JP2022524338A - 拘束され、条件的に活性化された結合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
本発明は、活性プロドラッグ形式で投与される条件付き二重特異性再方向付け活性化構築物またはCOBRAに関する。腫瘍プロテアーゼに曝露されると、構築物は開裂及び活性化され、これにより構築物は、腫瘍標的抗原(TTA)ならびにCD3の両方に結合し、したがって、CD3を発現させるT細胞を腫瘍に動員し、治療につながることができる。いくつかの実施形態では、腫瘍標的抗原はB7H3である。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2019年3月5日出願の米国仮出願第62/814,210号、2019年3月6日出願の米国仮出願第62/814,744号、及び2019年3月29日出願の米国仮出願第62/826,523号の優先権を主張し、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2019年3月5日出願の米国仮出願第62/814,210号、2019年3月6日出願の米国仮出願第62/814,744号、及び2019年3月29日出願の米国仮出願第62/826,523号の優先権を主張し、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
個々の細胞または特定の細胞型の選択的破壊は、様々な臨床環境において望ましい場合が多い。例えば、腫瘍細胞を特異的に破壊しながら、健康な細胞及び組織を可能な限り無傷及び非損傷の状態で残すことが、がん療法の主要目的である。1つのそのような方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘発して、ナチュラルキラー(NK)細胞または細胞傷害性Tリンパ球(CTL)などの免疫エフェクター細胞に腫瘍細胞を攻撃及び破壊させることによる。
腫瘍関連抗原に優れた結合特異性及び親和性を提供する無傷モノクローナル抗体(mAb)の使用は、がん治療及び診断の分野でうまく適用されてきた。しかしながら、無傷mAbの大きいサイズ、それらの不十分な生体内分布、低い効力、及び血液プール中の長い持続性は、無傷mAbの臨床用途を制限してきた。例えば、無傷抗体は、腫瘍範囲内の特定の蓄積を示し得る。生体内分布研究において、周辺領域内の一次蓄積を伴う不均質な抗体分布は、腫瘍を精密に調査するときに顕著である。腫瘍壊死、不均質な抗体分布、及び間質組織圧力の増大により、無傷抗体構築物で腫瘍の中心部分に到達することは不可能である。対照的に、より小さい抗体フラグメントは、迅速な腫瘍局在を示し、腫瘍内へとより深く浸透し、また血流から比較的迅速に除去される。しかしながら、scFv及び他の構築物を含む多くの抗体は、分子が非腫瘍細胞上で活性であり、副作用を引き起こし、その一部が毒性であり得る、「オン標的/オフ腫瘍」効果を示す。本発明は、腫瘍プロテアーゼの存在下で選択的に活性化される新規の構築物に関する。
本発明は、がんの治療のための多くの異なるタンパク質組成物を提供する。したがって、一態様では、本発明は、N末端からC末端に、ヒト腫瘍標的抗原(TTA)に結合する第1の単一ドメイン抗原結合ドメイン(sdABD)(sdABD-TTA)と、b)ドメインリンカーと、c)i)vhCDR1、vhCDR2、及びvhCDR3を含む可変重ドメイン、ii)拘束非開裂性リンカー(CNCL)、ならびにiii)vlCDR1、vlCDR2、及びvlCDR3を含む可変軽ドメイン、を含む、拘束Fvドメインと、d)第2のドメインリンカーと、e)第2のsdABD-TTAと、f)開裂性リンカー(CL)と、g)i)偽軽可変ドメイン、ii)非開裂性リンカー(NCL)、及びiii)偽重可変ドメイン、を含む、拘束偽Fvドメインと、h)第3のドメインリンカーと、i)ヒト血清アルブミンに結合する第3のsdABDと、を含む「形式2」タンパク質を提供し、可変重ドメイン及び可変軽ドメインは、ヒトCD3に結合することが可能であるが、拘束Fvドメインは、CD3に結合せず、可変重ドメイン及び偽可変軽ドメインは、分子内で会合して不活性Fvを形成し、可変軽ドメイン及び偽可変重ドメインは、分子内で会合して不活性Fvを形成する。いくつかの実施形態では、ヒト腫瘍標的抗原はB7H3である。
さらなる態様では、本発明は、N末端からC末端に、sdFR1-sdCDR1-sdFR2-sdCDR2-sdFR3-sdCDR3-sdFR4を含む、ヒト腫瘍標的抗原(TTA)に結合する第1の単一ドメイン抗原結合ドメイン(sdABD)(sdABD-TTA)と、b)第1のドメインリンカーと、c)i)vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4を含む可変重ドメイン、ii)拘束非開裂性リンカー(CNCL)、及びiii)vlFR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4を含む可変軽ドメイン、を含む、拘束Fvドメインと、d)第2のドメインリンカーと、e)第2のsdABD-TTAと、f)開裂性リンカー(CL)と、g)i)sdFR1-sdCDR1-sdFR2-sdCDR2-sdFR3-sdCDR3-sdFR4を含む偽軽可変ドメイン、ii)非開裂性リンカー(NCL)、及びiii)vlFR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4を含む偽重可変ドメイン、を含む、拘束偽Fvドメインと、h)第3のドメインリンカーと、i)sdFR1-sdCDR1-sdFR2-sdCDR2-sdFR3-sdCDR3-sdFR4を含む、ヒト血清アルブミンに結合する第3のsdABDと、を含むタンパク質を提供し、可変重ドメイン及び可変軽ドメインは、ヒトCD3に結合することが可能であるが、拘束Fvドメインは、CD3に結合せず、可変重ドメイン及び偽可変軽ドメインは、分子内で会合して不活性Fvを形成し、可変軽ドメイン及び偽可変重ドメインは、分子内で会合して不活性Fvを形成する。いくつかの実施形態では、ヒト腫瘍標的抗原はB7H3である。
形式2タンパク質のいくつかの実施形態では、可変重ドメインは、可変軽ドメインのN末端にあり、偽軽可変ドメインは、偽可変重ドメインのN末端にある。いくつかの実施形態では、可変重ドメインは、可変軽ドメインのN末端にあり、偽可変軽ドメインは、偽可変重ドメインのC末端にある。いくつかの実施形態では、可変重ドメインは、可変軽ドメインのC末端にあり、偽可変軽ドメインは、偽可変重ドメインのN末端にある。いくつかの実施形態では、可変重ドメインは、可変軽ドメインのC末端にあり、偽可変軽ドメインは、偽可変重ドメインのC末端にある。
形式2タンパク質のいくつかの実施形態では、第1のsdABDTTA及び第2のsdABDTTAは同じである。いくつかの実施形態では、第1のsdABDTTA及び第2のsdABDTTAは異なる。これらの実施形態では、sdABD-TTAは、配列番号1、配列番号5、配列番号9、配列番号13、配列番号17、配列番号21、配列番号25、配列番号29、配列番号33、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号49、配列番号53、配列番号57、配列番号61、配列番号65、配列番号69、配列番号73,77、配列番号81、配列番号85、配列番号89、配列番号93、配列番号97、配列番号101、配列番号105、配列番号109、及び配列番号113を含む、図5に示されるものから選択される。
形式2タンパク質のいくつかの実施形態では、拘束偽Fvドメインの偽重可変ドメインは、図5に示されるように、配列番号146(VHi)、配列番号150(VHi2)、及び配列番号154(VHiGL4)の群から選択される。いくつかの実施形態では、拘束偽Fvドメインの偽軽可変ドメインは、図5に示されるように、配列番号130(VLi)、配列番号134(VLi2)、及び配列番号138(VLiGL)の群から選択される。
さらなる態様では、本発明は、N末端からC末端に、a)第1のsdABD-TTAと、b)第1のドメインリンカーと、c)i)vhCDR1、vhCDR2、及びvhCDR3を含む第1の可変重ドメイン、ii)拘束開裂性リンカー(CCL)、ならびにiii)vlCDR1、vlCDR2、及びvlCDR3を含む第1の可変軽ドメイン、を含む、拘束Fvドメインと、d)第2のドメインリンカーと、e)第2のsdABD-TTAと、f)開裂性リンカー(CL)と、g)i)第1の偽軽可変ドメイン、ii)非開裂性リンカー(NCL)、及びiii)第1の偽重可変ドメイン、を含む、拘束偽Fvドメインと、h)第3のドメインリンカーと、i)ヒト血清アルブミンに結合する第3のsdABDと、を含む「形式1」タンパク質を提供し、該第1の可変重ドメイン及び該第1の可変軽ドメインは、ヒトCD3に結合することが可能であるが、該拘束Fvドメインは、CD3に結合せず、該第1の可変重ドメイン及び該第1の偽可変軽ドメインは、分子内で会合して不活性Fvを形成し、該第1の可変軽ドメイン及び該第1の偽可変重ドメインは、分子内で会合して不活性Fvを形成する。追加の態様では、本発明は、N末端からC末端に、a)ヒト腫瘍標的抗原(TTA)に結合する単一ドメイン抗原結合ドメイン(sdABD)(sdABD-TTA)と、b)第1のドメインリンカーと、c)i)vhCDR1、vhCDR2、及びvhCDR3を含む第1の可変重ドメイン、ii)拘束非開裂性リンカー(CNCL)、ならびにiii)vlCDR1、vlCDR2、及びvlCDR3を含む第1の可変軽ドメイン、を含む、拘束Fvドメインと、d)開裂性リンカー(CL)と、e)ヒト血清アルブミンに結合する第2のsdABDと、f)ドメインリンカーと、g)i)第1の偽軽可変ドメイン、ii)非開裂性リンカー(NCL)、及びiii)第1の偽重可変ドメイン、を含む、拘束偽Fvドメインと、を含む「形式4」タンパク質を提供し、該第1の可変重ドメイン及び該第1の可変軽ドメインは、ヒトCD3に結合することが可能であるが、該拘束Fvドメインは、CD3に結合せず、該第1の可変重ドメイン及び該第1の偽可変軽ドメインは、分子内で会合して不活性Fvを形成し、該第1の可変軽ドメイン及び該第1の偽可変重ドメインは、分子内で会合して不活性Fvを形成する。
上記に列挙した形式1、形式2、及び形式4タンパク質のさらなる態様では、該第1の可変重ドメインは、該第1の可変軽ドメインのN末端にあり、該偽軽可変ドメインは、該偽可変重ドメインのN末端にある。
上記に列挙した形式1、形式2、及び形式4タンパク質のさらなる態様では、該第1の可変重ドメインは、該第1の可変軽ドメインのN末端にあり、該偽可変重ドメインは、該偽可変軽ドメインのN末端にある。
上記に列挙した形式1、形式2、及び形式4タンパク質のさらなる態様では、該第1の可変軽ドメインは、該第1の可変重ドメインのN末端にあり、該偽軽可変ドメインは、該偽可変重ドメインのN末端にある。
上記に列挙した形式1、形式2、及び形式4タンパク質のさらなる態様では、該第1の可変軽ドメインは、該第1の可変重ドメインのN末端にあり、該偽可変重ドメインは、該偽可変軽ドメインのN末端にある。
追加の態様では、本発明は、該第1及び第2のTTAが同じである、形式1及び2タンパク質を提供する。
さらなる態様では、本発明は、該第1及び第2のTTAが異なる、形式1及び2タンパク質を提供する。
追加の態様では、本発明は、該第1及び第2のTTAが、EGFR、EpCAM、FOLR1、Trop2、ca9、及びB7H3から選択される、形式1、2、及び4タンパク質を提供する。これらの配列は、配列番号1、配列番号5、配列番号9、配列番号13、配列番号17、配列番号21、配列番号25、配列番号29、配列番号33、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号49、配列番号53、配列番号57、配列番号61、配列番号65、配列番号69、配列番号73,77、配列番号81、配列番号85、配列番号89、配列番号93、配列番号97、配列番号101、配列番号105、配列番号109、及び配列番号113からなる群から選択され得る。
さらなる態様では、本発明は、該半減期延長ドメインが配列番号117(aHSA(10GE))及び配列番号121(Hisタグ付きaHSA)を有する、形式1、2、及び4タンパク質を提供する。
追加の態様では、本発明は、該開裂性リンカーが、MMP2、MMP9、メプリンA、メプリンB、カテプシンS、カテプシンK、カテスピンL、グランザイムB、uPA、カリクレイン7、マトリプターゼ、及びトロンビン、または図6に示される他のものからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される、形式1、2、及び4タンパク質を提供する。
さらなる態様では、本発明は、Pro186、Pro225、Pro226、Pro233、Pro262、Pro311、Pro312、Pro313、Pro356、Pro359、Pro364、Pro388、Pro448、Pro449、Pro450、Pro451、Pro495、Pro246、Pro254、Pro255、Pro256、Pro420、Pro421、Pro432、Pro479、Pro480、Pro187、Pro221、Pro222、Pro223、Pro224、Pro393、Pro394、Pro395、Pro396、Pro429、Pro430、Pro431、Pro601、Pro602、V3及びV4、Pro664、Pro665、Pro667、Pro694、Pro695、Pro565、Pro566、Pro567、Pro727、Pro728、Pro729、Pro730、Pro731、Pro676、Pro677、Pro678、Pro679、Pro808、Pro819、Pro621、Pro622、Pro640、Pro641、Pro642、Pro643、Pro744、Pro746、Pro638、Pro639、Pro396、Pro476、Pro706、Pro709、Pro470、Pro471、Pro551、Pro552、Pro623、Pro624、Pro698、Pro655、Pro656、Pro657、Pro658、Pro516、Pro517、Pro518、ならびにPro519からなる群から選択されるタンパク質を提供する。
追加の態様では、本発明は、本明細書に記載の形式1、2、または4タンパク質をコードする核酸、ならびにタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター及び宿主細胞を提供する。
さらなる態様では、本発明は、本発明のタンパク質を作製する方法、及び治療を必要としている患者にそれを行う方法を提供する。
追加の態様では、本発明は、a)第1のタンパク質であって、N末端からC末端に、i)第1のsdABD-TTAと、ii)第1のドメインリンカーと、iii)N末端からC末端に、1)vhCDR1、vhCDR2、及びvhCDR3を含む可変重鎖、2)開裂性リンカー、ならびに3)iVLCDR1、iVLCDR2、及びiVLCDR3を含む第1の偽可変軽ドメイン、を含む、偽Fvドメインと、iv)第2のドメインリンカーと、v)sdABD-HSAと、を含む、第1のタンパク質と、a)第2のタンパク質であって、N末端からC末端に、i)ヒト腫瘍標的抗原に結合する第3のsdABDと、ii)第3のドメインリンカーと、iii)N末端からC末端に、1)VLCDR1、VLCDR2、及びVLCDR3を含む可変軽鎖、2)開裂性リンカー、ならびに3)iVHCDR1、iVHCDR2、及びiVHCDR3を含む第1の偽可変重ドメイン、を含む、偽Fvドメインと、iv)第4のドメインリンカーと、v)sdABD-HSAと、を含む、第2のタンパク質と、を含む、プロドラッグタンパク質の「形式3A」対を含む組成物を提供し、該第1の可変重ドメイン及び該第1の可変軽ドメインは、会合したときにヒトCD3に結合することが可能であり、該第1の可変重ドメイン及び該第1の偽可変軽ドメインは、分子間で会合して不活性Fvを形成し、該第1の可変軽ドメイン及び該第1の偽可変重ドメインは、分子間で会合して不活性Fvを形成し、該第1及び第3のsdABDは、配列番号1、配列番号5、配列番号9、配列番号13、配列番号17、配列番号21、配列番号25、配列番号29、配列番号33、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号49、配列番号53、配列番号57、配列番号61、配列番号65、配列番号69、配列番号73,77、配列番号81、配列番号85、配列番号89、配列番号93、配列番号97、配列番号101、配列番号105、配列番号109、及び配列番号113からなる群から選択される。
さらなる態様では、本発明は、a)第1のタンパク質であって、N末端からC末端に、i)第1のsdABD-TTAと、ii)第1のドメインリンカーと、iii)第2のsdABD-TTAと、iv)第2のドメインリンカーと、iii)N末端からC末端に、1)vhCDR1、vhCDR2、及びvhCDR3を含む可変重鎖、2)開裂性リンカー、ならびに3)iVLCDR1、iVLCDR2、及びiVLCDR3を含む第1の偽可変軽ドメイン、を含む、偽Fvドメインと、iv)第3のドメインリンカーと、v)sdABD-HSAと、を含む、第1のタンパク質と、a)第1第2のタンパク質であって、N末端からC末端に、i)第3のsdABD-TTAと、ii)第4のドメインリンカーと、iii)第4のsdABD-TTAと、iv)第5のドメインリンカーと、iii)N末端からC末端に、1)VLCDR1、VLCDR2、及びVLCDR3を含む可変軽鎖、2)開裂性リンカー、ならびに3)iVHCDR1、iVHCDR2、及びiVHCDR3を含む第1の偽可変重ドメイン、を含む、偽Fvドメインと、iv)第6のドメインリンカーと、v)sdABD-HSAと、を含む、第1第2のタンパク質と、を含む、プロドラッグタンパク質の「形式3B」対を含む組成物を提供し、該第1の可変重ドメイン及び該第1の可変軽ドメインは、会合したときにヒトCD3に結合することが可能であり、該第1の可変重ドメイン及び該第1の偽可変軽ドメインは、分子間で会合して不活性Fvを形成し、該第1の可変軽ドメイン及び該第1の偽可変重ドメインは、分子間で会合して不活性Fvを形成する。
追加の態様では、形式3A及び形式3Bタンパク質は、配列番号117または配列番号121を有するsdABD-HSAを有する。
さらなる態様では、形式3A及び形式3Bタンパク質は、EGFR、EpCAM、Trop2、CA9、FOLR1、及びB7H3から選択されるTTAに結合するsdABD-TTAを有する。sdABD-TTAは、配列番号1、配列番号5、配列番号9、配列番号13、配列番号17、配列番号21、配列番号25、配列番号29、配列番号33、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号49、配列番号53、配列番号57、配列番号61、配列番号65、配列番号69、配列番号73,77、配列番号81、配列番号85、配列番号89、配列番号93、配列番号97、配列番号101、配列番号105、配列番号109、及び配列番号113からなる群から選択され得る。
追加の態様では、本発明は、配列番号77、配列番号81、配列番号85、配列番号89、及び配列番号93から選択される配列を有するヒトTrop2に結合するsdABDを提供する。
さらなる態様では、本発明は、配列番号41、配列番号45、配列番号49、配列番号53、及び配列番号57から選択される配列を有するヒトB7H3に結合するsdABDを提供する。
追加の態様では、本発明は、配列番号101、配列番号105、配列番号109、及び配列番号113から選択される配列を有するヒトCA9に結合するsdABDを提供する。
さらなる態様では、本発明は、配列番号69及び配列番号73から選択される配列を有するヒトEpCAMに結合するsdABDを提供する。
さらなる態様では、本発明は、プロドラッグ対の第1のタンパク質メンバーをコードする第1の核酸、及び対の第2のタンパク質メンバーをコードする第2の核酸、ならびに核酸を含有する発現ベクター及び宿主細胞を含む、核酸組成物を提供する。
導入
本発明は、CD3及び腫瘍抗原などの重要な生理学的標的に結合する二重特異性抗体(抗体様機能タンパク質を含む)の毒性及び副作用を低減する方法に関する。抗体などの多くの抗原結合タンパク質は、正常組織を標的化することにより有意な副作用を有する可能性があり、したがって、罹患組織の近くの治療用分子の結合能力のみを活性化して、正常組織相互作用を回避する必要性がある。したがって、本発明は、多くの機能タンパク質ドメインを有する多価の条件的に有効な(「MCE」)タンパク質に関する。一般に、これらのドメインのうちの1つは、標的腫瘍抗原(TTA)に結合する抗原結合ドメイン(ABD)であり、もう1つは、ある特定の条件下でCD3などのT細胞抗原に結合するABDである。加えて、MCEタンパク質はまた、1つ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。つまり、治療用分子は、CD3結合ドメインが腫瘍環境に曝露されるまで不活性である「プロドラッグ」様形式で作製される。腫瘍環境は、プロテアーゼを含有し、これによりプロテアーゼに曝露されると、プロドラッグは開裂され、活性になる。
本発明は、CD3及び腫瘍抗原などの重要な生理学的標的に結合する二重特異性抗体(抗体様機能タンパク質を含む)の毒性及び副作用を低減する方法に関する。抗体などの多くの抗原結合タンパク質は、正常組織を標的化することにより有意な副作用を有する可能性があり、したがって、罹患組織の近くの治療用分子の結合能力のみを活性化して、正常組織相互作用を回避する必要性がある。したがって、本発明は、多くの機能タンパク質ドメインを有する多価の条件的に有効な(「MCE」)タンパク質に関する。一般に、これらのドメインのうちの1つは、標的腫瘍抗原(TTA)に結合する抗原結合ドメイン(ABD)であり、もう1つは、ある特定の条件下でCD3などのT細胞抗原に結合するABDである。加えて、MCEタンパク質はまた、1つ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。つまり、治療用分子は、CD3結合ドメインが腫瘍環境に曝露されるまで不活性である「プロドラッグ」様形式で作製される。腫瘍環境は、プロテアーゼを含有し、これによりプロテアーゼに曝露されると、プロドラッグは開裂され、活性になる。
これは概して、本明細書において、MCEのCD3 Fvを本明細書で考察されるような不活性形式に拘束する、CD3などのT細胞抗原に向けられた「偽」可変重ドメイン及び「偽」可変軽ドメインを含むタンパク質を使用することによって達成される。TTAが腫瘍の付近でMCEを標的とし、したがって、MCEは、プロテアーゼを曝露される。開裂すると、活性可変重ドメイン及び活性軽ドメインがここで、対になってCD3に対する1つ以上の活性ABDを形成し、したがってT細胞を腫瘍に動員し、治療につながることが可能である。
