%, EDTA 2mM, conjunto cóctel inhibidor de proteasa III (Calbiochem) , conjunto cóctel inhibidor de fosfatasa II (Calbiochem) ) . Se bloquearon placas de 96 pozos MA6000 (MSD, # L15XB) con bloque A al 3% (MSD) en PBS, pH7.4, Tween20 al 0.05% y recubre con anticuerpo de captura especifico HER3 (R&D Systems, # MAB3481) . Los Usados celulares se agregaron' e incubaron durante 2h a temperatura ambiente (TA) . El anticuerpo de Tirosina anti-fosfo biotinilado (R&D Systems, # BAM1676) y reactivo de estreptavidina de etiqueta sulfo (MSD, #R32AD) se usaron para detección (Tabla C-12) . El Nanocuerpo monovalente 17B05 fue capaz de bloquear de forma potente la fosforilación HER3 inducida por el ligando EGFR, mientras que los aglutinantes de dominio II 18G11 y 34C07 no fueron capaces de bloquear la fosforilación HER3 inducida por el ligando EGFR.
Tabla C-12: Inhibición de fosforilación de HER3 inducida por ligando E6FR <50% = menos de 50% de inhibición Ejemplo 14: Generación de Nanocuerpos específicos HER3 precursores multivalentes con extensión de vida media (HLE) Con objeto de generar un producto de Nanocuerpo de vida media extendida que bloquea la unión de HRG a HER3 y también bloquea la heterodimerización de HER3, los Nanocuerpos de panel guia monovalentes (4C07,. 17C08, 18G11, 21F06, 34C07 y 17B05) se formatearon a moléculas bivalentes y multivalentes.
Para extensión de vida media, se optó por fusionar los constructos al Nanocuerpo anti-HSA ALB 11. Se usó un enfoque de colección para hacer todas las combinaciones de Nanocuerpo l-35GS-Nanocuerpo2-9GS-ALB 11 posibles. Los Nanocuerpos multivalentes se expresaron como proteína etiquetada en His6, c-myc, en Pichia pastoris. La inducción de expresión de Nanocuerpo se presenta por adición en etapas de metanol . Se usó medio clarificado con Nanocuerpo secretado como material de partida para cromatografía de afinidad inmovilizada en metal (IMAC) seguido por desalación resultante en al menos 90% de pureza como se evalúa por SDS-PAGE. Los Nanocuerpos específicos HER3 precursores multivalentes purificados se probaron en una selección alfa que bloquea HRG usando HRG 20 nM y HER3-Fc 0.05 nM . Los resultados indicated que el mejor bloque de construcción de Nanocuerpo determina la potencia de los Nanocuerpos formateados (Tabla C-13) . El Nanocuerpo 21F06 fue el bloque de construcción monovalente más potente en este ensayo (IC50 1.35E-11 M) y todos los constructos que contienen 21F06 como bloque de construcción tienen IC50s entre 5.69E-12 M y 5.77E-11 M.
Tabla C-13: Resultados de selección alfa de competencia HRG de Nanocuerpos anti-HER3 precursores multivalentes 5 10 Ejemplo 15: Análisis de la capacidad de bloqueo de señalización inducida por HRG de los Nanocuerpos precursores multivalentes con ALB11 HLE en. ensayos celulares Para determinar la potencia de Nanocuerpos multivalentes en inhibir la fosforilación inducida por el ligando de HER3 y transfosforilación EGFR/Her3 y Her2/Her3, los Nanocuerpos se probaron en ensayos basados en células como se describe a continuación. La inhibición de pHER3 inducida por ligando (fosfoHER3) en células MCF-7 (ensayo electroquimioluminiscente basado en célula (ECLA) ) : Células MCF-7 (ATCC HTB 22) se privaron de suero e incubaron previamente con Nanocuerpos (diluciones en serie, concentración iniciando de 666nM o 167nM) en medio libre de suero por 60min a 37°C; CO2 al 5%. Las células se estimularon con 50ng/ml de dominio HRGl-ß? EGF (R&D Systems, #396- HB) por 10 mins, se descartaron los sobrenadantes y las células se Usaron en solución amortiguadora de lisis NP-40 fría (NP-40 al 1%, Tris 20mM, pH8.0, NaCl 137mM, glicerol al 10%, EDTA 2mM, conjunto cóctel inhibidor dé proteasa III (Calbiochem) , conjunto cóctel inhibidor- de fosfatasa II (Calbiochem)). Se bloquearon placas de '96 pozos MA6000 (MSD, # L15XB) con bloque A al 3% (MSD) en PBS, pH7.4, T een20 al 0.05% y recubre con anticuerpo de captura especifico HER3 (R&D Systems, # MAB3481) . Los Usados celulares se agregaron e incubaron durante 2h a temperatura ambiente (TA) . El anticuerpo de Tirosina anti-fosfo biotinilado (R&D Systems, # BAM1676) y reactivo de estreptavidina de etiqueta sulfo (MSD, #R32AD) se usaron para detección (Tabla C-14) . Inhibición de transfosforilación EGFR/HER3 y HER2/HER3: MDA MB468 (ATCC HTB 132) y células CHO HER2/HER3 se privaron de suero y trataron como se describe arriba (estimulación de MDA MB468 con 50ng/ml de dominio HRGl-ß? EGF; estimulación de células CHO HER2/HER3 con 100ng/ml' de- dominio HRGl-ß? EGF) . Los lisados celulares se probaron en pHER3 ECLA (Tabla C-14).
Los Nanocuerpos precursores multivalentes con Albll inhiben de forma potente señalización HER3 inducida por HRG1-ß? en células MCF-7, asi como células que expresan HER2/HER3 (CHO HER2/HER3) y células que expresan EGFR/HER3 (MDA-MB468 ) .
Tabla C-14: Inhibición de fosforilación HER3 inducida por HRG por Nanocuerpos precursores multivalentes con Albll HLE 5 15 5 10 n.d .= no determinado 15 Ejemplo 16: Análisis de la capacidad de bloqueo de heterodimerización EGFR-HER3 de los Nanocuerpos precursores multivalentes con ALBli HLE en ensayos celulares Los Nanocuerpos precursores multivalentes que contiene 17B05 como un bloque de construcción, Albll, y un segundo Nanocuerpo HER3 (04C07, 18G11, 21F06, 34C07, o 17B05) se probaron por su capacidad para bloquear la fosforilación HER3 inducida por el ligando EGFR. Todos los 17B08 que contienen Nanocuerpos precursores multivalentes bloquean de forma potente de pHER3 inducida por TGFa en células CHO EGFR/HER3 como se demuestra por 17B05 monovalente. Las células CHO EGFR/HER3 se privaron de suero e incubaron previamente con Nanocuerpos o anticuerpo EGFR cetuximab (diluciones en serie, concentración iniciando de 166.7n ) en medio libre de suero por 60min a 37 °C, C02 al 5%. Las células se estimularon con 100ng/ml de rhTGFa (R&D Systems, #239- A) por 10 mins, se descartaron los sobrenadantes y las células se lisaron en solución amortiguadora de lisis NP-40 fría (NP-40 al 1%, Tris 20mM, pH8.0, NaCl 137mM, glicerol al 10%, EDTA 2mM, conjunto cóctel inhibidor de .proteasa III (Calbiochem) , conjunto cóctel inhibidor de fosfatasa II (Calbiochem) ) . Se bloquearon placas de 96 pozos MA6000 (MSD, # L15XB) con bloque A al 3% (MSD) en PBS, pH7.4, Tween20 al 0.05% y recubre con anticuerpo de captura especifico HER3 (R&D Systems, # MAB3481) . Los Usados celulares- se agregaron e incubaron durante 2h a temperatura ambiente (TA) . El anticuerpo de Tirosina a'nti-fosfo biotinilado (R&D Systems, # BAM1676) y reactivo de estreptavidina de etiqueta sulfo (MSD, #R32AD) se usaron para detección (Tabla C-15) .
