CN114390938A

CN114390938A - 受约束的条件性活化的结合蛋白

Info

Publication number: CN114390938A
Application number: CN202080034144.2A
Authority: CN
Inventors: C·梅; R·B·迪布瑞吉; M·维诺格拉多沃娃; A·潘沙尔
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-03-05
Filing date: 2020-03-05
Publication date: 2022-04-22
Also published as: WO2020181140A1; JP2022524338A; US11685780B2; EP3934762A1; US20200347132A1

Abstract

本发明涉及以活性前药形式施用的条件性双特异性重定向的活化构建体或COBRA。在暴露于肿瘤蛋白酶后，所述构建体被裂解并活化，以使得它们能够结合肿瘤靶抗原(TTA)以及CD3两者，由此将表达CD3的T细胞募集至肿瘤，从而进行治疗。在一些实施方案中，所述肿瘤靶抗原是B7H3。

Description

受约束的条件性活化的结合蛋白

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年3月5日提交的美国临时申请号62/814,210；2019年3月6日提交的美国临时申请号62/814,744；以及2019年3月29日提交的美国临时申请号62/826,523的优先权，所述公开内容以引用的方式整体并入本文。

发明背景

在各种临床环境中，通常需要选择性破坏单独细胞或特定细胞类型。例如，癌症疗法的主要目标是特异性地破坏肿瘤细胞，同时使健康的细胞和组织尽可能完整无损。一种这样的方法是通过诱导针对肿瘤的免疫应答以使诸如自然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的免疫效应细胞攻击并破坏肿瘤细胞。

完整单克隆抗体(mAb)(其为肿瘤相关抗原提供优异的结合特异性和亲和力)的使用已成功应用于癌症治疗和诊断领域。但是，完整mAb的大尺寸、它们的较差生物分布、低效力以及在血池中持久存在限制了它们的临床应用。例如，完整抗体可在肿瘤区域内表现出特异性累积。在生物分布研究中，当精确检查肿瘤时，注意到在周边区域存在不均匀的抗体分布与原始累积。由于肿瘤坏死、不均匀的抗原分布和增加的间质组织压力，不可能用完整抗体构建体到达肿瘤的中心部分。相比之下，较小的抗体片段显示出快速肿瘤定位、更深地渗透到肿瘤中并且也相对快速地从血流中清除。然而，许多抗体(包括scFv和其他构建体)显示“中靶/脱肿瘤(on target/off tumor)”效应，其中分子在非肿瘤细胞上具有活性，从而引起副作用，所述副作用中的一些可能是毒性的。本发明涉及在肿瘤蛋白酶存在下选择性地活化的新型构建体。

发明内容

本发明提供了许多用于治疗癌症的不同蛋白质组合物。因此，在一方面，本发明提供了“形式2”蛋白质，所述形式2蛋白质从N-末端至C-末端包含：结合至人肿瘤靶抗原(TTA)的第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)(sdABD-TTA)；b)结构域接头；c)受约束的Fv结构域，所述受约束的Fv结构域包含：i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的可变重结构域；ii)受约束的不可裂解的接头(CNCL)；和iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的可变轻结构域；d)第二结构域接头；e)第二sdABD-TTA；f)可裂解的接头(CL)；g)受约束的伪Fv结构域，所述受约束的伪Fv结构域包含：i)伪轻可变结构域；ii)不可裂解的接头(NCL)；和iii)伪重可变结构域；h)第三结构域接头；以及i)结合至人血清白蛋白的第三sdABD；其中所述可变重结构域和所述可变轻结构域能够结合人CD3，但所述受约束的Fv结构域不结合CD3；所述可变重结构域和所述伪可变轻结构域分子内缔合以形成无活性的Fv；并且所述可变轻结构域和所述伪可变重结构域分子内缔合以形成无活性的Fv。在一些实施方案中，所述人肿瘤靶抗原是B7H3。

在另一方面，本发明提供了蛋白质，所述蛋白质从N-末端至C-末端包含：结合至人肿瘤靶抗原(TTA)的第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)(sdABD-TTA)，所述第一单结构域抗原结合结构域包含sdFR1-sdCDR1-sdFR2-sdCDR2-sdFR3-sdCDR3-sdFR4；b)第一结构域接头；c)受约束的Fv结构域，所述受约束的Fv结构域包含：i)包含vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4的可变重结构域；ii)受约束的不可裂解的接头(CNCL)；和iii)包含vlFR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4的可变轻结构域；d)第二结构域接头；e)第二sdABD-TTA；f)可裂解的接头(CL)；g)受约束的伪Fv结构域，所述受约束的伪Fv结构域包含：i)伪轻可变结构域，所述伪轻可变结构域包含sdFR1-sdCDR1-sdFR2-sdCDR2-sdFR3-sdCDR3-sdFR4；ii)不可裂解的接头(NCL)；和iii)伪重可变结构域，所述伪重可变结构域包含vlFR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4；h)第三结构域接头；以及i)结合至人血清白蛋白的第三sdABD，所述第三sdABD包含sdFR1-sdCDR1-sdFR2-sdCDR2-sdFR3-sdCDR3-sdFR4；其中所述可变重结构域和所述可变轻结构域能够结合人CD3，但所述受约束的Fv结构域不结合CD3；所述可变重结构域和所述伪可变轻结构域分子内缔合以形成无活性的Fv；并且所述可变轻结构域和所述伪可变重结构域分子内缔合以形成无活性的Fv。在一些实施方案中，所述人肿瘤靶抗原是B7H3。

在形式2蛋白质的一些实施方案中，可变重结构域位于所述可变轻结构域的N-末端，并且所述伪轻可变结构域位于所述伪可变重结构域的N-末端。在一些实施方案中，所述可变重结构域位于所述可变轻结构域的N-末端，并且所述伪可变轻结构域位于所述伪可变重结构域的C-末端。在一些实施方案中，所述可变重结构域位于所述可变轻结构域的C-末端，并且所述伪可变轻结构域位于所述伪可变重结构域的N-末端。在一些实施方案中，所述可变重结构域位于所述可变轻结构域的C-末端，并且所述伪可变轻结构域位于所述伪可变重结构域的C-末端。

在形式2蛋白质的一些实施方案中，所述第一sdABDTTA和所述第二sdABDTTA是相同的。在一些实施方案中，所述第一sdABDTTA和所述第二sdABDTTA是不同的。在这些实施方案中，sdABD-TTA选自图5中描绘的那些，包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：33、SEQID NO：37、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73,77、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：113。

在形式2蛋白质的一些实施方案中，所述受约束的伪Fv结构域的伪重可变结构域选自SEQ ID NO：146(V_Hi)、SEQ ID NO：150(V_Hi2)和SEQ ID NO：154(VHiGL4)的组，如图5所示。在一些实施方案中，所述受约束的伪Fv结构域的伪轻可变结构域选自SEQ ID NO：130(V_Li)、SEQ ID NO：134(V_Li2)和SEQ ID NO：138(V_LiGL)的组，如图5所示。

在另一方面，本发明提供了“形式1”蛋白质，所述形式1蛋白质从N-末端至C-末端包含：a)第一sdABD-TTA；b)第一结构域接头；c)受约束的Fv结构域，所述受约束的Fv结构域包含：i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重结构域；ii)受约束的可裂解的接头(CCL)；和iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻结构域；d)第二结构域接头；e)第二sdABD-TTA；f)可裂解的接头(CL)；g)受约束的伪Fv结构域，所述受约束的伪Fv结构域包含：i)第一伪轻可变结构域；ii)不可裂解的接头(NCL)；和iii)第一伪重可变结构域；h)第三结构域接头；以及i)结合至人血清白蛋白的第三sdABD；其中所述第一可变重结构域和所述第一可变轻结构域能够结合人CD3，但所述受约束的Fv结构域不结合CD3；其中所述第一可变重结构域和所述第一伪可变轻结构域分子内缔合以形成无活性的Fv；并且其中所述第一可变轻结构域和所述第一伪可变重结构域分子内缔合以形成无活性的Fv。在另一方面，本发明提供了“形式4”蛋白质，所述形式4蛋白质从N-末端至C-末端包含：a)结合至人肿瘤靶抗原(TTA)的第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)(sdABD-TTA)；b)第一结构域接头；c)受约束的Fv结构域，所述受约束的Fv结构域包含：i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重结构域；ii)受约束的不可裂解的接头(CNCL)；和iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻结构域；d)可裂解的接头(CL)；e)结合至人血清白蛋白的第二sdABD；f)结构域接头；g)受约束的伪Fv结构域，所述受约束的伪Fv结构域包含：i)第一伪轻可变结构域；ii)不可裂解的接头(NCL)；和iii)第一伪重可变结构域；其中所述第一可变重结构域和所述第一可变轻结构域能够结合人CD3，但所述受约束的Fv结构域不结合CD3；其中所述第一可变重结构域和所述第一伪可变轻结构域分子内缔合以形成无活性的Fv；并且所述第一可变轻结构域和所述第一伪可变重结构域分子内缔合以形成无活性的Fv。

在上文列出的形式1、形式2和形式4蛋白质的另一方面，所述第一可变重结构域位于所述第一可变轻结构域的N-末端，并且所述伪轻可变结构域位于所述伪可变重结构域的N-末端。

在上文列出的形式1、形式2和形式4蛋白质的另一方面，所述第一可变重结构域位于所述第一可变轻结构域的N-末端，并且所述伪可变重结构域位于所述伪可变轻结构域的N-末端。

在上文列出的形式1、形式2和形式4蛋白质的另一方面，所述第一可变轻结构域位于所述第一可变重结构域的N-末端，并且所述伪轻可变结构域位于所述伪可变重结构域的N-末端。

在上文列出的形式1、形式2和形式4蛋白质的另一方面，所述第一可变轻结构域位于所述第一可变重结构域的N-末端，并且所述伪可变重结构域位于所述伪可变轻结构域的N-末端。

在另一方面，本发明提供了形式1和形式2蛋白质，其中所述第一和第二TTA是相同的。

在另一方面，本发明提供了形式1和形式2蛋白质，其中所述第一和第二TTA是不同的。

在另一方面，本发明提供了形式1、形式2和形式4蛋白质，其中所述第一和第二TTA选自EGFR、EpCAM、FOLR1、Trop2、ca9和B7H3。这些序列可选自由以下组成的组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ IDNO：73、77、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：113。

在另一方面，本发明提供了形式1、形式2和形式4蛋白质，其中所述半衰期延长结构域具有SEQ ID NO：117(aHSA(10GE))和SEQ ID NO：121(具有His标签的aHSA)。

在另一方面，本发明提供了形式1、形式2和形式4蛋白质，其中所述可裂解的接头通过选自由以下组成的组的人蛋白酶裂解：MMP2、MMP9、Meprin A、Meprin B、组织蛋白酶S、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、颗粒酶B、uPA、Kallekriein7、蛋白裂解酶和凝血酶，或如图6中描述的其他人蛋白酶。

在另一方面，本发明提供了一种选自由以下组成的组的蛋白质：Pro186、Pro225、Pro226、Pro233、Pro262、Pro311、Pro312、Pro313、Pro356、Pro359、Pro364、Pro388、Pro448、Pro449、Pro450、Pro451、Pro495、Pro246、Pro254、Pro255、Pro256、Pro420、Pro421、Pro432、Pro479、Pro480、Pro187、Pro221、Pro222、Pro223、Pro224、Pro393、Pro394、Pro395、Pro396、Pro429、Pro430、Pro431、Pro601、Pro602、V3和V4、Pro664、Pro665、Pro667、Pro694、Pro695、Pro565、Pro566、Pro567、Pro727、Pro728、Pro729、Pro730、Pro731、Pro676、Pro677、Pro678、Pro679、Pro808、Pro819、Pro621、Pro622、Pro640、Pro641、Pro642、Pro643、Pro744、Pro746、Pro638、Pro639、Pro396、Pro476、Pro706、Pro709、Pro470、Pro471、Pro551、Pro552、Pro623、Pro624、Pro698、Pro655、Pro656、Pro657、Pro658、Pro516、Pro517、Pro518和Pro519。

在另一方面，本发明提供了编码如本文所述的形式1、形式2或形式4蛋白质的核酸，以及包含编码所述蛋白质的核酸的表达载体和宿主细胞。

在另一方面，本发明提供了制备本发明的蛋白质的方法和治疗有需要的患者的方法。

在另一方面，本发明提供了包含“形式3A”前药蛋白质对的组合物，所述组合物包含：a)第一蛋白，所述第一蛋白从N-末端至C-末端包含：i)第一sdABD-TTA；ii)第一结构域接头；iii)伪Fv结构域，所述伪Fv结构域从N-末端至C-末端包含：1)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的可变重链；2)可裂解的接头；3)包含iVLCDR1、iVLCDR2和iVLCDR3的第一伪可变轻结构域；iv)第二结构域接头；v)sdABD-HSA；a)第二蛋白质，所述第二蛋白质从N-末端至C-末端包含：i)结合至人肿瘤靶抗原的第三sdABD；ii)第三结构域接头；iii)伪Fv结构域，所述伪Fv结构域从N-末端至C-末端包含：1)包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的可变轻链；2)可裂解的接头；和3)包含iVHCDR1、iVHCDR2和iVHCDR3的第一伪可变重结构域；iv)第四结构域接头；v)sdABD-HSA；其中所述第一可变重结构域和所述第一可变轻结构域在缔合时能够结合人CD3；其中所述第一可变重结构域和所述第一伪可变轻结构域分子间缔合以形成无活性的Fv；其中所述第一可变轻结构域和所述第一伪可变重结构域分子间缔合以形成无活性的Fv；并且其中所述第一和第三sdABD选自由以下组成的组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQID NO：9、SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：29、SEQID NO：33、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：53、SEQID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73,77、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：113。

在另一方面，本发明提供包含“形式3B”前药蛋白质对的组合物，所述组合物包含a)第一蛋白质，所述第一蛋白质从N-末端至C-末端包含：i)第一sdABD-TTA；ii)第一结构域接头；iii)第二sdABD-TTA；iv)第二结构域接头；iii)伪Fv结构域，所述伪Fv结构域从N-末端至C-末端包含：1)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的可变重链；2)可裂解的接头；3)包含iVLCDR1、iVLCDR2和iVLCDR3的第一伪可变轻结构域；iv)第三结构域接头；和v)sdABD-HSA；a)第一第二蛋白质，所述第一第二蛋白质从N-末端至C-末端包含：i)第三sdABD-TTA；ii)第四结构域接头；iii)第四sdABD-TTA；iv)第五结构域接头；iii)伪Fv结构域，所述伪Fv结构域从N-末端至C-末端包含：1)包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的可变轻链；2)可裂解的接头；和3)包含iVHCDR1、iVHCDR2和iVHCDR3的第一伪可变重结构域；iv)第六结构域接头；v)sdABD-HSA；其中所述第一可变重结构域和所述第一可变轻结构域在缔合时能够结合人CD3；其中所述第一可变重结构域和所述第一伪可变轻结构域分子间缔合以形成无活性的Fv；并且其中所述第一可变轻结构域和所述第一伪可变重结构域分子间缔合以形成无活性的Fv。

在另一方面，形式3A和形式3B蛋白质具有sdABD-HSA，所述sdABD-HSA具有SEQ IDNO：117或SEQ ID NO：121。

在另一方面，形式3A和形式3B蛋白质具有结合至选自EGFR、EpCAM、Trop2、CA9、FOLR1和B7H3的TTA的sdABD-TTA。所述sdABD-TTA可选自由以下组成的组：SEQ ID NO：1、SEQID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25、SEQID NO：29、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：49、SEQID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、77、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：113。

在另一方面，本发明提供结合至人Trop2的sdABD，所述sdABD具有选自SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：93的序列。

在另一方面，本发明提供结合至人B7H3的sdABD，所述sdABD具有选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：57的序列。

在另一方面，本发明提供结合至人CA9的sdABD，所述sdABD具有选自SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：113的序列。

在另一方面，本发明提供结合至人EpCAM的sdABD，所述sdABD具有选自SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：73的序列。

在另一方面，本发明提供了核酸组合物，所述核酸组合物包含编码前药对的第一蛋白质成员的第一核酸和编码所述对的第二蛋白质成员的第二核酸；以及含有所述核酸的表达载体和宿主细胞。

附图说明

图1描绘本发明的蛋白酶活化的“形式1”类型，在本文中称为“受约束的、不可裂解的构建体”或“cc构建体”。在此实施方案中，代表性构建体是Pro140：两个TTA存在ABD(如图1所描绘，这些均是相同的，尽管如本文所述，它们可以是不同的)。在裂解后，前药构建体分裂成三个组成部分，一个含有经由结构域接头连接至αCD3的活性VH的α-TTA结构域，第二个含有经由结构域接头连接至αCD3的活性VL的α-TTA结构域，并且“剩余”部分包含连接至无活性的VH和VL的半衰期延长结构域。两个活性可变结构域然后自由缔合以形成功能性抗CD3结合结构域。应注意，在“形式1”实施方案中，所得的活性组分是三价的：存在与CD3的单价结合和与TTA的二价结合，从而产生双特异性结合蛋白，尽管在一些情况下这种三价可以是三特异性的，具有与CD3的单价结合、与第一TTA的单价结合和与第二TTA的单价结合。图1还示出作为半衰期延长结构域的抗人血清白蛋白(HSA)结构域，在许多实施方案中，如本文所定义的sdABD，尽管如本文所述，这是任选的和/或可被其他半衰期延长结构域替代；另外，所述半衰期延长结构域也可在构建体的N末端或内部。图1还具有处于特定顺序的Fv的VH和VL以及伪Fv的iVH和iVL，例如从N-末端至C-末端，VH-接头-VL(和iVL-接头-iVH)，尽管如本领域技术人员将认识到的，这些可颠倒(VL-接头-VH和iVH-接头-iVL)。或者，这些Fv中的一个可处于一个取向，并且另一个处于另一取向，尽管处于如此处所示的取向的蛋白质的表达出人意料地高于其他取向。

图2描绘本发明的蛋白酶活化的“形式2”类型，在本文中称为“受约束的、不可裂解的构建体”或“CNCL构建体”，在本文中有时也称为如本文所论述的“二聚化构建体”。这些构建体未如本文所论述异构化。在裂解后，两种前药构建体分裂成四个组成部分，与两个伪结构域连接的两个半衰期延长结构域(在这种情况下，sdABD至HSA)(取决于接头的长度和失活突变，它们可能能够或可能不能够自缔合)，以及自组装成二聚体活性部分的两个活性部分，所述二聚体活性部分包含四个抗TTA结构域(其可全部相同或两个相同，并且另外两个不同)。应注意，在“形式2”实施方案中，所得的活性组分是六价的：存在与CD3的二价结合和与TTA的四价结合，从而产生双特异性结合蛋白，尽管在一些情况下这种六价可以是三特异性的，具有与CD3的二价结合、与第一TTA的二价结合和与第二TTA的二价结合。图2还示出作为半衰期延长结构域的抗人血清白蛋白(HSA)结构域，在许多实施方案中，如本文所定义的sdABD，尽管如本文所述，这是任选的和/或可被其他半衰期延长结构域替代；另外，所述半衰期延长结构域也可在构建体的N末端或内部。图2还具有处于特定顺序的Fv的VH和VL以及伪Fv的iVH和iVL，例如从N-末端至C-末端，VH-接头-VL(和iVL-接头-iVH)，尽管如本领域技术人员将认识到的，这些可颠倒(VL-接头-VH和iVH-接头-iVL)。或者，这些Fv中的一个可处于一个取向，并且另一个处于另一取向，尽管处于如此处所示的取向的蛋白质的表达出人意料地高于其他取向。

