CN116249553A - 抗体-药物缀合物和抗体-皂苷缀合物的组合 - Google Patents

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    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
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Abstract

本发明涉及一种治疗组合，其包含：(a)包含缀合物的第一药物组合物，该缀合物包含用于与细胞表面分子的第一结合位点结合的第一结合分子，并且该缀合物包含与所述第一结合分子结合的皂苷，其中该皂苷是三萜糖苷；和(b)包含缀合物的第二药物组合物，该缀合物包含不同于该第一结合分子的第二结合分子，该第二结合分子包含不同于该第一结合区域的第二结合区域，该第二结合区域用于结合不同于所述细胞表面分子的第一结合位点的所述细胞表面分子的第二结合位点，并且该缀合物包含与所述第二结合分子共价结合的效应分子。本发明还涉及包含所述两个缀合物的药物组合物。此外，本发明涉及本发明的药物组合或药物组合物用作药物。此外，本发明涉及本发明的药物组合或药物组合物，用于治疗或预防癌症、自身免疫疾病、与蛋白质(过)表达相关的疾病、与异常细胞如肿瘤细胞或患病肝细胞相关的疾病、与突变基因相关的疾病、与基因缺陷相关的疾病、与突变蛋白相关的疾病、与(功能性)蛋白质不存在相关的疾病、与(功能性)蛋白质缺乏相关的疾病。

Description

抗体-药物缀合物和抗体-皂苷缀合物的组合
技术领域
本发明涉及一种治疗组合，其包含：(a)包含缀合物的第一药物组合物，该缀合物包含第一结合分子，该第一结合分子包含用于结合细胞表面分子的第一结合位点的第一结合区，并且该缀合物包含共价结合至所述第一结合分子的至少一个皂苷；和(b)包含缀合物的第二药物组合物，该缀合物包含不同于该第一结合分子的第二结合分子，该第二结合分子包含不同于该第一结合区的第二结合区，该第二结合区用于结合不同于所述细胞表面分子的第一结合位点的所述细胞表面分子的第二结合位点，并且该缀合物包含与所述第二结合分子共价结合的效应分子。本发明还涉及包含所述两个缀合物的药物组合物。此外，本发明涉及本发明的药物组合或药物组合物用作药物。此外，本发明涉及本发明的药物组合或药物组合物，用于治疗或预防癌症、自身免疫疾病、与蛋白质(过)表达相关的疾病、与异常细胞如肿瘤细胞或患病肝细胞相关的疾病、与突变基因相关的疾病、与基因缺陷相关的疾病、与突变蛋白相关的疾病、与(功能性)蛋白质不存在相关的疾病、与(功能性)蛋白质缺乏相关的疾病。
背景技术
具有治疗生物活性的分子在理论上在许多情况下适合作为有效的治疗药物应用，用于治疗有需要的人类患者的疾病例如癌症。典型的实例是小分子生物活性部分。然而，即使不是全部，也有许多目前在临床中使用的潜在药物样分子和疗法至少存在众多缺点和缺陷中的一个。当施用给人体时，除了针对待治疗疾病或健康问题的潜在方面的生物活性之外，治疗活性分子还可以发挥脱靶效应。这种脱靶效应是不希望出现的，并且存在诱发所施用分子的危及健康副作用甚至危及生命的副作用的风险。正是此类不良事件的发生导致许多药物样化合物和治疗性部分未能通过III期临床试验甚至IV期临床试验(上市后跟踪)。因此，强烈希望提供药物分子，例如小分子治疗剂，其中药物分子的治疗效果应该例如(1)对引起疾病的生物因子或生物过程高度特异，(2)足够安全，(3)足够有效，(4)充分针对患病细胞，对非患病细胞几乎没有或没有脱靶活性，(5)具有足够及时的作用模式(例如，所施用的药物分子应当在一定的时间范围内到达人患者中的靶向位点，并且应当在靶向位点保持一定的时间范围)，和/或(6)在患者体内具有足够长的持续治疗活性，等等。不幸的是，迄今为止，尽管已经进行了长期深入的研究，并且尽管在个别解决遇到的困难和缺点的几个领域中取得了令人印象深刻的进展，但是对于患者来说，仍然不能获得具有上述许多甚至所有有益特征的“理想”疗法。