Tabla C-15: Inhibición de fosforilación de HER3 inducida por TGFa por Nanocuerpos precursores multivalentes con Albll HLE y 17B05 <50 = menos de 50% de inhibición Ejemplo 17: Inducción de internalización HER3 por los Nanocuerpos precursores multivalentes con ALB11 HLE El efecto de' Nanocuerpos específicos de HER3 en internalización HER3 se evaluó usando células MCF-7 y MALME-3M. Las células se sembraron en placas de 6 pozos a una concentración de 105 células/ml e incubaron en un incubador celular a 37 °C por 2 días. Luego, se agregó Nanocuerpo 100 nM con o sin 5 µ? de HSA (Sigma, A8763) y se incubaron las células 2 h a 4°C o 37°C. Los pozos con control MAbl y los pozos sin ningún Nanoc.uerpo o Ab se tomaron como controles positivo y negativo respectivamente. Después de lavar las células, se cosecharon y tiñeron con anti-HER3 (R&D systems, #AF234) y anti-cabra-PE de burro (Jackson ImmunoResearch Laboratories) . Las muestras se midieron usando una configuración FACS (Becton Dickinson) y el porcentaje de internalización se determinó al comparar la señal obtenida de expresión de superficie HER3 en condiciones a 37°C con las que están con condición de control negativo a 4°C. Ninguno de los Nanocuerpos monovalentes fue capaz de inducir internalización HER3, mientras- que el 17B05 bivalente induce el 17.8% de internalización. 18G11, 34C07, 4C07 y 21F06 bivalente inducen el 60-70% de internalización, que es ligeramente mayor que el MAbl de control positivo (57% de internalización) . La inducción de internalización HER3 por constructos biparatrópicos fue dependiente de sus composiciones respectivas. No se observó internali zación cuando se presentó 21F06 en el constructo. En constructos sin 21F06, la internali zación (40-70%) sólo se observó cuando 17B05 o 04C07 se localizó en la posición de terminal N. Se obtuvieron resultados idénticos en ambas líneas de célula.
Ejemplo 18: Optimización de secuencias Los Nanocuerpos 4C07, 17B05, 21F06, 18G11 y 34C07 se tomaron además para optimización de secuencia. Este es un proceso en el cual las secuencias de Nanocuerpo precursoras se mutan para proporcionar secuencias de Nanocuerpo que son más idénticas a secuencias de consenso de línea germinal VH3-JH de humano. Los aminoácidos específicos, con la excepción de los residuos llamados distintivos, en los FRs que difieren entre el Nanocuerpo y la línea germinal VH3-JH de humano de consenso se alteran para la contraparte humana de tal manera que la estructura, actividad y estabilidad de la proteína se mantienen intactas. La secuencia de aminoácidos del Nanocuerpo precursor también se alinea con la secuencia de aminoácidos de línea germinal IGHV de llama del Nanocuerpo (identificada como la línea superior a partir de un análisis BlastP del Nanocuerpo contra las líneas germinales IGHV de llama) , y en ciertos casos se introducen mutaciones hacia la linea germinal de llama para incrementar la estabilidad del Nanocuerpo, que se define como llamanización . Además de los sitios potenciales pára Modificaciones Posteriores a la Traducción (PTMs como desamidación, isomerización, oxidación de metionina) se cambian para garantizar la estabilidad química. El análisis se presenta en dos rondas, en una primera ronda se evaluaron mutaciones sencillas y mutaciones combinadas sobre las variantes básicas. Con base es estos resultados, las sustituciones aceptables se combinan en variantes de segunda ronda que se caracterizan de forma adicional .
Seis residuos de aminoácido en 04C07 pueden sustituirse para propósitos de . humanización. En el proceso de optimización de secuencia, se construyeron cuatro versiones 04C07 (una versión básica y 3 variantes adicionales) . La variante básica (HER3MS0042) contiene 4 sustituciones: A14P, A74S, K83R y Q108L. Además de estos cambios, las sustituciones A46E y L93A se introdujeron e investigaron en variantes adicionales. Se expresaron los constructos en E. coli y purificaron por IMAC y desalación.
Las moléculas purificadas se evaluaron por su capacidad de bloqueo HRG usando selección alfa. También se probó la estabilidad térmica en un ensayo de cambio térmico usando el Lightcycler (Roche) . En este ensayo las variantes de Nanocuerpo se incubaron en pH' s diferentes en presencia de naranja sypro y se aplica un gradiente de temperatura. Cuando los Nanocuerpos comienzan a desnaturalizar, se une la naranja sypro y la fluorescencia medida se incrementa bruscamente. Puede determinarse una temperatura de fusión para un cierto pH. Los resultados se resumen en C-16.
Tabla C-16: Resultados de las variantes de optimización secuencia de primera ronda de 04C07 La variante básica tiene una potencia similar en la selección alfa de · bloqueo HRG como el Nanocuerpo 04C07 precursor, lo que significa que las mutaciones en las posiciones 14, 74, 84 y 108 fueron aceptadas. Se observó una potencia 3 a 4 veces menor en variantes HER3MS0043 (A46E) y HER3MS0044 (L93A) , que se incrementa hasta una caída de potencial de 18 veces si se combinaron. Todas las variantes tienen una influencia positiva en la estabilidad conforme se obtengan valores Tm más altos para el Nanocuerpo 04C07 precursor. El análisis de sitios de- modificación posterior a la traducción indica la desamidación en la posición N101 (22-29% de desamidación después de 4 semanas de almacenamiento a 40°C y 9-14% de desamidación después de 3 días de almacenamiento a pH9 y'25°C). Se hizo una colección de N101X, se transfectó en E. coli y los Usados periplásmicos que contienen Nanocuerpo se probaron para su capacidad de bloqueo de HRG en un FMAT de competencia asi como por su relación de salida en HER3 recombinante . Todas las variantes probadas dan un 99-100% de bloqueo y una relación de salida 2-3 veces más alta en comparación con el Nanocuerpo 04C07 precursor. Las variantes N101G y N101S se seleccionaron para caracterización adicional. La formación de piroglutamato fue del 6.6% después de 4 semanas almacenamiento a 40°C, que fue aceptable y no requiere una sustitución de aminoácido en la posición 1. Se hicieron cuatro variantes en la segunda ronda de optimización de secuencia. Hubo combinaciones de la variante básica con sustituciones A46E, N101G o N101S (Tabla C-17) . La introducción de la sustitución ?46? resulta en una caída de potencia importante en la selección alfa de competencia HRG y ensayo de bloqueo pHER3 en células MCF7 pero por otro lado incrementan la estabilidad conforme se observó un incremento en Tm de 4.5°C. Estos resultados estuvieron de acuerdo con los resultados de la primera ronda de optimización de secuencia. La mutación de N101 ' a G o S da una caída de potencia de 5 hasta 6 veces y una reducción en Tm de 1.5-2°C. Las variantes HER3MS00129 y HER3MS00130 se seleccionaron para caracterización adicional conforme el formateado pudiera enmascarar su potencia inferior en un formato monovalente. El porcentaje de identidad de ' estructura en la región de estructura para HER3MS00129 es 95.5% y para HER3MS00130 94.4%, con base en la definición AbM.