一般に、CD3結合ドメイン(「Fv」)は、拘束された形式であり、従来Fvを形成する活性可変重ドメインと活性可変軽ドメインとの間のリンカーは、2つの活性可変ドメインが互いに結合することを可能にするには短すぎ、これは、「拘束リンカー」と称され、これらは、拘束され開裂可能であり得るか(形式1で使用されるようなCCL)、または拘束され開裂可能ではない(形式2で使用されるようなCNCL)。むしろ、プロドラッグ(例えば、未開裂)形式において、プロドラッグポリペプチドはまた、「偽Fvドメイン」も含む。偽Fvドメインは、標準的なフレームワーク領域であるが、「非活性」または「不活性」のCDRを有する、可変重及び軽ドメインを含む。偽Fvドメインはまた、不活性可変重ドメインと不活性可変軽ドメインとの間に拘束リンカーを有する。Fvドメインも偽Fvドメインも、立体障害により自己集合することができないため、各々のフレームワーク領域の親和性により、aVLをiVHと、かつaVHをiVLと対にする分子内集合が存在する。しかしながら、偽ドメインの「非活性」CDRにより、得られるABDは、CD3に結合せず、したがって腫瘍などの罹患組織外の毒性を防止する。しかしながら、腫瘍内またはその近くにあるプロテアーゼの存在下で、プロドラッグ構築物は、偽Fvドメインが表面から放出されるように開裂され、したがって「真の」可変重及び可変軽ドメインが分子間で会合する(例えば、2つの開裂構築物が一緒になる)ことを可能にし、したがって活性CD3結合及び得られる腫瘍有効性を引き起こす。これらの構築物は概して、本明細書において、条件付き二重特異性再方向付け活性化構築物または「COBRA(商標)」と称される。分子内集合の安定性は、本明細書において条件付け実験によって示され、プロテアーゼの非存在下で、未開裂構築物は、活性を有しない(例えば、活性CD3結合ドメインは形成されない)。
興味深いことに、説明を簡単にするために、これらの構築物が全て、本明細書において「拘束された」と称される一方で、さらなる研究は、分子内集合が、Fvドメインのうちの1つが拘束されていない場合、例えば、ドメインのうちの1つがより長く柔軟なリンカーを有することができる場合でさえ好ましいことを示す。つまり、図37~39に示されるように、分子内集合は、Fvドメインのうちの1つのみ、活性VL及びVHを有するドメイン、または偽Fvドメインのいずれかが拘束されている場合でもやはり生じる(例えば、未開裂構築物は、プロテアーゼ開裂の非存在下で不活性である)。しかしながら、本系において、両方のリンカーが拘束されているとき、タンパク質は、より良好な発現を有する。しかしながら、当業者によって理解されるように、本明細書の形式1、形式2、または形式4構築物のいずれかは、「非拘束」または「柔軟性」リンカーを有するこれらのFvドメインのうちの1つを有することができる。参照を容易にするために、構築物は、両方のFvドメインが拘束された形式で示される。
本発明の構築物及び形式は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれるWO2017/156178に記載される発明の変化形態である。図17~21に示されるように、以前の構築物は、単一ポリペプチド中のVH及びVLドメインの2つのセットの存在により異性化して、二価scFv及び単鎖ダイアボディの両方を形成する能力を有する。各アイソフォームの精製後でさえ、二価構築物はなお、ダイアボディアイソフォームとの均衡状態に達することができる。単鎖ダイアボディは、プロテアーゼ開裂の非存在下でCD3に結合する能力を有し、構築物の有用性は低下する。
この問題を解決するために、本発明は、この条件付き活性化を達成するために4つの別々のタイプの構築物を提供する。プロドラッグ活性化は、図面に概して示されるように、4つの一般的な方法のうちの1つで起こり得る。図1中、「形式1」機構が示される。この実施形態では、プロドラッグ構築物は、2つの開裂部位を有し、1つは、拘束FvのVHドメインとvlドメインとの間にあり、したがって、2つの可変ドメインを自由に会合させ、第2の開裂部位は、プロドラッグ構築物から偽Fvドメインを放出する部位にあり、可変重及び可変軽ドメインの固有の自己集合により会合する2つの分子を残し、各々は、同様に腫瘍抗原に対する抗原結合ドメインを有し、したがって、T細胞の腫瘍部位への動員を可能にする。
代替の実施形態では、プロドラッグ構築物は、図2の「形式2」機構に示される。この実施形態では、活性可変重鎖と活性軽鎖との間のドメインリンカーは、拘束されているが非開裂性のリンカー(「CNCL」)である。プロドラッグ形式において、拘束偽Fvドメイン不活性VH及びVLは、CD3結合が存在しないように、拘束FvドメインのVH及びVLと会合する。しかしながら、いったん腫瘍環境における開裂が起こると、各々が活性可変重及び軽ドメインを含む2つの異なる活性化タンパク質は会合して、2つの抗CD3結合ドメインを形成する。この形式2は、2つの標的腫瘍抗原結合ドメイン(「TTA-ABD」)を有し、これは、以下でより十分に記載されるように、同一(例えば、「ホモ-COBRA」)であることも異なる(例えば、「ヘテロ-COBRA」)こともできる。異なる場合、以下でより十分に記載されるように、それらは、各々異なる腫瘍抗原に向けられることも、同じ腫瘍抗原であるが異なるエピトープに向けられることもできる。
構成成分の全てが単一のアミノ酸配列上に含有される、上記で考察される「単鎖タンパク質」COBRA形式に加えて、図3に示されるように、対で作用する2つのタンパク質「ヘミCOBRA」に依存する構築物も存在する。この実施形態では、各タンパク質は、ロテアーゼ開裂部位によって分離される1つの活性可変ドメイン及び1つの非活性可変ドメインを有する。各分子は、TTA結合ドメインを含有し、これにより、分子がTTAに結合され、腫瘍プロテアーゼに曝露されたとき、非活性ドメインが開裂され、2つの活性可変ドメインが自己集合して、抗CD3結合ドメインを形成する。
さらに、本発明は、図4に示されるように、同様に「形式4」構築物を提供する。これらは、TTAに対して単一のABDが使用され、これにより、開裂すると、以下にさらに記載されるように、プロドラッグ分子のうちの2つがここで、2つの活性抗CD3ドメインを含有する四価の二重特異性構築物を形成することを除いて、「形式2」の設計と同様である。
したがって、本発明の形式及び構築物は、疾患の治療で使用される。
定義
本出願がより完全に理解され得るために、いくつかの定義が以下に記載される。そのような定義は、文法的等価物を包含するよう意図される。
本出願がより完全に理解され得るために、いくつかの定義が以下に記載される。そのような定義は、文法的等価物を包含するよう意図される。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」及び「アミノ酸同一性」とは、特定の定義された位置に存在し得る20個の天然に存在するアミノ酸または任意の非天然類似体のうちの1つを意味する。多くの実施形態では、「アミノ酸」は、20個の天然に存在するアミノ酸のうちの1つを意味する。本明細書の「タンパク質」とは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチドを含む、少なくとも2つの共有結合したアミノ酸を意味する。
本明細書の「アミノ酸修飾」とは、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換、挿入、及び/もしくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分への改変を意味する。例えば、修飾は、タンパク質に付着した、改変した炭水化物またはPEG構造であり得る。明確にするために、特に断りのない限り、アミノ酸修飾は常に、DNAによってコードされるアミノ酸、例えば、DNA及びRNA中にコドンを有する20個のアミノ酸に対してである。本明細書の好ましいアミノ酸修飾は、置換である。
本明細書の「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸の、異なるアミノ酸配列による置き換えを意味する。具体的には、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置において天然に存在しない、その生物内または任意の生物内のいずれかに天然に存在しないアミノ酸に対してである。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、出発アミノ酸を変化させない(例えば、CGG(アルギニンをコードする)をCGA(なおもアルギニンをコードする)に交換して宿主生物発現レベルを増大させる)ように操作されたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではなく、つまり、同じタンパク質をコードする新しい遺伝子の生成にもかかわらず、タンパク質が、それが出発した特定の位置における同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸配列の付加を意味する。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸配列の除去を意味する。
本発明のポリペプチドは、本明細書で概説されるように、CD3に特異的に結合し、標的細胞受容体などの標的腫瘍抗原(TTA)を標的とする。抗原またはエピトープへの「特異的結合」またはそれ「に特異的に結合する」またはそれ「に特異的」とは、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有しない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することによって測定され得る。例えば、特異的結合は、標的と同様である対照分子との競合によって決定され得る。
特定の抗原またはエピトープへの特異的結合は、例えば、少なくとも約10-4M、少なくとも約10-5 M、少なくとも約10-6M、少なくとも約10-7M、少なくとも約10-8M、少なくとも約10-9M、あるいは少なくとも約10-10M、少なくとも約10-11M、少なくとも約10-12M、またはそれ以上の抗原またはエピトープに対するKDを有する抗体によって示され得、KDは、特定の抗原-抗体相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープと比較して、対照分子に対して20、50、100、500、1000、5,000、10,000倍、またはそれ以上であるKDを有する。
また、特定の抗原またはエピトープへの特異的結合は、例えば、対照と比較して、エピトープに対して少なくとも20、50、100、500、1000、5,000、10,000倍、またはそれ以上の抗原またはエピトープのKAまたはKaを有する抗体によって示され得、KAまたはKaは、特定の抗体-抗原相互作用の会合速度を指す。結合親和性は概して、当該技術分野において既知であるようなBiacoreアッセイまたはOctetを使用して測定される。
本明細書で使用される場合、「親ポリペプチド」または「前駆体ポリペプチド」(Fc親または前駆体を含む)とは、後に修飾されて変異体を生成するポリペプチドを意味する。該親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドの変異体もしくは操作された型であってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指し得る。したがって、本明細書で使用される場合、「親Fcポリペプチド」とは、修飾されて変異体を生成する未修飾Fcポリペプチドを意味し、本明細書で使用される場合、「親抗体」とは、修飾されて変異体抗体を生成する未修飾抗体を意味する。
本明細書で使用される場合、「位置」とは、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順次に、または確立された形式、例えば、抗体番号付けのためのEUインデックスに従って番号付けされ得る。
本明細書で使用される場合、「標的抗原」とは、所与の抗体の可変領域によって特異的に結合される分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化合物であってもよい。幅広い好適な例示的な標的抗原が本明細書に記載される。
本明細書で使用される場合、「標的細胞」とは、標的抗原を発現させる細胞を意味する。概して、本発明の目的で、標的細胞は、TTAを発現させる腫瘍細胞またはCD3抗原を発現させるT細胞のいずれかである。
本明細書で使用される場合、「Fv」または「Fvドメイン」または「Fv領域」とは、概して抗体からの抗原結合ドメインのVL及びVHドメインを含むポリペプチドを意味する。Fvドメインは通常、それらが活性VH及びVLドメインを含有する場合、本明細書で考察されるような「抗原結合ドメイン」または「ABD」を形成する(場合によっては、拘束リンカーを含有するFvが使用され、これにより活性ABDは、開裂前に形成されないが)。以下で考察されるように、Fvドメインは、本発明の多くの方法で組織化され得、scFv形式、拘束Fv形式、偽Fv形式などで「活性」または「不活性」であり得る。本発明において、場合によっては、Fvドメインが、図1及び図2に示されるように、単一のポリペプチド鎖上のVH及びVLドメインで構成されるが、分子内ABDを形成することができないように拘束リンカーを有することが理解されるべきである。これらの実施形態では、2つの活性ABDが形成されるのは開裂後である。場合によっては、Fvドメインは、VH及びVLドメインで構成され、そのうちの1つは非活性であり、これにより、開裂後にのみ分子間ABDが形成される。以下で考察されるように、Fvドメインは、本発明の多くの方法で組織化され得、scFv形式、拘束Fv形式、偽Fv形式などで「活性」または「不活性」であり得る。加えて、本明細書で考察されるように、VH及びVLを含有するFvドメインは、ABDであり得/ABDを形成することができ、VH及びVLドメインを含有しない他のABDは、sdABDを使用して形成され得る。
本明細書の「可変ドメイン」とは、それぞれカッパ、ラムダ、及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するVκ、Vλ、及び/またはVH遺伝子のうちのいずれかによって実質的にコードされた1つ以上のIgドメインを含む、免疫グロブリンの領域を意味する。場合によっては、sdFv(また、本明細書においてsdABDとも称される)などの単一の可変ドメインが使用され得る。
可変重(VH)ドメイン及び可変軽(VL)ドメインの両方を利用する実施形態では、各VH及びVLは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される、3つの超可変領域(「相補性決定領域」、「CDR」)及び4つの「フレームワーク領域」または「FR」からなる:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。したがって、VHドメインは、構造vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4を有し、VLドメインは、構造vlFR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4を有する。本明細書においてより十分に記載されるように、vhFR領域及びvlFR領域は自己集合して、Fvドメインを形成する。一般に、本発明のプロドラッグ形式では、VH及びVLドメインが自己会合することができない「拘束Fvドメイン」、ならびにCDRが自己会合したときに抗原結合ドメインを形成しない「偽Fvドメイン」が存在する。
超可変領域は、抗原結合特異性を与え、概して、軽鎖可変領域内のおよそアミノ酸残基24~34(LCDR1、「L」は軽鎖を示す)、50~56(LCDR2)、及び89~97(LCDR3)、ならびに重鎖可変領域内の約31~35B(HCDR1、「H」は重鎖を示す)、50~65(HCDR2)、及び95~102(HCDR3)(Kabat et al.,SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))、及び/または軽鎖可変領域内の超可変ループ(例えば、残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)、及び91-96(LCDR3)、ならびに重鎖可変領域内の26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)、及び96-101(HCDR3)を形成する残基(Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)のアミノ酸残基を包含する。本発明の特定のCDRは、以下に記載される。
当業者によって理解されるように、CDRの正確な番号付け及び配置は、異なる番号付けシステムによって異なり得る。しかしながら、可変重及び/または可変軽配列の開示が、関連する(固有の)CDRの開示を含むことが理解されるべきである。したがって、各可変重領域の開示は、vhCDR(例えば、vhCDR1、vhCDR2、及びvhCDR3)の開示であり、各可変軽領域の開示は、vlCDR(例えば、vlCDR1、vlCDR2、及びvlCDR3)の開示である。
本明細書全体を通して、Kabat番号付けシステムは概して、可変ドメインの残基(およそ、軽鎖可変領域の残基1-107及び重鎖可変領域の残基1-113)を指すときに使用され、Fc領域に対してはEU番号付けシステムが使用される(例えば、Kabat et al.、上記を参照(1991))。
本発明は、多数の異なるCDRセットを提供する。この場合、抗CD3構成成分の文脈における「完全CDRセット」は、3つの可変軽CDR及び3つの可変重CDR、例えば、vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2、及びvhCDR3を含む。当業者によって理解されるように、CDRの各セット、VH及びVL CDRは、両方が個々に、かつセットとして抗原に結合することができる。例えば、拘束Fvドメインにおいて、vhCDRは、例えばCD3に結合することができ、vlCDRは、CD3に結合することができるが、拘束された形式では、それらはCD3に結合することができない。
標的腫瘍抗原(TTA)に結合するために本明細書において概して使用されるような単一ドメインABD(「sdABD」)の文脈において、CDRセットは、3つのCDRのみであり、これらは、当該技術分野において、「VHH」ドメインとも称されるときがある。
これらのCDRは、丁寧に、より大きい可変軽ドメインまたは可変重ドメインの一部であり得る。加えて、本明細書においてより十分に概説されるように、可変重及び可変軽ドメインは、本明細書の部分の形式及び構成に応じて、別々のポリペプチド鎖上、またはscFv配列の場合は単一ポリペプチド鎖上にあり得る。
CDRは、抗原結合部位、より具体的には、エピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」は、パラトープとして既知の可変領域内の特定の抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の集団であり、通常、特定の構造特性ならびに特定の電荷特性を有する。単一の抗原が2つ以上のエピトープを有し得る。
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基(エピトープの免疫優性構成成分とも呼ばれる)、及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特定の抗原結合ペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基を含んでもよく、換言すれば、アミノ酸残基は、特定の抗原結合ペプチドのフットプリント内にある。
エピトープは、立体配座または線状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。立体配座及び非立体配座エピトープは、前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるが、後者は失われないという点で区別され得る。
エピトープは典型的には、独特の空間的立体配座で少なくとも3つ、通常は少なくとも5つまたは8~10個のアミノ酸を含む。同じエピトープを認識する抗体は、1つの抗体が別の抗体の標的抗原への結合をブロックする能力を示す単純な免疫測定法、例えば「ビニング」で検証され得る。以下で概説されるように、本発明は、本明細書の列挙される抗原結合ドメイン及び抗体だけではなく、列挙される抗原結合ドメインによって結合されたエピトープとの結合を競合するものも含む。
本発明の可変重及び可変軽ドメインは、「活性」または「不活性」であり得る。
本明細書で使用される場合、「不活性VH」(「iVH」)及び「不活性VL」(「iVL」)は、それらの同種VLまたはVHパートナーとそれぞれが対になったときに、「不活性」ではない類似VLまたはVHに結合すれば、「活性」VHまたは「活性」VLが結合するであろう抗原に特異的に結合しない得られるVH/VL対を形成する、偽Fvドメインの構成成分を指す。例示的な「不活性VH」及び「不活性VL」ドメインは、以下でより十分に概説されるように、野生型VHまたはVL配列の突然変異によって形成される。例示的な突然変異は、VHまたはVLのCDR1、CDR2、またはCDR3内である。例示的な突然変異は、CDR2内にドメインリンカーを置き、それにより「不活性VH」または「不活性VL」ドメインを形成することを含む。対照的に、「活性VH」また「活性VL」は、その「活性」同種パートナー、すなわちVLまたはVHとそれぞれ対になると、その標的抗原に特異的に結合することが可能であるものである。したがって、偽FvがVH/iVL対、iVH/VL対、またはiVH/iVL対であり得ることが理解されるべきである。
対照的に、本明細書で使用される場合、「活性」という用語は、CD-3に特異的に結合することが可能であるCD-3結合ドメインを指す。この用語は、2つの文脈、(a)その同種パートナーと対になり、CD-3に特異的に結合することが可能である、Fv結合対の単一メンバー(すなわち、VHまたはVL)を指す場合、及び(b)CD-3に特異的に結合することが可能な配列の同種の対(すなわち、VH及びVL)で使用される。例示的な「活性」VH、VL、またはVH/VL対は、野生型または親配列である。
「CD-x」は、分化クラスター(CD)タンパク質を指す。例示的な実施形態では、CD-xは、本発明のポリペプチド構築物が投与された対象におけるT細胞の動員または活性化に関与するCDタンパク質から選択される。例示的な実施形態では、CD-xは、CD3であり、その配列は、図5に示される。
「結合ドメイン」という用語は、本発明に関連して、標的分子(抗原)上の所与の標的エピトープまたは所与の標的部位、例えば、EGFR及びCD-3のそれぞれに(特異的に)結合する/それと相互作用する/それを認識するドメインを特徴付ける。標的抗原結合ドメイン(EGFRを認識する)の構造及び機能、また好ましくはCD-3結合ドメイン(CD3を認識する)の構造及び/または機能は、抗体、例えば、sdABDを含む完全長または全免疫グロブリン分子の構造及び/または機能に基づく。本発明によると、標的抗原結合ドメインは概して、標的腫瘍抗原に結合する3つのCDRの存在によって特徴付けられる(概して、当該技術分野において可変重ドメインと称されるが、対応する軽鎖CDRは、存在しない)。あるいは、TTAに対するABDは、3つの軽鎖CDR(すなわち、VL領域のCDR1、CDR2、及びCDR3)、及び/または3つの重鎖CDR(すなわち、VH領域のCDR1、CDR2、及びCDR3)を含むことができる。CD-3結合ドメインは好ましくは、標的結合を可能にする抗体の少なくとも最小の構造要件も含む。より好ましくは、CD-3結合ドメインは、少なくとも3つの軽鎖CDR(すなわち、VL領域のCDR1、CDR2、及びCDR3)、及び/または3つの重鎖CDR(すなわち、VH領域のCDR1、CDR2、及びCDR3)を含む。例示的な実施形態では、標的抗原及び/またはCD-3結合ドメインが、ファージディスプレイまたはライブラリスクリーニング方法によって産生されるか、または取得可能であることが想定される。
