CN116261469A - 包含含有vhh的adc或aoc和皂苷或配体-皂苷缀合物的组合 - Google Patents

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盖伊·赫尔曼斯
亨德里克·福斯
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Saprami Technology Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种药物组合，其包含：第一缀合物，该第一缀合物包含至少一个效应分子和用于结合第一细胞表面分子的单结构域抗体(sdAb)；并且包含皂苷、其衍生物，或第二缀合物，该第二缀合物包含用于结合第二细胞表面分子的结合分子和该皂苷和/或其衍生物，其中该皂苷或其衍生物是单糖链或双糖链三萜糖苷。本发明还涉及包含该第一缀合物和该皂苷(衍生物)或含有该皂苷(衍生物)的第二缀合物的组合物。此外，本发明涉及本发明的药物组合或组合物，其用作药物并用于治疗或预防癌症、自身免疫疾病例如类风湿性关节炎、酶缺乏、基因缺陷、与基因缺陷相关的疾病、淀粉样变性病、与酶缺乏相关的疾病、感染例如病毒感染、高胆固醇血症、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、α‑1抗胰蛋白酶相关的肝病、急性肝卟啉病、甲状腺素转运蛋白介导的淀粉样变性病。此外，本发明涉及一种体外或离体方法，用于将本发明的第一缀合物从细胞的外部转移至所述细胞内，优选转移至所述细胞的胞质溶胶。

Description

包含含有VHH的ADC或AOC和皂苷或配体-皂苷缀合物的组合
技术领域
本发明涉及一种药物组合，其包含：第一缀合物，该第一缀合物包含至少一个效应分子和用于结合第一细胞表面分子的单结构域抗体(sdAb)；并且包含皂苷、其衍生物，或第二缀合物，该第二缀合物包含用于结合第二细胞表面分子的结合分子和皂苷和/或其衍生物，其中该皂苷或其衍生物是单糖链或双糖链三萜糖苷。本发明还涉及包含第一缀合物和皂苷(衍生物)的组合物，或者涉及包含第一缀合物和含有皂苷(衍生物)的第二缀合物的组合物。此外，本发明涉及本发明的药物组合或组合物，其用作药物并用于治疗或预防癌症、自身免疫疾病例如类风湿性关节炎、酶缺乏、基因缺陷、与基因缺陷相关的疾病、淀粉样变性病、与酶缺乏相关的疾病、感染例如病毒感染、高胆固醇血症、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、α-1抗胰蛋白酶相关的肝病、急性肝卟啉病、甲状腺素转运蛋白介导的淀粉样变性病。此外，本发明涉及一种体外或离体方法，用于将本发明的第一缀合物从细胞的外部转移至所述细胞内，优选转移至所述细胞的胞质溶胶。本发明还涉及一种体外或离体方法，用于将本发明的第一缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内，以及一旦第一缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内，例如在所述细胞的内体、内溶酶体或溶酶体内，则使第一缀合物包含的效应分子转移到所述细胞的胞质溶胶中。
背景技术
具有治疗生物活性的分子在理论上在许多情况下适合作为有效的治疗药物应用，用于治疗有需要的人类患者的疾病例如癌症。典型的实例是小分子生物活性部分。然而，即使不是全部，也有许多目前在临床中使用的潜在药物样分子和疗法至少存在众多缺点和缺陷中的一个。当施用给人体时，除了针对待治疗疾病或健康问题的潜在方面的生物活性之外，治疗活性分子还可以发挥脱靶效应。这种脱靶效应是不希望出现的，并且存在诱发所施用分子的危及健康副作用甚至危及生命的副作用的风险。正是此类不良事件的发生导致许多药物样化合物和治疗性部分未能通过III期临床试验甚至IV期临床试验(上市后跟踪)。因此，强烈希望提供药物分子，例如小分子治疗剂，其中药物分子的治疗效果应该例如(1)对引起疾病的生物因子或生物过程高度特异，(2)足够安全，(3)足够有效，(4)充分针对患病细胞，对非患病细胞几乎没有或没有脱靶活性，(5)具有足够及时的作用模式(例如，所施用的药物分子应当在一定的时间范围内到达人患者中的靶向位点，并且应当在靶向位点保持一定的时间范围)，和/或(6)在患者体内具有足够长的持续治疗活性，等等。不幸的是，迄今为止，尽管已经进行了长期深入的研究，并且尽管在个别解决遇到的困难和缺点的几个领域中取得了令人印象深刻的进展，但是对于患者来说，仍然不能获得具有上述许多甚至所有有益特征的“理想”疗法。
化疗是癌症治疗最重要的治疗选择之一。然而，它通常与低的治疗窗有关，因为它相比于健康组织中的分裂细胞对癌细胞没有特异性。单克隆抗体的发明提供了利用其特异性结合特性作为将细胞毒剂靶向递送至癌细胞的机制同时不伤害正常细胞的可能性。这可以通过细胞毒性效应子(也称为载荷或弹头)与抗体的化学缀合来实现，以产生抗体-药物缀合物(ADC)。通常，使用非常有效的载荷，例如厄塔毒素(emtansine)(DM1)，其未缀合形式的治疗指数(毒性剂量与有效剂量的比率)有限。DM1与曲妥珠单抗(曲妥珠单抗-厄塔毒素(ado-trastuzumab emtansine))(也称为Kadcycla)的缀合可将猴中DM1的耐受剂量提高至少两倍。在过去的几十年里，人们为开发治疗性ADC付出了巨大的努力和投资。然而，尽管临床前数据很有希望，但将ADC带入临床仍然具有挑战性。第一个获批用于临床的ADC是2000年用于复发性急性髓性白血病(AML)的吉妥珠单抗-奥加米星(gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg，靶向CD33，辉瑞公司(Pfizer)/惠氏公司(Wyeth))。然而，Mylotarg应联邦药物管理局(FDA)的要求退出市场，原因是存在诸多问题，包括其安全性。接受Mylotarg治疗的患者比接受常规化疗的患者更容易死亡。Mylotarg于2017年在较低的推荐剂量、与化疗组合或单独使用的不同时间表以及新的患者群体情况下再次进入市场。迄今为止，只有五种ADC被批准用于临床，同时大约有五十五种ADC的临床开发已经停止。然而，人们的兴趣仍然很高，目前大约有八十种ADC仍在近六百项临床试验中进行临床开发。
尽管有可能使用患者通常不能耐受的毒性载荷，但低治疗指数(毒性剂量比有效剂量的比率)是许多ADC在临床开发中中止的主要问题，这可能由几种机制引起，如对正常细胞的脱靶毒性、对细胞毒性剂的抗性发展和循环中药物的过早释放。FDA对ADC进行的系统审查发现，大多数ADC的毒性特征可以根据使用的载荷进行分类，而不是根据使用的抗体进行分类，这表明毒性主要是由载荷的过早释放决定的。在大约五十五种中止的ADC中，估计至少有二十三种是由于治疗指数不佳。例如，特斯瑞曲妥珠单抗(trastuzumabtesirine)缀合物(ADCT-502，HER-2靶向，ADC疗法)的开发最近由于治疗指数窄而中止，这可能是由于表达相当高水平HER-2的肺组织中的中靶、脱组织效应。此外，由于缺少主要终点，3期试验中的几个ADC已经中止。例如，在新诊断的胶质母细胞瘤患者中测试的迪妥昔珠单抗-玛汀(depatuxizumab mafodotin)缀合物(ABT-414，EGFR靶向，艾伯维公司(AbbVie))和在铂耐药卵巢癌患者中测试的米妥昔单抗-索星(mirvetuximab soravtansine)缀合物(IMGN853，叶酸受体α(FRα)靶向，免疫原公司(ImmunoGen))的3期试验最近被停止，显示无存活益处。需要注意的是，一些ADC的临床使用剂量可能不足以发挥其全部抗癌活性。例如，曲妥珠单抗-厄塔毒素在人中的MTD为3.6mg/kg。在乳腺癌的临床前模型中，曲妥珠单抗-厄塔毒素在3mg/kg或更高的剂量水平下诱导肿瘤消退，但在15mg/kg时观察到更有效的功效。这表明在临床施用剂量下，曲妥珠单抗-厄塔毒素可能无法发挥其最大的潜在抗肿瘤作用。
ADC主要由抗体、细胞毒性部分(如载荷)和接头构成。针对ADC的每个组分，在新ADC的设计和开发中已经提出并实施了几种新策略以克服现有问题。例如，通过鉴定和验证抗体组分的足够抗原靶标，通过选择在肿瘤中具有高表达水平而在正常组织中表达很少或没有表达的抗原，存在于细胞表面上可被循环的ADC接近的抗原，以及允许ADC在结合后内化进入细胞的抗原；和替代活动机制；设计和优化接头，以提高ADC的溶解度和药物-比-抗体比率(DAR)，并克服由可将化疗药物转运出细胞的蛋白质引起的抗性；通过包含更多载荷来提高DAR比率，选择和优化抗体以提高抗体同质性和可开发性。除了ADC的技术发展，新的临床和转化策略也正在部署以最大化治疗指数，例如，通过分次给药改变给药方案；进行生物分布研究；包括生物标志物以优化患者选择，及早捕获反应信号并监测反应的持续时间和深度，并为联合研究提供信息。
具有临床潜力的ADC的实例是那些ADC，例如布仑妥昔单抗-维多汀(brentuximabvedotin)、艾诺妥珠单抗-奥加米星(inotuzumab ozogamicin)、莫塞妥莫单抗-帕舒托(moxetumomab pasudotox)、和珀拉妥珠单抗-维多汀(polatuzumab vedotin)，它们被评估为淋巴恶性肿瘤和多发性骨髓瘤的治疗选择。结合(恶性)B细胞上的CD79b的珀拉妥珠单抗-维多汀和结合CD22的匹那妥珠单抗-维多汀(pinatuzumab vedotin)在临床试验中进行了测试，其中每种ADC均与共同施用的利妥昔单抗(一种结合CD20且不具有载荷的单克隆抗体)组合[B.Yu和D.Liu,Antibody-drug conjugates in clinical trials for lymphoidmalignancies and multiple myeloma[淋巴恶性肿瘤和多发性骨髓瘤临床试验中的抗体-药物缀合物]；Journal of Hematology&Oncology[血液学与肿瘤学杂志](2019)12:94]。诸如这些实例的单克隆抗体的组合是进一步的方法，并试图达到组合许多甚至所有上述ADC所期望特性的“灵丹妙药”。
同时，在过去的几十年中，基于核酸的疗法正在开发中。治疗性核酸可基于脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、反义寡核苷酸(ASO、AON)和短干扰RNA(siRNA)、微小RNA以及DNA和RNA适体，用于方法例如基因疗法，RNA干扰(RNAi)。它们中的许多通过抑制DNA或RNA表达来共享相同的基本作用基础，从而防止与疾病相关的异常蛋白质的表达。基因疗法领域正在进行的临床试验数量最多，全球有近2600项正在进行或已完成的临床试验，但只有约4％进入3期。随后是ASO的临床试验。与ADC类似，尽管正在探索大量技术，但治疗性核酸在临床开发过程中存在两个主要问题：递送至细胞和脱靶效应。例如，ASO，例如肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯吗啉寡聚物(PMO)、锁核酸(LNA)和桥接核酸(BNA)，正在被研究作为一种有吸引力的策略来抑制特异性靶基因，尤其是那些难以用小分子抑制剂或中和抗体靶向的基因。目前，正在研究不同ASO在许多神经退行性疾病(例如亨廷顿病、帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症)以及几个癌症阶段中的功效。ASO作为潜在治疗剂的应用需要安全有效的方法将其递送至靶细胞和组织的细胞质和/或细胞核。尽管ASO的临床相关性已得到证实，但体外和体内低效的细胞摄取限制了ASO的功效，并成为治疗发展的障碍。细胞摄取可能小于剂量的2％，导致活性部位的ASO浓度过低，无法获得有效和持续的结局。因此，这需要增加施用剂量，从而诱导脱靶效应。最常见的副作用是补体级联的激活、凝血级联的抑制和Toll样受体介导的免疫系统刺激。
化疗药物最常见的是小分子，然而，它们的功效受到严重的脱靶副作用毒性、以及它们溶解性差、清除速度快和肿瘤暴露有限等因素的阻碍。支架-小分子药物缀合物，如聚合物-药物缀合物(PDC)是具有药理活性的大分子结构，其包含与载剂支架(例如聚乙二醇(PEG))结合的小分子药物的一个或多个分子。
这种缀合原理引起了很多关注，并且已经研究了几十年。大多数处于临床前或临床开发阶段的小分子药物缀合物用于肿瘤适应症。然而，截至目前只有一种与癌症无关的药物(Movantik，阿片类拮抗剂纳洛酮的PEG低聚物缀合物，阿斯利康公司)于2014年获批用于慢性疼痛患者中阿片类引起的便秘，这是一种非肿瘤药物适应症。迄今为止，将药物-支架缀合物的应用转化为人类受试者的治疗几乎没有取得临床成功。例如，PK1(N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物多柔比星；由法玛西亚公司(Pharmacia)、辉瑞公司开发)在鼠模型中显示出对实体瘤和白血病的强大抗癌活性，并且正在针对肿瘤适应症进行临床研究。尽管它在人中证明了非特异性毒性的显著降低和药代动力学的改善，但在患者中抗癌功效的改善却微乎其微，因此PK1的进一步开发停止了。
支架-小分子药物缀合物的失败至少部分归因于其在肿瘤部位的积聚不良。例如，虽然在鼠模型中，PK1在肿瘤中的积累比在健康组织(肝、肾、肺、脾和心脏)中高45-250倍，但在临床试验中，仅在一小部分患者中观察到肿瘤中的积累。
上述问题的潜在解决方案是应用纳米颗粒系统进行药物递送，例如脂质体。脂质体是由一个或多个磷脂双层组成的球形囊泡，当磷脂分散在水中时会自发形成球形囊泡。磷脂的两亲特性使其具有自组装、乳化和润湿特性，并且这些特性可用于新药和新药递送系统的设计。与直接施用药物相比，脂质体递送系统中的药物封装可能具有多种优势，例如改善和控制药代动力学和药效学、组织靶向特性、降低毒性和增强药物活性。这种成功的实例是小分子化疗药物多柔比星的脂质体包封形式(Doxil：多柔比星的聚乙二醇化脂质体包封形式；Myocet：非聚乙二醇化脂质体多柔比星)，其已被批准用于临床。
因此，仍然需要找到一种解决方案，以允许药物疗法(例如抗肿瘤疗法)在期望时适用于非全身性使用，其中药物具有例如可接受的安全性谱、很少的脱靶活性、足够的功效，从患者体内清除率足够低，治疗窗足够宽等。
在欧洲专利EP 1623715 B1中，描述了一种组合物，该组合物包含与靶细胞特异性结合分子偶联的药理活性剂与皂苷组合，其中靶细胞特异性结合分子是全长单克隆免疫球蛋白G型抗体。该药理活性剂例如是毒素。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种药物组合，其包含：
-第一缀合物，该第一缀合物包含至少一个效应分子和用于结合第一细胞表面分子的单结构域抗体(sdAb)，该至少一个效应分子和该单结构域抗体直接或通过接头彼此共价连接；
-皂苷和/或其衍生物和/或第二缀合物，其包含用于结合第二细胞表面分子的结合分子和皂苷和/或其衍生物，该结合分子和该皂苷或其衍生物直接或通过接头彼此共价连接，其中该皂苷或其衍生物是单糖链三萜糖苷或双糖链三萜糖苷，其中该第二细胞表面分子与该第一细胞表面分子相同或与该第一细胞表面分子不同；和任选地，
-药学可接受的赋形剂和/或药学可接受的稀释剂。
实施例是至少两个、优选两个药物组合物形式的本发明药物组合，其包含：
-第一药物组合物，其包含第一缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂；以及
-第二药物组合物，其包含皂苷和/或其衍生物和/或第二缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂。
实施例是单一药物组合物形式的本发明的药物组合，该单一药物组合物包含第一缀合物和以下中的至少一个，优选一个：
·皂苷；
·皂苷衍生物；以及
·第二缀合物，
并且任选包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂。
本发明的第二个方面涉及本发明的药物组合，其用作药物。
本发明的第三方面涉及本发明的药物组合，其用于治疗或预防癌症、自身免疫疾病例如类风湿性关节炎、酶缺乏、基因缺陷、与基因缺陷相关的疾病、淀粉样变性病、与酶缺乏相关的疾病、感染例如病毒感染、高胆固醇血症、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、α-1抗胰蛋白酶相关的肝病、急性肝卟啉病、甲状腺素转运蛋白介导的淀粉样变性病。
本发明的第四个方面涉及一种体外或离体方法，用于将本发明的第一缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内，优选转移到所述细胞的胞质溶胶，该方法包括以下步骤：
a)提供细胞，该细胞在其表面表达根据本发明的第一细胞表面分子，并任选在其表面表达根据本发明的第二细胞表面分子，所述细胞优选选自肝细胞、异常细胞如病毒感染细胞、自身免疫细胞和肿瘤细胞；
b)提供本发明的第一缀合物，用于转移到步骤a)中提供的细胞中；
c)提供本发明的皂苷或皂苷衍生物，或者，当步骤a)中提供的细胞在其表面表达根据本发明的第二细胞表面分子时，提供本发明的第二缀合物；
d)将步骤a)的细胞体外或离体与步骤b)的第一缀合物以及步骤c)的皂苷、皂苷衍生物和缀合物中的任何一个或多个接触，
由此实现第一缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内，优选转移到所述细胞的胞质溶胶中。
定义
术语“朊”具有其常规的科学含义并且在此指的是蛋白样分子，意思是该分子在某种程度上具有蛋白的物理化学性质特征，具有蛋白，与蛋白相关，包含蛋白，属于蛋白，由蛋白组成，类似蛋白，或者是蛋白。在例如“朊分子”中使用的术语“朊”是指存在至少一部分类似于或者是蛋白的分子，其中“蛋白”应理解为包括至少两个残基长的氨基酸残基链，因此包括肽、多肽和蛋白以及蛋白或蛋白结构域的组合。在朊分子中，至少两个氨基酸残基例如通过(一个或多个)酰胺键，例如(一个或多个)肽键连接。在朊分子中，氨基酸残基是天然氨基酸残基和/或人工氨基酸残基，例如经修饰的天然氨基酸残基。在优选的实施例中，朊分子是包含至少两个氨基酸残基，优选地介于两个和约2,000个之间的氨基酸残基的分子。在一个实施例中，朊分子是包含2至20个(通常对于肽而言)氨基酸的分子。在一个实施例中，朊分子是包含21至1,000个氨基酸的分子(对于多肽、蛋白、蛋白结构域，例如抗体、Fab、scFv、单结构域抗体、受体例如EGF的配体而言是典型的)。优选地，氨基酸残基(通常)通过(一个或多个)肽键连接。根据本发明，所述氨基酸残基是或包含(经修饰的)(非)天然氨基酸残基。
术语“效应分子”或“效应子部分”当指作为例如共价缀合物的一部分的效应分子时，具有其常规的科学含义，在此指分子，该分子可选择性结合例如以下任何一个或多个靶分子：蛋白质，肽，碳水化合物，糖类如聚糖，(磷)脂，核酸如DNA、RNA，酶，并调节这样一个或多个靶分子的生物活性。效应分子是例如选自小分子如药物分子、毒素如蛋白毒素、寡核苷酸如BNA、异种核酸或siRNA、酶、肽、蛋白质中的任何一个或多个或其任何组合的小分子。因此，例如，效应分子或效应子部分是例如选自小分子如药物分子、毒素如蛋白毒素、寡核苷酸如BNA、异种核酸或siRNA、酶、肽、蛋白质中的任何一个或多个或其任何组合的效应分子或部分，其可以选择性地结合以下靶分子中的任何一个或多个：蛋白质，肽，碳水化合物，糖类如聚糖，(磷)脂，核酸如DNA、RNA，酶，并且其在与靶分子结合后调节这样一个或多个靶分子的生物活性。典型地，效应分子可以在细胞如哺乳动物细胞如人细胞内，如在所述细胞的胞质溶胶中发挥生物效应。因此，典型的效应分子是药物分子、质粒DNA、毒素如抗体-药物缀合物(ADC)包含的毒素、寡核苷酸如siRNA、BNA、抗体-寡核苷酸缀合物(AOC)包含的核酸。例如，效应分子是可以充当配体的分子，该配体可以增加或减少(细胞内)酶活性、基因表达或细胞信号传导。在本发明的上下文中，当效应分子是缀合物的一部分时，效应分子或效应子部分不是皂苷，也不是细胞表面分子结合分子，例如抗体如sdAb。
术语“经修饰的皂苷”具有其常规的科学含义并且在此指的是皂苷，即皂苷衍生物，其在非衍生的皂苷中在进行化学修饰以提供经修饰的皂苷之前先前存在醛基团、羧基基团、乙酸酯基团和/或乙酰基基团的位置处具有一个或多个化学修饰。例如，通过经修饰皂苷所基于的皂苷中的醛基团、羧基基团、乙酸基团和/或乙酰基基团中的任何一个或多个的化学修饰来提供经修饰的皂苷，即提供皂苷并且醛基团、羧基基团、乙酸基团和/或乙酰基基团中的任何一个被化学修饰，从而提供经修饰的皂苷。例如，为了提供经修饰的皂苷而被修饰的皂苷是天然存在的皂苷。典型地，经修饰的皂苷是合成的皂苷，典型地，经修饰的皂苷是天然皂苷的修饰，因此衍生自天然皂苷，尽管经修饰的皂苷也可以衍生自可能具有或可能不具有天然对应物的合成皂苷。通常，经修饰的皂苷没有天然对应物，即经修饰的皂苷不是由例如植物或树木天然产生的。
术语“苷元核心结构”具有其常规的科学含义并且此处指的是皂苷的苷元核心，或简称为苷元，没有与其结合的一个或两个碳水化合物触角或糖链(聚糖)。例如，皂皮酸是SO1861、QS-7和QS21的苷元核心结构。通常，皂苷的聚糖是单糖或寡糖，例如直链或支链聚糖。
术语“糖链”具有其常规的科学含义并且此处指的是聚糖、碳水化合物触角、单个糖部分(单糖)或包含多个糖部分(寡糖、多糖)的链中的任何。糖链可仅由糖部分组成，或还可包含其他部分，例如4E-甲氧基肉桂酸、4Z-甲氧基肉桂酸和5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸中的任一种，例如存在于QS-21中。
术语“化学修饰的”具有其常规的科学含义并且在此指第一化学基团或第一化学部分的化学修饰，从而提供第二化学基团或第二化学部分。实例是将羰基基团化学修饰成–(H)C-OH基团，将乙酸酯基团化学修饰成羟基基团，通过化学反应提供在其醛基团处与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)部分缀合的皂苷，等等。
术语“化学修饰的醛基团”具有其常规的科学含义并且在此是指通过涉及皂苷的醛基团的化学反应获得的化学反应产物，该化学反应导致初始醛基团被新的化学基团替代。例如，从皂苷的起始醛基团形成–(H)C-OH基团。
术语“化学修饰的羧基基团”具有其常规的科学含义并且在此是指通过涉及皂苷的羧基基团(如葡糖醛酸部分的羧基基团)和另外的分子的化学反应获得的化学反应产物，该化学反应导致初始羧基基团被新的化学基团替代。例如，皂苷与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)或1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)中的任何一种形成缀合物，涉及皂苷的葡糖醛酸的羧基基团。
糖链名称上下文中的术语“Api/Xyl-”或“Api-或Xyl-”具有其常规的科学含义并且此处是指包含芹菜糖(Api)部分或包含木糖(Xyl)部分的糖链。
术语“经修饰的皂苷所基于的皂苷”具有其常规的科学含义并且此处指的是经过修饰以提供经修饰的皂苷的皂苷。通常，经修饰的皂苷所基于的皂苷是天然存在的皂苷，对其进行化学修饰以提供经修饰的皂苷。
术语“基于皂苷的经修饰的皂苷”具有其常规的科学含义并且此处指的是经过化学修饰步骤以提供经修饰的皂苷的皂苷，其中从其制备经修饰的皂苷的皂苷通常是天然存在的皂苷。
术语“寡核苷酸”具有其常规的科学含义并且此处指任何天然或合成的核酸链，包括DNA、经修饰的DNA、RNA、mRNA、经修饰的RNA、合成的核酸，以单链分子或双链分子呈现，例如BNA、反义寡核苷酸(ASO)、短或小干扰RNA(siRNA；沉默RNA)、反义DNA、反义RNA等。
术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”具有其常规的科学含义并且在此指抗体(例如IgG、Fab、scFv、免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、一个或多个VH结构域、单结构域抗体、VHH、骆驼VH等)以及当与受试者如人患者的细胞接触时能够发挥治疗效果的任何分子(如活性药物成分、毒素、寡核苷酸、酶、小分子药物化合物等)的任何缀合物。
术语“抗体-寡核苷酸缀合物”或“AOC”具有其常规的科学含义并且在此指抗体(例如IgG、Fab、scFv、免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、一个或多个VH结构域、单结构域抗体、VHH、骆驼VH等)和当与受试者如人患者的细胞接触时能发挥治疗作用的任何寡核苷酸分子(如选自天然或合成的核酸串的寡核苷酸，包括DNA、经修饰的DNA、RNA、mRNA、经修饰的RNA、合成的核酸，呈现为单链分子或双链分子，如BNA、反义寡核苷酸(ASO)、短或小干扰RNA(siRNA；沉默RNA)、反义DNA、反义RNA等)的任何缀合物。
术语“桥接核酸”，或简称“BNA”，或简称“锁核酸”或“LNA”，具有其常规的科学含义并且此处指经修饰的RNA核苷酸。BNA也称为“受限RNA分子”或“不可接近的RNA分子”。BNA单体可以包含五元、六元或甚至七元桥接结构，其具有“固定”C3'-内糖折叠。该桥在核糖的2',4'-位置合成地并入，以提供2',4'-BNA单体。可以使用本领域已知的标准亚磷酰胺化学将BNA单体并入寡核苷酸聚合结构中。BNA是结构刚性的寡核苷酸，具有增加的结合亲和力和稳定性。
如在包含接头的抗体-皂苷缀合物中使用的术语“S”代表“稳定接头”，其在哺乳动物细胞如人细胞如人肿瘤细胞的内体、内溶酶体和溶酶体中，因此在弱酸性条件下(pH<6.6，例如pH 4.0–5.5)保持完整。
如在包含接头的抗体-皂苷缀合物中使用的术语“L”表示在哺乳动物细胞如人细胞如人肿瘤细胞的内体、内溶酶体和溶酶体中的弱酸性条件下(pH<6.6，例如pH4.0–5.5)被切割的“不稳定接头”。
说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等用于区分例如相似的要素、组合物、组合物中的成分或单独的方法步骤，而不一定用于描述先后顺序或时间顺序。这些术语在适当的情况下是可互换的，并且本发明的实施例可以以本文描述或说明的顺序以外的顺序操作，除非另有说明。
除非另有说明，在此描述的本发明的实施例可以组合和协作操作。
此外，尽管各种实施例被称为“优选的”或“例如”或“举例”或“特别地”等，但是这些实施例应被解释为可以实施本发明的示例性方式，而不是限制本发明的范围。
权利要求中使用的术语“包含”不应被解释为限于例如要素或方法步骤或其后列出的组合物的成分；它不排除某一组合物中的其他要素或方法步骤或成分。它需要被解释为指定所提及的所陈述特征、整数、(方法)步骤或组分的存在，但不排除一个或多个其他特征、整体、步骤或组分或其组合的存在或添加。因此，表述“包括步骤A和B的方法”的范围不应限于仅由步骤A和B组成的方法，而是对于本发明而言，该方法的唯一列举的步骤是A和B，并且权利要求应进一步解释为包括那些方法步骤的等同物。因此，表述“包含组分A和B的组合物”的范围不应限于仅由组分A和B组成的组合物，而是对于本发明而言，该组合物的唯一列举的组分是A和B，并且权利要求应进一步解释为包括那些组分的等同物。
另外，通过不定冠词“一个/一种”(“a”或“an”)指代要素或组分并不排除存在多于一个/一种要素或组分的可能性，除非上下文明确要求存在一个/一种并且仅一个/一种要素或组分。因此，不定冠词“一个/一种”(“a”或“an”)通常意指“至少一个/一种”。
术语“Saponinum album”具有其正常含义并且此处指的是Merck KGaA(达姆施塔特，德国)生产的皂苷混合物，其中含有来自满天星(Gypsophila paniculata)和Gypsophila arostii的皂苷，其含有SA1657，主要是SA1641。
术语“皂树皂苷”具有其正常含义并且此处指的是皂树皂苷的皂苷级分，因此是所有其他QS皂苷的来源，主要含有QS-18和QS-21。
“QS-21”或“QS21”具有其常规的科学含义并且此处指的是QS-21A-apio(约63％)、QS-21A-xylo(约32％)、QS-21B-apio(约3.3％)和QS-21B-xylo(约1.7％)的混合物。
同样，“QS-21A”具有其常规的科学含义并且此处指的是QS-21A-apio(约65％)和QS-21A-xylo(约35％)的混合物。
同样，“QS-21B”具有其常规的科学含义并且此处指的是QS-21B-apio(约65％)和QS-21B-xylo(约35％)的混合物。
术语“Quil-A”是指从皂树中得到的半纯化提取物，含有不同数量的50多种不同的皂苷，其中许多在QS-7、QS-17、QS18和QS-21的C-3β-OH基团上结合了三萜-三糖亚结构Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-。Quil-A中发现的皂苷列于van Setten(1995)，表2[DirkC.van Setten,Gerrit van de Werken,Gijsbert Zomer和Gideon F.A.Kersten,GlycosylCompositions and Structural Characteristics of the Potential Immuno-adjuvantActive Saponins in the Quillaja saponaria Molina Extract Quil A[皂树提取物Quil A中潜在免疫佐剂活性皂苷的糖基组成和结构特征],RAPID COMMUNICATIONS INMASS SPECTROMETRY[质谱分析快讯],第9卷,660-666(1995)]。Quil-A和皂树皂苷是来自皂树的皂苷的级分，两者都含有大量不同的皂苷，且含量大体上是重叠的。这两个级分的具体组成不同，因为这两个级分是通过不同的纯化程序获得的。
术语“QS1861”和术语“QS1862”指的是QS-7和QS-7api。QS1861的分子量为1861道尔顿，QS1862的分子量为1862道尔顿。QS1862在以下中有描述：Fleck等人(2019)表1中,第28行[Juliane Deise Fleck,Andresa Heemann Betti,Francini Pereira da Silva,Eduardo Artur Troian,Cristina Olivaro,Fernando Ferreira and Simone GasparinVerza,Saponins from Quillaja saponaria和Quillaja brasiliensis:ParticularChemical Characteristics and Biological Activities[特定的化学特征和生物活性],Molecules[分子]2019,24,171；doi:10.3390/molecules24010171]。所描述的结构是QS-7的api-变体QS1862。分子量为1862道尔顿，因为该质量是包括葡糖醛酸处的质子在内的形式质量。在中性pH下，分子去质子化。在负离子模式下进行质谱测量时，测量质量为1861道尔顿。
附图说明
图1A(Fig.1A)：靶向的2组分方法(1靶标)。SO1861和毒素(核糖体失活蛋白)分别各自与VHH或抗体(mAb)结合，用于递送和内化到靶细胞内。1)mAb-毒素和VHH-SO1861与细胞表面受体结合，2)两种缀合物的受体介导的胞吞作用发生(缀合物与受体结合后，缀合物/受体复合物内化)，3)在低溶酶体pH和适当浓度下，SO1861变得有活性，实现内溶酶体逃逸，4)毒素向细胞质的释放发生并且诱导细胞死亡。
图1B(Fig.1B)：靶向的2组分方法(2靶标)。SO1861和毒素(核糖体失活蛋白)分别各自与VHH或抗体(mAb)结合，用于递送和内化到靶细胞内。1)mAb-毒素和VHH-SO1861与其相应的细胞表面受体结合，2)两种缀合物的受体介导的胞吞作用发生(缀合物与受体结合后，缀合物/受体复合物内化)，3)在低溶酶体pH和适当浓度下，SO1861变得有活性，实现内溶酶体逃逸，4)毒素向细胞质的释放发生并且诱导细胞死亡。
图1C(Fig.1C)：靶向的2组分方法(2靶标)。SO1861和毒素(核糖体失活蛋白)分别各自与VHH结合，用于递送和内化到靶细胞内。1)VHH-毒素和VHH-SO1861与其相应的细胞表面受体结合，2)两种缀合物的受体介导的胞吞作用发生(缀合物与受体结合后，缀合物/受体复合物内化)，3)在低溶酶体pH和适当浓度下，SO1861变得有活性，实现内溶酶体逃逸，4)毒素向细胞质的释放发生并且诱导细胞死亡。
图1D(Fig.1D)：靶向的2组分方法(2靶标)。SO1861和毒素(核糖体失活蛋白)分别各自与VHH或mAb结合，用于递送和内化到靶细胞内。1)VHH-毒素和mAb-SO1861与其相应的细胞表面受体结合，2)两种缀合物的受体介导的胞吞作用发生(缀合物与受体结合后，缀合物/受体复合物内化)，3)在低溶酶体pH和适当浓度下，SO1861变得有活性，实现内溶酶体逃逸，4)毒素向细胞质的释放发生并且诱导细胞死亡。
图1E(Fig.1E)：靶向的2组分方法(1靶标)。SO1861和毒素(核糖体失活蛋白)分别各自与VHH或抗体(mAb)结合，用于递送和内化到靶细胞内。1)VHH-毒素和mAb-SO1861与细胞表面受体结合，2)两种缀合物的受体介导的胞吞作用发生(缀合物与受体结合后，缀合物/受体复合物内化)，3)在低溶酶体pH和适当浓度下，SO1861变得有活性，实现内溶酶体逃逸，4)毒素向细胞质的释放发生并且诱导细胞死亡。
图2(Fig.2)：在SK-BR-3细胞(HER2++/CD71+)(A)和MD-MB-468细胞(HER2-/CD71+)(B)上用根据本发明的VHH(HER2)-SO1861(DAR1)+50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白(DAR4)或10pM CD71mab-皂草毒蛋白(DAR4)的联合处理的细胞杀伤(MTS)测定。
图3(Fig.3)：在SK-BR-3细胞(HER2++/CD71+)(A)和MD-MB-468细胞(HER2-/CD71+)(B)上用根据本发明的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白(DAR4)或CD71-皂草毒蛋白(DAR4)+900nMHER2VHH-SO1861(DAR1)的联合处理的细胞杀伤(MTS)测定。
图4(Fig.4)：在SK-BR-3细胞(HER2++/CD71+)(A)和MD-MB-468细胞(HER2-/CD71+)(B)上用根据本发明的VHH(HER2)-SO1861(DAR1)+50pM CD71VHH-香石竹毒蛋白(DAR1)的联合处理的细胞杀伤(MTS)测定。
图5(Fig.5)：在SK-BR-3细胞(HER2++/CD71+)(A)和MD-MB-468细胞(HER2-/CD71+)(B)上用根据本发明的CD71VHH-香石竹毒蛋白(DAR1)+900nM HER2VHH-SO1861(DAR1)的联合处理的细胞杀伤(MTS)测定。
图6(Fig.6)：在A431细胞(EGFR+＝/HER+/-/CD71+)(A)和A2058细胞(EGFR-/HER+/-/CD71+)(B)上用根据本发明的CD71VHH-香石竹毒蛋白(DAR1)+西妥昔单抗-SO1861(DAR4)或HER2VHH-香石竹毒蛋白(DAR1)+西妥昔单抗-SO1861(DAR4)或EGFRVHH-香石竹毒蛋白(DAR1)+西妥昔单抗-SO1861(DAR4)的联合处理的细胞杀伤(MTS)测定。
图7(Fig.7)：在A431细胞(EGFR+＝/HER+/-/CD71+)(A)和MDA-MB-468细胞(HER2-/EGFR++/CD71+)(B)上用根据本发明的CD71VHH-香石竹毒蛋白(DAR1)+77nM西妥昔单抗-SO1861(DAR4)或HER2VHH-香石竹毒蛋白(DAR1)+77nM西妥昔单抗-SO1861(DAR4)或EGFRVHH-香石竹毒蛋白(DAR1)+77nM西妥昔单抗-SO1861(DAR4)的联合处理的细胞杀伤(MTS)测定。
图8.(FIG.8)：1靶标2组分(EGFR高表达)。通过治疗性组合，A431(EGFR+++)和CaSKi(EGFR++)中的EGFR靶向细胞杀伤。A，B)与10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白的固定浓度组合的西妥昔单抗-SO1861滴定表明，与未缀合的SO1861相比，需要降低100-400倍的缀合的SO1861浓度，以诱导西妥昔单抗-皂草毒蛋白杀伤细胞。C，D)，与300nM未缀合的SO1861+西妥昔单抗-皂草毒蛋白相比，与278nM西妥昔单抗-SO1861组合的西妥昔单抗-皂草毒蛋白滴定杀伤细胞。与治疗性组合相比，1500nM未缀合的SO1861+西妥昔单抗-皂草毒蛋白更有效，因为两种西妥昔单抗缀合物竞争相同的EGFR受体。只有两种西妥昔单抗缀合物的同时靶向递送才导致有效的细胞杀伤，这与单独使用任一缀合物的单一疗法不同。备注：图8B中显示的图例也与图8A中的图表有关。备注：图8D中显示的图例也与图8C中的图表有关。
图9(FIG.9)：1靶标2组分(EGFR无/低表达)。通过治疗性组合，HeLa(EGFR+)和A2058(EGFR-)中的EGFR靶向细胞杀伤。A，B)与10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白的固定浓度组合的西妥昔单抗-SO1861滴定不诱导西妥昔单抗-皂草毒蛋白杀伤细胞。C，D)，与278nM西妥昔单抗-SO1861组合的西妥昔单抗-皂草毒蛋白滴定不能诱导细胞杀伤。低EGFR受体表达禁止了足够的SO1861通过抗体介导的递送进行递送，而1500nM的非缀合SO1861诱导细胞杀伤。备注：图9B中显示的图例也与图9A中的图表有关。备注：图9D中显示的图例也与图9C中的图表有关。
图10(FIG.10)：1靶标2组分(HER2高表达)。通过治疗性组合，SKBR3(HER2+++)细胞中的HER2靶向细胞杀伤。A)与673pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的固定浓度组合的曲妥珠单抗-SO1861滴定表明，与未缀合的SO1861相比，需要降低1000倍的缀合的SO1861浓度，以诱导曲妥珠单抗-皂草毒蛋白杀伤细胞。C，D)，与10nM未缀合的SO1861+曲妥珠单抗-皂草毒蛋白相比，与9,4nM曲妥珠单抗-SO1861组合的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白滴定杀伤细胞。与治疗性组合相比，1075nM未缀合的SO1861+曲妥珠单抗-皂草毒蛋白更有效，因为两种曲妥珠单抗缀合物竞争相同的HER2受体。只有两种曲妥珠单抗缀合物的同时靶向递送才导致有效的细胞杀伤，这与单独使用任一缀合物的单一疗法不同。SPT001是SO1861。
图11(FIG.11)：1靶标2组分(HER2无/低表达)。通过治疗性组合，JIMT1(HER2+)和A431(HER2+/-)中的HER2靶向细胞杀伤。A，B)与50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的固定浓度组合的曲妥珠单抗-SO1861滴定不诱导曲妥珠单抗-皂草毒蛋白杀伤细胞。C，D)，与10nM曲妥珠单抗-SO1861组合的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白滴定不能诱导细胞杀伤。低HER2受体表达禁止了足够的SO1861通过抗体介导的递送进行递送，而1500nM的非缀合SO1861诱导有效细胞杀伤。备注：图11B中显示的图例也与图11A中的图表有关。备注：图11D中显示的图例也与图11C中的图表有关。SPT001是SO1861。
图12(FIG.12)：2靶标2组分(EGFR高表达和HER2低表达)。通过治疗性组合，A431(EGFR+++/HER2+/-)和Caski(EGFR++/HER2+/-)细胞中的EGFR/HER2靶向细胞杀伤。A，B)与50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的固定浓度组合的西妥昔单抗-SO1861滴定表明，与未缀合的SO1861相比，需要降低100倍的缀合的SO1861浓度，以诱导曲妥珠单抗-皂草毒蛋白杀伤细胞。C，D)，与300nM未缀合的SO1861+曲妥珠单抗-皂草毒蛋白相比，与278nM曲妥珠单抗-SO1861组合的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白滴定杀伤细胞。与治疗性组合278nM西妥昔单抗-SO1861+曲妥珠单抗-皂草毒蛋白相比，1500nM未缀合的SO1861+曲妥珠单抗-皂草毒蛋白具有相当的细胞杀伤效率，因为两种之和物不竞争相同的受体。只有两种缀合物的同时靶向递送才导致有效的细胞杀伤，这与单独使用任一缀合物的单一疗法不同。备注：图12B中显示的图例也与图12A中的图表有关。备注：图12D中显示的图例也与图12C中的图表有关。SPT001是SO1861。
图13.(FIG.13)：2靶标2组分(EGFR低表达和HER2无/低表达)。通过治疗性组合，HeLa(EGFR+/HER2+/-)和A2058(EGFR-/HER2+/-)细胞中的EGFR/HER2靶向细胞杀伤。A，B)与50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的固定浓度组合的西妥昔单抗-SO1861滴定不诱导曲妥珠单抗-皂草毒蛋白杀伤细胞。C，D)，与278nM西妥昔单抗-SO1861组合的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白滴定不增强细胞杀伤，而1500nM的非缀合SO1861诱导有效的细胞杀伤。低EGFR受体表达禁止了足够的SO1861通过抗体介导的递送进行递送。备注：图13B中显示的图例也与图13A中的图表有关。备注：图13D中显示的图例也与图13C中的图表有关。SPT001是SO1861。
图14.(FIG.14)：2靶标2组分(HER2高表达和EGFR低表达)。通过治疗性组合，SKBR3(HER2+++/EGFR+/-)细胞中的HER2靶向细胞杀伤。A)与1.5pM EGF香石竹毒蛋白的固定浓度组合的曲妥珠单抗-SO1861滴定表明，与未缀合的SO1861相比，需要降低400倍的缀合的SO1861浓度，以诱导EGF香石竹毒蛋白杀伤细胞。B)，与10nM未缀合的SO1861+EGF香石竹毒蛋白相比，与9,4nM曲妥珠单抗-SO1861组合的EGF香石竹毒蛋白滴定可以杀伤细胞。与治疗性组合9,4nM曲妥珠单抗-SO1861+EGF香石竹毒蛋白相比，1075nM未缀合的SO1861+EGF香石竹毒蛋白具有相当的细胞杀伤效率，因为两种之和物不竞争相同的受体。只有两种缀合物的同时靶向递送才导致有效的细胞杀伤，这与单独使用任一缀合物的单一疗法不同。SPT001是SO1861。
图15.(FIG.15)：2靶标2组分(HER2低表达和EGFR低或高表达)。通过根据本发明的治疗性组合，JIMT1(HER2+)和A431(HER2+/-)中的HER2靶向细胞杀伤。A，B)与5pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白的固定浓度组合的曲妥珠单抗-SO1861滴定不诱导西妥昔单抗-皂草毒蛋白杀伤细胞。C，D)，与10nM曲妥珠单抗-SO1861组合的西妥昔单抗-皂草毒蛋白滴定不能诱导细胞杀伤。低HER2受体表达禁止了足够的SO1861通过抗体介导的递送进行递送，而1500nM的非缀合SO1861诱导有效细胞杀伤。在曲妥珠单抗-SO1861存在下，即使高EGFR受体表达水平(D)用于递送西妥昔单抗-皂草毒蛋白也不会改变其效力，这表明细胞杀伤活性的瓶颈是太低的HER2表达水平，导致靶细胞内SO1861不足以启动内体逃逸。备注：图15B中显示的图例也与图15A中的图表有关。备注：图15D中显示的图例也与图15C中的图表有关。SPT001是SO1861。
图16.(FIG.16)：2靶标2组分相比于T-DM1。具有高EGFR表达和低HER2表达的细胞(A431)被治疗性组合有效杀伤，但是T-DM1在如此低的毒素浓度下无效。T-DM1是曲妥珠单抗-厄塔毒素
Figure BDA0004086218780000181
每个抗体携带约3.5个DM1毒素分子。
图17A-E.(FIG.17A-E)：显示了当曲妥珠单抗(图17A)、西妥昔单抗(图17B)或T-DM1(图17C)、游离毒素皂草毒蛋白(图17D)和香石竹毒蛋白(图17D)、与非细胞结合IgG偶联的皂草毒蛋白(图17D)以及与非细胞结合IgG偶联的皂草毒蛋白跟游离皂苷SO1861组合(图17E)与所示细胞系SK-BR-3、JIMT-1、MDA-MB-468、A431、CaSki、HeLa、A2058、BT-474接触时的相对细胞活力。备注：图17C中显示的图例也与图17A和17B中的曲线相关。
图18.(FIG.18)：1T2C体内活性。与对照相比，50mg/kg西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4+25mg/kg西妥昔单抗-(-L-HSP27BNA)4的1T2C组合在A431荷瘤小鼠中显示了强肿瘤靶向基因沉默。
图19.(FIG.19)：1T2C体内活性。在PDX肿瘤小鼠模型(高HER2表达)中，40mg/kg曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4+0.02/0.03mg/kg曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的1T2C组合显示出有效的肿瘤生长抑制。
图20.(FIG.20)：在A431荷瘤小鼠模型中测试的2T2组分系统显示肿瘤消退。
图21.(FIG.21)：在A431荷瘤小鼠模型中测试的2T2组分系统显示肿瘤消退和根除。
图22(FIG.22)：2靶标2组分。通过根据本发明的治疗性组合，A431细胞(EGFR++/HER2+/-)(A，C)和CaSKi细胞(EGFR++/HER2+/-)(B，D)中的EGFR/HER2靶向细胞杀伤。A，B)西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7滴定+固定浓度50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白和对照，用A431细胞。C，D)曲妥珠单抗-皂草毒蛋白滴定+75nM西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7的固定浓度和对照，用Caski细胞。图例和/或轴对于A、B是相同的，图例对于图C和D是相同的。
图23.(FIG.23)：2靶标2组分。通过根据本发明的治疗性组合，HeLa细胞(EGFR+/-/HER2+/-)(A，C)和A2058细胞(EGFR-/HER2+/-)(B，D)中的EGFR/HER2靶向细胞杀伤。A，B)西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7滴定+固定浓度50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白和对照，用HeLa细胞。C，D)曲妥珠单抗-皂草毒蛋白滴定+75nM西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7的固定浓度和对照，用A2058细胞。图例和/或轴对于C和D是相同的。
图24.(FIG.24)：2靶标2组分。通过根据本发明的治疗性组合，在SKBR3细胞(HER2++/EGFR+/-)中HER2/EGFR靶向细胞杀伤(A，B)。曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4滴定+固定浓度1.5pM EGF香石竹毒蛋白和对照，用SKBR3细胞。B)EGF香石竹毒蛋白滴定+2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4的固定浓度和对照，用SKBR3细胞。
图25.(FIG.25)：2靶标2组分。通过根据本发明的治疗性组合，JIMT-1细胞(HER2+/-EGFR+/-)(A，C)和MDA-MB-468细胞(HER2-/EGFR++)(B，D)中的HER2/EGFR靶向细胞杀伤。A，B)曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4滴定+固定浓度1.5pM EGF香石竹毒蛋白和对照，用JIMT-1细胞。C，D)EGF香石竹毒蛋白滴定+2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4的固定浓度和对照，用MDA-MB-468细胞。图例和/或轴对于C和D是相同的。
图26.(FIG.26)：2靶标2组分。通过根据本发明的治疗性组合，在SKBR3细胞(HER2++/EGFR+/-)中HER2/EGFR靶向细胞杀伤(A，B)。A)曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4滴定+固定浓度10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白和对照，用SKBR3细胞。B)西妥昔单抗-皂草毒蛋白滴定+2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4的固定浓度和对照，用SKBR3细胞。