图3A-图3B描绘如本文概述的“形式3”类型的构建体，有时也称为“半构建体”或“半-COBRA^TM”，因为这些是共同构成MCE治疗剂的两条不同的多肽链，如本文进一步所论述。在此实施方案中，所述构建体成对递送，具有预先裂解分子内自组装，从而产生无活性的抗CD3 Fv结构域。在裂解后，惰性可变结构域被释放，并且两个活性可变结构域然后分子间组装以形成活性抗CD3结合结构域。两种sdABD-TTA结合至肿瘤细胞表面上的相应受体，并且所述裂解通过蛋白酶进行。这允许分子间组装，因为分子物理上保持在适当位置，从而有利于活性抗CD3结构域的组装。如上文对于形式1和2，在此实施方案中，可变结构域的N-末端至C-末端顺序也可颠倒或混合。此外，sdABD(HSA)可位于每种半构建体的N-末端或C-末端。Pro16在C末端具有sdABD(HSA)，并且Pro17在N末端具有它(参见Pro19，SEQ ID NO：XX，在C-末端具有sdABD(HSA))。图3A示出每个半构建体具有单个sdABD-TTA结构域的形式3构建体，并且图3B示出呈“双重靶向”或“异质靶向”形式的每个半构建体具有两个sdABD-TTA的形式3构建体。注意，图3B使用FOLR1和EGFR作为两个TTA，但是也可使用如本文概述的其他组合。

图4描绘类似于“形式2”构建体、但只有单个sdABD-TTA的“形式4”类型的构建体。所述图示出针对EGFR的sdABD-TTA，但是如本领域技术人员将理解的，也可使用其他TTA。在裂解后，前药构建体分裂成两个组成部分，与伪Fv连接的半衰期延长结构域(在这种情况下，针对HSA的sdABD)和活性部分，所述活性部分在来自不同裂解分子的第二活性部分存在下自组装成含有两个抗TTA结构域的二聚活性部分。应注意，在“形式4”实施方案中，所得的活性组成部分是四价的：存在与CD3的二价结合和与TTA的二价结合，从而产生双特异性结合蛋白。图4还示出作为半衰期延长结构域的抗人血清白蛋白(HSA)结构域，在许多实施方案中，如本文所定义的sdABD(1/2)，尽管如本文所述，这是任选的和/或可被其他半衰期延长结构域替代；另外，所述半衰期延长结构域也可在构建体的N末端或内部。图4还具有处于特定顺序的Fv的VH和VL以及伪Fv的iVH和iVL，例如从N-末端至C-末端，VH-接头-VL(和iVL-接头-iVH)，尽管如本领域技术人员将认识到的，这些可颠倒(VL-接头-VH和iVH-接头-iVL)。或者，这些Fv中的一个可处于一个取向，并且另一个处于另一取向，尽管处于如此处所示的取向的蛋白质的表达出人意料地高于其他取向。

图5A-图5J描绘本发明的多个序列。对于抗原结合结构域，CDR加下划线。如本文更全面地概述的，在本发明中这些结构域可以广泛范围的构型来组装，包括“形式1”、“形式2”、“形式3”和“形式4”取向。

图6A-图6D描绘许多适合的蛋白酶裂解位点。如本领域技术人员将理解的，这些裂解位点可用作可裂解的接头。在一些实施方案中，例如，当需要更柔性的可裂解接头时，可存在在这些裂解位点的N-末端或C-末端或两者的另外的氨基酸(通常是甘氨酸和丝氨酸)。

图7A-图7D描绘与“形式3”或“半-COBRA^TM”结构相关的一些数据。这表明形式3构建体在被蛋白酶(在这种情况下为EK蛋白酶，但是可使用本文中概述以及图5和图6中描绘的任何蛋白酶裂解位点)裂解后协同结合至CD3并且产生CD3结合位点，如通过夹心FACS分析所示。

图8A-图8D示出，蛋白酶裂解通过互补的半-COBRA^TM对协同活化EGFR+靶细胞的T细胞杀伤。图8A和图8B示出分离、但是用不同浓度的蛋白酶裂解的构建体不影响靶细胞存活力。然而，图8C示出组合地在蛋白酶存在下，靶细胞存活力显著降低。图8D示出一般机制。

图9示出用于测定以测试形式1构建体的功效的一些非靶标对照。

图10A-图10F示出活性CD3结合结构域的产生取决于两个“臂”(例如sdABD-TTA结构域)的靶结合，两者中的一者在两种构建体中的每一者上。如实施例中所述进行ELISA测定。

图11示出适合的半-COBRA^TM对的示意图。“Mep”代表meprin蛋白酶裂解位点，“His-6”是如本文更充分论述的标签，ST14是蛋白裂解酶蛋白酶裂解位点，并且“Thb”是凝血酶蛋白酶裂解位点。

图12A-图12C示出与图11的构建体相关的TDCC数据。图12A示出添加预先裂解的半-COBRA对产生对OvCAR8细胞的功效，图12B示出添加预先裂解的半-COBRA对产生对HCT116细胞的功效，并且图12C示出，添加预先裂解的半-COBRA对产生对LoVo细胞的功效，所述细胞全部是癌细胞系。

图13A-图13B示出，MMP9接头在体内稳定。经由尾静脉以0.5mg/kg的剂量向NSG小鼠施用Pro40(MMP9可裂解)和Pro74(不可裂解)单次静脉内推注剂量。在25mM柠檬酸、75-mML-精氨酸、75mM NaCl和4％蔗糖pH 7.0的媒介物中制备每种化合物的剂量溶液。在预先选择的时间从每只动物采集两个血液样品，一个在研究开始时通过眼眶出血或下颌下出血采集，并且另一个在终点时间点通过心脏穿刺采集。血液采集的时间点是0.083、1、6、24、72和168小时。使用K₂EDTA管从每个单独的血液样本中制备血浆。使用采用对抗HSA sdABD具有特异性的单克隆抗体的MSD测定确定浓度并用EGFR细胞外域检测。

图14描绘在图15中描绘的实验中使用的形式3A半-COBRA^TM构建体的示意图。Pro51是阳性对照，因为它“始终开启”，所以它形成活性抗CD3 Fv。Pro98是阴性对照，因为它的sdABD针对鸡卵溶菌酶，鸡卵溶菌酶不由肿瘤表达。Pro77和Pro53是前药形式3A对，使用针对EGFR的sdABD和MMP9裂解位点。Pro74和Pro72是阴性对照形式3A对，因为它们没有裂解位点。

图15示出，使用实施例中的方案，使用植入小鼠中的两种不同的肿瘤细胞系，形式1构建体在体内消退肿瘤。半-COBRA构建体(Pro77和Pro53)的抗肿瘤活性取决于抗EGFRsdABD和MMP9可裂解接头以及活性抗CD3 Fv的包含。

图16示出下一代形式的示意图，即具有两个伪Fv结构域(在它们之间具有可裂解位点)的全长构建体，如US 2018/0134789中总体描述的，所述专利特此以引用的方式并入。但是，如下图所示，这种第一代全长构建体未显示非常好的条件性，因为它可异构化以形成活性和非活性构建体。

图17示出，形式3A构建体对实际上显示出比Pro100第一代全长构建体更好的条件性。

图18描绘另外的第一代全长构建体，所述构建体在图19中进行了测试。

图19示出第一代构建体即使在未裂解的形式下也显示出高活性，例如较差条件性。

图20示出第一代全长构建体在分析SEC上显示两个单体峰。

图21示出非裂解活性的原因的示意图，所述原因是全长第一代构建体异构化以形成两种构象，一种构象是无活性的，因为没有形成活性抗CD3 Fv(“二价scFv”)，并且另一种构象在不存在蛋白酶的情况下具有活性，即“单链双抗体”类型的构型。参见PEDS 23(8)：667-677(2010)。

图22示出TDCC测定的结果，在37C下运行2天，使用第一代单链构建体。结果表明，未裂解的构建体显示强大的杀伤。这些结果导致形式1构建体的生成。

图23A-图23G示出本发明中使用的形式1构建体。如本领域技术人员将理解的并且在本文中所述，这些被描绘为具有sdABD-EGFR靶向部分，但是可使用针对其他TTA的sdABD。

图24示出形式1构建体(在这种情况下Pro140)形成在37℃下稳定的单一异构体。

图25描绘如通过Octet测定所测量，形式1构建体在未裂解形式下与人CD3的结合非常低。顶部线是Pro120，中间线是Pro51(阳性对照)，并且底部线是在4℃或37℃下保持3天的Pro140。

图26类似地描绘形式1构建体在未裂解形式下具有非常低的TDCC活性。

图27描绘在体内测试中使用的特定形式1构建体Pro140，使用作为靶向部分的sdABD-EGFR和MMP9裂解位点。

图28A-图28B示出使用形式1构建体的肿瘤消退。

图29描绘由于受约束的Fv中的裂解位点，可产生若干不同的片段：部分裂解的片段和完全裂解的片段。出人意料地，部分裂解的形式比完全裂解的形式更具活性，从而导致形式2的生成。

图30示出许多形式2示意图，所述示意图全部使用sdABD-EGFR靶向结构域，但是如本文所述和序列中所列出，可使用针对其他TTA的sdABD。Pro51和Pro201是阳性对照(分别处于活性“半”构型和活性二聚体构型)，并且Pro214是全长阴性对照，因为没有裂解位点。

图31示出形式2构建体Pro187的TDCC活性，所述构建体使用meprin裂解位点。TDCC测定中的Pro187在预先裂解添加时的活性比未裂解添加时的活性高1200倍。预先裂解的Pro187展现出介于阳性对照Pro51与Pro201之间的活性。未裂解的Pro187展现出类似于Pro214的活性，所述Pro214不含蛋白酶可裂解接头。

图32示出使用n个MMP9裂解位点的形式2构建体Pro186的TDCC活性。TDCC测定中的Pro186在预先裂解添加时的活性比未裂解添加时的活性高18倍。预先裂解的Pro186展现出介于阳性对照Pro51与Pro201之间的活性。未裂解的Pro186展现出比Pro214更高的活性，Pro214不包含蛋白酶可裂解接头，这可能是由于细胞在48小时测定期间产生的MMP活性所致。

图33描绘Pro186构建体结合至具有不同水平的EGFR受体的细胞，但不结合至在细胞表面上不表达EGFR的CHO细胞。Pro186使在相似COBRA浓度下表达不同水平的EGFR的细胞饱和。

图34示出在图35的体内研究中使用的形式2构建体的示意图，其全部使用sdABD-EGFR靶向结构域。

图35示出，形式2构建体Pro186在两种剂量水平下均是高效的，并且在较低剂量下优于形式1构建体Pro140。

图36描绘基于Pro186、但具有不同蛋白酶裂解位点的许多形式2构建体。尽管所有这些构建体都将sdABD-EGFR用于两个靶向结构域，但也可使用针对不同TTA的其他sdABD，并且它们可相同或不同。也就是说，均可进行均质靶向(使sdABD靶向同一TTA)或异质靶向(使一个sdABD靶向第一TTA，并且使另一个sdABD靶向不同的TTA)。

图37描绘在Fv结构域之间改变接头长度的不同形式2构建的示意图。使用MMP9裂解位点示出这些，但是如本文所述也可使用其他裂解位点。类似地，尽管所有这些构建体都将sdABD-EGFR用于两个靶向结构域，但也可使用针对不同TTA的其他sdABD，并且它们可相同或不同。

图38示出伪Fv的接头长度可改变，例如在活性Fv之间具有短接头(“短活性”)、在伪Fv之间具有较长接头(“长无活性”)的形式2构建体表现出与“短活性”和“短无活性”相似的活性。因此，COBRA构建体的条件性不依赖于受约束的活性和无活性scFv接头两者；只要它们中的一者受约束，单链双抗体折叠似乎比二价scFv折叠更有利。

图39示出活性Fv的接头长度可改变，例如，具有“长活性”和“短无效”的形式2构建体与“短活性”和“短无活性”构建体表现相似。因此，COBRA构建体的条件性不依赖于受约束的活性和无活性scFv接头两者；只要它们中的一者受约束，单链双抗体折叠似乎比二价scFv折叠更有利。

图40A一图40C示出许多不同构建体的示意图。Pro188是形式1的构建体，与Pro140相似、但在伪Fv中带有长接头(16聚体)。Pro189和Pro190(形式2构建体)与Pro186和Pro187相似，除了在伪Fv结构域中具有长接头(16聚体)。Pro191和Pro192(也是形式2构建体)与Pro189和Pro190类似，除了它们在sdABD(1/2)上游具有额外的裂解位点。Pro193(形式4)具有单个EGFR靶向结构域、重排为处于相反顺序的iVH和iVL以及在sdABD(1/2)上游的额外裂解位点。Pro195是类似于Pro186的形式2构建体，其具有结合至同一TTA(即EGFR)、但结合至不同表位的靶向结构域。Pro196、Pro197和Pro198是具有重排可变结构域的形式2构建体。

图41描绘以下事实：针对人FOLR1的不同sdABD克隆显示出不同的杀伤。将结合至人FOLR1的Pro22型构建体(具有FLAG序列而不是NCL的Pro51)与针对多个细胞系家族的Pro22-EGFR构建体进行了比较。

图42描绘四种sdABD-FOLR1构建体的示意图，包括利用使用sdABD-EGFR2的作为阳性对照的Pro201活性结构域二聚体(两个分子分子间缔合以形成针对CD3的两个活性Fv)，以及两种形式2测试品使用77.2 sdABD的Pro311和使用h59.3 sdABD的Pro312，以及两种阴性对照，使用h77.2 sdABD的Pro299和使用h59.3 sdABD的Pro303。

图43描绘用于FOLR/MMP9体内设计的形式2构建体的示意图。

图44示出Pro312构建体在体内的功效，并且证明MMP9可裂解接头对于抗肿瘤活性是必需的。

图45描绘使用针对人B7H3的sdABD(sdABD-B7H3)的一些形式的示意图，包括Pro244、阳性对照(使用sdABD-B7H3(hF7)，以及两种形式2测试品Pro225(形式2构建体)和Pro295(缺少裂解位点的阴性对照)。

图46示出，与对照Pro295相比，Pro225具有更大的条件性。

图47示出，与Pro295相比，使用meprin接头的形式2构建体Pro373显示出巨大条件性。

图48描绘许多sdABD-B7H3(使用hF12序列)构建体，其示出使用sdABD-EGFR的Pro51阳性对照、使用sdABD-hF12 B7H3的Pro244阳性对照、测试构建体Pro226和无含裂解位点的阴性对照Pro296。

图49示出在TDCC测定中Pro226构建体的良好条件性。

图50示出针对人EpCAM的sdABD的人源化。

图51示出多种形式的示意图：Pro244是标准T细胞衔接器阳性对照，并且Pro205是活性结构域二聚体阳性对照，Pro199是形式2构建体，并且Pro175是阴性对照。

图52示出sdABD-EpCAM构建体的TDCC活性，显示良好的条件性。

图53A-图53B示出sdABD-EpCAM Pro199构建体的TDCC活性，从而在HT29和LoVo细胞模型中显示出良好条件性。

图54A-图54B示出sdABD-EpCAM Pro200构建体的TDCC活性，从而在HT29和LoVo细胞模型中显示出良好条件性。

图55示出Pro255的示意图，与使用双EpCAM sdABD的Pro199相比，它使用两种不同的sdABD-TTA，一种针对EGFR(sdABD-EGFR)，并且另一种针对EpCAM(sdABD-EpCAM)。这些有时在本文中称为“异质靶向”构建体，在这种情况下，称为形式2构建体。

图56示出，具有MMP9裂解位点的Pro255双重靶向分子显示出良好条件性。

图57A-图57D示出在三种不同细胞类型上的实验的结果。首先，产生具有EpCAM、EGFR和EpCAM+EGFR的相似表达水平的Raji转染子(数据未示出)。然后，使用每种细胞类型在TDCC分析中对靶向EpCAM和EGFR两者的Pro255进行了测试。图57A示出不表达任一受体的亲本Raji品系。图57B示出在EpCAM品系上的条件性。图57C示出在EGRF品系上的条件性。图57D示出在EpCAM/EGFR品系上的条件性。

图58描绘形式4构建体Pro258的示意图。

图59A-图59B示出Pro258在FBS和人血清两者中都是条件性的。由于培养物中的MMP9活性，MMP9接头的条件性被低估。令人感兴趣的是，Pro51 TDCC活性受HSA结合抑制，而Pro258 TDCC活性与HSA存在下的Pro51相似。最后，在HSA存在下，Pro258条件性增强6倍。

图60A-图60C.图60A示出其他MMP对MMP9底物的裂解。图60B和60C示出含有MMP9接头序列的FRET探针的裂解。

图61A-图61B示出一些示例性构建体及其形式。

图62A-图62V示出本发明的许多序列，但是在序列表中还发现了许多其他序列。CDR加下划线且加粗，接头加双下划线(其中可裂解的接头呈斜体且加双下划线)，并且结构域分隔用“/”表示。所有His6标签都是任选的，因为它们可用于降低人体内的免疫原性，以及作为纯化标签。

图63A至63EE描绘包含多个sdABD-B7H3和伪Fv结构域(例如，Vli2/Vhi2结构域)的示例性形式2构建体的氨基酸序列。图63A描绘Pro601和Pro602的氨基酸序列。图63B描绘V3和V4的氨基酸序列。Pro601包含结合B7H3的两种相同sdAb(例如aB7H3 hF7 sdAb)。Pro602包含结合B7H3的两种相同sdAb(例如，抗B7H3 hF12 sdAb)。V3包含结合B7H3的两种不同sdAb(例如，抗B7H3 hF7 sdAb和抗B7H3 hE12 sdAb)。V4包含结合B7H3的两种不同sdAb(例如，抗B7H3 hF7 sdAb和抗B4H3 hF12 sdAb)。

图64A-64C示出COBRA设计和预测的折叠机制。图64A描绘Pro186 COBRA(图62B的SEQ ID NO：145)的示意图。图64B示出预测的COBRA折叠。图64C示出Pro186的分析型尺寸排阻色谱图。

图65A-图65C描绘本文所述的构建体的示例性实施方案，包括Pro186(预先裂解)、Pro186裂解产物和PRO186活性二聚体。

图66提供在蛋白酶裂解后COBRA转化为活性二聚体的说明。

图67A-图67B提供COBRA结合的表征。图67A示出对人、食蟹猴和小鼠制品的结合活性。图67B示出PRO186与人CD3ε的结合；人CD3ε的活性PRO186结合和人EGFR的活性PRO186结合。

图68A-图68B示出MMP2和MMP9对PRO186接头的裂解。图68A描绘裂解后活性结合产物分子的蛋白质印迹。图68B示出活性结合产物分子相对于裂解时间的累积。

图69示出条件性PRO186构建体的体外活性。图69-左图示出T细胞杀伤测定的结果。图69-右图示出与测试品的浓度相关的IFN-γ释放的水平。

图70示出在三种肿瘤细胞系-LoVo(结肠直肠癌(CRC)细胞系)、HT-29(结肠直肠癌(CRC)细胞系)和SCC25(头颈癌细胞系)中相对于活性的EGFR表达。