化疗是癌症治疗最重要的治疗选择之一。然而，它通常与低的治疗窗有关，因为它相比于健康组织中的分裂细胞对癌细胞没有特异性。单克隆抗体的发明提供了利用其特异性结合特性作为将细胞毒剂靶向递送至癌细胞的机制同时不伤害正常细胞的可能性。这可以通过细胞毒性效应子(也称为载荷或弹头)与抗体的化学缀合来实现，以产生抗体-药物缀合物(ADC)。通常，使用非常有效的载荷，例如厄塔毒素(emtansine)(DM1)，其未缀合形式的治疗指数(毒性剂量与有效剂量的比率)有限。DM1与曲妥珠单抗(曲妥珠单抗-厄塔毒素(ado-trastuzumab emtansine))(也称为Kadcycla)的缀合可将猴中DM1的耐受剂量提高至少两倍。在过去的几十年里，人们为开发治疗性ADC付出了巨大的努力和投资。然而，尽管临床前数据很有希望，但将ADC带入临床仍然具有挑战性。第一个获批用于临床的ADC是2000年用于复发性急性髓性白血病(AML)的吉妥珠单抗-奥加米星(gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg，靶向CD33，辉瑞公司(Pfizer)/惠氏公司(Wyeth))。然而，Mylotarg应联邦药物管理局(FDA)的要求退出市场，原因是存在诸多问题，包括其安全性。接受Mylotarg治疗的患者比接受常规化疗的患者更容易死亡。Mylotarg于2017年在较低的推荐剂量、与化疗组合或单独使用的不同时间表以及新的患者群体情况下再次进入市场。迄今为止，只有五种ADC被批准用于临床，同时大约有五十五种ADC的临床开发已经停止。然而，人们的兴趣仍然很高，目前大约有八十种ADC仍在近六百项临床试验中进行临床开发。
尽管有可能使用患者通常不能耐受的毒性载荷，但低治疗指数(毒性剂量比有效剂量的比率)是许多ADC在临床开发中中止的主要问题，这可能由几种机制引起，如对正常细胞的脱靶毒性、对细胞毒性剂的抗性发展和循环中药物的过早释放。FDA对ADC进行的系统审查发现，大多数ADC的毒性特征可以根据使用的载荷进行分类，而不是根据使用的抗体进行分类，这表明毒性主要是由载荷的过早释放决定的。在大约五十五种中止的ADC中，估计至少有二十三种是由于治疗指数不佳。例如，特斯瑞曲妥珠单抗(trastuzumabtesirine)缀合物(ADCT-502，HER-2靶向，ADC疗法)的开发最近由于治疗指数窄而中止，这可能是由于表达相当高水平HER-2的肺组织中的中靶、脱组织效应。此外，由于缺少主要终点，3期试验中的几个ADC已经中止。例如，在新诊断的胶质母细胞瘤患者中测试的迪妥昔珠单抗-玛汀(depatuxizumab mafodotin)缀合物(ABT-414，EGFR靶向，艾伯维公司(AbbVie))和在铂耐药卵巢癌患者中测试的米妥昔单抗-索星(mirvetuximab soravtansine)缀合物(IMGN853，叶酸受体α(FRα)靶向，免疫原公司(ImmunoGen))的3期试验最近被停止，显示无存活益处。需要注意的是，一些ADC的临床使用剂量可能不足以发挥其全部抗癌活性。例如，曲妥珠单抗-厄塔毒素在人中的MTD为3.6mg/kg。在乳腺癌的临床前模型中，曲妥珠单抗-厄塔毒素在3mg/kg或更高的剂量水平下诱导肿瘤消退，但在15mg/kg时观察到更有效的功效。这表明在临床施用剂量下，曲妥珠单抗-厄塔毒素可能无法发挥其最大的潜在抗肿瘤作用。
ADC主要由抗体、细胞毒性部分(如载荷)和接头构成。针对ADC的每个组分，在新ADC的设计和开发中已经提出并实施了几种新策略以克服现有问题。例如，通过鉴定和验证抗体组分的足够抗原靶标，通过选择在肿瘤中具有高表达水平而在正常组织中表达很少或没有表达的抗原，存在于细胞表面上可被循环的ADC接近的抗原，以及允许ADC在结合后内化进入细胞的抗原；和替代活动机制；设计和优化接头，以提高ADC的溶解度和药物-比-抗体比率(DAR)，并克服由可将化疗药物转运出细胞的蛋白质引起的抗性；通过包含更多载荷来提高DAR比率，选择和优化抗体以提高抗体同质性和可开发性。除了ADC的技术发展，新的临床和转化策略也正在部署以最大化治疗指数，例如，通过分次给药改变给药方案；进行生物分布研究；包括生物标志物以优化患者选择，及早捕获反应信号并监测反应的持续时间和深度，并为联合研究提供信息。