图27.(FIG.27)：2靶标2组分。通过根据本发明的治疗性组合，JIMT-1细胞(HER2+/-EGFR+/-)(A，C)和MDA-MB-468细胞(HER2-/EGFR++)(B，D)中的HER2/EGFR靶向细胞杀伤。A，B)曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4滴定+固定浓度10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白和对照，用JIMT-1细胞。C，D)西妥昔单抗-皂草毒蛋白滴定+2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4的固定浓度和对照，用MDA-MB-468细胞。图例和/或轴对于A和B是相同的，图例对于C和D是相同的。
具体实施方式
本发明的第一个目的是提供具有增加的治疗窗的改善的ADC和AOC，并且提供用于递送有效量或剂量的效应分子的改善的治疗组合或改善的药物组合物，例如当考虑从靶细胞的外部递送到所述细胞内时，或者更具体地当考虑在所述靶细胞的胞质溶胶中递送效应分子时。本发明的第二个目的是提供一种治疗患有疾病的(人)患者的改善方法，所述疾病要用(有效量的)包含效应分子和例如针对靶肿瘤细胞的配体(细胞表面分子结合分子，用于将效应分子靶向于靶异常细胞如肿瘤细胞处和其中)的缀合物来治疗，即以改善ADC或AOC(其包含要在靶肿瘤细胞的胞质溶胶中递送的效应分子)的治疗窗。
本发明的目的是提供效应分子活性增强分子和改善的ADC或AOC的组合，用于疗法如抗癌疗法中。本发明的另一个目的是提供治疗组合物或例如两种治疗组合物的治疗组合，治疗组合物包含这种改善的ADC或AOC，并且包含效应分子活性增强分子。一旦所述效应分子被递送到靶细胞内，例如并优选递送到内体、内溶酶体和/或溶酶体中，并且例如随后并优选递送到所述细胞的胞质溶胶中，这种效应分子活性增强分子能够改善效应分子的生物效应，所述靶细胞包含效应分子的分子靶标。所述提供的效应分子活性增强分子，当施用给有需要的携带靶细胞的(人)患者时，导致所述患者在比达到效应分子有效剂量的当前所需剂量更低的效应分子剂量下体验到改善的治疗效果或优选至少足够的效果。这样，有效地拓宽了效应分子(例如是缀合物一部分的效应分子，例如ADC或AOC)的治疗窗。
为了使生物活性分子(例如效应分子)起作用，该分子必须能够与其靶标接合，例如在血清中、细胞表面外部或细胞或细胞器内部。几乎所有基于蛋白质的靶向毒素的活性部分，例如，必须进入靶细胞的胞质溶胶以介导其靶标调节作用。在许多情况下，毒素仍然无效，因为(1)靶向部分内化不良，仍与细胞的外部结合，(2)内化后被循环回细胞表面，或(3)运输到溶酶体内，在那里被降解。尽管这些基本问题几十年前就为人所知，并且在过去几十年中研究了500多种靶向毒素，但这些问题尚未得到解决，并且只有少数靶向抗体的蛋白毒素被允许进入市场，尽管带有严重毒性的警告标签。莫塞妥莫单抗-帕舒托(moxetumomab pasudotox)-tdfk(
Figure BDA0004086218780000201
阿斯利康制药公司(AstraZenecaPharmaceuticals LP))迄今已被FDA批准用于复发或难治性毛细胞白血病。其他此类批准的ADC是Elzonris、Ontak。
为了克服这些问题，已经描述了许多策略，包括将毒素重定向到内质网生物合成途径的内源性细胞膜转运复合物的方法，以及破坏或削弱内体(即细胞中内吞途径的隔室)膜完整性的技术，从而促进内体逃逸。这包括使用亲溶酶体胺、羧基离子载体，钙通道拮抗剂，病毒、细菌、植物、动物、人和合成来源的各种细胞穿透肽，其他有机分子和光诱导技术。尽管靶向毒素的功效通常在细胞培养中增加了一百倍或一千倍，在特殊情况下增加了超过一百万倍，但将内体逃逸增强剂与其他物质共同施用的需要带来了新的问题，包括额外的副作用、靶特异性的丧失、难以确定治疗窗和细胞类型依赖性变异。
所有策略，包括物理化学技术，都需要或多或少直接与膜相互作用的增强子分子，并且基本上包括小化学分子、次级代谢物、肽和蛋白质。所有这些物质的共同特征是它们本身不是靶细胞特异性的，并且以不同于靶向的毒素的其他动力学分布。这是当前方法的一个主要缺点。
本发明的另一个目的是为基于sdAb的ADC和基于sdAb的AOC提供改善的增强剂，并且提供用于递送有效量的效应分子的改善的治疗组合或改善的药物组合物，例如当考虑从靶细胞的外部递送到所述细胞内时，或者更具体地当考虑在所述靶细胞的胞质溶胶中递送效应分子时。本发明的另一个目的是提供一种治疗患有疾病的(人)患者的改善方法，所述疾病要用包含效应分子和例如针对靶肿瘤细胞的配体(即sdAb)的缀合物来治疗，即以改善ADC或AOC(其包含效应分子并包含要在靶肿瘤细胞的胞质溶胶中递送的sdAb)的治疗窗。
本发明的一个目的是提供用于疗法如抗癌疗法中的效应分子增强分子、治疗组合物或例如两个治疗组合物的治疗组合，治疗组合物包含这样一种分子，该分子一旦被递送到包含效应分子的分子靶标的靶细胞内就能够改善效应分子的生物效应，当对有需要的携带靶细胞的(人)患者施用时，在比达到效应分子有效剂量的当前所需剂量更低的效应分子剂量下经历改善的治疗效果或足够的效果。这样，有效地拓宽了效应分子(例如是缀合物一部分的效应分子，例如包含sdAb的ADC或包含sdAb的AOC)的治疗窗。
本发明将相对于具体实施例来说明，但本发明并不受限于此而只受权利要求限制。虽然本发明已根据几个实施例进行了描述，但可以预期的是，在阅读说明书和研究附图后，其替换、修改、置换和等同物对于本领域普通技术人员来说将变得显而易见。本发明不以任何方式限制于所示实施例。在不脱离所附权利要求限定的范围的情况下可以进行改变。
发明人发明并确定了本发明的第一缀合物如抗体药物缀合物或抗体-寡核苷酸缀合物的治疗窗在以下情况时增加：当这样的ADC或AOC优选包含细胞表面分子结合性sdAb以将ADC或AOC靶向细胞表面分子时，并且当对有需要的相同受试者如人癌症患者或荷瘤哺乳动物施用包含至少一个共价结合的皂苷的第二缀合物时(例如参见表A5-A7中的实例，例如参见图4-7的包含VHH的缀合物，图2、3、8-13、16、16、18-23、26和27的包含单克隆抗体(mAb)的缀合物，在实例部分中是一系列体外和体内肿瘤细胞模型实例，显示了与抗体如IgG或VHH共价结合的皂苷在与包含抗体如mAb或sdAb的ADC或AOC组合时的作用)。皂苷与抗体如IgG或VHH缀合，效应分子如蛋白毒素或寡核苷酸如BNA与第二抗体如IgG或sdAb缀合。发明人首先建立并确定了本发明的皂苷与用于结合细胞表面分子的配体如抗体如全长完整IgG，或如sdAb如VHH的缀合提供了一种缀合物，用于在其细胞表面暴露细胞表面分子的靶细胞的细胞表面特异性递送皂苷，随后将(游离)皂苷递送到细胞内，如细胞内体、内溶酶体、溶酶体，并最终递送到细胞胞质溶胶中(优选的是包含皂苷的缀合物，其中皂苷通过在哺乳动物细胞如人肿瘤细胞的内体、内溶酶体、溶酶体中可切割的键共价连接，使得一旦包含皂苷的缀合物进入细胞内体、内溶酶体、溶酶体并且键被切割(例如一旦缀合物结合到细胞表面分子即受体上通过受体介导的内吞作用进入)，则存在游离皂苷)。这样的细胞靶向皂苷缀合物的实例例如在图2-27中提供了皂苷-VHH缀合物和皂苷-Mab缀合物，如下文实部分所述。皂苷与配体例如EGF、靶向VHH的Her2或IgG、靶向IgG的EGFR结合。
通过提供包含细胞表面分子结合性sdAb和本发明的效应分子增强分子的改善的ADC或改善的AOC的组合，例如包含共价连接的二糖链三萜糖苷(三萜皂苷)的第二缀合物，实现了至少一个上述目的。
本发明的第一方面涉及一种药物组合，其包含：
ο第一缀合物，该第一缀合物包含至少一个效应分子和用于结合第一细胞表面分子的单结构域抗体(sdAb)，该至少一个效应分子和该单结构域抗体直接或通过接头彼此共价连接；
ο皂苷和/或其衍生物和/或第二缀合物，其包含用于结合第二细胞表面分子的结合分子和皂苷和/或其衍生物，该结合分子和该皂苷或其衍生物直接或通过接头彼此共价连接，其中该皂苷或其衍生物是单糖链三萜糖苷或双糖链三萜糖苷，其中该第二细胞表面分子与该第一细胞表面分子相同或与该第一细胞表面分子不同；和任选地，
ο药学可接受的赋形剂和/或药学可接受的稀释剂。
当考虑效应分子在细胞内的作用时，本发明人确定，作为包含sdAb的第一缀合物的一部分的效应分子在皂苷(例如本发明的第二缀合物所包含的皂苷)的影响下被高效递送到细胞内。更具体地，当考虑效应分子在细胞内的作用时，本发明人确定，作为包含sdAb的第一缀合物的一部分的效应分子在本发明的皂苷(例如本发明的第二缀合物所包含的皂苷)的影响下被高效递送到细胞的胞质溶胶中。也就是说，在不存在皂苷(例如作为第二缀合物的一部分的皂苷)的情况下，将肿瘤细胞与亚最佳剂量的第一缀合物接触不会导致细胞内效应分子活性(效应分子的生物活性不会有效杀伤靶细胞)。然而，当靶肿瘤细胞与包含效应分子和游离皂苷的第一缀合物和/或包含皂苷的第二缀合物接触时，确定有效的肿瘤细胞杀伤。
为了更详细地解释本发明，首先描述细胞摄取物质的过程和本发明中使用的术语。通过囊泡出芽将细胞外物质摄取到细胞内称为内吞作用。所述囊泡出芽的特征在于(1)细胞溶质蛋白网格蛋白介导的受体依赖性配体摄取，(2)胆固醇结合蛋白小窝蛋白介导的脂筏摄取，(3)非特异性流体摄取(胞饮作用)，或(4)非特异性颗粒摄取(吞噬作用)。所有类型的内吞作用都会遇到以下称为内吞途径的囊泡运输和物质分选的细胞过程。内吞途径很复杂，尚未完全了解。早些时候，人们认为细胞器是从头形成并沿着内吞途径成熟为下一个细胞器。如今，据推测，内吞途径包括由囊泡交通连接的稳定的隔室。隔室是一种复杂的多功能膜细胞器，专门负责细胞的一组特定基本功能。囊泡被认为是短暂的细胞器，组成更简单，并且被定义为通过从预先存在的隔室出芽从头形成的膜封闭容器。与隔室不同，囊泡可以经历成熟，这是生理上不可逆的一系列生化变化。早期内体和晚期内体代表内吞途径中的稳定隔室，而初级内吞囊泡、吞噬体、多囊泡体(也称为内体载体囊泡)、分泌颗粒，甚至溶酶体代表囊泡。内吞囊泡出现在质膜上，最突出的是来自网格蛋白包被的凹坑，首先与早期内体融合，早期内体是大约pH 6.5的主要分选隔室。大部分内化的货物和膜通过回收囊泡(回收途径)回收回质膜。应降解的组分通过多囊泡体被运输到酸性晚期内体(pH低于6)。溶酶体是囊泡，可以储存成熟的溶酶体酶，并在需要时将它们递送到晚期内体隔室。由此产生的细胞器称为混合细胞器或内溶酶体。溶酶体在称为溶酶体重构的过程中从混合细胞器中出芽。晚期内体、溶酶体和混合细胞器是极动态的细胞器，通常很难区分它们。内吞分子的降解发生在内溶酶体内。核内体逃逸是物质从任何类型的隔室或囊泡的内腔中主动或被动地从内吞途径，优选从网格蛋白介导的内吞或再循环途径释放到胞质溶胶中。因此，内体逃逸包括但不限于从内体、内溶酶体或溶酶体释放，包括它们的中间和混合细胞器。进入胞质溶胶后，所述物质可能会移动到其他细胞单位，例如细胞核。本发明上下文中的糖苷分子(皂苷)是能够增强效应分子作用的化合物，特别是通过促进内体逃逸。糖苷分子与内吞和再循环途径的隔室和囊泡的膜相互作用，并使它们对所述效应分子发生渗漏，从而导致内体逃逸增加。
术语“改善效应分子的作用”是指皂苷增加效应分子的功能功效(例如毒素或药物的治疗指数；生物技术过程中调节剂的代谢功效；基因在细胞培养研究实验中的转染功效)，优选是通过实现或改善其靶标接合。优选不包括抗原特异性免疫反应的加速、延长或增强。治疗功效包括但不限于更强的治疗效果且更低的剂量和/或更少的副作用。“改善效应分子的作用”也可以指当用作包含细胞表面分子靶向性sdAb的本发明第一缀合物的一部分并与游离皂苷(衍生物)组合和/或与包含共价结合的皂苷(衍生物)的本发明第二缀合物组合时，由于缺乏作用而不能使用的效应分子(例如不知道是效应分子)变得有效。有益的或期望的且可归因于效应子部分(作为根据本发明第一缀合物的包含细胞靶向sdAb的ADC或包含细胞靶向sdAb的AOC的一部分)和由本发明提供的本发明的第二缀合物包含的皂苷的组合的任何其他作用被认为是“改善的作用”。在本发明的上下文中，皂苷(例如本发明的第二缀合物所包含的皂苷)是效应分子功能功效的“增强剂”，该效应分子由第一单独的缀合物(例如根据本发明包含细胞表面分子结合性sdAb的ADC或包含细胞表面分子结合性sdAb的AOC)所包含。
到本发明为止，通过游离糖苷(不是细胞表面分子靶向性缀合物的一部分，例如本发明的皂苷)增强靶向毒素的一个主要缺点是靶向毒素通过受体介导的内吞作用被内化(靶向毒素缀合物与受体结合后，靶向毒素缀合物/受体复合物被内化)，而糖苷被动扩散通过质膜并可能通过与胆固醇的相互作用到达内体膜。原则上，糖苷如本发明第二缀合物中的皂苷，当处于游离的非缀合形式时，可以进入任何细胞，也可以进入非靶细胞(脱靶细胞)，导致靶细胞中用于有效释放靶向毒素的增强剂利用率低，并可能在非靶细胞中产生副作用。一个主要问题是靶向毒素和糖苷的进入以不同的动力学进行，并且这些动力学在细胞(系)与细胞(系)之间以及组织与组织之间不同，从而两种物质(例如包含用于结合细胞表面分子的sdAb的ADC或AOC，连同游离皂苷)的正确施用时间差可以在肿瘤(细胞(系))与肿瘤(细胞(系))之间变化很大。而且，在生物体内，这些物质的释放、吸收、分布、代谢和排泄也是不同的。此外，非靶向细胞对糖苷的特异性摄取可能会在这些细胞中引起不良影响。这可以是，例如，本应被递送至溶酶体的化合物的胞质递送、被扰乱的抗原呈递等。糖苷和靶向药物的非靶向施用在药物开发中也可能成为问题，并可能会阻碍或至少推迟相关机构(例如FDA或EMA)的上市许可。在本发明的上下文中，靶向毒素或靶向药物是指毒素或药物特异性靶向靶细胞上的膜结合分子(细胞表面分子)，例如与抗体如sdAb结合的毒素或药物，所述抗体特异性识别靶细胞细胞膜上的结构(结合位点、表位)。
因此，通过与效应分子相同的途径(例如，通过靶向配体)将糖苷(本发明的皂苷)定向至靶细胞是非常有用的，以使增强剂在靶细胞的内吞途径的酸性区室中以有效浓度可用，并显示出与毒素的协同作用。因此，本发明提供了通过靶向配体(结合分子)将效应分子和内体逃逸增强剂(即本发明的皂苷)重定向至靶细胞内吞途径的酸性隔室的新方法。本发明第二缀合物中包含皂苷的靶向配体可以与包含本发明效应分子的第一缀合物所包含的靶向配体，即sdAb相同，也可以不同。当靶向配体不同时，应理解两种靶向配体结合不同但存在于相同靶细胞如肿瘤细胞上的第一和第二细胞表面分子。例如，包含皂苷部分的本发明的第二缀合物可以结合EGFR或CD71或HER2，并且例如包含效应子部分和细胞表面分子结合性sdAb的第一缀合物可以结合EGFR或CD71或HER2，其中本发明的第一缀合物和第二缀合物结合相同的细胞受体或不同的细胞受体。
当考虑细胞内的效应分子的作用时，发明人确定，在本发明的第二缀合物所包含的皂苷的影响下，作为包含靶向配体如sdAb的第一缀合物的一部分的效应分子被高效递送到细胞内。出人意料的是，尽管sdAb例如VHH的尺寸相对较小，但是当第一缀合物包含效应分子和sdAb(sdAb优选为VHH)时，包含效应分子并且包含这样的sdAb的本发明第一缀合物与靶细胞表面受体的结合仍然发生。出人意料的是，尽管sdAb例如VHH的尺寸相对较小，但是当第二缀合物包含皂苷和sdAb(sdAb优选为VHH)时，包含皂苷并且包含sdAb的本发明第二缀合物与靶细胞表面受体的结合仍然发生。当考虑VHH结合细胞表面分子的能力时，效应分子与sdAb如VHH的结合(这形成本发明的第一缀合物)不会导致例如空间位阻。当考虑VHH结合细胞表面分子的能力时，皂苷与sdAb如VHH的结合(这形成本发明的第二缀合物)不会导致例如空间位阻。也就是说，在不存在本发明第二缀合物(其包含共价偶联至细胞表面分子结合配体如抗体如根据本发明第二缀合物的sdAb的皂苷)的情况下，将例如肿瘤细胞与亚最佳剂量的例如包含sdAb的ADC或包含sdAb的AOC(即本发明的第一缀合物)接触不会导致细胞内效应分子活性(靶细胞不会因效应分子的生物活性而被有效杀伤)。然而，当靶肿瘤细胞与包含效应分子和sdAb的本发明第一缀合物(例如ADC或AOC)以及游离皂苷和/或包含皂苷的本发明第二缀合物接触时，实现了有效的肿瘤细胞杀伤。
通过用本发明的第二缀合物和ADC或AOC(即本发明的第一缀合物)靶向单个细胞表面分子，或者通过用本发明的第二缀合物靶向第二细胞表面分子并用ADC或AOC(即本发明的第一缀合物)靶向第一细胞表面分子，其中第一和第二细胞表面分子是不同的并且存在于相同的靶细胞上，在将一个或多个细胞表面分子暴露在细胞表面上的靶细胞的胞质溶胶处和内部，本发明的第二缀合物中结合到细胞表面分子靶向性抗体如sdAb的皂苷的递送以及包含效应分子和用于结合第一细胞表面分子的sdAb的ADC或AOC的递送得到了改善并且更加特异性，该改善并且更加特异性是与例如以下相比：仅将细胞与ADC接触，而不同时将细胞与包含本发明皂苷的第二缀合物接触，因此不存在细胞靶向皂苷(本发明的第二缀合物)。选择用于被第一缀合物的细胞表面分子靶向性sdAb靶向和被第二缀合物包含的细胞表面分子结合分子如抗体如sdAb靶向的异常细胞理想地在细胞表面分子上带有表位，细胞表面分子靶向性分子可以与该表位高程度地结合(即，靶向的细胞表面分子在靶向的细胞(例如肿瘤细胞或自身免疫细胞)上的表达相对高于在非靶向的细胞(例如健康细胞)上的表达)和/或暴露靶向细胞表面分子中的表位，用于结合第一缀合物的细胞表面分子靶向性sdAb和用于结合第二缀合物的细胞表面分子靶向性抗体例如sdAb，特别是当考虑患者中的(相邻)健康细胞时。优选地，由本发明第一缀合物的细胞表面分子靶向性sdAb靶向的细胞表面分子和由本发明第二缀合物的细胞表面分子靶向性分子例如抗体例如sdAb靶向的细胞表面分子与健康细胞相比在靶(患病、肿瘤)细胞上相对高和/或特异性表达。实施例是本发明的第一缀合物，其中第一缀合物的细胞表面分子靶向性sdAb的靶细胞表面分子，例如肿瘤细胞受体，当与健康(邻近)细胞表面上的细胞表面分子的表达相比时，特异性地或以相对较高的程度表达。实施例是本发明的第二缀合物，其中第二缀合物的细胞表面分子靶向性分子的靶细胞表面分子如抗体如sdAb，例如肿瘤细胞受体，当与健康(邻近)细胞表面上的细胞表面分子的表达相比时，特异性地或以相对较高的程度表达。因此，靶向的细胞表面分子上的表位理想地对靶向的患病细胞是独特的，并且至少特异性地存在并暴露于靶向的细胞的表面。本发明的第一缀合物与靶向的细胞上细胞表面分子上的表位结合后是缀合物与靶细胞表面分子的复合物的内吞作用(缀合物与受体(靶细胞表面分子)结合后是缀合物/受体复合物的内化)。本发明的第二缀合物与靶向的细胞上细胞表面分子上的表位结合后是第二缀合物与靶细胞表面分子的复合物的内吞作用(缀合物与靶细胞表面分子(细胞表面受体)结合后是缀合物/受体复合物的内化)。由于第一和第二缀合物只能通过与细胞表面分子(当与不应该被靶向的健康细胞相比时，所述细胞表面分子在靶细胞上特异性表达到足够的程度或独特表达)的结合相互作用进入靶细胞，由ADC或AOC(本发明的第一缀合物)所包含的治疗活性量的效应子部分(其靶向与本发明的第二缀合物相同的细胞表面分子，或者其靶向不同的细胞表面分子，尽管这些不同的细胞表面分子存在于与本发明的第二缀合物靶向的细胞表面分子相同的靶细胞中)和由本发明的第二缀合物所包含的皂苷在靶细胞内的累积在一个或多个靶细胞表面分子的表达水平高于某一最小表达阈值时才是可能的并且发生。同时，结合到第一缀合物的细胞表面分子性sdAb上的效应子部分仅能够在具有本发明的共价结合的皂苷的第二缀合物存在下发挥其细胞内(例如细胞毒性或基因沉默)活性，当与不存在包含一个或多个共价结合的皂苷的本发明第二缀合物的情况下将细胞暴露于ADC相比时，这一事实也提供了防止效应子部分对例如健康细胞和健康组织(其不是效应子部分的靶向和影响对象)的负面和不希望的副作用的保护。也就是说，本发明的第一缀合物(例如包含sdAb的ADC或AOC)和包含皂苷的第二缀合物可以结合的一个或多个暴露的细胞表面分子的足够低的表达或甚至不存在理想地不允许包含效应分子的本发明的第一缀合物和包含皂苷的第二缀合物按以下量进入(非靶向)健康细胞，该量会导致ADC或AOC的效应子部分在本发明的第二缀合物包含的皂苷的影响下的内体逃逸。由于在本发明的含皂苷的第二缀合物的存在下，ADC或AOC可以以较低的剂量使用，因此与在不存在本发明第二种缀合物的情况下将ADC或AOC应用于治疗方案相比，ADC或AOC在健康细胞中的低程度进入已经具有发生不希望的副作用的较低风险，例如当考虑靶向和杀伤靶患病细胞如肿瘤细胞和自身免疫细胞时。
与包含抗体如IgG(全长免疫球蛋白)或其结合片段或结合结构域相比，在第一缀合物中包含sdAb具有许多优点。重要的是，由于sdAb不包含IgG中存在的Fc尾，因此当将本发明的第一缀合物施用于哺乳动物如人受试者时，不存在由于缀合物与细胞(例如施用缀合物的宿主的内皮细胞)上的Fc受体结合而导致的脱靶副作用的风险。因此，与基于IgG的ADC和AOC相比，或者与包含Fc尾的ADC或AOC相比，本发明的第一缀合物的风险谱得到改善。此外，由于本发明的第一缀合物不能与Fc受体结合，因此第一缀合物在低于用基于全长抗体的ADC和AOC达到相同效应分子活性所需剂量的剂量下就已经有效，这是因为不同于针对的第一靶细胞表面分子的细胞表面受体对第一缀合物的捕获更少或没有不期望的捕获。此外，由于与例如Fab、scFv、IgG相比，sdAb的尺寸相对较小，因此本发明的第一缀合物的组织穿透性得到改善，一旦将第一缀合物施用给需要疗法(其基于该患者(肿瘤)细胞内效应分子的生物活性)的患者，这有利于到达靶细胞。当与在类似的ADC或AOC中应用更大的抗体或其片段(例如包含Fc尾的IgG)相比时，在本发明的第一缀合物中应用sdAb的所有这些优点导致当被本发明的第一缀合物包含时，效应分子的治疗窗得到改善。例如，当效应分子例如是毒素时，在靶向肿瘤细胞的情况下以与基于IgG并包含相同效应分子的ADC相同的剂量(其无效或只是次优有效)时改善的靶细胞杀伤。由于本发明的方面，现在可以用较低剂量的效应分子作为包含sdAb的缀合物(即本发明的第一缀合物)的一部分来治疗患者，从而与使用包含相同效应分子的基于抗体的ADC或AOC时所需的更高剂量相比，在靶细胞中达到相同或改善的效应分子介导的作用。以较低剂量施用本发明的这样的第一缀合物降低了患者例如通过非靶向的健康细胞的非特异性进入发生副作用的风险。例如，当由第一缀合物包含的sdAb靶向的第一细胞表面分子在靶(肿瘤)细胞上以更高程度表达，但不是在此类靶细胞上独特表达时，这例如是重要的。较低剂量的第一缀合物降低了第一缀合物与此类低表达者如非肿瘤健康细胞结合的风险。
发明人还发现，当本发明的第一缀合物在皂苷或更特别是包含皂苷的本发明的第二缀合物的存在下与靶细胞接触时，本发明的第一缀合物的治疗窗变宽。当携带第一细胞表面分子(即第一缀合物包含的sdAb的靶标)和携带第二细胞表面分子(根据本发明的实施例，当第一和第二细胞表面分子都是相同的细胞表面分子时，这在本质上是真实情况)的靶细胞(即第二缀合物包含的结合分子的靶标)与第一缀合物和第二缀合物接触时，效应分子的有效剂量低于靶细胞在没有第二缀合物(或没有游离皂苷)的情况下与第一缀合物接触时的剂量。本发明的包含皂苷的第二缀合物的存在或游离皂苷的存在增强了靶细胞中效应分子的活性，使得第一缀合物的治疗窗变宽，从而效应分子的治疗窗变宽。当靶细胞与本发明的第一和第二缀合物两者接触时，以较低剂量实现足够的效应分子效率。在以下情况下发明人发现了类似的效果：当第一缀合物在皂苷或其功能衍生物的存在下与靶细胞接触时，当考虑到皂苷的效应分子增强活性时，然而，与包含共价结合的皂苷的第二缀合物与第一缀合物组合时建立的有效剂量相比，游离皂苷(衍生物)的浓度高100-1000倍。因此，当第一和第二缀合物与在其表面表达两种细胞表面分子的靶细胞一起接触时，提供具有结合分子的皂苷或其衍生物(即本发明的第二缀合物)导致效应分子活性增强作用的改善。在靶细胞内递送效应分子以及从所述细胞的内体、内溶酶体或溶酶体递送到胞质溶胶方面，靶向皂苷在比游离皂苷更低的剂量下就已经是有效的，其中效应分子应结合其靶结合配偶体并应发挥其生物活性(例如在靶细胞是肿瘤细胞且效应分子是例如毒素的情况下的细胞杀伤)。
在组合中，发明人提供了包含第一缀合物的第一药物组合物和包含游离皂苷(衍生物)或含皂苷(衍生物)的第二缀合物的第二药物组合物的组合，并提供了包含第一缀合物和游离皂苷(衍生物)或第二缀合物的药物组合物，其当与基于全长抗体或全长抗体的包含Fc构建体的当前ADC或AOC相比时具有改善的治疗窗，当将第一缀合物包含的有效剂量的效应分子施用于需要基于效应分子的疗法的患者时诱导副作用的风险更低，以及由于第一缀合物在靶细胞内的改善的递送而改善的效应分子活性，更具体地说，由于效应分子在这种靶细胞的胞质溶胶内的改善的递送而改善的效应分子活性。本发明的一部分是将本发明的这样的第一缀合物与游离皂苷(衍生物)或第二缀合物一起施用给需要基于效应分子的疗法的患者，尽管第二缀合物与第一缀合物的联合应用是优选的。
实施例是至少两个、优选两个药物组合物形式的本发明药物组合，其包含：
-第一药物组合物，其包含第一缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂；以及
-第二药物组合物，其包含皂苷和/或其衍生物和/或第二缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂。
实施例是单一药物组合物形式的本发明的药物组合，该单一药物组合物包含第一缀合物和以下中的至少一个，优选一个：
·皂苷；
·皂苷衍生物；以及
·第二缀合物，
并且任选包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂。
本发明的一个方面涉及一种药物组合物，其包含：
ο第一缀合物，该第一缀合物包含至少一个效应分子和用于结合第一细胞表面分子的单结构域抗体(sdAb)，该至少一个效应分子和该单结构域抗体直接或通过接头彼此共价连接；
ο皂苷和/或其衍生物和/或第二缀合物，其包含用于结合第二细胞表面分子的结合分子和皂苷和/或其衍生物，该结合分子和该皂苷或其衍生物直接或通过接头彼此共价连接，其中该皂苷或其衍生物是单糖链三萜糖苷或双糖链三萜糖苷，其中该第二细胞表面分子与该第一细胞表面分子相同或与该第一细胞表面分子不同；和任选地，
ο药学可接受的赋形剂和/或药学可接受的稀释剂。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第一缀合物包含sdAb，其是以下中的任何一个或多个：衍生自抗体重链的VH结构域，该抗体优选免疫球蛋白G来源，优选人来源；衍生自抗体轻链的VL结构域，该抗体优选免疫球蛋白G来源，优选人来源；VHH结构域，其例如衍生自仅重链抗体(HCAb)，该仅重链抗体例如来自骆驼科来源或Ig-NAR来源，例如可变重链链新抗原受体(VNAR)结构域，优选该HCAb来自骆驼科来源；并且优选地，该sdAb是衍生自来自骆驼科来源的HCAb(骆驼VH)的VHH结构域，例如衍生自来自骆驼、美洲驼、羊驼、单峰驼、骆马、原驼和双峰驼的HCAb。
特别地，VHH结构域适用于本发明的第一缀合物中，事实上也适用于本发明的第二缀合物中。这样的VHH结构域通常因以下而闻名：其高稳定性(即抗展开性)，其与结合配偶体结合的能力(不需要存在第二个V结构域，例如存在于例如IgG中，并且是IgG通过两个V结构域与其结合配偶体结合所必需的)，其通过本领域已知的技术(骆驼免疫、噬菌体展示技术等)易于生产，其穿透组织的能力比全长IgG更高(当靶(肿瘤)细胞位于这种(器官)组织内部或作为这种组织的一部分时，这是有益的)。此外，这样的VHH结构域缺乏免疫球蛋白G型抗体所共有的Fc尾，使得施用包含sdAb如VHH结构域的缀合物不会发生Fc-受体介导的副作用，该副作用可能发生在施用包含Fc尾的治疗性全长免疫球蛋白的受试者中。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第一缀合物包含至少两个sdAb，其中单个第一sdAb共价结合到至少一个效应分子，或两个或更多个sdAb结合到至少一个效应分子，或至少两个sdAb全部结合到至少一个效应分子，例如其中至少两个sdAb中的每一个结合到至少一个效应分子中的一个或多个。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中sdAb包含至少两个sdAb，它们是相同的sdAb，优选二至八个sdAb，更优选二至四个sdAb。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其包含能够与该第一细胞表面分子上的相同结合位点结合的一至八个sdAb，其中该至少一个效应分子与该一至八个sdAb中的单个第一sdAb结合，或者其中如果这些sdAb中的两个或更多个存在的话该至少一个效应分子与该两个或更多个结合，和/或其中该至少一个效应分子中的每一个单独与单个sdAb结合，使得这些sdAb中的一个或多个各自与单个效应分子结合。
提供包含彼此共价连接的多个sdAb的(线性)串的本发明的第一缀合物(和/或本发明的第二缀合物)，可以提供缀合物以更高亲和力结合靶细胞的能力的益处，这可以导致靶细胞对缀合物的摄取(胞吞作用)得到改善。
当考虑皂苷对效应分子的内体逃逸增强作用的应用时，同步化是小鼠成功递送策略与其在人类中的应用之间缺失的环节。事实上，发明人建立了一系列体内小鼠肿瘤模型，即，与没有在游离皂苷存在下用ADC治疗的对照动物相比，分别给小鼠施用一定剂量的游离皂苷和一定剂量的例如不存在根据本发明的包含皂苷的第二缀合物时的ADC没有产生任何期望的抗肿瘤活性，例如肿瘤生长延迟、肿瘤消退、肿瘤生长减少和减慢。还可参见图18-21中的体内肿瘤模型和下文实例部分描述的实例。使用各种施用途径施用游离皂苷并使用与施用ADC的时刻相比施用游离皂苷的不同时间点(在施用ADC之前、期间和之后施用游离皂苷)。在体内肿瘤模型中测试的ADC是西妥昔单抗-香石竹毒蛋白(含游离SO1861)或曲妥珠单抗-皂草毒蛋白(含游离SO1861)。改变游离皂苷的剂量并不能提供有效的抗肿瘤活性。所提及的ADC的施用剂量本身不会对荷瘤动物造成任何有益的抗肿瘤作用。出人意料的是，发明人确定，在使用人肿瘤细胞的各种基于哺乳动物细胞的体外生物测定中和/或在各种体内动物肿瘤模型中，可以通过用根据本发明的第二缀合物与ADC或AOC(即本发明的第一缀合物)组合处理细胞或动物来实现有益的抗肿瘤活性。
本发明的第二缀合物任选地包含根据本发明的支架(见下文；支架，例如共价皂苷缀合物，其包含具有一个或多个与其共价结合的皂苷部分的寡聚或聚合结构)。支架例如是具有通过可切割或不可切割的键共价结合的皂苷(例如SO1861、QS-21)三官能接头，支架通过共价键与第二缀合物的细胞表面分子靶向性分子连接，所述细胞表面分子靶向性分子例如是单克隆抗体，例如西妥昔单抗、曲妥珠单抗、OKT-9，但优选sdAb，例如VHH，或者支架是树状突，例如树状突，例如G4-树状突或G5树状突，例如四个部分(例如四个皂苷分子)可以结合到其上，或者用于结合例如八个皂苷的树状突，树状突包含用于(共价)偶联到第二缀合物的细胞表面分子靶向性抗体例如sdAb的化学基团。参考进一步的实施例和实例部分，举例说明根据本发明的这些支架中的几个，当考虑由例如本发明的第一缀合物包含的朊毒素产生的细胞毒性或当考虑肿瘤细胞中的基因沉默时，其显示体内和/或体外抗肿瘤细胞活性。
不希望受任何理论的束缚，鉴于考虑用ADC和游离皂苷一起治疗荷瘤动物时观察到的失败，优选在靶细胞(例如肿瘤细胞或自身免疫细胞)的内吞途径的隔室或小泡中同步存在至少一个皂苷和效应子部分(优选毒素或寡核苷酸)两者。根据本发明人的尝试，对于ADC和游离皂苷，为了在体内获得协同效应，使晚期内体中分子的存在同步化是不有利的。在一个方面，本发明优选地解决了关于将包含效应子部分和(肿瘤)细胞表面分子结合性sdAb(例如ADC或AOC)的的第一缀合物与包含一个或多个皂苷的本发明第二缀合物组合的至少以下问题：不希望受任何理论的束缚，内体逃逸活性需要在例如皂苷中唯一合理的化学基团，其可用于(共价)，特别是单一的和可切割的、可保留的偶联。已知的限制很可能是为什么除了将皂苷应用于疫苗接种方案(其中暗示了免疫增强佐剂物质的使用)中以外，在临床研究中没有将皂苷与药物活性物质联合使用的原因，尽管例如本发明和本文举例说明的皂苷的显著的内体逃逸增强剂作用已为人所知超过10年。例如，提供具有共价结合的皂苷的本发明的第二缀合物，例如在携带若干皂苷的支架的情况下，至少部分地解决了这些困难。例如，提供具有通过在靶细胞的内体、内溶酶体和溶酶体中显而易见的微酸性pH(pH<6,5)的影响下切割的可切割键共价结合的皂苷的本发明的第二缀合物，使得一旦第二缀合物被胞吞并递送到细胞内则从第二缀合物切割的游离皂苷存在于所述内体、内溶酶体或溶酶体中，至少部分解决了这些困难。出人意料的是，以前在涉及皂苷作为佐剂组分的疫苗接种环境中应用其免疫增强活性的皂苷现在也适用于(共价)偶联至细胞表面分子靶向性抗体，例如由本发明的缀合物包含的sdAb，用于当与包含sdAb的ADC或AOC(即本发明的第一缀合物)组合使用时的体外和体内的抗肿瘤活性。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中sdAb是单个sdAb或者是至少两个，优选两个sdAb，其中一个或多个sdAb可以结合第一细胞表面分子，例如HIVgp41，或者第一细胞表面分子是肿瘤细胞表面受体，例如肿瘤细胞特异性受体，更优选选自以下的受体：CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、黏结蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CanAg、整合素-αV、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC-1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA-4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2、c-Met(HGFR)、EGFR1、RANKL、ADAMTS5、CD16、CXCR7(ACKR3)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)，最优选选自：HER2、c-Met、VEGFR2、CXCR7、CD71和EGFR1。
本发明的一部分是本发明的第一缀合物包含的sdAb对在靶细胞上特异性表达的细胞表面分子具有结合特异性。“特异性表达”在此应理解为细胞表面分子仅在靶细胞上的独特表达，其中例如不应该结合第一缀合物的健康细胞没有被靶向，或在此应理解为与例如健康细胞上的细胞表面分子的较低表达相比，靶细胞上靶细胞表面分子的上调或相对高的表达，所述健康细胞不应或至少在低得多的程度上结合缀合物。这些列出的细胞受体是这样的细胞表面分子，其对作为第一缀合物的靶标的细胞具有足够的特异性，因此是被第一缀合物结合的优选候选物。应当理解，当靶细胞上细胞表面分子的表达与本发明的第一缀合物不打算靶向的其他细胞上的表达相比较时，某种细胞表面分子的特异性越高，当考虑细胞内效应分子的活性时，治疗窗更好。例如，第一缀合物靶向的合适靶标包括其他肿瘤细胞特异性受体、HER2、EGFR，例如EGFR1和CD71。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第一缀合物包含的sdAb是单个sdAb或者是至少两个，优选两个sdAb，其中该一个或多个sdAb选自：抗CD71 sdAb、抗HER2sdAb、抗CD20 sdAb、抗CA125 sdAb、抗EpCAM(17-1A)sdAb、抗EGFR sdAb、抗CD30 sdAb、抗CD33 sdAb、抗血管整合素α-vβ-3sdAb、抗CD52 sdAb、抗CD22 sdAb、抗CEA sdAb、抗CD44v6sdAb、抗FAP sdAb、抗CD19 sdAb、抗CanAg sdAb、抗CD56 sdAb、抗CD38 sdAb、抗CA6 sdAb、抗IGF-1R sdAb、抗整合素sdAb、抗黏结蛋白聚糖-1sdAb、抗CD79b、抗c-Met sdAb、抗EGFR1sdAb、抗VEGFR2 sdAb、抗CXCR7 sdAb和抗HIVgp41，其中该一个或多个sdAb优选是一个或多个VHH，更优选是一个或多个骆驼VH。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第一缀合物包含可结合HER2、CD71、HIVgp41和/或EGFR的sdAb，其中sdAb优选为VHH，更优选为骆驼VH。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第一缀合物包含用于结合HER2的sdAb，其选自：由克隆11A4、克隆18C3、克隆22G12、克隆Q17或克隆Q17-C-标签产生的sdAb；或用于结合EGFR并由克隆抗EGFR Q86-C-标签产生的sdAb；或用于结合CD71并由克隆抗CD71 Q52-C-标签产生的sdAb；或用于结合HIVgp41并由克隆抗HIVgp41 Q8-C-标签产生的sdAb；或由SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31中任一项的cDNA编码的sdAb；或具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、36-72的氨基酸序列的sdAb中的任一个，其中任选地，该第一缀合物进一步包含用于结合白蛋白的共价结合的sdAb，例如具有SEQ ID NO:33、34和35的氨基酸序列的sdAb中的任一个或多个，优选地该sdAb是VHH，更优选是骆驼VH。适用于掺入本发明第一缀合物的VHH例如在以下中找到：单结构域抗体数据库(Wilton,E.E.等人(2018))、专利申请US20160251440(抗CD123、抗CEACAM)、US9683045(抗c-Met)、US20090252681(抗EGFR、抗IGF-1R)、US9969805(抗HER2)、US20190023796A1(抗HER3)和Kijanka等人(2013)(对于抗HER2)和Mercier等人(2019)(对于抗HER2)。下文还鉴于它们与肿瘤细胞特异性受体结合的能力提供了抗HER2、抗HER3、抗CD123、抗CEACAM、抗c-Met、抗-EGFR、抗-IGF-1R、抗-PD-L1、抗-CTLA-4、抗-CD19、抗-HER1和抗-VGFR2的一系列合适的VHH的氨基酸序列和/或cDNA序列，如SEQ ID NO 1-32和36-72。特别地，能够结合到任何肿瘤细胞特异性受体HER2、VEGFR和CD71上的结合位点的VHH适合并入本发明的第一缀合物中。发明人揭示了包含靶向任何一种此类受体的VHH的ADC可有效递送与sdAb结合的效应分子。例如，参见实例部分和图4-7。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中该效应分子包含以下或由以下组成：小分子如药物分子、毒素如蛋白毒素、寡核苷酸如BNA、异种核酸或siRNA、酶、肽、蛋白质中的至少一个或其任何组合。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中效应分子选自以下中的任何一个或多个：载体、基因、诱导细胞自杀的转基因、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、抗有义寡核苷酸(ASO，AON)、短干扰RNA(siRNA)、抗微小RNA(抗miRNA)、DNA适体、RNA适体、mRNA、小环DNA、肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯吗啉寡聚物(PMO)、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2'-脱氧-2'-氟阿拉伯糖核酸(FANA)、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、www.biosyn.com/literaturevault/superior-silencing-by-2-4-bnanc-based-short-antisense-oligonucleotides.aspx、3’-氟己糖醇核酸(FHNA)、质粒、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)或其衍生物，更优选BNA，例如用于沉默HSP27蛋白表达的BNA或用于沉默载脂蛋白B表达的BNA。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中效应分子是选自以下中的任何一个或多个的寡核苷酸：短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、抗发夹状微小RNA(miRNA)、单链RNA、适体RNA、双链RNA(dsRNA)、抗微小RNA(抗miRNA、抗miR)、反义寡核苷酸(ASO)、mRNA、DNA、反义DNA、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2'-O,4'-氨基乙烯桥接核酸(BNANC)、基于BNA的siRNA和基于BNA的反义寡核苷酸(BNA-AON)。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中效应分子是选自抗miRNA、BNA-AON或siRNA例如基于BNA的siRNA中的任一个的寡核苷酸，优选选自化学修饰的siRNA、代谢稳定的siRNA和化学修饰的代谢稳定的siRNA。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中效应分子是寡核苷酸，该寡核苷酸当存在于包含基因的细胞中时能够沉默这样的基因，其中该基因是以下基因中的任何一个：载脂蛋白B(apoB)、甲状腺素转运蛋白(TTR)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/科信9型(PCSK9)、δ-氨基乙酰丙酸合酶1(ALAS1)、抗凝血酶3(AT3)、乙醇酸氧化酶(GO)、补体组分C5(CC5)、乙型肝炎病毒(HBV)的X基因、HBV的S基因、α-1抗胰蛋白酶(AAT)和乳酸脱氢酶(LDH)，和/或当存在于包含异常miRNA的细胞中时能够靶向这样的miRNA。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中效应分子是寡核苷酸，该寡核苷酸当存在于包含mRNA的细胞中时能够靶向这样的mRNA，其中该mRNA参与以下任何一种蛋白质的表达：apoB、TTR、PCSK9、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因的表达产物、HBV的S基因的表达产物、AAT和LDH，或当存在于包含miRNA的细胞中时能够拮抗或恢复这样的miRNA的功能，如抑制致癌miRNA(onco-miR)或阻遏onco-miR的表达。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中效应分子包含至少一个朊分子或由其组成，优选选自肽、蛋白、酶和蛋白毒素中的任何一个或多个。本发明人发现，当选择结合HER2、VEGFR、CD71中任一种的sdAb时，可实现非常有效的肿瘤细胞杀伤，该sdAb在第一缀合物中与毒素如蛋白毒素如香石竹毒蛋白或皂草毒蛋白组合。在实施例部分提供了证明本发明的这样的第一缀合物的高功效的实例，并显示在图4-7中。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中效应分子包含以下中的至少一种或由以下中的至少一种组成：脲酶和Cre-重组酶、朊毒素、核糖体失活蛋白、蛋白毒素、细菌毒素、植物毒素，更优选选自以下中的任何一个或多个：病毒毒素，例如凋亡素；细菌毒素，例如志贺毒素、志贺样毒素、铜绿假单胞菌外毒素(PE)或PE的外毒素A、全长或截短的白喉毒素(DT)、霍乱毒素；真菌毒素，例如α-八叠球菌素；植物毒素，其包括核糖体失活蛋白和2型核糖体失活蛋白的A链，该2型核糖体失活蛋白是例如香石竹毒蛋白如香石竹毒蛋白-30或香石竹毒蛋白-32、皂草毒蛋白如皂草毒蛋白-S3或皂草毒蛋白-S6；bouganin或bouganin的去免疫衍生物debouganin、志贺样毒素A、商陆抗病毒蛋白、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、莫迪素(modeccin)、莫迪素A链、相思豆毒素、相思豆毒素A链、沃氏藤黄辛(volkensin)、沃氏藤黄辛A链、槲寄生凝集素、槲寄生凝集素A链；或动物或人毒素，例如青蛙RNA酶，或颗粒酶B或人血管生成素，或其任何有毒片段或有毒衍生物；优选地，蛋白毒素是香石竹毒蛋白和/或皂草毒蛋白。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中效应分子包含至少一个载荷或由至少一个载荷组成。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中效应分子包含以下中的至少一种或由以下中的至少一种组成：靶向核糖体的毒素、靶向延伸因子的毒素、靶向微管蛋白的毒素、靶向DNA的毒素和靶向RNA的毒素、更优选以下中的任何一种或多种：厄塔毒素、帕舒托、美登素类衍生物DM1、美登素类衍生物DM4、单甲基奥瑞西汀E(MMAE、维多汀)、单甲基瑞奥西汀F(MMAF、马福多汀)、加利车霉素、N-乙酰基-γ-加利车霉素、吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0004086218780000371
(PBD)二聚体、苯并二氮杂/>
Figure BDA0004086218780000372
CC-1065类似物、倍癌霉素、多柔比星、紫杉醇、多西他赛、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷、多西他赛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、米托蒽醌、tubulysin、吲哚啉苯并二氮杂
Figure BDA0004086218780000373
AZ13599185、念珠藻素、根霉素、甲氨蝶呤、蒽环素、喜树碱类似物、SN-38、DX-8951f、甲磺酸依喜替康、截短形式的绿脓杆菌外毒素(PE38)、倍癌霉素衍生物、鹅膏蕈碱、α-鹅膏蕈碱、斯普利他汀、泰兰斯他汀、奥加米星、泰斯林、Amberstatin269和索星、或其衍生物。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第一缀合物包含以下或由以下组成：抗体-药物缀合物(ADC)，例如包含至少一个sdAb的ADC和衍生自以下任一ADC的毒素：吉妥珠单抗-奥加米星、布仑妥昔单抗-维多汀、曲妥珠单抗-厄塔毒素、艾诺妥珠单抗-奥加米星、莫塞妥莫单抗-帕舒托(moxetumomab pasudotox)和珀拉妥珠单抗-维多汀(polatuzumab vedotin)。应当理解，当sdAb衍生自此类人抗体时，此类人抗体的VH结构域可能需要在结构域稳定性方面进行一些在本领域中是已知的改善(人VH结构域的“骆驼化”)。
在本发明中用作ADC或AOC的一部分的效应子部分(即本发明的第一缀合物)优选依赖于晚期内体逃逸来发挥其作用。一些效应分子，例如假单胞菌外毒素，在“晚期内体阶段”之前被重新引导到其他细胞器，因此，通常不会受益于掺入ADC与根据本发明的第二缀合物组合。然而，此类毒素可适用于本发明，例如，通过缺失负责重新引导的信号肽。特别是剧毒的毒素，只需要一个分子就可以逃脱内体来杀伤细胞，这些毒素可能会被修饰为效力较低的毒素。如果至少2个、更优选至少5个、更优选至少10个、更优选至少20个、更优选至少50个、最优选至少100个毒素分子逃出内体(并进入胞质溶胶)，则优选使用杀伤细胞的毒素。进一步优选的是，药物组合物所包含的或本发明的药物组合所包含的本发明的第一缀合物包含共价缀合的官能化支架，即支架，例如寡聚或聚合分子或三官能接头，其包含一个或多个共价结合的效应子部分，用于将包含一个或多个结合的效应子部分的支架靶向靶细胞，例如肿瘤细胞或自身免疫细胞。此外，为了减少脱靶毒性，细胞膜不可渗透的小分子毒素是优于细胞膜可渗透毒素的优选效应分子。
优选地，用于与本发明的第二缀合物组合的ADC或AOC(即本发明的第一缀合物)所包含的效应子部分(该效应子部分的作用被本发明的第二缀合物所包含的皂苷增强)从第一缀合物(即ADC、AOC)上脱离，例如，当内吞时，从作为第一缀合物的细胞表面分子靶向性部分存在于第一缀合物中的抗体(如sdAb)上脱离。这可以通过例如在酸性、还原性、酶或光诱导条件下断裂的可切割键来实现。
发明人表明，具有有共价偶联的反义BNA如BNA(HSP27)(本发明的第一缀合物)的肿瘤细胞靶向性单克隆抗体或sdAb与相同或不同并且具有共价偶联的皂苷的肿瘤细胞靶向性单克隆抗体或sdAb(即本发明的第二缀合物)组合(BNA偶联到细胞靶向配体(即第一缀合物)(通过可切割键)并且皂苷偶联到抗体(例如本发明第二缀合物中的sdAb)(通过可切割键))与肿瘤细胞接触跟对照和在不存在包含皂苷的本发明第二缀合物的情况下带有BNA的AOC相比，能够在肿瘤中体内沉默HSP 27)SO1861)。将ADC(本发明的第一缀合物)与包含本发明皂苷的第二缀合物一起施用，或者将抗体-寡核苷酸缀合物如本发明的抗体-BNA缀合物(其中抗体是VHH)与包含本发明皂苷的第二缀合物一起施用，从而赋予ADC或AOC抗肿瘤细胞活性，在不存在本发明的第二缀合物的情况下，在相同剂量下，仅用ADC或仅用AOC观察不到该活性。根据Zhang等人(2011)，反义BNA(HSP27)是一种具有寡核苷酸序列的BNA[YZhang,Z Qu,S Kim,V Shi,B Liao1,P Kraft,R Bandaru,Y Wu,LM Greenberger和IDHorak,Down-modulation of cancer targets using locked nucleic acid(LNA)-basedantisense oligonucleotides without transfection[使用基于锁核酸(LNA)的反义寡核苷酸在不转染的情况下下调癌症靶标],Gene Therapy[基因疗法](2011)18,326–333]。值得注意的是，就发明人所知，BNA设计用于作为游离核酸应用。发明人现在首先证明反义BNA可以通过(不)可切割的接头以如下方式与配体或抗体如mAb或sdAb如VHH共价偶联：在体外，更重要的是在体内，在荷瘤动物的肿瘤细胞中保留基因沉默活性。这种提供基于BNA的AOC(即本发明的第一缀合物)的方法开辟了向有需要的人(癌症)患者施用靶向BNA的新途径。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中皂苷包含选自以下的苷元核心结构，或者皂苷衍生物包含衍生自以下的苷元核心结构：