图71A和图71B示出肿瘤细胞和肿瘤异种移植物上的EGFR、MMP2和MMP9表达。图71A示出三种癌细胞系-LoVo、HT-29和SCC25上的EGFR细胞表面密度。图71B示出肿瘤异种移植物的EGFR、MMP2和MMP9的免疫组织化学染色。

图72提供在荷瘤小鼠中过继性人T细胞转移模型的实验程序的示意图。

图73示出PRO186对小鼠中建立的实体瘤的消退。图73-左图示出LoVo来源的肿瘤的消退。图73-中图示出HT-29来源的肿瘤的消退。图73-右图示出SCC25来源的肿瘤的消退。

图74A-图74B示出裂解的PRO186比完整的(未裂解的)PRO186清除得更快。图74A示出测试品在非荷瘤小鼠的血浆中的药代动力学。图74B示出施用了测试品的小鼠中LoVo来源的肿瘤的肿瘤体积。

图75描绘使用用MMP9裂解的Pro233和Pro233的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定的结果。Pro233依赖于人源化抗EGFR结合结构域。结果表明，与未裂解的形式相比，裂解的Pro233在表达EGFR的HT29细胞上显示出效力。

图76描绘使用Pro565、通过MMP9裂解的Pro565和Pro568(不可裂解的对照)的TDCC测定的结果。Pro565依赖于hVIB664抗EpCAM结合结构域。结果表明，在表达EpCAM的HT29肿瘤细胞上，裂解的Pro565比非裂解型式和不可裂解的对照更有效。

图77描绘使用Pro225、通过MMP9裂解的Pro225和Pro295(不可裂解的对照)的TDCC测定的结果。Pro225依赖于hF7抗B7H3结合结构域。结果表明，在表达B7H3的HT29肿瘤细胞上，裂解的Pro566比非裂解型式和不可裂解的对照更有效(注意HT29表达EGFR、B7H3和EpCAM)。

图78描绘使用Pro566、通过MMP9裂解的Pro566和Pro569(不可裂解的对照)的TDCC测定的结果。Pro566依赖于hVIB665抗EpCAM结合结构域。结果表明，在表达EpCAM的HT29肿瘤细胞上，裂解的Pro566比非裂解型式和不可裂解的对照更有效。

图79描绘使用EGFR2结合结构域和hVIB664 EpCAM结合结构域使用针对EGFR和EpCAM的双重靶向构建体(本文有时称为“异-COBRA”)的TDCC测定的结果。结果显示MMP9裂解的Pro623比未裂解的Pro623或不可裂解的对照Pro625更有效。

图80描绘使用EGFR2结合结构域和hVIB665 EpCAM结合结构域使用针对EGFR和EpCAM的双重靶向构建体的TDCC测定的结果。结果显示MMP9裂解的Pro624比未裂解的Pro624或不可裂解的对照Pro626更有效。

图81描绘使用hEGFR2结合结构域和hVIB665 EpCAM结合结构域使用针对EGFR和EpCAM的双重靶向构建体(呈与Pro624相反的取向)的TDCC测定结果。结果显示MMP9裂解的Pro698比未裂解的Pro698或不可裂解的对照Pro699更有效。

图82描绘在Pro655中使用hF7 B7H3结合结构域和hVIB664 EpCAM结合结构域使用针对B7H3和EpCAM的双重靶向构建体的TDCC测定的结果。结果显示MMP9裂解的Pro665比未裂解的Pro665或不可裂解的对照Pro659更有效。

图83描绘在Pro657(呈与Pro655相反的取向)中使用hF7 B7H3结合结构域和hVIB664 EpCAM结合结构域使用针对B7H3和EpCAM的双重靶向构建体的TDCC测定的结果。结果显示MMP9裂解的Pro657比未裂解的Pro657或不可裂解的对照Pro661更有效。

图84描绘在Pro656中使用hF7 B7H3结合结构域和hVIB665 EpCAM结合结构域使用针对B7H3和EpCAM的双重靶向构建体的TDCC测定的结果。结果显示MMP9裂解的Pro656比未裂解的Pro656或不可裂解的对照Pro660更有效。

图85描绘在Pro658(呈与Pro656相反的取向)中使用hF7 B7H3结合结构域和hVIB665 EpCAM结合结构域使用针对B7H3和EpCAM的双重靶向构建体的TDCC测定的结果。结果显示MMP9裂解的Pro658比未裂解的Pro658或不可裂解的对照Pro662更有效。

图86描述的实验表明，结合至B7H3和EpCAM两者的双重靶向构建体Pro656和Pro658(两个结构域的取向不同)杀死所有三种细胞类型(表达B7H3且不表达EpCAM的那些，表达EpCAM且不表达B7H3的那些和表达两者的那些)。相比之下，Pro225(其具有两个抗B7H3结构域)仅杀死两种细胞类型(表达B7H3以及B7H3和EpCAM两者的那些)。类似地，Pro566(其具有两个抗EpCAM结构域)仅杀死两种细胞类型，即表达EpCAM以及B7H3和EpCAM两者的那些。使用瞬时表达适当蛋白质的Raji F细胞系。

图87描绘使用B7H3靶向构建体Pro226的TDCC测定的结果。结果表明，与不可裂解的对照Pro296相比，Pro226和用MMP9裂解的Pro226显示出更高活性。预先裂解的Pro226显示出约8pM的EC50。

图88描绘使用Pro226的TDCC测定的结果，所述Pro226在衣霉素存在下表达，其提高Pro226的效力。衣霉素阻止糖基化，并且裂解产物的EC50增加至1pM，从而表明糖基化正在降低EC50(增加效力)。

图89描绘使用Pro664的TDCC测定的结果，与Pro226(相同构建体但没有氨基酸变体)相比，Pro664含有具有氨基酸变体(S59Y)以去除糖基化位点的抗B7H3 hF12结构域。Pro664显示出与Pro226类似的活性。

图90描绘使用Pro665的TDCC测定的结果，与Pro226(相同构建体但没有氨基酸变体)相比，Pro665含有具有氨基酸变体(N57Q)以去除糖基化位点的抗B7H3 hF12结构域。Pro665显示出比Pro226更高的效力。

图91描绘使用Pro667的TDCC测定的结果，与Pro226(相同构建体但没有氨基酸变体)相比，Pro667含有具有氨基酸变体(N57E)以去除糖基化位点的抗B7H3 hF12结构域。Pro667显示出比Pro226更低的效力。

图92描绘使用Pro694的TDCC测定的结果，与Pro226(相同构建体但没有氨基酸变体)相比，Pro694含有具有氨基酸变体(S59A)以去除糖基化位点的抗B7H3 hF12结构域。Pro694显示出比Pro226更高的效力。

图93描绘使用Pro695的TDCC测定的结果，与Pro226(相同构建体但没有氨基酸变体)相比，Pro695含有具有氨基酸变体(N57D)以去除糖基化位点的抗B7H3 hF12结构域。Pro695显示出与Pro226相似的效力。

图94示出TDCC测定，其比较无活性的结构域中的两种不同失活。Pro186在Vhi和Vli两者中均具有标记失活，并且Pro476具有i2失活，并且它们显示出相似的效力。

图95示出比较含有MMP9裂解位点的Pro186和含有S9裂解位点的Pro393的TDCC测定；结果表明，两种构建体在不同蛋白酶裂解位点的情况下表现相似。

图96描绘比较含有MMP9裂解位点的Pro186和含有ST14 MV裂解位点的Pro394的TDCC测定；结果表明，两种构建体在不同蛋白酶裂解位点的情况下表现相似。

图97描绘比较含有MMP9裂解位点的Pro186和含有CathS裂解位点的Pro395的TDCC测定；结果表明，两种构建体在不同蛋白酶裂解位点的情况下表现相似。

图98描绘了比较含有MMP9裂解位点的Pro186和含有MMP9v裂解位点的Pro396的TDCC测定；结果表明，两种构建体在不同蛋白酶接头序列的情况下表现相似。注意，MMP9位点通过MMP9和CathS两者裂解，而MMP9v是MMP9特异性的。

图99描绘比较含有MMP9裂解位点的Pro186和含有MepGzb裂解位点的Pro429的TDCC测定；结果表明，两种构建体在不同蛋白酶裂解位点的情况下表现相似。

图100描绘比较含有MMP9裂解位点的Pro186和含有MMP9-2裂解位点的Pro430的TDCC测定；尽管MMP9裂解位点不同，但它们的表现相似。

图101描绘比较含有MMP9裂解位点的Pro186和含有ST14MS裂解位点的Pro431的TDCC测定；结果表明，两种构建体在不同蛋白酶裂解位点的情况下表现相似。

图102描绘使用Pro676(一种含有Trop2的构建体)的TDCC测定，表明Pro677及其活性二聚体(Pro684AD)显示出与Pro680(不可裂解的对照)相比更高的针对BXPC3肿瘤细胞的活性。活性二聚体是通过表达自我二聚化的活性结构域而制成的。

图103描绘使用Pro677(一种含有Trop2的构建体)的TDCC测定，表明Pro677及其活性二聚体(Pro685AD)显示出与Pro681(不可裂解的对照)相比更高的针对BXPC3肿瘤细胞的活性。

图104描绘使用Pro677(一种含有Trop2的构建体)的TDCC测定，表明Pro677及其活性二聚体(Pro685AD)显示出与Pro681(不可裂解的对照)相比更高的针对HT29肿瘤细胞的活性。Pro677显示出与BXPC3细胞相比，通过HT29细胞活化更少。

图105描绘使用Pro678(一种含有Trop2的构建体)的TDCC测定，表明Pro678及其活性二聚体(Pro686AD)显示出与Pro682(不可裂解的对照)相比更高的针对BXPC3肿瘤细胞的活性。

图106描绘使用Pro679(一种含有Trop2的构建体)的TDCC测定，表明Pro679及其活性二聚体(Pro687活性结构域，AD)显示出与Pro683(不可裂解的对照)相比更高的针对BXPC3肿瘤细胞的活性。

图107描绘使用Pro808(一种含有Trop2的构建体)的TDCC测定，表明Pro808、其裂解形式和活性二聚体(Pro810AD)显示出与Pro809(不可裂解的对照)相比更高的针对BXPC3肿瘤细胞的活性。

图108描绘在HT29肿瘤细胞中使用Pro808(一种含有Trop2的构建体)的TDCC测定。Pro810AD(活性结构域)在TDCC测定中显示出比Pro809(不可裂解的对照)更高的活性。全长Pro808在使用HT29细胞的测定中没有显示出太多的活化。

图109描绘使用Pro819(一种含有Trop2的构建体)的TDCC测定，表明Pro819及其活性二聚体(Pro821AD)显示出与Pro820(不可裂解的对照)相比更高的针对BXPC3肿瘤细胞的活性。

图110描绘使用Pro819(一种含有Trop2的构建体)的TDCC测定，表明活性二聚体(Pro821AD)显示出与不可裂解的对照相比更高的活性。当与不可裂解的对照Pro820相比时，全长Pro819没有显示出太多的HT29细胞活化。对于图107和108以及图109和110的两对，数据表明，当结合显示添加MMP9抑制剂降低活性的数据时，不同的靶细胞类型产生不同水平的MMP活性(参见图133)。

图111描绘使用Pro311(一种FOLR1构建体)的TDCC测定，表明通过MMP9裂解的Pro311和Pro311显示出与Pro299不可裂解的对照相比针对H292肿瘤细胞更高的活性。

图112描绘使用Pro312(一种FOLR1构建体)的TDCC测定，表明通过MMP9裂解的Pro312和Pro312显示出与Pro303不可裂解的对照相比针对H292肿瘤细胞更高的活性。

图113描绘使用具有FOLR1和EGFR靶向的双重靶向构建体Pro420的TDCC测定的结果。结果表明，与不可裂解的对照Pro299相比，Pro420和用MMP9裂解的Pro420显示出更高活性。

图114描绘使用双重靶向构建体Pro421的TDCC测定的结果，所述Pro421具有FOLR1和EGFR靶向(呈与Pro420相反的取向)。结果表明，与不可裂解的对照Pro299相比，Pro421和用MMP9裂解的Pro421显示出更高活性。

图115描绘使用具有EGFR和FOLR1靶向的双重靶向构建体Pro551的TDCC测定的结果。结果表明，与不可裂解的对照Pro550相比，Pro551和用MMP9裂解的Pro551显示出更高活性。

图116描绘使用双重靶向构建体Pro552的TDCC测定的结果，所述Pro552具有FOLR1和EGFR靶向(呈与Pro551相反的取向)。结果表明，与不可裂解的对照Pro303相比，Pro522和用MMP9裂解的Pro522显示出更高活性。

图117描绘使用双靶向构建体Pro254的TDCC测定的结果，其中每个靶向结构域结合至EGFR的不同表位，并且它针对表达EGFR的HT29细胞有效。

图118描绘使用两种不同的双重靶向构建体的TDCC测定的结果，所述双重靶向构建体也使用两个不同的靶向结构域但两者都结合至B7H3。Pro479和Pro480除了两个结合结构域的取向外是相同的，并且两者在表达B7H3的HT29细胞上通过MMP9裂解后均显示出活性。

图119描绘使用在表达EGFR的HT-29细胞上裂解的Pro233和Pro233的TDCC测定的结果。Pro233在用MMP9裂解时显示出良好的条件性和良好的效力。

图120描绘使用Pro225(一种具有B7H3靶向和MMP9接头的构建体)的肿瘤消退研究的结果。所述研究是使用人PBMC植入模型进行的，其中向NSG-β2M-/-小鼠(Jackson)静脉内植入人PBMC；植入后3天，向小鼠皮下植入肿瘤细胞系。一旦确定肿瘤生长，就基于肿瘤体积将小鼠随机分组，并如所示静脉内给予测试品。通过卡尺测量评估肿瘤体积。结果表明，与不可裂解的对照Pro295相比，Pro225使已建立的实体瘤消退。

图121描绘使用Pro226(一种具有B7H3靶向和MMP9接头的构建体)的肿瘤消退研究的结果。所述研究如图120中所述进行，并且结果显示与不可裂解的对照Pro295相比，Pro226使已建立的实体瘤消退。

图122描绘使用Pro565和Pro566的肿瘤消退研究的结果，Pro565和Pro566两者均具有EpCAM靶向和MMP9接头。结果表明，与不可裂解的对照Pro568相比，Pro565和Pro566均表现出抗肿瘤响应。

图123描绘使用Pro393的肿瘤消退研究的结果，Pro393利用EGFR靶向和S9接头，使用图122中描述的方案。结果表明，与不可裂解的对照Pro214相比，Pro393使已建立的实体瘤消退。

图124描绘使用Pro394的肿瘤消退研究的结果，Pro394利用EGFR靶向和ST14 MV接头，使用图122中描述的方案。结果表明，与不可裂解的对照Pro214相比，Pro394表现出小的抗肿瘤响应。

图125描绘使用Pro395的肿瘤消退研究的结果，Pro395利用EGFR靶向和CathS接头，使用图122中描述的方案。结果表明，与不可裂解的对照Pro214相比，Pro395使已建立的实体瘤消退。

图126描绘使用Pro396的肿瘤消退研究的结果，Pro396利用EGFR靶向和MMP9v接头，使用图122中描述的方案。结果表明，与不可裂解的对照Pro214相比，Pro396表现出抗肿瘤响应。

图127描绘使用Pro430的肿瘤消退研究的结果，Pro430利用EGFR靶向和MMP9-2接头，使用图122中描述的方案。结果表明，与不可裂解的对照Pro214相比，Pro430使已建立的实体瘤消退。

图128描绘使用Pro431的肿瘤消退研究的结果，Pro431利用EGFR靶向和ST14 MS接头，使用图122中描述的方案。结果表明，与不可裂解的对照Pro214相比，Pro431表现出抗肿瘤响应。

图129描绘使用Pro476的肿瘤消退研究的结果，Pro476利用EGFR靶向、MMP9-2接头和无活性的结构域Vli2和VHi2，使用图122中描述的方案。结果表明，与不可裂解的对照Pro214相比，Pro476使已建立的实体瘤消退。

图130描绘使用Pro517的肿瘤消退研究的结果，Pro517利用EGFR靶向和MMP9-2接头，使用图122中描述的方案。结果表明，与不可裂解的对照Pro513相比，Pro517使已建立的实体瘤消退。

图131描绘使用Pro664的肿瘤消退研究的结果，Pro664利用B7H3靶向和MMP9接头，使用图120中描述的方案。结果表明，与不可裂解的对照Pro766相比，Pro664使已建立的实体瘤消退。

图132描绘使用Pro676的肿瘤消退研究的结果，Pro676利用Trop2靶向和MMP9接头，使用图122中描述的方案。结果表明，与不可裂解的对照Pro681相比，Pro676使已建立的实体瘤消退。

图133描绘使用Pro225(具有MMP9接头的抗B7H3构建体)和增加量的MMP特异性抑制剂巴马司他(Batimastat)的研究结果，表明未裂解的Pro225的效力被巴马司他降低，从而证明测定中COBRA被细胞裂解和活化。

具体实施方式

引言

本发明涉及降低结合至重要的生理靶标如CD3和肿瘤抗原的双特异性抗体(包括抗体样功能性蛋白质)的毒性和副作用的方法。许多抗原结合蛋白(如抗体)可因靶向正常组织而具有显著副作用，并且因此仅需要在疾病组织附近活化治疗分子的结合能力，以避免正常组织相互作用。因此，本发明涉及具有许多功能性蛋白质结构域的多价条件性有效(“MCE”)蛋白质。一般而言，这些结构域中的一个是将结合靶肿瘤抗原(TTA)的抗原结合结构域(ABD)，并且另一个是在某些条件下将结合T细胞抗原如CD3的ABD。另外，MCE蛋白还包括一个或多个蛋白酶裂解位点。即，以“前药”样形式制备治疗性分子，其中CD3结合结构域在暴露于肿瘤环境之前是无活性的。肿瘤环境含有蛋白酶，使得在暴露于蛋白酶时，前药被裂解并变得具有活性。

这通常通过使用包含针对T细胞抗原(如CD3)的“伪”可变重结构域和“伪”可变轻结构域的蛋白质来实现，所述蛋白质将MCE的CD3Fv约束为如本文论述的无活性形式。由于TTA使MCE靶向到肿瘤附近，因此使MCE暴露于蛋白酶。在裂解后，活性可变重结构域和活性轻结构域现在能够配对以形成针对CD3的一个或多个活性ABD，并且因此将T细胞募集至肿瘤，从而进行治疗。