Tabla C-17: Resultados de variantes de segunda ronda de optimización de secuencia de 04C07 Cinco residuos de aminoácido en 21F06 pueden sustituirse para propósitos de humanización/llamanizacion y pueden analizarse cinco sustituciones de aminoácido para propósitos de estabilidad química. En el proceso de optimización de secuencia, cuatro versiones 21F06 (una versión básica y 3 variantes adicionales) se construyeron. La variante básica (HER3MS0046) contiene 4 sustituciones: A14P, A74S, K83R y Q108L. Además de estos cambios, las sustituciones G40A y D44E se introdujeron e investigaron en variantes adicionales. Los constructos se expresaron, en E. coli y purificaron por IMAC y desalaron. Las moléculas purificadas se evaluaron por su capacidad de bloqueo de HRG usando selección alfa. También se probó la estabilidad térmica de las variantes en un ensayo de cambio térmico usando naranja sypro y se aplica un gradiente de temperatura. Cuando los Nanocuerpos comienzan a desnaturalizarse, se une la naranja sypro y la fluorescencia medida se incrementa bruscamente. Puede determinarse una temperatura de fusión para un cierto pH . Los resultados se resumen en la Tabla C-18.
Tabla C-18: Resultados de variantes de humanización 21F06 en la primera ronda de optimización de secuencia Todas las variantes probadas tiene una potencia similar en la selección alfa de bloqueo HRG como el Nanocuerpo 21F06 precursor, lo que significa que las mutaciones en las posiciones 14, 40, 44, 74, 84 y 108 fueron aceptadas. La sustitución G40A resulta en un valor Tm incrementado, lo que sugiere que tiene un efecto positivo en la estabilidad del Nanocuerpo. Para dar con 2 sitios de isomerización potenciales y un sitio de oxidación et, se hicieron bibliotecas donde los aminoácidos D54, G55, MIOOb, D101 y S102 se distribuyeron al azar. Las bibliotecas se transformaron en TG1 y se tomaron colonias individuales e hicieron crecer en placas de 96 pozos. Se prepararon extractos periplásmicos , procesaron por secuencia y seleccionaron. Todas las variantes probadas así como precursor 21F06 dan un bloqueo completo en un experimento FMAT. de competencia HRG y el análisis de relación de salida tampoco podría discriminar entre estas variantes y precursor 21F06 ( 6.2E-4-8.3E-4 ) . Se seleccionaron algunas variantes (con base en características similares de aminoácido original y sustituido) para purificar y probar su estabilidad térmica. Los resultados se muestran en C-19.
Tabla C-19: Resultados Tm de variantes de estabilidad química 21F06 en la primera ronda de optimización de secuencia El análisis de sitios de modificación posteriores a la traducción indica piroglutamato al 14% después de 4 semanas almacenamiento a 40°C y no se introdujo sustitución en la posición 1. Se observó trece por ciento del material mono-oxidado después de 3 h de tratamiento con H2C>2 10 mM a temperatura ambiente. Se requirió la sustitución de MIOOb y se seleccionó la mutación . MIOObL con base en datos de selección y similitud física entre M y L. El almacenamiento de 21F06 precursor bajo condiciones de desamidación forzada (4 semanas a 40°C o 3 días a pH9 y 25°C) induce el 20% de desamidación en la posición N73. Sin embargo, el porcentaje de desamidación sólo fue 3.2 después de 3 semanas almacenamiento a 25°C. El análisis de una variante 21F06 que contiene la mutación básica A74S muestra un porcentaje ligeramente más alto de desamidación: 37.1% después de almacenar en condiciones de desamidación forzadas (3 días a pH9 y 25°C) y 4.9% después de 3 semanas almacenamiento a 25°C. Se concluyó para mantener A74S para caracterización adicional en una segunda ronda de optimización de secuencia conforme esto incrementa el porcentaje de identidad de estructura comparado con anticuerpos humanos y desamidación debiera mantenerse bajo control durante DSP/USP ya que sólo una fracción desamidada de <5% se observó en las condiciones a 25°C. Finalmente, el 12.9% de desamidación se observó de D54 y la mutación D54E se seleccionó con base en datos de selección y similitud física entre D y E.
Se hizo la segunda .ronda de optimización de secuencia 21F06 variante HER3 S00122 la cual combina las sustituciones A14P, G40A, D44E, A74S, K83R y Q108L. Esta variante y precursor 21F06 da un IC50 similar en un ensayo de competencia de selección alfa HRG asi como en el ensayo de bloqueo pHER3 usando células MCF7 y muestra un valor Tm idéntico. 21F06 variante HER3MS00122 tiene 91% de identidad de estructura en la región de estructura de acuerdo con la definición AbM.
Con base en estos' resultados, HER3MS00122 se seleccionó como el Nanocuerpo 21F06 optimizado de secuencia final.
Cinco residuos de aminoácidos en 18G11 pueden sustituirse para propósitos de humanización y pueden analizarse cuatro sustituciones de aminoácido para propósitos de estabilidad química. En este caso se hizo la variante básica, que contiene mutaciones K83R y Q108L. Luego, se construyó una mini-colección- de la variante básica con 26 = 64 permutaciones en las posiciones 44, 61, 64, 74, 75 y 77. La mutación H93A no se investigó ya que esta mutación es cercana a CDR3 lo que incrementa la oportunidad de que la humanización pudiera afectar la potencia del Nanocuerpo.
Las bibliotecas se transformaron en TG1 y se tomaron colonias individuales e hicieron crecer en placas de 96 pozos. Se prepararon extractos periplásmicos , procesaron por secuencia y seleccionaron para competencia con 10G11 precursor biotinilado para unir HER3-FC recombinante . El Nanocuerpo 18G11 precursor y su variante básica HER3MS0050 muestra potencia idéntica en selección alfa (IC50 3.2E-9 M) y una Tm idéntica de 72°C. La sustitución W75K no se toleró ya que se observó una pérdida total en la unión HER3. Se probaron treinta y tres competidores únicos para relación de salida en HER3-ECD recombinante. La mayoría de los clones están dentro de un intervalo kd 2 veces más alto comparado con el precursor 18G11 (kd 6.2-7.7E-4 s"1) , sólo tres variantes muestran una relación de salida 2-3 veces más alta. Los resultados sugieren que las sustituciones E64K, T74S, A77T, 83R, Q108L no tienen efecto en la potencia o estabilidad de 18G11, mientras que un 28% de reducción en la potencia se observó en presencia de sustitución R44Q. Sin embargo, la sustitución R44Q incrementa los valores de Tm con alrededor de 4°C lo que sugiere que la estabilidad de las moléculas se mejora.