2α-羟基齐墩果酸；
16α-羟基齐墩果酸；
常春藤皂苷元(23-羟基齐墩果酸)；
16α,23-二羟基齐墩果酸；
丝石竹皂苷元；
皂皮酸；
原七叶皂苷元-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-22-乙酸酯；
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21,22-双(2-甲基丁-2-烯酸酯)；
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-16,22-二乙酸酯；
洋地黄皂苷配基；
3,16,28-三羟基齐墩果-12-烯；以及
丝石竹酸，
优选地，皂苷包含或皂苷衍生物衍生自选自皂皮酸和丝石竹皂苷元的苷元核心结构，更优选地，皂苷包含或皂苷衍生物衍生自苷元核心结构皂皮酸。
不希望受任何理论的束缚，皂苷的苷元核心结构(此处也称为“苷元”)中醛基团(或其衍生物)的存在有益于皂苷刺激和/或增强本发明的第一缀合物(例如ADC或AOC)所包含的效应分子的内体逃逸的能力，这是当这样的皂苷与作为本发明第二缀合物的一部分的这些效应分子共定位在细胞中在所述细胞的内体中时或者当在内体中为游离形式时(例如，一旦第二缀合物被递送到靶细胞内体或溶酶体中，就从第二缀合物中分离)并且当在带有效应分子和细胞靶向sdAb的第一缀合物的存在下暴露于细胞时。因此，包含具有带醛基团的苷元的皂苷的本发明的第二缀合物是优选的。在皂皮酸和丝石竹皂苷元中，醛基团位于苷元的C23原子处。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中皂苷或皂苷衍生物任选地包含与皂苷或皂苷衍生物的苷元核心结构的C3原子或C28原子结合的第一糖链，优选与C3原子结合，和/或其中皂苷或皂苷衍生物任选地包含与皂苷或皂苷衍生物的苷元核心结构的C28原子结合的第二糖链，优选地，至少一个皂苷包含第一和第二糖链。因此，当本发明的第二缀合物包含的皂苷带有两个聚糖(糖链)时，第一糖链结合在苷元核心结构的位置C3处并且第二糖链结合在苷元核心结构的位置C28处。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中
·皂苷或皂苷衍生物包含选自以下的第一糖链：
GlcA-，
Glc-，
Gal-，
Rha-(1→2)-Ara-，
Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-，
Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-，
Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-，
Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-，
Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-，
Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-，
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，和
其任何衍生物，
和/或
·皂苷或皂苷衍生物包含选自以下的第二糖链：
Glc-，
Gal-，
Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-，
Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-，
Ara-，
Xyl-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc-其中R1是4E-甲氧基肉桂酸，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc-其中R2是4Z-甲氧基肉桂酸，
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-，
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-二-OAc-Fuc-，
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc-其中R3是4E-甲氧基肉桂酸，
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-，
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-，
(Ara-或Xyl-)(1→3)-(Ara-或Xyl-)(1→4)-(Rha-或Fuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha-或Fuc-)(1→4)]-(Rha-或Fuc-)，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc-其中R4是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc-其中R5是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-，
6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-，
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-，
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-，
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-二-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-，
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-，
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-，
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc-其中R6是5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc-其中R7是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc-其中R8是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc-其中R9是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc-其中R10是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc-其中R11是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc-其中R12是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)
Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-，和
其任何衍生物。
因此，当本发明的第二缀合物包含的皂苷带有两个聚糖(糖链)时，第一糖链结合在苷元核心结构的位置C3处并且第二糖链结合在苷元核心结构的位置C28处。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第二缀合物中的皂苷或皂苷衍生物包含如权利要求24或25所述的第一糖链和第二糖链，其中该第一糖链包含多于一个糖部分并且该第二糖链包含多于一个糖部分，并且其中该苷元核心结构是皂皮酸或丝石竹皂苷元或是皂皮酸或丝石竹皂苷元的衍生物，其中以下中的一项、两项或三项，优选一项或两项：
i.该苷元核心结构中的醛基团已被衍生化，
ii.该第一糖链中的葡糖醛酸部分的羧基基团已被衍生化，以及
iii.该第二糖链中的至少一个乙酰氧基(Me(CO)O-)基团已被衍生化。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第二缀合物中的皂苷或皂苷衍生物包含：
i.包含醛基团的苷元核心结构，该醛基团已通过以下进行衍生化：
-还原成醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化为腙键，其中该BMPH的马来酰亚胺基团任选通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一烷酸]酰肼(KMUH)反应转化为腙键，其中该KMUH的马来酰亚胺基团任选通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
ii.第一糖链，其包含羧基基团，优选葡糖醛酸部分的羧基基团，该羧基基团已经通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化；
iii.第二糖链，其包含乙酰氧基基团(Me(CO)O-)，该乙酰氧基基团已经通过脱乙酰转化为羟基基团(HO-)而衍生化；或
iv.i.、ii.和/或iii.的两个或三个衍生化的任何组合，优选是i.、ii.和/或iii.的两个衍生化的任何组合。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中皂苷或皂苷衍生物选自：皂树树皮皂苷、川续断皂苷B、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、灰毡毛忍冬皂苷A、商陆皂苷A、商陆皂苷元、七叶皂苷盐、AS6.2、NP-005236、AMA-1、AMR、α-常春藤皂苷、NP-012672、NP-017777、NP-017778、NP-017774、NP-018110、NP-017772、NP-018109、NP-017888、NP-017889、NP-018108、SA1641、AE X55、NP-017674、NP-017810、AG1、NP-003881、NP-017676、NP-017677、NP-017706、NP-017705、NP-017773、NP-017775、SA1657、AG2、SO1861、GE1741、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1904、SO1862、QS-7、QS1861、QS-7api、QS1862、QS-17、QS-18、QS-21A-apio、QS-21A-xylo、QS-21B-apio、QS-21B-xylo、β-七叶皂苷、七叶皂苷Ia、油茶籽皂苷I、油茶籽皂苷J、阿萨姆皂苷F、洋地黄皂苷、报春花酸1和AS64R、或其衍生物、或其立体异构体、和/或其组合，优选皂苷或皂苷衍生物是以下中的任何一个或多个：QS-21或QS-21衍生物、SO1861或SO1861衍生物、SA1641或SA1641衍生物和GE1741或GE1741衍生物，更优选QS-21衍生物或SO1861衍生物，最优选SO1861衍生物，其中优选这样的皂苷衍生物是根据本发明的皂苷衍生物。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中皂苷或皂苷衍生物选自：SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、皂树皂苷、Saponinum album、QS-18、Quil-A、Gyp1、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1862、SO1904、或其衍生物、或其立体异构体、和/或其任何组合，优选地，该皂苷衍生物是SO1861衍生物和/或GE1741衍生物和/或SA1641衍生物和/或QS-21衍生物，更优选地，该皂苷衍生物是SO1861衍生物或QS21衍生物，最优选的是，该皂苷衍生物是根据本发明的SO1861衍生物。
当皂苷作为第二缀合物的一部分或以游离形式与细胞内的效应分子共定位时，这种三萜糖苷类型的皂苷能够增强第一缀合物所包含的并且存在于细胞的内体(或溶酶体)中的效应分子的内体逃逸。发明人确定，当皂苷作为本发明第二缀合物的一部分与细胞接触时，这些皂苷的内体逃逸增强活性约为100至1000倍更有效。当这样的细胞与作为第一缀合物的一部分的效应分子接触时，游离皂苷能够刺激效应分子在细胞胞质溶胶中的递送，并且与本发明第二缀合物所包含的相同皂苷的浓度相比，皂苷的浓度高100-1000倍，这是实现效应分子从靶细胞的外部递送到内体内并最终递送到所述细胞的胞质溶胶中的相同程度递送所需要的。表A1列出了显示这种内体逃逸增强活性的皂苷，以及与已经确定增强第一缀合物所包含的效应分子的胞质递送的能力的皂苷具有高度结构相似性的皂苷。当皂苷是本发明缀合物的一部分时，当第二缀合物的结合分子如抗体或sdAb与靶细胞上、所述细胞上的第二细胞表面结合位点结合时，并且在内吞后，皂苷靶向所述细胞的内体中的递送与使相同细胞与游离的、未靶向的皂苷(衍生物)(其不具有用于结合靶细胞的第二细胞表面分子的结合分子，例如抗体或sdAb)接触相比是约100至1000倍更有效。对于某些实施例，第二缀合物包含的结合分子是sdAb。与例如IgG型抗体或其片段如Fab、scFv相比，本发明的第二缀合物的sdAb的小尺寸有助于靶细胞的有效摄取(例如通过内吞作用摄取)，所述靶细胞暴露用于结合第二缀合物所包含的sdAb的第二结合位点。通常，本发明的第二缀合物中的sdAb能够结合靶细胞的细胞表面受体，例如肿瘤细胞特异性细胞表面受体，其与本发明的第一缀合物中包含的sdAb靶向的细胞表面受体相同或不同。这样，本发明的第一和第二缀合物特别适合于内吞到例如表达第一和第二细胞表面受体的肿瘤细胞中，其中这些第一和第二细胞表面受体可以相同或不同。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第二缀合物包含用于与第二细胞表面分子结合的结合分子，该结合分子是以下中的任何一个或多个：用于结合第二细胞表面分子例如EGF或细胞因子的配体例如朊配体，或免疫球蛋白或所述免疫球蛋白的能够结合第二细胞表面分子的至少一个结合片段或结合结构域，其中免疫球蛋白优选是以下中的任何一个或多个：抗体，例如单克隆抗体，优选人抗体，IgG，包含sdAb或由sdAb组成的分子，至少一个VHH结构域或至少一个VH结构域，可变重链新抗原受体(VNAR)结构域，Fab，scFv，Fv，dAb，F(ab)2，Fcab片段。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第二缀合物包含用于结合第二细胞表面分子的结合分子，其中第二细胞表面分子是存在于异常细胞如肿瘤细胞、自身免疫细胞、感染的细胞如病毒感染的细胞上的细胞表面受体。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第二缀合物包含用于结合第二细胞表面分子的结合分子，例如抗体或其结合片段或结合结构域，例如sdAb，或受体配体，其中优选第二细胞表面受体是HIVgp41或肿瘤细胞表面受体，例如肿瘤细胞特异性受体，更优选选自以下的细胞表面受体：CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、黏结蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CanAg、整合素-αV、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC-1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA-4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2、c-Met(HGFR)、EGFR1、RANKL、ADAMTS5、CD16、CXCR7(ACKR3)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)，最优选选自：HER2、c-Met、VEGFR2、CXCR7、CD71、EGFR和EGFR1。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第二缀合物包含用于结合第二细胞表面分子的结合分子，该结合分子是选自以下的免疫球蛋白，优选衍生自以下或基于以下的sdAb：抗CD71抗体如IgG型OKT-9、抗HER2抗体如曲妥珠单抗(赫赛汀)、珀妥珠单抗、抗CD20抗体如利妥昔单抗、奥法妥木单抗、托司妥莫单抗、奥比妥珠单抗艾瑞妥莫单抗、抗CA125抗体如奥戈伏单抗、抗EpCAM(17-1A)抗体如依决洛单抗、抗EGFR抗体如西妥昔单抗、马妥珠单抗、帕尼妥木单抗、尼妥珠单抗、抗CD30抗体如布仑妥昔单抗、抗CD33抗体如吉妥珠单抗、huMy9-6、抗血管整合素α-vβ-3抗体如伊瑞西珠单抗、抗CD52抗体如阿仑单抗、抗CD22抗体如依帕珠单抗、匹那妥珠单抗、抗CD22抗体莫塞妥莫单抗的结合片段(Fv)、人源化单克隆抗体艾诺妥珠单抗、抗CEA抗体如拉贝妥珠单抗、抗CD44v6抗体如比伐珠单抗、抗FAP抗体如西罗珠单抗、抗CD19抗体如huB4、抗CanAg抗体如huC242、抗CD56抗体如huN901、抗CD38抗体如达雷木单抗、OKT-10抗CD38单克隆抗体、抗CA6抗体如DS6、抗IGF-1R抗体如西妥木单抗、3B7、抗整合素抗体如CNTO 95、抗黏结蛋白聚糖-1抗体如B-B4、抗CD79b如珀拉妥珠单抗、抗HIVgp41抗体，优选以下中的任何一种：抗HIVgp41抗体、抗CD71抗体、抗HER2抗体和抗EGFR抗体，更优选以下中的任何一种：曲妥珠单抗、珀妥珠单抗、西妥昔单抗、马妥珠单抗、抗CD71抗体、OKT-9，最优选曲妥珠单抗、西妥昔单抗、抗CD71抗体OKT-9。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第二缀合物包含可结合HER2、CD71、HIVgp41和/或EGFR的sdAb，其中sdAb优选为VHH，更优选为骆驼VH。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第二缀合物包含用于结合HER2的sdAb，其选自：由克隆11A4、克隆18C3、克隆22G12、克隆Q17或克隆Q17-C-标签产生的sdAb；或用于结合EGFR并由克隆抗EGFR Q86-C-标签产生的sdAb；或用于结合CD71并由克隆抗CD71 Q52-C-标签产生的sdAb；或用于结合HIVgp41并由克隆抗HIVgp41 Q8-C-标签产生的sdAb；或由SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31中任一项的cDNA编码的sdAb；或具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、36-72的氨基酸序列的sdAb中的任一个，其中任选地，该第一缀合物进一步包含用于结合白蛋白的共价结合的sdAb，例如具有SEQ ID NO:33、34和35的氨基酸序列的sdAb中的任一个或多个，优选地该sdAb是VHH，更优选是骆驼VH。适用于掺入本发明第二缀合物的VHH例如在以下中找到：单结构域抗体数据库(Wilton,E.E.等人(2018))、专利申请US20160251440(抗CD123、抗CEACAM)、US9683045(抗c-Met)、US20090252681(抗EGFR、抗IGF-1R)、US9969805(抗HER2)、US20190023796A1(抗HER3)和Kijanka等人(2013)(对于抗HER2)和Mercier等人(2019)(对于抗HER2)。下文还鉴于它们与肿瘤细胞特异性受体结合的能力提供了抗HER2、抗HER3、抗CD123、抗CEACAM、抗c-Met、抗-EGFR、抗-IGF-1R、抗-PD-L1、抗-CTLA-4、抗-CD19、抗-HER1和抗-VGFR2的一系列合适的VHH的氨基酸序列和/或cDNA序列，如SEQ ID NO 1-32和36-72。特别地，能够结合到任何肿瘤细胞特异性受体HER2、VEGFR和CD71上的结合位点的VHH适合并入本发明的第二缀合物中。发明人揭示，皂苷和包含靶向任一此类受体的VHH的结合分子的缀合物在递送与sdAb结合的皂苷方面是有效的。例如，参见实例部分和图2-4。
这些细胞表面分子通常至少在一定程度上以肿瘤细胞特异性存在于肿瘤细胞上。肿瘤细胞特异性使这些受体成为本发明第一和第二缀合物的合适靶标，因此第一缀合物中的sdAb能够结合这样的细胞表面受体，并且因此本发明第二缀合物包含的结合分子如抗体或sdAb能够结合这样的细胞表面受体。肿瘤细胞通常被第二缀合物靶向，所述第二缀合物包含肿瘤细胞受体靶向结合分子，例如抗体或其结合片段或结构域，并且包含将被递送到靶肿瘤细胞内的皂苷，更具体地递送到所述肿瘤细胞的胞质溶胶中。由于本发明的第二缀合物所包含的皂苷能够刺激本发明的第一缀合物所包含的效应分子在细胞的胞质溶胶中，例如在由本发明的第二缀合物所包含的第二缀合物的结合分子(例如sdAb)靶向的(肿瘤)细胞中的释放和递送，特别适合选择已知其适合作为例如ADC和AOC的靶的细胞表面受体作为结合分子例如sdAb的靶(肿瘤)细胞表面分子。因此，本发明的第一和第二缀合物适合于作为第一缀合物一部分的效应分子与本发明第二缀合物包含的皂苷一起共同递送，所述效应分子是包含sdAb的ADC或AOC。用本发明的第二缀合物靶向肿瘤细胞特异性受体促进了作为第二缀合物一部分的皂苷内吞和递送到靶细胞内体和/或溶酶体中。当肿瘤细胞也与ADC或AOC(例如本发明的第一缀合物)接触时，由这样的ADC或AOC或本发明的第一缀合物包含的效应分子被共同递送到内体或溶酶体中，并且在皂苷的影响下，效应分子随后被递送到靶细胞的胞质溶胶中。如前所述，当考虑本发明的第一缀合物所包含的效应分子的生物活性时，与缺乏细胞靶向结合分子如受体配体、抗体或sdAb的游离皂苷的应用相比，作为本发明的第二缀合物的一部分的靶向皂苷的应用导致皂苷刺激作用增强约100倍至1000倍。与通常观察到的基于抗体的ADC的清除率相比，在本发明的第二缀合物中应用小的sdAb(例如骆驼VH)可防止或减缓本发明的第二缀合物从施用第二缀合物的人受试者的循环和身体中的清除，如所述这对于包含sdAb的第一缀合物也是明显的。此外，由于sdAb的相对小的尺寸，与例如结合皂苷的抗体的较大尺寸相比，由于连接的蛋白结构域的存在而限制或阻碍靶细胞内皂苷活性的风险是有限的。一般而言，与皂苷连接的分子尺寸越小，由于结合分子(例如抗体结构域，如VHH)的存在，干扰细胞内皂苷活性的风险越小。此外，与通常应用于例如ADC、OAC中的相对大尺寸的IgG相比，sdAb的相对小尺寸导致它们在组织(例如肿瘤组织)中的快速分布，从而允许本发明的第二缀合物更好地到达靶细胞，并由此改善与靶细胞的结合(程度)。在本发明的第二缀合物中应用sdAb的许多益处之一(其也适用于在例如ADC和AOC(即本发明的第一缀合物)中应用sdAb)是没有例如IgG型常规抗体共有的Fc尾。当将本发明的第一和第二缀合物施用于有需要的患者时，本发明的第一和第二缀合物中sdAb中没有Fc尾可防止发生Fcγ-受体介导的靶外效应，例如与Fcγ-受体活化相关的不希望的副作用。没有Fc尾消除了Fc与患者(例如施用基于抗体的ADC的患者)的细胞结合产生副作用的风险。包含本发明缀合物的sdAb不具有Fc介导的不良副作用的这种风险，而发明人揭示，当肿瘤细胞与ADC(以相对低的剂量；也参见实例部分)和本发明的第二缀合物(以相对低剂量；也参见实例部分)接触时，这样的第一和第二缀合物在增强第一缀合物包含的效应分子方面是高效和有效的。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第二缀合物包含皂苷或皂苷衍生物，皂苷或皂苷衍生物通过硫醚键共价结合到结合分子中的巯基基团，共价键合通过接头N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)，该接头共价结合到皂苷或皂苷衍生物的苷元核心结构的位置C23处的醛基团上并且共价结合到结合分子中的巯基基团，如半胱氨酸的巯基基团。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第二缀合物包含皂苷或皂苷衍生物，皂苷或皂苷衍生物是双糖链三萜皂苷或其衍生物，该双糖链三萜皂苷或其衍生物属于在皂苷或其衍生物的苷元核心结构的位置C23处任选地具有醛官能团的12,13-脱氢齐墩果烷类型，并且在皂苷的苷元核心结构的C3β-OH基团处的第一糖链中包含葡糖醛酸单元，其中皂苷或其衍生物通过第一糖链中葡糖醛酸单元的羧基基团，优选通过至少一个接头，共价结合到结合分子的氨基酸残基上，其中氨基酸残基优选选自半胱氨酸和赖氨酸。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第二缀合物包含皂苷或其衍生物，该皂苷或其衍生物在至少一个皂苷或其衍生物的苷元核心结构的C3β-OH基团处的第一糖链中包含葡糖醛酸单元，该葡糖醛酸单元共价结合到接头上，该接头优选通过酰胺键共价结合到结合分子中的胺基团上，例如结合分子的赖氨酸或N末端的胺基团，优选葡糖醛酸单元是共价结合的接头1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中第二缀合物包含多于一个共价结合的皂苷或其衍生物，优选2、3、4、5、6、8、10、16、32、64、128或1-100个，或其间的任何数目，例如7、9、12个皂苷或其衍生物。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中多于一个共价结合的皂苷或皂苷衍生物直接与结合分子的氨基酸残基共价结合，优选与半胱氨酸和/或赖氨酸共价结合，和/或通过至少一个接头和/或通过至少一个可切割接头共价结合。当考虑结合分子上用于皂苷偶联的结合位点时，皂苷通过接头与结合分子如抗体、sdAb或第二细胞表面分子的配体的偶联提供了柔性。此外，这样接头可作为结合分子如sdAb和皂苷之间的间隔物，使得当结合分子如sdAb与细胞表面分子以及效应分子结合后第二缀合物共定位于第一缀合物靶向的细胞的内体或溶酶体中时，结合分子保持其与细胞表面分子上的结合位点结合的能力并且皂苷保持其增强第一缀合物所含效应分子的内体逃逸的能力。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中多于一个共价结合的皂苷或皂苷衍生物是共价皂苷缀合物的一部分，所述缀合物包含至少一个寡聚分子或聚合分子，并且所述多于一个皂苷或皂苷衍生物与其共价结合，其中所述共价皂苷缀合物与结合分子共价结合。这样的共价皂苷缀合物充当多个皂苷部分的载剂，皂苷部分可以通过单键，优选通过(可切割的)接头，与第二缀合物所包含的结合分子，如抗体或sdAb结合。由于共价皂苷缀合物可带有任何选定数目的共价结合的皂苷部分，例如1-200个皂苷部分(这与包括用于共价连接这些皂苷的结合位点的选定寡聚或聚合结构的类型有关)，当考虑本发明的第二缀合物中皂苷部分的数目时，这种共价皂苷缀合物的应用提供了自由度。例如，对于本发明的第一缀合物所包含的选定效应分子的胞质递送，当共价皂苷缀合物是本发明的第二缀合物的一部分时，并且当效应分子与第二缀合物共定位在效应分子应发挥其生物活性的靶细胞的内体或溶酶体中时，本发明的第二缀合物中存在的皂苷的数量可以通过提供共价皂苷缀合物来适应，所述共价皂苷缀合物具有足以和足够刺激效应分子的胞质递送的数量的皂苷部分。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中1-8个这样的共价皂苷缀合物结合到结合分子上，更优选2-4个这样的共价皂苷缀合物，其中至少一个共价皂苷缀合物任选地基于树状突，其中任选地1-32个皂苷或皂苷衍生物，优选2、3、4、5、6、8、10、16、32个，或其间任意数目，例如7、9、12个皂苷或皂苷衍生物，直接或通过接头与至少一个共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子共价结合。优选地，一个或两个共价皂苷缀合物与单个结合分子(例如本发明的第二缀合物中的sdAb)结合。对于许多目的，单个皂苷或单个共价皂苷缀合物与第二缀合物所包含的单个结合分子如抗体或sdAb的偶联足以有效刺激效应分子递送到靶细胞中和所述细胞的胞质溶胶中，其中效应分子由本发明的第一缀合物所包含。通常，本发明的第二缀合物包含4、8或16个皂苷，例如由与本发明的第二缀合物中的结合分子如sdAb偶联的单个共价皂苷缀合物所包含的4或8个皂苷。通常，本发明的这样的第二缀合物包含单个抗体或单个sdAb，一个或多个皂苷或一个或多个共价皂苷缀合物与其结合，优选单个皂苷或单个共价皂苷缀合物是第二缀合物的一部分。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中皂苷或皂苷衍生物通过可切割接头共价结合到结合分子上。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中该可切割接头在酸性条件、还原条件、酶促条件和/或光诱导条件下经受切割，并且优选地，该可切割接头包含选自以下的可切割键：在酸性条件下经受切割的腙键和酰肼键，和/或易进行蛋白水解的键，例如被组织蛋白酶B进行蛋白水解的键，和/或在还原条件下易被切割的键，例如二硫键。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中可切割接头在酸性条件下进行体内切割，例如哺乳动物细胞，优选人细胞的内体和/或溶酶体中存在的酸性条件下，优选在pH 4.0-6.5，更优选在pH≤5.5。这种在内体和溶酶体中明显的条件下可切割的可切割接头有助于游离皂苷在内体或溶酶体中在皂苷从本发明的第二缀合物的剩余部分切割后的递送。这样，本发明的第二缀合物组合了以下的益处：在结合分子如抗体或sdAb与靶细胞上的第二细胞表面分子特异性结合后皂苷的细胞靶向递送，以及游离皂苷在细胞内，即在内体(或溶酶体)内的存在，这有助于游离皂苷刺激和/或促进本发明的第一缀合物所包含的效应分子递送出内体(或溶酶体)并进入靶细胞胞质溶胶的能力。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子与结合分子共价结合，优选与结合分子的氨基酸残基共价结合。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中皂苷或皂苷衍生物通过根据本发明的可切割接头共价结合至共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中皂苷或皂苷衍生物通过亚胺键、腙键、酰肼键、肟键、1,3-二氧戊环键、二硫键、硫醚键、酰胺键、肽键或酯键中的任何一个或多个，优选通过接头与该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子共价结合。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中皂苷或皂苷衍生物包含在位置C23含有醛官能团的苷元核心结构，并且皂苷任选地在该皂苷的苷元核心结构的C3β-OH基团处的第一糖链中包含葡糖醛酸官能团，该醛官能团参与与该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子的共价键合，和/或，如果存在的话，该葡糖醛酸官能团参与与该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子的共价键合，该皂苷或皂苷衍生物的键合通过直接共价键或通过接头，其中该接头是可切割接头或稳定接头。这里，稳定是指皂苷和结合分子如sdAb之间的键，或指皂苷和寡聚或多聚结构之间的键，该键在细胞内的酸性条件下，特别是在此类细胞的内体或溶酶体的酸性条件下，保持完整(未切割)。此外，这种稳定的键在例如施用了包含共价皂苷缀合物的本发明的第二缀合物的人受试者的循环和器官中保持完整(即未切割)。相比之下，在皂苷与第二缀合物包含的结合分子如抗体或sdAb结合的情况下或者与寡聚结构或多聚结构结合的情况下，可切割接头是指在哺乳动物细胞如人细胞如肿瘤细胞的内体和溶酶体内显而易见的酸性条件下被切割的键，而当包含这种可切割键的第二缀合物存在于例如施用本发明的第二缀合物的人受试者的循环或器官中，即细胞外时，这种可切割接头保持完整(未被切割)。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中皂苷或皂苷衍生物的苷元核心结构的位置C23的醛官能团与接头EMCH共价结合，该EMCH通过硫醚键共价结合到该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子中的巯基基团，例如半胱氨酸的巯基基团。EMCH接头与皂苷苷元的醛基团的结合导致腙键的形成。这样的腙键是内体和溶酶体内酸性条件下可切割键的典型实例。与第二缀合物包含的结合分子(例如本发明第二缀合物中的抗体或sdAb)偶联或者与共价皂苷缀合物(其中这样的共价皂苷缀合物与第二缀合物的结合分子偶联，例如与本发明第二缀合物中的sdAb偶联)的寡聚结构或聚合结构偶联的皂苷一旦在暴露结合分子(例如第二缀合物的抗体或sdAb)可以结合的第二细胞表面分子的靶细胞的内体或溶酶体中递送就可从本发明的第二缀合物中释放。这样，本发明第二缀合物中与结合分子如sdAb偶联的皂苷从细胞的外部转移到内体(或溶酶体)中，在内体(或溶酶体)中，皂苷在pH驱动的腙键切割后从第二缀合物释放。在内体(或溶酶体)中，当考虑将本发明的第一缀合物(其共定位于内体(或溶酶体)中)包含的效应分子递送到胞质溶胶中时，游离皂苷可以发挥其刺激活性。出人意料的是，发明人确定对于皂苷而言，皂苷以游离形式存在于内体或溶酶体中并不是皂苷内体逃逸增强活性的先决条件。此外，一旦分别作为第一和第二缀合物的一部分的效应分子和皂苷都与表达第一细胞表面分子和第二细胞表面分子(所述第一细胞表面分子和第二细胞表面分子可以相同或不同)的相同靶细胞接触，例如本发明的第二缀合物所包含的皂苷加强了第一缀合物所包含的效应分子从内体/溶酶体出来到靶细胞的胞质溶胶中的递送。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中在该皂苷或皂苷衍生物的苷元核心结构的C3β-OH基团处的第一糖链中的葡糖醛酸官能团与接头HATU共价结合，该HATU通过酰胺键共价结合到该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子中的胺基团，例如蛋白质的赖氨酸或N末端的胺基团。当HATU接头与皂苷和第二缀合物的结合分子例如sdAb偶联时，皂苷例如与sdAb的N末端或sdAb中存在的赖氨酸的胺基团结合。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中共价皂苷缀合物的聚合分子或寡聚分子结合到结合分子，优选结合到结合分子的氨基酸残基，涉及该共价皂苷缀合物的聚合分子或寡聚分子上的点击化学基团，该点击化学基团优选选自四嗪、叠氮化物、烯烃或炔烃或这些基团的环状衍生物，更优选该点击化学基团是叠氮化物。
实施例是本发明的药物组合或药物组合物，其中共价皂苷缀合物的聚合分子或寡聚分子包含选自以下的聚合结构和/或寡聚结构：线性聚合物、支化聚合物和/或环状聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、树状突、树状突化聚合物、树状突化寡聚物、DNA、多肽、聚赖氨酸、聚乙二醇、寡聚乙二醇(OEG)，例如OEG3、OEG4和OEG5，或这些聚合结构和/或寡聚结构的组装，该组装优选通过共价交联构建，优选该共价皂苷缀合物的聚合分子或寡聚分子是树状突，例如聚酰胺基胺(PAMAM)树枝状聚合物。由待掺入本发明的第二缀合物中的所选皂苷的数目驱动，选择寡聚结构或聚合结构的类型和大小或长度。也就是说，为了形成本发明的第二缀合物，要偶联到第二缀合物所包含的结合分子如sdAb上的皂苷的数量可以决定选择合适的寡聚或多聚结构，其带有足够数量的结合位点以偶联所期望数量的皂苷，从而提供共价皂苷缀合物，其带有要偶联到结合分子如抗体、受体配体或sdAb上的选定数量的皂苷部分，以提供本发明的第二缀合物。例如，OEG的长度或树状突分子或聚赖氨酸分子的大小决定了可以共价连接到此类寡聚或聚合结构的皂苷的最大数量。
因此，根据本发明的第二缀合物包含至少一个皂苷。本文中的“至少一个”是指第二缀合物包含一个皂苷分子，但也可以包含一些(例如两个、三个或四个)皂苷或多个(例如10、20或100个)皂苷。取决于应用，第二缀合物可以包含具有共价结合的皂苷的共价结合支架(共价皂苷缀合物)，其中所述支架可以被设计成包含限定数量的皂苷。优选地，根据本发明的第二缀合物包含限定数目或范围的皂苷，而不是随机数目。这对于与上市许可相关的药物开发尤其有利。在这方面定义的数量意味着第二缀合物优选包含先前定义数量的皂苷。例如，这是通过设计包含聚合结构的支架来实现的，该聚合结构具有一定数量的可能用于一个或多个皂苷(共价)附着的部分。在理想情况下，所有这些部分都与皂苷偶联，并且支架包含预先定义数量的皂苷。设想提供一套标准支架，包括例如二、四、八、十六、三十二、六十四个等皂苷，以便用户可以根据他的需要容易地测试最佳数量。实施例是本发明的第二缀合物，其包含本发明的支架(本发明的共价皂苷缀合物)，其中皂苷以限定的范围存在，例如，在非理想情况下，并非聚合结构中存在的所有部分都结合皂苷。例如，这样的范围可以是每个支架2-4个皂苷分子、每个支架3-6个皂苷分子、每个支架4-8个皂苷分子、每个支架6-8个皂苷分子、每个支架6-12个皂苷分子等等。在这种情况下，包含根据本发明的支架的第二缀合物(本发明的共价皂苷缀合物)因此包含2、3或4个皂苷，如果该范围被定义为2-4。
在本发明的第二缀合物中，支架基本上不依赖于与支架共价结合的皂苷的类型，支架随后(按顺序)与细胞表面分子结合分子如受体配体、抗体如sdAb共价偶联。因此，包含支架的本发明的第二缀合物(本发明的共价皂苷缀合物)是平台技术的基础产品。根据本发明，由于本发明的第二缀合物中的至少一个共价结合的皂苷介导了与细胞表面分子靶向性sdAb结合的效应子部分(其包括在本发明的第一缀合物如包含根据本发明sdAb的ADC或AOC中)的细胞内递送，根据本发明的支架技术是一种通过将ADC或AOC(即本发明的第一缀合物)与本发明的第二缀合物组合来介导通过皂苷的受控细胞内效应子部分递送的系统，所述第二缀合物包含皂苷和例如且优选用于结合靶细胞的细胞表面分子(例如且优选参与受体的内吞的受体)的抗体(例如sdAb)以及与其结合的缀合物。该支架提供了优化的功能活性单元，其可以在配体例如sdAb中的单个确定位置连接到由第二缀合物包含的一个或多个皂苷和细胞表面分子靶向配体如抗体如sdAb。
实施例是包含根据本发明的支架的本发明的第二缀合物(本发明的共价皂苷缀合物)，其中聚合结构或寡聚结构的单体数量是精确定义的数量或范围。优选地，聚合或寡聚结构包括结构例如聚(胺)，例如聚乙烯亚胺和聚(酰胺基胺)，或结构例如聚乙二醇、聚(酯)，例如聚(丙交酯)、聚(内酰胺)、聚丙交酯-共-乙交酯共聚物、聚(糊精)，或肽或蛋白质，或结构例如天然和/或人工聚氨基酸，例如聚赖氨酸、DNA聚合物、稳定的RNA聚合物或PNA(肽核酸)聚合物，其表现为线性、支化或环状聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、树状突、树状突化聚合物、树状突化寡聚物或这些结构的纯的或者是混合的组装体。优选地，聚合结构或寡聚结构是生物相容的，其中生物相容性是指所述聚合结构或寡聚结构在生物体中不表现出显著的急性或慢性毒性，并且可以按原样排泄或通过机体代谢完全降解为可排泄的和/或生理性的化合物。可以通过共价交联或非共价键和/或吸引来构建组件。因此，它们也可以形成纳米凝胶、微凝胶或水凝胶，或者它们可以附着在载体上，例如无机纳米颗粒、胶体、脂质体、胶束或包含胆固醇和/或磷脂的颗粒状结构。所述聚合结构或寡聚结构优选带有精确限定数目或范围的偶联部分(化学基团)，用于糖苷分子(和/或载体分子，例如配体、单克隆抗体或其片段，例如sdAb，其中sdAb根据本发明是优选的)的偶联。聚合结构或寡聚结构中精确定义数量或范围的偶联部分(化学基团)中优选至少50％，更优选至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％，更优选至少99％，最优选(约)100％被根据本发明的支架(本发明的共价皂苷缀合物)中的苷分子(本发明皂苷)占据。
优选地，树状突是一种分支的、明确定义的树状聚合物，在树的起点有单一的化学可寻址基团，称为焦点。树枝状聚合物是两个或多个树状突在其焦点处的连接。树状突化聚合物是一个或多个树状突的焦点与聚合物的连接。在优选的实施例中，提供了根据本发明的支架，其中聚合或寡聚结构包括线性、支化或环状聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、树状突、树状突化聚合物、树状突化寡聚物或这些结构的纯的或者是混合的组装体，其中组装体可以通过共价交联或非共价吸引来构建，并且可以形成纳米凝胶、微凝胶或水凝胶，并且其中优选地，聚合物是聚(胺)的衍生物，例如聚乙烯亚胺和聚(酰胺基胺)，以及结构例如聚乙二醇、聚(酯)，例如聚(乳酸)、聚(内酰胺)、聚丙交酯-共-乙交酯共聚物和聚(糊精)，以及结构例如天然和/或人工聚氨基酸，例如聚赖氨酸，或肽或蛋白质或DNA聚合物，稳定的RNA聚合物或PNA(肽核酸)聚合物。优选地，聚合结构或寡聚结构是生物相容的。
应当理解，当本发明第二缀合物中的结合分子，例如sdAb和本发明第一缀合物(即ADC或AOC)中的sdAb靶向不同的细胞表面分子，例如不同的肿瘤细胞特异性受体时，两种不同的靶标都存在于靶细胞的表面，其中第一缀合物(即ADC或AOC)所包含的效应分子和本发明第二缀合物所包含的皂苷应该被共同递送。当ADC或AOC(本发明的第一缀合物)和本发明的第二缀合物靶向不同的(肿瘤)细胞受体时，当本发明的第一缀合物(ADC或AOC)和本发明的第二缀合物的剂量与包括靶细胞在内的不同细胞类型的混合物接触时(例如当将本发明的第一缀合物(ADC或AOC)和本发明的第二缀合物的组合(共同)施用给有需要的患者时发生的情况)，优点是例如对例如在其表面上具有两种细胞表面分子之一的细胞产生脱靶效应的风险降低。通过施用本发明的第一缀合物(ADC或AOC)，其剂量太低而不能当ADC或AOC与这种靶细胞结合时在没有本发明第二种缀合物形式中的靶向皂苷的情况下在靶细胞内递送治疗有效量的效应分子，因此，当考虑ADC时，进入细胞(其可表达ADC或AOC(本发明的第一缀合物)可结合的细胞表面分子，但不表达针对本发明的第二缀合物中的结合分子例如sdAb的靶标)将不会诱发例如细胞毒性作用。只有在带有用于结合ADC或AOC(本发明的第一缀合物)和用于结合本发明的第二缀合物的受体的靶细胞中，一旦在表达两种受体的所述靶细胞内共定位的皂苷的影响下发生内体逃逸，效应分子的剂量将足以并且足够在所述细胞的胞质溶胶中发挥其生物学作用。
在一些实施例中，本发明第二缀合物包含的结合分子如sdAb和本发明第一缀合物(即ADC或AOC)包含的sdAb靶向相同的细胞表面分子如相同的肿瘤细胞特异性受体。这样，仅单一肿瘤细胞特异性受体的存在允许ADC或AOC(本发明的第一缀合物)和本发明的第二缀合物共同递送到携带这种单一类型靶受体的靶细胞内部。使用单一细胞特异性表面分子(例如肿瘤细胞特异性受体，例如HER2、EGFR、CD71)在靶细胞内进行这种共同递送的优点是靶向仅表达单一受体的肿瘤细胞的可能性，所述单一受体的特异性足以通过带有皂苷的本发明的第二缀合物和通过ADC或AOC(即本发明的第一缀合物)特异性靶向这种靶肿瘤细胞。选择并靶向这种单一特异性受体使得在肿瘤细胞内共同递送靶向皂苷和靶向效应分子成为可能，使得这种难以治疗的肿瘤细胞仍然可以被有效地提供有效剂量的效应分子。
本发明的一个方面涉及本发明的药物组合或根据本发明的药物组合物，其用作药物。
本发明的一个方面涉及本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其用于治疗或预防癌症、自身免疫疾病例如类风湿性关节炎、酶缺乏、基因缺陷、与基因缺陷相关的疾病、淀粉样变性病、与酶缺乏相关的疾病、感染例如病毒感染、高胆固醇血症、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、α-1抗胰蛋白酶相关的肝病、急性肝卟啉病、甲状腺素转运蛋白介导的淀粉样变性病。
出人意料地，发明人发现，不导致任何肿瘤细胞杀伤的本发明的第一缀合物(即ADC)的剂量当包含效应分子的本发明的第一缀合物在本发明的第二缀合物存在下与肿瘤细胞接触时足以且足够有效杀伤肿瘤细胞。图4-7中提供了实例。例如，当与肿瘤细胞接触时，一定剂量的本发明的第一缀合物如ADC抗CD71 VHH-毒素、抗HER2VHH-毒素或抗EGFR VHH-毒素不会对肿瘤细胞产生毒性作用。典型的毒素是蛋白毒素，例如香石竹毒蛋白和/或皂草毒蛋白。然而，当本发明的第一缀合物与本发明的第二缀合物一起共同施用时，实现了有效的肿瘤细胞杀伤。本发明的第二缀合物例如是抗HER2 VHH–SO1861、抗CD71 VHH–SO1861、抗EGFR VHH–SO1861、西妥昔单抗-SO1861、曲妥珠单抗-SO1861。本发明的第一缀合物例如是ADC，例如包含能够结合HER2、CD71或EGFR的VHH的ADC，并且例如，ADC包含蛋白毒素，例如香石竹毒蛋白或皂草毒蛋白。如前所述，通过施用本发明的第二缀合物，当包含皂苷的第二缀合物与本发明的第一缀合物(即ADC或AOC)共同施用至靶细胞时，与本发明的第一缀合物和游离皂苷一起共同施用至靶细胞时所需的游离皂苷剂量相比，在靶细胞内实现本发明的第一缀合物(即ADC或AOC)所包含的效应分子的有效生物活性所需的皂苷剂量低约100至1000倍。因此，本发明的第二缀合物在ADC或AOC的剂量下增强了本发明的第一缀合物(即包含sdAb的ADC或AOC)，否则当在没有靶向皂苷(本发明的第二缀合物)的情况下将第一缀合物施用给有需要的患者时，该剂量在肿瘤细胞中不会有效，此外，当考虑本发明的第一缀合物(即ADC或AOC)的效应分子的增强时，包含本发明的第二缀合物在相对低的剂量下(即在未提供肿瘤细胞靶向结合性分子如sdAb的游离皂苷不足以有效增强效应分子的剂量下)已经足够有效。组合起来，发明人提供了一种用治疗有效量的本发明第一缀合物(即包含肿瘤细胞靶向sdAb的ADC或AOC)治疗需要治疗的人患者的改善的方法，因为当在本发明第二缀合物存在下共同施用给患者时，ADC或AOC在较低剂量下就已经有效。本发明的第一和第二缀合物的许多益处之一在于在第一缀合物的sdAb部分中没有Fc尾，并且优选地在第二缀合物中也没有。Fc尾的不存在防止了缀合物与带有Fc受体的非靶患者细胞的不需要的结合，否则如果存在这种Fc尾，这种结合会导致副作用，如在许多常规ADC、AOC中所见。基于抗体的包含Fc尾的ADC和AOC由于这种基于IgG的ADC、AOC与Fc受体的不期望的结合而遭受功效降低。作为Fc受体结合的结果，这种基于IgG的ADC和AOC的有效剂量降低。因此，Fc尾的不存在在这方面提供了几个益处。第一缀合物和优选还有第二缀合物与Fc受体的脱靶和不期望的结合不会发生。因此，当考虑靶受体介导的本发明的第一和第二缀合物在内体中的胞吞和递送时，本发明的第一和第二缀合物具有较低的有效剂量，因为没有缀合物由于Fc受体结合而“丢失”，这种丢失是基于IgG的缀合物情况下所见的缺点。结果，本发明的第一缀合物的治疗窗比当sdAb被包含Fc尾的常规IgG替代时所达到的治疗窗更宽。类似地，结果，本发明的第二缀合物的治疗窗宽于当第二缀合物中的sdAb被用于结合靶细胞上的第二细胞表面分子的结合分子(例如包含Fc尾的常规IgG)替代时所达到的治疗窗。
实施例是用于本发明的用途的药物组合或用于本发明的用途的药物组合物，其中皂苷是SO1861或QS-21，或其中皂苷衍生物是SO1861衍生物或QS-21衍生物，优选本发明的皂苷衍生物。
实施例是用于本发明的用途的药物组合或用于本发明的用途的药物组合物，其中：
-所述用途用于治疗或预防人受试者的癌症；和/或
-所述用途是在有需要的患者中治疗或预防癌症，其中第一和第二细胞表面分子是相同或不同的肿瘤细胞表面分子，优选一个或多个肿瘤细胞特异性表面分子，并且其中sdAb和第二缀合物的结合分子结合肿瘤细胞表面分子，优选肿瘤细胞特异性表面分子；和/或