一般而言，CD3结合结构域(“Fv”)处于受约束的形式，其中传统上形成Fv的活性可变重结构域与活性可变轻结构域之间的接头太短以至于不允许两个活性可变结构域彼此结合；这被称为“受约束的接头”；这些可以是受约束且可裂解的(CCL，如形式1中所用)或受约束且不可裂解的(CNCL，如形式2中所用)。而是，以前药(例如未裂解的)形式，前药多肽还包含“伪Fv结构域”。伪Fv结构域包含具有标准框架区、但“惰性”或“非活性”CDR的可变重链和轻链结构域。伪Fv结构域还在无活性可变重链结构域与无活性可变轻链结构域之间具有受约束的接头。因为由于空间约束，Fv和伪Fv结构域两者均不能自组装，因此由于各自的框架区的亲和力，存在使aVL与iVH配对以及使aVH与iVL配对的分子内组装。然而，由于伪结构域的“惰性”CDR，所得ABD将不结合CD3，从而防止患病组织(如肿瘤)外的毒性。然而，在肿瘤中或附近存在蛋白酶的情况下，前药构建体被裂解，使得伪-Fv结构域从表面释放，并且因此允许“真实的”可变重结构域和可变轻结构域分子间缔合(例如两个裂解的构建体结合在一起)，从而触发活性CD3结合和所得肿瘤功效。这些构建体在本文中通常被称为条件性双特异性重定向活化构建体或“COBRA^TM”。分子内组装的稳定性通过本文的条件性实验显示，由此在不存在蛋白酶的情况下，未裂解的构建体不具有活性(例如，不形成活性CD3结合结构域)。

令人感兴趣的是，为了便于描述，尽管这些构建体在本文中均被称为“受约束的”，但是另外的工作表明即使Fv结构域之一不受约束，例如，所述结构域之一可具有更长、柔性的接头也有利于分子内组装。即，如图37-39中所示，如果仅约束一个Fv结构域(具有活性VL和VH的结构域或伪Fv结构域)，则分子内组装仍然发生(例如，未裂解的构建体在没有蛋白酶裂解的情况下是无活性的)。但是，在当前系统中，当两个接头均受约束时，所述蛋白质具有更好的表达。然而，如本领域技术人员将理解的，本文的任何形式1、形式2或形式4构建体都可具有带有“不受约束的”或“柔性”接头的这些Fv结构域之一。为便于参考，示出具有处于受约束形式的两个Fv结构域的构建体。

本发明的构建体和形式是相对于WO2017/156178中描述的发明的变化型式，所述专利特此明确地以引用的方式整体并入。如图17-21中所示，由于单个多肽中存在两组VH和VL结构域，所以先前构建体具有异构化的能力，从而形成二价scFv和单链双抗体。即使在纯化每种同种型之后，二价构建体仍可与双抗体同种型达到平衡。由于在没有蛋白酶裂解的情况下单链双抗体具有结合至CD3的能力，因此构建体的效用降低。

为了解决这个问题，本发明提供了四种单独类型的构建体来完成这种条件性活化。前药活化可以四种一般方式之一发生，如附图中总体上所示。在图1中，示出“形式1”机制。在此实施方案中，前药构建体具有两个裂解位点：一个在受约束的Fv的VH与vl结构域之间，从而释放出两个可变结构域以缔合；并且第二个在从前药构建体释放伪Fv结构域的位点，从而留下由于可变重结构域和可变轻结构域的先天自组装而缔合的两个分子，所述分子各自也具有与肿瘤抗原的抗原结合结构域，从而允许T细胞募集至肿瘤部位。

在替代实施方案中，前药构建体示于图2中，“形式2”机制。在此实施方案中，活性可变重链与活性轻链之间的结构域接头是受约束但不可裂解的接头(“CNCL”)。在前药形式中，受约束的伪Fv结构域的无活性VH和VL与受约束的Fv结构域的VH和VL缔合，使得没有CD3结合。然而，一旦在肿瘤环境中发生裂解，两种不同的活化蛋白质(各自包含活性可变重链和轻链结构域)就缔合以形成两个抗CD3结合结构域。此形式2具有两个靶肿瘤抗原结合结构域(“TTA-ABD”)，如下文更详细地描述，所述抗原结合结构域可相同(例如“同-COBRA”)，或者不同(例如“异-COBRA”)。如果不同，则它们可各自针对不同的肿瘤抗原，或者它们可针对同一肿瘤抗原但不同的表位，如下文更充分地描述。

除了上问论述的“单链蛋白质”COBRA形式(其中所有组分都包含在单个氨基酸序列上)外，还存在依赖于成对起作用的两种蛋白质“半-COBRA”的构建体，如图3所示。在此实施方案中，每种蛋白质具有被蛋白酶裂解位点隔开的一个活性可变结构域和一个惰性可变结构域。每个分子含有TTA结合结构域，使得当分子结合至TTA并暴露于肿瘤蛋白酶时，惰性结构域被裂解，并且两个活性可变结构域自组装以形成抗CD3结合结构域。

此外，本发明还提供了“形式4”构建体，如图4中所描绘。这些与“形式2”设计类似，除了使用针对TTA的单个ABD，使得在裂解时，两个前药分子现在形成含有两个活性抗CD3结构域的四价双特异性构建体，如在下文进一步描述。

因此，本发明的形式和构建体可用于治疗疾病。

定义

为了可更完全地理解本申请，以下提出若干定义。此类定义意在涵盖语法等效物。

如本文所用，“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指20种天然存在的氨基酸中的一种或可能存在于特定、确定位置处的任何非天然类似物。在许多实施方案中，“氨基酸”是指20种天然存在的氨基酸之一。本文中的“蛋白质”意指至少两种共价附接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。

如本文所用，“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或化学连接至蛋白质的部分的改变。例如，修饰可以是附接至蛋白质的改变的碳水化合物或PEG结构。为了清楚起见，除非另有注释，否则氨基酸修饰总是针对由DNA编码的氨基酸，例如在DNA和RNA中具有密码子的20个氨基酸。本文中的优选氨基酸修饰是取代。

如本文所用，“氨基酸取代”或“取代”意指亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸被不同氨基酸替换。特别地，在一些实施方案中，置换是在特定位置不是天然存在的氨基酸，或者不是在生物体内或在任何生物体中天然存在的。为了清楚起见，已被工程化以改变核酸编码序列、但不改变起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)交换成CGA(仍编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代物”；也就是说，尽管产生了编码相同蛋白质的新基因，但如果蛋白质在它开始的特定位置处具有相同的氨基酸，蛋白质就不是氨基酸取代。

如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中特定位置处添加氨基酸序列。

如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列中特定位置处去除氨基酸序列。

如本文概述的，本发明的多肽特异性地结合至CD3和靶肿瘤抗原(TTA)，如靶细胞受体。“特异性结合”或“特异地结合至”或“对特定抗原或表位具有特异性”是指明显不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可例如通过测定与对照分子结合相比的分子结合来测量，对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，可通过与类似于靶标的对照分子竞争来测定特异性结合。

对特定抗原或表位的特异性结合可例如由对抗原或抗原表位的KD为至少约10^-4M、至少约10^-5M、至少约10^-6M、至少约10^-7M、至少约10^-8M、至少约10^-9M、或者至少约10^-10M、至少约10^-11M、至少约10^-12M或更高的抗体展现，其中KD是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。通常，特异地结合抗原的抗体对于对照分子的KD为相对于所述抗原或表位的20、50、100、500、1000、5,000、10,000或更高倍数。

此外，对特定抗原或抗原表位的特异性结合可例如由对于抗原或抗原表位的KA或Ka为对于对照物的至少20、50、100、500、1000、5,000、10,000或更高倍数的抗体展现，其中KA或Ka是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率。结合亲和力通常使用本领域已知的Biacore测定或Octet来测量。

如本文所用，“亲本多肽”或“前体多肽”(包括Fc亲本或前体)意指随后被修饰以产生变体的多肽。所述亲本多肽可以是天然存在的多肽，或天然存在的多肽的变体或工程化型式。亲本多肽可以指多肽本身、包含亲本多肽的组合物、或编码所述多肽的氨基酸序列。因此，如本文所用，“亲本Fc多肽”意指被修饰以产生变体的未修饰的Fc多肽，并且如本文所用的“亲本抗体”意指被修饰以产生变异抗体的未修饰的抗体。

如本文所用，“位置”意指蛋白质的序列中的位置。位置可按顺序编号，或根据既定形式编号，例如用于抗体编号的EU索引。

如本文所用的“靶抗原”意指被给定抗体的可变区特异性地结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、脂质或其他化学化合物。本文描述了一系列合适的示例性靶抗原。

如本文所用的“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞。一般而言，出于本发明的目的，靶细胞是表达TTA的肿瘤细胞或表达CD3抗原的T细胞。

如本文所用生物“Fv”或“Fv片结构域”或“Fv区”意指包含通常来自抗体的抗原结合结构域的VL和VH结构域的多肽。如果Fv结构域含有活性VH和VL结构域，则Fv结构域通常形成如本文所论述的“抗原结合结构域”或“ABD”(但是在一些情况下，使用含有受约束的接头的Fv，以使得不会在裂解前形成活性ABD)。如下文所论述，在本发明中，Fv结构域可以多种方式组构，并且可以是“活性的”或“无活性的”，如呈scFv形式、受约束的Fv形式、伪Fv形式等。应理解，在本发明中，在一些情况下，Fv结构域由单个多肽链上的VH和VL结构域组成，如图1和图2中所示，但具有受约束的接头，以使得不能形成分子内ABD。在这些实施方案中，在裂解后形成两个活性ABD。在一些情况下，Fv结构域由VH和VL结构域组成，所述VH和VL结构域中的一个是惰性的，以使得仅在裂解后形成分子间ABD。如下文所论述，在本发明中，Fv结构域可以多种方式组构，并且可以是“活性的”或“无活性的”，如呈scFv形式、受约束的Fv形式、伪Fv形式等。此外，如本文所论述的，含有VH和VL的Fv结构域可以是/形成ABD，并且不包含VH和VL结构域的其他ABD可使用sdABD形成。

本文的“可变区”意指免疫球蛋白的区域，所述区域包含一个或多个Ig结构域，所述Ig结构域基本上由分别构成κ、λ以及重链和轻链免疫球蛋白基因座的任何Vκ、Vλ和/或VH基因编码。在一些情况下，可使用单个可变结构域，如sdFv(在本文也称为sdABD)。

在利用可变重(VH)结构域和可变轻(VL)结构域两者的实施方案中，每个VH和VL由三个高变区(“互补决定区”，“CDR”)和四个“框架区”或“FR”组成，其以下列次序从氨基末端至羧基末端排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。因此，VH结构域具有结构vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4，并且VL结构域具有结构vlFR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4。如本文更充分描述的，vhFR区和vlFR区自组装以形成Fv结构域。一般而言，在本发明的前药形式中，存在其中VH和VL结构域不能自缔合的“受约束的Fv结构域”，以及当自缔合时CDR不形成抗原结合结构域的“伪Fv结构域”。

高变区赋予抗原结合特异性并且通常涵盖来自轻链可变区中的约氨基酸残基24-34(LCDR1；“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)以及89-97(LCDR3)与重链可变区中的大致约31-35B(HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)以及95-102(HCDR3)的氨基酸残基；Kabat等，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，Public Health Service，第5版，National Institutes of Health，Bethesda Md.(1991)和/或形成轻链可变区中的高变环的那些残基(例如，残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)以及91-96(LCDR3))和形成重链可变区中的高变环的那些残基，26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)以及96-101(HCDR3)；Chothia andLesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917。以下描述本发明的特定CDR。

如本领域技术人员将理解的，不同编号系统中CDR的确切编号和位置可以不同。然而，应理解，可变重和/或可变轻序列的公开内容包括相关(固有)CDR的公开内容。因此，每个可变重区的公开内容是vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的公开内容，并且每个可变轻区的公开内容是vlCDR(例如vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的公开内容。

CDR编号的有用比较如下，参见Lafranc等人，Dev.Comp.Immunol.27(1)：55-77(2003)：

表1

	Kabat+Chothia	IMGT	Kabat	AbM	Chothia	接触性
							vhCDR1	26-35	27-38	31-35	26-35	26-32	30-35
vhCDR2	50-65	56-65	50-65	50-58	52-56	47-58
							vhCDR3	95-102	105-117	95-102	95-102	95-102	93-101
vlCDR1	24-34	27-38	24-34	24-34	24-34	30-36
							vlCDR2	50-56	56-65	50-56	50-56	50-56	46-55
vlCDR3	89-97	105-117	89-97	89-97	89-97	89-96

贯穿本说明书，当提及可变结构域中的残基(近似地，轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统和Fc区的EU编号系统(例如Kabat等人，同上(1991))。

本发明提供了大量不同的CDR集。在这种情况下，在抗CD3组分的背景下“全CDR组”包含三个可变轻CDR和三个可变重CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3。如本领域技术人员将理解的，每组CDR，即VH和VL CDR，可单独地和作为一组结合至抗原。例如，在受约束的Fv结构域中，vhCDR可例如结合至CD3，并且vlCDR可结合至CD3，但是在受约束的形式中，它们不能结合至CD3。

在单结构域ABD(“sdABD”)的背景下，如本文中通常用于结合至靶肿瘤抗原(TTA)，CDR组是仅三个CDR；这些在本领域中有时也称为“VHH”结构域。

这些CDR可以是更大的可变轻结构域或可变重结构域的一部分。此外，如本文更全面概述的，在scFv序列的情况下，可变重结构域和可变轻结构域可在分开的多肽链上或在单个多肽链上，这取决于本文部分的形式和构型。

CDR促进抗原结合位点，或更尤其表位结合位点的形成。“表位”是指与可变区中的称为互补位(paratope)的特异性抗原结合位点相互作用的决定簇。抗原表位是成组的如氨基酸或糖侧链的分子，并且通常具有特定结构特性，以及特定电荷特性。单一抗原可具有多于一个表位。

表位可包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)以及不直接参与结合的其它氨基酸残基，如会受到特定抗原结合肽所有效阻断的氨基酸残基；换句话说，氨基酸残基在特定抗原结合肽的足迹内。

表位可为构型或线性的。构型表位由直链多肽链的不同节段的空间上并列的氨基酸所产生。线性表位由多肽链中相邻的氨基酸残基所产生。构象和非构象抗原表位可能的区别在于：在变性溶剂存在下，丧失与前者的结合而未丧失与后者的结合。

表位通常包括至少3个、并且更通常至少5个或8-10个呈独特空间构象的氨基酸。识别相同表位的抗体可以在简单的免疫测定来进行验证，所述免疫测定示出一种抗体阻断另一种抗体结合至靶标抗原的能力，例如“分级(binning)”。如下文所概述，本发明不仅包括本文中列举的抗原结合结构域和抗体，而且包括与由列举的抗原结合结构域结合的表位竞争结合的那些。

本发明的可变重结构域和可变轻结构域可以是“活性的”或“无活性的”。

如本文所用，“无活性的VH”(“iVH”)和“无活性的VL”(“iVL”)是指伪Fv结构域的组分，所述伪Fv结构域的组分在分别与它们的同源VL或VH配偶体配对时形成所得的VH/VL对，所述VH/VL对不特异性地结合至“活性”VH或“活性”VL将结合至的抗原，如果它与非“无活性”的类似VL或VH结合。示例性“无活性的VH”和“无活性的VL”结构域通过野生型VH或VL序列的突变形成，如下文更全面地概述。示例性突变在VH或VL的CDR1、CDR2或CDR3内。示例性突变包括将结构域接头置于CDR2内，从而形成“无活性的VH”或“无活性的VL”结构域。相比之下，“活性VG”或“活性VL”是在分别与它的“活性”同源配偶体，即VL或VH配对时能够特异性地结合至它的靶抗原的一种。因此，应理解，伪Fv可以是VH/iVL对、iVH/VL对或iVH/iVL对。

相比之下，如本文所用，术语“活性”是指能够特异性地结合至CD-3的CD-3结合结构域。此术语在两种情况下使用：(a)当提及Fv结合对的单个成员(即VH或VL)时，其具有能够与它的同源配偶体配对并特异性地结合至CD-3的序列；和(b)能够特异性地结合至CD-3的序列的一对同源物(即，VH和VL)。示例性“活性”VH、VL或VH/VL对是野生型或亲本序列。

“CD-x”是指一组分化(CD)蛋白。在示例性实施方案中，CD-x选自对施用了本发明多肽构建体的受试者中的T细胞的募集或活化具有作用的那些CD蛋白。在一个示例性实施方案中，CD-x是CD3，其序列显示于图5中。

术语“结合结构域”关于本发明表征了(特异性地)与靶分子(抗原)(例如：分别为EGFR和CD-3)上的给定靶表位或给定靶位点结合/相互作用/识别所述给定靶表位或给定位点的结构域。靶抗原结合结构域(识别EGFR)的结构和功能，和优选地同样CD-3结合结构域(识别CD3)的结构和/或功能是基于抗体(例如全长或整个免疫球蛋白分子，包括sdABD)的结构和/或功能。根据本发明，靶抗原结合结构域通常以结合靶肿瘤抗原的三个CDR的存在为特征(在本领域中通常称为可变重结构域，尽管不存在相应的轻链CDR)。或者，针对TTA的ABD可包含三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)。CD-3结合结构域优选还至少包含允许靶标结合的抗体的最小结构要求。更优选地，CD-3结合结构域包含至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)。设想在示例性实施方案中，靶抗原和/或CD-3结合结构域通过噬菌体展示或文库筛选方法产生或可通过噬菌体展示或文库筛选方法获得。

如本文所用，“结构域”是指具有功能的蛋白质序列，如本文所概述。本发明的结构域包括肿瘤靶抗原结合结构域(TTA结构域)、可变重结构域、可变轻结构域、scFv结构域、接头结构域和半衰期延长结构域。

本文中的“结构域接头”是指连接如本文所概述的两个结构域的氨基酸序列。结构域接头可以是可裂解的接头、受约束的可裂解的接头、不可裂解的接头、受约束的不可裂解的接头、scFv接头等。

本文中的“可裂解的接头”(“CL”)是指可被如本文概述的疾病组织中的蛋白酶，优选人蛋白酶裂解的氨基酸序列。可裂解的接头通常长度为至少3个氨基酸，其中4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸可用于本发明，这取决于所需的灵活性。许多可裂解的接头序列在图6和图5中找到。

本文中的“不可裂解的接头”(“NCL”)是指在正常生理条件下不能被人蛋白酶裂解的氨基酸序列。

本文中的“受约束的可裂解的接头”(“CCL”)是指以使得两个结构域不能彼此显著相互作用直到它们驻留在不同的多肽链上后，例如裂解后的方式连接如本文所概述的两个结构域的含有蛋白酶裂解位点(如本文所定义)的短多肽。当CCL连接如本文定义的VH和VL结构域时，由于分子内方式中的空间限制，VH和VL在裂解前不能自组装来形成功能性Fv(但是它们可以分子间方式组装成伪Fv结构域)。在被相关蛋白酶裂解后，VH和VL可以分子间方式组装以形成活性抗原结合结构域。一般而言，CCL的长度小于10个氨基酸，其中9、8、7、6、5和4个氨基酸可用于本发明。一般而言，蛋白酶裂解位点的长度通常为至少4+个氨基酸，以赋予足够的特异性，如图6所示。

本文中的“受约束的不可裂解的接头”(“CNCL”)是指以两个结构域不能彼此显著相互作用并且在生理条件下未被人蛋白酶显著裂解的方式连接如本文所概述的两个结构域的短多肽。

本文中的“受约束的Fv结构域”是指包含活性可变重结构域和活性可变轻结构域的Fv结构域，所述Fv结构域以使得活性重和轻可变结构域不能分子内相互作用以形成将结合抗原(如CD3)的活性Fv的方式与如本文所概述的受约束的接头共价连接。因此，受约束的Fv结构域是类似于scFv、但是由于受约束的接头的存在而不能结合抗原的Fv结构域(但是它们可与惰性可变结构域分子间组装以形成伪Fv结构域)。