El análisis de sitios de modificación posteriores a la traducción revela una formación de piroglutamato al 12.3% en la posición 1 después de 4 semanas almacenamiento a 40°C pero este nivel no requiere sustitución de El. No podría detectarse variantes de isomerización en la posición 95 después de 4 semanas almacenamiento a 40°C y sólo se observó oxidación importante en los aminoácidos 99 y M102 (variante mono-oxidada al 30-40% después de oxidación forzada usando H2O2 10 mM durante 3 h a temperatura ambiente) . Se hicieron dos bibliotecas de sustitución para dar con estos sitios de oxidación Met (M99X y M102X) . Las bibliotecas se transformaron en TG1 -y se tomaron colonias individuales e hicieron crecer en placas de 96 pozos. Los extractos periplásmicos se prepararon, procesaron por secuencia y seleccionaron para competencia con 10G11 precursor biotinilado para unir HER3-Fc recombinante . Posteriormente, 18 competidores únicos se probaron en selección de relación de salida en HER3-ECD recombinante. Dieciseis clones muestran valores kd idénticos como el 18G11 precursor (6.10E-4 s-1). Se seleccionaron siete variantes para purificación y caracterización adicional para su capacidad para bloquear señalización pHER3 en células MCF7 y su estabilidad usando el ensayo de cambio térmico. Los resultados se muestran en la Tabla C-20. Las sustituciones 99L y M102L se seleccionaron para probar en una segunda ronda optimización de secuencia con base en potencia, estabilidad y propiedades físicas similares de leucina y metionina. labia C-20: Resultados de variantes 18611 en la primera ronda de optimización de secuencia En la segunda ronda de optimización de secuencia 18G11, se hicieron dos variantes que combinan las sustituciones seleccionadas para propósitos de humanización y estabilidad química. La única diferencia entre ambas variantes fue la presencia/ausencia de R44Q. Ambas variantes muestra un incremento de alrededor de 6°C en el valor de Tm comparado con el Nanocuerpo precursor (Tabla C-21) . Finalmente, la variante 18G11 HER3MS00211 se seleccionó como ausencia de la mutación R44Q que resulta en una potencia ligeramente mejor. El porcentaje de identidad de estructura obtenido en la región de estructura fue 87.6 de acuerdo con la definición 7AbM (ver Antibody Engineering, Vol 2 por Kontermann & Diibel (Eds), Springer Verlag Heidelberg Berlín, 2010) .
Tabla C-21 Resultados de variantes 18G11 en la segunda ronda optimización de secuencia Pueden sustituirse siete residuos de aminoácido en 34C07 para propósitos de humanización. En este caso se hizo la variante básica, que contiene mutaciones K83R y Q108L. Luego, se construyó una mini-biblioteca de la variante básica con 7 mutaciones únicas adicionales se extiende sobre 6 posiciones variables (25 x 3 = 96 permutaciones) . La mutación H93A no se investigó ya que esta mutación es cercana a CDR3 lo que incrementa la oportunidad de que la humanización pudiera afectar la potencia del Nanocuerpo. Las bibliotecas se transformaron en TG1 y se tomaron colonias individuales e hicieron crecer en placas de 96 pozos. Los extractos periplásmicos se prepararon, procesaron por secuencia y seleccionaron para competencia con 34C07 precursor biotinilado para unir HER3-Fc recombinante . Se probaron doce competidores únicos para relación de salida en HER3-ECD recombinante. La mayoría de los clones están dentro de un intervalo kd 2 veces más alto comparado con 34C07 precursor (kd 3.7E-4-3.9E-4 s'1 ) . La mutación 75K muestra menos de 40% de inhibición en la selección alfa de competencia 34C07 y un incremento de 95 de veces en la relación de salida comparado con 34C07 precursor. Las sustituciones G19R, V23A, V71R, A74S, V84P y V84A no afectan la unión a HER3.
El análisis de sitios de modificación posteriores a la traducción revela una formación de piroglutamato al 42% después de 4 semanas de almacenamiento a 40 °C. Por lo tanto, el efecto de la sustitución E1D en la potencia dé Nanocuerpo se analizó en la segunda ronda optimización de secuencias. No se identificaron oxidación (H2O2 10 mM durante 3 h a temperatura ambiente), desamidación (4 semanas a 40°C) o isomerización Asp (4 semanas a 40 °C) de manera que no se necesitó sustituir aminoácidos adicionales para propósitos de estabilidad química.
Se hicieron cuatro constructos en la segunda ronda de optimización de secuencia. Todas contienen las sustituciones G19R, V23A, V71R, A74S, K83R y Q108L pero fueron diferentes para E1D, V84A y V84P (Tabla C-22) . Los constructos se expresaron en E. coli y purificaron por IMAC y desalaron. Las moléculas purificadas se caracterizaron usando la selección alfa de competencia 34C07, análisis de relación de salida en HER3-ECD y ensayo de bloqueo pHER3 en células MCF7 estimuladas con HRG. Los resultados se resumen en Tabla C-22.
Tabla C-22 : Resultados de variantes 34C07 en la segunda ronda de optimización de secuencia Se confirmó que las sustituciones investigadas no tienen influencia en la unión de forma importante. Además, el bloqueo pHER3, relación de salida y Tm fueron similares para todas las variantes probadas y el Nanocuerpo 34C07 precursor. La variante final se vuelve HER3MS00123 y HER3MS00127 (que contiene la mutación E1D en caso de que el Nanocuerpo sea de terminal N localizado e.n el constructo multivalente ) . El porcentaje de identidad de estructura en la región de estructuras para HER3MS00123 es 89.9% y para HER3 S00127 es 88.8% con base en la definición AbM.
Pueden sustituirse seis residuos de aminoácido en 17B05 para propósitos de humanización y pueden analizarse dos sustituciones de aminoácido para propósitos de estabilidad química. En este caso se hizó la variante básica, que contiene mutaciones A74S,- K83R y Q108L. Luego, se hicieron nueve constructos que contienen las mutaciones y combinaciones básicas de las tres mutaciones adicionales que se investigaron (I73N, F79Y y R93A) .
Los constructos se expresaron en E. coli y purificaron por IMAC y desalaron. Las moléculas purificadas se probaron por su capacidad para bloquear la unión de HRG a HER3-FC usando selección alfa, relación de salida en HER3-ECD y estabilidad usando el ensayo de cambio térmico. Los resultados se resumen en C-23.
Tabla C-23 : Resultados de variantes 17B05 en la primera ronda de optimización de secuencia Se obse rvó al menos una reducción de 9 veces en la potencia en la selección alfa de bloqueo HRG cuando se introdujo la sustitución . R93A en el constructo, mientras que otras sustituciones resultan en un IC50 similar comparado con 17B05 precursor. Se confirmó esta observación por los datos de relación de salida. La mayoría de las mutaciones también tienen un efecto positivo pequeño en el valor Tm.
El análisis de sitios de modificación posteriores a la traducción revela una formación de piroglutamato al 25% después de 4 semanas almacenamiento a 40 °C. Por lo tanto, el efecto de la sustitución E1D en la potencia de Nanocuerpo se analizó en la segunda ronda optimización de secuencia. No se identificaron oxidación (H2O2 10 mM durante 3 h a temperatura ambiente) o desamidación Asn (4 semanas a 40 °C) de manera que no fue necesario sustituir aminoácidos adicionales para propósitos de estabilidad química.