-将该药物组合，优选治疗有效量的该药物组合，施用给有需要的患者，优选人患者。
本发明的另一方面涉及一种体外或离体方法，用于将本发明的第一缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内，优选转移到所述细胞的胞质溶胶，该方法包括以下步骤：
a)提供细胞，该细胞在其表面表达根据本发明的第一细胞表面分子，并任选在其表面表达根据本发明的第二细胞表面分子，所述细胞优选选自肝细胞、异常细胞如病毒感染细胞、自身免疫细胞和肿瘤细胞；
b)提供本发明的第一缀合物，用于转移到步骤a)中提供的细胞中；
c)提供本发明的皂苷或皂苷衍生物，和/或，当步骤a)中提供的细胞在其表面表达根据本发明的第二细胞表面分子时，提供本发明的第二缀合物；
d)将步骤a)的细胞体外或离体与步骤b)的第一缀合物以及步骤c)的皂苷、皂苷衍生物和缀合物中的任何一个或多个接触，
由此实现第一缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内，优选转移到所述细胞的胞质溶胶中。
实施例是根据本发明的用于将本发明的第一缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内的体外或离体方法，一旦第一缀合物被转移到所述细胞内，该方法进一步用于将第一缀合物包含的效应分子从细胞内体、内溶酶体或溶酶体转移到细胞的胞质溶胶中，该方法包括以下步骤：
a)提供细胞，该细胞在其表面表达根据本发明的第一细胞表面分子，并任选在其表面表达根据本发明的第二细胞表面分子，所述细胞优选选自肝细胞、异常细胞如病毒感染细胞、自身免疫细胞和肿瘤细胞；
b)提供本发明的第一缀合物，用于转移到步骤a)中提供的细胞中；
c)提供本发明任一项的皂苷或皂苷衍生物，或者，优选地，当步骤a)中提供的细胞在其表面表达根据本发明的第二细胞表面分子时，提供本发明的第二缀合物；
d)将步骤a)的细胞体外或离体与步骤b)的第一缀合物以及步骤c)的皂苷、皂苷衍生物和缀合物中的任何一个或多个接触，
由此实现第一缀合物从细胞的外部向所述细胞内的转移，并由此实现第一缀合物包含的效应分子向所述细胞的胞质溶胶中的递送，任选地作为第一缀合物的一部分，或作为在内体、内溶酶体或溶酶体中从第一缀合物上切下的游离效应分子。
在形式上，糖苷是任何分子，其中糖基团通过其异头碳通过糖苷键与另一个基团结合。糖苷分子，例如皂苷，在本发明的上下文中是这样的分子，其能够进一步增强效应子部分的作用，不希望受任何理论的束缚，特别是通过促进效应子部分的内体逃逸。不希望受任何理论的束缚，糖苷分子(本发明的皂苷，例如本文和权利要求中举例说明的那些)与内吞和再循环途径的隔室和囊泡的膜相互作用并使得它们对于所述效应子部分是渗漏的，从而导致增强的内体逃逸。术语“支架能够增加效应子部分的内体逃逸”是指至少一个皂苷(糖苷分子)(其通过接头或直接与细胞表面分子靶向性抗体如sdAb偶联，或通过本发明第二缀合物中的支架的聚合或寡聚结构(本发明的共价皂苷缀合物)偶联)，当两种分子都在内体如晚期内体中时能够增强本发明的第一缀合物所包含的效应子部分的内体逃逸，任选地且优选地，这是在至少一个皂苷从本发明的第二缀合物中释放之后，例如从所述第二缀合物包含的接头或聚合或寡聚结构中释放，例如通过至少一个糖苷(皂苷)和第二缀合物之间(例如通过支架的聚合或寡聚结构和/或通过接头)的可切割键的切割。即使根据本发明的至少一个皂苷与本发明的第二缀合物的细胞表面分子靶向配体如抗体如sdAb之间的键，任选地通过接头或支架，可以是“稳定键”，但这并不意味着这种键不能在内体中被例如酶切割。例如，皂苷任选地与接头或支架的寡聚结构或聚合结构的一部分一起，可以从剩余的接头片段或寡聚结构或聚合结构中切下。例如，蛋白酶可以切割(朊)接头或朊聚合结构，例如白蛋白，从而释放至少一个皂苷。然而，优选糖苷分子(优选皂苷)以活性形式释放，优选以其在任选地通过接头和/或寡聚或聚合支架(本发明的共价皂苷缀合物)与本发明的第二缀合物的细胞表面分子靶向性分子如sdAb偶联(被制备成偶联)之前所具有的原始形式释放；因此，糖苷(皂苷)在这种切割后具有其天然结构，或者糖苷(皂苷)在这种切割后具有与其结合的化学基团(的部分)或接头，而糖苷生物活性(皂苷生物活性)，例如对存在于同一内体或溶酶体中的效应子部分的内体/溶酶体逃逸增强活性，在糖苷(皂苷)和细胞表面分子靶向性抗体如sdAb(任选地包含本发明的接头和/或支架)之间的键的切割后被维持或恢复。关于本发明，关于例如皂苷和第二缀合物中的细胞表面分子靶向性sdAb的氨基酸残基、接头、聚合结构或寡聚结构(支架的，也称为本发明的共价皂苷缀合物)、配体、(单克隆)免疫球蛋白或其结合结构域或片段和/或效应子(效应子部分、效应分子)之间的键，术语“稳定”是指该键不容易断裂或至少不设计成容易被例如pH差异、盐浓度或UV光、还原条件断裂。关于本发明，关于例如皂苷和共价皂苷缀合物的细胞表面分子靶向性sdAb、接头、氨基酸残基、聚合或寡聚结构、配体、抗体和/或效应子之间的键的术语“可切割的”是指该键被设计成在还原条件下容易被例如pH差异、盐浓度等断裂。本领域技术人员熟知此类可切割键以及如何制备它们。
在本发明之前，将ADC和AOC引入市场的主要障碍之一是治疗窗小：治疗有效剂量的ADC或AOC伴随着(不可接受的)副作用，阻碍了ADC患者治疗的发展和作用。通过应用包含效应分子和细胞表面分子靶向性sdAb的本发明的第一缀合物和本发明的第二缀合物，例如sdAb-皂苷缀合物，现在已经可以将一个或多个糖苷分子(一个或多个皂苷)引导至(靶)细胞，连同携带载荷的ADC或连同与寡核苷酸例如根据本发明的BNA缀合的sdAb。特别是，以前不可能将ADC或AOC的效应子部分或载荷与(朊的)细胞表面分子靶向性分子的任何其他缀合物，以及每个效应子部分的(预定的、可控的)特定数目或范围的糖苷分子(皂苷)同时特异性地引导到细胞的胞质溶胶，例如通过细胞的内吞途径。如前所述，本发明的ADC或AOC(即本发明的第一缀合物)和第二缀合物可以靶向相同的细胞表面分子或可以靶向不同的细胞表面分子，其中两种不同的细胞表面分子在相同靶细胞如肿瘤细胞或自身免疫细胞的表面表达。
本发明提供的溶液包含至少一个皂苷与本发明的第二缀合物的细胞表面分子靶向性分子例如抗体优选sdAb的共价结合。本发明提供的另一种解决方案包括(首先)使用寡聚或聚合支架聚合糖苷分子(皂苷)，并为本发明的第二缀合物包含的细胞表面分子靶向性分子提供共价结合的皂苷簇，使一个或多个皂苷能够在需要皂苷作用方式的细胞内位点重新单体化，例如胞吞作用后。本文中的“聚合”是指皂苷分子通过接头或直接或通过聚合或寡聚结构与第二缀合物的细胞表面分子结合分子(例如抗体，例如sdAb)可逆和/或不可逆的多重缀合以形成支架(本发明的共价皂苷缀合物)，或(经修饰的)皂苷的可逆和/或不可逆的多重缀合以形成聚合或寡聚结构以形成支架(本发明的共价皂苷缀合物)。本文中的“再单聚化”是指例如在内吞后，从第二缀合物、从将一个或多个皂苷连接到缀合物的第二缀合物的细胞表面分子靶向配体(例如sdAb)的接头或从支架切割皂苷，并恢复未结合皂苷的(天然)化学状态，该未结合的皂苷可以包含或不包含另外的化学基团，例如用于将皂苷连接到接头、第二缀合物的氨基酸残基或支架上的化学基团，和/或连接到皂苷的化学基团如醛基团或羧酸基团上的(化学)接头。由于皂苷的复杂化学性质，例如皂苷在支架或其他连接接头处的聚合及其在所期望位置(如细胞内，如内吞后)的再单聚化是一项具有挑战性的任务。特别地，用于提供接头和包含共价连接的糖苷以与细胞表面分子结合分子共价结合以提供第二缀合物的支架(例如三萜皂苷(糖苷的聚合))的化学反应通常发生在不含水的有机溶剂中，但是皂苷和例如用作用于承载结合的皂苷的支架的生物相容性聚合物是水溶性分子。未修饰的皂苷的化学性质进一步抑制了其自身的聚合，另一种可能的解决方案是将多个皂苷(直接)结合到细胞表面分子结合分子，例如抗体，例如sdAb，据估计这不是很有前途，因为抗体如sdAb通常不提供足够的结合位点，并且因为偶联产物将变得非常不均匀和/或将生物活性分子如皂苷和细胞表面分子靶向性抗体如sdAb偶联在一起具有影响和阻碍皂苷活性的风险和/或影响和阻碍例如sdAb与细胞表面分子结合的风险，而在本发明的这种含皂苷的第二缀合物中结合在一起。本发明的实施例解决了这些缺点中的至少一个。
包含皂苷的本发明第二缀合物，无论是否进一步包含一个或多个(可切割的)接头和/或任选的支架(本发明的共价皂苷缀合物)，是否能够扰乱酸性环境并抑制至少一个糖苷(皂苷)的内体逃逸功能，可以用如实例部分所述的和本领域已知的测定法容易地确定。这种抑制被描述为“诱导50％细胞杀伤所必需的糖苷(本发明的皂苷)的倍数量增加”。优选的是，本发明的支架或第二缀合物不会导致增加，至少是当使用氯喹作为阳性对照时观察到的获得50％细胞杀伤所必需的糖苷分子(皂苷)的增加。可替代地，并且优选地，包含皂苷的第二缀合物，无论是否进一步包含一个或多个(可切割的)接头和/或任选的支架，都不会导致糖苷分子增加至少4倍以诱导50％的细胞杀伤，更优选不会导致增加至少2倍。倍数增加将在测定中测量，其中氯喹作为阳性对照，诱导糖苷量，优选皂苷量增加2倍，其中皂苷是本发明的任何一个或多个皂苷(前面的实施例)，以观察50％的细胞杀伤。
如前所述，本发明的第二缀合物所包含的至少一个皂苷增加了本发明中定义的至少当前和新的效应子部分的功效。由于本发明的第一缀合物所包含的效应子部分的剂量降低，潜在的副作用将会减少，而不会降低功效，所述第一缀合物还包含细胞表面分子结合性sdAb，例如ADC或AOC。因此，本发明提供了根据本发明的第二缀合物和根据本发明的第一缀合物的组合，并且本发明提供了根据本发明的第一缀合物，用于药剂或用作药物。本发明的一个方面涉及用作药物的本发明的药物组合物，其中该药物组合物包含本发明的第一缀合物。本发明的一个方面涉及用作药物的本发明的药物组合物，其中该药物组合物包含本发明的第一缀合物并包含本发明的第二缀合物。
可以为本发明的第二缀合物所包含的内体逃逸增强剂，即本发明的皂苷配制许多优选的特征：(1)它们优选无毒且不引起免疫反应，(2)它们优选不介导效应子部分被细胞质摄取到非靶细胞中，(3)它们在作用位点的存在优选与效应子部分的存在同步，(4)它们优选是可生物降解的或可排泄的，和(5)它们优选基本上不干扰与效应子、分子的生物活性无关的生物体的生物过程，所述效应分子与内体逃逸增强剂组合，例如与激素相互作用。至少在某种程度上满足上述标准的本发明皂苷的实例是双糖链三萜，优选双糖链三萜皂苷，例如SO1861、SA1641、QS-21、GE1741，以及根据本发明并在整个说明书中列出的其他皂苷。
还提供了根据本发明的第一缀合物用于制造药物的用途。还提供了根据本发明的第一缀合物和本发明的第二缀合物用于制备药物的用途。尤其是抗癌药物，尤其是经典的化疗药物，因其副作用而坏名声。由于第一缀合物如ADC或AOC所包含的药物活性物质和本发明的第二缀合物分子所包含的皂苷在时间和位置上的靶向性和同步性，本发明的第一缀合物特别有价值用作药物，或者本发明的第一缀合物和本发明的第二缀合物的组合特别有价值用作药物，特别是用于治疗癌症的方法中，其中药物是包含本发明的ADC或AOC(本发明的第一缀合物)和本发明的第二缀合物的单一组合物，或者是包含本发明的第一缀合物(例如ADC或AOC)的第一药物组合物和包含本发明的第二缀合物的第二药物组合物的治疗组合。因此，本发明提供了根据本发明的第一缀合物用于治疗癌症的方法。本发明还提供根据本发明的第一缀合物用于治疗获得性或遗传性障碍，特别是单基因缺陷障碍的方法。因此，第二缀合物包含至少一个皂苷和用于将第二缀合物靶向异常靶细胞如肿瘤细胞或自身免疫细胞的sdAb，并且本发明的第二缀合物与至少一个本发明的包含效应子部分和本发明的sdAb如ADC或AOC的第一缀合物组合。因此，本发明的一个方面涉及根据本发明的第二缀合物，其中第二缀合物包含共价结合的皂苷和细胞表面分子结合性抗体如sdAb，用于治疗癌症或自身免疫疾病的方法中，该方法进一步包括将根据本发明的第一缀合物施用给有需要的受试者如癌症患者。
本发明的第一和第二缀合物在医学中的进一步应用是在靶细胞中替换细胞内酶的方法中的用途，该靶细胞产生的这些酶的量不足或功能不足。本发明的第二缀合物例如与本发明的第一缀合物组合施用给有需要的患者，该第一缀合物包含待替换的酶或用于基因疗法的寡核苷酸，用于替换靶细胞内酶。由此产生的疾病可能是遗传性的或获得性的。在大多数情况下，只能对症治疗，而对于一些罕见疾病，治疗选择不足会导致相关患者的寿命缩短。这种疾病的实例是苯丙酮尿症，它是一种先天性代谢错误，会导致氨基酸苯丙氨酸的代谢减少。该疾病的特征是肝酶苯丙氨酸羟化酶基因发生突变。迄今为止，苯丙酮尿症无法治愈。发病率约为1:10,000，土耳其的已知发病率最高，为1:2,600。本发明的第二缀合物所包含的细胞表面分子靶向性抗体(优选sdAb如VHH)连同结合的皂苷和包含相同或不同细胞表面分子结合性sdAb和苯丙氨酸羟化酶的第一缀合物或包含相同或不同细胞表面分子结合性sdAb连同编码苯丙氨酸羟化酶的结合多核苷酸的第一缀合物可用于通过在本发明的第二缀合物中使用合适的特异性抗体或sdAb和通过在根据本发明的第一缀合物中使用合适的特异性sdAb来靶向肝细胞，并替换肝细胞中的缺陷酶。这是本发明的第二缀合物用于替代或基因疗法的用途的实例，所述第二缀合物包含与之结合的皂苷，在该实例中，本发明的第一缀合物包含效应分子，如根据本发明的其结合的酶或与寡核苷酸。在优选的实施例中，用于基因疗法或替代疗法的方法中的本发明第二缀合物与本发明第一缀合物组合提供，所述第一缀合物包含细胞表面分子结合性sdAb和酶或编码该酶的核酸。
利用本发明的第一和第二缀合物，现在已经可以设计和制造一种两组分、非病毒临床适用的基因递送技术。例如，本发明的第二缀合物允许开发用于基因递送技术的第一和第二缀合物的非基于病毒的组合，其以较低的治疗剂量增强治疗功效，从而改善患者的健康。本发明的第二缀合物，特别是当包含共价结合的细胞表面分子靶向性抗体如单克隆抗体或sdAb用于结合(肿瘤、自身免疫)细胞表面特异性分子，并与包含效应子部分如寡核苷酸如BNA并包含细胞表面分子靶向性sdAb如VHH的第一缀合物组合时，允许克服基因递送领域中的长期和主要的瓶颈，即基因治疗产品穿过内体膜有效、安全和成本有效地转移到胞质溶胶/核溶胶中。事实上，基因疗法是未来广泛疾病高级疗法中最有希望的治疗选择之一。成功的基因递送需要识别靶细胞以及基因的细胞溶质和核溶质摄取。非病毒基因疗法领域的主要问题之一是用于患者治疗用途的遗传物质递送效率低下且不够安全。
因此，当应用本发明的包含细胞靶向性细胞表面分子靶向性分子如配体或优选抗体(其片段、结构域，优选sdAb)的第二缀合物并与本发明的第一缀合物如AOC或包含sdAb的第一缀合物(其包含寡核苷酸如反义BNA并包含细胞表面分子靶向性sdAb)组合时，发明人现在使得克服基因递送领域中的长期和主要瓶颈成为可能：基因治疗产品通过内体膜安全转移到胞质溶胶/核溶胶中。本发明的第一和第二缀合物的组合代表设计用于允许用所有已知的遗传试剂靶向任何可寻址细胞类型以及基因随后有效胞质递送的技术，从而确保不局限于遗传性障碍的更好的患者疗法，而且对于癌症疗法也是如此，因此对于大的患者群体是重要的。基于本发明的第一和第二缀合物的技术可包含本发明的第二缀合物，第二缀合物包含聚合或寡聚支架(本发明的共价皂苷缀合物)，其用作内体逃逸增强剂(EEE)(例如本文示例的皂苷以及根据本发明的实施例的皂苷)的载体，用于细胞表面分子靶向性分子例如靶向配体或(单克隆)(肿瘤细胞特异性)抗体或其片段，或优选sdAb例如VHH。本发明的第一缀合物包含第一细胞表面分子结合分子如sdAb，和效应子部分，这里是效应子基因如LNA或BNA。使用本发明的第二缀合物，例如包含细胞靶向性抗体(片段)或sdAb的第二缀合物与包含相同或不同细胞表面靶向性sdAb和寡核苷酸如BNA的本发明第一缀合物组合，具有将任何种类的生物大分子带入胞质溶胶和细胞核的潜力。全球众多研究小组和公司正在不断研究开发新的靶向配体、sdAb和单克隆(人、人源化)抗体。对于旨在递送到疾病细胞(例如癌细胞)的胞质溶胶中的寡核苷酸也是如此。因此，本发明的第一和第二缀合物也作为分子工具存在，其中现在和未来的靶向性sdAb和抗体可以通过点击化学来使用，这允许定制药物应用和组织和细胞靶向技术领域的未来研发，因此，根据本发明的第一缀合物也作为分子工具存在，其中通过点击化学将现在和未来的治疗性寡核苷酸(以及载荷如蛋白毒素)连接或可以连接到例如sdAb，这允许定制的药物应用和组织和细胞靶向技术领域的未来开发。本发明的第一和第二缀合物可包含抗体和配体作为细胞表面分子靶向性分子，但优选sdAb。全球基因治疗剂市场正在迅速增长，涵盖了癌症、心血管疾病、帕金森病、阿尔茨海默病、HIV和许多罕见(单基因)疾病等广泛疾病领域的潜在治疗。目前基于病毒载体的基因治疗技术面临着重大挑战，例如安全性、生产物流和相关高成本。当与包含待递送基因和细胞表面靶向性分子即sdAb的本发明的第一缀合物组合时，本发明的第二缀合物允许在代表当前病毒基因递送技术的替代技术平台中使用。因此，本发明的第一和第二缀合物适用于在开发用于疾病如癌症、心血管疾病、帕金森病、阿尔茨海默病、HIV感染和许多罕见(单基因)疾病的非病毒基因治疗的方法中实施。本发明的第一和第二缀合物适于开发用于通过制备基于非病毒载体的基因治疗剂(例如基于靶向反义BNA的基因治疗剂)来转化抗体-药物缀合物(ADC)和基于寡核苷酸的治疗剂领域的新治疗。应用本发明的第二缀合物，特别是在具有抗体如sdAb和皂苷的共价缀合物，并与包含细胞表面分子结合分子即sdAb和寡核苷酸如BNA的第一缀合物组合，是由于本发明而成为可能的许多有益方法之一。例如，使用本发明的第一和第二缀合物现在允许开发哺乳动物细胞的内吞途径。利用胞吞作用来递送治疗剂，其中本发明的第二缀合物有助于改善第一缀合物所包含的例如siRNA的摄取和内体逃逸。本发明的第一和第二缀合物适合与小分子一起使用，所述小分子充当例如载荷、寡核苷酸的递送增强剂。因此，本发明的第一缀合物(其带有共价偶联的寡核苷酸如BNA并带有共价偶联的细胞靶向性部分即sdAb，优选VHH的)与本发明第二缀合物(其带有本发明的皂苷并带有共价偶联的细胞靶向性部分如配体并且优选抗体(结构域或片段，优选VHH)组合，为目前的内体逃逸增强剂和基因治疗产品所面临的问题提供了解决方案，所述问题涉及它们作为包含游离非靶向皂苷的两组分的应用，从而使治疗批准和临床应用复杂化，因为这样的包含皂苷的本发明的第二缀合物与包含基因产品如BNA和(肿瘤)细胞靶向性部分即sdAb的本发明的第一缀合物组合。因此，本发明提供了一种非病毒基因递送技术，其中内体逃逸增强剂(例如本发明的实施例和所提供的实例的糖苷)和第二靶向配体或抗体(根据例如本发明的实施例和下文实例部分中举例说明的sdAb)包含在本发明的第二缀合物中，并且与本发明的第一缀合物组合，所述第一缀合物包含基因治疗产品(根据本发明的寡核苷酸，例如BNA)和第一细胞表面分子靶向性sdAb，例如本发明的第二缀合物所包含的相同或不同的细胞表面分子靶向性sdAb，其中第一细胞表面分子靶向性sdAb与本发明的第二缀合物的细胞表面分子靶向性分子相比结合相同或不同的细胞表面分子。因此，本发明的这样的第一和第二缀合物为当前和未来的大分子药物提供了用于广泛疾病和大患者群体的治疗机会。应用本发明的这样的第二缀合物(其包含至少一个皂苷和至少一个特异性细胞靶向性部分如免疫球蛋白或sdAb)与本发明的第一缀合物(其包含至少一个寡核苷酸和至少一个特异性细胞靶向性部分即sdAb)组合，该问题得到解决，该问题对于分开应用非细胞表面分子靶向的游离内体逃逸增强剂(例如，未与细胞表面分子结合性抗体缀合的皂苷)和基因治疗产品的当前方法是显而易见的，该当前方法不能确保两种化合物同时位于相互作用的位点。根据本发明，现在通过将本发明的第二缀合物与包含核酸的本发明的第一缀合物组合使用来克服该问题，其中本发明的第二缀合物和第一缀合物都包含细胞表面分子靶向性分子，例如抗体，当考虑第二缀合物时为sdAb，当考虑第一缀合物时为sdAb。也就是说，本发明的第二缀合物和包含寡核苷酸的第一缀合物的这种组合提供了两种化合物(即皂苷和基因产物如BNA)同步性(在时间和位置上)增强的非病毒基因递送技术。
基因疗法可以帮助治疗以前无法治愈的遗传性疾病，例如囊性纤维化、舞蹈病、亨廷顿舞蹈病或血友病。但是，目前还有一些问题没有解决：例如，治疗性基因必须精确到达体内的特定靶细胞。另一方面，治疗性基因应该被靶细胞吸收，但治疗性基因不应该被破坏。目前的基因治疗方法使用病毒作为基因的载剂。然而，这些程序涉及相当大的风险，并且不能转移到其他生物分子的引入。实施例是本发明的包含(植物衍生的)糖苷(例如本发明的任何一种皂苷)的第二缀合物，其使用平台技术，该技术不仅允许当作为载剂分子的本发明的第一缀合物包含基因时递送这样的基因，还允许递送待引入靶细胞的不同治疗性生物分子。因此，本发明的第二缀合物用于开发基于核酸的针对囊性纤维化、舞蹈病、亨廷顿舞蹈病或血友病的治疗。因此，利用本发明的第二缀合物，新的基因疗法策略可用于改善患有遗传疾病的患者的健康，包括患有囊性纤维化、亨廷顿舞蹈病和血友病的那些患者。作为本发明的一部分，开发了一种非病毒基因递送技术，其组合了植物衍生的内体逃逸增强剂(糖苷；即本发明的皂苷)和靶向配体(例如抗体如sdAb)，它们包含在本发明的单一第二缀合物中，第二缀合物用于与包含细胞表面分子结合性sdAb如VHH和基因治疗产品的本发明的第一缀合物组合。所得的基于本发明的第一和第二缀合物的非病毒基因疗法在包含基因的第一缀合物的较低剂量下显示出比目前可获得的策略高约40倍的递送效率。因此，本发明的第二缀合物用于临床应用，例如用于修复或替换有缺陷的基因，如在囊性纤维化患者中，以及用于靶向递送特定基因，例如用于破坏癌细胞。事实上，本发明的第一和第二缀合物适用于由遗传缺陷引起的任何疾病的治疗方案，例如囊性纤维化、亨廷顿舞蹈病和血友病，这些疾病目前是不可治愈的。利用本发明的第一和第二缀合物的基因疗法有助于克服两个当前的问题：首先，使用本发明的第二缀合物可以将包含治疗性基因的第一缀合物递送至体内特定的靶细胞；其次，治疗性基因进入这些细胞的内部，但不被破坏，这是由于存在一个或多个皂苷和用于结合靶细胞的靶向部分如抗体或sdAb(本发明的第二缀合物)，以及存在寡核苷酸产物和用于结合靶细胞的靶向sdAb(本发明的第一缀合物)，例如通过使用本发明的寡聚或多聚支架(本发明的共价效应分子缀合物)作为本发明的第一和第二缀合物的一部分。
本发明还提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括将包含根据本发明的第二缀合物的药物与本发明的第一缀合物(即包含效应分子和细胞表面分子结合性sdAb的ADC或AOC)组合施用给有需要的患者，优选将有效剂量的所述药物施用给有需要的患者，优选人癌症患者。
关于适合施用形式的考虑是本领域已知的，并且包括毒性作用、溶解度、施用途径和维持活性。例如，注射到血流中的药物组合物应该是可溶的。
合适的剂型部分取决于用途或进入途径，例如透皮或通过注射。无论靶细胞是否存在于多细胞宿主中，这种剂型都应允许化合物到达靶细胞。其他因素在本领域是已知的，包括诸如毒性和剂型之类的因素，这些因素阻碍了化合物或组合物发挥其作用。
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实例和示例性实施例
实例1.VHH-SO1861+mAb-皂草毒蛋白(1T2C和2T2C)
1靶2组分系统(1T2C)是VHH-SO1861和mAb-蛋白毒素的联合处理，其中VHH和mAb识别并结合相同的细胞表面受体(图1A)。2靶2组分系统(2T2C)是VHH-SO1861和mAb蛋白毒素的联合处理，其中VHH和mAb识别并结合不同的细胞表面受体(图1B)。SO1861-EMCH通过末端半胱氨酸残基(Cys)与抗HER2VHH缀合，具有DAR 1(HER2VHH-SO1861)(不稳定)。HER2VHH-SO1861在10pM CD71mab-皂草毒蛋白(CD71单克隆抗体与蛋白毒素皂草毒蛋白偶联，具有DAR4)或50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白(曲妥珠单抗与蛋白毒素皂草毒蛋白偶联，具有DAR4)的固定浓度滴定。确定了靶向蛋白毒素介导的对SK-BR-3(HER2++/CD71+)和MDA-MB-468(HER2-/CD71+)的细胞杀伤。这揭示了对于与10pM CD71mab-皂草毒蛋白或50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的两种组合，在SK-BR-3中低浓度的HER2VHH-SO1861下增强的细胞杀伤(IC50＝300nM；图2A)。同等浓度的HER2VHH-SO1861单独在高浓度下诱导细胞杀伤(IC50＝4.000nM)，而同等浓度的HER2VHH、HER2VHH+CD71mab-皂草毒蛋白或HER2VHH+曲妥珠单抗-皂草毒蛋白不能诱导细胞杀伤活性(IC50>5000nM；图2A)。在MDA-MB-468(HER2-/CD71+)中，HER2VHH-SO1861+10pMCD71mab-皂草毒蛋白的组合在高浓度下显示细胞杀伤活性(IC50＝2.000nM；图2B)，而HER2VHH-SO1861+50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的组合在高得多的浓度下显示细胞杀伤活性(IC50>5.000nM；图2B)。同等浓度的HER2VHH、HER2VHH+CD71mab-皂草毒蛋白或HER2VHH+曲妥珠单抗-皂草毒蛋白不能在MDA-MB-468细胞中诱导细胞杀伤活性(IC50>5.000nM；图2B)。
所有这些表明SO1861-EMCH与HER2靶向性VHH的缀合增强了靶向蛋白毒素(靶向相同或不同的细胞表面受体)的内体逃逸和细胞质递送，导致HER2表达细胞的细胞杀伤。
接下来，在900nM HER2VHH-SO1861的固定浓度下滴定曲妥珠单抗-皂草毒蛋白或CD71mab-皂草毒蛋白，并确定了靶向蛋白毒素介导的对SK-BR-3(HER2++/CD71+)和MDA-MB-468(HER2-/CD71+)的细胞杀伤。这揭示了900nM HER2VHH-SO1861与低浓度曲妥珠单抗-皂草毒蛋白或CD71mab-皂草毒蛋白的组合已经诱导了SK-BR-3的有效细胞杀伤(IC50＝0.0001pM；图3A)，而CD71mab-皂草毒蛋白+900nM HER2VHH或曲妥珠单抗-皂草毒蛋白+900nMHER2VHH只能在高浓度诱导细胞杀伤(分别是IC50＝50pM；IC50＝400pM；图3)。在MDA-MB-468细胞(HER2-/CD71+)中，CD71mab-皂草毒蛋白+900nM HER2VHH-SO1861在IC50＝0,01pM显示细胞杀伤，而曲妥珠单抗-皂草毒蛋白+900nM HER2VHH-SO1861在IC50＝2.000pM显示活性。曲妥珠单抗-皂草毒蛋白+900nM HER2VHH或CD71mab-皂草毒蛋白+900nM HER2VHH分别仅在(IC50>10.000pM和IC50＝20pM，图3B)显示细胞杀伤。所有这些表明，在HER2++/CD71+表达细胞中，相对低浓度的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白或CD71单抗-皂草毒蛋白与相对低浓度的HER2VHH-SO1861(DAR1)组合可以有效并诱导细胞杀伤。
注释：在整个说明书中，包括实例和权利要求中，“VHH”和“VHH”应理解为指相同类型的单结构域抗体(sdAb)。
实例2.VHH-SO1861+VHH-香石竹毒蛋白(2T2C)
2target 2-components系统(2T2C)是VHH1-SO1861和VHH2-蛋白毒素的联合处理，其中每个VHH识别另一个细胞表面受体(图1C)。SO1861-EMCH与靶向HER2的VHH的末端半胱氨酸残基缀合，产生HER2VHH-SO1861(DAR1)。在50pM CD71VHH-香石竹毒蛋白的固定浓度下滴定HER2VHH-SO1861，并确定了靶向蛋白毒素介导的对SK-BR-3(HER2++/CD71+)和MDA-MB-468(HER2-/CD71+)的细胞杀伤。这揭示了在相对低浓度的VHHHER2-L-SO1861(SK-BR-3：IC50＝300nM；图4A)时的增强的细胞杀伤。同等浓度的HER2VHH-SO1861单独在高浓度下诱导细胞杀伤(IC50＝4.000nM)，而同等浓度的HER2VHH，HER2VHH+50pM CD71VHH-香石竹毒蛋白不能诱导细胞杀伤(IC50>5.000nM；图4A)。在MDA-MB-468(HER2-/CD71+)中，HER2VHH-SO1861+50pMCD71VHH-香石竹毒蛋白的组合在较高浓度下显示细胞杀伤活性(IC50＝600nM；图4B)，而同等浓度的HER2VHH，HER2VHH-SO1861或HER2VHH+50pM CD71VHH-香石竹毒蛋白不能诱导细胞杀伤活性(IC50>5.000nM；图4B)。
接下来，在900nM HER2VHH-SO1861的固定浓度下滴定CD71VHH-香石竹毒蛋白，并确定了靶向蛋白毒素介导的对SK-BR-3(HER2++/CD71+)和MDA-MB-468(HER2-/CD71+)的细胞杀伤。这揭示了900nM HER2VHH-SO1861与低浓度CD71VHH-香石竹毒蛋白的组合诱导了SK-BR-3细胞的有效细胞杀伤(IC50＝0,05pM；图5A)，而CD71VHH香石竹毒蛋白或CD71VHH-香石竹毒蛋白+900nM HER2VHH只能在高浓度下诱导细胞杀伤(IC50>10.000pM)；图5A)。此外，CD71VHH-香石竹毒蛋白也在77nM曲妥珠单抗-SO1861(DAR4)的固定浓度下滴定，这也揭示了在SK-BR-3(HER2++/CD71+)细胞中细胞杀伤活性的强烈增强(IC50<0,0001pM)。在MDA-MB-468细胞(HER2-/CD71+)中，CD71VHH-香石竹毒蛋白+900nM HER2VHH-SO1861仅在高得多的浓度下显示细胞杀伤(IC50＝10pM，图5B)，而CD71VHH-香石竹毒蛋白、CD71VHH-香石竹毒蛋白+900nM HER2VHH或CD71VHH-香石竹毒蛋白+曲妥珠单抗-SO1861(DAR4)仅在IC50＝2.000pM时显示细胞杀伤；图5B)。
所有这些表明，在高HER2/CD71表达细胞中，相对低浓度的VHHCD71-香石竹毒蛋白与低浓度的VHHHER2-SO1861缀合物组合可有效诱导细胞杀伤。
根据本发明的组合在MDA-MB-468细胞中(HER2-/CD71+)没有显示任何细胞杀伤活性。这表明在缺乏足够的受体表达的情况下，没有达到有效的胞内递送的SO1861浓度(阈值)来诱导蛋白毒素的内体逃逸和胞质递送。
实例3.VHH-香石竹毒蛋白+mAb-SO1861(1T2C和2T2C)
1靶2组分系统(1T2C)是mAb-SO1861和VHH-蛋白毒素的联合处理，其中mAb和VHH识别并结合相同的细胞表面受体(图1E)。2靶2组分系统(2T2C)也是mAb-SO1861和VHH-蛋白毒素的联合处理，其中mAb和VHH识别另一种细胞表面受体(图1D)。
香石竹毒蛋白-C(具有末端半胱氨酸的香石竹毒蛋白)与靶向HER2的VHH、靶向CD71的VHH或靶向EGFR的VHH的末端半胱氨酸残基缀合，产生HER2VHH-香石竹毒蛋白(DAR1)、CD71VHH-香石竹毒蛋白(DAR1)和EGFRVHH-香石竹毒蛋白(DAR1)。
CD71VHH-香石竹毒蛋白、HER2VHH-香石竹毒蛋白或EGFRVHH-香石竹毒蛋白在固定浓度的西妥昔单抗-SO1861(DAR4)滴定，并且确定了靶向蛋白毒素介导的对A431(EGFR++/HER2+/-/CD71+)和A2058(EGFR-/HER2+/-/CD71+)的细胞杀伤。这揭示了非常低浓度的CD71VHH-香石竹毒蛋白与77nM西妥昔单抗-SO1861的组合诱导了A431细胞的有效细胞杀伤(IC50<0,0001pM；图6A)，而单独CD71VHH-香石竹毒蛋白在IC50＝2000pM显示活性。其他两种组合EGFRVHH-香石竹毒蛋白+77nM西妥昔单抗-SO1861和HER2VHH-香石竹毒蛋白+77nM西妥昔单抗-SO1861分别在IC50＝20pM和IC50＝50pM时显示出有效的细胞杀伤，而EGFRVHH-香石竹毒蛋白或HER2VHH-香石竹毒蛋白单独不能在A431细胞中诱导有效的细胞杀伤(IC50>10.000pM；图6A)。在A2058细胞中(EGFR-/HER2+/-/CD71+)，CD71VHH-香石竹毒蛋白和CD71VHH-香石竹毒蛋白+77nM西妥昔单抗-SO1861分别在IC50＝3.000pM和IC50＝1.000pM显示细胞杀伤活性，而所有其他处理或组合在A2058细胞中在高达IC50＝10.000pM VHH毒素没有显示出细胞杀伤(图6B)。
这表明西妥昔单抗-SO1861(DAR4)可以有效地诱导三种不同的VHH-香石竹毒蛋白缀合物的内体逃逸，从而诱导A431细胞中增强的细胞杀伤。
接下来，在固定浓度的曲妥珠单抗-SO1861(DAR4)滴定CD71VHH-香石竹毒蛋白、HER2VHH-香石竹毒蛋白或EGFRVHH-香石竹毒蛋白，并且确定了靶向蛋白毒素介导的对SK-BR-3(HER2++/EGFR＝/CD71+)和MDA-MB-468细胞(HER2-/EGFR++/CD71+)的细胞杀伤。这揭示了非常低浓度的CD71VHH-香石竹毒蛋白与77nM曲妥珠单抗-SO1861的组合诱导了SK-BR-3细胞的有效细胞杀伤(IC50<0,0001pM；图7A)，而单独CD71VHH-香石竹毒蛋白在IC50＝10.000pM显示活性。其他两种组合EGFRVHH-香石竹毒蛋白+77nM曲妥珠单抗-SO1861和HER2VHH-香石竹毒蛋白+77nM曲妥珠单抗-SO1861分别在IC50＝400pM和IC50＝6pM时显示出有效的细胞杀伤，而EGFRVHH-香石竹毒蛋白或HER2VHH-香石竹毒蛋白单独不能在SK-BR-3细胞中诱导有效的细胞杀伤(IC50>10.000pM；图7A)。在MDA-MB-468细胞(HER2-/EGFR++/CD71+)中，CD71VHH-香石竹毒蛋白和CD71VHH-香石竹毒蛋白+77nM西妥昔单抗-SO1861分别在IC50＝3000pM和IC50＝2000pM显示细胞杀伤活性，而所有其他处理或组合在MDA-MB-468细胞中在高达IC50＝10.000pM VHH香石竹毒蛋白没有显示出细胞杀伤(图7B)。这表明曲妥珠单抗-SO1861(DAR4)可以有效地诱导三种不同的VHH-香石竹毒蛋白缀合物的内体逃逸，从而诱导SK-BR-3细胞中增强的细胞杀伤。
材料与方法
材料
SO1861由分析发现有限公司(Analyticon Discovery GmbH)从肥皂草获得的原植物提取物中分离和纯化。VHH购自荷兰乌特勒支的QVQ公司(HER2VHH：克隆名称：Q17c；CD71VHH：克隆名称：Q52c EGFRVHH：克隆名称：Q86c)。曲妥珠单抗(Tras，
Figure BDA0004086218780000771
罗氏公司(Roche))、西妥昔单抗(Cet，/>
Figure BDA0004086218780000772
默克公司(Merck KGaA))购自药房(夏里特，柏林)。CD71单克隆抗体购自生物细胞公司(BioCell)(Okt9，#BE0023)。定制曲妥珠单抗-皂草毒蛋白和抗CD71mab-皂草毒蛋白缀合物从先进靶向系统公司(Advanced TargetingSystems)(圣地亚哥，加利福尼亚州)生产和购买。香石竹毒蛋白-Cys(Dia-Cys，具有单个C-末端半胱氨酸的香石竹毒蛋白突变体，由法国Proteogenix公司生产。
三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP，98％，西格玛-奥尔德里奇公司)，5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB，埃尔曼试剂，99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，ZebaTM旋转脱盐柱(2mL，赛默飞世尔公司)，NuPAGETM4-12％ Bis-Tris蛋白质凝胶(赛默飞世尔公司)，NuPAGETMMES SDS运行缓冲液(赛默飞世尔公司)，NovexTMSharp预染色蛋白标准品(赛默飞世尔公司)，PageBlueTM蛋白质染色溶液(赛默飞世尔公司)，PierceTMBCA蛋白检测试剂盒(赛默飞世尔公司)，N-乙基马来酰亚胺(NEM，98％，西格玛-奥尔德里奇公司)，1,4-二硫苏糖醇(DTT，98％，西格玛-奥尔德里奇公司)，Sephadex G25(通用电气医疗保健公司)，Sephadex G50 M(通用电气医疗保健公司)、Superdex 200P(通用电气医疗保健公司)，异丙醇(IPA，99.6％，VWR)，三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris，99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，三(羟基甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris.HCL，西格玛-奥尔德里奇公司)，L-组氨酸(99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，D-(+)-海藻糖脱水物(99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，聚乙二醇脱水山梨醇单月桂酸酯(吐温20，西格玛-奥尔德里奇公司)，杜尔贝克氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS，赛默飞世尔公司)，盐酸胍(99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(EDTA-Na2，99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，0.2微米和0.45微米无菌过滤器(赛多利斯公司(Sartorius))，琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC，赛默飞世尔公司)，Vivaspin T4和T15浓缩器(赛多利斯公司)，Superdex200PG(通用电气医疗保健公司)，四(乙二醇)琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(PEG4-SPDP，赛默飞世尔公司)，HSP27 BNA二硫化物寡核苷酸(生物合成)，[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N,N-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐](HATU，97％，西格玛-奥尔德里奇公司)，二甲基亚砜(DMSO，99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐(AEM，98％，西格玛-奥尔德里奇公司)，L-半胱氨酸(98.5％，西格玛-奥尔德里奇公司)，去离子水(DI)是从超纯实验室水系统中新鲜取出的(密理博公司(MilliQ)，默克公司(Merck))，镍-氨三乙酸琼脂糖(Ni-NTA琼脂糖，Protino公司)，甘氨酸(99.5％，VWR)，5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸(埃尔曼试剂，DTNB，98％，西格玛-奥尔德里奇公司)，S-乙酰基巯基琥珀酸酐荧光素(SAMSA试剂，英杰公司)碳酸氢钠(99.7％，西格玛-奥尔德里奇公司)，碳酸钠(99.9％，西格玛-奥尔德里奇公司)，具有Sephadex G-25树脂的PD MiniTrap脱盐柱(通用电气医疗保健公司)，PD10G25脱盐柱(通用电气医疗保健公司)、Zeba旋转脱盐柱(0.5、2、5、和10mL(赛默飞世尔公司)，Vivaspin离心过滤器T4 10kDa MWCO，T4 100kDa MWCO，和T15(赛多利斯公司)，Bioseps3000 aSEC柱(菲罗门公司(Phenomenex))，Vivacell超滤装置10和30kDa MWCO(赛多利斯公司)，Nalgene快速流动过滤器(赛默飞世尔公司)，
方法
SO1861-EMCH合成
向SO1861(121mg，0.065mmol)和EMCH.TFA(110mg，0.325mmol)中添加甲醇(特干，3.00mL)和TFA(0.020mL，0.260mmol)。在室温下搅拌反应混合物。1.5小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC。1将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体的标题化合物(120mg，90％)。基于LC-MS的纯度为96％。
LRMS(m/z)：2069[M-1]1-
LC-MSr.t.(min)：1.084
细胞活力测定
处理后，将细胞在37℃下孵育72小时，然后根据制造商的说明(CellTiter
Figure BDA0004086218780000791
水性单溶液细胞增殖测定，普洛麦格公司(Promega))通过MTS测定确定细胞活力。简而言之，在不含酚红(泛生物技术公司(PAN-Biotech GmbH))的补充有10％ FBS的DMEM中将MTS溶液稀释20倍。用200μL/PBS孔洗涤细胞一次，之后每孔加入100μL稀释的MTS溶液。将板在37℃下孵育约20-30分钟。随后，在赛默飞世尔科技公司Multiskan FC平板读数器(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))上测量492nm处的OD。为了定量，在计算处理/未处理细胞的细胞活力百分比之前，通过将处理孔的背景校正信号除以未处理孔的背景校正信号，从所有其他孔中减去“仅培养基”孔的背景信号(x 100)。
FACS分析
将细胞以500,000个细胞/板接种于10cm培养皿中的补充有10％胎牛血清(泛生物技术公司)和1％青霉素/链霉素(泛生物技术公司)的DMEM(泛生物技术公司)中，并孵育48小时(5％ CO2，37℃)，直到达到90％的汇合。接下来，将细胞进行胰蛋白酶化(TryplEExpress，吉布科赛默飞世尔科技公司)成单细胞。将0.75x 106个细胞转移到15mL离心管中并离心(1,400rpm，3分钟)。弃去上清液，同时让细胞沉淀浸没。通过在涡旋振荡器上轻轻振荡离心管来解离沉淀，并用4mL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％ FBS)洗涤细胞。洗涤后，将细胞重悬浮于3mL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％ FBS)中，并等分于3个圆底FACS管中(1mL/管)。将细胞再次离心并重悬浮在200μL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％ FBS)或200μL抗体溶液中；在195μL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％ FBS)中含有5μL抗体。APC小鼠IgG1，κAPC抗人EGFR(#352906，百进公司(Biolegend))用于染色EGFR受体。PE抗人HER2 APC抗人CD340(erbB2/HER-2)(#324408百进公司)用于染色HER2受体，PE小鼠IgG2a，κ同种型Ctrl FC(#400212，百进公司)用作其匹配的同种型对照。PE抗人CD71(#334106，百进公司)用于染色CD71受体，PE小鼠IgG2a，κ同种型Ctrl FC(#400212，百进公司)用作其匹配的同种型对照。样品在4℃下在管辊混合器上孵育30分钟。之后，用冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％ FBS)将细胞洗涤3x，并使用PBS中的2％ PFA溶液在室温下固定20分钟。用冷PBS洗涤细胞2x，并重悬浮在250-350μL冷PBS中用于FACS分析。用BD FACSCanto II流式细胞仪系统(BD生物科学公司(BDBiosciences))和FlowJo软件分析样品。各种细胞上EGFR、HER2和CD71的细胞表面表达的分析结果总结在表A2中。
表A2.各种细胞的EGFR、HER2和CD71的细胞表面表达水平
Figure BDA0004086218780000801
VHH-SO1861缀合的程序
向VHH的等份中加入等份的新鲜制备的TCEP溶液(10.0mg/ml)，将混合物短暂涡旋，然后用辊混合在20℃孵育30分钟。孵育后，使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤将所得VHH-SH纯化至TBS pH 7.5。向所得的VHH-SH中添加新鲜制备的SPT-EMCH溶液，将混合物短暂涡旋，然后在20℃孵育过夜。
孵育后，取出VHH-SO1861混合物的等份，并通过Ellman测定进行表征，以确定SO1861掺入。将缀合物通过1.6×35cm Superdex 200PG柱纯化，用DPBS pH 7.5洗脱，得到纯化的VHH-SO1861。将等份过滤至0.2μm，浓缩并归一化至1.0mg/ml，得到VHH-SO1861。
VHH-香石竹毒蛋白缀合的程序
使用vivaspin T15 10KDa MWCO离心过滤器通过超滤浓缩香石竹毒蛋白-Cys，并进行缓冲液交换成TBS pH 7.5。向浓缩的香石竹毒蛋白-Cys中加入等份的新鲜制备的TCEP溶液(10.0mg/ml)，将混合物短暂涡旋，然后用辊混合在20℃孵育60分钟。孵育后，使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤纯化所得的香石竹毒蛋白-SH，然后使用vivaspin T15 10KDaMWCO离心过滤器重复离心洗涤循环至TBS pH 7.5中。将所得的香石竹毒蛋白-SH与在DMSO中新制备的DTME溶液(10mg/ml)反应，将混合物短暂涡旋，然后在20℃下孵育60分钟。之后，使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤到TBS pH 7.5中进行纯化，获得香石竹毒蛋白-DTME。将香石竹毒蛋白-DTME储存在20℃直到缀合。同时，使用vivaspin T15 10KDa MWCO离心过滤器通过超滤浓缩VHH的等份，并进行缓冲液交换成TBS pH 7.5。向浓缩的VHH中加入等份的新鲜制备的TCEP溶液(10.0mg/ml)，将混合物短暂涡旋，然后用辊混合在37℃孵育60分钟。孵育后，使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤纯化所得的VHH，然后使用vivaspin T4 5KDa MWCO离心过滤器重复离心洗涤循环至TBS pH 7.5中。将所得VHH-SH的等份与香石竹毒蛋白-DTME反应，将混合物短暂涡旋，然后在20℃下孵育过夜。之后，使用vivaspin T4 10KDa MWCO离心管浓缩反应混合物，并使用1.6×35cm Superdex 200PG柱通过凝胶过滤纯化，洗脱至DPBS pH 7.5中。
抗体-(L-SO1861)4
曲妥珠单抗、西妥昔单抗在下文中称为“Ab”。Ab通过迈克尔型硫醇-烯缀合反应以DAR为1、2、3、4、5和6与皂苷SO1861-EMCH缀合。SO1861-EMCH分子在其结构和其马来酰亚胺官能团之间获得不稳定的(L)腙键，在皂苷和Ab之间产生不稳定的键。针对曲妥珠单抗-(L-SO1861)4，示例性地描述了该程序：
向西妥昔单抗(40mg，8.0ml)溶液中加入10μl/ml的Tris浓缩物(127mg/ml，1.05M)，Tris.HCl浓缩物(623mg/ml，3.95M)和EDTA-Na2浓缩物(95mg/ml，0.26M)中的每者，得到50mM TBS，2.5mM EDTA缓冲液pH 7.5。
向分成四份的西妥昔单抗(每份9.73mg、4.864mg/ml、65nmol)中加入等份的新鲜制备的TCEP溶液(0.5–2.0g/ml，1.15–7.02摩尔当量，75–455nmol)，将混合物短暂涡旋，然后在20℃下用辊混合孵育300分钟。孵育后(在添加SO1861-EMCH之前)，从每种混合物中取出约1mg(0.210ml)等份的Ab-SH，并使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤纯化至TBS pH 7.5中。这些等份通过UV-vis分析和Ellman测定进行表征(硫醇比Ab比率＝分别为2.0、4.2、5.9和6.8)。向每个主体Ab-SH中加入等份的新鲜制备的SO1861-EMCH溶液(2mg/ml，1.3摩尔当量/“硫醇”，0.15-0.61μmol，0.16-0.63ml)，短暂涡旋混合物，然后在20℃下孵育120分钟。除了每个缀合反应之外，两个等份的脱盐Ab-SH(0.25mg，1.67nmol)分别与NEM(1.3摩尔当量/“硫醇”，4.3-17.4nmol，2.2-8.7μl的0.25mg/ml溶液)或TBS pH 7.5缓冲液(2.2-8.7μl)在20℃反应120分钟，作为阳性和阴性对照。孵育后(在添加NEM之前)，取出0.200ml等份的Ab–SO1861-EMCH混合物，并使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤纯化至TBS pH 7.5中。通过UV-vis表征该等份，并且通过Ellman测定表征阳性和阴性对照，以获得SO1861-EMCH掺入。向主体Ab–SO1861-EMCH混合物中加入等份的新鲜制备的NEM溶液(2.5mg/ml，2.5–10摩尔当量，0.15–0.58μmol)，并且将混合物通过zeba旋转脱盐柱纯化，用DPBS pH 7.5洗脱，得到纯化的西妥昔单抗–(L-SO1861)缀合物。在分配用于生物评估之前，将产物标准化至2.5mg/ml并过滤至0.2μm。曲妥珠单抗-L-SO1861缀合物的反应条件和结果以及西妥昔单抗-L-SO1861缀合物的反应条件和结果总结在表A3和表A4中。