本文中的“伪Fv结构域”是指包含使用结构域接头(其可以是可裂解的、受约束的、不可裂解的、非受约束的等)连接的伪或无活性可变重结构域或者伪或无活性可变轻结构域的结构域。伪Fv结构域的iVH和iVL结构域在彼此缔合(iVH/iVL)或在与活性VH或VL缔合时不结合至人抗原；因此，iVH/iVL、iVH/VL和iVL/VH Fv结构域不明显结合至人蛋白质，以使得这些结构域在人体中是惰性的。

本文中的“单链Fv”或“scFv”意指通常使用如本文所论述的scFv接头共价附接至可变轻(VL)结构域以形成scFv或scFv结构域的可变重(VH)结构域。scFv结构域可位于从N-末端至C-末端的任一个取向上(VH-接头-VL或VL-接头-VH)。

本文中的“单结构域Fv”、“sdFv”或“sdABD”是指通常基于骆驼科动物抗体技术的仅具有三个CDR的抗原结合结构域。参见：Protein Engineering 9(7)：1129-35(1994)；RevMol Biotech 74：277-302(2001)；Ann Rev Biochem 82：775-97(2013)。如本文所概述，本文使用两种通用类型的sdABD：结合至TTA并以此注释的sdABD(对于通用术语为sdABD-TTA，对于结合至EGFR的一种为sdABD-EGFR，对于结合至FOLR1的一种为sdABD-FOLR1)和结合至HSA的sdABD(“sdABD-HSA”或“sdABD(1/2)”)。

“蛋白酶裂解位点”是指被蛋白酶识别并裂解的氨基酸序列。适合的蛋白酶裂解位点在下文概述且在图5和图6中示出。

如本文所用，“蛋白酶裂解结构域”是指并入“蛋白酶裂解位点”以及在单独蛋白酶裂解位点之间和在蛋白酶裂解位点与本发明构建体的其他功能组分(例如，V_H、V_L、iVL靶抗原结合结构域、半衰期延长结构域等)之间的任何接头的肽序列。如本文所述，蛋白酶裂解结构域还可在必要时包含另外的氨基酸，例如以赋予柔性。

术语“COBRA^TM”和“条件性双特异性重定向活化”是指具有许多功能性蛋白质结构域的双特异性条件性有效的蛋白质。在一些实施方案中，功能性结构域之一是结合靶肿瘤抗原(TTA)的抗原结合结构域(ABD)。在某些实施方案中，另一个结构域是在某些条件下结合至T细胞抗原的ABD。T细胞抗原包括但不限于CD3。术语“半-COBRA^TM”是指由于集中在靶标表达细胞的表面上时先天自组装而在半-COBRA的可变重链可与另一个半-COBRA^TM(互补的COBRA^TM)的可变轻链缔合时可结合T细胞抗原的条件性有效的蛋白质。

具体实施方式

I.本发明的融合蛋白

本发明的融合蛋白具有以多种方式连接在一起的许多不同的组分(在本文中通常称为结构域)。所述结构域中的一些是结合结构域，所述结合结构域各自结合至靶抗原(例如，TTA或CD3)。由于它们结合至多于一种抗原，因此在本文中它们被称为“多特异性”；例如，本发明的前药构建体可结合至TTA和CD3，并且因此是“双特异性的”。蛋白质也可具有更高的特异性；例如，如果第一αTTA结合至EGFR，第二αTTA结合至EpCAM，并且存在抗CD3结合域，则这将是“三特异性”分子。类似地，向此构建体添加抗HSA结合结构域将是“四特异性的”，如图3B中所示。

如本领域技术人员将理解的，本发明的蛋白质可具有不同的化合价并且是多特异性的。即，本发明的蛋白质可结合具有多于一个结合位点的靶标；例如，Pro140对EGFR是二价的。

本发明的蛋白质可包括以如本文概述的多种方式排列的CD3抗原结合结构域、肿瘤靶标抗原结合结构域、半衰期延长结构域、接头等。

A.CD3抗原结合结构域

T细胞应答的特异性由T细胞受体复合物识别抗原(在主要组织相容性复合物MHC的背景下展示)介导。作为T细胞受体复合物的一部分，CD3是包含存在于细胞表面的CD3γ(γ)链、CD3δ(δ)链、两条CD3e(ε)链和两条CD3ζ(ζ)链的蛋白质复合物。CD3分子与T细胞受体(TCR)的α(α)和β(β)链缔合以构成TCR复合物。CD3在T细胞上的簇集(如通过结合至CD3的Fv结构域)导致T细胞活化，类似于T细胞受体的接合，但不依赖其克隆典型特异性。

然而，如本领域中已知的，CD3活化可引起许多毒性副作用，并且因此，本发明涉及仅在存在发现特定蛋白酶的肿瘤细胞存在下提供本发明多肽的活性CD3结合，所述蛋白酶然后裂解本发明的前药多肽以提供活性CD3结合结构域。因此，在本发明中，抗CD-3 Fv结构域与CD-3的结合由蛋白酶裂解结构域调控，所述蛋白酶裂解结构域仅在蛋白酶水平升高的患病细胞或组织的微环境中(例如在本文所述的肿瘤微环境中)限制CD-3 Fv结构域与CD-3的结合。

因此，本发明提供两组VH和VL结构域，一个活性组(VH和VL)和一个无活性组(iVH和iVL)，所有四者都存在于前药构建体中。使所述构建体形式化，以使得VH和VL组不能自缔合，而是与无活性配偶体(例如，如本文所示的iVH和VL以及iVL和VH)缔合。

1.活性抗CD3可变重结构域和可变轻结构域

存在许多本领域已知的适用于本发明的适合的活性CDR组和/或VH和VL结构域。例如，CDR和/或VH和VL结构域源自已知的抗CD-3抗体，例如像莫罗单抗-CD-3(OKT3)、奥西珠单抗(TRX4)、替普利珠单抗(MGA031)、维西珠单抗(Nuvion)、SP34或I2C、TR-66或X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1以及WT-31。

在一个实施方案中，形成结合至人CD3的活性Fv结构域的VH和VL序列在图5中示出。如本文所示，这些活性VH(“aVH”)和活性VL(“aVL”)结构域可以不同的构型和形式1、2、3和4使用。

2.无活性的抗CD3可变重结构域和可变轻结构域

无活性的iVH和iVL结构域含有允许缔合的“常规”框架区(FR)，以使得无活性的可变结构域将与活性可变结构域缔合，从而使所述对无活性，例如不能结合CD3。

如本领域技术人员将理解的，存在许多可用于本发明中的“无活性”可变结构域。基本上，可使用具有人框架区的任何可变结构域，所述可变结构域允许与另一个可变结构域自组装，无论可变区中CDR位置中的氨基酸是什么。为了清楚起见，无活性结构域被说成包含CDR，尽管从技术上说无活性可变结构域不赋予结合能力。

如本领域中将认识到的，产生无活性的VH或VL结构域通常很简单，并且可以多种方式完成。在一些实施方案中，通常通过改变活性Fv的一个或多个CDR，包括改变活性可变经域的三个CDR中的一个或多个来完成无活性可变结构域的产生。这可通过在一个或多个CDR中的功能上重要的残基处进行一个或多个氨基酸取代、用随机序列置换一些或所有CDR残基、用标签或标记序列置换一个或多个CDR和/或用来自不相关抗体的CDR和/或可变区(例如，针对不同生物体的蛋白质的CDR和/或可变区)交换CDR和/或可变区来完成。

在一些情况下，可变区中的CDR中仅一个可被改变以使其无活性，尽管其他实施方案包括1、2、3、4、5或6个CDR中的改变。

在一些情况下，可将无活性结构域工程改造成以前药形式促进选择性结合，以促进在裂解之前形成分子内iVH-VL和VH-iVL结构域(例如，超过分子间对形成)。参见例如Igawa等人Protein Eng.Des.Selection 23(8)：667-677(2010)，特此明确地以引用的方式整体并入，并且特别是关于界面残基氨基酸取代。

在某些实施方案中，本文所述的多肽构建体的CD-3结合结构域不仅显示出与人CD-3的有效CD-3结合亲和力，而且还显示出与相应食蟹猴CD-3蛋白的优异交叉反应性。在一些情况下，多肽构建体的CD-3结合结构域与来自食蟹猴的CD-3交叉反应。在某些情况下，CD-3的人：食蟹猴KD比率在5与0.2之间。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白的CD-3结合结构域可以是结合至CD-3的任何结构域，包括但不限于来自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体的结构域。在一些情况下，CD-3结合结构域源自其中最终将使用抗原结合蛋白的相同物种是有益的。例如，对于在人中使用，抗原结合蛋白的CD-3结合结构域包含来自抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基可以是有益的。

因此，在一方面，抗原结合结构域包含人源化或人结合结构域。在一个实施方案中，所述人源化或人抗CD-3结合结构域包含本文所述的人源化或人抗CD-3结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和/或本文所述的人源化或人抗CD-3结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区域3(HC CDR3)，例如，包含一个或多个(例如，全部三个)LC CDR和一个或多个(例如，全部三个)HC CDR的人源化或人抗CD-3结合结构域。

在一些实施方案中，所述人源化或人抗CD-3结合结构域包含对CD-3具有特异性的人源化或人轻链可变区，其中所述对CD-3具有特异性的轻链可变区包含人轻链框架区中的人或非人轻链CDR。在某些情况下，轻链框架区是λ(λ)轻链框架。在其他情况下，轻链框架区是κ(κ)轻链框架。

在一些实施方案中，一个或多个CD-3结合结构域是人源化的或完全人的。在一些实施方案中，一个或多个活化的CD-3结合结构域与表达CD-3的细胞上的CD-3具有1000nM或更小的KD结合。在一些实施方案中，一个或多个活化的CD-3结合结构域与表达CD-3的细胞上的CD-3具有100nM或更小的KD结合。在一些实施方案中，一个或多个活化的CD-3结合结构域与表达CD-3的细胞上的CD-3具有10nM或更小的KD结合。在一些实施方案中，一个或多个CD-3结合结构域与食蟹猴CD-3具有交叉反应性。在一些实施方案中，一个或多个CD-3结合结构域包含本文提供的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述人源化或人抗CD-3结合结构域包含对CD-3具有特异性的人源化或人重链可变区，其中所述对CD-3具有特异性的重链可变区包含人重链框架区中的人或非人重链CDR。

在一个实施方案中，所述抗CD-3结合结构域是Fv，所述Fv包含具有本文提供的氨基酸序列的轻链和重链。在一个实施方案中，所述抗CD-3结合结构域包含：轻链可变区，所述轻链可变区包含具有本文提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)、但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含具有本文提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)、但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。在一个实施方案中，所述人源化或人抗CD-3结合结构域是scFv，并且包含本文所述的氨基酸序列的轻链可变区经由scFv接头附接至包含本文所述的氨基酸序列的重链可变区。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如以任何以下取向：轻链可变区-scFv接头-重链可变区或重链可变区-scFv接头-轻链可变区。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白的CD-3结合结构域对表达CD3的细胞上的CD-3具有亲和力，其KD为1000nM或更小、100nM或更小、50nM或更小、20nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、1nM或更小或0.5nM或更小。在一些实施方案中，抗原结合蛋白的CD-3结合结构域对CD-3ε具有亲和力，其KD为1000nM或更小、100nM或更小、50nM或更小、20nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、1nM或更小或0.5nM或更小。在其他实施方案中，抗原结合蛋白的CD-3结合结构域对CD-3具有低亲和力，即约100nM或更大。

与CD-3结合的亲和力可例如通过抗原结合蛋白本身或其CD-3结合结构域与包被在测定板上；展示在微生物细胞表面上；溶液中等的CD-3结合的能力来确定，如本领域中已知的，通常使用Biacore或Octet测定。可通过将配体(例如CD-3)或抗原结合蛋白本身或其CD-3结合结构域固定至珠粒、底物、细胞等来测定本公开的抗原结合蛋白本身或其CD-3结合结构域与CD-3的结合活性。可在适当的缓冲液中添加试剂，并且将结合配偶体在给定温度下孵育一段时间。在洗涤以除去未结合的材料之后，可用例如SDS、具有高pH的缓冲液等释放结合的蛋白质，并且例如通过表面等离子体共振(SPR)进行分析。

在许多实施方案中，优选的活性和惰性结合结构域是图5中所示的那些。图5描绘一个活性VH和VL以及已经以不同方式失活的三个无活性的VHi和三个无活性的VLi。

如图5所示，一对特别有用的活性抗CD3VL和VH结构域具有VL，所述VL具有：具有SEQ ID NO：127的vlCDR1、具有SEQ ID NO：128的vlCDR2和具有SEQ ID NO：129的vlCDR3；和VH，所述VH具有：具有SEQ ID NO：143的vhCDR1、具有SEQ ID NO：144的vhCDR2和具有SEQ IDNO：145的vhCDR3。

如图5所示，一对特别有用的活性抗CD3VL和VH结构域具有VL，所述VL具有SEQ IDNO：126；和VH，所述VH具有SEQ ID NO：142。

B.针对肿瘤靶抗原的抗原结合结构域

除了所描述的CD3和半衰期延长结构域之外，本文所述的多肽构建体还包含结合至一种或多种靶抗原或单个靶抗原上的一个或多个区域的靶结构域。本文中考虑，本发明的多肽构建体例如在疾病特异性微环境中或在受试者的血液中在蛋白酶裂解结构域处被裂解，并且每个靶抗原结合结构域将结合至靶靶细胞上的靶抗原，从而活化CD3结合结构域以结合T细胞。一般而言，TTA结合结构域可在蛋白酶裂解之前结合至其靶标，因此它们可在靶细胞上“等待”被活化为T细胞衔接器。至少一种靶抗原参与疾病、病症或疾患和/或与疾病、病症或疾患相关。示例性靶抗原包括与增生性疾病、肿瘤性疾病、炎性疾病、免疫病症、自身免疫性疾病、感染性疾病、病毒性疾病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病相关的那些。在一些实施方案中，靶抗原是肿瘤细胞上表达的肿瘤抗原。或者在一些实施方案中，靶抗原与病原体(如病毒或细菌)相关。至少一种靶抗原也可针对健康组织。

在一些实施方案中，靶抗原是细胞表面分子，如蛋白质、脂质或多糖。在一些实施方案中，靶抗原是在肿瘤细胞、病毒感染的细胞、细菌感染的细胞、受损的红细胞、动脉斑块细胞或纤维化组织细胞上。

本发明的优选实施方案利用sdABD作为靶向结构域。这些相对于scFv ABD是优选的，因为将其他VH和VL结构域添加到本发明的构建体中可能使伪Fv结构域的形成复杂化。

在一些实施方案中，本发明的前药构建体利用单个TTA结合结构域，如总体上在图3A中描绘为成对的sdABD-TTA，并且在图4中描绘为“形式4”构型图4示出单一抗EGFR ABD的使用，尽管可使用其他TTA结合结构域。

在一些实施方案中，特别是在形式1和形式2构建体中，本发明的前药构建体利用两个TTA ABD，再次优选呈sdABD-TTA形式。当使用双重靶向结构域时，它们可结合至同一TTA的同一表位。例如，如本文所论述，本文的许多构建体利用两个相同的靶向结构域。在一些实施方案中，可使用结合至同一TTA的不同表位的两个靶向结构域，例如，如图5中所示，两个EGFR sdABD结合至人EGFR上的不同表位。在一些实施方案中，两个靶向结构域结合至不同的TTA，参见例如图。

本文考虑的多肽构建体包含至少一个抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域结合至至少一种靶抗原。在一些实施方案中，所述靶抗原结合结构域特异性地结合至细胞表面分子。在一些实施方案中，所述靶抗原结合结构域特异性地结合至肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述靶抗原结合结构域特异性地且独立地结合至肿瘤靶抗原(“TTA”)，所述肿瘤靶抗原选自EpCAM、EGFR、HER-2、HER-3、cMet、LyPD3、B7H3、CEA、Trop2和FOLR1中的至少一个。

(a)EGFR sdABD

如图5所示，存在许多特别有用的结合至人EGFR的sdABD，本文称为“sdABD-EGFR”或“EGFRABD”。

在一个有用的实施方案中，sdABD-EGFR1具有：具有SEQ ID NO：10的sdCDR1、具有SEQ ID NO：11的sdCDR2和具有SEQ ID NO：12的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-EGFR具有SEQ ID NO：9。

在一个有用的实施方案中，sdABD-EGFR2a具有：具有SEQ ID NO：14的sdCDR1、具有SEQ ID NO：15的sdCDR2和具有SEQ ID NO：16的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-EGFR具有SEQ ID NO：13。

在一个有用的实施方案中，sdABD-EGFR2d具有：具有SEQ ID NO：18的sdCDR1、具有SEQ ID NO：19的sdCDR2和具有SEQ ID NO：20的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-EGFR具有SEQ ID NO：17。

(b)EpCAM sdABD

如图5所示，存在许多特别有用的结合至人EpCAM的sdABD，本文称为“sdABD-EpCAM”或“EpCAMABD”。

在一个有用的实施方案中，sdABD-EpCAM h13具有：具有SEQ ID NO：62的sdCDR1、具有SEQ ID NO：63的sdCDR2、具有SEQ ID NO：64的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-EpCAM具有SEQ ID NO：61。

在一个有用的实施方案中，sdABD-EpCAM h23具有：具有SEQ ID NO：66的sdCDR1、具有SEQ ID NO：67的sdCDR2、具有SEQ ID NO：68的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-EpCAM具有SEQ ID NO：65。

在一个有用的实施方案中，sdABD-EpCAM hVIB665具有：具有SEQ ID NO：70的sdCDR1、具有SEQ ID NO：71的sdCDR2、具有SEQ ID NO：72的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-EpCAM具有SEQ ID NO：69。应注意，与h13和h23EpCAM sdABD相比，hVIB665(也称为“acEpCAM hVIB665”)结合至裂解和未裂解形式的EpCAM(其已知其在体内经历裂解)两者。

在一个有用的实施方案中，sdABD-EpCAM hVIB666具有：具有SEQ ID NO：74的sdCDR1、具有SEQ ID NO：75的sdCDR2、具有SEQ ID NO：76的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-EpCAM具有SEQ ID NO：73。应注意，与h13和h23 EpCAM sdABD相比，hVIB666(也称为“acEpCAM hVIB666”)结合至裂解和未裂解形式的EpCAM(其已知其在体内经历裂解)两者。

(c)B7H3 sdABD

如图5所示，存在许多特别有用的结合至人B7H3的sdABD，本文称为“sdABD-B7H3”或“B7H3-ABD”。

在一个有用的实施方案中，sdABD-B7H3 hF7具有：具有SEQ ID NO：34的sdCDR1、具有SEQ ID NO：35的sdCDR2、具有SEQ ID NO：36的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-B7H3具有SEQ ID NO：33。

在一个有用的实施方案中，sdABD-B7H3 hF12具有：具有SEQ ID NO：38的sdCDR1、具有SEQ ID NO：39的sdCDR2、具有SEQ ID NO：40的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-B7H3具有SEQ ID NO：37。