Se hicieron cuatro constructos en la segunda ronda de optimización de secuencias. Todos estos contienen las sustituciones I73N, F79Y, A74S, · K83R y Q108L pero fueron diferentes para E1D, S84A y S84P (Tabla C-24) . Los constructos se expresaron en E. coli y purificaron por IMAC y desalaron. Las moléculas purificadas se caracterizaron usando la selección alfa de competencia HRG en HER3-Fc, análisis de relación de salida en HER3-ECD y ensayo de bloqueo pHER3 en células MCF7. Los resultados se resumen en Tabla C-24.
Tabla C-24: Resultados de variantes 17B05 en la segunda ronda de optimización de secuencia Se confirmó que las sustituciones investigadas no tienen influencia en la unión y competencia HRG de forma importante. Además, IC50s por bloqueo pHER3 fueron similares para todas las variantes probadas y el Nanocuerpo 17B05 precursor. La introducción de S84P tiene un efecto positivo . en Tm. La variante final se vuelve HER3MS00119 y HER3MS00121 (que contiene la mutación E1D en el caso en que el Nanocuerpo se localize en la terminal N en el constructo multivalente) . El porcentaje de identidad de estructura en las regiones de estructura para HER3MS00119 ise89.9% y para HER3 S00121 es 88.8% con base en la definición AbM.
Ejemplo 19: Análisis de nivel de generación y expresión de Nanocuerpos específicos de HER3 que optimizan la secuencia multivalente con HLE Se hicieron combinaciones de Nanocuerpos que optimizan la secuencia que bloquea la unión de HRG a HER3 (21F06, 04C07 y 17B05), un Nanocuerpo que bloquea la heterodimerizacion HER3 (17B05) y un Nanocuerpo unido al dominio II de HER3 (18G11). La extensión- de vida media ALB se localizó a la mitad (Nbl-ALB-Nb2 ) o en la posición de terminal C (Nbl-Nb2-ALB) . Los diferentes bloques de construcción se conectaron con dos ligadores 9GS o dos ligadores 35GS. Los constructos se produjeron en Pichia pastoris como proteínas sin etiquetar y se purifican por medio de hipercélula MEP o cromatografía de afinidad de Proteína A, seguido por desalado. Se realizó una copia del número de selección y se predijeron los rendimientos de expresión para los clones con el número de copia más alto con base en los cultivos de escala pequeña (Tabla C-25) . Se observó poco impacto de la posición de los bloques que construyen Nanocuerpo y longitud del ligador en rendimientos predichos .
Tabla C-25: Resultados del análisis de de nivel de expresión de secuencia multivalente purificada optimizada con Nanocuerpos anti-HER3 con ALB 11 HLE E emplo 20 : Inducción de internalización HER3 por los Nanocuerpos que optimizan la secuencia multivalente ALB 11 HLE El efecto de Nanocuerpos que optimizan la secuencia multivalente específicos de HER3 con HLE en internalización HER3 se evaluó usando células ' MCF-7 y MALME-3M como se describe en los ejemplos previos. No se observó internalización cuando se presentó 21F06 en un constructo multivalente . En los constructos sin 21F06, sólo se observó internalización (36-71%) cuando se presentó 17B05 o 04C07 en la posición de terminal N. Los resultados (Tabla C-26) fueron idénticos en ambas líneas celulares. El constructo HER3MS00209 consiste de 17B05 optimizado en secuencia ligado a ALB11 y no muestra internalización. Estos resultados fueron similares a aquellos obtenidos con los constructos multivalentes precursores e indican que el panel multivalente seleccionado contiene moléculas con diferente modo de acciones . También se probaron dos anticuerpos de control en el ensayo de internalización e inducen ambos la internalización de HER3.
Tabla C-26: Porcentaje de Internallzacion HER3 inducida por Nanocuerpos que optimizan la secuencia muítivalente o MAbs de control en células MCF7 y MALME-3M. 5 10 15 Ejemplo 21: Inhibición de pHER3 inducida por HRG y señalización cadena abajo por Nanocuerpos que optimizan la secuencia multivalente ,con ALB11 HLE en ensayos celulares Para determinar la potencia de Nanocuerpos que optimizan la secuencia multivalente en inhibir la fosforilación inducida por el ligando de HER3 y transfosforilación EGFR/HER3 y HER2/HER3, se probaron Nanocuerpos en ensayos basados en células como se describe a continuación.
Inhibición de pHER3 inducida por ligando (fosfoHER3) en células MCF-7 (ensayo electroquimioluminiscente basado en célula (ECLA) ) : células MCF-7 (ATCC HTB 22) se privaron de suero e incubaron previamente con Nanocuerpos (diluciones en serie, concentración iniciando de 666nM o 167 nM) en medio libre de suero por 60min a 37°C, CO2 al 5%. Las células se estimularon con 50ng/ml de dominio HRGl-ß? EGF (R&D Systems, #396-HB) por 10 mins, se descartaron los sobrenadantes y las células se lisaron en solución amortiguadora de lisis NP-40 fría (NP-40 al 1%, Tris 20m , pH8.0, NaCl 137mM, glicerol al 10%, EDTA 2m , conjunto cóctel inhibidor de proteasa III (Calbiochem) , conjunto cóctel inhibidor de fosfatasa II (Calbiochem) ) . Se bloquearon placas de 96 pozos MA6000 (MSD, # L15XB) con bloque A al' 3% (MSD) en PBS, pH7.4, Tween20 al 0.05% y recubre con anticuerpo de captura especifico HER3 (R&D Systems, # MAB3481) . Los Usados celulares se agregaron e incubaron durante 2h a temperatura ambiente (TA) . El anticuerpo de Tirosina anti-fosfo biotinilado (R&D Systems, # BAM1676) y reactivo de estreptavidina de etiqueta sulfo (MSD, #R32AD) se usaron para detección (Tabla C-27) . 21.1 Inhibición de trañsfosforilación EGFR/HER3 y HER2/HER3: Las células MDA MB468 (ATCC HTB 132) y CHO HER2/HER3 se privaron de suero y trataron como se describe arriba (estimulación MDA MB468 con 50ng/ml de dominio HRGl-ß? EGF; estimulación de células CHO HER2/HER3 con 100ng/ml dominio HRGl-ß? EGF) . Los Usados celulares se probaron en pHER3 ECLA (Tabla C-27) .
Los Nanocuerpos que optimizan la secuencia multivalente con Albll inhiben de forma potente señalización HER3 inducida por HRG en células MCF-7, asi como células que expresan HER2/HER3 (CHO HER2/HER3) o células que expresan EGFR/HER3 ( DA-MB468 ) . Además se inhibió de forma potente la señalización cadena abajo. Albll no suprime a potencia en los formatos probados . 21.2 Inhibición de señalización cadena abajo (pAkt/pERKl/2) : Inhibición de señalización cadena abajo (pAkt/pERKl/2 ) : Inhibición de pAKT y pERK inducida por ligando (fosfoAkt, fosfor ERK) en células MCF-7 (ensayo electroquimioluminiscente basado en célula (ECLA) ) : células MCF-7 (ATCC HTB 22) se privaron de suero e incubaron previamente con Nanocuerpos . (diluciones en serie, concentración iniciando de 666nM o 167nM) en medio libre de suero por 60min a 37°C, CO2 al 5%. Las células se estimularon con 50ng/ml de dominio HRGl-ß? EGF (R&D Systems, #396-HB) por 10 mins, se descartaron los sobrenadantes y las células se lisaron en solución amortiguadora de lisis NP-40 fría (NP-40 al 1%, Tris 20mM, pH8.0, NaCl 137mM, glicerol al 10%, EDTA 2m , conjunto cóctel inhibidor de proteasa III (Calbiochem) , conjunto cóctel inhibidor de fosfatasa II (Calbiochem)) . Los lisados celulares se probaron en Kit de Lisado Celular Entero Fosfo-Akt (Ser473) (MSD, # K151CAD) y Kit de Lisado Celular Entero Fosfo-ERKl/2 (MSD, # Kl 11DWD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tabla C-28).