表A3.曲妥珠单抗-L-SO1861缀合物的总结反应条件和结果
Figure BDA0004086218780000821
表A4.西妥昔单抗-L-SO1861缀合物的总结反应条件和结果
Figure BDA0004086218780000822
有关共价结合到蛋白毒素或皂苷的抗体和受体配体的许多实施例的总结
mAb：曲妥珠单抗(HER2)或西妥昔单抗(EGFR)
配体：EGF
蛋白毒素：核糖体失活蛋白，皂草毒蛋白或香石竹毒蛋白
皂苷与配体的内体逃逸增强缀合物：
mAb-SO1861内体逃逸增强缀合物
·含有可切割的腙接头
·曲妥珠单抗-SO1861 DAR 4.0
·西妥昔单抗-SO1861 DAR 3.7
皂苷与配体的内体逃逸增强缀合物在体外或体内试验模型中与以下组合：
mAb/配体-蛋白毒素缀合物
·包含不可切割的化学接头或者是重组融合蛋白
Figure BDA0004086218780000831
对于实例4-9：
材料：
曲妥珠单抗和西妥昔单抗购自药房(夏里特，柏林)。SO1861由分析发现有限公司(Analyticon Discovery GmbH)从肥皂草获得的原植物提取物中分离和纯化。
方法
SO1861-EMCH合成
SO1861来自肥皂草(分析发现有限公司)，并根据本领域已知的常规步骤与EMCH偶联。
SO1861与抗体的缀合
曲妥珠单抗-SO1861和西妥昔单抗-SO1861的定制生产由菲利特生物加工公司(FleetBioprocessing)(英国)完成。SO1861-EMCH与抗体的半胱氨酸缀合。
皂草毒蛋白与曲妥珠单抗和西妥昔单抗的缀合
定制的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白和西妥昔单抗-皂草毒蛋白缀合物从先进靶向系统公司(Advanced Targeting Systems)(圣地亚哥，加利福尼亚州)生产和购买。IgG-皂草毒蛋白和皂草毒蛋白购自先进靶向系统公司
FACS分析
在BD FACSCanto II上进行FACS分析，用FlowJo V10软件进行数据分析，FACS抗体为：1)同种型：APC小鼠IgG1，κ同种型Ctrl(FC)(400122，百进公司)。EGFR：APC抗人EGFR(352906，百进公司)HER2：APC抗人CD340(erbB2/HER-2)(324408，百进公司)。
香石竹毒蛋白产生
在细菌培养物中表达香石竹毒蛋白，并按照本领域已知的常规细胞培养和蛋白质纯化步骤纯化蛋白质。
抗体与香石竹毒蛋白的缀合
抗体和香石竹毒蛋白的缀合是根据本领域已知的普通程序进行的。
细胞培养
在37℃和5％ CO2下，在补充有10％胎牛血清(FBS)的DMEM(泛生物技术公司)中培养细胞。
细胞活力测定
将细胞以5.000-10.000c/w接种在96孔板中，每孔100μL，并在37℃下孵育过夜。第二天，在PBS中制备10x浓缩的处理混合物样品，其含有都是10x终浓度的抗体缀合的SO1861(即本发明的“结合分子”或“内体逃逸增强缀合物”)和靶向毒素(即“结合分子”)。从细胞培养板中取出培养基，用180μL培养基代替，随后添加20μL处理混合物/孔。作为对照，制备10x处理混合物样品，其含有相应浓度的仅缀合抗体的SO1861、仅抗体、仅SO1861、仅靶向毒素或不含化合物的PBS作为媒剂对照。在使用内体酸化抑制剂(氯喹(西格玛奥德里奇公司)或巴弗洛霉素A1(恩佐生命科学公司))的情况下，处理的步骤1中的细胞培养基被180μL含有1μM氯喹或0.2μM巴弗洛霉素A1的培养基所替代。在添加10x处理混合物样品之前，将板在37℃下孵育1小时。根据本领域已知的标准程序进行剩余的孵育和处理步骤。
处理后，将细胞在37℃下孵育72小时，然后根据制造商的说明(CellTiter
Figure BDA0004086218780000851
水性单溶液细胞增殖测定，普洛麦格公司(Promega))通过MTS测定确定细胞活力。简而言之，在不含酚红(泛生物技术公司)的补充有10％ FBS(泛生物技术公司)的DMEM中将MTS溶液稀释20x。用每孔200μL PBS洗涤细胞一次，之后每孔添加100μL稀释的MTS溶液。将板在37℃下孵育约20-30分钟。随后，在赛默飞世尔科技公司Multiskan FC平板读数器(赛默飞世尔科技公司)上测量492nm处的光密度。为了定量，在计算未处理/处理细胞的比率之前，通过将未处理孔的背景校正信号除以处理孔的背景校正信号，从所有其他孔中减去“仅培养基”孔的背景信号。
结果
实例4.1靶标2组分系统
1靶标2组分系统是mAb1-蛋白毒素和mAb1-SO1861的联合处理(见图1A，E)，而2靶标2组分系统是mAb1-蛋白毒素和mAb2-SO1861或mAb2-蛋白毒素+mAb1-SO1861的组合(图1B-D)。
西妥昔单抗-SO1861(识别并结合EGFR的单克隆抗体，与皂苷分子SO1861缀合；内体逃逸增强结合物)在10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白(识别并结合EGFR的单克隆抗体，与蛋白毒素皂草毒蛋白结合)的固定浓度下滴定(基于浓度SO1861计算)，并测定对高EGFR表达细胞的细胞杀伤。当10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白与高浓度的非靶向非缀合SO1861组合时，高EGFR表达细胞(A431或CaSKi)显示出有效的细胞杀伤(A431：[SO1861]IC50＝600nM和CaSKi：[SO1861]IC50＝700nM；图8A，8B表A6)。然而，当西妥昔单抗-皂草毒蛋白与西妥昔单抗-SO1861组合时，在低浓度的SO1861下已经诱导了强烈的细胞杀伤(A431：[SO1861]IC50＝5nM和Caski[SO1861]IC50＝8nM；图8A，8B；表A6)。这表明，与非靶向非缀合SO1861相比，靶向缀合SO1861在诱导内体逃逸方面更有效。接下来，在300nM的西妥昔单抗-SO1861的固定浓度下滴定西妥昔单抗-皂草毒蛋白，并测定对EGFR表达细胞的靶向蛋白毒素介导的细胞杀伤。高EGFR表达细胞(A431或CaSKi)仅在高西妥昔单抗-皂草毒蛋白浓度与非靶向非缀合的300nM SO1861组合时显示细胞杀伤(A431：[毒素]IC50＝40pM；CaSki：[毒素]IC50＝40pM；图8C，8D；表A7)而300nM西妥昔单抗-SO1861与低浓度的西妥昔单抗-皂草毒蛋白组合已经诱导了有效的细胞杀伤(A431：[毒素]IC50＝0.4pM；CaSKi：[毒素]IC50＝2pM；图8C和8D；表A7)。当高浓度的非靶向非缀合SO1861(1500nM)与低浓度的西妥昔单抗-皂草毒蛋白组合时实现最高的细胞杀伤效率(A431：[毒素]IC50＝0,03pM；CaSki：[毒素]IC50＝0,02pM；图8C，8D；表A7)。所有这些表明，当与西妥昔单抗缀合时，相对低浓度的SO1861与相对低浓度的西妥昔单抗-皂草毒蛋白组合可有效杀伤高EGFR表达细胞。高浓度(1500nM)的非靶向非缀合SO1861与低浓度的西妥昔单抗-皂草毒蛋白的组合仍然是最有效的，因为受体竞争对SO1861进入细胞不起作用，因为在1靶标2组分系统中，两种缀合物竞争相同的EGFR受体。受体竞争原理也清楚地显示在没有(A431：[毒素]IC50＝40pM；Caski：[毒素]IC50＝40pM)或有75nM西妥昔单抗(A431：[毒素]IC50＝1000pM；Caski：从IC50＝1000pM；图8C、8D)的西妥昔单抗-毒素滴定处理中。
接下来，在10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白的固定浓度滴定西妥昔单抗-SO1861(基于浓度SO1861计算)，并测定对低/无EGFR表达细胞的细胞杀伤。当10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白与高浓度的非靶向非缀合SO1861组合时，仅低EGFR表达细胞(HeLa)显示细胞杀伤，而不表达EGFR(A2058)的A2058细胞根本不敏感(HeLa：[SO1861]IC50＝1000nM；A2058：[SO1861]IC50>1000nM；图9A，9B；表A6)。10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白与增加浓度的西妥昔单抗-SO1861的组合在两种细胞系中都没有诱导任何显著的细胞杀伤(HeLa：[SO1861]IC50＝1000nM；A2058：[SO1861]IC50>1000nM；图9A，9B；表A6)。这表明在缺乏足够的受体表达的情况下，没有达到有效的细胞内SO1861浓度(阈值)来诱导内体蛋白毒素逃逸和毒素介导的细胞杀伤。接下来，在300nM的西妥昔单抗-SO1861的固定浓度下滴定西妥昔单抗-皂草毒蛋白，并测定对低/无EGFR表达细胞的靶向蛋白毒素介导的细胞杀伤。低EGFR表达细胞(HeLa)仅在非常高的西妥昔单抗-皂草毒蛋白浓度与278nM西妥昔单抗-SO1861或300nM非缀合SO1861组合时显示细胞杀伤，而A2058细胞(EGFR)在任何测试浓度下都不敏感(HeLa：[毒素]IC50＝60pM；A2058：[毒素]IC50>10.000pM；图9C，9D；表A7)。在低EGFR表达细胞(HeLa)中，高浓度的非缀合SO1861(1500nM)与低浓度的西妥昔单抗-皂草毒蛋白组合显示出有效的细胞杀伤，而在A2058细胞中，只有在非常高的西妥昔单抗-皂草毒蛋白浓度与1500nMSO1861组合时，才诱导非靶向非特异性细胞杀伤(Hela：[毒素]IC50＝0,03pM；A2058：[毒素]IC50＝20pM；图9C，9D；表A6)。所有这些表明，具有低或无EGFR受体表达的细胞对西妥昔单抗-SO1861+西妥昔单抗-皂草毒蛋白的组合不敏感，因为缺乏足够的EGFR受体来促进足够的SO1861和毒素进入细胞内。
曲妥珠单抗-SO1861(识别并结合HER2的单克隆抗体，与皂苷分子SO1861缀合；根据本发明的内体逃逸增强缀合物)在50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白(识别并结合HER2的单克隆抗体，与蛋白毒素皂草毒蛋白结合)的固定浓度下滴定(基于浓度SO1861计算),并测定对高HER2表达细胞的细胞杀伤。当50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白与高浓度的非靶向非缀合SO1861组合时，高HER2表达细胞(SKBR3)显示出有效的细胞杀伤(SKBR3；图10A，10B；表A6)。然而，当曲妥珠单抗-皂草毒蛋白与曲妥珠单抗-SO1861组合时，在低浓度的SO1861下已经诱导了强烈的细胞杀伤(SKBR3；图10A，10B；表A6)。这表明，与非靶向非缀合SO1861相比，靶向缀合SO1861在诱导内体逃逸方面更有效。接下来，在50nM的曲妥珠单抗-SO1861的固定浓度下滴定曲妥珠单抗-皂草毒蛋白，并测定对HER2表达细胞的靶向蛋白毒素介导的细胞杀伤。高HER2表达细胞(SKBR3或BT474)仅在高曲妥珠单抗-皂草毒蛋白浓度与非靶向非缀合的10nM SO1861组合时显示细胞杀伤(表A7)，而10nM曲妥珠单抗-SO1861与低曲妥珠单抗-皂草毒蛋白浓度组合已经诱导了有效的细胞杀伤(表A7)。当高浓度的非靶向非缀合SO1861(1500nM)与低浓度的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白组合时实现最高的细胞杀伤效率(表A7)。所有这些都表明，当与曲妥珠单抗缀合时，低浓度的SO1861与相对低浓度的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白组合可以有效地杀伤高HER2表达细胞。高浓度(1500nM)的非靶向非缀合SO1861与低浓度的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的组合仍然是最有效的，因为受体竞争对SO1861进入细胞不起作用，因为在1靶标2组分系统中，两种缀合物竞争相同的EGFR受体。在没有或有2.5nM曲妥珠单抗时的曲妥珠单抗-毒素滴定处理中也清楚地显示了受体竞争原理(SKBR3：[毒素]IC50＝1000nM)。
接下来，在50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的固定浓度下滴定曲妥珠单抗-SO1861(基于浓度SO1861计算)，并测定对低/无EGFR表达细胞的细胞杀伤。低EGFR表达细胞(JIMT1；A431)仅当50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白与高浓度的非靶向非缀合SO1861组合时显示细胞杀伤(JIMT1：[SO1861]IC50>1000nM；A431：[SO1861]IC50>1000nM；图11A，11B；表A6)。50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白与增加浓度的曲妥珠单抗-SO1861的组合在两种细胞系中都没有诱导任何显著的细胞杀伤(JIMT1：[SO1861]IC50>1000nM；A431：[SO1861]IC50>1000nM；图11A，11B；表A6)。这表明在缺乏足够的受体表达的情况下，没有达到有效的细胞内SO1861浓度(阈值)来诱导内体蛋白毒素逃逸和毒素介导的细胞杀伤。接下来，在10nM的曲妥珠单抗-SO1861的固定浓度下滴定曲妥珠单抗-皂草毒蛋白，并测定对低/无HER2表达细胞的靶向蛋白毒素介导的细胞杀伤。低HER2表达细胞(JIMT1；A431)显示在高曲妥珠单抗-皂草毒蛋白浓度与10nM曲妥珠单抗-SO1861组合时没有显著的细胞杀伤(JIMT-1：[毒素]IC50>10.000pM；A431：[毒素]IC50>10.000pM；图11C，11D；表A7)。在低HER2表达细胞中，高浓度的非缀合SO1861(1500nM)与低浓度的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白组合显示有效的细胞杀伤(JIMT1：[毒素]IC50＝0,1pM；A431：[毒素]IC50＝0,8pM；图11C，11D；表A5)。所有这些表明，具有低或无HER2受体表达的细胞对曲妥珠单抗-SO1861+曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的组合不敏感，因为缺乏足够的HER2受体来促进足够的SO1861和毒素进入细胞内。
实例5.2靶标2组分系统
接下来，在50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的固定浓度滴定西妥昔单抗-SO1861(基于浓度SO1861计算)，并测定对高EGFR/低HER2表达细胞的细胞杀伤。当50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白与高浓度的非靶向非缀合SO1861组合时A431和CaSki细胞显示出有效的细胞杀伤(A431和Caski：[SO1861]IC50＝1000nM；图12A，12B；表A6)。然而，当曲妥珠单抗-皂草毒蛋白与西妥昔单抗-SO1861组合时，在低浓度的SO1861下已经诱导了强烈的细胞杀伤(A431：[SO1861]IC50＝12nM和Caski[SO1861]IC50＝40nM；图12A，12B；表A6)。这表明，与非靶向非缀合SO1861相比，靶向缀合SO1861在诱导内体逃逸方面更有效。接下来，在300nM西妥昔单抗-SO1861的固定浓度滴定曲妥珠单抗-皂草毒蛋白，并测定对高EGFR/低HER2表达细胞(A431和CaSki)的靶向蛋白毒素介导的细胞杀伤。在高曲妥珠单抗-皂草毒蛋白浓度与非靶向非缀合的300nM SO1861组合时没有观察到有效的细胞杀伤(A431和Caski：[毒素]IC50>10.000pM；图12C，12D；表A7)而300nM西妥昔单抗-SO1861与低浓度的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白组合已经诱导了有效的细胞杀伤(A431：[毒素]IC50＝3pM；Caski：[毒素]IC50＝1pM；图12C和12D；表A7)。在A431细胞中，当高浓度(1500nM)的非靶向非缀合SO1861与低浓度的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白组合时实现相当的细胞杀伤效率(A431：[毒素]IC50＝1pM；参见图12C；表A7)。在Caski细胞中，与西妥昔单抗-SO1861和曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的组合相比，反应稍微更强，这是由于这些细胞中的EGFR表达与A431相比显著较低，因此SO1861向Caski细胞的靶向递送不够充分(Caski：[毒素]IC50＝0.2pM，参见图12D；表A7)。所有这些表明，当与西妥昔单抗缀合时，低浓度的SO1861与相对低浓度的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白组合可有效杀伤高EGFR表达细胞。高浓度(1500nM)的非靶向非缀合SO1861与低浓度的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的组合具有相当的活性，因为受体竞争对SO1861进入细胞不起作用，因为在2靶标2组分系统中，两种缀合物通过不同的受体递送，SO1861通过EGFR递送，毒素通过HER2受体递送。
接下来，在50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的固定浓度滴定曲妥珠单抗-SO1861(基于浓度SO1861计算)，并测定对低/无EGFR/HER2表达细胞的细胞杀伤。低EGFR/HER2表达细胞仅当50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白与高浓度的非靶向非缀合SO1861组合时显示细胞杀伤(HeLa：[SO1861]IC50>1000nM；A2058：[SO1861]IC50>1000nM；图13A，13B；表A6)。50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白与增加浓度的西妥昔单抗-SO1861的组合仅在两种细胞系中高浓度的西妥昔单抗-SO1861下显示显著的细胞杀伤(HeLa：[SO1861]IC50>1000nM；A2058：[SO1861]IC50>1000nM；图13A，13B；表A6)。这表明在缺乏足够的受体表达的情况下，没有达到有效的细胞内SO1861浓度(阈值)来诱导内体蛋白毒素逃逸和毒素介导的细胞杀伤。接下来，在西妥昔单抗-SO1861的固定浓度滴定曲妥珠单抗-皂草毒蛋白，并测定对低/无EGFR/HER2表达细胞的靶向蛋白毒素介导的细胞杀伤。低/无EGFR/HER2表达细胞(HeLa和A2058)显示在高曲妥珠单抗-皂草毒蛋白浓度与278nM西妥昔单抗-SO1861组合时没有显著的细胞杀伤(HeLa：[毒素]IC50>10.000pM；A2058：[毒素]IC50>10.000pM；图13C，13D；表A7)。高浓度的非缀合SO1861(1500nM)与低浓度的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白组合显示有效的细胞杀伤(HeLa：[毒素]IC50＝0,4pM；A2058：[毒素]IC50＝0,5pM；图13C，13D；表A5)。所有这些表明，具有低/无EGFR/低HER2表达的细胞对西妥昔单抗-SO1861+曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的组合不敏感，因为缺乏足够的EGFR受体来促进足够的SO1861进入以确保毒素在细胞内的有效胞质递送。
接下来，在1.5pM EGF-香石竹毒蛋白的固定浓度滴定曲妥珠单抗-SO1861(基于浓度SO1861计算)，并测定对高HER2/低EGFR表达细胞的细胞杀伤。当1.5pM EGF-香石竹毒蛋白与高浓度的非靶向非缀合SO1861组合时，SKBR3显示出有效的细胞杀伤(SKBR3：[SO1861]IC50＝800nM；图14A；表A6)。然而，当EGF-香石竹毒蛋白与曲妥珠单抗-SO1861组合时，在低浓度的缀合SO1861下已经诱导了强烈的细胞杀伤(SKBR3：[SO1861]IC50＝2nM；图14A；表A5)。这表明，与非靶向非缀合SO1861相比，靶向缀合SO1861在诱导内体逃逸方面更有效。接下来，在曲妥珠单抗-SO1861的固定浓度滴定EGF-香石竹毒蛋白，并对测定SKBR3的靶向蛋白毒素介导的细胞杀伤。用高EGF-香石竹毒蛋白浓度与非靶向非偶联的10nM SO1861组合没有观察到有效的细胞杀伤(SKBR3(显示)和BT474(未显示)：[毒素]IC50>10.000pM；图14B；表A7)而9.4nM曲妥珠单抗-SO1861与低EGF-香石竹毒蛋白浓度的组合已经诱导了有效的细胞杀伤(SKBR3：[毒素]IC50＝3pM(显示)；BT474：[毒素]IC50＝1pM(未显示)；图14B；表A7)。当高浓度(1075nM)的非靶向非缀合SO1861与低浓度的EGF-香石竹毒蛋白组合时，获得了相当的细胞杀伤效率；图14B；表A7)。所有这些都表明，当与曲妥珠单抗缀合时，低浓度的SO1861与相对低浓度的EGF-香石竹毒蛋白组合可以有效地杀伤高HER2表达细胞。高浓度(1500nM)的非靶向非缀合SO1861与低浓度的EGF-香石竹毒蛋白的组合具有相当的活性，因为受体竞争对SO1861进入细胞不起作用，因为在2靶标2组分系统中，两种缀合物通过不同的受体递送，SO1861通过HER2递送，毒素通过EGFR受体递送。
接下来，在5pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白的固定浓度滴定曲妥珠单抗-SO1861(基于浓度SO1861计算)，并测定对低HER2、低/高EGFR表达细胞的细胞杀伤，显示当5pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白与高浓度非靶向未缀合SO1861组合时的细胞杀伤(JIMT-1：[SO1861]IC50>1000nM；A431：[SO1861]IC50>1000nM；图15A，22B表A6)。5pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白与增加浓度的曲妥珠单抗-SO1861的组合在两种细胞系中仅在高浓度西妥昔单抗-SO1861下显示细胞杀伤(JIMT-1：[SO1861]IC50>1000nM；A431：[SO1861]IC50>1000nM；图15A，15B表A6)。这表明在缺乏足够的受体表达的情况下，没有达到有效的细胞内SO1861浓度(阈值)来诱导内体蛋白毒素逃逸和毒素介导的细胞杀伤。接下来，在曲妥珠单抗-SO1861的固定浓度滴定西妥昔单抗-皂草毒蛋白，并测定对JIMT-1和A431的靶向蛋白毒素介导的细胞杀伤。仅在高西妥昔单抗-皂草毒蛋白浓度与10nM曲妥珠单抗-SO1861组合时观察到细胞杀伤(JIMT-1：[毒素]IC50>90pM；A431：[毒素]IC50>20pM；图15C，15D；表A7)。高浓度的非缀合SO1861(1500nM)与低浓度的西妥昔单抗-皂草毒蛋白组合显示有效的细胞杀伤(JIMT-1：[毒素]IC50＝0,02pM；A431：[毒素]IC50＝0,03pM；图15C，15D；表A5)。所有这些表明，具有低HER2、低/高EGFR表达的细胞对曲妥珠单抗-SO1861+西妥昔单抗-皂草毒蛋白的组合不敏感，因为缺乏足够的HER2受体来促进足够的SO1861进入以确保毒素在细胞内的有效胞质递送。即使A431细胞中非常高的EGFR表达也没有导致西妥昔单抗-皂草毒蛋白的有效细胞杀伤，因为由于缺乏HER2受体而没有达到SO1861的阈值，HER2受体可以促进通过曲妥珠单抗-SO1861摄取SO1861。
实例6.
2靶向2组分系统导致表达非常低的靶的细胞的细胞杀伤。在A431细胞中，T-DM1在纳摩尔浓度杀伤细胞，而靶向的2组分系统可以在皮摩尔浓度有效杀伤细胞(毒素浓度降低约7000倍)(图16)
实例7.作用机制
当内体酸化被阻断时，靶向的2组分系统没有活性，因为SPT001(一种植物衍生的皂苷，SO1861)仅在低内体pH下有活性。
实例8
内体酸化抑制剂阻断靶向的2组分系统活性，表明当内体酸化被阻断时，SO1861功能降低。
实例9
图17A-E显示了当曲妥珠单抗(图17A)、西妥昔单抗(图17B)或T-DM1(图17C)、游离毒素皂草毒蛋白(图17D)和香石竹毒蛋白(图17D)、与非细胞结合IgG偶联的皂草毒蛋白(图17D)以及与非细胞结合IgG偶联的皂草毒蛋白跟游离皂苷SO1861组合(图17E)与所示细胞系SK-BR-3、JIMT-1、MDA-MB-468、A431、CaSki、HeLa、A2058、BT-474接触时的相对细胞活力。
当暴露于大多数细胞系时，曲妥珠单抗和西妥昔单抗不影响或几乎不影响细胞活力，当曲妥珠单抗以相对高剂量暴露于SK-BR-3细胞时，对细胞活力有一些影响，当西妥昔单抗以相对高剂量暴露于MDA-MB-468细胞时，对细胞活力有一些影响。
TDM-1或曲妥珠单抗-厄塔毒素是美国食品药品监督管理局批准的靶向疗法，用于治疗：HER2阳性的转移性乳腺癌，以前曾用赫赛汀(Herceptin)(化学名：曲妥珠单抗)和紫杉烷化疗；手术后早期HER2阳性乳腺癌，如果在使用赫赛汀和紫杉烷化疗的新辅助(手术前)治疗后发现残留疾病。TDM-1是赫赛汀和化疗药物厄塔毒素(emtansine)的组合。图17C显示TDM-1导致所有测试的细胞系的细胞活力降低。
游离毒素皂草毒蛋白和香石竹毒蛋白以及与对照IgG(对受试细胞系上的任何细胞表面分子都没有亲和力)偶联的毒素皂草毒蛋白在受试毒素浓度的大范围内，直至10000pM，对细胞活力没有或几乎没有任何影响。
当毒素皂草毒蛋白与非细胞结合IgG偶联时，缀合物与游离皂苷SO1861的组合导致相对细胞活力的IgG-皂草毒蛋白剂量依赖性降低(图17E)。
表A5.mAb、毒素、配体毒素或mAb-毒素单一疗法+/-SO1861的IC50值总结。
Figure BDA0004086218780000931
表A5的图例：
*在5nM以上的所有西妥昔单抗[]下MDA-MB-468细胞显示细胞活力降低20-25％
**SK-BR-3细胞在1nM的曲妥珠单抗下显示20％的细胞活力降低，在1nM以上的所有曲妥珠单抗[]下显示30-35％的细胞活力降低
表A6.用固定[mAb-毒素]情况下非靶向SO1861靶向2组分系统mAb-SO1861滴定的IC50值的数据摘要。
Figure BDA0004086218780000941
Figure BDA0004086218780000951
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表A7.靶向2组分系统的IC50值的数据总结，用固定的[mAb-SO1861]进行mAb-毒素滴定。每个值的IC50计算为相对于该处理的恒定浓度的一个或多个组分(100％)的百分比
Figure BDA0004086218780000952
实例10–用本发明的缀合物与ADC组合治疗荷瘤哺乳动物导致存活和肿瘤消退
给雌性Balb/c裸鼠皮下注射人A431肿瘤细胞的悬浮液。在小鼠的皮肤下，在异种移植动物肿瘤模型中发展人表皮癌。注射肿瘤细胞后，允许异种移植肿瘤发展到大约170-180mm3的大小。A431肿瘤细胞具有以下特征：高EGFR表达，中CD71表达，低HER2表达。
在表6A中，显示了对照小鼠和荷瘤小鼠的治疗结果。用针对人Her2/neu、人EGFR或人CD71(异种移植肿瘤上的细胞表面受体)的指定抗体治疗荷瘤小鼠。西妥昔单抗与皂苷SO1861共价缀合。首先向SO1861提供接头EMCH(N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼)，该EMCH是用于将巯基(抗体的还原半胱氨酸)共价缀合到羰基(醛或酮；这里是在皂苷的位置C-23处的醛的羰基)上的马来酰亚胺和酰肼交联剂。皂苷-EMCH与西妥昔单抗的还原半胱氨酸共价偶联，在EMCH和半胱氨酸侧链之间形成共价硫醚键。对ADC曲妥珠单抗-皂草毒蛋白(共价缀合物)和抗CD71 mAb(OKT-9，IgG)-皂草毒蛋白(共价缀合物)在小鼠中的肿瘤攻击功效进行了测试，测量为在开始用ADC治疗后的时间内的肿瘤体积。在肿瘤模型中，ADC的剂量是次优的。也就是说，从以前的实验中可以确定，在ADC的次优剂量下，不会观察到肿瘤消退或肿瘤生长抑制。
这些结果表明，当考虑用ADC单独治疗荷瘤小鼠时无效(肿瘤生长，不能防止小鼠死亡(安乐死)的剂量的ADC与本发明的缀合物(其由与皂苷即SO1861共价结合的肿瘤细胞特异性受体靶向性抗体组成，所述共价缀合物以单独施用时非有效剂量(肿瘤生长，不能防止小鼠的死亡(安乐死)施用给患有癌症的小鼠)的组合疗法提供了有效且高效的治疗方案，表达为治疗动物的肿瘤消退和延长的存活(超过实验持续时间)。次优剂量的ADC与本发明的包含共价结合的皂苷的缀合物(其在单独施用时没有抗肿瘤活性)组合，因此为癌症患者提供了有效的治疗选择，其中相对低剂量的ADC是有效的。较低剂量的ADC有望降低不良事件的风险，甚至完全没有副作用。此外，当考虑ADC的功效时，含有皂苷的缀合物的刺激作用表明，以前被证明在涉及肿瘤患者治疗时缺乏功效的ADC可能获得新的关注和价值，因为ADC功效在组合疗法环境中得到改善，如当前的实例所示。参考先前在人临床环境中研究过的本领域中已知的ADC，但是对于一些ADC，从进一步的临床研究中撤回。特别是由于观察到缺乏功效和/或由于出现不可接受的不良事件而终止临床开发的ADC是这样的ADC，当与包含共价结合的皂苷的缀合物(例如所测试的西妥昔单抗-皂苷)组合时，其可为癌症患者获得新的价值。
Figure BDA0004086218780000971
实例11–含有具有内体/溶酶体逃逸增强活性的QS-21的皂树皂苷混合物
方案Q显示了一系列QS-21皂苷的共同分子结构(部分改编自：Conrado Pedebos,Laércio Pol-Fachin,Ramon Pons,Cilaine V.Teixeira Hugo Verli,Atomic Model和Micelle Dynamics of QS-21Saponin[QS-21皂苷的胶束动力学],Molecules[分子]2014,19,3744-3760；四种同工型，其中每种描述的聚糖可以作为R基团结合)。从皂树中获得的水溶性皂苷混合物(西格玛-奥尔德里奇公司，产品号S4521；罗斯(Roth)，项目编号6857；英杰公司(InvivoGen)，产品“Quil-A”)基于混合物中存在的至少一种单独皂苷(例如QS-21)的内体/溶酶体逃逸增强特性或者基于混合物中包含的两种或更多种皂苷(例如QS-21和QS-7)的组合可以应用于本发明的内体/溶酶体逃逸增强缀合物、组合物和组合中。
发明人证明了来自皂树的皂苷的混合物在2.5微克/毫升的剂量下能够增强香石竹毒蛋白的内体逃逸，如在基于细胞的生物测定中用哺乳动物肿瘤细胞测试的。暴露于细胞的效应分子与配体EGF共价偶联：EGF-香石竹毒蛋白。测试的细胞是肿瘤细胞系HeLa(用于测试游离皂苷)，A431、MDA-MB-468、CaSki和A2058(用于测试与西妥昔单抗共价偶联时的皂苷)。
Figure BDA0004086218780000991
(方案Q)实例12
1靶标2组分系统(1T2C)是mAb1-蛋白毒素和mAb1-SO1861的联合治疗，如图1A，E所示。SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)缀合，HSP27BNA寡核苷酸通过赖氨酸残基缀合至西妥昔单抗(识别和结合人EGFR的单克隆抗体)，两者均以DAR 4，从而产生2种缀合物:西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4和西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4。在A431异种移植小鼠肿瘤模型中测试西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4(腹膜内施用，(i.p.))和西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4(静脉内施用，(i.v.))的组合的EGFR肿瘤靶向基因沉默活性。在第12天肿瘤达到约150mm3大小时开始给药，在第一次给药后72小时收集肿瘤样品，并与对照基因mRNA表达水平(参照基因)相比分析HSP27基因表达。这表明，与单一给予西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4或西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4单一疗法相比，1次给予50mg/kg西妥昔单抗(Cys-L-SO1861)4+25mg/kg西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4导致A431肿瘤中HSP27基因表达降低50％(图18)。与媒剂对照肿瘤相比，观察到40％的HSP27基因沉默减少。这表明并使得根据1T2C发明的西妥昔单抗缀合的SO1861+西妥昔单抗缀合的HSP27BNA寡核苷酸的组合能够诱导治疗性反义寡核苷酸在实体瘤细胞的细胞质中的有效靶向递送，从而在体内诱导肿瘤靶向基因沉默。
接下来，SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与曲妥珠单抗(识别和结合人HER2的单克隆抗体)缀合，具有DAR 4，导致曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4的产生。曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4和曲妥珠单抗-皂草毒蛋白(曲妥珠单抗蛋白毒素缀合物)的组合在具有高HER2表达水平和对曲妥珠单抗单一疗法有抗性的小鼠肿瘤模型(患者衍生异种肿瘤模型，PDX)中进行了测试。根据1T2C发明的40mg/kg曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4(腹膜内施用)+0.03(第1、8天)/0.02(第15、22、30、36、43天)mg/kg曲妥珠单抗-皂草毒蛋白(静脉内施用，(i.v.))的组合与媒剂对照和40mg/kg曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4或0.03/0.02mg/kg曲妥珠单抗-皂草毒蛋白单一疗法相比显示出强烈的肿瘤生长抑制作用(图19)。此外，在用较低剂量组合(40mg/kg曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4+0.01mg/kg曲妥珠单抗-皂草毒蛋白)治疗的荷瘤小鼠中，没有观察到肿瘤生长抑制活性(图26)。这表明并使得曲妥珠单抗缀合的SO1861+曲妥珠单抗缀合的蛋白毒素的1T2C组合能够诱导治疗性蛋白毒素在实体肿瘤细胞的细胞质中的有效靶向递送，从而诱导体内肿瘤细胞死亡和肿瘤生长抑制。
实例13.2靶标2组分系统(体内)
2靶标2组分系统(2T2C)是mAb1-SO1861和mAb2-蛋白毒素的联合治疗(图1B-D)。SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与西妥昔单抗(识别和结合人EGFR的单克隆抗体)缀合，具有DAR 4，导致西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4的产生。在A431(EGFR++/HER2+/-/CD71+)异种移植“裸”小鼠肿瘤模型中测试了西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4和曲妥珠单抗-皂草毒蛋白或CD71mab-皂草毒蛋白的组合对EGFR肿瘤的靶向细胞杀伤，如图1B-D所示。进行剂量递增以确定治疗功效(第9天：0.3mg/kg曲妥珠单抗-皂草毒蛋白或0.1mg/kg CD71mab-皂草毒蛋白+5mg/kg西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4；第14、18天：0.1mg/kg曲妥珠单抗-皂草毒蛋白或0.05mg/kg CD71mab-皂草毒蛋白+5mg/kg西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4；第21天：0.05mg/kg曲妥珠单抗-皂草毒蛋白或0.05mg/kg CD71mab-皂草毒蛋白+15mg/kg西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4；第28天：0.02mg/kg曲妥珠单抗-皂草毒蛋白或0.02mg/kg CD71mab-皂草毒蛋白+15mg/kg西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4曲妥珠单抗-皂草毒蛋白/西妥昔单抗-SO1861。对照分别采用相同的给药方案，仅在每个治疗日给予25mg/kg的西妥昔单抗(i.v.)。在第32天(垂直虚线)、第35天和第39天，发明人根据2T2C发明开始了25mg/kg西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4(腹膜内注射(i.p.))+0.02mg/kg曲妥珠单抗-皂草毒蛋白或0.02mg/kg CD71mab-皂草毒蛋白(静脉内施用，(i.v.))的组合并且这表明，与媒剂对照、25mg/kg西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4或0.02mg/kg曲妥珠单抗-皂草毒蛋白/CD71mab-皂草毒蛋白单一疗法相比，2T2C组合组均出现了强烈的肿瘤消退(图20)。2T2C系统甚至胜过临床上使用的抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗。接下来，发明人进行了相同的实验，但是随后用25mg/kg西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4(腹膜内注射(i.p.)+0.03mg/kg曲妥珠单抗-皂草毒蛋白或0.03CD71mab-皂草毒蛋白(静脉内施用)治疗开始试验，在第9天和第14天给药，此后每周给药1次。根据本发明的2T2C系统在所有小鼠中显示肿瘤消退，甚至在两个2T2C组中的1只小鼠中显示肿瘤完全根除(肿瘤体积＝0mm3)(图21)。此外，此处对照显示肿瘤体积显著增加，而A431小鼠模型的阳性对照西妥昔单抗仅显示肿瘤生长抑制，但无消退(图21)。这表明并实现了西妥昔单抗缀合的SO1861+曲妥珠单抗缀合的蛋白毒素或CD71mab缀合的蛋白毒素的2T2C系统方法，在体内在荷瘤小鼠的实体瘤的细胞质中诱导治疗性蛋白毒素的高效靶向递送，从而甚至在大尺寸肿瘤(2000mm3)时在一些小鼠中诱导甚至完全的肿瘤根除以及在其他小鼠中诱导强烈的肿瘤消退。
实例14.2靶标2组分系统(体外)
结果
2靶标2组分系统(2T2C)是mAb1-SO1861和mAb2-蛋白毒素的联合治疗(图1B-D)。SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与西妥昔单抗(识别和结合人EGFR的单克隆抗体)缀合，具有DAR 3,7(西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7)。在50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白(曲妥珠单抗，与蛋白毒素皂草毒蛋白缀合)的固定浓度滴定西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7，并且测定对EGFR/HER2表达细胞(A431，EGFR++/HER2+/-；CaSKi，EGFR+/HER2+/-)的由靶向蛋白毒素介导的细胞杀伤，如图1B-D所示。这揭示了在低浓度的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7的强烈细胞杀伤(A431：IC50＝3nM，CaSKi IC50＝10nM；图22A，22B)，而同等浓度的西妥昔单抗、西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7或西妥昔单抗+50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白不能在EGFR/HER2表达细胞中诱导任何细胞杀伤活性。这表明相对低浓度的西妥昔单抗-SO1861缀合物有效地增强了曲妥珠单抗缀合蛋白毒素的内体逃逸(在非有效浓度下)，从而诱导了对高EGFR/低HER2表达细胞的有效细胞杀伤。
接下来，在75nM西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7的固定浓度滴定曲妥珠单抗-皂草毒蛋白，并测定靶向蛋白毒素介导的对EGFR/HER2表达细胞的细胞杀伤。这揭示了75nM西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7与低浓度曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的组合在EGFR/HER2表达细胞中已经诱导了有效的细胞杀伤(A431：IC50＝5pM；CaSKi：IC50＝1pM；图22C和22D)，而曲妥珠单抗-皂草毒蛋白单独或曲妥珠单抗-皂草毒蛋白+75nM西妥昔单抗在两种细胞系中都没有显示出显著的细胞杀伤活性(IC50>10.000pM)(图22C，22D)。所有这些表明，在高EGFR/低HER2表达细胞中，相对低浓度的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白与低西妥昔单抗-SO1861缀合物浓度组合可以有效并诱导细胞杀伤。
接下来，在50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的固定浓度滴定西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7，并测定靶向蛋白毒素介导的对HeLa(EGFR+/-/HER2+/-)或A2058(EGFR-/HER2+/-)的细胞杀伤，如图1B-D所示。HeLa(EGFR+/-/HER2+/-)和A2058(EGFR-/HER2+/-)细胞在低浓度的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7+50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白时不显示细胞杀伤(HeLa：IC50＝400nM；A2058：IC50>400nM；图230A，23B)。这表明在缺乏足够的受体表达的情况下，没有达到有效的胞内递送的SO1861浓度(阈值)来诱导蛋白毒素的内体逃逸和胞质递送。接下来，在75nM西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7的固定浓度滴定曲妥珠单抗-皂草毒蛋白，并测定靶向蛋白毒素介导的对HeLa(EGFR+/-/HER2+/-)或A2058(EGFR-/HER2+/-)的细胞杀伤。HeLa(EGFR+/-/HER2+/-)和A2058(EGFR-/HER2+/-)细胞都没有显示细胞杀伤活性(HeLa：IC50>10.000pM；A2058：IC50>10.000pM；图23C，23D)。所有这些表明，EGFR受体低表达或无表达的细胞对西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7+曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的组合不敏感，因为缺乏足够的EGFR受体来促进抗体介导的足够SO1861(阈值)的递送以确保毒素在细胞胞质内的内体逃逸。
接下来，SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与曲妥珠单抗(识别和结合人HER2的单克隆抗体)缀合，具有DAR 4(曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4)。在1.5pM EGF香石竹毒蛋白(EGFR靶向配体毒素融合蛋白)的固定浓度滴定曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4，并且测定靶向蛋白毒素介导对HER2/EGFR表达细胞(SK-BR-3：HER2++/EGFR+/-)的细胞杀伤。这揭示了在低浓度的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4+1.5pM EGF香石竹毒蛋白(SK-BR-3：IC50＝1nM；图24A)时的强烈细胞杀伤，而同等浓度的曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4或曲妥珠单抗+1.5pM EGF香石竹毒蛋白不能在HER2++/EGFR+/-表达细胞中诱导任何细胞杀伤活性。这表明曲妥珠单抗缀合SO1861有效地增强EGF融合蛋白毒素的内体逃逸(在非有效浓度下)，从而诱导高HER2/低EGFR表达细胞的细胞杀伤。
接下来，在2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4的固定浓度滴定EGF香石竹毒蛋白，并测定靶向蛋白毒素介导的对SK-BR-3(HER2++/EGFR+/-)表达细胞的细胞杀伤。这揭示了2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4与低浓度EGF香石竹毒蛋白组合在HER2/EGFR表达细胞中已经诱导了有效的细胞杀伤(SK-BR-3：IC50＝1pM)(图24B)，而EGF香石竹毒蛋白单独或EGF香石竹毒蛋白+2.5nM曲妥珠单抗没有显示细胞杀伤活性(IC50>10.000pM)(图24B)。所有这些表明，在高HER2/低EGFR表达细胞中相对低浓度的EGF香石竹毒蛋白与低曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4浓度组合才能有效并诱导细胞杀伤。
接下来，在1.5pM EGF香石竹毒蛋白的固定浓度滴定曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4，并测定靶向蛋白毒素介导的对JIMT-1(HER2+/-/EGFR+/-)或MDA-MB-468：HER2-/EGFR++)的细胞杀伤。两种细胞系对曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4+1.5pM EGF香石竹毒蛋白的任何组合均不敏感(JIMT-1：IC50>1000nM；MDA-MB-468：IC50>1000nM：图25A，25B)。这表明在缺乏足够的HER2受体表达的情况下，没有达到有效的胞内递送的SO1861浓度(阈值)来诱导蛋白毒素的内体逃逸和胞质递送。
接下来，在2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4的固定浓度滴定EGF香石竹毒蛋白，并测定靶向蛋白毒素介导的对JIMT-1(HER2+/-/EGFR+/-)或MDA-MB-468(HER2-/EGFR++)的细胞杀伤。两种细胞系在有或没有2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4情况下在高EGF香石竹毒蛋白浓度下均显示细胞杀伤(JIMT-1：IC50＝10.000pM；MDA-MB-468：IC50＝200pM图25C，25D)。
所有这些表明，HER2受体低表达或无表达的细胞对曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,7+1.5pM EGF香石竹毒蛋白的组合不敏感，因为缺乏足够的HER2受体来促进抗体介导的足够SO1861(阈值)的递送以确保毒素在细胞胞质内的内体逃逸。