具有临床潜力的ADC的实例是那些ADC，例如布仑妥昔单抗-维多汀(brentuximabvedotin)、艾诺妥珠单抗-奥加米星(inotuzumab ozogamicin)、莫塞妥莫单抗-帕舒托(moxetumomab pasudotox)、和珀拉妥珠单抗-维多汀(polatuzumab vedotin)，它们被评估为淋巴恶性肿瘤和多发性骨髓瘤的治疗选择。结合(恶性)B细胞上的CD79b的珀拉妥珠单抗-维多汀和结合CD22的匹那妥珠单抗-维多汀(pinatuzumab vedotin)在临床试验中进行了测试，其中每种ADC均与共同施用的利妥昔单抗(一种结合CD20且不具有载荷的单克隆抗体)组合[B.Yu和D.Liu,Antibody-drug conjugates in clinical trials for lymphoidmalignancies and multiple myeloma[淋巴恶性肿瘤和多发性骨髓瘤临床试验中的抗体-药物缀合物]；Journal of Hematology&Oncology[血液学与肿瘤学杂志](2019)12:94]。诸如这些实例的单克隆抗体的组合是进一步的方法，并试图达到组合许多甚至所有上述ADC所期望特性的“灵丹妙药”。
同时，在过去的几十年中，基于核酸的疗法正在开发中。治疗性核酸可基于脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、反义寡核苷酸(ASO、AON)和短干扰RNA(siRNA)、微小RNA以及DNA和RNA适体，用于方法例如基因疗法，RNA干扰(RNAi)。它们中的许多通过抑制DNA或RNA表达来共享相同的基本作用基础，从而防止与疾病相关的异常蛋白质的表达。基因疗法领域正在进行的临床试验数量最多，全球有近2600项正在进行或已完成的临床试验，但只有约4％进入3期。随后是ASO的临床试验。与ADC类似，尽管正在探索大量技术，但治疗性核酸在临床开发过程中存在两个主要问题：递送至细胞和脱靶效应。例如，ASO，例如肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯吗啉寡聚物(PMO)、锁核酸(LNA)和桥接核酸(BNA)，正在被研究作为一种有吸引力的策略来抑制特异性靶基因，尤其是那些难以用小分子抑制剂或中和抗体靶向的基因。目前，正在研究不同ASO在许多神经退行性疾病(例如亨廷顿病、帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症)以及几个癌症阶段中的功效。ASO作为潜在治疗剂的应用需要安全有效的方法将其递送至靶细胞和组织的细胞质和/或细胞核。尽管ASO的临床相关性已得到证实，但体外和体内低效的细胞摄取限制了ASO的功效，并成为治疗发展的障碍。细胞摄取可能小于剂量的2％，导致活性部位的ASO浓度过低，无法获得有效和持续的结局。因此，这需要增加施用剂量，从而诱导脱靶效应。最常见的副作用是补体级联的激活、凝血级联的抑制和Toll样受体介导的免疫系统刺激。
化疗药物最常见的是小分子，然而，它们的功效受到严重的脱靶副作用毒性、以及它们溶解性差、清除速度快和肿瘤暴露有限等因素的阻碍。支架-小分子药物缀合物，如聚合物-药物缀合物(PDC)是具有药理活性的大分子结构，其包含与载剂支架(例如聚乙二醇(PEG))结合的小分子药物的一个或多个分子。