本明細書で使用される場合、「ドメイン」とは、本明細書で概説されるように、機能を有するタンパク質配列を意味する。本発明のドメインは、腫瘍標的抗原結合ドメイン(TTAドメイン)、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、scFvドメイン、リンカードメイン、及び半減期延長ドメインを含む。
本明細書の「ドメインリンカー」とは、本明細書で概説されるような2つのドメインを結合するアミノ酸配列を意味する。ドメインリンカーは、開裂性リンカー、拘束開裂性リンカー、非開裂性リンカー、拘束非開裂性リンカー、scFvリンカーなどであり得る。
本明細書の「開裂性リンカー」(「CL」)とは、本明細書で概説されるように、プロテアーゼ、好ましくは罹患組織におけるヒトプロテアーゼによって開裂され得るアミノ酸配列を意味する。開裂性リンカーは概して、少なくとも3アミノ酸長であり、必要な柔軟性に応じて、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個、またはそれ以上のアミノ酸が本発明で使用される。多くの開裂性リンカー配列が図6及び図5に見られる。
本明細書の「非開裂性リンカー」(「NCL」)とは、正常な生理学的条件下でヒトプロテアーゼによって開裂することができないアミノ酸配列を意味する。
本明細書の「拘束開裂性リンカー」(「CCL」)とは、2つのドメインが、それらが異なるポリペプチド鎖上に存在するまで、例えば、開裂後まで互いと有意に相互作用することができない方法で、本明細書で概説されるような2つのドメインを結合するプロテアーゼ開裂部位(本明細書で定義されるような)を含有する、短いポリペプチドを意味する。CCLが本明細書で定義されるようなVH及びVLドメインと結合する場合、VH及びVLは、分子内での立体障害により、開裂前に自己集合して機能的Fvを形成することができない(それらは、分子間で偽Fvドメインに集合し得るが)。関連するプロテアーゼによって開裂すると、VH及びVLは集合して、分子間で活性抗原結合ドメインを形成することができる。一般に、CCLは、10アミノ酸長未満であり、9、8、7、6、5、及び4つのアミノ酸が本発明で使用される。一般に、プロテアーゼ開裂部位は概して、図6に示されるように、十分な特異性を与えるために少なくとも4+アミノ酸長である。
本明細書の「拘束非開裂性リンカー」(「CNCL」)とは、2つのドメインが互いと有意に相互作用することができない方法で、本明細書で概説されるような2つのドメインを結合し、生理学的条件下でヒトプロテアーゼによって有意に開裂されない、短いポリペプチドを意味する。
本明細書の「拘束Fvドメイン」とは、活性重及び軽可変ドメインが分子内で相互作用して、CD3などの抗原に結合する活性Fvを形成することができない方法で、本明細書で概説されるような拘束リンカーと共有結合した、活性可変重ドメイン及び活性可変軽ドメインを含むFvドメインを意味する。したがって、拘束Fvドメインは、scFvと同様であるが、拘束リンカーの存在により抗原に結合することが可能ではないものである(それらは、分子間で非活性可変ドメインと集合して、偽Fvドメインを形成し得るが)。
本明細書の「偽Fvドメイン」とは、ドメインリンカー(開裂性、拘束、非開裂性、非拘束などであり得る)を使用して連結された、偽もしくは不活性可変重ドメインまたは偽もしくは不活性可変軽ドメイン、あるいは両方を含むドメインを意味する。偽FvドメインのiVH及びiVLドメインは、互いと会合したとき(iVH/iVL)、または活性VHまたはVLと会合したときのいずれかにおいてヒト抗原に結合せず、したがって、iVH/iVL、iVH/VL、及びiVL/VH Fvドメインは、ヒトタンパク質にはっきりと結合せず、これにより、これらのドメインは、ヒト体内で非活性である。
本明細書の「単鎖Fv」または「scFv」とは、概して本明細書で考察されるようなドメインリンカーを使用して可変軽(VL)ドメインに共有結合されて、scFvまたはscFvドメインを形成する、可変重(VH)ドメインを意味する。scFvドメインは、N末端からC末端配向のいずれかであり得る(VH-リンカー-VLまたはVL-リンカー-VH)。
本明細書の「単一ドメインFv」、「sdFv」、または「sdABD」とは、概してラクダ抗体技術に基づき、3つのCDRのみを有する抗原結合ドメインを意味する。Protein Engineering 9(7):1129-35(1994);Rev Mol Biotech 74:277-302(2001);Ann Rev Biochem 82:775-97(2013)を参照されたい。本明細書で概説されるように、2つの一般的なタイプのsdABD、TTAに結合し、そのようなものとして注釈が付けられるsdABD(一般名称にはsdABD-TTA、またはEGFRに結合するものにはsdABD-EGFR、FOLR1に結合するものにはsdABD-FOLR1など)、及びHSAに結合するsdABD(「sdABD-HSA」または「sdABD(1/2)」)が本明細書で使用される。
「プロテアーゼ開裂部位」とは、プロテアーゼによって認識及び開裂されるアミノ酸配列を指す。好適なプロテアーゼ開裂部位は、以下で概説され、図5及び図6に示される。
本明細書で使用される場合、「プロテアーゼ開裂ドメイン」は、「プロテアーゼ開裂部位」、ならびに個々のプロテアーゼ開裂部位間、及びプロテアーゼ開裂部位(複数可)と本発明の構築物の他の機能的構成成分(例えば、VH、VL、iVH、iVL、標的抗原結合ドメイン(複数可)、半減期延長ドメインなど)との間の任意のリンカーを組み込むペプチド配列を指す。本明細書で概説されるように、プロテアーゼ開裂ドメインはまた、必要に応じて、例えば、柔軟性を与えるために、追加のアミノ酸も含み得る。
「COBRA(商標)」及び「条件付き二重特異性再方向付け活性化」という用語は、多くの機能タンパク質ドメインを有する二重特異性の条件的に有効なタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、機能ドメインのうちの1つは、標的腫瘍抗原(TTA)に結合する抗原結合ドメイン(ABD)である。ある特定の実施形態では、別のドメインは、ある特定の条件下でT細胞抗原に結合するABDである。T細胞抗原としては、CD3が挙げられるが、これに限定されない。「ヘミCOBRA(商標)」という用語は、標的発現細胞の表面上に集中したときの固有の自己集合により、ヘミCOBRAの可変重鎖が別のヘミCOBRA(商標)(相補的ヘミCOBRA(商標))の可変軽鎖に会合することができる場合に、T細胞抗原に結合することができる、条件的に有効なタンパク質を指す。
実施形態の詳細な説明
I.本発明の融合タンパク質
本発明の融合タンパク質は、様々な方法で一緒に連結された、本明細書において概してドメインと称される多くの異なる構成成分を有する。ドメインのうちのいくつかは、各々が標的抗原(例えば、TTAまたは例えば、CD3)に結合する結合ドメインである。それらが2つ以上の抗原に結合するため、それらは、本明細書において「多重特異性」と称され、例えば、本発明のプロドラッグ構築物は、TTA及びCD3に結合し得、したがって、「二重特異性」である。タンパク質はまた、より高い特異性を有することができ、例えば、第1のαTTAがEGFRに結合し、第2のαTTAがEpCAMに結合し、抗CD3結合ドメインが存在する場合、これは、「三重特異性」分子である。同様に、この構築物への抗HSA結合ドメインの付加は、図3Bに示されるように「四重特異性」である。
I.本発明の融合タンパク質
本発明の融合タンパク質は、様々な方法で一緒に連結された、本明細書において概してドメインと称される多くの異なる構成成分を有する。ドメインのうちのいくつかは、各々が標的抗原(例えば、TTAまたは例えば、CD3)に結合する結合ドメインである。それらが2つ以上の抗原に結合するため、それらは、本明細書において「多重特異性」と称され、例えば、本発明のプロドラッグ構築物は、TTA及びCD3に結合し得、したがって、「二重特異性」である。タンパク質はまた、より高い特異性を有することができ、例えば、第1のαTTAがEGFRに結合し、第2のαTTAがEpCAMに結合し、抗CD3結合ドメインが存在する場合、これは、「三重特異性」分子である。同様に、この構築物への抗HSA結合ドメインの付加は、図3Bに示されるように「四重特異性」である。
当業者によって理解されるように、本発明のタンパク質は、異なる原子価を有することができ、かつ多重特異性であり得る。つまり、本発明のタンパク質は、標的を2つ以上の結合部位と結合することができ、例えば、Pro140は、EGFRに対して二価である。
本発明のタンパク質は、腫瘍標的抗原結合ドメイン、半減期延長ドメイン、リンカーなど、本明細書で概説されるような様々な方法で配置されたCD3抗原結合ドメインを含むことができる。
A.CD3抗原結合ドメイン
T細胞の応答の特異性は、T細胞受容体複合体による抗原(主要組織適合遺伝子複合体、MHCにおいて提示される)の認識によって媒介される。T細胞受容体複合体の一部として、CD3は、細胞表面に存在するCD3γ(ガンマ)鎖、CD3δ(デルタ)鎖、2つのCD3e(イプシロン)鎖、及び2つのCD3ζ(ゼータ)鎖を含む、タンパク質複合体である。CD3分子は、T細胞受容体(TCR)のα(アルファ)及びβ(ベータ)鎖と会合して、TCR複合体を含む。CD3に結合するFvドメインなどによるT細胞上のCD3のクラスタリングは、T細胞受容体の関与と同様であるが、そのクローンに典型的な特異性とは無関係の、T細胞活性化をもたらす。
T細胞の応答の特異性は、T細胞受容体複合体による抗原(主要組織適合遺伝子複合体、MHCにおいて提示される)の認識によって媒介される。T細胞受容体複合体の一部として、CD3は、細胞表面に存在するCD3γ(ガンマ)鎖、CD3δ(デルタ)鎖、2つのCD3e(イプシロン)鎖、及び2つのCD3ζ(ゼータ)鎖を含む、タンパク質複合体である。CD3分子は、T細胞受容体(TCR)のα(アルファ)及びβ(ベータ)鎖と会合して、TCR複合体を含む。CD3に結合するFvドメインなどによるT細胞上のCD3のクラスタリングは、T細胞受容体の関与と同様であるが、そのクローンに典型的な特異性とは無関係の、T細胞活性化をもたらす。
しかしながら、当該技術分野において既知であるように、CD3活性化は、多くの毒性副作用を引き起こす可能性があり、したがって、本発明は、後に本発明のプロドラッグポリペプチドを開裂して活性CD3結合ドメインを提供する特定のプロテアーゼが見つかる、腫瘍細胞の存在下でのみ、本発明のポリペプチドの活性CD3結合を提供することに関する。したがって、本発明において、抗CD-3 FvドメインのCD-3への結合は、高いレベルのプロテアーゼを有する罹患細胞または組織の微小環境においてのみ、例えば、本明細書に記載されるような腫瘍微小環境において、CD-3 FvドメインのCD-3への結合を制限するプロテアーゼ開裂ドメインによって調節される。
したがって、本発明は、VH及びVLドメインの2つのセット、活性セット(VH及びVL)ならびに不活性セット(iVH及びiVL)を提供し、4つ全てが、プロドラッグ構築物中に存在する。構築物は、VH及びVLセットが自己会合することができず、むしろ不活性パートナー、例えば、本明細書に示されるようなiVH及びVLならびにiVL及びVHと会合するように形式設定される。
1.活性抗CD3可変重及び可変軽ドメイン
本発明で使用される、当該技術分野において既知である多くの好適な活性CDRセット、及び/またはVH及びVLドメインが存在する。例えば、CDR及び/またはVH及びVLドメインは、例えば、ムロモナブ-CD-3(OKT3)、オテリキシズマブ(TRX4)、テプリズマブ(MGA031)、ビシリズマブ(Nuvion)、SP34またはI2C、TR-66またはX35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、及びWT-31などの既知の抗CD-3抗体に由来する。
本発明で使用される、当該技術分野において既知である多くの好適な活性CDRセット、及び/またはVH及びVLドメインが存在する。例えば、CDR及び/またはVH及びVLドメインは、例えば、ムロモナブ-CD-3(OKT3)、オテリキシズマブ(TRX4)、テプリズマブ(MGA031)、ビシリズマブ(Nuvion)、SP34またはI2C、TR-66またはX35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、及びWT-31などの既知の抗CD-3抗体に由来する。
一実施形態では、ヒトCD3に結合する活性Fvドメインを形成するVH及びVL配列は、図5に示される。本明細書に示されるように、これらの活性VH(「aVH」)及び活性VL(「aVL」)ドメインは、異なる構成ならびに形式1、2、3、及び4で使用され得る。
2.不活性抗CD3可変重及び可変軽ドメイン
不活性iVH及びiVLドメインは、会合を可能にする「規則的な」フレームワーク領域(FR)を含有し、これにより、不活性可変ドメインは活性可変ドメインと会合し、対を不活性にする、例えば、CD3に結合できないようにする。
不活性iVH及びiVLドメインは、会合を可能にする「規則的な」フレームワーク領域(FR)を含有し、これにより、不活性可変ドメインは活性可変ドメインと会合し、対を不活性にする、例えば、CD3に結合できないようにする。
当業者によって理解されるように、本発明で使用される多くの「不活性」可変ドメインが存在する。基本的に、どんなアミノ酸が可変領域内のCDR位置にあろうと、別の可変ドメインとの自己集合を可能にするヒトフレームワーク領域を有する任意の可変ドメインが使用され得る。明確にするために、不活性ドメインは、CDRを含むと言われているが、技術的に、不活性可変ドメインは結合能力を与えない。
当該技術分野において理解されるように、不活性VHまたはVLドメインを生成することが概して単純であり、様々な方法で行われ得る。いくつかの実施形態では、不活性可変ドメインの生成は概して、活性可変ドメインの3つのCDRのうちの1つ以上を変化させることを含む、活性FvのCDRのうちの1つ以上を改変することによって行われる。これは、1つ以上のCDRの機能的に重要な残基において1つ以上のアミノ酸置換を行うこと、いくつかもしくは全てのCDR残基をランダム配列で置き換えること、1つ以上のCDRをタグもしくはフラグ配列で置き換えること、及び/またはCDR及び/もしくは可変領域を無関係の抗体(例えば、異なる生物のタンパク質に向けられたもの)からのものと交換することによって行われ得る。
場合によっては、可変領域内のCDRのうちの1つのみがそれを不活性にするように改変され得るが、他の実施形態は、1、2、3、4、5、または6つのCDRの改変を含む。
場合によっては、不活性ドメインは、プロドラッグ形式で選択的結合を促進して、開裂前の分子内iVH-VL及びVH-iVLドメインの形成を(例えば、分子間対形成よりも)促すように操作され得る。例えば、参照により全体が、特に界面残基アミノ酸置換に関して本明細書に明示的に組み込まれるIgawa et al.,Protein Eng.Des.Selection 23(8):667-677(2010)を参照されたい。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物のCD-3結合ドメインは、ヒトCD-3との強力なCD-3結合親和性を示すだけではなく、個々のカニクイザルCD-3タンパク質との優れた交差反応性も示す。場合によっては、ポリペプチド構築物のCD-3結合ドメインは、カニクイザルからのCD-3と交差反応性である。ある特定の場合では、CD-3に対するヒト:カニクイザルKD比率は、5~0.2である。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のCD-3結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインが挙げられるが、これらに限定されない、CD-3に結合する任意のドメインであり得る。場合によっては、CD-3結合ドメインが、抗原結合タンパク質が最終的に使用される同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトにおいて使用するために、抗原結合タンパク質のCD-3結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインからのヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
したがって、一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化またはヒト結合ドメインを含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗CD-3結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化もしくはヒト抗CD-3結合ドメインの1つ以上の(例えば、3つ全ての)軽鎖相補性決定領域1(LC CDR1)、軽鎖相補性決定領域2(LC CDR2)、及び軽鎖相補性決定領域3(LC CDR3)、及び/または本明細書に記載のヒト化もしくはヒト抗CD-3結合ドメインの1つ以上の(例えば、3つ全ての)重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)、及び重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)、例えば、1つ以上の、例えば3つ全てのLC CDR及び1つ以上の、例えば3つ全てのHC CDRを含むヒト化またはヒト抗CD-3結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ヒト化またはヒト抗CD-3結合ドメインは、CD-3に特異的なヒト化またはヒト軽鎖可変領域を含み、CD-3に特異的な軽鎖可変領域は、ヒト軽鎖フレームワーク領域内にヒトまたは非ヒト軽鎖CDRを含む。ある特定の場合では、軽鎖フレームワーク領域は、λ(ラムダ)軽鎖フレームワークである。他の場合では、軽鎖フレームワーク領域は、κ(カッパ)軽鎖フレームワークである。
いくつかの実施形態では、1つ以上のCD-3結合ドメインが、ヒト化または完全ヒトである。いくつかの実施形態では、1つ以上の活性化CD-3結合ドメインは、CD-3発現細胞上でCD-3に対して1000nM以下のKD結合を有する。いくつかの実施形態では、1つ以上の活性化CD-3結合ドメインは、CD-3発現細胞上でCD-3に対して100nM以下のKD結合を有する。いくつかの実施形態では、1つ以上の活性化CD-3結合ドメインは、CD-3発現細胞上でCD-3に対して10nM以下のKD結合を有する。いくつかの実施形態では、1つ以上のCD-3結合ドメインは、カニクイザルCD-3との交差反応性を有する。いくつかの実施形態では、1つ以上のCD-3結合ドメインは、本明細書に提供されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ヒト化またはヒト抗CD-3結合ドメインは、CD-3に特異的なヒト化またはヒト重鎖可変領域を含み、CD-3に特異的な重鎖可変領域は、ヒト重鎖フレームワーク領域内にヒトまたは非ヒト重鎖CDRを含む。
一実施形態では、抗CD-3結合ドメインは、本明細書に提供されるアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含むFvである。一実施形態では、抗CD-3結合ドメインは、本明細書に提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1、2、もしくは3つの修飾(例えば、置換)であるが、30、20、もしくは10個以下の修飾(例えば、置換)を有するアミノ酸配列、または本明細書に提供されるアミノ酸配列と95~99%の同一性を有する配列を含む、軽鎖可変領域、及び/あるいは本明細書に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1、2、もしくは3つの修飾(例えば、置換)であるが、30、20、もしくは10個以下の修飾(例えば、置換)を有するアミノ酸配列、または本明細書に提供されるアミノ酸配列と95~99%の同一性を有する配列を含む、重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗CD-3結合ドメインは、scFvであり、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、scFvリンカーを介して、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に付着している。scFvの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、次の配向、軽鎖可変領域-scFvリンカー-重鎖可変領域または重鎖可変領域-scFvリンカー-軽鎖可変領域のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のCD-3結合ドメインは、1000nM以下、100nM以下、50nM以下、20nM以下、10nM以下、5nM以下、1nM以下、または0.5nM以下のKDでの、CD-3発現細胞上でのCD-3への親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のCD-3結合ドメインは、1000nM以下、100nM以下、50nM以下、20nM以下、10nM以下、5nM以下、1nM以下、または0.5nM以下のKDでのCD-3εへの親和性を有する。さらなる実施形態では、抗原結合タンパク質のCD-3結合ドメインは、CD-3に対する低い親和性、すなわち、約100nM以上を有する。
CD-3への結合親和性は、例えば、当該技術分野において既知であるように、概してBiacoreまたはOctetアッセイを使用して、抗原結合タンパク質自体またはそのCD-3結合ドメインがアッセイプレート上でコーティングされた、微生物細胞表面上に提示された、溶液中などのCD-3に結合する能力によって決定され得る。CD-3に対する本開示の抗原結合タンパク質自体またはそのCD-3結合ドメインの結合活性は、リガンド(例えば、CD-3)または抗原結合タンパク質自体もしくはそのCD-3結合ドメインをビーズ、基質、細胞などに固定化することによってアッセイされ得る。薬剤は、適切な緩衝液に添加され得、結合パートナーが所与の温度である期間にわたってインキュベートされ得る。未結合材料を除去するための洗浄後、結合タンパク質は、例えば、高いpHのSDS緩衝液などで放出され、例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)によって分析され得る。
多くの実施形態では、好ましい活性及び非活性結合ドメインは、図5に示されるものである。図5は、異なる方法で不活性化された、1つの活性VH及びVL、ならびに3つの不活性VHi及び3つの不活性VLisを示す。
図5に示されるように、活性抗CD3 VL及びVHドメインの特に有用な対は、配列番号127のvlCDR1、配列番号128のvlCDR2、及び配列番号129のvlCDR3を伴うVLと、配列番号143のvhCDR1、配列番号144のvhCDR2、及び配列番号145のvhCDR3を伴うVHとを有する。
図5に示されるように、活性抗CD3 VL及びVHドメインの特に有用な対は、配列番号126のVLと配列番号142のVHとを有する。
B.腫瘍標的抗原に対する抗原結合ドメイン