接下来，SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与曲妥珠单抗(识别和结合人HER2的单克隆抗体)缀合，具有DAR 4(曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4)。在5pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白(EGFR靶向抗体-蛋白毒素缀合物)的固定浓度滴定曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4，并测定靶向蛋白毒素介导的对HER2/EGFR表达细胞(SK-BR-3：HER2++/EGFR+/-)的细胞杀伤，如图1B-D所示。这揭示了在低浓度的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4+5pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白(SK-BR-3：IC50＝1nM；图26A)时的强烈细胞杀伤，而同等浓度的曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4或曲妥珠单抗+5pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白不能在HER2++/EGFR+/-表达细胞中诱导任何细胞杀伤活性。这表明曲妥珠单抗缀合SO1861有效地增强西妥昔单抗缀合蛋白毒素的内体逃逸(在非有效浓度下)，从而诱导HER2++/EGFR+/-表达细胞的细胞杀伤。
接下来，在2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4和75nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4的固定浓度滴定西妥昔单抗-皂草毒蛋白，并测定靶向蛋白毒素介导的对HER2/EGFR表达细胞(SK-BR-3：HER2++/EGFR+/-)的细胞杀伤。这揭示了2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4与低浓度西妥昔单抗-皂草毒蛋白组合在SK-BR-3细胞中已经诱导了有效的细胞杀伤(SK-BR-3：IC50＝1pM；图26B)，而单独的西妥昔单抗-皂草毒蛋白或西妥昔单抗-皂草毒蛋白+2.5nM曲妥珠单抗仅在高浓度曲妥珠单抗-皂草毒蛋白下显示细胞杀伤(SK-BR-3：IC50>4000pM；图26B)。所有这些表明，在HER2++/EGFR+/-表达细胞中相对低浓度的西妥昔单抗-皂草毒蛋白只有与低曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4浓度组合才能有效并诱导细胞杀伤。
接下来，在5pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白的固定浓度滴定曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4，并测定靶向蛋白毒素介导的对JIMT-1(HER2+/-/EGFR+/-)和MDA-MB-468(HER2-/EGFR++)细胞的细胞杀伤。两种细胞系对曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4+5pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白的组合均不敏感(JIMT-1：IC50>1000nM；MDA-MB-468：IC50>1000nM：图27A，27B)。这表明在缺乏足够的HER2受体表达的情况下，没有达到有效的胞内递送的SO1861浓度(阈值)来诱导蛋白毒素的内体逃逸和胞质递送。
接下来，在2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4的固定浓度滴定西妥昔单抗-皂草毒蛋白，并测定靶向蛋白毒素介导的对JIMT-1(HER2+/-/EGFR+/-)和MDA-MB-468(HER2-/EGFR++)细胞的细胞杀伤。两种细胞系在有或没有2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4情况下在相似的西妥昔单抗-皂草毒蛋白浓度下均显示细胞杀伤(JIMT-1：IC50＝80pM；MDA-MB-468：IC50＝100pM；图27C，27D)。
所有这些表明，HER2受体低表达或无表达的细胞对曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4+西妥昔单抗-皂草毒蛋白的组合不敏感，因为缺乏足够的HER2受体来促进抗体介导的足够SO1861(阈值)的递送以确保毒素在细胞胞质内的内体逃逸。
参考文献
·Wilton,E.E.et al.(2018)“sdAb-DB:The Single Domain AntibodyDatabase”,ACS Synthetic Biology 7(11):2480-2484.DOI:10.1021/acssynbio.8b00407
·Marta Kijanka&Frank-Jan Warnders&Mohamed El Khattabi&Marjolijn Lub-de Hooge&Gooitzen M.van Dam&Vasilis Ntziachristos&Liesbeth de Vries&SabrinaOliveira&Paul M.P.van Bergen en Henegouwen,“Rapid optical imaging of humanbreast tumour xenografts using anti-HER2 VHHs site-directly conjugated toIRDye 800CW for image-guided surgery”,Eur J Nucl Med Mol Imaging(2013)40:1718–1729 DOI 10.1007/s00259-013-2471-2
·Karen Mercier,Raimond Heukers and Chiraz Frydman,“Surface PlasmonResonance imaging(SPRi)-Production of a single domain antibody Q17c directedagainst recombinant HER2 protein and its binding study by Surface PlasmonResonance imaging technology”,Horiba Application Note Pharmaceuticals SPRi42,2019
SEQ ID NO
SEQ ID NO:1：来自骆驼的抗HER2 sdAb 2Rb17c的氨基酸编码DNA序列gaagttcagctgcaggaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgcggcgtctggtttcatcttctctaacgacgcgatgacctgggttcgtcaggcgccgggtaaaggtctggaatgggtttcttctatcaactggtctggtacccacaccaactacgcggactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaacgcgaaacgtaccctgtacctgcagatgaactctctgaaagacgaagacaccgcgctgtactactgcgttaccggttacggtgttaccaaaaccccgaccggtcagggtacccaggttaccgtttcttctcaccaccaccaccaccactctccgtctaccccgccgaccccgtctccgtctaccccgccgtgc
SEQ ID NO:2：来自骆驼的抗HER2 sdAb 2Rb17c的氨基酸序列
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSNDAMTWVRQAPGKGLEWVSSINWSGTHTNYADSVKGRFTISRDNAKRTLYLQMNSLKDEDTALYYCVTGYGVTKTPTGQGTQVTVSSHHHHHHSPSTPPTPSPSTPPC
SEQ ID NO:3：来自单峰驼的抗HER2 sdAb NB2的氨基酸编码DNA序列
atggaagttcagctggttgaatctggtggtggtctggttcaggcgggtggttctctgcgtctgtcttgcgcggcgtctggtatcaccttctctatcaacaccatgggttggtaccgtcaggcgccgggtaaacagcgtgaactggttgcgctgatctcttctatcggtgacacctactacgcggactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaacgcgaaaaacaccgtttacctgcagatgaactctctgaaaccggaagacaccgcggtttactactgcaaacgtttccgtaccgcggcgcagggtaccgactactggggtcagggtacccaggttaccgtttcttctcaccaccaccaccaccac
SEQ ID NO:4：来自单峰驼的抗HER2 sdAb NB2的氨基酸序列
MEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGITFSINTMGWYRQAPGKQRELVALISSIGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCKRFRTAAQGTDYWGQGTQVTVSSHHHHHH
SEQ ID NO:5：抗HER2 sdAb pcNB2(一种合成构建体)的氨基酸编码DNA序列
atggaagttcagctggttgaaaaaggtggtggtcgtgttcaggcgggtggttctctgcgtctgcgttgcgcggcgtctggtatcaccttctctatcaacaccatgggttggtaccgtcaggcgccgggtaaacagcgtgaactggttgcgctgatctcttctatcggtgacacctactacgcggactctgttaaaggtcgtttccgtatccgtcgtgacaacgcgaaaaacaccgtttacctgcgtatgcgtcgtctgaaaccggaagacaccgcggtttactactgcaaacgtttccgtaccgcggcgcagggtaccgactactggggtcagggtacccgtgttaccgtttctaaacaccaccaccaccaccac
SEQ ID NO:6：抗HER2 sdAb pcNB2(一种合成构建体)的氨基酸序列
MEVQLVEKGGGRVQAGGSLRLRCAASGITFSINTMGWYRQAPGKQRELVALISSIGDTYYADSVKGRFRIRRDNAKNTVYLRMRRLKPEDTAVYYCKRFRTAAQGTDYWGQGTRVTVSKHHHHHH
SEQ ID NO:7：来自骆驼的抗HER1 sdAb 7D12的氨基酸编码DNA序列
gcggcgcaggttaaactggaagaatctggtggtggttctgttcagaccggtggttctctgcgtctgacctgcgcggcgtctggtcgtacctctcgttcttacggtatgggttggttccgtcaggcgccgggtaaagaacgtgaattcgtttctggtatctcttggcgtggtgactctaccggttacgcggactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaacgcgaaaaacaccgttgacctgcagatgaactctctgaaaccggaagacaccgcgatctactactgcgcggcggcggcgggttctgcgtggtacggtaccctgtacgaatacgactactggggtcagggtacccaggttaccgtttcttct
SEQ ID NO:8：来自骆驼的抗HER1 sdAb 7D12的氨基酸序列
AAQVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:9：来自骆驼的抗HER1 sdAb 9G8的氨基酸编码DNA序列
gaagttcagctggttgaatctggtggtggtctggttcaggcgggtggttctctgcgtctgtcttgcgcggcgtctggtcgtaccttctcttcttacgcgatgggttggttccgtcaggcgccgggtaaagaacgtgaattcgttgttgcgatcaactggtcttctggttctacctactacgcggactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaacgcgaaaaacaccatgtacctgcagatgaactctctgaaaccggaagacaccgcggtttactactgcgcggcgggttaccagatcaactctggtaactacaacttcaaagactacgaatacgactactggggtcagggtacccaggttaccgtttcttct
SEQ ID NO:10：来自骆驼的抗HER1 sdAb 9G8的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVVAINWSSGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGYQINSGNYNFKDYEYDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:11：抗VGFR2 sdAb NTV1(一种合成构建体)的氨基酸编码DNA序列
atggcgcaggttcagctgctggaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgcggcgtctggttactctgttatcaacgacttcatgacctgggttcgtcaggcgccgggtaaaggtctggaatgggtttcttctatctctgttgcggacggttctacctactacgcggactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaactctaaaaacaccctgtacctgcagatgaactctctgcgtgcggaagacaccgcggtttactactgcgcggcgcgtgttggtggtcgtgacctgggttggccgtacgaactggactactggggtcagggtaccctggttaccgtttcttct
SEQ ID NO:12：抗VGFR2 sdAb NTV1(一种合成构建体)的氨基酸序列
MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSVINDFMTWVRQAPGKGLEWVSSISVADGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAARVGGRDLGWPYELDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:13：抗VGFR2 sdAb NTV2(一种合成构建体)的氨基酸编码DNA序列
atggcgcaggttcagctgctggaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgcggcgtctggtttcaaaatcaccaacaaaaccatggcgtgggttcgtcaggcgccgggtaaaggtctggaatgggtttcttctatcggttcttcttctggttctacctactacgcggactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaactctaaaaacaccctgtacctgcagatgaactctctgcgtgcggaagacaccgcggtttactactgcgcgcgtcgtaaaggtaaccgtctgggtccggcggcgctgcgttcttggggtcagggtaccctggttaccgtttcttct
SEQ ID NO:14：抗VGFR2 sdAb NTV2(一种合成构建体)的氨基酸序列
MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITNKTMAWVRQAPGKGLEWVSSIGSSSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRKGNRLGPAALRSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:15：抗VGFR2 sdAb NTV3(一种合成构建体)的氨基酸编码DNA序列
atggcgcaggttcagctgctggaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgcggcgtctggtgttcgtgttaactacaaatctatgtcttgggttcgtcaggcgccgggtaaaggtctggaatgggtttctaccatcacctctcgtaacggttctacctactacgcggactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaactctaaaaacaccctgtacctgcagatgaactctctgcgtgcggaagacaccgcggtttactactgcgcgaccggtcgtgcgcaccacgcgccggttcgttactggggtcagggtaccctggttaccgtttcttct
SEQ ID NO:16：抗VGFR2 sdAb NTV3(一种合成构建体)的氨基酸序列
MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVRVNYKSMSWVRQAPGKGLEWVSTITSRNGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATGRAHHAPVRYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:17：抗VGFR2 sdAb NTV4(一种合成构建体)的氨基酸编码DNA序列
atggcgcaggttcagctgctggaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgcggcgtctggtgttaccatcaccgacgaagacatgacccgtgttcgtcaggcgccgggtaaaggtctggaatgggtttcttctatcctgaacaccggtggttctacctactacgcggactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaactctaaaaacaccctgtacctgcagatgaactctctgcgtgcggaagacaccgcggtttactactgcgcggcggttcacgaaaaagcggcggacatgaacttctggggtcagggtaccctggttaccgtttcttct
SEQ ID NO:18：抗VGFR2 sdAb NTV4(一种合成构建体)的氨基酸序列
AQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVTITDEDMTRVRQAPGKGLEWVSSILNTGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVHEKAADMNFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:19：来自双峰驼抗人CD19 sdAb SRB-85的氨基酸编码DNA序列
gaagttcagctgctggaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgttcttgcgaagcgtctggtttcaacgcgatgacctctatcgactcttggaccgacgcggttaaaggttgggttcgtcagccgccgggtaaaggtctggaatgggtttctcgtttcgcgatctctcaggacaacgcgaaaaacaccgtttacctgcagatgaactctctgaaaccggaagacaccgcgatgtactactgcgcgctgtctaaatgctacacccgtgtttacgactactggggtcagggtacccaggttaccgtttcttctggt
SEQ ID NO:20：来自双峰驼抗人CD19 sdAb SRB-85的氨基酸序列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRSCEASGFNAMTSIDSWTDAVKGWVRQPPGKGLEWVSRFAISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCALSKCYTRVYDYWGQGTQVTVSSG
SEQ ID NO:21：来自双峰驼抗人CD19 sdAb SRB-37的氨基酸编码DNA序列
gaagttcagctgcaggaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgcggcgtctggtttcatctacatggttggtatcaaaaccgaacgtgacggtgttaaaggttgggttcgtcaggcgccgggtaaaggtctggaatggctgtctcgtttcaccatcccgcgtgacaacgcgaaaaacaccctgtacctgcagatgaacaacctgaaatctgaagacaccgcgctgtactactgcgcgaccgaagaaaacgactggggtcagggtacccaggttaccgtttcttctggt
SEQ ID NO:22：来自双峰驼抗人CD19 sdAb SRB-37的氨基酸序列
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIYMVGIKTERDGVKGWVRQAPGKGLEWLSRFTIPRDNAKNTLYLQMNNLKSEDTALYYCATEENDWGQGTQVTVSSG
SEQ ID NO:23：来自单峰驼的抗CTLA-4sdAb NB16的氨基酸编码DNA序列
caggttcagctgcaggaatctggtggtggttctgttcaggcgggtggttctctgcgtctgtcttgcaccgcgtctggtttcggtgttgacggtaccgacatgggttggtaccgtcaggcgccgggtaacgaatgcgaactggtttcttctatctcttctatcggtatcggttactactctgaatctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaacgcgaaaaacaccgtttacctgcagatgaactctctgcgtccggacgacaccgcggtttactactgcggtcgtcgttggatcggttaccgttgcggtaactggggtcgtggtacccaggttaccgtttcttct
SEQ ID NO:24：来自单峰驼的抗CTLA-4 sdAb NB16的氨基酸序列
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTASGFGVDGTDMGWYRQAPGNECELVSSISSIGIGYYSESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPDDTAVYYCGRRWIGYRCGNWGRGTQVTVSS
SEQ ID NO:25：来自单峰驼的抗CTLA-4 sdAb NB36的氨基酸编码DNA序列
caggttcagctgcaggaatctggtggtggttctgttcaggcgggtggttctctgcgtctgtcttgcaccggttctcgttacacctacaccatgggttggttccgtcaggcgccgggtaaagaacgtgaaggtgttgttgcgatcaccgcgttcggttctccgttctacgcggactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaacgcgaacaacaccatcttcctgcagatgaactctctgaaaccggaagactctgcgatgtactactgcgcggcgcgtggttcttctggtacctcttacaaatggaacgaatacggttcttacaactactggggtcagggtacccaggttaccgtttcttct
SEQ ID NO:26：来自单峰驼的抗CTLA-4 sdAb NB36的氨基酸序列
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTGSRYTYTMGWFRQAPGKEREGVVAITAFGSPFYADSVKGRFTISRDNANNTIFLQMNSLKPEDSAMYYCAARGSSGTSYKWNEYGSYNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:27：来自单峰驼的抗CTLA-4 sdAb NB91的氨基酸编码DNA序列
caggttcagctgcaggaatctggtggtggttctgttcaggcgggtggttctctgcgtctgtcttgcgcggcgtctaaatacacctcttgcatgggttggttccgtcaggcgccgggtaaagaacgtgaagttgttgcgcacatcgactctggtccgcgtaccctgtacgcggactctgttaaaggtcgtttcaccatctctaaagacaacgcgaaaaacaccctgtacctggaaatgtctaccctgaaaccggacgacaccgcgatgtactactgcgcggcgggtccgatgtactctggttcttgcaactacaactactggggtcagggtacccaggttaccgtttcttct
SEQ ID NO:28：来自单峰驼的抗CTLA-4 sdAb NB91的氨基酸序列
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASKYTSCMGWFRQAPGKEREVVAHIDSGPRTLYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLEMSTLKPDDTAMYYCAAGPMYSGSCNYNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:29：来自单峰驼的抗人PD-L1 sdAb A1的氨基酸编码DNA序列
Caggttcagctgcaggaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgcggcgtctggtttcaccctggactactacgcgatcggttggttccgtcaggcgccgggtaaagaacgtgaaggtgtttcttgcatctcttcttctgacggttctacctactacgcggactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaacgcgaaaaacaccgtttacctgcagatgtcttctctgaaaccggaagacaccgcggtttactactgcggtatctctggttcttgcctgctggaagactacggtatggactactggggtaaaggtacccaggttaccgtttcttct
SEQ ID NO:30：来自单峰驼的抗人PD-L1 sdAb A1的氨基酸序列
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCGISGSCLLEDYGMDYWGKGTQVTVSS
SEQ ID NO:31：来自单峰驼的抗人PD-L1 sdAb B1的氨基酸编码DNA序列
caggttcagctgcaggaatctggtggtggtctggttcacccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgcggcgtctggtttctctctggacaactacgcgatcggttggttccgtcaggcgccgggtaaagaacgtgaaggtgtttcttgcatctcttctggttctgaaggtcgtcgttactacgcggacttcgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaacgcgaaaaacaccgcgttcctgcagatgaactctctgaaaccggaagacaccgcggactactactgcgcgaccgttggtttctgctcttctcagtacggtatggaattcgttggtgactactggggtcagggtacccaggttaccgtttcttct
SEQ ID NO:32：来自单峰驼的抗人PD-L1 sdAb B1的氨基酸序列
QVQLQESGGGLVHPGGSLRLSCAASGFSLDNYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSGSEGRRYYADFVKGRFTISRDNAKNTAFLQMNSLKPEDTADYYCATVGFCSSQYGMEFVGDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:33：抗小鼠血清白蛋白sdAb MSA21的氨基酸序列
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCEASGFTFSRFGMTWVRQAPGKGVEWVSGISSLGDSTLYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLNPGGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:34：抗人血清白蛋白sdAb Alb-1的氨基酸序列
AVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS
SEQ ID NO:35：抗人血清白蛋白sdAb Alb23的氨基酸序列(人源化、优化的Alb1)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
SEQ ID NO:36：抗EGFR VHH 7A5的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASDRTFSSNNMGWFRQAPGKEREFVAAIGWGGLETHYSDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTARYYCAVSSTRTVIYTLPRMYNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:37：抗EGFR VHH 7D12的氨基酸序列
QVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:38：抗EGFR VHH 7C12的氨基酸序列
AVQLVESGGGSVQAGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSTWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:39：抗胰岛素样生长因子1受体VHH 4B11的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFTFNAMGWYRQAPGKQRELVAVIISGGSTHYVDSVKGRFTISRDNAKKMVYLQMNSLKPEDTAVYYCNVKKFGDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:40：抗胰岛素样生长因子1受体VHH 3G7的氨基酸序列
DVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASESISTINVMAWYRQAPGKQRELVAEITRSGRTNYVDSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLNLEDTAVYYCRTIDGSWREYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:41：抗胰岛素样生长因子1受体VHH 2C7的氨基酸序列
QVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCVASGRTFSNYAIVIGWFRQAPGQEREFVAAINWNSRSTYYADSVKGRFTISRLNARNTVYLQMNRLKPEDTAVYDCAASHDSDYGGTNANLYDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:42：抗胰岛素样生长因子1受体VHH 1C7的氨基酸序列
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSRTANAWFRQAPGKEREFVATITWNSGTTRYADSVKGRFFISKDSAKNTIYLEMNSLEPEDTAVYYCAATAAAVITPTRGYYNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:43：抗CEACAM VHH NbCEA5的氨基酸序列
EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGDTYGSYWMGWFRQAPGKEREGVAAINRGGGYTVYADSVKGRFTISRDTAKNTVYLQMNSLRPDDTADYYCAASGVLGGLHEDWFNYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:44：抗CEACAM VHH CEA5的氨基酸序列
EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGDTYGSYWMGWFRQAPGQEREAVAAINRGGGYTVYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPDDTADYYCAASGVLGGLHEDWFNYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:45：抗CD123 VHH 57A07的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSGNVMGWYRRQAPGKEREWVAAIASGGSIYYRDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNSHPPTLPYWGLGTQVTVSS
SEQ ID NO:46：抗CD123 VHH 57B04的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGINFRFNSMGWWRRRAPGKEREWVAAITSGDITNYRDSVRGRFTISRDNVKNTVYLQMNTLKLEDTAVYYCNTFPPIADYWGLGTQVTVSS
SEQ ID NO:47：抗CD123 VHH 51D09的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSGNTMGWYRQAPGKQRELVAAISSGGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNAAILLYRLYGYEEGDYWGLGTLVTVSS
SEQ ID NO:48：抗CD123 VHH 55C05的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVPAGDSLRLSCVASGRSLNTYTMGWFRQAPGKECEEVAAINWNGVYRDYADSAKGRETASRDNAMNTVFLQMNSLKPEDTAVYFCATATQGWDRHTEPSDFGSWGLGTQVTVSS
SEQ ID NO:49：抗CD123 VHH 50F07的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTGSGSTFSINAMGWYRQAPGKQRELVAAITSGGRTNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNARISAGTAFWLWSDYEYWGLGTLVTVSS
SEQ ID NO:50：抗CD123 VHH 55F03的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQAGGPLRLSCAASGRTFSSYVMGWFRQAPGKEREFVAAIYWSNGKTQYTDSVKGRFTISGDNAKNTVYLQMNSLNPEDTAVYYCVADKDETGFRTLPIAYDYWGLGTQVTVSS
SEQ ID NO:51：抗CD123 VHH 55A01的氨基酸序列
EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCTTSGRALNMYVMGWFRQAPGNEREFVAATSSSGGSTSYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAAYRCAASPYVSTPTMNILEEYRYWGLGTQVTVSS
SEQ ID NO:52：抗c-MET VHH 04E09的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFILDYYAIGWFRQAPGKEREGVLCIDASDDITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTGVYYCATPIGLSSSCLLEYDYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:53：抗c-MET VHH 06B08的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTISRYTMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGDNTNYADSVKGRFTISRPNTKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCAADYRSGSYYQASEWTRPSGYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:54：抗c-MET VHH 06C12的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLDYFAIGWFRQAPGKEREEISCISNSDGSTYYANSVKGRFTISIDNAKNTVYLQMTSLKPEDTAVYYCATPVGLGPFCKTTNDYDYSGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:55：抗c-MET VHH 06F10的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAINWFRQAPGKEREGVSCISGGDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATALGLSSSCHGDGYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:56：抗Her3 VHH 21F6的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTYYLNAMGWFRQGPGKDREFVAAIDWSDGNKDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADTPPWGPMIYIESYDSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:57：抗Her3 VHH 4C7的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGPAWVSTVSPGGITTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCLRDLNNRGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:58：抗Her3 VHH 17B5的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIGGLNAMAWYRQAPGKERELVAGIFGVGSTRYADSVKGRFTISRDIAKNTVFLQMNSLNSEDTAVYYCRMSSVTRGSSDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:59：抗Her3 VHH 18G11的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGTLFKINAMGWYRQAPGKRRELVALITSSDTTDYAESVEGRFTISRDNTWNAVYLQMNSLKPEDTAVYYCHSDHYSMGVPEKRVIMYGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:60：抗Her3 VHH 34C7的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLGLSCVASGSIFRINAMAWYRQAPGKQRELVAEITAGGSTNYADSVKGRFTISVDNAWNTLYLQMNSLKVEDTAVYYCNLDHYTTWDRRSAYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:61：抗Her2 VHH 47D5的氨基酸序列
KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFGFNDMAWYRQAPGKQRELVALISRVGVTSSADSVKGRFTISRVNAKDTVYLQMNSLKPEDTAVYYCYMDQRLDGSTLAYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:62：抗Her2 VHH 2D3的氨基酸序列
EVQLVESGGSLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQVPGKGLEWVSSINWSGTHTDYADSVKGRFTISRNNANNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNWRDAGTTWFEKSGSAGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:63：抗Her2 VHH 5F7的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSINTMGWYRQAPGKQRELVALISSIGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCKRFRTAAQGTDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:64：抗Her2 VHH 13D11的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVHPGGSLRLSCVGSGFSLDDYGMTWVRRAPGKGLEWVSSINWSGTHTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLFLQMNSLNPEDTAVYYCGQGWKIVPTNPRGHGTQVTVSS
SEQ ID NO:65：抗Her2 VHH 2B4的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVGSGFSLDDYAMTWVRQAPGKGLEWVSSINWSGTHTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLFLQMNSLSPEDTAVYYCNQGWKIRPTIPMGHGTQVTVSS
SEQ ID NO:66：抗Her2 VHH 2G2的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFSLDDYGMTWVRQAPGKGLEWVSSINWSGTHTDYTDPVKGRFTISRDNAKNTLFLQMNNLTPEDTAVYYCNRGWKIVPTDLGGHGTQVTVSS
SEQ ID NO:67：抗Her2 VHH 13G11的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFISNYAMGWFRQAPGKEREFVATINWSGSHSDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKSEDTAVYYCAPGWGTAPLSTSVYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:68：抗Her2 VHH 12E33的氨基酸序列
EVQLVESGGGMVQAGGSLRLSCAASGLTLSNYGMGWFRQAPGKEREFVSSINWSGTHTYDADFVKGRFIISRDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCAAGGWGTGRYNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:69：抗Her2 VHH 13F21的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQSGGSLRLSCVASGTIVSINATSWYRQAPGNQRELVATIIGDGRTHYADSVKDRFTISRDAAANLVYLQMNSLKPSDTAIYSCNANGIESYGWGNRHFNYWTVGTQVTVSS
SEQ ID NO:70：抗Her2 VHH 11A101的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSPGVTYYADSVKGRFTTSRDNAKNTVYLQMNDLKPEDTAVYYCAADFYLATLAHEYDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:71：抗Her2 VHH 11A22的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMAWFRQAPGTEREFIAGIRWSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADFYVSTLAHEYDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:72：抗Her2 VHH 12D44的氨基酸序列
KVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMAWFRQAPGTEREFIAGIRWSDGSTYYADSVKGRFTISRANAKNTVYLQMNGLKPEDTAVYYCAADFYVSTLAHEYDYWGQGTQVTVSS。
序列表
<110> 萨普雷米科技有限公司(Sapreme Technologies B.V.); 柏林夏里特医学院（Charité – Universitätsmedizin Berlin）
<120> 包含含有VHH的ADC或AOC和皂苷或配体-皂苷缀合物的组合
<130> P6094578PCT
<160> 72
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 414
<212> DNA
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 1
gaagttcagc tgcaggaatc tggtggtggt ctggttcagc cgggtggttc tctgcgtctg 60
tcttgcgcgg cgtctggttt catcttctct aacgacgcga tgacctgggt tcgtcaggcg 120