这种缀合原理引起了很多关注，并且已经研究了几十年。大多数处于临床前或临床开发阶段的小分子药物缀合物用于肿瘤适应症。然而，截至目前只有一种与癌症无关的药物(Movantik，阿片类拮抗剂纳洛酮的PEG低聚物缀合物，阿斯利康公司)于2014年获批用于慢性疼痛患者中阿片类引起的便秘，这是一种非肿瘤药物适应症。迄今为止，将药物-支架缀合物的应用转化为人类受试者的治疗几乎没有取得临床成功。例如，PK1(N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物多柔比星；由法玛西亚公司(Pharmacia)、辉瑞公司开发)在鼠模型中显示出对实体瘤和白血病的强大抗癌活性，并且正在针对肿瘤适应症进行临床研究。尽管它在人中证明了非特异性毒性的显著降低和药代动力学的改善，但在患者中抗癌功效的改善却微乎其微，因此PK1的进一步开发停止了。
支架-小分子药物缀合物的失败至少部分归因于其在肿瘤部位的积聚不良。例如，虽然在鼠模型中，PK1在肿瘤中的积累比在健康组织(肝、肾、肺、脾和心脏)中高45-250倍，但在临床试验中，仅在一小部分患者中观察到肿瘤中的积累。
上述问题的潜在解决方案是应用纳米颗粒系统进行药物递送，例如脂质体。脂质体是由一个或多个磷脂双层组成的球形囊泡，当磷脂分散在水中时会自发形成球形囊泡。磷脂的两亲特性使其具有自组装、乳化和润湿特性，并且这些特性可用于新药和新药递送系统的设计。与直接施用药物相比，脂质体递送系统中的药物封装可能具有多种优势，例如改善和控制药代动力学和药效学、组织靶向特性、降低毒性和增强药物活性。这种成功的实例是小分子化疗药物多柔比星的脂质体包封形式(Doxil：多柔比星的聚乙二醇化脂质体包封形式；Myocet：非聚乙二醇化脂质体多柔比星)，其已被批准用于临床。
因此，仍然需要找到一种解决方案，以允许药物疗法(例如抗肿瘤疗法)在期望时适用于非全身性使用，其中药物具有例如可接受的安全性谱、很少的脱靶活性、足够的功效，从患者体内清除率足够低，治疗窗足够宽等。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种治疗组合，其包含：
(a)包含缀合物的第一药物组合物，该缀合物包含第一结合分子，该第一结合分子包含用于结合细胞表面分子的第一结合位点的第一结合区，并且该缀合物包含共价结合至所述第一结合分子的至少一个皂苷，其中该皂苷是单糖链三萜糖苷或双糖链三萜糖苷；以及
(b)包含缀合物的第二药物组合物，该缀合物包含不同于该第一结合分子的第二结合分子，该第二结合分子包含不同于该第一结合区的第二结合区，该第二结合区用于结合不同于所述细胞表面分子的第一结合位点的所述细胞表面分子的第二结合位点，并且该缀合物包含与所述第二结合分子共价结合的效应分子，
该第一药物组合物和该第二药物组合物任选地进一步包含药学上可接受的赋形剂，并且任选地进一步包含药学上可接受的稀释剂。
本发明的第二方面涉及一种药物组合物，其包含：
-缀合物，该缀合物包含第一结合分子，该第一结合分子包含用于结合细胞表面分子的第一结合位点的第一结合区，并且该缀合物包含共价结合至所述第一结合分子的至少一个皂苷，其中该皂苷是单糖链类型或双糖链类型的三萜皂苷；以及
-缀合物，该缀合物包含不同于所述第一结合分子的第二结合分子，该第二结合分子包含不同于所述第一结合区的第二结合区，该第二结合区用于结合不同于所述细胞表面分子的所述第一结合位点的所述细胞表面分子的第二结合位点，并且该缀合物包含与所述第二结合分子共价结合的效应分子，
并且任选地进一步包含药学上可接受的赋形剂，并且任选地进一步包含药学上可接受的稀释剂。
本发明的第三方面涉及本发明的药物组合或根据本发明的药物组合物，其用作药物。
本发明的第四方面涉及本发明的药物组合或本发明的药物组合物，用于治疗或预防癌症、自身免疫疾病、与蛋白质(过)表达相关的疾病、与异常细胞如肿瘤细胞或患病肝细胞相关的疾病、与突变基因相关的疾病、与基因缺陷相关的疾病、与突变蛋白相关的疾病、与(功能性)蛋白质不存在相关的疾病、与(功能性)蛋白质缺乏相关的疾病。