Los Nanocuerpos formateados que optimizan la secuencia fueron capaces de bloquear de forma potente la señalización cadena abajo inducida por HRG de HER3.
Tabla C-27: Inhibición de pHER3 inducida por HRG Tabla C-28 : Inhibición de pAKt y pERK inducida por HRG Ejemplo 22: Análisis de la capacidad de bloqueo de heterodimerización HER1-HER3 de los Nanocuerpos que optimizan la secuencia multivalente con ALB11 HLE en ensayos celulares Para determinar la potencia de Nanocuerpos que optimizan la secuencia multivalente en inhibir fosforilación de HER3 inducida por ligando EGFR, los Nanocuerpos se probaron en ensayos basados en células como se describe a continuación.
Inhibición de pHER3 inducida por ligando EGFR ( fosfoHER3 ) en células CHO EGFR/HER3 (ensayo electroquimioluminiscerite basado en célula (ECLA) ) : CHO EGFR/HER3 se privaron de suero e incubaron previamente con Nanocuerpos (diluciones en serie, concentración iniciando de 666nM o 167 nM) en medio libre de suero por 60min a 37°C, C02 al 5%. Las células se estimularon con 100ng/ml de rhTGFa (R&D Systems, #239-A) , por 10 mins, se descartaron los sobrenadantes y las células se Usaron en solución amortiguadora de lisis NP-40 fría (NP-40 al 1%, Tris 20m , pH8.0, NaCl 137mM, glicerol al 10%, EDTA 2m , conjunto cóctel inhibidor de proteasa III (Calbiochem) , conjunto cóctel inhibidor de fosfatasa II (Calbiochem) ) . Se bloquearon placas de 96 pozos MA6000 (MSD, # L15XB) con bloque A al 3% ( SD) en PBS, pH7.4, Tween20 al 0.05% y recubre con anticuerpo de captura especifico HER3 (R&D Systems, # MAB3481) . Los lisados celulares se agregaron e incubaron durante 2h a temperatura ambiente (TA). El .anticuerpo de Tirosina anti-fosfo biotinilado (R&D Systems, # BA 1676) y reactivo de estreptavidina de etiqueta sulfo (MSD, #R32AD) se usaron para detección (Tabla C-29) . Los Nanocuerpos multivalentes que optimizan la secuencia que contiene 17B05 como bloque de construcción inhiben de forma potente la fosforilación HER3 inducida por el ligando EGFR. Se observó inhibición parcial con el Nanocuerpo multivalente 214 (HER3MS0021 ) , que no incluye 17B05 como un bloque de construcción.
Tabla C-29: Inhibición de fosforilación de HER3 inducida por ligando EGFR * inhibición parcial Ejemplo 23: Capacidad de .bloqueo de migración de Nanocuerpos que optimizan la secuencia multivalente con ALB11 HLE La capacidad de Nanocuerpos formateados que optimizan la secuencia para inhibir la migración de célula dependiente de HRG1-ß? se evaluó en el siguiente ensayo. Se sembraron células A431 (CRL 1555) en insertos de placa de 96 pozos HTS Fluoroblok (BD Falcon #351164) en presencia de Nanocuerpos (diluciones en serie; iniciando en 666nM) . Se agregó medio más dominio extracelular HRGl-ß? 500nM (R&D Systems,. #377-HB) al fondo de los pozos. Se tiñeron las células migradas con CalceinAM y se detecta la fluorescencia por un lector de placa. Los Nanocuerpos HER3MS00135, HER3MS00212, y HER3 S00215 inhiben de forma potente la migración de célula A431 (Tabla C-30) . Todas las secuencias formateadas probadas optimizan la migración de célula inducida por ligando que bloquea de forma potente los Nanocuerpos optimizados.
Tabla C-30: Inhibición de migración de célula A431 inducida por HR6 Ejemplo 24: Especificidad de HER3 de Nanocuerpos específicos de HER3 optimizados por secuencia multivalente con HLE La unión de objetivo' completo de Nanocuerpos específicos de HER3 con HLE se evaluó, al medir su capacidad de unión para Fc-HERl (R&D Systems, 344-ER) , Fc-HER2 (R&D Systems, 1129-ER) y Fc-HER4 (R&D Systems, 1131-ER) recubierto en placas ELISA. Se probaron diluciones en serie de los Nanocuerpos iniciando a una concentración de 500 nM y se dio la detección usando el Nanocuerpo 02H05 específico de ALB biotinilado y estreptavidina HRP (Dako, P0397) . Se usó la unión al Fc-HER3 (R&D Systems, 348-RB) como el control positivo para los Nanocuerpos específicos de HER3. Los anticuerpos policlonales anti-HERl (R&D Systems, AF231) , anti-HER2 (R&D Systems, AF1 129), anti-HER3 (R&D Systems, AF234) y anti-HER4 (R&D Systems, AF1 131) se. usaron como control de calidad del recubrimiento HER en las placas. Los resultados en las Figures 3A hasta 3D muestran que los Nanocuerpos optimizados por la secuencia multivalente se unen a HER3 (Figure 3B) pero no a las otras proteínas HER (Figures 3A, 3C y 3D) .
Ejemplo 25: Reactividad cruzada de especies de Nanocuerpos específicos HER3 que optimizan la secuencia multivalente con HLE La reactividad cruzada de especies de Nanocuerpos específicos HER3 que optimizan la secuencia multivalente con HLE se analizó al medir la capacidad de unión de estas moléculas a células Flp-In de ovario de hámster chino transfectadas con HER3 humano, HER3 de ratón o HER3 cyno por FACS . Las diluciones en serie que inician a una concentración de 1 µ? se incubaron con las células y se dio la detección usando el Nanocuerpo 02H05 específico de ALB biotinilado y estreptavidina PE (BD Pharmingen, 554061). Los valores EC50 obtenidos fueron máximo 4.4 veces diferentes cuando se compara la unión al HER3 humano con HER3 de ratón o HER3 cyno, lo que sugiere reactividad cruzada entre HER3 humano, ratón y cyno (Tabla C-31) .