ccgggtaaag gtctggaatg ggtttcttct atcaactggt ctggtaccca caccaactac 180
gcggactctg ttaaaggtcg tttcaccatc tctcgtgaca acgcgaaacg taccctgtac 240
ctgcagatga actctctgaa agacgaagac accgcgctgt actactgcgt taccggttac 300
ggtgttacca aaaccccgac cggtcagggt acccaggtta ccgtttcttc tcaccaccac 360
caccaccact ctccgtctac cccgccgacc ccgtctccgt ctaccccgcc gtgc 414
<210> 2
<211> 138
<212> PRT
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 2
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Asp
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Trp Ser Gly Thr His Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Thr Gly Tyr Gly Val Thr Lys Thr Pro Thr Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Ser Pro Ser Thr Pro
115 120 125
Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Cys
130 135
<210> 3
<211> 375
<212> DNA
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 3
atggaagttc agctggttga atctggtggt ggtctggttc aggcgggtgg ttctctgcgt 60
ctgtcttgcg cggcgtctgg tatcaccttc tctatcaaca ccatgggttg gtaccgtcag 120
gcgccgggta aacagcgtga actggttgcg ctgatctctt ctatcggtga cacctactac 180
gcggactctg ttaaaggtcg tttcaccatc tctcgtgaca acgcgaaaaa caccgtttac 240
ctgcagatga actctctgaa accggaagac accgcggttt actactgcaa acgtttccgt 300
accgcggcgc agggtaccga ctactggggt cagggtaccc aggttaccgt ttcttctcac 360
caccaccacc accac 375
<210> 4
<211> 125
<212> PRT
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 4
Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile
20 25 30
Asn Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His
115 120 125
<210> 5
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗HER2 dsAb pcNB2的氨基酸编码DNA序列
<400> 5
atggaagttc agctggttga aaaaggtggt ggtcgtgttc aggcgggtgg ttctctgcgt 60
ctgcgttgcg cggcgtctgg tatcaccttc tctatcaaca ccatgggttg gtaccgtcag 120
gcgccgggta aacagcgtga actggttgcg ctgatctctt ctatcggtga cacctactac 180
gcggactctg ttaaaggtcg tttccgtatc cgtcgtgaca acgcgaaaaa caccgtttac 240
ctgcgtatgc gtcgtctgaa accggaagac accgcggttt actactgcaa acgtttccgt 300
accgcggcgc agggtaccga ctactggggt cagggtaccc gtgttaccgt ttctaaacac 360
caccaccacc accac 375
<210> 6
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗HER2 dsAb pcNB2的氨基酸序列
<400> 6
Met Glu Val Gln Leu Val Glu Lys Gly Gly Gly Arg Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Arg Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile
20 25 30
Asn Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Arg Ile Arg Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Met Arg Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Arg Val Thr Val Ser Lys His His His His His His
115 120 125
<210> 7
<211> 378
<212> DNA
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 7
gcggcgcagg ttaaactgga agaatctggt ggtggttctg ttcagaccgg tggttctctg 60
cgtctgacct gcgcggcgtc tggtcgtacc tctcgttctt acggtatggg ttggttccgt 120
caggcgccgg gtaaagaacg tgaattcgtt tctggtatct cttggcgtgg tgactctacc 180
ggttacgcgg actctgttaa aggtcgtttc accatctctc gtgacaacgc gaaaaacacc 240
gttgacctgc agatgaactc tctgaaaccg gaagacaccg cgatctacta ctgcgcggcg 300
gcggcgggtt ctgcgtggta cggtaccctg tacgaatacg actactgggg tcagggtacc 360
caggttaccg tttcttct 378
<210> 8
<211> 126
<212> PRT
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 8
Ala Ala Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg
20 25 30
Ser Tyr Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 9
<211> 381
<212> DNA
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 9
gaagttcagc tggttgaatc tggtggtggt ctggttcagg cgggtggttc tctgcgtctg 60
tcttgcgcgg cgtctggtcg taccttctct tcttacgcga tgggttggtt ccgtcaggcg 120
ccgggtaaag aacgtgaatt cgttgttgcg atcaactggt cttctggttc tacctactac 180
gcggactctg ttaaaggtcg tttcaccatc tctcgtgaca acgcgaaaaa caccatgtac 240
ctgcagatga actctctgaa accggaagac accgcggttt actactgcgc ggcgggttac 300
cagatcaact ctggtaacta caacttcaaa gactacgaat acgactactg gggtcagggt 360
acccaggtta ccgtttcttc t 381
<210> 10
<211> 127
<212> PRT
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Val Ala Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Tyr Gln Ile Asn Ser Gly Asn Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr
100 105 110
Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 11
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗VGFR2 dsAb NTV1的氨基酸编码DNA序列
<400> 11
atggcgcagg ttcagctgct ggaatctggt ggtggtctgg ttcagccggg tggttctctg 60
cgtctgtctt gcgcggcgtc tggttactct gttatcaacg acttcatgac ctgggttcgt 120
caggcgccgg gtaaaggtct ggaatgggtt tcttctatct ctgttgcgga cggttctacc 180
tactacgcgg actctgttaa aggtcgtttc accatctctc gtgacaactc taaaaacacc 240
ctgtacctgc agatgaactc tctgcgtgcg gaagacaccg cggtttacta ctgcgcggcg 300
cgtgttggtg gtcgtgacct gggttggccg tacgaactgg actactgggg tcagggtacc 360
ctggttaccg tttcttct 378
<210> 12
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗VGFR2 dsAb NTV1的氨基酸序列
<400> 12
Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Val Ile
20 25 30
Asn Asp Phe Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Ser Ile Ser Val Ala Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Arg Val Gly Gly Arg Asp Leu Gly Trp Pro Tyr Glu
100 105 110
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 13
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗VGFR2 dsAb NTV2的氨基酸编码DNA序列
<400> 13
atggcgcagg ttcagctgct ggaatctggt ggtggtctgg ttcagccggg tggttctctg 60
cgtctgtctt gcgcggcgtc tggtttcaaa atcaccaaca aaaccatggc gtgggttcgt 120
caggcgccgg gtaaaggtct ggaatgggtt tcttctatcg gttcttcttc tggttctacc 180
tactacgcgg actctgttaa aggtcgtttc accatctctc gtgacaactc taaaaacacc 240
ctgtacctgc agatgaactc tctgcgtgcg gaagacaccg cggtttacta ctgcgcgcgt 300
cgtaaaggta accgtctggg tccggcggcg ctgcgttctt ggggtcaggg taccctggtt 360
accgtttctt ct 372
<210> 14
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗VGFR2 dsAb NTV2的氨基酸序列
<400> 14
Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Ile Thr
20 25 30
Asn Lys Thr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Ser Ile Gly Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Arg Lys Gly Asn Arg Leu Gly Pro Ala Ala Leu Arg
100 105 110
Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗VGFR2 dsAb NTV3的氨基酸编码DNA序列
<400> 15
atggcgcagg ttcagctgct ggaatctggt ggtggtctgg ttcagccggg tggttctctg 60
cgtctgtctt gcgcggcgtc tggtgttcgt gttaactaca aatctatgtc ttgggttcgt 120
caggcgccgg gtaaaggtct ggaatgggtt tctaccatca cctctcgtaa cggttctacc 180
tactacgcgg actctgttaa aggtcgtttc accatctctc gtgacaactc taaaaacacc 240
ctgtacctgc agatgaactc tctgcgtgcg gaagacaccg cggtttacta ctgcgcgacc 300
ggtcgtgcgc accacgcgcc ggttcgttac tggggtcagg gtaccctggt taccgtttct 360
tct 363
<210> 16
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗VGFR2 dsAb NTV3的氨基酸序列
<400> 16
Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Arg Val Asn
20 25 30
Tyr Lys Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Thr Ile Thr Ser Arg Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Thr Gly Arg Ala His His Ala Pro Val Arg Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗VGFR2 dsAb NTV4的氨基酸编码DNA序列
<400> 17
atggcgcagg ttcagctgct ggaatctggt ggtggtctgg ttcagccggg tggttctctg 60
cgtctgtctt gcgcggcgtc tggtgttacc atcaccgacg aagacatgac ccgtgttcgt 120
caggcgccgg gtaaaggtct ggaatgggtt tcttctatcc tgaacaccgg tggttctacc 180
tactacgcgg actctgttaa aggtcgtttc accatctctc gtgacaactc taaaaacacc 240
ctgtacctgc agatgaactc tctgcgtgcg gaagacaccg cggtttacta ctgcgcggcg 300
gttcacgaaa aagcggcgga catgaacttc tggggtcagg gtaccctggt taccgtttct 360
tct 363
<210> 18
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗VGFR2 dsAb NTV4的氨基酸序列
<400> 18
Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Ile Thr Asp
20 25 30
Glu Asp Met Thr Arg Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ser Ser Ile Leu Asn Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Val His Glu Lys Ala Ala Asp Met Asn Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 19
<211> 327
<212> DNA
<213> 双峰驼（Camelus bactrianus）
<400> 19
gaagttcagc tgctggaatc tggtggtggt ctggttcagc cgggtggttc tctgcgttct 60
tgcgaagcgt ctggtttcaa cgcgatgacc tctatcgact cttggaccga cgcggttaaa 120
ggttgggttc gtcagccgcc gggtaaaggt ctggaatggg tttctcgttt cgcgatctct 180
caggacaacg cgaaaaacac cgtttacctg cagatgaact ctctgaaacc ggaagacacc 240
gcgatgtact actgcgcgct gtctaaatgc tacacccgtg tttacgacta ctggggtcag 300
ggtacccagg ttaccgtttc ttctggt 327
<210> 20
<211> 109
<212> PRT
<213> 双峰驼（Camelus bactrianus）
<400> 20
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Asn Ala Met Thr Ser Ile
20 25 30
Asp Ser Trp Thr Asp Ala Val Lys Gly Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly
35 40 45
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Phe Ala Ile Ser Gln Asp Asn Ala
50 55 60
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
65 70 75 80
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Cys Tyr Thr Arg Val Tyr Asp
85 90 95
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly
100 105
<210> 21
<211> 312
<212> DNA
<213> 双峰驼（Camelus bactrianus）
<400> 21
gaagttcagc tgcaggaatc tggtggtggt ctggttcagc cgggtggttc tctgcgtctg 60
tcttgcgcgg cgtctggttt catctacatg gttggtatca aaaccgaacg tgacggtgtt 120
aaaggttggg ttcgtcaggc gccgggtaaa ggtctggaat ggctgtctcg tttcaccatc 180
ccgcgtgaca acgcgaaaaa caccctgtac ctgcagatga acaacctgaa atctgaagac 240
accgcgctgt actactgcgc gaccgaagaa aacgactggg gtcagggtac ccaggttacc 300
gtttcttctg gt 312
<210> 22
<211> 104
<212> PRT
<213> 双峰驼（Camelus bactrianus）
<400> 22
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Tyr Met Val Gly
20 25 30
Ile Lys Thr Glu Arg Asp Gly Val Lys Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro
35 40 45
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ser Arg Phe Thr Ile Pro Arg Asp Asn
50 55 60
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp
65 70 75 80
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Thr Glu Glu Asn Asp Trp Gly Gln Gly
85 90 95
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly
100
<210> 23
<211> 351
<212> DNA
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 23
caggttcagc tgcaggaatc tggtggtggt tctgttcagg cgggtggttc tctgcgtctg 60
tcttgcaccg cgtctggttt cggtgttgac ggtaccgaca tgggttggta ccgtcaggcg 120
ccgggtaacg aatgcgaact ggtttcttct atctcttcta tcggtatcgg ttactactct 180
gaatctgtta aaggtcgttt caccatctct cgtgacaacg cgaaaaacac cgtttacctg 240
cagatgaact ctctgcgtcc ggacgacacc gcggtttact actgcggtcg tcgttggatc 300
ggttaccgtt gcggtaactg gggtcgtggt acccaggtta ccgtttcttc t 351
<210> 24
<211> 117
<212> PRT
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Gly Val Asp Gly Thr
20 25 30
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Glu Leu Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ile Gly Ile Gly Tyr Tyr Ser Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly
85 90 95
Arg Arg Trp Ile Gly Tyr Arg Cys Gly Asn Trp Gly Arg Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 369
<212> DNA
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 25
caggttcagc tgcaggaatc tggtggtggt tctgttcagg cgggtggttc tctgcgtctg 60
tcttgcaccg gttctcgtta cacctacacc atgggttggt tccgtcaggc gccgggtaaa 120
gaacgtgaag gtgttgttgc gatcaccgcg ttcggttctc cgttctacgc ggactctgtt 180
aaaggtcgtt tcaccatctc tcgtgacaac gcgaacaaca ccatcttcct gcagatgaac 240
tctctgaaac cggaagactc tgcgatgtac tactgcgcgg cgcgtggttc ttctggtacc 300
tcttacaaat ggaacgaata cggttcttac aactactggg gtcagggtac ccaggttacc 360
gtttcttct 369
<210> 26
<211> 123
<212> PRT
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 26
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Arg Tyr Thr Tyr Thr Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Val Ala Ile
35 40 45
Thr Ala Phe Gly Ser Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Ile Phe Leu Gln Met Asn
65 70 75 80
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Gly
85 90 95
Ser Ser Gly Thr Ser Tyr Lys Trp Asn Glu Tyr Gly Ser Tyr Asn Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 351
<212> DNA
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 27
caggttcagc tgcaggaatc tggtggtggt tctgttcagg cgggtggttc tctgcgtctg 60
tcttgcgcgg cgtctaaata cacctcttgc atgggttggt tccgtcaggc gccgggtaaa 120
gaacgtgaag ttgttgcgca catcgactct ggtccgcgta ccctgtacgc ggactctgtt 180
aaaggtcgtt tcaccatctc taaagacaac gcgaaaaaca ccctgtacct ggaaatgtct 240
accctgaaac cggacgacac cgcgatgtac tactgcgcgg cgggtccgat gtactctggt 300
tcttgcaact acaactactg gggtcagggt acccaggtta ccgtttcttc t 351
<210> 28
<211> 117
<212> PRT
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Lys Tyr Thr Ser Cys Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Val Ala His Ile
35 40 45
Asp Ser Gly Pro Arg Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Glu Met Ser
65 70 75 80
Thr Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Pro
85 90 95
Met Tyr Ser Gly Ser Cys Asn Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 366
<212> DNA
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 29
caggttcagc tgcaggaatc tggtggtggt ctggttcagc cgggtggttc tctgcgtctg 60
tcttgcgcgg cgtctggttt caccctggac tactacgcga tcggttggtt ccgtcaggcg 120
ccgggtaaag aacgtgaagg tgtttcttgc atctcttctt ctgacggttc tacctactac 180
gcggactctg ttaaaggtcg tttcaccatc tctcgtgaca acgcgaaaaa caccgtttac 240
ctgcagatgt cttctctgaa accggaagac accgcggttt actactgcgg tatctctggt 300
tcttgcctgc tggaagacta cggtatggac tactggggta aaggtaccca ggttaccgtt 360
tcttct 366
<210> 30
<211> 122
<212> PRT
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 30
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Ile Ser Gly Ser Cys Leu Leu Glu Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 378
<212> DNA
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 31
caggttcagc tgcaggaatc tggtggtggt ctggttcacc cgggtggttc tctgcgtctg 60
tcttgcgcgg cgtctggttt ctctctggac aactacgcga tcggttggtt ccgtcaggcg 120
ccgggtaaag aacgtgaagg tgtttcttgc atctcttctg gttctgaagg tcgtcgttac 180
tacgcggact tcgttaaagg tcgtttcacc atctctcgtg acaacgcgaa aaacaccgcg 240
ttcctgcaga tgaactctct gaaaccggaa gacaccgcgg actactactg cgcgaccgtt 300
ggtttctgct cttctcagta cggtatggaa ttcgttggtg actactgggg tcagggtacc 360
caggttaccg tttcttct 378
<210> 32
<211> 126
<212> PRT
<213> 单峰驼（Camelus dromedarius）
<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Gly Ser Glu Gly Arg Arg Tyr Tyr Ala Asp Phe
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala
65 70 75 80
Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Thr Val Gly Phe Cys Ser Ser Gln Tyr Gly Met Glu Phe Val
100 105 110
Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 33
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗小鼠血清白蛋白dsAb MSA21的氨基酸序列
<400> 33
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Val Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Leu Gly Asp Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Asn Pro Gly Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗人血清白蛋白dsAb Alb-1的氨基酸序列
<400> 34
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗人血清白蛋白dsAb Alb23的氨基酸序列
<400> 35
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 36
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR VHH 7A5的氨基酸序列
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Arg Thr Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Trp Gly Gly Leu Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Ser Ser Thr Arg Thr Val Ile Tyr Thr Leu Pro Arg Met Tyr
100 105 110
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 37
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR VHH 7D12的氨基酸序列
<400> 37
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR VHH 7C12的氨基酸序列
<400> 38
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Thr Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗胰岛素样生长因子1受体的氨基酸序列
VHH 4B11
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Thr Phe Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Val Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Val Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Val Lys Lys Phe Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 40
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗胰岛素样生长因子1受体的氨基酸序列
VHH 3G7
<400> 40
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ile Asn
20 25 30
Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Thr Arg Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Asn Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg
85 90 95
Thr Ile Asp Gly Ser Trp Arg Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗胰岛素样生长因子1受体的氨基酸序列
VHH 2C7
<400> 41
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Val Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ala Ala Ile Asn Trp Asn Ser Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Leu Asn Ala Arg Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Asp Cys Ala Ala Ser His Asp Ser Asp Tyr Gly Gly Thr Asn Ala Asn
100 105 110
Leu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 42
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗胰岛素样生长因子1受体的氨基酸序列
VHH 1C7
<400> 42
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Thr
20 25 30
Ala Asn Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Trp Asn Ser Gly Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Phe Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Asn Thr Ile Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Ile Thr Pro Thr Arg Gly Tyr Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 43
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CEACAM VHH NbCEA5的氨基酸序列
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Gly Val Leu Gly Gly Leu His Glu Asp Trp Phe Asn Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 44
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CEACAM VHH CEA5的氨基酸序列
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Gly Val Leu Gly Gly Leu His Glu Asp Trp Phe Asn Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 45
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD123 VHH 57A07的氨基酸序列
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Gly Asn
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ala Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ser His Pro Pro Thr Leu Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD123 VHH 57B04的氨基酸序列
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asn Phe Arg Phe Asn
20 25 30
Ser Met Gly Trp Trp Arg Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ala Ile Thr Ser Gly Asp Ile Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Thr Phe Pro Pro Ile Ala Asp Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD123 VHH 51D09的氨基酸序列
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Gly Asn
20 25 30
Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Ala Ile Leu Leu Tyr Arg Leu Tyr Gly Tyr Glu Glu Gly Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 48
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD123 VHH 55C05的氨基酸序列
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Pro Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ser Leu Asn Thr Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Cys Glu Glu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Trp Asn Gly Val Tyr Arg Asp Tyr Ala Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Glu Thr Ala Ser Arg Asp Asn Ala Met Asn Thr Val Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Thr Ala Thr Gln Gly Trp Asp Arg His Thr Glu Pro Ser Asp Phe
100 105 110
Gly Ser Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 49
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD123 VHH 50F07的氨基酸序列
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Arg Ile Ser Ala Gly Thr Ala Phe Trp Leu Trp Ser Asp Tyr Glu
100 105 110
Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD123 VHH 55F03的氨基酸序列
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Pro Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Trp Ser Asn Gly Lys Thr Gln Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ala Asp Lys Asp Glu Thr Gly Phe Arg Thr Leu Pro Ile Ala Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 51
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD123 VHH 55A01的氨基酸序列
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Arg Ala Leu Asn Met Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Thr Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Arg Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Pro Tyr Val Ser Thr Pro Thr Met Asn Ile Leu Glu Glu
100 105 110
Tyr Arg Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 52
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗c-MET VHH 04E09的氨基酸序列
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Leu Cys Ile Asp Ala Ser Asp Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Pro Ile Gly Leu Ser Ser Ser Cys Leu Leu Glu Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 53
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗c-MET VHH 06B08的氨基酸序列
<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Asp Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Pro Asn Thr Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Tyr Arg Ser Gly Ser Tyr Tyr Gln Ala Ser Glu Trp Thr
100 105 110
Arg Pro Ser Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 54
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗c-MET VHH 06C12的氨基酸序列
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Tyr Phe
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Asn Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Pro Val Gly Leu Gly Pro Phe Cys Lys Thr Thr Asn Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 55
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗c-MET VHH 06F10的氨基酸序列
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Gly Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Ala Leu Gly Leu Ser Ser Ser Cys His Gly Asp Gly Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 56
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗Her3 VHH 21F6的氨基酸序列
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Leu Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Trp Ser Asp Gly Asn Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Pro Pro Trp Gly Pro Met Ile Tyr Ile Glu Ser Tyr