本发明的第五方面涉及成套试剂盒，其包含本发明的药物组合或包含本发明的药物组合物，以及任选的所述药物组合或所述药物组合物的使用说明书。
定义
术语“结合区”具有其常规的科学含义并且在此指分子的一部分或分子的一个或多个化学基团或蛋白质或肽的(线性或非线性)氨基酸序列等，其具有结合结合配偶体分子的能力。典型的结合区域是免疫球蛋白的CDR环。蛋白质的典型结合区域是所述蛋白质包含的氨基酸残基的一个或多个环，并且能够特异性结合结合配偶体分子如蛋白质、细胞表面受体等上的结合位点。
术语“结合位点”具有其常规的科学含义并且在此指大分子如蛋白质上的区域，例如细胞表面分子如细胞表面受体，其特异性结合另一分子如蛋白质，例如配体。
术语“细胞表面分子”具有其常规的科学含义并且在此指存在并暴露于细胞(如血细胞或器官细胞，如哺乳动物细胞，如人细胞)外表面的分子。通常，细胞表面分子是蛋白质，如受体，或脂质分子或多糖。
术语“皂苷”具有其常规的科学含义并且此处指的是一组两亲性糖苷，其包含一个或多个亲水性糖基部分与亲脂性苷元核心(其是皂苷配基)组合。皂苷可以是天然存在的或合成的(即非天然存在的)。术语“皂苷”包括天然存在的皂苷、天然存在的皂苷的衍生物以及通过化学和/或生物技术合成途径从头合成的皂苷。皂苷具有三萜骨架，它是五环C30萜骨架，也称为皂苷配基或苷元。在本发明的上下文中，皂苷不被认为是效应分子，也不被认为是根据本发明的缀合物中的效应子部分。因此，在包含皂苷和效应子部分的缀合物中，效应子部分是与缀合的皂苷不同的分子。
术语“苷元核心结构”，也称为“皂苷配基”或“苷元核心”或“苷元”，具有其常规的科学含义并且此处指的是皂苷的苷元核心，没有与其结合的一个或两个碳水化合物触角或糖链(聚糖)。例如，皂皮酸是SO1861、QS-7、QS21的苷元核心结构。
术语“糖链”具有其常规的科学含义并且此处指的是聚糖、碳水化合物触角、单个糖部分(单糖)或包含多个糖部分(寡糖、多糖)的链中的任何。糖链可仅由糖部分组成，或还可包含其他部分，例如4E-甲氧基肉桂酸、4Z-甲氧基肉桂酸和5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸中的任一种，例如存在于QS-21中。
术语“单糖链皂苷”具有其常规的科学含义并且在此指的是含有与苷元核心结合的单糖链的三萜皂苷，其中糖链由一个或多个糖部分组成。
术语“双糖链皂苷”具有其常规的科学含义并且在此指的是含有与苷元核心结合的两个糖链的三萜皂苷，其中两个糖链中的每个由一个或多个糖部分组成。
术语“三萜皂苷”具有其常规的科学含义并且在此指的是具有三萜型苷元核心结构的皂苷。三萜皂苷不同于基于类固醇糖苷(例如皂草精醇)的皂苷，因为这种包含类固醇糖苷的皂苷具有类固醇核心结构，并且三萜皂苷不同于基于生物碱糖苷(例如番茄苷配基)的皂苷，因为这种包含生物碱糖苷的皂苷具有生物碱核心结构。
术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”具有其常规的科学含义并且在此指抗体(例如IgG、Fab、scFv、免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、一个或多个VH结构域等)以及当与受试者如人患者的细胞接触时能够发挥治疗效果的任何分子(如活性药物成分、毒素、寡核苷酸、酶、小分子药物化合物等)的任何缀合物。
术语“抗体-寡核苷酸缀合物”或“AOC”具有其常规的科学含义并且在此指抗体(例如IgG、Fab、scFv、免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、一个或多个VH结构域等)和当与受试者如人患者的细胞接触时能发挥治疗作用的任何寡核苷酸分子(如选自天然或合成的核酸串的寡核苷酸，包括DNA、经修饰的DNA、RNA、经修饰的RNA、合成的核酸，呈现为单链分子或双链分子，如BNA、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)、短或小干扰RNA(siRNA；沉默RNA)、反义DNA、反义RNA等)的任何缀合物。