Tabla C-31 : valores EC50 de Nanocuerpos específicos HER3 que optimizan la secuencia multivalente con HLE en un ensayo de unión FACS a células CHO-FlpLn transfectadas con HER3 de humano , ratón y cyno 5 15 Ejemplo 26: Unión de Nanocuerpos específicos HER3 que optimizan la secuencia multivalente con ALB11 HLE a albúmina de suero Se determinó la afinidad de unión de tres Nanocuerpos específicos HER3 que optimizan la secuencia multivalente con extensión de vida media ALB11 para albúmina de suero humano, de ratón y cyno por resonancia de plasmón de superficie usando Biacore. Se unieron covalentemente albúmina de suero de humano (Sigma #A3782), cyno (en producción casera) y ratón (Sigma, #A3559) a la superficie de placa de detección por medio de acoplamiento amina usando EDC/NHS para activación y etanolamina HC1 para desactivación. Los Nanocuerpos se inyectaron por 2 minutos a una relación de flujo de 45 µ?/min para permitir la ?????· al antígeno unido a la microplaqueta. A continuación, se envió la solución amortiguadora de enlace sobre la microplaqueta en la misma relación de flujo para permitir la disociación espontánea del nanocuerpo unido. Los parámetros cinéticos valores kon (ka), valores koff (kd) y KD se calcularon de los sensogramos ' obtenidos de los diferentes Nanocuerpos (Tabla C-32) . .
Tabla C-32 : Parámetros cinéticos de Nanocuerpos específicos HER3 que optimizan secuencia multivalente Ejemplo 27: Inhibición de pHER3 y señalización cadena abajo en lineas de célula de cáncer humano.
Los Nanocuerpos formateados que optimizan la secuencia inhiben de forma potente pHER3 y señalización cadena abajo en lineas de célula de cáncer humano como se muestra por MCF-7 (Ejemplo 21 enseguida) y- otros tipo una linea de célula de cáncer pancreática BxPC3 y una linea de cáncer de mama BT-474. 17B05 y Nanocuerpos formateados incluyendo 17B05 que optimiza la secuencia (HER3MS00119) como bloque de construcción inhiben la señalización HER3 en tanto la conducción EGFR/HER3 (en células BxPC3) así como líneas celulares HER2/HER3 (BT-474, línea celular que sobreexpresa Her2). Las células BxPC3 (ATCC CRL-1687) y BT-47 (ATCC HTB-20) se privaron de suero e incubaron previamente con Nanocuerpos (diluciones en serie, concentración iniciando de 167nM) por 60min a 37°C, C02 al 5%. Las células se estimularon con 100ng/ml de dominio HRGl-ß? EGF (R&D Systems, #396-HB) por 10 mins, se descartaron los sobrenadantes y las células se lisaron en solución amortiguadora de lisis RIPA fría (NP-40 al 1% (Nonidet P40) , desoxicolato de sodio al 0.5% (V/V) , SDS al 0.1% (V/V) , Tris/HCl 50 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, conjunto cóctel inhibidor de proteasa III (Calbiochem) , conjunto cóctel inhibidor de fosfatasa II (Calbiochem) ) por 45min a 4°C. Después de centrifugar, se agregó solución amortiguadora de muestra 4x (Biorad #161-0791} a los sobrenadantes y las muestras se analizaron por SDS-PAGE (Criterion. XT precast get, 4-12%, Bis Tris, Biorad #345-0125) seguido por WB. Anticuerpos de detección: pHER3 Tyrl289 (Señalización Celular' #4791), pHER3 pTyrll97 (Señalización Celular #4561), . pAkt (Ser473) (Señalización Celular #4060), pERKl/2 (Thr202/Thr204 ) (Señalización Celular #9101), HER3 (Millipore #05-390), Akt (Señalización Celular #9272), EKR1/2 (Señalización Celular #4695).
Los resultados se muestran en las Figuras 5A y 5B, asi como Figuras 6A hasta 6C. La Figura 5 muestra la inhibición de pHER3 y señalización cadena abajo en células de cáncer de mama BT-474 por Nanocuerpos formateados que optimizan la secuencia: Figura 5A) : carriles 1-6 Nanocuerpo HER3MS00135 (0, 0.65, 2.7, 10, 42,. 167nM) , carriles 7-12 Nanocuerpo HER3MS00212 (0, 0.65, 2.7, 10, 42, 167nM), carriles 13-18 Nanocuerpo HER3MS00215¦ (0, 0.65, 2..7, 10, 42, 167nM) , carril 19 células sin tratar, no estimuladas. Figura 5B) : carriles 7-12 Nanocuerpo HER3MS00119 (0, 0.65, 2.7, 10, 42, 167n ) . La Figura 6 muestra la . inhibición de pHER3 y señalización cadena abajo en células de cáncer de mama BxPC3 por Nanocuerpos formateados que optimizan la secuencia: Figura 6A) : carriles 13-18 Nanocuerpo HER3MS00.119 (0, 0.65, 2.7, 10, 42, 167nM) , carriles 19-24 HER3MS00135 (0, 0.65, 2.7, 10, 42, 167n ) . Figura 6B) carriles 1-6 HER3MS00213 (0, 0.65, 2.7, 10, 42, 167nM), 7-12 HER3MS00214 (0, 0.65, 2.7, 10, 42, 167nM) . Figura 6C): carriles 1-6 HER3MS00209 (0, 0.65, 2.7, 10, 42, 167nM), carriles 7-12 HER3MS00212 (0, 0.65, 2.7, 10, 42, 167n ), carriles 13-18 HER3MS00215 (0, 0.65, 2.7, 10, 42, 167nM), carril 19 células sin tratar, no estimuladas, carriles 20-24 Nanocuerpo de- control sin tratar (0.65, 2.7, 10, '42, 167nM) .
Ejemplo 28: Modelo in vivo ?549: Inhibición de crecimiento de tumor por Nanocuerpos formateados que optimizan la secuencia Para evaluar la eficacia de Nanocuerpos formateados que optimizan la secuencia, se estableció el modelo de xenoinjerto A549 de cáncer de pulmón humano en ratones sin pelo y se evaluó la inhibición .del crecimiento de tumor a dosis múltiples. Se adquirieron ratones sin pelo deficientes en célula T/sin peso (ratones hembra de 6 semanas de edad originados en NIH, de columna albina, de resultado) de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) para estudios de xenoinjerto. Se hicieron crecer células A549 (ATCC, CCL-185) en medio de cultivo (RPMI, 10 FBS; L-glutamina, 37 °C, C02 al 5%) . Se inyectaron los ratones con células 5E+6 en ???µ? de PBS en el flanco derecho subcutáneamente. Se vigiló el peso corporal y crecimiento de tumor inicial. Después de 13 días los tumores alcanza un volumen promedio de 174 mra3 y los ratones se distribuyeron al azar en grupos de 10. Se dosificaron los ratones intra-peritonealmente cada tercer día con lmg/kg, 3mg/kg, o 10mg/kg de Nanocuerpos HER3MS00135, HER3MS00212, o HER3MS00215, respectivamente. Se usó Albll como control a 10mg/kg. Se usó PBS como control de vehículo. La duración del tratamiento fue 20 días. Se registraron el volumen del tumor y peso corporal dos veces a la semana. Se analizaron los datos de porcentaje de peso corporal por ANOVA de Una Via seguido por comparaciones post-hoc de Dunnett contra los controles. Se analizaron los datos de volumen de tumor por ANOVA de Mediciones. Repetidas seguido por comparaciones en pares Bonferrioni post-hoc (a=0.05).
Los volúmenes de tumor medios de cada grupo de control y tratamiento se muestran en las Figuras 7? hasta 7C (para HER3MS00135, HER3MS00212 y HER3MS00215, respectivamente) .