在一个有用的实施方案中，sdABD-B7H3 hF12(N57Q)具有：具有SEQ ID NO：42的sdCDR1、具有SEQ ID NO：43的sdCDR2、具有SEQ ID NO：44的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-B7H3具有SEQ ID NO：41。与hF7和hF12 B7H3 sdABD相比，氨基酸取代N57Q去除糖基化位点。

在一个有用的实施方案中，sdABD-B7H3 HF12(N57E)具有：具有SEQ ID NO：46的sdCDR1、具有SEQ ID NO：47的sdCDR2和具有SEQ ID NO：48的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-B7H3具有SEQ ID NO：45。与hF7和hF12 B7H3 sdABD相比，氨基酸取代N57E去除糖基化位点。

在一个有用的实施方案中，sdABD-B7H3 hF12(N57D)具有：具有SEQ ID NO：50的sdCDR1、具有SEQ ID NO：51的sdCDR2、具有SEQ ID NO：52的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-B7H3具有SEQ ID NO：49。与hF7和hF12 B7H3 sdABD相比，氨基酸取代N57D去除糖基化位点。

在一个有用的实施方案中，sdABD-B7H3 hF12(S59A)具有：具有SEQ ID NO：54的sdCDR1、具有SEQ ID NO：55的sdCDR2、具有SEQ ID NO：56的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-B7H3具有SEQ ID NO：53。与hF7和hF12 B7H3 sdABD相比，氨基酸取代S59A去除糖基化位点。

在一个有用的实施方案中，sdABD-B7H3 hF12(S59Y)具有：具有SEQ ID NO：58的sdCDR1、具有SEQ ID NO：59的sdCDR2、具有SEQ ID NO：60的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-B7H3具有SEQ ID NO：57。与hF7和hF12 B7H3 sdABD相比，氨基酸取代NS59Y去除糖基化位点。

(d)FOLR1 sdABD

如图5所示，存在许多特别有用的结合至人FOLR1的sdABD，本文称为“sdABD-FOLR1”或“FOLR1-ABD”。

在一个有用的实施方案中，sdABD-FOLR1 h77-2具有：具有SEQ ID NO：22的sdCDR1、具有SEQ ID NO：23的sdCDR2、具有SEQ ID NO：24的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-FOLR1具有SEQ ID NO：21。

在一个有用的实施方案中，sdABD-FOLR1 h59.3具有：具有SEQ ID NO：26的sdCDR1、具有SEQ ID NO：27的sdCDR2、具有SEQ ID NO：28的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-FOLR1具有SEQ ID NO：25。

在一个有用的实施方案中，sdABD-FOLR1 h22-4具有：具有SEQ ID NO：30的sdCDR1、具有SEQ ID NO：31的sdCDR2、具有SEQ ID NO：32的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-FOLR1具有SEQ ID NO：29。

(e)Trop2 sdABD

如图5所示，存在许多特别有用的结合至人Trop2的sdABD，本文称为“sdABD-Trop2”或“Trop2-ABD”。

在一个有用的实施方案中，sdABD-Trop2 hVIB557具有：具有SEQ ID NO：78的sdCDR1、具有SEQ ID NO：79的sdCDR2、具有SEQ ID NO：80的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-Trop2具有SEQ ID NO：77。

在一个有用的实施方案中，sdABD-Trop2 hVIB565具有：具有SEQ ID NO：82的sdCDR1、具有SEQ ID NO：83的sdCDR2、具有SEQ ID NO：84的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-Trop2具有SEQ ID NO：81。

在一个有用的实施方案中，sdABD-Trop2 hVIB575具有：具有SEQ ID NO：86的sdCDR1、具有SEQ ID NO：87的sdCDR2、具有SEQ ID NO：88的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-Trop2具有SEQ ID NO：85。

在一个有用的实施方案中，sdABD-Trop2 hVIB578具有：具有SEQ ID NO：90的sdCDR1、具有SEQ ID NO：01的sdCDR2、具有SEQ ID NO：92的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-Trop2具有SEQ ID NO：89。

在一个有用的实施方案中，sdABD-Trop2 hVIB609具有：具有SEQ ID NO：94的sdCDR1、具有SEQ ID NO：95的sdCDR2、具有SEQ ID NO：96的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-Trop2具有SEQ ID NO：93。

在一个有用的实施方案中，sdABD-Trop2 hVIB619具有：具有SEQ ID NO：98的sdCDR1、具有SEQ ID NO：99的sdCDR2、具有SEQ ID NO：100的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-Trop2具有SEQ ID NO：97。

(f)CA9 sdABD

如图5所示，存在许多特别有用的结合至人CA9的sdABD，本文称为“sdABD-CA9”或“CA9-ABD”。

在一个有用的实施方案中，sdABD-CA9 hVIB456具有：具有SEQ ID NO：102的sdCDR1、具有SEQ ID NO：103的sdCDR2、具有SEQ ID NO：104的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-Trop2具有SEQ ID NO：101。

在一个有用的实施方案中，sdABD-CA9hVIB476具有：具有SEQ ID NO：106的sdCDR1、具有SEQ ID NO：107的sdCDR2、具有SEQ ID NO：108的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-Trop2具有SEQ ID NO：105。

在一个有用的实施方案中，sdABD-CA9 hVIB407具有：具有SEQ ID NO：110的sdCDR1、具有SEQ ID NO：111的sdCDR2、具有SEQ ID NO：112的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-Trop2具有SEQ ID NO：109。

在一个有用的实施方案中，sdABD-CA9 hVIB445具有：具有SEQ ID NO：114的sdCDR1、具有SEQ ID NO：115的sdCDR2、具有SEQ ID NO：116的sdCDR3。在一些情况下，所述sdABD-Trop2具有SEQ ID NO：113。

在一些实施方案中，在蛋白酶裂解结构域裂解之前的蛋白质小于约100kDa。在一些实施方案中，在蛋白酶裂解结构域裂解后的蛋白质是约25至约75kDa。在一些实施方案中，在蛋白酶裂解之前的蛋白质具有高于用于首过清除的肾脏阈值的大小。在一些实施方案中，在蛋白酶裂解之前的蛋白质具有至少约50小时的消除半衰期。在一些实施方案中，在蛋白酶裂解之前的蛋白质具有至少约100小时的消除半衰期。在一些实施方案中，与针对同一靶抗原的IgG相比，所述蛋白质具有增加的组织渗透。在一些实施方案中，与针对同一靶抗原的IgG相比，所述蛋白质具有增加的组织分布。

C.半衰期延长结构域

本发明的MCE蛋白(再次在本文中也称为“COBRA^TM”蛋白或构建体)任选地包含半衰期延长结构域。考虑此类结构域包括但不限于HSA结合结构域、Fc结构域、小分子和本领域已知的其他半衰期延长结构域。

人血清白蛋白(HSA)(分子量约67kDa)是血浆中最丰富的蛋白质，以约50mg/ml(600uM)存在，并且在人中具有约20天的半衰期。HSA用于维持血浆pH值，促进胶体血压，充当许多代谢产物和脂肪酸的载体，并且用作血浆中的主要药物转运蛋白。

与白蛋白的非共价缔合延长短寿蛋白质的消除半衰期。例如，与仅施用Fab片段相比，当分别向小鼠和兔静脉内施用时白蛋白结合结构域与Fab片段的重组融合体使得体内清除率降低25和58倍且半衰期延长26和37倍。在另一个实例中，当胰岛素被脂肪酸酰化以促进与白蛋白的缔合时，当皮下注射在兔或猪中时观察到持久的作用。这些研究在一起证明白蛋白结合与延长作用之间的联系。

在一方面，本文所述的抗原结合蛋白包含半衰期延长结构域，例如特异性地结合至HSA的结构域。在其他实施方案中，所述HSA结合结构域是肽。在其他实施方案中，HSA结合结构域是小分子。考虑在一些实施方案中，抗原结合蛋白的HSA结合结构域相当小并且不超过25kD、不超过20kD、不超过15kD或不超过10kD。在某些情况下，如果HSA结合结构域是肽或小分子，则其为5kD或更小。

在许多实施方案中，半衰期延长结构域是来自结合至HSA的单结构域抗体的单结构域抗原结合结构域。此结构域在本文中通常被称为针对人HSA的“sdABD”(sdABD-HSA)，或可替代地“sdABD(1/2)”，以将这些结合结构域与针对TTA的sdABD区分开。特别有用的sdABD(1/2)在图5中所示。

抗原结合蛋白的半衰期延长结构域提供抗原结合蛋白本身的改变的药效学和药代动力学。如上所述，半衰期延长结构域延长消除半衰期。半衰期延长结构域还改变药效学性质，包括改变抗原结合蛋白的组织分布、渗透和扩散。在一些实施方案中，与没有半衰期延长结合结构域的蛋白质相比，半衰期延长结构域提供改善的组织(包括肿瘤)靶向、组织渗透、组织分布、组织内扩散以及增强的功效。在一个实施方案中，治疗方法有效地且高效地利用减少量的抗原结合蛋白，从而产生降低的副作用，如降低的非肿瘤细胞细胞毒性。

此外，半衰期延长结构域，例如HSA结合结构域的特征包括HSA结合结构域对HSA的结合亲和力。可选择所述HSA结合结构域的亲和力，以靶向特定多肽构建体中的特定消除半衰期。因此，在一些实施方案中，HSA结合结构域具有高结合亲和力。在其他实施方案中，HSA结合结构域具有中等结合亲和力。在其他实施方案中，HSA结合结构域具有低或边缘结合亲和力。示例性结合亲和力包括KD浓度在10nM或更小(高)、介于10nM与100nM之间(中等)以及大于100nM(低)。如上所述，通过已知方法如表面等离子体共振(SPR)来确定对HSA的结合亲和力。

D.蛋白酶裂解位点

如本文所概述，本发明的蛋白质组合物、并且特别是前药构建体包含通常位于可裂解的接头中的一个或多个蛋白酶裂解位点。

如本文所述，本发明的前药构建体包含至少一个蛋白酶裂解位点，所述至少一个蛋白酶裂解位点包含被至少一种蛋白酶裂解的氨基酸序列。在一些情况下，本文所述的MCE蛋白包含被至少一种蛋白酶裂解的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个蛋白酶裂解位点。如本文中更充分论述的，当在前药构建中使用多于一个蛋白酶裂解位点时，所述蛋白酶裂解位点可以是相同的(例如，被单一蛋白酶裂解的多个位点)或不同的(被至少两种不同的蛋白酶裂解的两个或更多个裂解位点)。如本领域技术人员将理解的，含有三个或更多个蛋白酶裂解位点的构建体可利用一个，两个，三个等；例如一些构建体对于两种不同的蛋白酶可利用三个位点等。

蛋白酶裂解位点的氨基酸序列将取决于所靶向的蛋白酶。如本领域中已知的，存在在体内发现并且可与疾病状态相关的许多人蛋白酶。

已知蛋白酶由一些患病细胞和组织，例如肿瘤或癌细胞分泌，从而产生富含蛋白酶的微环境(microenvironment that is rich in proteases)或富含蛋白酶的微环境(protease-rich microenvironment)。在一些情况下，受试者的血液富含蛋白酶。在一些情况下，肿瘤周围的细胞将蛋白酶分泌到肿瘤微环境中。分泌蛋白酶的肿瘤周围的细胞包括但不限于肿瘤基质细胞、成肌纤维细胞、血细胞、肥大细胞、B细胞、NK细胞、调控性T细胞、巨噬细胞、细胞毒性T淋巴细胞、树突状细胞、间充质干细胞、多形核细胞以及其他细胞。在一些情况下，蛋白酶存在于受试者的血液中，例如靶向微生物肽中发现的氨基酸序列的蛋白酶。这种特征允许诸如抗原结合蛋白的靶向治疗剂具有另外的特异性，因为除了在靶向细胞或组织的富含蛋白酶的微环境中，T细胞将不会被抗原结合蛋白结合。

蛋白酶是在一些情况下以序列特异性方式裂解蛋白质的蛋白质。蛋白酶包括但不限于丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬酰胺肽裂解酶、血清蛋白酶、组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S)、激肽释放酶、hK1、hK10、hK15、KLK7、颗粒酶B、纤溶酶、胶原酶、IV型胶原酶、溶基质素、XA因子、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、弹性蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶、猕猴桃蛋白酶、菠萝蛋白酶、钙蛋白酶、半胱天冬酶(例如半胱天冬酶-3)、Mir1-CP、木瓜蛋白酶、HIV-1蛋白酶、HSV蛋白酶、CMV蛋白酶、凝乳酶、肾素、胃蛋白酶、蛋白裂解酶、豆荚蛋白酶、疟原虫天冬氨酸蛋白酶(plasmepsin)、猪笼草蛋白酶(nepenthesin)、金属外肽酶、金属内肽酶、基质金属蛋白酶(MMP)、MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP13、MMP11、MMP14、Meprin、尿激酶纤溶酶原活化因子(uPA)、肠激酶、前列腺特异性抗原(PSA，hK3)、白介素-1β转化酶、凝血酶、FAP(FAP-α)、二肽基肽酶和二肽基肽酶IV(DPPIV/CD26)。

一些适合的蛋白酶和蛋白酶裂解序列在图5和图6中示出。

E.接头

如本文所论述，本发明的不同结构域通常使用氨基酸接头连接在一起，所述氨基酸接头也可赋予功能性，包括柔性或刚性(例如空间约束)以及使用原位蛋白酶裂解的能力。这些接头可以多种方式分类。

本发明提供了“结构域接头”，所述结构域接头用于将两个或更多个结构域(例如VH和VL，靶肿瘤抗原结合结构域(TTABD，在本文中有时也称为“αTTA”)(对于“抗TTA”)连接至VH或VL，将半衰期延长结构域连接至另一种组分等。结构域接头可以是不可裂解的(NCL)、可裂解的(“CL”)、受约束且和可裂解的(CCL)以及受约束且不可裂解的(CNCL)，例如。

1.不可裂解的接头

在一些实施方案中，所述结构域接头是不可裂解的。一般来说，这些可以是两种类型之一：不可裂解且柔性的，从而允许构建体中接头“上游”和“下游”的组分以某种方式分子内自组装；或不可裂解且受约束的，其中被接头分隔的两种组分不能分子内自组装。然而，应注意的是，在后一种情况下，尽管由不可裂解的受约束的接头分隔的两个组分结构域没有分子内自组装，但其他分子内组分将自组装以形成伪Fv结构域。

(i)不可裂解但柔性的接头

在此实施方案中，接头用于通常通过不被患者体内的原位蛋白酶裂解的更长的柔性结构域来连接结构域以保留结构域的功能性。适用于连接本发明多肽中的结构域的内部、不可裂解的接头的实例包括但不限于(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGSG)n、(GGSGG)n或(GGGGS)n，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，接头的长度可以是约15个氨基酸。

(ii)不可裂解且受约束的接头

在某些情况下，接头不包含裂解位点，而且太短而无法让由接头分隔的蛋白质结构域进行分子内自组装，并且是“受约束的不可裂解接头”或“CNCL”。例如，在Pro186中，活性VH和活性VL通过8个氨基酸(“8聚体”)隔开，其不允许VH和VL自组装成活性抗原结合结构域。在一些实施方案中，接头仍然是柔性的；例如，(GGGS)n，其中n＝2。在其他实施方案中，虽然通常不太优选，但可使用更刚性的接头，如包括脯氨酸或大体积氨基酸的那些。

2.可裂解的接头

本文所有的前药构建体均包含至少一个可裂解的接头。因此，在一个实施方案中，结构域接头是可裂解的(CL)，本文有时称为“蛋白酶裂解结构域”(“PCD”)。在此实施方案中，CL含有蛋白酶裂解位点，如本文概述且如图5和图6所示。在一些情况下，CL仅含有蛋白酶裂解位点。任选地，取决于裂解识别位点的长度，在CL的N-末端或C-末端中的一者或两者处可存在额外的几个连接氨基酸。例如，在裂解位点的N-末端和C-末端中的一者或两者处可存在1、2、3、4或5个氨基酸。因此，可裂解的接头也可以是受约束的(例如8聚体)或柔性的。

在本发明中特别令人感兴趣的是MMP9可裂解的接头和Meprin可裂解的接头，特别是MMP9受约束的可裂解的接头和Meprin受约束的可裂解的接头。

II.本发明的结构域

本发明提供了本发明的前药多肽的多种不同形式。本发明提供了受约束的Fv结构域和受约束的伪Fv结构域。另外，本发明提供了多价条件性有效(“MCE”)的蛋白质，所述蛋白质含有两个Fv结构域，但为非异构化构建体。如本文所概述，尽管每个构建体均含有至少一个蛋白酶裂解结构域，但是这些可以是非异构化可裂解的形式或非异构化不可裂解的形式。

重要的是，尽管这两种结构域(Fv结构域和伪Fv结构域)在本文中均被称为“受约束的”，但意味着如上文所论述并在图36、图37和图38中所示，这些中的仅一个需要受约束，尽管通常，当两个接头都受约束时，蛋白质具有更好的表达。

本领域技术人员将理解，对于形式1、2和4，本发明的受约束的和伪Fv结构域的N-末端至C-末端顺序存在四种可能性(未示出接头)：aVH-aVL和iVL-iVH，aVH-aVL和iVH-iVL，aVL-aVH和iVL-iVH，aVL-aVH和iVH-iVL。所有四种都已进行测试，并且所有四种都具有活性，但是第一顺序aVH-aVL和iVL-iVH显示出比其他三种更好的表达。因此，尽管本文的描述通常以这种aVH-aVL和iVL-iVH形式显示，但本文的所有公开内容也包括这些结构域的其他顺序。

注意，一般而言，本发明的全长构建体的N-末端至C-末端顺序是基于aVH-aVL和iVL-iVH取向。

另外，本领域已知人中可能存在源自某些ABD的C-末端序列的免疫原性。因此，一般而言，特别是当构建体的C-末端终止于sdABD(例如，许多构建体的sdABD-HSA结构域)时，可使用组氨酸标签(His6或His10)。出于纯化原因，本文的许多或大多数序列使用His6 C-末端标签性成，但是这些序列也可用于降低人中的免疫原性，如Holland等人，DOI10.1007/s10875-013-9915-0和WO2013/024059中所示。

A.受约束的Fv结构域

本发明提供了受约束的Fv结构域，所述受约束的Fv结构域包含活性VH和活性VL结构域，所述活性VH和活性VL结构域使用受约束的接头(如本文所概述，所述受约束的接头可以是可裂解的(形式1)或不可裂解的(形式2和4))共价附接。受约束的接头在不存在裂解的情况下防止aVH与aVL之间的分子内缔合。因此，受约束的Fv结构域一般包含可变结构域内所含的一组六个CDR，其中VH的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3结合人CD-3，并且VL的vlCDR1、vCDR2和vlCDR3结合人CD-3，但是在前药形式(例如未裂解的)中，VH和VL不能空间缔合来形成活性结合结构域，而是优选与伪Fv分子内配对。

如本文所述，受约束的Fv结构域可包含活性VH和活性VL(aVH和aVL)或无活性的VH和VL(iVH和iVL，在这种情况下，其是受约束的伪Fv结构域)或它们的组合。