术语“缀合物”具有其常规的科学含义并且在此是指通过化学键共价结合到至少第二分子上的至少第一分子，由此形成包含第一分子和第二分子或由其组成的共价偶联组装体。典型的缀合物是ADC、AOC和SO1861-EMCH(与皂苷的苷元核心结构的醛基团连接的EMCH)。
简而言之，术语“单结构域抗体”或“sdAb”具有其常规的科学含义并且在此指由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。在本发明的缀合物中，可以存在多于一个sdAb，这些sdAb可以是相同的(多价的且单特异性的)或者可以是不同的(多价的和/或例如多表位、双表位、多特异性的、双特异性的)。此外，例如，多于两个sdAb例如是单特异性且多价sdAb以及至少一个结合不同表位的另外的sdAb的组合(例如多特异性或双表位)。
术语“效应分子”或“效应子部分”当指作为例如共价缀合物的一部分的效应分子时，具有其常规的科学含义，在此指分子，该分子可选择性结合例如以下任何一个或多个靶分子：蛋白质，肽，碳水化合物，糖类如聚糖，(磷)脂，核酸如DNA、RNA，酶，并调节这样一个或多个靶分子的生物活性。在本发明的缀合物中，效应子部分例如在胞质溶胶、细胞核中发挥其作用，在胞内体和/或溶酶体中被胞内递送，和/或在退出或逃逸胞内体-溶酶体途径后具有活性。效应分子是例如选自小分子如药物分子、毒素如蛋白毒素、寡核苷酸如BNA、异种核酸或siRNA、酶、肽、蛋白质或其活性片段或活性结构域的任何一个或多个或其任何组合的小分子。因此，例如，效应分子或效应子部分是例如选自小分子如药物分子、毒素如蛋白毒素、寡核苷酸如BNA、异种核酸或siRNA、酶、肽、蛋白质中的任何一个或多个或其任何组合的效应分子或部分，其可以选择性地结合以下靶分子中的任何一个或多个：蛋白质，肽，碳水化合物，糖类如聚糖，(磷)脂，核酸如DNA、RNA，酶，并且其在与靶分子结合后调节这样一个或多个靶分子的生物活性。例如，效应子部分是毒素或其活性毒性片段或其活性毒性衍生物或活性毒性结构域。通常，效应分子可以在细胞内发挥生物学效应，例如哺乳动物细胞，例如人细胞，例如在所述细胞的胞质溶胶中。因此，本发明的效应分子或部分是通过与细胞内效应分子靶标相互作用影响细胞代谢的任何物质，其中该效应分子靶标是细胞内的任何分子或结构，不包括内吞和再循环途径的隔室和囊泡的内腔，但包括这些隔室和囊泡的膜。因此，细胞内的所述结构包括细胞核、线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体、其他运输小泡、质膜的内部和胞质溶胶。因此，典型的效应分子是药物分子、酶、质粒DNA、毒素如抗体-药物缀合物(ADC)包含的毒素、寡核苷酸如siRNA、BNA、抗体-寡核苷酸缀合物(AOC)包含的核酸。例如，效应分子是可以充当配体的分子，该配体可以增加或减少(细胞内)酶活性、基因表达或细胞信号传导。在本发明的上下文中，当效应分子是缀合物的一部分时，效应分子或效应子部分不是皂苷，也不是细胞表面分子结合分子，例如抗体如sdAb。通常，缀合物包含的效应子部分在胞质溶胶和/或细胞核中发挥其治疗作用(例如毒性、酶促、抑制、基因沉默、等)。典型地，效应子部分在胞内体和/或溶酶体中被胞内递送，并且典型地，效应子部分在退出或逃逸胞内体-溶酶体途径后是有活性的。
术语“肿瘤细胞特异性表面分子”和术语“肿瘤细胞特异性受体”具有它们常规的科学含义并且在此指在肿瘤细胞表面而不是在健康非癌细胞表面表达和暴露的分子或受体，或者在健康非癌细胞表面的表达程度低于在肿瘤细胞表面的表达水平(分子/受体的数量)。
术语“载荷”具有其常规的科学含义并且在此指生物活性分子，例如细胞毒性(抗癌)药物分子。