記載されるCD3及び半減期延長ドメインに加えて、本明細書に記載のポリペプチド構築物はまた、1つ以上の標的抗原、または単一標的抗原上の1つ以上の領域に結合する標的ドメインも含む。本明細書において、本発明のポリペプチド構築物が、例えば、プロテアーゼ開裂ドメインにおいて疾患特異的な微小環境または対象の血液中で開裂されること、及び各標的抗原結合ドメインが、標的細胞上の標的抗原に結合し、それによりCD3結合ドメインをT細胞に結合するように活性化することが企図される。一般に、TTA結合ドメインは、プロテアーゼ開裂前にそれらの標的に結合することができ、したがって、それらは、T細胞誘導として活性化されるために標的細胞上で「待つ」ことができる。少なくとも1つの標的抗原が、疾患、障害、または状態に関与及び/または関連している。例示的な標的抗原は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生反応、移植片対宿主病、または宿主対移植片病に関連したものを含む。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞上に発現した腫瘍抗原である。あるいは、いくつかの実施形態では、標的抗原は、ウイルスまたは細菌などの病原体に関連している。少なくとも1つの標的抗原はまた、健康な組織に向けられ得る。
記載されるCD3及び半減期延長ドメインに加えて、本明細書に記載のポリペプチド構築物はまた、1つ以上の標的抗原、または単一標的抗原上の1つ以上の領域に結合する標的ドメインも含む。本明細書において、本発明のポリペプチド構築物が、例えば、プロテアーゼ開裂ドメインにおいて疾患特異的な微小環境または対象の血液中で開裂されること、及び各標的抗原結合ドメインが、標的細胞上の標的抗原に結合し、それによりCD3結合ドメインをT細胞に結合するように活性化することが企図される。一般に、TTA結合ドメインは、プロテアーゼ開裂前にそれらの標的に結合することができ、したがって、それらは、T細胞誘導として活性化されるために標的細胞上で「待つ」ことができる。少なくとも1つの標的抗原が、疾患、障害、または状態に関与及び/または関連している。例示的な標的抗原は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生反応、移植片対宿主病、または宿主対移植片病に関連したものを含む。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞上に発現した腫瘍抗原である。あるいは、いくつかの実施形態では、標的抗原は、ウイルスまたは細菌などの病原体に関連している。少なくとも1つの標的抗原はまた、健康な組織に向けられ得る。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、タンパク質、脂質、またはポリサッカライドなどの細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷した赤血球、動脈プラーク細胞、または線維性細胞上にある。
本発明の好ましい実施形態は、標的化ドメインとしてsdABDを利用する。これらは、本発明の構築物への他のVH及びVLドメインの付加が、偽Fvドメインの形式を複雑にし得るため、scFv ABDよりも好ましい。
いくつかの実施形態では、本発明のプロドラッグ構築物は、概してsdABD-TTAの対として図3Aに、かつ「形式4」構成として図4に示されるような、単一TTA結合ドメインを利用する。図4は、単一抗EGFR ABDの使用を示すが、他のTTA結合ドメインが使用され得る。
いくつかの実施形態では、特に、形式1及び形式2構築物において、本発明のプロドラッグ構築物は、この場合もやはり好ましくはsdABD-TTA形式で、2つのTTA ABDを利用する。二重標的化ドメインが使用される場合、それらは、同じTTAの同じエピトープに結合することができる。例えば、本明細書で考察されるように、本明細書の構築物のうちの多くは、2つの同一の標的化ドメインを利用する。いくつかの実施形態では、同じTTAの異なるエピトープに結合する2つの標的化ドメインが使用され得、例えば、図5に示されるように、2つのEGFR sdABDが、ヒトEGFR上の異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、2つの標的化ドメインは、異なるTTAに結合し、例えば、図を参照されたい。
本明細書で企図されるポリペプチド構築物は、少なくとも1つの抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、少なくとも1つの標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、細胞表面分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、EpCAM、EGFR、HER-2、HER-3、cMet、LyPD3、B7H3、CEA、Trop2、及びFOLR1のうちの少なくとも1つから選択される腫瘍標的抗原(「TTA」)に特異的に、かつ独立して結合する。
(a)EGFR sdABD
図5に示されるように、本明細書では「sdABD-EGFR」または「EGFRABD」と称される、ヒトEGFRに結合する特に有用なsdABDがある数存在する。
図5に示されるように、本明細書では「sdABD-EGFR」または「EGFRABD」と称される、ヒトEGFRに結合する特に有用なsdABDがある数存在する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-EGFR1は、配列番号10のsdCDR1、配列番号11のsdCDR2、及び配列番号12のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-EGFRは、配列番号9を有する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-EGFR2aは、配列番号14のsdCDR1、配列番号15のsdCDR2、及び配列番号16のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-EGFRは、配列番号13を有する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-EGFR2dは、配列番号18のsdCDR1、配列番号19のsdCDR2、及び配列番号20のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-EGFRは、配列番号17を有する。
(b)EpCAM sdABD
図5に示されるように、本明細書では「sdABD-EpCAM」または「EpCAMABD」と称される、ヒトEpCAMに結合する特に有用なsdABDがある数存在する。
図5に示されるように、本明細書では「sdABD-EpCAM」または「EpCAMABD」と称される、ヒトEpCAMに結合する特に有用なsdABDがある数存在する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-EpCAM h13は、配列番号62のsdCDR1、配列番号63のsdCDR2、及び配列番号64のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-EpCAMは、配列番号61を有する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-EpCAM h23は、配列番号66のsdCDR1、配列番号67のsdCDR2、及び配列番号68のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-EpCAMは、配列番号65を有する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-EpCAM hVIB665は、配列番号70のsdCDR1、配列番号71のsdCDR2、及び配列番号72のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-EpCAMは、配列番号69を有する。h13及びh23 EpCAM sdABDとは対照的に、hVIB665(「acEpCAM hVIB665」とも称される)は、EpCAM(インビボで開裂を受けることが知られている)の開裂形態及び未開裂形態の両方に結合することに留意されたい。
1つの有用な実施形態では、sdABD-EpCAM hVIB666は、配列番号74のsdCDR1、配列番号75のsdCDR2、及び配列番号76のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-EpCAMは、配列番号73を有する。h13及びh23 EpCAM sdABDとは対照的に、hVIB666(「acEpCAM hVIB666」とも称される)は、EpCAM(インビボで開裂を受けることが知られている)の開裂形態及び未開裂形態の両方に結合することに留意されたい。
(c)B7H3 sdABD
図5に示されるように、本明細書では「sdABD-B7H3」または「B7H3-ABD」と称される、ヒトB7H3に結合する特に有用なsdABDがある数存在する。
図5に示されるように、本明細書では「sdABD-B7H3」または「B7H3-ABD」と称される、ヒトB7H3に結合する特に有用なsdABDがある数存在する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-B7H3 hF7は、配列番号34のsdCDR1、配列番号35のsdCDR2、及び配列番号36のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-B7H3は、配列番号33を有する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-B7H3 hF12は、配列番号38のsdCDR1、配列番号39のsdCDR2、及び配列番号40のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-B7H3は、配列番号37を有する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-B7H3 hF12(N57Q)は、配列番号42のsdCDR1、配列番号43のsdCDR2、及び配列番号44のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-B7H3は、配列番号41を有する。hF7及びhF12 B7H3 sdABDとは対照的に、アミノ酸置換N57Qは、グリコシル化部位を除去する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-B7H3 HF12(N57E)は、配列番号46のsdCDR1、配列番号47のsdCDR2、及び配列番号48のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-B7H3は、配列番号45を有する。hF7及びhF12 B7H3 sdABDとは対照的に、アミノ酸置換N57Eは、グリコシル化部位を除去する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-B7H3 hF12(N57D)は、配列番号50のsdCDR1、配列番号51のsdCDR2、及び配列番号52のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-B7H3は、配列番号49を有する。hF7及びhF12 B7H3 sdABDとは対照的に、アミノ酸置換N57Dは、グリコシル化部位を除去する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-B7H3 hF12(S59A)は、配列番号54のsdCDR1、配列番号55のsdCDR2、及び配列番号56のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-B7H3は、配列番号53を有する。hF7及びhF12 B7H3 sdABDとは対照的に、アミノ酸置換S59Aは、グリコシル化部位を除去する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-B7H3 hF12(S59Y)は、配列番号58のsdCDR1、配列番号59のsdCDR2、及び配列番号60のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-B7H3は、配列番号57を有する。hF7及びhF12 B7H3 sdABDとは対照的に、アミノ酸置換NS59Yは、グリコシル化部位を除去する。
(d)FOLR1 sdABD
図5に示されるように、本明細書では「sdABD-FOLR1」または「FOLR1-ABD」と称される、ヒトFOLR1に結合する特に有用なsdABDがある数存在する。
図5に示されるように、本明細書では「sdABD-FOLR1」または「FOLR1-ABD」と称される、ヒトFOLR1に結合する特に有用なsdABDがある数存在する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-FOLR1 h77-2は、配列番号22のsdCDR1、配列番号23のsdCDR2、及び配列番号24のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-FOLR1は、配列番号21を有する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-FOLR1 h59.3は、配列番号26のsdCDR1、配列番号27のsdCDR2、及び配列番号28のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-FOLR1は、配列番号25を有する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-FOLR1 h22-4は、配列番号30のsdCDR1、配列番号31のsdCDR2、及び配列番号32のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-FOLR1は、配列番号29を有する。
(e)Trop2 sdABD
図5に示されるように、本明細書では「sdABD-Trop2」または「Trop2-ABD」と称される、ヒトTrop2に結合する特に有用なsdABDがある数存在する。
図5に示されるように、本明細書では「sdABD-Trop2」または「Trop2-ABD」と称される、ヒトTrop2に結合する特に有用なsdABDがある数存在する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-Trop2 hVIB557は、配列番号78のsdCDR1、配列番号79のsdCDR2、及び配列番号80のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-Trop2は、配列番号77を有する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-Trop2 hVIB565は、配列番号82のsdCDR1、配列番号83のsdCDR2、及び配列番号84のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-Trop2は、配列番号81を有する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-Trop2 hVIB575は、配列番号86のsdCDR1、配列番号87のsdCDR2、及び配列番号88のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-Trop2は、配列番号85を有する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-Trop2 hVIB578は、配列番号90のsdCDR1、配列番号01のsdCDR2、及び配列番号92のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-Trop2は、配列番号89を有する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-Trop2 hVIB609は、配列番号94のsdCDR1、配列番号95のsdCDR2、及び配列番号96のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-Trop2は、配列番号93を有する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-Trop2 hVIB619は、配列番号98のsdCDR1、配列番号99のsdCDR2、及び配列番号100のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-Trop2は、配列番号97を有する。
(f)CA9 sdABD
図5に示されるように、本明細書では「sdABD-CA9」または「CA9-ABD」と称される、ヒトCA9に結合する特に有用なsdABDがある数存在する。
図5に示されるように、本明細書では「sdABD-CA9」または「CA9-ABD」と称される、ヒトCA9に結合する特に有用なsdABDがある数存在する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-CA9 hVIB456は、配列番号102のsdCDR1、配列番号103のsdCDR2、及び配列番号104のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-Trop2は、配列番号101を有する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-CA9 hVIB476は、配列番号106のsdCDR1、配列番号107のsdCDR2、及び配列番号108のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-Trop2は、配列番号105を有する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-CA9 hVIB407は、配列番号110のsdCDR1、配列番号111のsdCDR2、及び配列番号112のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-Trop2は、配列番号109を有する。
1つの有用な実施形態では、sdABD-CA9 hVIB445は、配列番号114のsdCDR1、配列番号115のsdCDR2、及び配列番号116のsdCDR3を有する。場合によっては、sdABD-Trop2は、配列番号113を有する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂ドメインの開裂前のタンパク質は、約100kDa未満である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂ドメインの開裂後のタンパク質は、約25~約75kDaである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、初回通過クリアランスの腎閾値を超えるサイズを有する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、少なくとも約50時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、少なくとも約100時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、同じ標的抗原に対するIgGと比較して、増大した組織浸透を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、同じ標的抗原に対するIgGと比較して、増大した組織分布を有する。
C.半減期延長ドメイン
本発明のMCEタンパク質(この場合もやはり、本明細書において、「COBRA(商標)」タンパク質または構築物とも称される)は、任意に、半減期延長ドメインを含む。そのようなドメインは、HSA結合ドメイン、Fcドメイン、小分子、及び当該技術分野において既知の他の半減期延長ドメインが挙げられるが、これらに限定されないことが企図される。
本発明のMCEタンパク質(この場合もやはり、本明細書において、「COBRA(商標)」タンパク質または構築物とも称される)は、任意に、半減期延長ドメインを含む。そのようなドメインは、HSA結合ドメイン、Fcドメイン、小分子、及び当該技術分野において既知の他の半減期延長ドメインが挙げられるが、これらに限定されないことが企図される。
ヒト血清アルブミン(HSA)(分子質量約67kDa)は、約50mg/mL(600uM)で存在する血漿中で最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて約20日間の半減期を有する。HSAは、血漿pHを維持する働きをし、コロイド血圧に寄与し、多くの代謝物及び脂肪酸の担体として機能し、血漿中の主要な薬物輸送タンパク質としての役割を果たす。
アルブミンとの非共有結合性会合は、短命タンパク質の消失半減期を延長する。例えば、Fabフラグメントへのアルブミン結合ドメインの組換え融合は、Fabフラグメント単独の投与と比較して、マウス及びウサギのそれぞれに静脈内投与されたときに、25~58倍の低減されたインビボクリアランス及び26~37倍の半減期延長をもたらした。別の例では、インスリンが脂肪酸でアシル化されてアルブミンとの会合を促進する場合、ウサギまたはブタに皮下注射されたときに持続的な効果が観察された。合わせて、これらの研究は、アルブミン結合と持続性作用との間のつながりを実証した。
一態様では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、半減期延長ドメイン、例えば、HSAに特異的に結合するドメインを含む。他の実施形態では、HSA結合ドメインは、ペプチドである。さらなる実施形態では、HSA結合ドメインは、小分子である。抗原結合タンパク質のHSA結合ドメインが、かなり小さく、いくつかの実施形態では、25kD以下、20kD以下、15kD以下、または10kD以下であることが企図される。ある特定の場合では、HSA結合ドメインは、それがペプチドまたは小分子である場合、5kD以下である。
多くの実施形態では、半減期延長ドメインは、HSAに結合する単一ドメイン抗体からの単一ドメイン抗原結合ドメインである。このドメインは概して、これらの結合ドメインをTTAに対するsdABDと区別するために、本明細書においてヒトHSAに対する「sdABD」(sdABD-HSA)、あるいは「sdABD(1/2)」と称される。特に有用なsdABD(1/2)は、図5に示される。
抗原結合タンパク質の半減期延長ドメインは、抗原結合タンパク質自体の改変した薬力学及び薬物動態を提供する。上記のとおり、半減期延長ドメインは、消失半減期を延長する。半減期延長ドメインはまた、抗原結合タンパク質の組織分布、浸透、及び拡散の改変を含む、薬理学的特性を改変させる。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、半減期延長結合ドメインなしのタンパク質と比較して、改善された組織(腫瘍を含む)標的化、組織浸透、組織分布、組織内の拡散、及び増強した有効性を提供する。一実施形態では、治療法は、低減した量の抗原結合タンパク質を効果的かつ効率的に利用し、非腫瘍細胞の細胞毒性の低減などの副作用の低減をもたらす。