如本领域技术人员将理解的，在受约束的Fv结构域中，VH和VL的顺序可以是(N-末端至C-末端)VH-接头-VL或VL-接头-VH。

如本文所概述，对于形式1构建体，受约束的Fv结构域可包含使用可裂解的接头连接的VH和VL，在诸如图5和图6中所示的那些的情况下。在此实施方案中，受约束的Fv结构域具有结构(N-末端至C-末端)vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-CCL-vlFR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4。一般而言，受约束的Fv结构域包含活性VH和VL结构域(例如，在缔合时能够结合CD3)，并且因此具有结构(N-末端至C-末端)vhFR1-avhCDR1-vhFR2-avhCDR2-vhFR3-avhCDR3-vhFR4-CCL-vlFR1-avlCDR1-vlFR2-avlCDR2-vlFR3-avlCDR3-vlFR4。

如本文所概述，对于形式2构建体，受约束的Fv结构域可包含使用不可裂解的接头连接的VH和VL。在此实施方案中，受约束的Fv结构域具有结构(N-末端至C-末端)vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-CNCL-vlFR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4。一般而言，受约束的Fv结构域包含活性VH和VL结构域(例如，在缔合时能够结合CD3)，并且因此具有结构(N-末端至C-末端)vhFR1-avhCDR1-vhFR2-avhCDR2-vhFR3-avhCDR3-vhFR4-CNCL-vlFR1-avlCDR1-vlFR2-avlCDR2-vlFR3-avlCDR3-vlFR4。

在本发明中特别有用的是受约束的不可裂解的Fv结构域，所述Fv结构域具有：具有SEQ ID NO：142的aVH、具有SEQ ID NO：126的aVL和具有SEQ ID NO：233的结构域接头。

B.受约束的伪Fv结构域

本发明提供了受约束的伪Fv结构域，所述受约束的伪Fv结构域包含使用受约束的接头(如本文所概述，所述受约束的接头可以是可裂解的或不可裂解的)共价附接的无活性或伪iVH和iVL结构域。受约束的接头在不存在裂解的情况下阻止iVH与iVL之间的分子内缔合。因此，受约束的伪Fv结构域通常包含iVH和iVL，具有允许iVH和iVL缔合的框架区(当呈非受约束的形式时)，但是所得的伪Fv结构域不结合至人蛋白质。iVH结构域可与aVL结构域组装，并且iVL结构域可与aVH结构域组装，但是所得结构不结合至CD3。

受约束的伪Fv结构域包含无活性的VH和VL(iVH和iVL)。

如本领域技术人员将理解的，在受约束的伪Fv结构域中，VH和VL的顺序可以是(N-末端至C-末端)VH-接头-VL或VL-接头-VH。

如本文所概述，受约束的伪Fv结构域可包含使用不可裂解的接头(如形式1、2和4中所示)或用可裂解的接头(如形式3中所示)连接的iVH和iVL。

一般而言，受约束的Fv结构域包含惰性VH和VL结构域(例如，在缔合时能够结合CD3)，并且因此具有结构(N-末端至C-末端)vhFR1-ivlCDR1-vhFR2-ivlCDR2-vhFR3-ivlCDR3-vhFR4-CNCL-vlFR1-ivhCDR1-vlFR2-ivhCDR2-vlFR3-ivhCDR3-vlFR4。

在本发明中特别有用的是受约束的不可裂解的伪Fv结构域，所述伪Fv结构域具有：具有SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：150或SEQ ID NO：154的iVH、具有SEQ ID NO：130、SEQID NO：134或SEQ ID NO：138的iVL和具有SEQ ID NO：233的结构域接头。

III.本发明的形式

如本文所论述，本发明的前药构建体可采取多种不同形式，包括具有双TTA结合结构域的可裂解形式、具有双TTA结合结构域的不可裂解形式(其中的任一者均可具有相同的TTA结合结构域或不同的结合结构域)，以及具有单个靶向结构域的不可裂解的形式。

A.具有双重靶向的可裂解形式

本发明在图1中提供了“形式1”类型的非异构化可裂解形式。在此实施方案中，受约束的Fv结构域包含使用受约束的可裂解的接头连接的VH和VL结构域，并且受约束的伪Fv结构域使用受约束的不可裂解的接头。为便于讨论，本文将这两者都称为“受约束的”，但如上文所论述并在图37、图38和图39中所示，这些中的仅一个需要受约束，尽管通常，当两个接头都受约束时，蛋白质具有更好的表达。

形式1(以及其他形式)的所有构建体还具有被人肿瘤蛋白酶裂解的可裂解的接头(CL)。

本发明提供了前药蛋白，所述前药蛋白从N-末端至C-末端包含(sdABD-TTA1)-结构域接头-受约束的Fv结构域-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-受约束的伪Fv结构域-结构域接头-sdABD-HSA。

如本领域技术人员将理解的，在受约束的Fv结构域或受约束的伪Fv结构域中，VH和VL的顺序可以是(N-末端至C-末端)VH-接头-VL或VL-接头-VH。

因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。

因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVH-CCL-iVL-结构域接头-sdABD-HSA。

因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVL-CCL-aVH-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。

因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVL-CCL-aVH-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVH-CCL-iVL-结构域接头-sdABD-HSA。

在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-NCL-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH和iVL具有图5中所示的序列。

在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至同一TTA，所述TTA可以是EGFR、EpCAM、FOLR1、Trop2、CA9或B7H3，所述TTA的序列描绘于图5中。

在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至不同的TTA。

在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EGFR和EpCAM，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。

在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EGFR和FOLR1，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。

在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EGFR和B7H3，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。

在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EpCAM和FOLR1，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。

在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EpCAM和B7H3，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。

在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至B7H3和FOLR1，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。

在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至同一TTA，所述TTA可以是EGFR、FOLR1、B7H3、Trop2、CA9或EpCAM，所述TTA的序列描绘于图5中，并且CCL和CL选自被MMP9或meprin裂解的接头，并且sdABD(1/2)具有SEQ ID NO：117或SEQ IDNO：121。

在形式1中，优选的结构域接头是SEQ ID NO：233(其还用作优选的受约束的不可裂解的接头)。

在形式1中，优选的构建体是Pro140和Pro140b。

B.不可裂解的形式

如图2中所示，本发明提供了非异构化不可裂解的形式。在此实施方案中，应理解，“不可裂解的”仅适用于受约束的Fv结构域的键联，因为前药构建体中存在活化裂解位点。在此实施方案中，受约束的Fv结构域包含使用受约束的不可裂解的接头连接的VH和VL结构域，并且受约束的伪Fv结构域使用受约束的不可裂解的接头。

本发明提供了前药蛋白，所述前药蛋白从N-末端至C-末端包含sdABD(TTA1)-结构域接头-受约束的Fv结构域-结构域接头-sdABD(TTA2)-可裂解的接头-受约束的伪Fv结构域-结构域接头-sdABD-HSA。

因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。

因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVH-CNCL-iVL-结构域接头-sdABD-HSA。

因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVL-CNCL-aVH-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。

因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVL-CNCL-aVH-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVH-CNCL-iVL-结构域接头-sdABD-HSA。

在一些实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至同一TTA，所述TTA可以是EGFR、EpCAM、FOLR1、Trop2、CA9或B7H3，所述TTA的序列描绘于图5中。

在一些实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至不同的TTA。

在一些实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EGFR和EpCAM，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。在此实施方案中，EGFR和EpCAM的优选组合包括：

交叉	EGFR2	EGFR2a	EGFR2d
				EpCAM h13	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向
EpCAM h23	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向
				EpCAM hVIB665	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向
EpCAM hVIB666	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向

在这种情况下，“任一取向”是指EpCAM sdABD位于本发明的构建体中EGFR sdABD的N-末端或它的C-末端。

在一些实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EGFR和FOLR1，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。在此实施方案中，EGFR和FOLR1的优选组合包括：

交叉	EGFR2	EGFR2a	EGFR2d
				FOLR1h77-2	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向
FOLR1 h59.3	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向
				FOLR h22-4	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向

在这种情况下，“任一取向”是指FOLR1 sdABD位于本发明的构建体中EGFR sdABD的N-末端或它的C-末端。

在一些实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EGFR和B7H3，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。在此实施方案中，EGFR和B7H3的优选组合包括：

交叉	EGFR2	EGFR2a	EGFR2d
				B7H3 hF7	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向
B7H3 hF12	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向
				B7H3 hF12(N57Q)	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向
B7H3 hF12(N57E)	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向
				B7H3 hF12(N57D)	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向
B7H3 hF12(S59A)	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向
				B7H3 hF12(S59Y)	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向

在这种情况下，“任一取向”是指B7H3 sdABD位于本发明的构建体中EGFR sdABD的N-末端或它的C-末端。

在一些实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EpCAM和FOLR1，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。在此实施方案中，EpCAM和FOLR1的优选组合包括：

交叉	FOLR1h77-2	FOLR1 h59.3	FOLR h22-4
				EpCAM h13	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向
EpCAM h23	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向
				EpCAM hVIB665	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向
EpCAM hVIB666	呈任一取向	呈任一取向	呈任一取向

在这种情况下，“任一取向”是指EpCAM sdABD位于本发明的构建体中FOLR1 sdABD的N-末端或它的C-末端。

在一些实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EpCAM和B7H3，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。在此实施方案中，EpCAM和B7H3的优选组合包括：

在一些实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至FOLR1和B7H3，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。在此实施方案中，FOLR1和B7H3的优选组合包括：

在这种情况下，“任一取向”是指B7H3 sdABD位于本发明的构建体中FOLR1sdABD的N-末端或它的C-末端。

在一些实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至同一TTA，所述TTA可以是EGFR、FOLR1、B7H3、CA9、Trop2或EpCAM，所述TTA的序列描绘于图5中，并且CCL和CL选自被MMP9或meprin裂解的接头，并且sdABD(1/2)具有SEQ IDNO：117。

在形式2中，优选的结构域接头是SEQ ID NO：233(其还用作优选的受约束的不可裂解的接头)。

在形式2中，优选的双重靶向构建体(本文有时称为“异-COBRA”)包括靶向EGFR和EpCAM、EGFR和Trop2、EGFR和FOLR1、EGF和B7H3、EpCAM和Trop2、EpCAM和FOLR1、EpCAM和B7H3、Trop2和FOLR1、Trop2和B7H3以及FOLR1和B7H3的组合，如下文更全面地描述。

在形式2中，具体使用的实施方案包括但不限于Pro186、Pro225、Pro226、Pro233、Pro262、Pro311、Pro312、Pro313、Pro356、Pro359、Pro364、Pro388、Pro448、Pro449、Pro450、Pro451、Pro495、Pro246、Pro254、Pro255、Pro256、Pro420、Pro421、Pro432、Pro479、Pro480、Pro187、Pro221、Pro222、Pro223、Pro224、Pro393、Pro394、Pro395、Pro396、Pro429、Pro430、Pro431、Pro601、Pro602、V3和V4、Pro664、Pro665、Pro667、Pro694、Pro695、Pro565、Pro566、Pro567、Pro727、Pro728、Pro729、Pro730、Pro731、Pro676、Pro677、Pro678、Pro679、Pro808、Pro819、Pro621、Pro622、Pro640、Pro641、Pro642、Pro643、Pro744、Pro746、Pro638、Pro639、Pro396、Pro476、Pro706、Pro709、Pro470、Pro471、Pro551、Pro552、Pro623、Pro624、Pro698、Pro655、Pro656、Pro657、Pro658、Pro516、Pro517、Pro518和Pro519。

C.单一TTA构建体

如图4中所示，“形式4”构建体也包括在本发明的组合物中，其类似于形式2构建体，但是没有第二TTA ABD。在此实施方案中，应理解，“不可裂解的”仅适用于受约束的Fv结构域的键联，因为前药构建体中存在活化裂解位点。在此实施方案中，受约束的Fv结构域包含使用受约束的不可裂解的接头连接的VH和VL结构域，并且受约束的伪Fv结构域使用受约束的不可裂解的接头。

本发明提供了前药蛋白，所述前药蛋白从N-末端至C-末端包含sdABD(TTA)-结构域接头-受约束的Fv结构域-可裂解的接头-sdABD-HSA-受约束的伪Fv结构域。(注意，对于这种形式的所有构建体，sdABD-HSA通常都没有His6标签，但是可包含His6标签)。

因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-CL-(sdABD-HSA)-结构域接头-iVL-CNCL-iVH。

因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-CL-(sdABD-HSA)-结构域接头-iVH-CNCL-iVL。

因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA)-结构域接头-aVL-CNCL-aVH-CL-(sdABD-HSA)-结构域接头-iVH-CNCL-iVL。

因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA)-结构域接头-aVL-CNCL-aVH-CL-(sdABD-HSA)-结构域接头-iVL-CNCL-iVH。

因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N-末端至C-末端包含：(sdABD-TTA)-结构域接头-aVL-CNCL-aVH-CL-(sdABD-HSA)-结构域接头-iVL-CNCL-iVH。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有图5中所示的序列。在此实施方案中，靶向结构域结合至TTA，所述TTA可以是EGFR、EpCAM、FOLR1、Trop2、CA9或B7H3，所述TTA的序列描绘于图5中。

在形式4中，优选的结构域接头是SEQ ID NO：233(其还用作优选的受约束的不可裂解的接头)。

在形式4中，优选的sdABD-HSA是SEQ ID NO：121或117的sdABD-HSA。

D.两种蛋白质组合物

在一些实施方案中，本发明的组合物包含两个不同的分子，有时称为“半-COBRA^TM”或“半-构建体”，在不存在裂解的情况下，所述两个不同的分子分子内缔合以形成伪Fv。在蛋白酶存在下，裂解位点被裂解，从而释放惰性可变结构域，并且蛋白质对然后形成与CD3的活性抗原结合结构域，如总体上描绘于图3中。

在半-构建体的设计中重要的是，裂解后活性可变结构域和sdABD-TTA保持在一起，以使得两个裂解的部分通过肿瘤表面上的肿瘤抗原受体保持在一起，并且然后可形成活性抗CD3结合结构域。

存在两种不同的通用形式3构建体，其中所述对中的每个成员具有单一sdABD-TTA的那些(图3A)以及具有两个不同sdABD-TTA、各自针对不同的TTA的那些(图3B)。

1.具有单个TTA结合结构域的半-COBRA^TM构建体(形式3A)

在一些实施方案中，第一半-COBRA^TM从N-末端至C-末端具有sdABD(TTA1)结构域接头-aVH-CL-iVL结构域接头-sdABD(1/2)，并且第二具有sdABD(1/2)-结构域接头-iVH-CL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL和sdABD(1/2)具有图5中所示的序列，并且sdABD-TTAa结合至人EGFR、EpCAM、Trop2、CA9FOLR1和/或B7H3，并且具有图5中描绘的序列。

2.具有双重TTA ABD的半-COBRA^TM构建体

在一些实施方案中，配对的前药构建体每个构建体可具有两个sdABD-TTA结合结构域，如图3B中所示。在此实施方案中，所述对的第一成员从N-末端至C-末端包含sdABD-TTA1-结构域接头-sdABD-TTA2-结构域接头-aVH-CL-iVL-结构域接头-sdABD(HAS)，并且第二成员从N-末端至C-末端包含sdABD-TTA1-结构域接头-sdABD-TTA2-aVL-CL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。

所述对的每个成员上的两个sdABD-TTA不同，但通常两个成员(半-COBRA^TM)均具有相同的两个sdABD-TTA，例如均具有EGFR和FOLR1或EGFR和B7H3等。

在一些实施方案中，两个sdABD-TTA选自图5中所示的sdABD-TTA。

IV.制备本发明的组合物的方法

如本领域技术人员通常所理解的并且在下文所概述制备本发明的前药组合物。

本发明提供了编码本发明的前药组合物的核酸组合物。如本领域技术人员将理解的，所述核酸组合物将取决于前药多肽的形式。因此，例如，当所述形式需要两个氨基酸序列，如“形式3”构建体时，可将两个核酸序列并入一个或多个表达载体中用于表达。类似地，作为单个多肽(形式1、2和4)的前药构建体需要单个表达载体中的单一核酸来产生。

如本领域中已知的，编码本发明的组分的核酸可如本领域中所已知并入表达载体中，并且取决于用于产生本发明的前药组合物的宿主细胞。一般而言，核酸可操作地连接至任何数量的调控元件(启动子、复制起点、选择性标记物、核糖体结合位点、诱导物等)。表达载体可以是染色体外或整合载体。

然后将本发明的核酸和/或表达载体转化到本领域众所周知的任何数量的不同类型的宿主细胞中，包括哺乳动物、细菌、酵母、昆虫和/或真菌细胞，其中哺乳动物细胞(例如CHO细胞，293细胞)可用于许多实施方案中。

如本领域所熟知，通过培养包含表达载体的宿主细胞来制备本发明的前药组合物。一旦产生，就进行传统的抗体纯化步骤，包括蛋白A亲和色谱步骤和/或离子交换色谱步骤。

V.本发明的前药组合物的配制和施用

通过将具有所需纯度程度的前药(在形式1、2和4的情况下单一蛋白质，并且在形式3的情况下两种蛋白质)与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(如总体上概述于Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.[1980])混合来制备根据本发明使用的前药组合物的制剂用于储存，呈冻干制剂或水溶液的形式。

本发明的前药组合物根据已知方法施用至受试者，所述已知方法如作为大丸剂或通过在一段时间内连续输注静脉内施用。

本发明的前药组合物可用于治疗癌症。

实施例

A.实施例1：Pro构建体的构建和纯化

转染

从单独表达载体(pcdna3.4衍生物)表达每种蛋白质(例如，形式1、2和4的单一蛋白质)或成对的构建体(形式3)。按照制造商的转染方案，将等量的编码一对半-眼镜蛇或单链构建体的质粒DNA混合并转染至Expi293细胞。转染后5天，通过离心(6000rpm x 25’)和过滤(0.2uM过滤器)收获条件培养基。通过SDS-PAGE确认蛋白质表达。纯化构建体，并且最终的缓冲液组成是：25mM柠檬酸盐、75mM精氨酸、75mM NaCl、4％蔗糖，pH 7。最终的制剂储存在-80℃。

MMP9的活化

根据以下方案活化重组人(rh)MMP9。重组人MMP-9(R&D#911-MP-010)是0.44mg/ml(4.7uM)。在DMSO中以100mM的储备液浓度制备对氨基乙酸苯汞(APMA)(Sigma)。测定缓冲液是50mM Tris pH 7.5、10mM CaCl2、150mM NaCl、0.05％Brij-35。

-用测定缓冲液将rhMMP9稀释至约100ug/ml(25ul hMMP9+75uL测定缓冲液)

-从DMSO中的100mM储备液中添加对氨基乙酸苯汞(APMA)至终浓度1mM(1uL至100uL)

-在37′C下孵育24小时

-将MMP9稀释至10ng/ul(向100ul活化溶液中添加900ul测定缓冲液)

活化的rhMMP9的浓度是约100nM。

用于TDCC测定的构建体的裂解

为了裂解构建体，向配制缓冲液(25mM柠檬酸、75mM L-精氨酸、75mM NaCl、4％蔗糖)中的1mg/ml浓度(10.5uM)的100ul蛋白质样品中供应CaCl₂至10mM。添加活化的rhMMP9至浓度20-35nM。将样品在室温下孵育过夜(16-20小时)。使用SDS PAGE(10％-20％TG，TG运行缓冲液，200v，1小时)验证裂解的完整性。样品通常98％裂解。