术语“寡核苷酸”具有其常规的科学含义并且在此指一串两个或更多个核苷酸，即寡核苷酸是由核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸构成的短寡聚物。实例是RNA和DNA，以及任何经修饰的RNA或DNA，例如包含核苷酸类似物(例如桥接核酸(BNA)，也称为锁核酸(LNA)或2’-O,4’-C-氨基亚乙基或2’-O,4’-C-氨基亚甲基桥接核酸(BNANC))的一串核酸，其中核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
术语“桥接核酸”，或简称“BNA”，或简称“锁核酸”或“LNA”，或2’-O,4’-C-氨基亚乙基或2’-O,4’-C-氨基亚甲基桥接核酸(BNANC)，具有其常规的科学含义并且此处指经修饰的RNA核苷酸。BNA也称为“受限RNA分子”或“不可接近的RNA分子”。BNA单体可以包含五元、六元或甚至七元桥接结构，其具有“固定”C3'-内糖折叠。该桥在核糖的2',4'-位置合成地并入，以提供2',4'-BNA单体。可以使用本领域已知的标准亚磷酰胺化学将BNA单体并入寡核苷酸聚合结构中。BNA是结构刚性的寡核苷酸，具有增加的结合亲和力和稳定性。
术语“朊”具有其常规的科学含义并且在此指的是蛋白样分子，意思是该分子在某种程度上具有蛋白的物理化学性质特征，具有蛋白，与蛋白相关，包含蛋白，属于蛋白，由蛋白组成，类似蛋白，或者是蛋白。在例如“朊分子”中使用的术语“朊”是指存在至少一部分类似于或者是蛋白的分子，其中“蛋白”应理解为包括至少两个残基长的氨基酸残基链，因此包括肽、多肽和蛋白以及蛋白或蛋白结构域的组合。在朊分子中，至少两个氨基酸残基例如通过(一个或多个)酰胺键，例如(一个或多个)肽键连接。在朊分子中，氨基酸残基是天然氨基酸残基和/或人工氨基酸残基，例如经修饰的天然氨基酸残基。在优选的实施例中，朊分子是包含至少两个氨基酸残基，优选地介于两个和约2,000个之间的氨基酸残基的分子。在一个实施例中，朊分子是包含2至20个(通常对于肽而言)氨基酸的分子。在一个实施例中，朊分子是包含21至1,000个氨基酸的分子(对于多肽、蛋白、蛋白结构域，例如抗体、Fab、scFv、受体例如EGF的配体而言是典型的)。优选地，氨基酸残基(通常)通过(一个或多个)肽键连接。根据本发明，所述氨基酸残基是或包含(经修饰的)(非)天然氨基酸残基。
术语“结合分子”具有其常规的科学含义并且在此指能够特异性结合另一分子(例如细胞表面分子，例如细胞表面受体)的分子。典型的结合分子是肽、蛋白质、非蛋白质分子、细胞表面受体配体、蛋白质配体，它们可以结合到例如蛋白质、脂质、(多)糖，例如细胞表面受体或细胞表面分子。这里的“特异性结合”是指比非特异性背景结合具有更高亲和力的特异性和选择性结合。
糖链名称上下文中的术语“Api/Xyl-”或“Api-或Xyl-”具有其常规的科学含义并且此处是指包含芹菜糖(Api)部分或包含木糖(Xyl)部分的糖链。
术语“部分”具有其常规的科学含义并且在此是指与另一分子、接头、分子组装体等结合、连接、缀合并由此形成更大分子、缀合物、分子组装体的一部分的分子。通常，一个部分是与另一分子共价结合的分子，该共价结合涉及一个或多个最初存在于效应分子上的化学基团。例如，皂草毒蛋白是一种典型的效应分子。作为抗体-药物缀合物的一部分，皂草毒蛋白是ADC中典型的效应子部分。作为抗体-寡核苷酸缀合物的一部分，BNA或siRNA是AOC中典型的效应子部分。
说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等用于区分例如相似的要素、组合物、组合物中的成分或单独的方法步骤，而不一定用于描述先后顺序或时间顺序。这些术语在适当的情况下是可互换的，并且本发明的实施例可以以本文描述或说明的顺序以外的顺序操作，除非另有说明。
除非另有说明，在此描述的本发明的实施例可以组合和协作操作。
此外，尽管各种实施例被称为“优选的”或“例如”或“举例”或“特别地”等，但是这些实施例应被解释为可以实施本发明的示例性方式，而不是限制本发明的范围。