さらに、半減期延長ドメイン、例えば、HSA結合ドメインの特徴は、HSAに対するHSA結合ドメインの結合親和性を含む。該HSA結合ドメインの親和性は、特定のポリペプチド構築物における特定の消失半減期を標的とするように選択され得る。したがって、いくつかの実施形態では、HSA結合ドメインは、高い結合親和性を有する。他の実施形態では、HSA結合ドメインは、中程度の結合親和性を有する。さらに他の実施形態では、HSA結合ドメインは、低いまたはわずかな結合親和性を有する。例示的な結合親和性は、10nM以下(高)、10nM~100nM(中)、及び100nM超(低)のKD濃度を含む。上記のとおり、HSAへの結合親和性は、表面プラズモン共鳴(SPR)などの既知の方法によって決定される。
D.プロテアーゼ開裂部位
本発明のタンパク質組成物、特にプロドラッグ構築物は、本明細書で概説されるように、概して開裂性リンカー内に存在する1つ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。
本発明のタンパク質組成物、特にプロドラッグ構築物は、本明細書で概説されるように、概して開裂性リンカー内に存在する1つ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。
本明細書に記載されるように、本発明のプロドラッグ構築物は、少なくとも1つのプロテアーゼによって開裂されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つのプロテアーゼ開裂部位を含む。場合によっては、本明細書に記載のMCEタンパク質は、少なくとも1つのプロテアーゼによって開裂される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、またはそれ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。本明細書でより十分に考察されるように、2つ以上のプロテアーゼ開裂部位がプロドラッグ構築で使用される場合、それらは同じであっても(例えば、単一プロテアーゼによって開裂される複数の部位)、異なっていてもよい(2つ以上の開裂部位が少なくとも2つの異なるプロテアーゼによって開裂される)。当業者によって理解されるように、3つ以上のプロテアーゼ開裂部位を含有する構築物は、1、2、3個などを利用することができ、例えば、いくつかの構築物は、2つの異なるプロテアーゼに対して3つの部位などを利用することができる。
プロテアーゼ開裂部位のアミノ酸配列は、標的とされるプロテアーゼに依存する。当該技術分野において既知であるように、体内で見つかり、疾患状態に関連し得る多くのヒトプロテアーゼが存在する。
プロテアーゼは、いくつかの罹患細胞及び組織、例えば腫瘍またはがん細胞によって分泌され、プロテアーゼが豊富である微小環境またはプロテアーゼに富んだ微小環境を作り出すことが既知である。場合によっては、対象の血液は、プロテアーゼが豊富である。場合によっては、腫瘍を包囲する細胞が、プロテアーゼを腫瘍微小環境中に分泌する。プロテアーゼを分泌する腫瘍を包囲する細胞としては、腫瘍間質細胞、筋線維芽細胞、血液細胞、マスト細胞、B細胞、NK細胞、制御性T細胞、マクロファージ、細胞傷害性T細胞、樹状細胞、間葉系幹細胞多形核細胞、及び他の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、プロテアーゼ、例えば、微生物ペプチドで見られるアミノ酸配列を標的とするプロテアーゼは、対象の血液中に存在する。この特徴は、標的細胞または組織のプロテアーゼに富んだ微小環境を除いて、T細胞が抗原結合タンパク質によって結合されないため、抗原結合タンパク質などの標的化治療薬がさらなる特異性を有することを可能にする。
プロテアーゼは、場合によっては、配列特異的な方法でタンパク質を開裂するタンパク質である。プロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、血清プロテアーゼ、カテプシン(例えば、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンK、カテプシンL、カテプシンS)、カリクレイン、hK1、hK10、hK15、KLK7、グランザイムB、プラスミン、コラゲナーゼ、IV型コラゲナーゼ、ストロメリシン、第XA因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニジン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ(例えば、カスパーゼ-3)、Mir1-CP、パパイン、HIV-1プロテアーゼ、HSVプロテアーゼ、CMVプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)、MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP13、MMP11、MMP14、メプリン、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原(PSA、hK3)、インターロイキン-1β変換酵素、トロンビン、FAP(FAP-α)、ジペプチジルペプチダーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV/CD26)が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの好適なプロテアーゼ及びプロテアーゼ開裂配列が図5及び図6に示される。
E.リンカー
本明細書で考察されるように、本発明の異なるドメインは概して、アミノ酸リンカーを使用して一緒に連結され、これは、同様に柔軟性または非柔軟性(例えば、立体障害)を含む機能性、ならびに原位置プロテアーゼを使用して開裂される能力を与えることができる。これらのリンカーは、多くの方法で分類され得る。
本明細書で考察されるように、本発明の異なるドメインは概して、アミノ酸リンカーを使用して一緒に連結され、これは、同様に柔軟性または非柔軟性(例えば、立体障害)を含む機能性、ならびに原位置プロテアーゼを使用して開裂される能力を与えることができる。これらのリンカーは、多くの方法で分類され得る。
本発明は、2つ以上のドメインを結合するために使用される「ドメインリンカー」を提供する(例えば、VH及びVL、VHまたはVLに対する標的腫瘍抗原結合ドメイン(TTABD、本明細書において「αTTA」(「抗TTA」に対して)と称されるときもある)、別の構成成分に対する半減期延長ドメインなど)。ドメインリンカーは、例えば、非開裂性(NCL)、開裂性(「CL」)、拘束及び開裂性(CCL)、ならびに拘束及び非開裂性(CNCL)であり得る。
1.非開裂性リンカー
いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、非開裂性である。概して、これらは、構築物のリンカーの構成成分「上流」及び「下流」がある特定の方法で分子内で自己集合することを可能にする非開裂性及び柔軟性、またはリンカーによって分離された2つの構成成分が分子内で自己集合することができない非開裂性及び拘束、の2つのタイプのうちの1つであり得る。しかしながら、後者の場合、非開裂性拘束リンカーによって分離された2つの構成成分ドメインが分子内で自己集合しない一方で、他の分子内構成成分が自己集合して、偽Fvドメインを形成することに留意されたい。
いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、非開裂性である。概して、これらは、構築物のリンカーの構成成分「上流」及び「下流」がある特定の方法で分子内で自己集合することを可能にする非開裂性及び柔軟性、またはリンカーによって分離された2つの構成成分が分子内で自己集合することができない非開裂性及び拘束、の2つのタイプのうちの1つであり得る。しかしながら、後者の場合、非開裂性拘束リンカーによって分離された2つの構成成分ドメインが分子内で自己集合しない一方で、他の分子内構成成分が自己集合して、偽Fvドメインを形成することに留意されたい。
(i)非開裂性であるが柔軟性のリンカー
この実施形態では、リンカーは、概して、患者において原位置プロテアーゼによって開裂されないより長い柔軟性ドメインを通して、ドメインに結合してドメインの機能性を維持するために使用される。本発明のポリペプチド中のドメインに連結するのに好適な内部の非開裂性リンカーの例としては、(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGSG)n、(GGSGG)n、または(GGGGS)nが挙げられるが、これらに限定されず、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。いくつかの実施形態では、リンカーの長さは、約15アミノ酸であり得る。
この実施形態では、リンカーは、概して、患者において原位置プロテアーゼによって開裂されないより長い柔軟性ドメインを通して、ドメインに結合してドメインの機能性を維持するために使用される。本発明のポリペプチド中のドメインに連結するのに好適な内部の非開裂性リンカーの例としては、(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGSG)n、(GGSGG)n、または(GGGGS)nが挙げられるが、これらに限定されず、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。いくつかの実施形態では、リンカーの長さは、約15アミノ酸であり得る。
(ii)非開裂性及び拘束リンカー
場合によっては、リンカーは、開裂部位を含有せず、またリンカーによって分離されたタンパク質ドメインが分子内で自己集合することを可能にするには短すぎ、「拘束非開裂性リンカー」または「CNCL」である。例えば、Pro186において、活性VH及び活性VLは、VH及びVLが活性抗原結合ドメインに自己集合することを可能にしない8アミノ酸(「8mer」)によって分離される。いくつかの実施形態では、リンカーは、なおも柔軟性、例えば、(GGGS)n(n=2)である。他の実施形態では、概してあまり好ましくないが、プロリンまたはかさ高いアミノ酸を含むものなどのより剛性のリンカーが使用され得る。
場合によっては、リンカーは、開裂部位を含有せず、またリンカーによって分離されたタンパク質ドメインが分子内で自己集合することを可能にするには短すぎ、「拘束非開裂性リンカー」または「CNCL」である。例えば、Pro186において、活性VH及び活性VLは、VH及びVLが活性抗原結合ドメインに自己集合することを可能にしない8アミノ酸(「8mer」)によって分離される。いくつかの実施形態では、リンカーは、なおも柔軟性、例えば、(GGGS)n(n=2)である。他の実施形態では、概してあまり好ましくないが、プロリンまたはかさ高いアミノ酸を含むものなどのより剛性のリンカーが使用され得る。
2.開裂性リンカー
本明細書のプロドラッグ構築物の全ては、少なくとも1つの開裂性リンカーを含む。したがって、一実施形態では、ドメインリンカーは、開裂性(CL)であり、本明細書において「プロテアーゼ開裂ドメイン」(「PCD」)と称されるときもある。この実施形態では、CLは、本明細書で概説されるように、かつ図5及び図6に示されるように、プロテアーゼ開裂部位を含有する。場合によっては、CLは、プロテアーゼ開裂部位のみを含有する。任意に、開裂認識部位の長さに応じて、CLのN末端またはC末端のいずれかまたは両方にさらに数個の連結アミノ酸が存在し得、例えば、開裂部位のN末端またはC末端のいずれかまたは両方に1、2、3、4、または5つのアミノ酸が存在し得る。したがって、開裂性リンカーはまた、拘束されているか(例えば、8mer)または柔軟性である。
本明細書のプロドラッグ構築物の全ては、少なくとも1つの開裂性リンカーを含む。したがって、一実施形態では、ドメインリンカーは、開裂性(CL)であり、本明細書において「プロテアーゼ開裂ドメイン」(「PCD」)と称されるときもある。この実施形態では、CLは、本明細書で概説されるように、かつ図5及び図6に示されるように、プロテアーゼ開裂部位を含有する。場合によっては、CLは、プロテアーゼ開裂部位のみを含有する。任意に、開裂認識部位の長さに応じて、CLのN末端またはC末端のいずれかまたは両方にさらに数個の連結アミノ酸が存在し得、例えば、開裂部位のN末端またはC末端のいずれかまたは両方に1、2、3、4、または5つのアミノ酸が存在し得る。したがって、開裂性リンカーはまた、拘束されているか(例えば、8mer)または柔軟性である。
本発明で特に興味深いのは、MMP9開裂性リンカー及びメプリン開裂性リンカー、特にMMP9拘束開裂性リンカー及びメプリン拘束開裂性リンカーである。
II.本発明のドメイン
本発明は、本発明のプロドラッグポリペプチドに対する多くの異なる形式を提供する。本発明は、拘束Fvドメイン及び拘束偽Fvドメインを提供する。加えて、本発明は、2つのFvドメインを含有するが、非異性化構築物である、多価の条件的に有効な(「MCE」)タンパク質を提供する。本明細書で概説されるように、これらは、非異性化開裂性形式または非異性化非開裂性形式であり得るが、全ての構築物が、少なくとも1つのプロテアーゼ開裂ドメインを含有する。
本発明は、本発明のプロドラッグポリペプチドに対する多くの異なる形式を提供する。本発明は、拘束Fvドメイン及び拘束偽Fvドメインを提供する。加えて、本発明は、2つのFvドメインを含有するが、非異性化構築物である、多価の条件的に有効な(「MCE」)タンパク質を提供する。本明細書で概説されるように、これらは、非異性化開裂性形式または非異性化非開裂性形式であり得るが、全ての構築物が、少なくとも1つのプロテアーゼ開裂ドメインを含有する。
重要なことに、これらのドメイン(Fvドメイン及び偽Fvドメイン)の両方が、本明細書において「拘束された」と称され、上記で考察されるように、かつ図36、図37、及び図38に示されるように、これらのうちの1つのみが拘束される必要があることを意味するが、概して、両方のリンカーが拘束されているときに、タンパク質は、より良好な発現を有する。
当業者は、形式1、2、及び4に関して、本発明の拘束及び偽FvドメインのN末端からC末端への順序(リンカーは示さず)に対して4つの可能性、aVH-aVL及びiVL-iVH、aVH-aVL及びiVH-iVL、aVL-aVH及びiVL-iVH、aVL-aVH及びiVH-iVLがあることを理解するであろう。4つ全てが試験され、4つ全てが活性を有するが、第1の順序、aVH-aVL及びiVL-iVHは、他の3つよりも良好な発現を示す。したがって、本明細書の説明は概して、このaVH-aVL及びiVL-iVH形式で示されるが、本明細書の全ての開示は、これらのドメインの他の順序も含む。
概して、本発明の完全長構築物のN末端からC末端への順序が、aVH-aVL及びiVL-iVH配向に基づくことに留意されたい。
加えて、ある特定のABDのC末端配列に由来するヒトにおける免疫原性が存在し得ることが、当該技術分野において既知である。したがって、一般に、特に構築物のC末端がsdABD(例えば、構築物のうちの多くのsdABD-HSAドメイン)で終端するとき、ヒスチジンタグ(His6またはHis10のいずれか)が使用され得る。本明細書の配列のうちの多くまたはほとんどを、精製の理由でHis6 C末端タグを使用して生成したが、これらの配列はまた、Holland et al.,DOI 10.1007/s10875-013-9915-0及びWO2013/024059によって示されるように、ヒトにおける免疫原性を低減するためにも使用され得る。
A.拘束Fvドメイン
本発明は、拘束リンカー(本明細書で概説されるように、開裂性(形式1)または非開裂性(形式2及び4)であり得る)を使用して供給結合された活性VH及び活性VLドメインを含む、拘束Fvドメインを提供する。拘束リンカーは、開裂の非存在下でaVHとaVLとの間の分子内会合を防止する。したがって、拘束Fvドメインは概して、可変ドメイン内に含有された6つのCDRのセットを含み、VHのvhCDR1、vhCDR2、及びvhCDR3は、ヒトCD-3に結合し、VLのvlCDR1、vCDR2、及びvlCDR3は、ヒトCD-3に結合するが、プロドラッグ形式(例えば、未開裂)では、VH及びVLは、立体的に会合して活性結合ドメインを形成することができず、むしろ偽Fvと分子内で対になることを好む。
本発明は、拘束リンカー(本明細書で概説されるように、開裂性(形式1)または非開裂性(形式2及び4)であり得る)を使用して供給結合された活性VH及び活性VLドメインを含む、拘束Fvドメインを提供する。拘束リンカーは、開裂の非存在下でaVHとaVLとの間の分子内会合を防止する。したがって、拘束Fvドメインは概して、可変ドメイン内に含有された6つのCDRのセットを含み、VHのvhCDR1、vhCDR2、及びvhCDR3は、ヒトCD-3に結合し、VLのvlCDR1、vCDR2、及びvlCDR3は、ヒトCD-3に結合するが、プロドラッグ形式(例えば、未開裂)では、VH及びVLは、立体的に会合して活性結合ドメインを形成することができず、むしろ偽Fvと分子内で対になることを好む。
拘束Fvドメインは、本明細書に記載されるように、活性VH及び活性VL(aVH及びaVL)もしくは不活性VH及びVL(iVH及びiVL、この場合、それは拘束偽Fvドメインである)、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
当業者によって理解されるように、拘束Fvドメイン中のVH及びVLの順序は、(N末端からC末端に)VH-リンカー-VLまたはVL-リンカー-VHのいずれかであり得る。
本明細書で概説されるように、形式1構築物に関して、拘束Fvドメインは、図5及び図6に示されるものなどの場合、開裂性リンカーを使用して連結されたVH及びVLを含むことができる。この実施形態では、拘束Fvドメインは、構造(N末端からC末端に)vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-CCL-vlFR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4を有する。一般に、拘束Fvドメインは、活性VH及びVLドメイン(例えば、会合したときにCD3に結合することが可能)を含有し、したがって構造(N末端からC末端に)vhFR1-avhCDR1-vhFR2-avhCDR2-vhFR3-avhCDR3-vhFR4-CCL-vlFR1-avlCDR1-vlFR2-avlCDR2-vlFR3-avlCDR3-vlFR4を有する。
本明細書で概説されるように、形式2構築物に関して、拘束Fvドメインは、非開裂性リンカーを使用して連結されたVH及びVLを含むことができる。この実施形態では、拘束Fvドメインは、構造(N末端からC末端に)vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-CNCL-vlFR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4を有する。一般に、拘束Fvドメインは、活性VH及びVLドメイン(例えば、会合したときにCD3に結合することが可能)を含有し、したがって構造(N末端からC末端に)vhFR1-avhCDR1-vhFR2-avhCDR2-vhFR3-avhCDR3-vhFR4-CNCL-vlFR1-avlCDR1-vlFR2-avlCDR2-vlFR3-avlCDR3-vlFR4を有する。
配列番号142を有するaVHと、配列番号126を有するaVLと、配列番号233を有するドメインリンカーとを有する拘束非開裂性Fvドメインが、本発明で特に使用される。
B.拘束偽Fvドメイン
本発明は、拘束リンカー(本明細書で概説されるように、開裂性または非開裂性であり得る)を使用して供給結合された不活性または偽iVH及びiVLドメインを含む、拘束偽Fvドメインを提供する。拘束リンカーは、開裂の非存在下でiVHとiVLとの間の分子内会合を防止する。したがって、拘束偽Fvドメインは概して、iVH及びiVLの会合(非拘束形式であるとき)を可能にするフレームワーク領域を有するiVH及びiVLを含むが、得られる偽Fvドメインは、ヒトタンパク質に結合しない。iVHドメインは、aVLドメインと集合することができ、iVLドメインは、aVHドメインと集合することができるが、得られる構造は、CD3に結合しない。
本発明は、拘束リンカー(本明細書で概説されるように、開裂性または非開裂性であり得る)を使用して供給結合された不活性または偽iVH及びiVLドメインを含む、拘束偽Fvドメインを提供する。拘束リンカーは、開裂の非存在下でiVHとiVLとの間の分子内会合を防止する。したがって、拘束偽Fvドメインは概して、iVH及びiVLの会合(非拘束形式であるとき)を可能にするフレームワーク領域を有するiVH及びiVLを含むが、得られる偽Fvドメインは、ヒトタンパク質に結合しない。iVHドメインは、aVLドメインと集合することができ、iVLドメインは、aVHドメインと集合することができるが、得られる構造は、CD3に結合しない。
拘束偽Fvドメインは、不活性VH及びVL(iVH及びiVL)を含む。
当業者によって理解されるように、拘束偽Fvドメイン中のVH及びVLの順序は、(N末端からC末端に)VH-リンカー-VLまたはVL-リンカー-VHのいずれかであり得る。
本明細書で概説されるように、拘束偽Fvドメインは、形式1、2、及び4に示されるような非開裂性リンカーを使用して、または形式3に示されるような開裂性リンカーを用いて連結されたiVH及びiVLを含むことができる。
一般に、拘束Fvドメインは、非活性VH及びVLドメインを含有し(例えば、会合したときにCD3に結合することが可能)、したがって、構造(N末端からC末端に)vhFR1-ivlCDR1-vhFR2-ivlCDR2-vhFR3-ivlCDR3-vhFR4-CNCL-vlFR1-ivhCDR1-vlFR2-ivhCDR2-vlFR3-ivhCDR3-vlFR4を有する。
配列番号146、配列番号150、及び配列番号154を有するiVHと、配列番号130、配列番号134、または配列番号138を有するiVLと、配列番号233を有するドメインリンカーとを有する拘束非開裂性偽Fvドメインが、本発明で特に使用される。
III.本発明の形式
本明細書で考察されるように、本発明のプロドラッグ構築物は、二重TTA結合ドメインを有する開裂性形式、二重TTA結合ドメインを有する非開裂性形式(そのうちのいずれかが同じTTA結合ドメインまたは異なる結合ドメインを有することができる)、及び単一標的化ドメインを有する非開裂性形式を含む、多くの異なる形式をとることができる。
本明細書で考察されるように、本発明のプロドラッグ構築物は、二重TTA結合ドメインを有する開裂性形式、二重TTA結合ドメインを有する非開裂性形式(そのうちのいずれかが同じTTA結合ドメインまたは異なる結合ドメインを有することができる)、及び単一標的化ドメインを有する非開裂性形式を含む、多くの異なる形式をとることができる。
A.二重標的化を有する開裂性形式
本発明は、図1の「形式1」型の非異性化開裂性形式を提供する。この実施形態では、拘束Fvドメインは、拘束開裂性リンカーを使用して連結されたVH及びVLドメインを含み、拘束偽Fvドメインは、拘束非開裂性リンカーを使用する。考察を容易にするために、これらのうちの両方が本明細書において「拘束された」と称されるが、上記で考察されるように、かつ図37、図38、及び図39に示されるように、これらのうちの1つのみが拘束される必要があるが、概して、両方のリンカーが拘束されているときに、タンパク質は、より良好な発現を有する。