La administración de los Nanocuerpos resulta en inhibición del crecimiento de tumor dependiente de la dosis importante del modelo de xenoingerto de cáncer de pulmón humano cuando se compara con tumores tratados con control de vehículo PBS o Albll.

Claims (32)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Una proteina o polipéptido que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (tal como dos o tres) dominios variables sencillos de inmunoglobulina que son cada uno dirigidos a y/o que pueden cada uno unir específicamente un HER3 humano (SEQ ID NO: 1), caracterizado porque cada uno de tales dominios variables sencillos de inmunoglobulina se elige independientemente de: a) ISV's que son capaces de inhibir o bloquear el enlace de HRG a HER-3; y/o b) ISV s que son capaces de inhibir o bloquear heterodimeri zación de HER-3; y/o c) ISV's que son capaces de enlazar al dominio II de HER-3.
2. La proteína o polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende o consiste esencialmente de: a) al menos una (tal como una) ISV que es capaz de inhibir o bloquear heterodimerización de HER-3; y b) al menos una (tal como una) ISV que es capaz de inhibir o bloquear la unión de HRG a HER-3.
3. La proteina o polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende o consiste esencialmente de: a) al menos una (tal como una) ISV que es capaz de inhibir o bloquear hetérodimerización de HER-3; y b) al menos una (tal como una) ISV que es capaz de unirse al dominio II de HER-3.
4. La proteina o polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o 3, caracterizado porque la ISV que es capaz de unirse al dominio II de ' HER-3 es capaz de inhibir o bloquear la transfosforilación HER-3
5. Una proteína o polipéptido que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (tal como dos o tres) dominios variables sencillos de inmunoglobulina que son cada uno dirigidos a y/o que pueden cada uno unir específicamente un HER3 humano (SEQ ID NO: 1), caracterizado porque cada uno de tales dominios variables sencillos de inmunoglobulina se elige independientemente de: secuencias tipo 21F06, secuencias tipo 04C07, secuencias tipo 17B05, secuencias tipo 18G11 y/o secuencias tipo 34C07.
6. La proteína o polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, 2 o 5, caracterizado porque comprende: a) al menos una (tal como una) ISV que es una secuencia tipo 17B05; y b) al menos una (tal como una) ISV que es una secuencia tipo 21F06.
7. La proteina o polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, 3, 4 o 5, caracterizado porque comprende: a) al menos una (tal como una) ISV que es una secuencia tipo 17B05; y b) al menos una (tal como una) ISV que es una secuencia tipo 18G11.
8. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7, caracterizado porque se ha proporcionado con una vida media incrementada, por ejemplo por funcionali zación y/o al incluir en la proteina o polipéptido una porción o unidad de unión que incrementa la vida media del constructo.
9. La proteina o' polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 8, caracterizado porque se ha proporcionado con una vida media incrementada, por ejemplo por funcionalización y/o al incluir en la proteina o polipéptido un péptido o unidad de unión que puede unirse a una proteina de suero tal como albúmina de suero.
10. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 9, caracterizado porque comprende un ISV que se dirige a albúmina de suero humano .
11. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 10, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NOs 147 - 327, preferiblemente SEQ ID NO:282, SEQ ID NO: 319 SEQ ID NO:322.
12. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 11, caracterizado porque las secuencias -de aminoácido de las ISV s se eligen independientemente del grupo que consiste de SEQ ID NOs 12 hasta 26, preferiblemente SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO:22.
13. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 12, caracterizado porque al menos una de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de los dominios variables ' sencillos de inmunoglobulina tienen al menos 90% de identidad de aminoácidos con las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de al menos uno de los dominios variables sencillos de inmunoglobulina dé SEQ ID NO's: 12 hasta 26.
14. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, caracterizado porque el dominio variable sencillo de inmunoglobulina: i) tiene al menos 80% de identidad de aminoácidos con al menos uno de los . dominios variables sencillos de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 12 hasta 26, en que para los propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácido, los residuos de aminoácido que forman las secuencias CDR se ignoran; y en que: ii) preferiblemente uno o. más de los residuos de aminoácido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla B-2.
15. Dominio variable sencillo de inmunoglobulina, caracterizado porque se dirige contra y/o que puede unir específicamente un HER3 humano (SEQ ID NO: 1).
16. Dominio variable sencillo de inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque es capaz de inhibir o bloquear la unión de HRG a HER-3.
17. Dominio variable sencillo de inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 15 o 16, caracterizado porque se elige del grupo que consiste de las secuencias tipo 21F06 y las secuencias tipo 04C0 .
18. Dominio variable sencillo de inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque es capaz de inhibir o bloquear la heterodimerización de HER-3.
19. Dominio variable sencillo de inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 15, 16 o 18, caracterizado porque se elige del grupo- que consiste de las secuencias tipo 17B05.
20. Dominio variable sencillo de inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque es capaz de inhibir o bloquear transfosforilación HER-3.
21. Dominio variable sencillo de inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque es capaz de unirse al dominio II de HER-3.
22. Dominio variable sencillo de inmunoglobulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 hasta 21, caracterizado porque es capaz de inhibir o bloquear fosforilación HER-3.
23. Dominio variable sencillo de inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 15, 21 o 22, caracterizado porque se elige del grupo que consiste de las secuencias tipo 18G11 y las secuencias tipo 34C07.
24. Dominio variable sencillo de inmunoglobulina (ISV) de conformidad con' cualquiera de las reivindicaciones 15 hasta 23, caracterizado porque las secuencias de aminoácidos de las ISV s se eligen independientemente del grupo que consiste de SEQ ID NOs 12 hasta 26, preferiblemente SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO:22.
25. Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación .15, caracterizado porque las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio variable sencillo de inmunoglobulina tienen al menos 90% de identidad de aminoácidos con las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de al menos uno de los · dominios variables sencillos de inmunoglobulina de SEQ ID NO's: 12 hasta 26.
26. Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de conformidad con la. reivindicación 15, caracterizado porque consiste esencialmente de un polipéptido que i) tiene al menos 80% de identidad de aminoácidos con al menos uno de los dominios variables sencillos de inmunoglobulina de SEQ ' ID NO's: 12 hasta 26, en que para los propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácido, los residuos de aminoácido que forman las secuencias CDR se ignoran; y en que : ii) preferiblemente uno o más de los residuos de aminoácido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla B-2.
27. Una proteina o polipéptido que compiten con una proteina, polipéptido o ISV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 22, caracterizado porque es para unirse al HER3 (SEQ ID NO:l).
28. Un ácido nucleico, caracterizado porque es para codificar una proteina o polipéptido o ISV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1- hasta 27.
29. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una proteina o polipéptido o ISV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 28.
30. El uso de una cantidad eficiente de una proteina o polipéptido o 'ISV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 28 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer o de una enfermedad relacionada con la regeneración nerviosa.
31. La proteína o polipéptido o ISV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 28, caracterizado porque es para uso en terapia de cáncer o de un trastorno relacionado con la regeneración nerviosa.
32. La proteína o polipéptido o ISV de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el cáncer es cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de vejiga urinaria, cáncer cerebral, retinoblastoma, melanoma, cáncer colorectal, cáncer pancreático, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cérvico, y/o cáncer del esófago.
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