100 105 110
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 57
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗Her3 VHH 4C7的氨基酸序列
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Ala Trp Val
35 40 45
Ser Thr Val Ser Pro Gly Gly Ile Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Leu Arg Asp Leu Asn Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 58
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗Her3 VHH 17B5的氨基酸序列
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Gly Gly Leu Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Phe Gly Val Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Val Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg
85 90 95
Met Ser Ser Val Thr Arg Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 59
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗Her3 VHH 18G11的氨基酸序列
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Leu Phe Lys Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Thr Ser Ser Asp Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Trp Asn Ala Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His
85 90 95
Ser Asp His Tyr Ser Met Gly Val Pro Glu Lys Arg Val Ile Met Tyr
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 60
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗Her3 VHH 34C7的氨基酸序列
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Gly Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Phe Arg Ile Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Thr Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ala Trp Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Leu Asp His Tyr Thr Thr Trp Asp Arg Arg Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 61
<211> 119
<212> PRT
<213> 大羊驼（Lama glama）
<400> 61
Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Gly Phe Asn
20 25 30
Asp Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Arg Val Gly Val Thr Ser Ser Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Val Asn Ala Lys Asp Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
85 90 95
Met Asp Gln Arg Leu Asp Gly Ser Thr Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 124
<212> PRT
<213> 大羊驼（Lama glama）
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Trp Ser Gly Thr His Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Asn Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Trp Arg Asp Ala Gly Thr Thr Trp Phe Glu Lys Ser Gly
100 105 110
Ser Ala Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 63
<211> 118
<212> PRT
<213> 大羊驼（Lama glama）
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 64
<211> 118
<212> PRT
<213> 大羊驼（Lama glama）
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Ser Leu Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Trp Ser Gly Thr His Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Gln Gly Trp Lys Ile Val Pro Thr Asn Pro Arg Gly His Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 65
<211> 118
<212> PRT
<213> 大羊驼（Lama glama）
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Ser Leu Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Trp Ser Gly Thr His Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Ser Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Gln Gly Trp Lys Ile Arg Pro Thr Ile Pro Met Gly His Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 66
<211> 118
<212> PRT
<213> 大羊驼（Lama glama）
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Trp Ser Gly Thr His Thr Asp Tyr Thr Asp Pro Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Arg Gly Trp Lys Ile Val Pro Thr Asp Leu Gly Gly His Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 122
<212> PRT
<213> 大羊驼（Lama glama）
<400> 67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ile Ser Asn
20 25 30
Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Val Ala Thr Ile Asn Trp Ser Gly Ser His Ser Asp Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Pro Gly Trp Gly Thr Ala Pro Leu Ser Thr Ser Val Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 68
<211> 119
<212> PRT
<213> 大羊驼（Lama glama）
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Trp Ser Gly Thr His Thr Tyr Asp Ala Asp Phe Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Gly Trp Gly Thr Gly Arg Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 69
<211> 119
<212> PRT
<213> 大羊驼（Lama glama）
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Trp Ser Gly Thr His Thr Tyr Asp Ala Asp Phe Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 70
<211> 120
<212> PRT
<213> 大羊驼（Lama glama）
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Ala Met
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
35 40 45
Ile Ser Arg Ser Pro Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 71
<211> 122
<212> PRT
<213> 大羊驼（Lama glama）
<400> 71
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<210> 72
<211> 122
<212> PRT
<213> 大羊驼（Lama glama）
<400> 72
Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Ala Asp Phe Tyr Val Ser Thr Leu Ala His Glu Tyr Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims (56)

1.一种药物组合，其包含：
-第一缀合物，该第一缀合物包含至少一个效应分子和用于结合第一细胞表面分子的单结构域抗体(sdAb)，该至少一个效应分子和该单结构域抗体直接或通过接头彼此共价连接；
-皂苷和/或其衍生物和/或第二缀合物，该第二缀合物包含用于结合第二细胞表面分子的结合分子和该皂苷和/或其衍生物，该结合分子和该皂苷或其衍生物直接或通过接头彼此共价连接，其中该皂苷或其衍生物是单糖链三萜糖苷或双糖链三萜糖苷，其中该第二细胞表面分子与该第一细胞表面分子相同或不同；和任选地，
-药学可接受的赋形剂和/或药学可接受的稀释剂。
2.如权利要求1所述的药物组合，其呈至少两个、优选两个药物组合物的形式，包含：
-第一药物组合物，其包含该第一缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂；以及
-第二药物组合物，其包含皂苷和/或其衍生物和/或该第二缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂。
3.如权利要求1所述的药物组合，其呈单一药物组合物形式，该单一药物组合物包含该第一缀合物和以下中的至少一个，优选一个：
·该皂苷；
·该皂苷衍生物；以及
·该第二缀合物，
并且任选包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂。
4.如权利要求1-3中任一项所述的药物组合，其中该第一缀合物包含sdAb，该sdAb是以下中任何一个或多个：衍生自抗体重链的VH结构域，该抗体优选免疫球蛋白G来源，优选人来源；衍生自抗体轻链的VL结构域，该抗体优选免疫球蛋白G来源，优选人来源；VHH结构域，其例如衍生自仅重链抗体(HCAb)，该仅重链抗体例如来自骆驼科来源或Ig-NAR来源，例如可变重链链新抗原受体(VNAR)结构域，优选该HCAb来自骆驼科来源；并且优选地，该sdAb是衍生自来自骆驼科来源的HCAb(骆驼VH)的VHH结构域，例如衍生自来自骆驼、美洲驼、羊驼、单峰驼、骆马、原驼和双峰驼的HCAb。
5.如权利要求1-4中任一项所述的药物组合，其中该第一缀合物包含至少两个sdAb，其中单个第一sdAb共价结合到至少一个效应分子，或两个或更多个sdAb结合到至少一个效应分子，或该至少两个sdAb全部结合到该至少一个效应分子，例如其中该至少两个sdAb中的每一个结合到该至少一个效应分子中的一个或多个。
6.如权利要求1-5中任一项所述的药物组合，其中该sdAb包含至少两个sdAb，该至少两个sdAb是相同的sdAb，优选地包含二至八个sdAb，更优选地二至四个sdAb。
7.如权利要求1-6中任一项所述的药物组合，其包含能够与该第一细胞表面分子上的相同结合位点结合的一至八个sdAb，其中该至少一个效应分子与该一至八个sdAb中的单个第一sdAb结合，或者其中如果这些sdAb中的两个或更多个存在的话该至少一个效应分子与该两个或更多个结合，和/或其中该至少一个效应分子中的每一个单独与单个sdAb结合，使得这些sdAb中的一个或多个各自与单个效应分子结合。
8.如权利要求1-7中任一项所述的药物组合，其中该sdAb是单个sdAb或者是至少两个，优选两个sdAb，其中该一个或多个sdAb可以结合该第一细胞表面分子，例如HIVgp41，或者该第一细胞表面分子是肿瘤细胞表面受体，例如肿瘤细胞特异性受体，更优选选自以下的受体：CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、黏结蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CanAg、整合素-αV、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC-1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA-4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2、c-Met(HGFR)、EGFR1、RANKL、ADAMTS5、CD16、CXCR7(ACKR3)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)，最优选选自：HER2、c-Met、VEGFR2、CXCR7、CD71和EGFR1。
9.如权利要求1-8中任一项所述的药物组合，其中该sdAb是单个sdAb或是至少两个，优选两个sdAb，其中该一个或多个sdAb选自：抗CD71 sdAb、抗HER2 sdAb、抗CD20 sdAb、抗CA125 sdAb、抗EpCAM(17-1A)sdAb、抗EGFR sdAb、抗CD30sdAb、抗CD33 sdAb、抗血管整合素α-vβ-3sdAb、抗CD52 sdAb、抗CD22 sdAb、抗CEA sdAb、抗CD44v6 sdAb、抗FAP sdAb、抗CD19sdAb、抗CanAg sdAb、抗CD56 sdAb、抗CD38 sdAb、抗CA6 sdAb、抗IGF-1R sdAb、抗整合素sdAb、抗黏结蛋白聚糖-1sdAb、抗CD79b、抗c-Met sdAb、抗EGFR1 sdAb、抗VEGFR2 sdAb、抗CXCR7 sdAb和抗HIVgp41，其中该一个或多个sdAb优选是一个或多个VHH，更优选是一个或多个骆驼VH。
10.如权利要求1-9中任一项所述的药物组合，其中该第一缀合物包含能结合HER2、CD71、HIVgp41和/或EGFR的sdAb，其中该sdAb优选是VHH，更优选是骆驼VH。
11.如权利要求1-10中任一项所述的药物组合，其中该第一缀合物包含选自以下的用于结合HER2的sdAb：由克隆11A4、克隆18C3、克隆22G12、克隆Q17或克隆Q17-C-标签产生的sdAb；或用于结合EGFR并由克隆抗EGFR Q86-C-标签产生的sdAb；或用于结合CD71并由克隆抗CD71 Q52-C-标签产生的sdAb；或用于结合HIVgp41并由克隆抗HIVgp41 Q8-C-标签产生的sdAb；或由SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31中任一项的cDNA编码的sdAb；或具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、36-72的氨基酸序列的sdAb中的任一个，其中任选地，该第一缀合物进一步包含用于结合白蛋白的共价结合的sdAb，例如具有SEQ ID NO:33、34和35的氨基酸序列的sdAb中的任一个或多个，优选地该sdAb是VHH，更优选是骆驼VH。
12.如权利要求1-11中任一项所述的药物组合，其中该效应分子包含以下或由以下组成：小分子如药物分子、毒素如蛋白毒素、寡核苷酸如BNA、异种核酸或siRNA、酶、肽、蛋白质中的至少一个或其任何组合。
13.如权利要求1-12中任一项所述的药物组合，其中该效应分子选自以下中的任何一个或多个：载体、基因、诱导细胞自杀的转基因、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、抗有义寡核苷酸(ASO，AON)、短干扰RNA(siRNA)、抗微小RNA(抗miRNA)、DNA适体、RNA适体、mRNA、小环DNA、肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯吗啉寡聚物(PMO)、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2'-脱氧-2'-氟阿拉伯糖核酸(FANA)、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、3’-氟己糖醇核酸(FHNA)、质粒、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)或其衍生物，更优选BNA，例如用于沉默HSP27蛋白表达的BNA或用于沉默载脂蛋白B表达的BNA。
14.如权利要求1-13中任一项所述的药物组合，其中该效应分子是选自以下中的任何一个或多个的寡核苷酸：短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、抗发夹状微小RNA(miRNA)、单链RNA、适体RNA、双链RNA(dsRNA)、抗微小RNA(抗miRNA、抗miR)、反义寡核苷酸(ASO)、mRNA、DNA、反义DNA、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2'-O,4'-氨基乙烯桥接核酸(BNANC)、基于BNA的siRNA和基于BNA的反义寡核苷酸(BNA-AON)。
15.如权利要求1-14中任一项所述的药物组合，其中该效应分子是选自抗miRNA、BNA-AON或siRNA例如基于BNA的siRNA中的任一个的寡核苷酸，优选选自化学修饰的siRNA、代谢稳定的siRNA和化学修饰的代谢稳定的siRNA。
16.如权利要求1-15中任一项所述的药物组合，其中该效应分子是寡核苷酸，该寡核苷酸当存在于包含基因的细胞中时能够沉默这样的基因，其中该基因是以下基因中的任何一个：载脂蛋白B(apoB)、甲状腺素转运蛋白(TTR)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/科信9型(PCSK9)、δ-氨基乙酰丙酸合酶1(ALAS1)、抗凝血酶3(AT3)、乙醇酸氧化酶(GO)、补体组分C5(CC5)、乙型肝炎病毒(HBV)的X基因、HBV的S基因、α-1抗胰蛋白酶(AAT)和乳酸脱氢酶(LDH)，和/或当存在于包含异常miRNA的细胞中时能够靶向这样的miRNA。
17.如权利要求1-16中任一项所述的药物组合，其中该效应分子是寡核苷酸，该寡核苷酸当存在于包含mRNA的细胞中时能够靶向这样的mRNA，其中该mRNA参与以下任何一种蛋白质的表达：apoB、TTR、PCSK9、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因的表达产物、HBV的S基因的表达产物、AAT和LDH，或当存在于包含miRNA的细胞中时能够拮抗或恢复这样的miRNA的功能，如抑制致癌miRNA(onco-miR)或阻遏onco-miR的表达。
18.如权利要求1-17中任一项所述的药物组合，其中该效应分子包含至少一个朊分子，或当从属于权利要求1-11中任一项时，由至少一个朊分子组成，优选选自肽、蛋白、酶和蛋白毒素中的任何一个或多个。
19.如权利要求1-18中任一项所述的药物组合，其中该效应分子包含以下中的至少一个，或当从属于权利要求1-11中任一项时，由以下中的至少一个组成：脲酶和Cre-重组酶、朊毒素、核糖体失活蛋白、蛋白毒素、细菌毒素、植物毒素，更优选选自以下中的任何一个或多个：病毒毒素，例如凋亡素；细菌毒素，例如志贺毒素、志贺样毒素、铜绿假单胞菌外毒素(PE)或PE的外毒素A、全长或截短的白喉毒素(DT)、霍乱毒素；真菌毒素，例如α-八叠球菌素；植物毒素，其包括核糖体失活蛋白和2型核糖体失活蛋白的A链，该2型核糖体失活蛋白是例如香石竹毒蛋白如香石竹毒蛋白-30或香石竹毒蛋白-32、皂草毒蛋白如皂草毒蛋白-S3或皂草毒蛋白-S6；bouganin或bouganin的去免疫衍生物debouganin、志贺样毒素A、商陆抗病毒蛋白、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、莫迪素、莫迪素A链、相思豆毒素、相思豆毒素A链、沃氏藤黄辛、沃氏藤黄辛A链、槲寄生凝集素、槲寄生凝集素A链；或动物或人毒素，例如青蛙RNA酶，或颗粒酶B或人血管生成素，或其任何有毒片段或有毒衍生物；优选地，该蛋白毒素是香石竹毒蛋白和/或皂草毒蛋白。
20.如权利要求1-19中任一项所述的药物组合，其中该效应分子包含至少一个载荷，或当从属于权利要求1-11中任一项时，由至少一个载荷组成。
21.如权利要求1-20中任一项所述的药物组合，其中该效应分子包含以下中的至少一个，或当从属于权利要求1-11中任一项时，由以下中的至少一个组成：靶向核糖体的毒素、靶向延伸因子的毒素、靶向微管蛋白的毒素、靶向DNA的毒素和靶向RNA的毒素、更优选以下中的任何一种或多种：厄塔毒素、帕舒托、美登素类衍生物DM1、美登素类衍生物DM4、单甲基奥瑞西汀E(MMAE、维多汀)、单甲基瑞奥西汀F(MMAF、马福多汀)、加利车霉素、N-乙酰基-γ-加利车霉素、吡咯并苯并二氮杂
Figure FDA0004086218770000061
(PBD)二聚体、苯并二氮杂/>
Figure FDA0004086218770000062
、CC-1065类似物、倍癌霉素、多柔比星、紫杉醇、多西他赛、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷、多西他赛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、米托蒽醌、tubulysin、吲哚啉苯并二氮杂/>
Figure FDA0004086218770000063
、AZ13599185、念珠藻素、根霉素、甲氨蝶呤、蒽环素、喜树碱类似物、SN-38、DX-8951f、甲磺酸依喜替康、截短形式的绿脓杆菌外毒素(PE38)、倍癌霉素衍生物、鹅膏蕈碱、α-鹅膏蕈碱、斯普利他汀、泰兰斯他汀、奥加米星、泰斯林、Amberstatin269和索星、或其衍生物。
22.如权利要求1-21中任一项所述的药物组合，其中该第一缀合物包含以下或由以下组成：抗体-药物缀合物(ADC)，例如包含至少一个sdAb的ADC和衍生自以下任一ADC的毒素：吉妥珠单抗-奥加米星、布仑妥昔单抗-维多汀、曲妥珠单抗-厄塔毒素、艾诺妥珠单抗-奥加米星、莫塞妥莫单抗-帕舒托和珀拉妥珠单抗-维多汀。
23.如权利要求1-22中任一项所述的药物组合，其中该皂苷包含选自以下的苷元核心结构，或者该皂苷衍生物包含衍生自以下的苷元核心结构：
2α-羟基齐墩果酸；
16α-羟基齐墩果酸；
常春藤皂苷元(23-羟基齐墩果酸)；
16α,23-二羟基齐墩果酸；
丝石竹皂苷元；
皂皮酸；
原七叶皂苷元-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-22-乙酸酯；
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21,22-双(2-甲基丁-2-烯酸酯)；
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-16,22-二乙酸酯；
洋地黄皂苷配基；
3,16,28-三羟基齐墩果-12-烯；以及
丝石竹酸，
优选地，该皂苷包含或该皂苷衍生物衍生自选自皂皮酸和丝石竹皂苷元的苷元核心结构，更优选地，该皂苷包含或该皂苷衍生物衍生自苷元核心结构皂皮酸。
24.如权利要求1-23中任一项所述的药物组合，其中该皂苷或该皂苷衍生物任选地包含与该皂苷或皂苷衍生物的苷元核心结构的C3原子或C28原子结合的第一糖链，优选与C3原子结合，和/或其中该皂苷或该皂苷衍生物任选地包含与该皂苷或该皂苷衍生物的苷元核心结构的C28原子结合的第二糖链。
25.如权利要求24所述的药物组合，其中
·该皂苷或该皂苷衍生物包含选自以下的第一糖链：
GlcA-，
Glc-，
Gal-，
Rha-(1→2)-Ara-，
Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-，
Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-，
Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-，
Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-，
Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-，
Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-，
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，和其任何衍生物，
和/或
·该皂苷或该皂苷衍生物包含选自以下的第二糖链：
Glc-，
Gal-，
Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-，
Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-，
Ara-，
Xyl-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc-其中R1是4E-甲氧基肉桂酸，Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc-其中R2是4Z-甲氧基肉桂酸，Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-，
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-二-OAc-Fuc-，
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc-其中R3是4E-甲氧基肉桂酸，
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-，
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-，
(Ara-或Xyl-)(1→3)-(Ara-或Xyl-)(1→4)-(Rha-或Fuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha-或Fuc-)(1→4)]-(Rha-或Fuc-)，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc-其中R4是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc-其中R5是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-，
6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-，
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-，
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-，
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-二-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-，
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-，
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-，
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc-其中R6是5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc-其中R7是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc-其中R8是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc-其中R9是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc-其中R10是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc-其中R11是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc-其中R12是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)
Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-，和
其任何衍生物。
26.如权利要求1-25中任一项所述的药物组合，其中该第二缀合物中的皂苷或皂苷衍生物包含如权利要求24或25所述的第一糖链和第二糖链，其中该第一糖链包含多于一个糖部分并且该第二糖链包含多于一个糖部分，并且其中该苷元核心结构是皂皮酸或丝石竹皂苷元或是皂皮酸或丝石竹皂苷元的衍生物，其中以下中的一项、两项或三项，优选一项或两项：
i.该苷元核心结构中的醛基团已被衍生化，
ii.该第一糖链中的葡糖醛酸部分的羧基基团已被衍生化，以及
iii.该第二糖链中的至少一个乙酰氧基(Me(CO)O-)基团已被衍生化。
27.如权利要求1-26中任一项所述的药物组合，其中该第二缀合物中的皂苷或皂苷衍生物包含：
i.包含醛基团的苷元核心结构，该醛基团已通过以下进行衍生化：
-还原成醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化为腙键，其中该BMPH的马来酰亚胺基团任选通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一烷酸]酰肼(KMUH)反应转化为腙键，其中该KMUH的马来酰亚胺基团任选通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
ii.第一糖链，其包含羧基基团，优选葡糖醛酸部分的羧基基团，该羧基基团已经通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化；
iii.第二糖链，其包含乙酰氧基基团(Me(CO)O-)，该乙酰氧基基团已经通过脱乙酰转化为羟基基团(HO-)而衍生化；或
iv.i.、ii.和/或iii.的两个或三个衍生化的任何组合，优选是i.、ii.和/或iii.的两个衍生化的任何组合。
28.如权利要求1-27中任一项所述的药物组合，其中该皂苷或该皂苷衍生物选自：皂树树皮皂苷、川续断皂苷B、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、灰毡毛忍冬皂苷A、商陆皂苷A、商陆皂苷元、七叶皂苷盐、AS6.2、NP-005236、AMA-1、AMR、α-常春藤皂苷、NP-012672、NP-017777、NP-017778、NP-017774、NP-018110、NP-017772、NP-018109、NP-017888、NP-017889、NP-018108、SA1641、AE X55、NP-017674、NP-017810、AG1、NP-003881、NP-017676、NP-017677、NP-017706、NP-017705、NP-017773、NP-017775、SA1657、AG2、SO1861、GE1741、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1904、SO1862、QS-7、QS1861、QS-7api、QS1862、QS-17、QS-18、QS-21A-apio、QS-21A-xylo、QS-21B-apio、QS-21B-xylo、β-七叶皂苷、七叶皂苷Ia、油茶籽皂苷I、油茶籽皂苷J、阿萨姆皂苷F、洋地黄皂苷、报春花酸1和AS64R、或其衍生物、或其立体异构体、和/或其组合，优选该皂苷或该皂苷衍生物是以下中的任何一个或多个：QS-21或QS-21衍生物、SO1861或SO1861衍生物、SA1641或SA1641衍生物和GE1741或GE1741衍生物，更优选QS-21衍生物或SO1861衍生物，最优选SO1861衍生物，其中优选该皂苷或该皂苷衍生物是如权利要求26或27所述的皂苷衍生物。
29.如权利要求1-28中任一项所述的药物组合，其中该皂苷或该皂苷衍生物选自：SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、皂树皂苷、Saponinum album、QS-18、Quil-A、Gyp1、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1862、SO1904、或其衍生物、或其立体异构体、和/或其任何组合，优选地，该皂苷衍生物是SO1861衍生物和/或GE1741衍生物和/或SA1641衍生物和/或QS-21衍生物，更优选地，该皂苷衍生物是SO1861衍生物或QS21衍生物，最优选地，该皂苷衍生物是根据权利要求26或27所述的SO1861衍生物。
30.如权利要求1-29中任一项所述的药物组合，其中该第二缀合物包含用于与该第二细胞表面分子结合的结合分子，该结合分子是以下中的任何一个或多个：用于结合该第二细胞表面分子例如EGF或细胞因子的配体例如朊配体，或免疫球蛋白或所述免疫球蛋白的能够结合该第二细胞表面分子的至少一个结合片段或结合结构域，其中该免疫球蛋白优选是以下中的任何一个或多个：抗体，例如单克隆抗体，优选人抗体，IgG，包含sdAb或由sdAb组成的分子，至少一个VHH结构域或至少一个VH结构域，可变重链新抗原受体(VNAR)结构域，Fab，scFv，Fv，dAb，F(ab)2，Fcab片段。
31.如权利要求1-30中任一项所述的药物组合，其中该第二缀合物包含用于结合该第二细胞表面分子的结合分子，其中该第二细胞表面分子是存在于异常细胞如肿瘤细胞、自身免疫细胞、感染的细胞如病毒感染的细胞上的细胞表面受体。
32.如权利要求1-31中任一项所述的药物组合，其中该第二缀合物包含用于结合该第二细胞表面分子的结合分子，例如抗体或其结合片段或结合结构域，例如sdAb，或受体配体，其中优选该第二细胞表面受体是HIVgp41或肿瘤细胞表面受体，例如肿瘤细胞特异性受体，更优选选自以下的细胞表面受体：CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、黏结蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CanAg、整合素-αV、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC-1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA-4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2、c-Met(HGFR)、EGFR1、RANKL、ADAMTS5、CD16、CXCR7(ACKR3)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)，最优选选自：HER2、c-Met、VEGFR2、CXCR7、CD71、EGFR和EGFR1。
33.如权利要求1-32中任一项所述的药物组合，其中该第二缀合物包含用于结合该第二细胞表面分子的结合分子，该结合分子是选自以下的免疫球蛋白，优选衍生自以下或基于以下的sdAb：抗CD71抗体如IgG型OKT-9、抗HER2抗体如曲妥珠单抗(赫赛汀)、珀妥珠单抗、抗CD20抗体如利妥昔单抗、奥法妥木单抗、托司妥莫单抗、奥比妥珠单抗艾瑞妥莫单抗、抗CA125抗体如奥戈伏单抗、抗EpCAM(17-1A)抗体如依决洛单抗、抗EGFR抗体如西妥昔单抗、马妥珠单抗、帕尼妥木单抗、尼妥珠单抗、抗CD30抗体如布仑妥昔单抗、抗CD33抗体如吉妥珠单抗、huMy9-6、抗血管整合素α-vβ-3抗体如伊瑞西珠单抗、抗CD52抗体如阿仑单抗、抗CD22抗体如依帕珠单抗、匹那妥珠单抗、抗CD22抗体莫塞妥莫单抗的结合片段(Fv)、人源化单克隆抗体艾诺妥珠单抗、抗CEA抗体如拉贝妥珠单抗、抗CD44v6抗体如比伐珠单抗、抗FAP抗体如西罗珠单抗、抗CD19抗体如huB4、抗CanAg抗体如huC242、抗CD56抗体如huN901、抗CD38抗体如达雷木单抗、OKT-10抗CD38单克隆抗体、抗CA6抗体如DS6、抗IGF-1R抗体如西妥木单抗、3B7、抗整合素抗体如CNTO 95、抗黏结蛋白聚糖-1抗体如B-B4、抗CD79b如珀拉妥珠单抗、抗HIVgp41抗体，优选以下中的任何一种：抗HIVgp41抗体、抗CD71抗体、抗HER2抗体和抗EGFR抗体，更优选以下中的任何一种：曲妥珠单抗、珀妥珠单抗、西妥昔单抗、马妥珠单抗、抗CD71抗体、OKT-9，最优选曲妥珠单抗、西妥昔单抗、抗CD71抗体OKT-9。
34.如权利要求1-33中任一项所述的药物组合，其中该第二缀合物包含该皂苷或该皂苷衍生物，该皂苷或该皂苷衍生物通过硫醚键共价结合到该结合分子中的巯基基团，共价键合通过接头N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)，该接头共价结合到该皂苷或该皂苷衍生物的苷元核心结构的位置C23处的醛基团上并且共价结合到该结合分子中的巯基基团，如半胱氨酸的巯基基团。
35.如权利要求1-34中任一项所述的药物组合，其中该第二缀合物包含该皂苷或该皂苷衍生物，该皂苷或该皂苷衍生物是双糖链三萜皂苷或其衍生物，该双糖链三萜皂苷或其衍生物属于在该皂苷或其衍生物的苷元核心结构的位置C23处任选地具有醛官能团的12,13-脱氢齐墩果烷类型，并且在该皂苷的苷元核心结构的C3β-OH基团处的第一糖链中包含葡糖醛酸单元，其中该皂苷或其衍生物通过该第一糖链中葡糖醛酸单元的羧基基团，优选通过至少一个接头，共价结合到该结合分子的氨基酸残基上，其中该氨基酸残基优选选自半胱氨酸和赖氨酸。
36.如权利要求35所述的药物组合，其中该第二缀合物包含该皂苷或其衍生物，该皂苷或其衍生物在该至少一个皂苷或其衍生物的苷元核心结构的C3β-OH基团处的第一糖链中包含葡糖醛酸单元，该葡糖醛酸单元共价结合到接头上，该接头优选通过酰胺键共价结合到该结合分子中的胺基团上，例如该结合分子的赖氨酸或N末端的胺基团，优选该葡糖醛酸单元是共价结合的接头1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)。
37.如权利要求1-36中任一项所述的药物组合，其中该第二缀合物包含多于一个共价结合的皂苷或其衍生物，优选2、3、4、5、6、8、10、16、32、64、128或1-100个，或其间的任何数目，例如7、9、12个皂苷或其衍生物。
38.如权利要求37所述的药物组合，其中该多于一个共价结合的皂苷或皂苷衍生物直接与该结合分子的氨基酸残基共价结合，优选与半胱氨酸和/或赖氨酸共价结合，和/或通过至少一个接头和/或通过至少一个可切割接头共价结合。
39.如权利要求37所述的药物组合，其中该多于一个共价结合的皂苷或皂苷衍生物是共价皂苷缀合物的一部分，该共价皂苷缀合物包含至少一个寡聚分子或聚合分子，并且该多于一个皂苷或皂苷衍生物与该至少一个寡聚分子或聚合分子共价结合，其中该共价皂苷缀合物与该结合分子共价结合。
40.如权利要求39所述的药物组合，其中1-8个该共价皂苷缀合物与该结合分子共价结合，更优选2-4个该共价皂苷缀合物，其中该至少一个共价皂苷缀合物任选地基于树状突，其中任选地1-32个皂苷或皂苷衍生物，优选2、3、4、5、6、8、10、16、32个，或其间任意数目，例如7、9、12个皂苷或皂苷衍生物，直接或通过接头与该至少一个共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子共价结合。
41.如权利要求1-40中任一项所述的药物组合，其中该皂苷或该皂苷衍生物通过可切割接头与该结合分子共价结合。
42.如权利要求41所述的药物组合，其中该可切割接头在酸性条件、还原条件、酶促条件和/或光诱导条件下经受切割，并且优选地，该可切割接头包含选自以下的可切割键：在酸性条件下经受切割的腙键和酰肼键，和/或易进行蛋白水解的键，例如被组织蛋白酶B进行蛋白水解的键，和/或在还原条件下易被切割的键，例如二硫键。
43.如权利要求41或42所述的药物组合，其中该可切割接头在如例如哺乳动物细胞，优选人细胞的内体和/或溶酶体中存在的酸性条件下，优选在pH 4.0-6.5，更优选在pH≤5.5经受体内切割。
44.如权利要求40或权利要求41-43中任一项从属于权利要求37时所述的药物组合，其中该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子与该结合分子共价结合，优选与该结合分子的氨基酸残基共价结合。
45.如权利要求44所述的药物组合，其中该皂苷或该皂苷衍生物通过如权利要求41-43中任一项所述的可切割接头与该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子共价结合。
46.如权利要求44或45所述的药物组合，其中该皂苷或该皂苷衍生物通过亚胺键、腙键、酰肼键、肟键、1,3-二氧戊环键、二硫键、硫醚键、酰胺键、肽键或酯键中的任何一个或多个，优选通过接头与该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子共价结合。
47.如权利要求44-46中任一项所述的药物组合，其中该皂苷或该皂苷衍生物包含在位置C23含有醛官能团的苷元核心结构，并且该皂苷任选地在该皂苷的苷元核心结构的C3β-OH基团处的第一糖链中包含葡糖醛酸官能团，该醛官能团参与与该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子的共价键合，和/或，如果存在的话，该葡糖醛酸官能团参与与该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子的共价键合，该皂苷或该皂苷衍生物的键合通过直接共价键或通过接头。
48.如权利要求47所述的药物组合，其中该皂苷或该皂苷衍生物的苷元核心结构的位置C23的醛官能团与接头EMCH共价结合，该EMCH通过硫醚键共价结合到该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子中的巯基基团，例如半胱氨酸的巯基基团。
49.如权利要求47或48所述的药物组合，其中在该皂苷或该皂苷衍生物的苷元核心结构的C3β-OH基团处的第一糖链中的葡糖醛酸官能团与接头HATU共价结合，该HATU通过酰胺键共价结合到该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子中的胺基团，例如蛋白质的赖氨酸或N-末端的胺基团。
50.如权利要求44-49中任一项所述的药物组合，其中该共价皂苷缀合物的聚合分子或寡聚分子结合到该结合分子，优选结合到该结合分子的氨基酸残基，涉及该共价皂苷缀合物的聚合分子或寡聚分子上的点击化学基团，该点击化学基团优选选自四嗪、叠氮化物、烯烃或炔烃或这些基团的环状衍生物，更优选该点击化学基团是叠氮化物。
51.如权利要求44-50中任一项所述的药物组合，其中该共价皂苷缀合物的聚合分子或寡聚分子包含选自以下的聚合结构和/或寡聚结构：线性聚合物、支化聚合物和/或环状聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、树状突、树状突化聚合物、树状突化寡聚物、DNA、多肽、聚赖氨酸、聚乙二醇、寡聚乙二醇(OEG)，例如OEG3、OEG4和OEG5，或这些聚合结构和/或寡聚结构的组装，该组装优选通过共价交联构建，优选该共价皂苷缀合物的聚合分子或寡聚分子是树状突，例如聚酰胺基胺(PAMAM)树枝状聚合物。
52.如权利要求1-51中任一项所述的药物组合，其用作药物。
53.如权利要求1到51中任一项所述的药物组合，其用于治疗或预防癌症、自身免疫疾病例如类风湿性关节炎、酶缺乏、基因缺陷、与基因缺陷相关的疾病、淀粉样变性病、与酶缺乏相关的疾病、感染例如病毒感染、高胆固醇血症、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、α-1抗胰蛋白酶相关的肝病、急性肝卟啉病、甲状腺素转运蛋白介导的淀粉样变性病。
54.用于如权利要求52或53所述使用的药物组合，其中该皂苷是SO1861或QS-21，或者其中该皂苷衍生物是SO1861衍生物或QS-21衍生物，优选如权利要求26或27所述的皂苷衍生物。
55.用于如权利要求53或54所述使用的药物组合，其中：
-所述用途用于治疗或预防人受试者的癌症；和/或
-所述用途是在有需要的患者中治疗或预防癌症，其中该第一和该第二细胞表面分子是相同或不同的肿瘤细胞表面分子，优选一个或多个肿瘤细胞特异性表面分子，并且其中该sdAb和该第二缀合物的结合分子结合这些肿瘤细胞表面分子，优选肿瘤细胞特异性表面分子；和/或
-将该药物组合，优选治疗有效量的该药物组合，施用给有需要的患者，优选人患者。
56.一种用于将如权利要求1-51中任一项所述的第一缀合物从细胞的外部转移至所述细胞内，优选转移至所述细胞的胞质溶胶的体外或离体方法，该方法包括以下步骤：
a)提供细胞，该细胞在其表面表达如权利要求1-51中任一项所述的第一细胞表面分子，并任选地在其表面表达如权利要求1-51中任一项所述的第二细胞表面分子，所述细胞优选选自肝细胞、异常细胞如病毒感染的细胞、自身免疫细胞和肿瘤细胞；
b)提供如权利要求1-51中任一项所述的第一缀合物，用于转移到步骤a)中提供的细胞中；
c)提供如权利要求1-51中任一项所述的皂苷或皂苷衍生物，或者，当步骤a)中提供的细胞在其表面表达如权利要求1-51中任一项所述的第二细胞表面分子时，提供如权利要求1-51中任一项所述的第二缀合物；
d)将步骤a)的细胞体外或离体与步骤b)的第一缀合物以及步骤c)的皂苷、皂苷衍生物和缀合物中的任何一个或多个接触，
由此实现该第一缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内，优选转移到所述细胞的胞质溶胶中。
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