本発明は、図1の「形式1」型の非異性化開裂性形式を提供する。この実施形態では、拘束Fvドメインは、拘束開裂性リンカーを使用して連結されたVH及びVLドメインを含み、拘束偽Fvドメインは、拘束非開裂性リンカーを使用する。考察を容易にするために、これらのうちの両方が本明細書において「拘束された」と称されるが、上記で考察されるように、かつ図37、図38、及び図39に示されるように、これらのうちの1つのみが拘束される必要があるが、概して、両方のリンカーが拘束されているときに、タンパク質は、より良好な発現を有する。
形式1(ならびに他の形式)の全ての構築物はまた、ヒト腫瘍プロテアーゼによって開裂される開裂性リンカー(CL)を有する。
本発明は、N末端からC末端に(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-拘束Fvドメイン-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-拘束偽Fvドメイン-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む、プロドラッグタンパク質を提供する。
当業者によって理解されるように、拘束Fvドメインまたは拘束偽FvドメインのいずれかのVH及びVLの順序は、(N末端からC末端に)VH-リンカー-VLまたはVL-リンカー-VHのいずれかであり得る。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CCL-aVL-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CCL-aVL-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-iVH-CCL-iVL-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-aVL-CCL-aVH-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-aVL-CCL-aVH-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-iVH-CCL-iVL-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、sdABD(TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CCL-aVL-ドメインリンカー-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-NCL-sdABD(1/2)を含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、及びiVLは、図5に示される配列を有する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、sdABD(TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CCL-aVL-ドメインリンカー-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD(1/2)を含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、EGFR、EpCAM、FOLR1、Trop2、CA9、またはB7H3であり得る同じTTAに結合し、この配列は、図5に示される。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、sdABD(TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CCL-aVL-ドメインリンカー-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD(1/2)を含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、異なるTTAに結合する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、sdABD(TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CCL-aVL-ドメインリンカー-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD(1/2)を含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、EGFR及びEpCAMに結合し、sdABD-TTAは、図5の配列を有する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、sdABD(TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CCL-aVL-ドメインリンカー-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD(1/2)を含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、EGFR及びFOLR1に結合し、sdABD-TTAは、図5の配列を有する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、sdABD(TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CCL-aVL-ドメインリンカー-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD(1/2)を含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、EGFR及びB7H3に結合し、sdABD-TTAは、図5の配列を有する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、sdABD(TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CCL-aVL-ドメインリンカー-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD(1/2)を含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、EpCAM及びFOLR1に結合し、sdABD-TTAは、図5の配列を有する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、sdABD(TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CCL-aVL-ドメインリンカー-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD(1/2)を含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、EpCAM及びB7H3に結合し、sdABD-TTAは、図5の配列を有する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、sdABD(TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CCL-aVL-ドメインリンカー-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD(1/2)を含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、B7H3及びFOLR1に結合し、sdABD-TTAは、図5の配列を有する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、sdABD(TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CCL-aVL-ドメインリンカー-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD(1/2)を含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、EGFR、FOLR1、B7H3、Trop2、CA9、またはEpCAMであり得る同じTTAに結合し、この配列は、図5に示され、CCL及びCLは、MMP9またはメプリンによって開裂されるリンカーから選択され、sdABD(1/2)は、配列番号117または配列番号121を有する。
形式1において、好ましいドメインリンカーは、配列番号233である(これはまた、好ましい拘束非開裂性リンカーとしても機能する)。
形式1において、好ましい構築物は、Pro140及びPro140bである。
B.非開裂性形式
図2に示されるように、本発明は、非異性化非開裂性形式を提供する。この実施形態では、プロドラッグ構築物において活性化開裂部位が存在するため、「非開裂性」が拘束Fvドメインの連結にのみ適用されることが理解される。この実施形態では、拘束Fvドメインは、拘束非開裂性リンカーを使用して連結されたVH及びVLドメインを含み、拘束偽Fvドメインは、拘束非開裂性リンカーを使用する。
図2に示されるように、本発明は、非異性化非開裂性形式を提供する。この実施形態では、プロドラッグ構築物において活性化開裂部位が存在するため、「非開裂性」が拘束Fvドメインの連結にのみ適用されることが理解される。この実施形態では、拘束Fvドメインは、拘束非開裂性リンカーを使用して連結されたVH及びVLドメインを含み、拘束偽Fvドメインは、拘束非開裂性リンカーを使用する。
当業者によって理解されるように、拘束Fvドメインまたは拘束偽FvドメインのいずれかのVH及びVLの順序は、(N末端からC末端に)VH-リンカー-VLまたはVL-リンカー-VHのいずれかであり得る。
本発明は、N末端からC末端に、sdABD(TTA1)-ドメインリンカー-拘束Fvドメイン-ドメインリンカー-sdABD(TTA2)-開裂性リンカー-拘束偽Fvドメイン-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む、プロドラッグタンパク質を提供する。
当業者によって理解されるように、拘束Fvドメインまたは拘束偽FvドメインのいずれかのVH及びVLの順序は、(N末端からC末端に)VH-リンカー-VLまたはVL-リンカー-VHのいずれかであり得る。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CNCL-aVL-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CNCL-aVL-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-iVH-CNCL-iVL-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-aVL-CNCL-aVH-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-aVL-CNCL-aVH-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-iVH-CNCL-iVL-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CNCL-aVL-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、EGFR、EpCAM、FOLR1、Trop2、CA9、またはB7H3であり得る同じTTAに結合し、この配列は、図5に示される。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CNCL-aVL-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、異なるTTAに結合する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CNCL-aVL-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、EGFR及びEpCAMに結合し、sdABD-TTAは、図5の配列を有する。この実施形態では、EGFRとEpCAMとの好ましい組み合わせは、以下を含む。
この場合、「いずれかの配向」は、EpCAM sdABDが、本発明の構築物におけるEGFR sdABDに対してN末端であるか、またはEGFR sdABDに対してC末端であるかのいずれかであることを意味する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CNCL-aVL-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、EGFR及びFOLR1に結合し、sdABD-TTAは、図5の配列を有する。この実施形態では、EGFRとFOLR1との好ましい組み合わせは、以下を含む。
この場合、「いずれかの配向」は、FOLR1 sdABDが、本発明の構築物におけるEGFR sdABDに対してN末端であるか、またはEGFR sdABDに対してC末端であるかのいずれかであることを意味する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CNCL-aVL-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、EGFR及びB7H3に結合し、sdABD-TTAは、図5の配列を有する。この実施形態では、EGFRとB7H3との好ましい組み合わせは、以下を含む。
この場合、「いずれかの配向」は、B7H3 sdABDが、本発明の構築物におけるEGFR sdABDに対してN末端であるか、またはEGFR sdABDに対してC末端であるかのいずれかであることを意味する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CNCL-aVL-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、EpCAM及びFOLR1に結合し、sdABD-TTAは、図5の配列を有する。この実施形態では、EpCAMとFOLR1との好ましい組み合わせは、以下を含む。
この場合、「いずれかの配向」は、EpCAM sdABDが、本発明の構築物におけるFOLR1 sdABDに対してN末端であるか、またはFOLR1 sdABDに対してC末端であるかのいずれかであることを意味する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CNCL-aVL-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、EpCAM及びB7H3に結合し、sdABD-TTAは、図5の配列を有する。この実施形態では、EpCAMとB7H3との好ましい組み合わせは、以下を含む。
この場合、「いずれかの配向」は、B7H3 sdABDが、本発明の構築物におけるEGFR sdABDに対してN末端であるか、またはEGFR sdABDに対してC末端であるかのいずれかであることを意味する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CNCL-aVL-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、FOLR1及びB7H3に結合し、sdABD-TTAは、図5の配列を有する。この実施形態では、FOLR1とB7H3との好ましい組み合わせは、以下を含む。
この場合、「いずれかの配向」は、B7H3 sdABDが、本発明の構築物におけるFOLR1 sdABDに対してN末端であるか、またはFOLR1 sdABDに対してC末端であるかのいずれかであることを意味する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CNCL-aVL-ドメインリンカー-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、2つの標的化ドメインは、EGFR、FOLR1、B7H3、CA9、Trop2、またはEpCAMであり得る同じTTAに結合し、この配列は、図5に示され、CCL及びCLは、MMP9またはメプリンによって開裂されるリンカーから選択され、sdABD(1/2)は、配列番号117を有する。
形式2において、好ましいドメインリンカーは、配列番号233である(これはまた、好ましい拘束非開裂性リンカーとしても機能する)。
形式2において、好ましい二重標的化構築物(本明細書では「ヘテロCOBRA」と称されることがある)は、以下により十分に記載されるように、EGFR及びEpCAM、EGFR及びTrop2、EGFR及びFOLR1、EGFR及びB7H3、EpCAM及びTrop2、EpCAM及びFOLR1、EpCAM及びB7H3、Trop2及びFOLR1、Trop2及びB7H3、ならびにFOLR1及びB7H3を標的とする組み合わせを含む。
形式2において、特定の使用の実施形態としては、Pro186、Pro225、Pro226、Pro233、Pro262、Pro311、Pro312、Pro313、Pro356、Pro359、Pro364、Pro388、Pro448、Pro449、Pro450、Pro451、Pro495、Pro246、Pro254、Pro255、Pro256、Pro420、Pro421、Pro432、Pro479、Pro480、Pro187、Pro221、Pro222、Pro223、Pro224、Pro393、Pro394、Pro395、Pro396、Pro429、Pro430、Pro431、Pro601、Pro602、V3及びV4、Pro664、Pro665、Pro667、Pro694、Pro695、Pro565、Pro566、Pro567、Pro727、Pro728、Pro729、Pro730、Pro731、Pro676、Pro677、Pro678、Pro679、Pro808、Pro819、Pro621、Pro622、Pro640、Pro641、Pro642、Pro643、Pro744、Pro746、Pro638、Pro639、Pro396、Pro476、Pro706、Pro709、Pro470、Pro471、Pro551、Pro552、Pro623、Pro624、Pro698、Pro655、Pro656、Pro657、Pro658、Pro516、Pro517、Pro518、ならびにPro519が挙げられるが、これらに限定されない。
C.単一TTA構築物
図4に示されるように、形式2構築物と同様であるが、第2のTTA ABDがない「形式4」構築物もまた、本発明の組成物に含まれる。この実施形態では、プロドラッグ構築物において活性化開裂部位が存在するため、「非開裂性」が拘束Fvドメインの連結にのみ適用されることが理解される。この実施形態では、拘束Fvドメインは、拘束非開裂性リンカーを使用して連結されたVH及びVLドメインを含み、拘束偽Fvドメインは、拘束非開裂性リンカーを使用する。
図4に示されるように、形式2構築物と同様であるが、第2のTTA ABDがない「形式4」構築物もまた、本発明の組成物に含まれる。この実施形態では、プロドラッグ構築物において活性化開裂部位が存在するため、「非開裂性」が拘束Fvドメインの連結にのみ適用されることが理解される。この実施形態では、拘束Fvドメインは、拘束非開裂性リンカーを使用して連結されたVH及びVLドメインを含み、拘束偽Fvドメインは、拘束非開裂性リンカーを使用する。
当業者によって理解されるように、拘束Fvドメインまたは拘束偽FvドメインのいずれかのVH及びVLの順序は、(N末端からC末端に)VH-リンカー-VLまたはVL-リンカー-VHのいずれかであり得る。
本発明は、N末端からC末端に、sdABD(TTA)-ドメインリンカー-拘束Fvドメイン-開裂性リンカー-sdABD-HSA-拘束偽Fvドメインを含む、プロドラッグタンパク質を提供する。(この形式の全ての構築物について、sdABD-HSAが概してHis6を有しないが、それが含まれ得ることに留意されたい)。
当業者によって理解されるように、拘束Fvドメインまたは拘束偽FvドメインのいずれかのVH及びVLの順序は、(N末端からC末端に)VH-リンカー-VLまたはVL-リンカー-VHのいずれかであり得る。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA)-ドメインリンカー-aVH-CNCL-aVL-CL-(sdABD-HSA)-ドメインリンカー-iVL-CNCL-iVHを含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA)-ドメインリンカー-aVH-CNCL-aVL-CL-(sdABD-HSA)-ドメインリンカー-iVH-CNCL-iVLを含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA)-ドメインリンカー-aVL-CNCL-aVH-CL-(sdABD-HSA)-ドメインリンカー-iVH-CNCL-iVLを含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA)-ドメインリンカー-aVL-CNCL-aVH-CL-(sdABD-HSA)-ドメインリンカー-iVL-CNCL-iVHを含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、N末端からC末端に、(sdABD-TTA)-ドメインリンカー-aVH-CNCL-aVL-CL-(sdABD-HSA)-ドメインリンカー-iVL-CNCL-iVHを含む。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVLは、図5に示される配列を有する。この実施形態では、標的化ドメインは、EGFR、EpCAM、FOLR1、Trop2、CA9、またはB7H3であり得るTTAに結合し、この配列は、図5に示される。
形式4において、好ましいドメインリンカーは、配列番号233である(これはまた、好ましい拘束非開裂性リンカーとしても機能する)。
形式4において、好ましいsdABD-HSAは、配列番号121または117のものである。
D.2つのタンパク質組成物
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、開裂の非存在下で、分子内で会合して偽Fvを形成する、「ヘミCOBRA(商標)」または「ヘミ構築物」と称されるときがある、2つの異なる分子を含む。プロテアーゼの存在下で、開裂部位は開裂され、非活性可変ドメインを放出し、次いで、タンパク質対は、概して図3に示されるように、CD3に対する活性抗原結合ドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、開裂の非存在下で、分子内で会合して偽Fvを形成する、「ヘミCOBRA(商標)」または「ヘミ構築物」と称されるときがある、2つの異なる分子を含む。プロテアーゼの存在下で、開裂部位は開裂され、非活性可変ドメインを放出し、次いで、タンパク質対は、概して図3に示されるように、CD3に対する活性抗原結合ドメインを形成する。