B.实施例2：T细胞依赖性细胞细胞毒性(TDCC)测定

使萤火虫荧光素酶转导的HT-29细胞生长至大约80％汇合，并用Versene(PBS中的0.48mM EDTA-Ca-Mg)脱离。将细胞离心并重悬于TDCC培养基(含HEPES、GlutaMax、丙酮酸钠、非必需氨基酸和β-巯基乙醇的RPMI 1640中的5％热灭活的FBS)。将纯化的人P泛-T细胞解冻，离心并重悬于TDCC培养基中。

将HT-29_Luc细胞和T细胞的共培养物添加至384孔细胞培养板中。然后将连续稀释的COBRA添加至共培养物中，并在37℃下孵育48小时。最终，将等体积的SteadyGlo荧光素酶测定试剂添加至板并孵育20分钟。在Perkin Elmer Envision上读取板，暴露时间为0.1s/孔。读取总荧光并在GraphPad Prism 7或型式8.3.1(取决于定时)上分析数据。

C.实施例3：体内过继性T细胞转移功效模型的通用方案设计

这些方案被用于图中的许多实验中。将肿瘤细胞皮下(SC)植入NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wj1/SzJ)小鼠(The Jackson Laboratory，目录号005557)的右侧腹中并使其生长直至达到平均体积为约200mm³的建立的肿瘤。在含有来自T细胞活化/扩增试剂盒(Miltenyi目录号130-091-441)的MACSiBead的G-Rex100M透气烧瓶(Wilson Wolf目录号81100S)中的T细胞培养基(X-VIVO 15[Lonza，目录号04-418Q]、5％人血清、1％青霉素/链霉素、0.01mM 2-巯基乙醇)中平行培养人T细胞约10天，并补充重组人IL-2蛋白。协调小鼠的肿瘤生长和人类T细胞活化/扩增，以使得在研究的第0天，基于肿瘤大小将小鼠随机分组(N＝6)；然后各自静脉内注射(IV)2.5x10⁶个培养的人T细胞，并且施用第一剂量的COBRA或对照分子。每3天向小鼠给予7个剂量(第0、3、6、9、12、15和18天)，且然后追踪另外2-3周，直到肿瘤体积达到＞2000mm³或终止研究。每3天测量肿瘤体积。

D.实施例4：EGFR/MMP9半-COBRA对Pro77和Pro53的体内活性。

将5 x 10⁶个LoVo细胞或5 x 10⁶个HT29细胞皮下植入NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠的右侧腹中(The Jackson Laboratory，目录号005557)，并且使其生长直至肿瘤形成。在含有来自T细胞活化/扩增试剂盒(Miltenyi目录号130-091-441)的MACSiBead的G-Rex100M透气烧瓶(Wilson Wolf目录号81100S)中的T细胞培养基(X-VIVO15[Lonza，目录号04-418Q]、5％人血清、1％青霉素/链霉素、0.01mM 2-巯基乙醇)中培养平行人T细胞10天，并补充重组人IL-2蛋白。协调小鼠的肿瘤生长和人类T细胞活化/扩增，以使得在研究的第0天，基于肿瘤大小将小鼠随机分组(N＝6)；然后各自静脉内注射(IV)2.5x10⁶个培养的人T细胞，并且施用第一剂量的COBRA或对照分子。每3天向小鼠给予7个剂量(第0、3、6、9、12、15和18天)，且然后追踪直到肿瘤体积达到＞2000mm³或终止研究。各组接受0.2mg/kg(mpk)的抗EGFR x CD3阳性对照Pro51双特异性抗体(bsAb)、0.5mpk的阴性对照抗鸡卵溶菌酶(HEL)x CD3 bsAb Pro98、各自0.5mpk的含MMP9可裂解接头的抗EGFR半-COBRA对Pro77和Pro53或各自0.5mpk的含不可裂解的(NCL)接头的抗EGFR半-COBRA对Pro74和Pro72。每3天测量肿瘤体积。

E.实施例5：EGFR/MMP9 COBRA Pro140的体内活性。

将5 x 10⁶个LoVo细胞或5 x 10⁶个HT29细胞皮下植入NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wj1/SzJ)小鼠的右侧腹中(The Jackson Laboratory，目录号005557)，并且使其生长直至肿瘤形成。在含有来自T细胞活化/扩增试剂盒(Miltenyi目录号130-091-441)的MACSiBead的G-Rex100M透气烧瓶(Wilson Wolf目录号81100S)中的T细胞培养基(X-VIVO15[Lonza，目录号04-418Q]、5％人血清、1％青霉素/链霉素、0.01mM 2-巯基乙醇)中平行培养人T细胞10天，并补充重组人IL-2蛋白。协调小鼠的肿瘤生长和人类T细胞活化/扩增，以使得在研究的第0天，基于肿瘤大小将小鼠随机分组(N＝6)；然后各自静脉内注射(IV)2.5x10⁶个培养的人T细胞，并且施用第一剂量的COBRA或对照分子。每3天向小鼠给予7个剂量(第0、3、6、9、12、15和18天)，且然后追踪直到肿瘤体积达到＞2000mm³或终止研究。各组接受0.2mpk的抗EGFR x CD3阳性对照Pro51双特异性抗体(bsAb)、0.5mpk的阴性对照抗鸡卵溶菌酶(HEL)x CD3 bsAb Pro98或0.5mpk的含MMP9可裂解接头的抗-EGFR COBRAPro140。每3天测量肿瘤体积。

F.实施例6：EGFR/MMP9 COBRA Pro186的体内活性。

将5 x 10⁶个HT29细胞皮下植入NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wj1/SzJ)小鼠(The Jackson Laboratory，目录号005557)的右侧腹中，并且使其生长直至肿瘤形成。在含有来自T细胞活化/扩增试剂盒(Miltenyi目录号130-091-441)的MACSiBead的G-Rex100M透气烧瓶(Wilson Wolf目录号81100S)中的T细胞培养基(X-VIVO 15[Lonza，目录号04-418Q]、5％人血清、1％青霉素/链霉素、0.01mM2-巯基乙醇)中平行培养人T细胞10天，并补充重组人IL-2蛋白。协调小鼠的肿瘤生长和人类T细胞活化/扩增，以使得在研究的第0天，基于肿瘤大小将小鼠随机分组(N＝6)；然后各自静脉内注射(IV)2.5x106个培养的人T细胞，并且施用第一剂量的COBRA或对照分子。每3天向小鼠给予7个剂量(第0、3、6、9、12、15和18天)，且然后追踪直到肿瘤体积达到＞2000mm³或终止研究。各组接受0.1mg/kg(mpk)的抗EGFR x CD3阳性对照Pro51双特异性抗体(bsAb)、0.3mpk的含不可裂解的(NCL)对照接头的抗EGFR COBRA Pro214、0.1或0.3mpk的含MMP9可裂解的接头的抗EGFR COBRA Pro140、或0.1或0.3mpk的含MMP9可裂解的接头的抗EGFR COBRA Pro186。每3天测量肿瘤体积。

G.实施例7：抗EGFR序列的成功人源化

下文显示结果。

这些结果表明，EGFR结合结构域的人源化是成功的，并且当分子上有两个结合位点时，对靶EGFR存在强亲合力。

实施例：EpCAM sdABD的成功人源化

下文显示结果。

这些结果表明，EpCAM结合结构域的人源化是成功的。

H.实施例8：COBRA^TM：消退小鼠体内已建立的实体瘤的新型条件活性双特异性抗体

尽管靶向血液恶性肿瘤的双特异性抗体(bsAb)(例如博纳吐单抗，一种CD19xCD3bsAb)在临床上取得了成功，但在实体瘤适应症中的功效仍然是重大挑战。由于T细胞重定向bsAb如此有效，即使正常组织上细胞表面靶抗原表达水平非常低，也可能快速成为安全隐患，并严重限制患者所能达到的剂量水平。这限制了达到有效浓度的可能性并降低了这些高活性分子的治疗潜力。此外，鉴定在肿瘤上而非正常组织上独特表达的“干净”靶抗原充其量是非常困难的。

为了克服这些挑战，开发了称为COBRA^TM(条件性双特异性重定向活化)的新型重组bsAb平台。COBRA被工程化为通过将T细胞接合集中在肿瘤微环境中而能够靶向更广泛表达和验证的肿瘤细胞表面抗原。COBRA分子被设计成与靶抗原结合，所述靶抗原可在肿瘤和正常细胞上表达，但不接合T细胞，除非暴露于蛋白水解微环境，这在肿瘤中很常见，但在正常健康组织中并不常见。一旦与肿瘤靶抗原结合，蛋白酶依赖性接头裂解允许COBRA将无活性的抗CD3 scFv转化为活性CD3 scFv结合结构域。转化后，COBRA然后能够同时共同接合T细胞和靶抗原，从而产生针对肿瘤细胞的有效溶细胞性T细胞应答。此外，COBRA设计有半衰期延长部分，所述半衰期延长部分在蛋白水解裂解后从活性分子中除去。这允许在肿瘤靶标结合之前持续存在于无活性COBRA的循环中，并更快速地清除未结合的活性COBRA分子，从而降低正常组织中细胞毒性活性的可能性。

在此，揭示了COBRA分子的新设计，并且证明其接合CD3和表皮生长因子受体(EGFR)以在T细胞培养物和人T细胞植入的荷瘤小鼠中引发有效细胞毒活性的能力。已经报告了体外低至亚皮摩尔的T细胞活化和细胞毒性，以及COBRA接头裂解依赖性T细胞介导的体内NSG小鼠中已建立的实体瘤异种移植物的消退。

图64A-64C示出COBRA设计和预测的折叠机制。图64A描绘PRO186 COBRA的示意图。图64B示出预测的COBRA折叠。COBRA包含与抗CD3VH和VL结构域配对的无活性的VH和VL。未裂解的PRO186 COBRA结合EGFR，CD3结合受损，并结合血清白蛋白。图64C示出PRO186的分析型尺寸排阻色谱图。数据表明未裂解的PRO186折叠成单一结构。

图65A-图65C描绘本文所述的构建体的示例性实施方案，包括PRO186(预先裂解的PRO186)、PRO186裂解产物和PRO186活性二聚体。一种裂解产物包含抗CD3VH和VL结构域，并且它结合EGFR并具有受损的CD3结合。另一种裂解产物包含抗CD3无活性的VH和VL结构域并结合血清白蛋白。活性PRO186二聚体包括活性抗CD3激动剂(抗CD3VH和VL的二聚体)并结合CD3和EGFR。

图66提供在蛋白酶裂解后COBRA转化为活性二聚体的说明。

图67A-图67B提供COBRA结合的表征。图67A示出对人、食蟹猴和小鼠制品的结合活性。图67B示出PRO186与人CD3ε的结合；人CD3ε的活性PRO186结合和人EGFR的活性PRO186结合。结合动力学通过Octet(Forte Bi)与EGFR(Acro Biosystems)、血清白蛋白(AthensResearch Technology)和CD3ε(Creative Biomart)评估。

图70示出在三种肿瘤细胞系-LoVo(结肠直肠癌(CRC)细胞系)、HT-29(结肠直肠癌(CRC)细胞系)和SCC25(头颈癌细胞系)中相对于活性的EGFR表达。对于体外EGFR表达，使用1∶1 PE标记的抗EGFR mAb#EGFR.1和BD QuantiBrite Bead测量结合的抗体/细胞。对于体内EGFR表达，使用抗EGFR mAb#WP84和MACH4-HRP检测(Ensigna)进行IHC染色。对于T细胞杀伤测定，将表达荧光素酶的肿瘤细胞与人T细胞以10∶1的E∶T共培养48小时，并通过Steady-Glo(Promega)进行测量。对于IFNγ释放测定，在24小时在E∶T 10∶1下使用Meso ScaleDiscovery V-Pex测量IFNγ。

图72提供在荷瘤小鼠中过继性人T细胞转移模型的实验程序的示意图。所述实验用于测量体内抗肿瘤功效和药代动力学(PK)。所述程序包括(1)在NSG小鼠的右侧腹中皮下植入肿瘤，(2)允许形成已建立的肿瘤，如约200mm3的肿瘤，(3)从第0天开始向小鼠给予q3dx7，(4)在第18天施用最后一个剂量，和(5)终止研究。所述程序还包括以下，其与体内实验同时进行：(a)活化和扩增培养中人T细胞10天，以使得扩增在与植入肿瘤相同的时间过程开始，以及(b)在第0天收获T细胞。

结论：设计了多价sdAb-双抗体融合物，其在蛋白水解作用下转化为高效双特异性重定向T细胞治疗剂。体外测定表明蛋白酶依赖性接头裂解将T细胞介导的杀伤效力提高200倍，从而产生具有亚皮摩尔效力的治疗剂。在具有已建立的异种移植物的小鼠中施用PRO186(Pro186)导致多种肿瘤模型中蛋白酶裂解依赖性T细胞介导的肿瘤消退。PRO186展示(1)施用后体内半衰期延长和(2)蛋白水解激活后快速清除，从而证明PRO186是优于常规T细胞重定向双特异性药物的改进的安全性特征的治疗方法。

Claims

1.一种融合蛋白，所述融合蛋白从N-末端至C-末端包含：

a)第一sdABD-TTA；

b)第一结构域接头；

c)受约束的Fv结构域，所述受约束的Fv结构域包含：

i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重结构域；

ii)受约束的不可裂解的接头(CNCL)；以及

iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻结构域；

d)第二结构域接头；

e)第二sdABD-TTA；

f)可裂解的接头(CL)；

g)受约束的伪Fv结构域，所述受约束的伪Fv结构域包含：

i)第一伪轻可变结构域；

ii)不可裂解的接头(NCL)；以及

iii)第一伪重可变结构域；

h)第三结构域接头；以及

i)结合至人血清白蛋白的第三sdABD；

其中所述第一可变重结构域和所述第一可变轻结构域能够结合人CD3，但所述受约束的Fv结构域不结合CD3；

所述第一可变重结构域和所述第一伪可变轻结构域分子间缔合以形成无活性的Fv；

所述第一可变轻结构域和所述第一伪可变重结构域分子内缔合以形成无活性的Fv；以及

其中所述sdABD-TTA中的至少一者是具有选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：57的序列的sdABD-B7H3。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，所述融合蛋白是Pro664并且具有SEQ ID NO：282。

3.一种融合蛋白，所述融合蛋白从N-末端至C-末端包含：

a)结合至人肿瘤靶抗原(TTA)的第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)(sdABD-TTA)；

b)第一结构域接头；

c)受约束的Fv结构域，所述受约束的Fv结构域包含：

i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重结构域；

ii)受约束的不可裂解的接头(CNCL)；以及

iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻结构域；

d)第二结构域接头；

e)第二sdABD-TTA；

f)可裂解的接头(CL)；

g)受约束的伪Fv结构域，所述受约束的伪Fv结构域包含：

i)第一伪轻可变结构域；

ii)不可裂解的接头(NCL)；以及

iii)第一伪重可变结构域；

h)第三结构域接头；以及

i)结合至人血清白蛋白的第三sdABD；

其中所述sdABD-TTA中的至少一者是具有选自SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：73的序列的sdABD-EpCAM。

4.一种融合蛋白，所述融合蛋白从N-末端至C-末端包含：

a)第一sdABD-TTA；

b)第一结构域接头；

c)受约束的Fv结构域，所述受约束的Fv结构域包含：

i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重结构域；

ii)受约束的不可裂解的接头(CNCL)；以及

iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻结构域；

d)第二结构域接头；

e)第二sdABD-TTA；

f)可裂解的接头(CL)；

g)受约束的伪Fv结构域，所述受约束的伪Fv结构域包含：

i)第一伪轻可变结构域；

ii)不可裂解的接头(NCL)；以及

iii)第一伪重可变结构域；

h)第三结构域接头；以及

i)结合至人血清白蛋白的第三sdABD；

其中所述sdABD-TTA中的至少一者是具有选自SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：81、SEQ IDNO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：97的序列的sdABD-Trop2。

5.一种融合蛋白，所述融合蛋白从N-末端至C-末端包含：

a)第一sdABD-TTA；

b)第一结构域接头；

c)受约束的Fv结构域，所述受约束的Fv结构域包含：

i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重结构域；

ii)受约束的不可裂解的接头(CNCL)；以及

iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻结构域；

d)第二结构域接头；

e)第二sdABD-TTA；

f)可裂解的接头(CL)；

g)受约束的伪Fv结构域，所述受约束的伪Fv结构域包含：

i)第一伪轻可变结构域；

ii)不可裂解的接头(NCL)；以及

iii)第一伪重可变结构域；

h)第三结构域接头；以及

i)结合至人血清白蛋白的第三sdABD；

所述第一可变重结构域和所述第一伪可变轻结构域分子内缔合以形成无活性的Fv；并且

所述第一可变轻结构域和所述第一伪可变重结构域分子内缔合以形成无活性的Fv。

其中所述sdABD-TTA中的至少一者是具有选自SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ IDNO：109和SEQ ID NO：113的序列的sdABD-CA9。

6.根据权利要求1和3至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一可变重结构域位于所述第一可变轻结构域的N-末端，并且所述伪轻可变结构域位于所述伪可变重结构域的N-末端。

7.根据权利要求1和3至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一可变重结构域位于所述第一可变轻结构域的N-末端，并且所述伪可变重结构域位于所述伪可变轻结构域的N-末端。

8.根据权利要求1和3至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一可变轻结构域位于所述第一可变重结构域的N-末端，并且所述伪轻可变结构域位于所述伪可变重结构域的N-末端。

9.根据权利要求1和3至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一可变轻结构域位于所述第一可变重结构域的N-末端，并且所述伪可变重结构域位于所述伪可变轻结构域的N-末端。

10.根据权利要求1和3至9中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一和第二TTA是相同的。

11.根据权利要求1和3至9中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一和第二TTA是不同的。

12.根据权利要求1和3至11中任一项所述的融合蛋白，其中所述半衰期延长结构域具有SEQ ID NO：117。

13.根据权利要求1和3至12中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白具有选自由以下组成的组的序列：Pro601 Pro602、V3和V4、Pro665、Pro666、Pro667、Pro694、Pro695、Pro565、Pro566、Pro567、Pro727-731、Pro676-679、Pro808、Pro819、Pro621、Pro622、Pro640-643、Pro744、Pro746、Pro638、Pro639、Pro396、Pro476、Pro706、Pro709、Pro470、Pro471、Pro551、Pro552、Pro623、Pro624、Pro698、Pro655、Pro656、Pro657、Pro658、Pro516、Pro517、Pro518和Pro519。

14.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白。

15.一种表达载体，所述表达载体包含如权利要求14所述的核酸。

16.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求15所述的表达载体。

17.一种制备融合蛋白的方法，所述方法包括其中在表达所述蛋白质的条件下培养如权利要求16所述的宿主细胞以及回收所述融合蛋白。

18.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用如权利要求1至13中任一项所述的蛋白质。

19.一种结合人Trop2的单结构域抗原结合结构域，其具有选自SEQ ID NO：77、SEQ IDNO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：93的序列。

20.一种结合人B7H3的单结构域抗原结合结构域，其具有选自SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：57的序列。

21.一种结合人CA9的单结构域抗原结合结构域，其具有选自SEQ ID NO：101、SEQ IDNO：105、SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：113的序列。

22.一种结合人EpCAM的单结构域抗原结合结构域，其具有选自SEQ ID NO：69和SEQ IDNO：73的序列。