ヘミ構築物の設計で重要なことは、活性可変ドメイン及びsdABD-TTAが開裂後に一緒のままであり、これにより、2つの開裂部分が腫瘍表面上の腫瘍抗原受容体によって一緒に保持され、次いで活性抗CD3結合ドメインを形成することができることである。
対の各メンバーが単一sdABD-TTAを有するもの(図3A)、及び各々が異なるTTAに対する2つの異なるsdABD-TTAを有するもの(図3B)の、2つの異なる一般的な形式3構築物が存在する。
1.単一TTA結合ドメインを有するヘミCOBRA(商標)構築物(形式3A)
いくつかの実施形態では、第1のヘミCOBRA(商標)は、N末端からC末端に、sdABD(TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CL-iVL-ドメインリンカー-sdABD(1/2)を有し、第2のヘミCOBRA(商標)は、sdABD(1/2)-ドメインリンカー-iVH-CL-aVL-ドメインリンカー-sdABD(TTA2)を有する。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVL、及びsdABD(1/2)は、図5に示される配列を有し、sdABD-TTAaは、ヒトEGFR、EpCAM、Trop2、CA9 FOLR1、及び/またはB7H3に結合し、図5に示される配列を有する。
いくつかの実施形態では、第1のヘミCOBRA(商標)は、N末端からC末端に、sdABD(TTA1)-ドメインリンカー-aVH-CL-iVL-ドメインリンカー-sdABD(1/2)を有し、第2のヘミCOBRA(商標)は、sdABD(1/2)-ドメインリンカー-iVH-CL-aVL-ドメインリンカー-sdABD(TTA2)を有する。この実施形態では、aVH、aVL、iVH、iVL、及びsdABD(1/2)は、図5に示される配列を有し、sdABD-TTAaは、ヒトEGFR、EpCAM、Trop2、CA9 FOLR1、及び/またはB7H3に結合し、図5に示される配列を有する。
2.二重TTA ABDを有するヘミCOBRA(商標)構築物
いくつかの実施形態では、対になったプロドラッグ構築物は、図3Bに示されるように、構築物当たり2つのsdABD-TTA結合ドメインを有することができる。この実施形態では、対の第1のメンバーは、N末端からC末端に、sdABD-TTA1-ドメインリンカー-sdABD-TTA2-ドメインリンカー-aVH-CL-iVL-ドメインリンカー-sdABD(HAS)を含み、第2のメンバーは、N末端からC末端に、sdABD-TTA1-ドメインリンカー-sdABD-TTA2-aVL-CL-iVH-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。
いくつかの実施形態では、対になったプロドラッグ構築物は、図3Bに示されるように、構築物当たり2つのsdABD-TTA結合ドメインを有することができる。この実施形態では、対の第1のメンバーは、N末端からC末端に、sdABD-TTA1-ドメインリンカー-sdABD-TTA2-ドメインリンカー-aVH-CL-iVL-ドメインリンカー-sdABD(HAS)を含み、第2のメンバーは、N末端からC末端に、sdABD-TTA1-ドメインリンカー-sdABD-TTA2-aVL-CL-iVH-ドメインリンカー-sdABD-HSAを含む。
対の各メンバー上の2つのsdABD-TTAは異なるが、概して、両方のメンバー(ヘミCOBRA(商標))が、同じ2つのsdABD-TTAを有し、例えば、両方がEGFR及びFOLR1またはEGFR及びB7H3などを有する。
2つのsdABD-TTAは、いくつかの実施形態では、図5に示されるものから選択される。
IV.本発明の組成物の作製方法
本発明のプロドラッグ組成物は、概して当業者によって理解されるように、かつ以下で概説されるように作製される。
本発明のプロドラッグ組成物は、概して当業者によって理解されるように、かつ以下で概説されるように作製される。
本発明は、本発明のプロドラッグ組成物をコードする核酸組成物を提供する。当業者によって理解されるように、核酸組成物は、プロドラッグポリペプチド(複数可)の形式によって決まる。したがって、例えば、「形式3」構築物など、形式が2つのアミノ酸配列を必要とする場合、2つの核酸配列は、発現のために1つ以上の発現ベクターに組み込まれ得る。同様に、単一ポリペプチドであるプロドラッグ構築物(形式1、2、及び4)は、産生のために単一発現ベクター中に単一核酸を必要とする。
当該技術分野において既知であるように、本発明の構成成分をコードする核酸は、当該技術分野において既知であるように、かつ本発明のプロドラッグ組成物を産生するために使用される宿主細胞に応じて、発現ベクターに組み込まれ得る。概して、核酸は、任意の数の調節エレメント(プロモーター、複製起点、選択可能なマーカー、リボゾーム結合部位、誘導因子など)に作動可能に連結されている。発現ベクターは、染色体外または組み込みベクターであり得る。
次いで、本発明の核酸及び/または発現ベクターは、多くの実施形態で使用される哺乳動物細胞(例えば、CHO細胞、293細胞)で、哺乳動物、細菌、酵母、昆虫、及び/または真菌細胞を含む、当該技術分野において周知であるような任意の数の異なる型の宿主細胞に変換される。
本発明のプロドラッグ組成物は、当該技術分野において周知であるように、発現ベクター(複数可)を含む宿主細胞を培養することによって作製される。いったん産生されると、タンパク質A親和性クロマトグラフィステップ及び/またはイオン交換クロマトグラフィステップを含む、従来の抗体精製ステップが行われる。
V.本発明のプロドラッグ組成物の製剤及び投与
本発明に従って使用されるプロドラッグ組成物の製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、(概して、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.[1980]で概説されるように)任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を伴い所望の純度を有するプロドラッグ(形式1、2、及び4の場合は単一タンパク質、ならびに形式3の場合は2つのタンパク質)を混合することによって、保存のために調製される。
本発明に従って使用されるプロドラッグ組成物の製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、(概して、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.[1980]で概説されるように)任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を伴い所望の純度を有するプロドラッグ(形式1、2、及び4の場合は単一タンパク質、ならびに形式3の場合は2つのタンパク質)を混合することによって、保存のために調製される。
本発明のプロドラッグ組成物は、ボーラスとしての、またはある期間にわたる持続注入による静脈内投与などの既知の方法に従って、対象に投与される。
本発明のプロドラッグ組成物は、がんの治療に有用である。
A.実施例1:プロ構築物の構築及び精製
トランスフェクション
各タンパク質(例えば、形式1、2、及び4については単一タンパク質)または構築物の対(形式3)を、別個の発現ベクター(pcdna3.4誘導体)から発現させた。ヘミcobraまたは単鎖構築物の対をコードした等量のプラスミドDNAを混合し、製造業者のトランスフェクションプロトコルに従ってExpi293細胞にトランスフェクトした。条件培地を遠心分離(6000rpm×25’)及び濾過(0.2uMフィルタ)によって、トランスフェクションの5日後に採取した。タンパク質発現をSDS-PAGEによって確認した。構築物を精製すると、最終緩衝液組成物は、25mMのクエン酸塩、75mMのアルギニン、75mMのNaCl、4%スクロース、pH7であった。最終調製物を-80°Cで保存した。
トランスフェクション
各タンパク質(例えば、形式1、2、及び4については単一タンパク質)または構築物の対(形式3)を、別個の発現ベクター(pcdna3.4誘導体)から発現させた。ヘミcobraまたは単鎖構築物の対をコードした等量のプラスミドDNAを混合し、製造業者のトランスフェクションプロトコルに従ってExpi293細胞にトランスフェクトした。条件培地を遠心分離(6000rpm×25’)及び濾過(0.2uMフィルタ)によって、トランスフェクションの5日後に採取した。タンパク質発現をSDS-PAGEによって確認した。構築物を精製すると、最終緩衝液組成物は、25mMのクエン酸塩、75mMのアルギニン、75mMのNaCl、4%スクロース、pH7であった。最終調製物を-80°Cで保存した。
MMP9の活性化
組換えヒト(rh)MMP9を以下のプロトコルに従って活性化した。組換えヒトMMP-9(R&D #911-MP-010)は、0.44mg/mL(4.7uM)であった。酢酸p-アミノフェニル水銀(APMA)(Sigma)を、DMSO中100mMのストック濃度で調製する。アッセイ緩衝液は、50mMのトリス、pH7.5、10mMのCaCl2、150mMのNaCl、0.05% Brij-35である。
組換えヒト(rh)MMP9を以下のプロトコルに従って活性化した。組換えヒトMMP-9(R&D #911-MP-010)は、0.44mg/mL(4.7uM)であった。酢酸p-アミノフェニル水銀(APMA)(Sigma)を、DMSO中100mMのストック濃度で調製する。アッセイ緩衝液は、50mMのトリス、pH7.5、10mMのCaCl2、150mMのNaCl、0.05% Brij-35である。
-rhMMP9をアッセイ緩衝液で約100ug/mLに希釈する(25uLのhMMP9+75uLのアッセイ緩衝液)
-DMSO中100mMのストックからの酢酸p-アミノフェニル水銀(APMA)を、1mM(1uL~100uL)の最終濃度になるように添加する
-37℃で24時間インキュベートする
-MMP9を10ng/uLに希釈する(900uLのアッセイ緩衝液を100uLの活性化溶液に添加する)
活性化rhMMP9の濃度は、約100nMである。
TDCCアッセイのための構築物の開裂
構築物を開裂するために、製剤緩衝液(25mMのクエン酸、75mMのL-アルギニン、75mMのNaCl、4%スクロース)中1mg/mLの濃度(10.5uM)の100uLのタンパク質試料に、最大10mMのCaCl2を供給した活性化rhMMP9を20~35nMの濃度になるまで添加した。試料を室温で一晩(16~20時間)インキュベートした。開裂の完全性を、SDS PAGE(10~20% TG、TG泳動用緩衝液、200v、1時間)を使用して検証した。試料を典型的には98%開裂した。
B.実施例2:T細胞依存性細胞傷害作用(TDCC)アッセイ
ホタルルシフェラーゼ形質導入HT-29細胞を約80%密集度まで成長させ、Versene(PBS-Ca-Mg中0.48mMのEDTA)で分離した。細胞を遠心分離し、TDCC培地(HEPES、GlutaMax、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、及びβ-メルカプトエタノールを有するRPMI 1640中の5%熱失活FBS)中に再懸濁した。精製したヒトPan-T細胞を解凍、遠心分離、及びTDCC培地中に再懸濁した。
ホタルルシフェラーゼ形質導入HT-29細胞を約80%密集度まで成長させ、Versene(PBS-Ca-Mg中0.48mMのEDTA)で分離した。細胞を遠心分離し、TDCC培地(HEPES、GlutaMax、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、及びβ-メルカプトエタノールを有するRPMI 1640中の5%熱失活FBS)中に再懸濁した。精製したヒトPan-T細胞を解凍、遠心分離、及びTDCC培地中に再懸濁した。
HT-29_Luc細胞及びT細胞の共培養を384ウェル細胞培養プレートに添加した。次いで、連続希釈したCOBRAを共培養に添加し、37℃で48時間インキュベートした。最後に、等量のSteadyGloルシフェラーゼアッセイ試薬をプレートに添加し、20分間インキュベートした。プレートを0.1秒/ウェルの曝露時間でPerkin Elmer Envisionにおいて読み取った。全発光を記録し、データをGraphPad Prism 7またはVersion 8.3.1(タイミングに応じて)で分析した。
C.実施例3:インビボ養子T細胞移入有効性モデルの一般的なプロトコル設計
これらのプロトコルを図面の実験の多くで使用した。腫瘍細胞を、NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)マウス(The Jackson Laboratory、カタログ番号No.005557)の右脇腹に皮下(SC)移植し、約200mm3の平均体積を有する確立された腫瘍が達成されるまで成長させた。並行して、ヒトT細胞を、約10日間、T Cell Activation/Expansion Kit(Miltenyi、カタログ番号130-091-441)からのMACSiBeadを有するG-Rex100Mガス透過性フラスコ(Wilson Wolf、カタログ番号81100S)内のT細胞培地(X-VIVO 15[Lonza、カタログ番号04-418Q]、5%ヒト血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.01mMの2-メルカプトエタノール)で培養し、組換えヒトIL-2タンパク質を補充する。マウスにおける腫瘍成長及びヒトT細胞活性化/拡大を調整し、これにより研究の0日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群(N=6)に分け、次いで、各々に2.5×106の培養したヒトT細胞を静脈内注射(IV)し、COBRAまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、3日毎に7用量(0、3、6、9、12、15、及び18日目)、次いで腫瘍が2000mm3を超える体積に到達するまで、または研究は終了するまでさらに2~3週間投与した。腫瘍体積を3日毎に測定した。
これらのプロトコルを図面の実験の多くで使用した。腫瘍細胞を、NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)マウス(The Jackson Laboratory、カタログ番号No.005557)の右脇腹に皮下(SC)移植し、約200mm3の平均体積を有する確立された腫瘍が達成されるまで成長させた。並行して、ヒトT細胞を、約10日間、T Cell Activation/Expansion Kit(Miltenyi、カタログ番号130-091-441)からのMACSiBeadを有するG-Rex100Mガス透過性フラスコ(Wilson Wolf、カタログ番号81100S)内のT細胞培地(X-VIVO 15[Lonza、カタログ番号04-418Q]、5%ヒト血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.01mMの2-メルカプトエタノール)で培養し、組換えヒトIL-2タンパク質を補充する。マウスにおける腫瘍成長及びヒトT細胞活性化/拡大を調整し、これにより研究の0日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群(N=6)に分け、次いで、各々に2.5×106の培養したヒトT細胞を静脈内注射(IV)し、COBRAまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、3日毎に7用量(0、3、6、9、12、15、及び18日目)、次いで腫瘍が2000mm3を超える体積に到達するまで、または研究は終了するまでさらに2~3週間投与した。腫瘍体積を3日毎に測定した。
D.実施例4:EGFR/MMP9ヘミCOBRA対Pro77及びPro53を用いたインビボ活性。
5×106のLoVo細胞または5×106のHT29細胞を、NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)マウス(The Jackson Laboratory、カタログ番号005557)の右脇腹に皮下移植し、腫瘍が確立されるまで成長させた。並行して、ヒトT細胞を、10日間、T Cell Activation/Expansion Kit(Miltenyi、カタログ番号130-091-441)からのMACSiBeadを有するG-Rex100Mガス透過性フラスコ(Wilson Wolf、カタログ番号81100S)内のT細胞培地(X-VIVO 15[Lonza、カタログ番号04-418Q]、5%ヒト血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.01mMの2-メルカプトエタノール)で培養し、組換えヒトIL-2タンパク質を補充する。マウスにおける腫瘍成長及びヒトT細胞活性化/拡大を調整し、これにより研究の0日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群(N=6)に分け、次いで、各々に2.5×106の培養したヒトT細胞を静脈内注射(IV)し、COBRAまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、3日毎に7用量(0、3、6、9、12、15、及び18日目)、次いで腫瘍が2000mm3を超える体積に到達するまで、または研究は終了するまで投与した。群に、0.2mg/kg(mpk)の抗EGFR×CD3陽性対照、Pro51二重特異性抗体(bsAb)、0.5mpkの陰性対照、抗ニワトリ卵白リゾチーム(HEL)×CD3 bsAb Pro98、0.5mpkの抗EGFRヘミCOBRA対Pro77及びPro53を含有するMMP9開裂性リンカーの各々、または0.5mpkの抗EGFRヘミCOBRA対Pro74及びPro72を含有する非開裂性(NCL)リンカーの各々を投与した。腫瘍体積を3日毎に測定した。
5×106のLoVo細胞または5×106のHT29細胞を、NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)マウス(The Jackson Laboratory、カタログ番号005557)の右脇腹に皮下移植し、腫瘍が確立されるまで成長させた。並行して、ヒトT細胞を、10日間、T Cell Activation/Expansion Kit(Miltenyi、カタログ番号130-091-441)からのMACSiBeadを有するG-Rex100Mガス透過性フラスコ(Wilson Wolf、カタログ番号81100S)内のT細胞培地(X-VIVO 15[Lonza、カタログ番号04-418Q]、5%ヒト血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.01mMの2-メルカプトエタノール)で培養し、組換えヒトIL-2タンパク質を補充する。マウスにおける腫瘍成長及びヒトT細胞活性化/拡大を調整し、これにより研究の0日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群(N=6)に分け、次いで、各々に2.5×106の培養したヒトT細胞を静脈内注射(IV)し、COBRAまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、3日毎に7用量(0、3、6、9、12、15、及び18日目)、次いで腫瘍が2000mm3を超える体積に到達するまで、または研究は終了するまで投与した。群に、0.2mg/kg(mpk)の抗EGFR×CD3陽性対照、Pro51二重特異性抗体(bsAb)、0.5mpkの陰性対照、抗ニワトリ卵白リゾチーム(HEL)×CD3 bsAb Pro98、0.5mpkの抗EGFRヘミCOBRA対Pro77及びPro53を含有するMMP9開裂性リンカーの各々、または0.5mpkの抗EGFRヘミCOBRA対Pro74及びPro72を含有する非開裂性(NCL)リンカーの各々を投与した。腫瘍体積を3日毎に測定した。
E.実施例5:EGFR/MMP9 COBRA Pro140を用いたインビボ活性。
5×106のLoVo細胞または5×106のHT29細胞を、NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)マウス(The Jackson Laboratory、カタログ番号005557)の右脇腹に皮下移植し、腫瘍が確立されるまで成長させた。並行して、ヒトT細胞を、10日間、T Cell Activation/Expansion Kit(Miltenyi、カタログ番号130-091-441)からのMACSiBeadを有するG-Rex100Mガス透過性フラスコ(Wilson Wolf、カタログ番号81100S)内のT細胞培地(X-VIVO 15[Lonza、カタログ番号04-418Q]、5%ヒト血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.01mMの2-メルカプトエタノール)で培養し、組換えヒトIL-2タンパク質を補充する。マウスにおける腫瘍成長及びヒトT細胞活性化/拡大を調整し、これにより研究の0日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群(N=6)に分け、次いで、各々に2.5×106の培養したヒトT細胞を静脈内注射(IV)し、COBRAまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、3日毎に7用量(0、3、6、9、12、15、及び18日目)、次いで腫瘍が2000mm3を超える体積に到達するまで、または研究は終了するまで投与した。群に、0.2mpkの抗EGFR×CD3陽性対照、Pro51二重特異性抗体(bsAb)、0.5mpkの陰性対照、抗ニワトリ卵白リゾチーム(HEL)×CD3 bsAb Pro98、または0.5mpkの抗EGFR COBRA Pro140を含有するMMP9開裂性リンカーを投与した。腫瘍体積を3日毎に測定した。
5×106のLoVo細胞または5×106のHT29細胞を、NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)マウス(The Jackson Laboratory、カタログ番号005557)の右脇腹に皮下移植し、腫瘍が確立されるまで成長させた。並行して、ヒトT細胞を、10日間、T Cell Activation/Expansion Kit(Miltenyi、カタログ番号130-091-441)からのMACSiBeadを有するG-Rex100Mガス透過性フラスコ(Wilson Wolf、カタログ番号81100S)内のT細胞培地(X-VIVO 15[Lonza、カタログ番号04-418Q]、5%ヒト血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.01mMの2-メルカプトエタノール)で培養し、組換えヒトIL-2タンパク質を補充する。マウスにおける腫瘍成長及びヒトT細胞活性化/拡大を調整し、これにより研究の0日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群(N=6)に分け、次いで、各々に2.5×106の培養したヒトT細胞を静脈内注射(IV)し、COBRAまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、3日毎に7用量(0、3、6、9、12、15、及び18日目)、次いで腫瘍が2000mm3を超える体積に到達するまで、または研究は終了するまで投与した。群に、0.2mpkの抗EGFR×CD3陽性対照、Pro51二重特異性抗体(bsAb)、0.5mpkの陰性対照、抗ニワトリ卵白リゾチーム(HEL)×CD3 bsAb Pro98、または0.5mpkの抗EGFR COBRA Pro140を含有するMMP9開裂性リンカーを投与した。腫瘍体積を3日毎に測定した。
F.実施例6:EGFR/MMP9 COBRA Pro186を用いたインビボ活性。
5×106のHT29細胞を、NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)マウス(The Jackson Laboratory、カタログ番号No.005557)の右脇腹に皮下移植し、腫瘍が確立されるまで成長させた。腫瘍を確立するまで成長させた。並行して、ヒトT細胞を、10日間、T Cell Activation/Expansion Kit(Miltenyi、カタログ番号130-091-441)からのMACSiBeadを有するG-Rex100Mガス透過性フラスコ(Wilson Wolf、カタログ番号81100S)内のT細胞培地(X-VIVO 15[Lonza、カタログ番号04-418Q]、5%ヒト血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.01mMの2-メルカプトエタノール)で培養し、組換えヒトIL-2タンパク質を補充する。マウスにおける腫瘍成長及びヒトT細胞活性化/拡大を調整し、これにより研究の0日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群(N=6)に分け、次いで、各々に2.5×106の培養したヒトT細胞を静脈内注射(IV)し、COBRAまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、3日毎に7用量(0、3、6、9、12、15、及び18日目)、次いで腫瘍が2000mm3を超える体積に到達するまで、または研究は終了するまで投与した。群に、0.1mg/kg(mpk)の抗EGFR×CD3陽性対照、Pro51二重特異性抗体(bsAb)、0.3mpkの抗EGFR COBRA Pro214を含有する非開裂性(NCL)対照リンカー、0.1もしくは0.3mpkの抗EGFR COBRA Pro140を含有するMMP9開裂性リンカー、または0.1もしくは0.3mpkの抗EGFR COBRA Pro186を含有するMMP9開裂性リンカーを投与した。腫瘍体積を3日毎に測定した。
5×106のHT29細胞を、NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)マウス(The Jackson Laboratory、カタログ番号No.005557)の右脇腹に皮下移植し、腫瘍が確立されるまで成長させた。腫瘍を確立するまで成長させた。並行して、ヒトT細胞を、10日間、T Cell Activation/Expansion Kit(Miltenyi、カタログ番号130-091-441)からのMACSiBeadを有するG-Rex100Mガス透過性フラスコ(Wilson Wolf、カタログ番号81100S)内のT細胞培地(X-VIVO 15[Lonza、カタログ番号04-418Q]、5%ヒト血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.01mMの2-メルカプトエタノール)で培養し、組換えヒトIL-2タンパク質を補充する。マウスにおける腫瘍成長及びヒトT細胞活性化/拡大を調整し、これにより研究の0日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群(N=6)に分け、次いで、各々に2.5×106の培養したヒトT細胞を静脈内注射(IV)し、COBRAまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、3日毎に7用量(0、3、6、9、12、15、及び18日目)、次いで腫瘍が2000mm3を超える体積に到達するまで、または研究は終了するまで投与した。群に、0.1mg/kg(mpk)の抗EGFR×CD3陽性対照、Pro51二重特異性抗体(bsAb)、0.3mpkの抗EGFR COBRA Pro214を含有する非開裂性(NCL)対照リンカー、0.1もしくは0.3mpkの抗EGFR COBRA Pro140を含有するMMP9開裂性リンカー、または0.1もしくは0.3mpkの抗EGFR COBRA Pro186を含有するMMP9開裂性リンカーを投与した。腫瘍体積を3日毎に測定した。
これらの結果は、EGFR結合ドメインのヒト化が成功したこと、及び2つの結合部位が分子上に存在するときに標的EGFRに対して強力な結合力があることの両方を示す。
これらの結果は、EpCAM結合ドメインのヒト化が成功したことの両方を示す。
H.実施例8:COBRA(商標):マウスにおいて確立された固形腫瘍を退行させる新規の条件付き活性二重特異性抗体
血液悪性腫瘍を標的化する二重特異性抗体(bsAb)(例えば、ブリナツモマブ、CD19×CD3 bsAb)による臨床的成功にもかかわらず、固形腫瘍適応における有効性は依然として重大な課題である。T細胞再方向付けbsAbは非常に強力であるため、正常組織上の非常に低いレベルの細胞表面標的抗原発現でさえも、すぐに安全性の不利益となり、患者において達成され得る用量レベルを厳しく制限することがある。これにより、有効濃度に到達する可能性が制限され、これらの高度に活性な分子の治療可能性が低減する。加えて、腫瘍上で独自に発現され、正常組織上では発現されない「クリーンな」標的抗原を同定することは、ひいき目に見ても非常に困難であった。
血液悪性腫瘍を標的化する二重特異性抗体(bsAb)(例えば、ブリナツモマブ、CD19×CD3 bsAb)による臨床的成功にもかかわらず、固形腫瘍適応における有効性は依然として重大な課題である。T細胞再方向付けbsAbは非常に強力であるため、正常組織上の非常に低いレベルの細胞表面標的抗原発現でさえも、すぐに安全性の不利益となり、患者において達成され得る用量レベルを厳しく制限することがある。これにより、有効濃度に到達する可能性が制限され、これらの高度に活性な分子の治療可能性が低減する。加えて、腫瘍上で独自に発現され、正常組織上では発現されない「クリーンな」標的抗原を同定することは、ひいき目に見ても非常に困難であった。
これらの課題を克服するために、発明者らは、COBRA(商標)(条件付き二重特異性再方向付け活性化(Conditional Bispecific Redirected Activation))と呼ぶ新規の組換えbsAbプラットフォームを開発した。COBRAは、腫瘍微小環境中のT細胞従事に焦点を当てることによって、より広く発現され、検証されている腫瘍細胞表面抗原の標的化を可能にするように操作される。COBRA分子は、標的抗原に結合するように設計されており、この標的抗原は、腫瘍細胞及び正常細胞の両方で発現され得るが、腫瘍中では一般的であるが正常な健康組織中では一般的ではないタンパク質分解微小環境に曝露されない限り、T細胞を従事させない。腫瘍標的抗原に結合すると、プロテアーゼ依存性リンカー開裂により、COBRAは、不活性な抗CD3 scFvを活性な抗CD3 scFv結合ドメインに変換することができるようになる。その後、変換時に、COBRAはT細胞と標的抗原とを同時に共同従事させることができ、腫瘍細胞に対する強力な細胞溶解性T細胞応答をもたらす。加えて、COBRAは、タンパク質分解性開裂時に活性分子から除去される半減期延長部分を有するように設計される。これにより、腫瘍標的結合前の不活性COBRAが循環中に持続的に存在できるようになり、結合していない活性COBRA分子のクリアランスがより迅速になることで、正常組織における細胞傷害活性の可能性が減少する。
ここで、発明者らは、COBRA分子の新規の設計を明らかにし、それがCD3及び上皮成長因子受容体(EGFR)を従事させて、T細胞培養及びヒトT細胞を移植した腫瘍保有マウスにおいて強力な細胞傷害活性を誘発する能力を実証した。発明者らは、インビトロでの低ピコモル~サブピコモルのT細胞活性化及び細胞傷害性、ならびにインビボでのNSGマウスにおける確立された固形腫瘍異種移植片のCOBRAリンカー開裂依存性T細胞媒介性退行を報告した。
図64A~64Cは、COBRAの設計及び予測される折り畳み機序を示す。図64Aは、PRO186 COBRAの概略図を示す。図64Bは、予測されるCOBRA折り畳みを示す。COBRAには、抗CD3 VH及びVLドメインと対になった不活性VH及びVLが含まれる。未開裂のPRO186 COBRAは、EGFRに結合し、CD3結合を障害し、血清アルブミンに結合する。図64Cは、PRO186の分析的サイズ排除クロマトグラムを示す。データにより、未開裂のPRO186が単一の構造に折り畳まれることが示される。
図65A~図65Cは、PRO186(予め開裂されたPro186)、PRO186開裂生成物、及びPRO186活性ダイマーを含む、本明細書に記載の構築物の例示的な実施形態を示す。1つの開裂生成物は、抗CD3 VH及びVLドメインを含み、EGFRに結合し、CD3結合を障害する。他の開裂生成物は、抗CD3不活性VH及びVLドメインを含み、血清アルブミンに結合する。活性PRO186ダイマーは、活性抗CD3アゴニスト(抗CD3 VH及びVLのダイマー)を含み、CD3及びEGFRに結合する。
図66は、プロテアーゼ開裂時の活性ダイマーへのCOBRA変換の例示を提供する。
図67A~図67Bは、COBRA結合の特徴付けを提供する。図67Aは、ヒト、カニクイザル、及びマウス物への結合活性を示す。図67Bは、ヒトCD3イプシロンへのPRO186結合、ヒトCD3イプシロンの活性PRO186結合、及びヒトEGFRの活性PRO186結合を示す。結合動態を、EGFR(Acro Biosystems)、血清アルブミン(Athens Research Technology)、及びCD3ε(Creative Biomart)を用いてOctet(Forte Bi)により評価した。
図68A~図68Bは、MMP2及びMMP9によるPRO186リンカーの開裂を示す。図68Aは、開裂時の活性結合生成物分子のウエスタンブロットを示す。図68Bは、開裂時間に対する活性結合生成物分子の蓄積を示す。
図69は、条件付きPRO186構築物のインビトロ活性を示す。図69-左パネルは、T細胞死滅アッセイの結果を示す。図69-右パネルは、試験物品の濃度に関連させたIFN-ガンマ放出のレベルを示す。
図70は、LoVo(大腸癌(CRC)細胞株)、HT-29(大腸癌(CRC)細胞株)、及びSCC25(頭頸部癌細胞株)の3つの腫瘍細胞株における活性と比べたEGFR発現を示す。インビトロのEGFR発現について、1:1のPE標識した抗EGFR mAb#EGFR.1及びBD QuantiBrite Beadsを使用して、抗体結合/細胞を測定した。インビボのEGFR発現について、抗EGFR mAb#WP84及びMACH4-HRP検出(Ensigna)を使用して、IHC染色を行った。T細胞死滅アッセイのために、腫瘍細胞を発現するルシフェラーゼを、10:1のE:TでヒトT細胞と48時間共培養し、Steady-Glo(Promega)によって測定した。IFNγ放出アッセイのために、Meso Scale Discovery V-Pexを、24時間目に、10:1のE:Tで使用して、IFNγを測定した。
図71A及び図71Bは、腫瘍細胞及び腫瘍異種移植片上のEGFR、MMP2、及びMMP9の発現を示す。図71Aは、LoVo、HT-29、及びSCC25の3つのがん細胞株上のEGFR細胞表面密度を示す。図71Bは、腫瘍異種移植片のEGFR、MMP2、及びMMP9の免疫組織化学染色を示す。
図72は、腫瘍保有マウスにおける養子ヒトT細胞移入モデルの実験手順の概略図を提供する。実験を使用して、インビボの抗腫瘍有効性及び薬物動態(PK)を測定した。手順には、(1)NSGマウスの右脇腹に腫瘍を皮下移植すること、(2)約200mm3の腫瘍など、確立された腫瘍の成長を可能にすること、(3)0日目から開始してマウスq3dx7を投薬すること、(4)18日目に最後の用量を投与すること、及び(5)研究を終了することが含まれた。本手順には、(a)ヒトT細胞を、腫瘍の移植と同じ経過で拡大が開始されるように、10日間培養中で活性化及び拡大すること、ならびに(b)0日目にT細胞を採取することも含まれ、これらはインビボ実験と並行して行った。
図73は、PRO186によるマウスにおける確立された固形腫瘍の退行を示す。図73-左パネルは、LoVo由来腫瘍の退行を示す。図73-中央パネルは、HT-29由来腫瘍の退行を示す。図73-右パネルは、SCC25由来腫瘍の退行を示す。
図74A~図74Bは、開裂PRO186が、無傷(未開裂)PRO186よりも迅速に消えることを示す。図74Aは、非腫瘍保有マウスの血漿中の試験物品の薬物動態を示す。図74Bは、試験物品を投与したマウスにおけるLoVo由来腫瘍の腫瘍体積を示す。
結論:発明者は、タンパク質分解作用の際に極めて強力な二重特異性再方向付けT細胞治療薬に変換する多価sdAb-ダイアボディ融合物を設計した。インビトロアッセイにより、プロテアーゼ依存性リンカー開裂が、T細胞媒介性殺滅の効力を200倍増加させ、これにより、サブピコモルの効力を有する治療薬が得たことを実証した。確立された異種移植片を有するマウスにおけるPRO186(Pro186)の投与により、複数の腫瘍モデルにおいてプロテアーゼ開裂依存性T細胞媒介性腫瘍退行が生じた。PRO186は、(1)投与時のインビボでの半減期の延長と、(2)タンパク質分解活性化後の迅速なクリアランスとを示し、それにより、PRO186が、従来のT細胞再方向付け二重特異性よりも安全性プロファイルが改善された治療薬であることを実証した。
Claims (22)
- 融合タンパク質であって、N末端からC末端に、
a)第1のsdABD-TTAと、
b)第1のドメインリンカーと、
c)拘束Fvドメインであって、
i)vhCDR1、vhCDR2、及びvhCDR3を含む第1の可変重ドメイン、
ii)拘束非開裂性リンカー(CNCL)、ならびに
iii)vlCDR1、vlCDR2、及びvlCDR3を含む第1の可変軽ドメイン、を含む、前記拘束Fvドメインと、
d)第2のドメインリンカーと、
e)第2のsdABD-TTAと、
f)開裂性リンカー(CL)と、
g)拘束偽Fvドメインであって、
i)第1の偽軽可変ドメイン、
ii)非開裂性リンカー(NCL)、及び
iii)第1の偽重可変ドメイン、を含む、前記拘束偽Fvドメインと、
h)第3のドメインリンカーと、
i)ヒト血清アルブミンに結合する第3のsdABDと、を含み、
前記第1の可変重ドメイン及び前記第1の可変軽ドメインが、ヒトCD3に結合することが可能であるが、前記拘束Fvドメインが、CD3に結合せず、
前記第1の可変重ドメイン及び第1の偽可変軽ドメインが、分子内で会合して不活性Fvを形成し、
前記第1の可変軽ドメイン及び第1の偽可変重ドメインが、分子内で会合して不活性Fvを形成し、
前記sdABD-TTAのうちの少なくとも1つが、配列番号41、配列番号45、配列番号49、配列番号53、及び配列番号57から選択される配列を有するsdABD-B7H3である、前記融合タンパク質。 - Pro664であり、配列番号282を有する、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 融合タンパク質であって、N末端からC末端に、
a)ヒト腫瘍標的抗原(TTA)に結合する第1の単一ドメイン抗原結合ドメイン(sdABD)(sdABD-TTA)と、
b)第1のドメインリンカーと、
c)拘束Fvドメインであって、
i)vhCDR1、vhCDR2、及びvhCDR3を含む第1の可変重ドメイン、
ii)拘束非開裂性リンカー(CNCL)、ならびに
iii)vlCDR1、vlCDR2、及びvlCDR3を含む第1の可変軽ドメイン、を含む、前記拘束Fvドメインと、
d)第2のドメインリンカーと、
e)第2のsdABD-TTAと、
f)開裂性リンカー(CL)と、
g)拘束偽Fvドメインであって、
i)第1の偽軽可変ドメイン、
ii)非開裂性リンカー(NCL)、及び
iii)第1の偽重可変ドメイン、を含む、前記拘束偽Fvドメインと、
h)第3のドメインリンカーと、
i)ヒト血清アルブミンに結合する第3のsdABDと、を含み、
前記第1の可変重ドメイン及び前記第1の可変軽ドメインが、ヒトCD3に結合することが可能であるが、前記拘束Fvドメインが、CD3に結合せず、
前記第1の可変重ドメイン及び第1の偽可変軽ドメインが、分子内で会合して不活性Fvを形成し、
前記第1の可変軽ドメイン及び第1の偽可変重ドメインが、分子内で会合して不活性Fvを形成し、
前記sdABD-TTAのうちの少なくとも1つが、配列番号69及び配列番号73から選択される配列を有するsdABD-EpCAMである、前記融合タンパク質。 - 融合タンパク質であって、N末端からC末端に、
a)第1のsdABD-TTAと、
b)第1のドメインリンカーと、
c)拘束Fvドメインであって、
i)vhCDR1、vhCDR2、及びvhCDR3を含む第1の可変重ドメイン、
ii)拘束非開裂性リンカー(CNCL)、ならびに
iii)vlCDR1、vlCDR2、及びvlCDR3を含む第1の可変軽ドメイン、を含む、前記拘束Fvドメインと、
d)第2のドメインリンカーと、
e)第2のsdABD-TTAと、
f)開裂性リンカー(CL)と、
g)拘束偽Fvドメインであって、
i)第1の偽軽可変ドメイン、
ii)非開裂性リンカー(NCL)、及び
iii)第1の偽重可変ドメイン、を含む、前記拘束偽Fvドメインと、
h)第3のドメインリンカーと、
i)ヒト血清アルブミンに結合する第3のsdABDと、を含み、
前記第1の可変重ドメイン及び前記第1の可変軽ドメインが、ヒトCD3に結合することが可能であるが、前記拘束Fvドメインが、CD3に結合せず、
前記第1の可変重ドメイン及び第1の偽可変軽ドメインが、分子内で会合して不活性Fvを形成し、
前記第1の可変軽ドメイン及び第1の偽可変重ドメインが、分子内で会合して不活性Fvを形成し、
前記sdABD-TTAのうちの少なくとも1つが、配列番号77、配列番号81、配列番号85、配列番号89、配列番号93、及び配列番号97から選択される配列を有するsdABD-Trop2である、前記融合タンパク質。 - 融合タンパク質であって、N末端からC末端に、
a)第1のsdABD-TTAと、
b)第1のドメインリンカーと、
c)拘束Fvドメインであって、
i)vhCDR1、vhCDR2、及びvhCDR3を含む第1の可変重ドメイン、
ii)拘束非開裂性リンカー(CNCL)、ならびに
iii)vlCDR1、vlCDR2、及びvlCDR3を含む第1の可変軽ドメイン、を含む、前記拘束Fvドメインと、
d)第2のドメインリンカーと、
e)第2のsdABD-TTAと、
f)開裂性リンカー(CL)と、
g)拘束偽Fvドメインであって、
i)第1の偽軽可変ドメイン、
ii)非開裂性リンカー(NCL)、及び
iii)第1の偽重可変ドメイン、を含む、前記拘束偽Fvドメインと、
h)第3のドメインリンカーと、
i)ヒト血清アルブミンに結合する第3のsdABDと、を含み、
前記第1の可変重ドメイン及び前記第1の可変軽ドメインが、ヒトCD3に結合することが可能であるが、前記拘束Fvドメインが、CD3に結合せず、
前記第1の可変重ドメイン及び第1の偽可変軽ドメインが、分子内で会合して不活性Fvを形成し、
前記第1の可変軽ドメイン及び第1の偽可変重ドメインが、分子内で会合して不活性Fvを形成し、
前記sdABD-TTAのうちの少なくとも1つが、配列番号101、配列番号105、配列番号109、及び配列番号113から選択される配列を有するsdABD-CA9である、前記融合タンパク質。 - 前記第1の可変重ドメインが、前記第1の可変軽ドメインのN末端にあり、前記偽軽可変ドメインが、前記偽可変重ドメインのN末端にある、請求項1及び3~5のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記第1の可変重ドメインが、前記第1の可変軽ドメインのN末端にあり、前記偽可変重ドメインが、前記偽可変軽ドメインのN末端にある、請求項1及び3~5のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記第1の可変軽ドメインが、前記第1の可変重ドメインのN末端にあり、前記偽軽可変ドメインが、前記偽可変重ドメインのN末端にある、請求項1及び3~5のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記第1の可変軽ドメインが、前記第1の可変重ドメインのN末端にあり、前記偽可変重ドメインが、前記偽可変軽ドメインのN末端にある、請求項1及び3~5のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記第1及び前記第2のTTAが同じである、請求項1及び3~9のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記第1及び前記第2のTTAが異なる、請求項1及び3~9のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 半減期延長ドメインが、配列番号117を有する、請求項1及び3~11のいずれかに記載の融合タンパク質。
- Pro601、Pro602、V3及びV4、Pro665、Pro666、Pro667、Pro694、Pro695、Pro565、Pro566、Pro567、Pro727~731、Pro676~679、Pro808、Pro819、Pro621、Pro622、Pro640~643、Pro744、Pro746、Pro638、Pro639、Pro396、Pro476、Pro706、Pro709、Pro470、Pro471、Pro551、Pro552、Pro623、Pro624、Pro698、Pro655、Pro656、Pro657、Pro658、Pro516、Pro517、Pro518、ならびにPro519からなる群から選択される配列を有する、請求項1及び3~12のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 請求項1~13のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
- 請求項14に記載の核酸を含む、発現ベクター。
- 請求項15に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 融合タンパク質を作製する方法であって、前記タンパク質が発現する条件下で請求項16に記載の宿主細胞を培養することと、前記融合タンパク質を回収することと、を含む、前記方法。
- 請求項1~13のいずれかに記載のタンパク質を患者に投与することを含む、がんを治療する方法。
- 配列番号77、配列番号81、配列番号85、配列番号89、及び配列番号93から選択される配列を有するヒトTrop2に結合する単一ドメイン抗原結合ドメイン。
- 配列番号41、配列番号45、配列番号49、配列番号53、及び配列番号57から選択される配列を有するヒトB7H3に結合する単一ドメイン抗原結合ドメイン。
- 配列番号101、配列番号105、配列番号109、及び配列番号113から選択される配列を有するヒトCA9に結合する単一ドメイン抗原結合ドメイン。
- 配列番号69及び配列番号73から選択される配列を有するヒトEpCAMに結合する単一ドメイン抗原結合ドメイン。
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