权利要求中使用的术语“包含”不应被解释为限于例如要素或方法步骤或其后列出的组合物的成分；它不排除某一组合物中的其他要素或方法步骤或成分。它需要被解释为指定所提及的所陈述特征、整数、(方法)步骤或组分的存在，但不排除一个或多个其他特征、整体、步骤或组分或其组合的存在或添加。因此，表述“包括步骤A和B的方法”的范围不应限于仅由步骤A和B组成的方法，而是对于本发明而言，该方法的唯一列举的步骤是A和B，并且权利要求应进一步解释为包括那些方法步骤的等同物。因此，表述“包含组分A和B的组合物”的范围不应限于仅由组分A和B组成的组合物，而是对于本发明而言，该组合物的唯一列举的组分是A和B，并且权利要求应进一步解释为包括那些组分的等同物。
另外，通过不定冠词“一个/一种”(“a”或“an”)指代要素或组分并不排除存在多于一个/一种要素或组分的可能性，除非上下文明确要求存在一个/一种并且仅一个/一种要素或组分。因此，不定冠词“一个/一种”(“a”或“an”)通常意指“至少一个/一种”。
附图说明
图1(FIG.1)是显示根据本发明的非竞争性1靶标2组分系统(1T2C，非竞争性)(其是mAb1-SO1861和mAb2-蛋白毒素的组合治疗)的卡通图，其中mAb1和mAb2都靶向并结合相同的受体，但识别受体上的不同表位，从而排除了mAb受体结合竞争。
图2(FIG.2)显示了在游离珀妥珠单抗和游离曲妥珠单抗，或与SO1861或皂草毒蛋白缀合的抗体，及其组合的影响下，对HER2表达细胞(SK-BR-3，HER2++)(A)和非表达细胞(MDA-MB-468，HER2-)(B)的细胞杀伤的测定结果，如图例所示(图例对于图2A和2B相同并且显示在图2B旁边)。
图3(FIG.3)显示了当在2.5nM和75nM珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4的固定浓度滴定曲妥珠单抗-皂草毒蛋白时，靶向蛋白毒素介导对HER2表达细胞(SK-BR-3，HER2++)(A)和HER2非表达细胞(MDA-MB-468，HER2-)(B)的细胞杀伤的测定结果(图例对于图3A和3B相同并且显示在图3B旁边)。
图4(FIG.4)显示了当在50pM珀妥珠单抗-香石竹毒蛋白(珀妥珠单抗与蛋白毒素香石竹毒蛋白缀合，DAR4)的固定浓度下滴定珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4或曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4时，靶向蛋白毒素介导对HER2表达细胞(SK-BR-3，HER2++)(A)和非表达细胞(MDA-MB-468，HER2-)(B)的细胞杀伤的测定结果(图例对于图4A和4B相同并且显示在图4B旁边)。
图5(FIG.5)显示了当在2.5nM和25nM珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4或曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4的固定浓度滴定珀妥珠单抗-香石竹毒蛋白时，靶向蛋白毒素介导对HER2表达细胞(SK-BR-3，HER2++)和非表达细胞(MDA-MB-468，HER2-)的细胞杀伤的测定结果(图例对于图5A和5B相同并且显示在图5B旁边)。
图6(FIG.6)显示了当在10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白(西妥昔单抗与蛋白毒素皂草毒蛋白缀合，DAR4)或10pM EGF香石竹毒蛋白(重组毒素融合蛋白)的固定浓度下滴定马妥珠单抗-SO1861时，靶向蛋白毒素介导对EGFR表达细胞(A431，EGFR++)(A)和非表达细胞(A2058，EGFR-)(B)的细胞杀伤的测定结果(图例对于图6A和6B相同并且显示在图6B旁边)。与西妥昔单抗和EGF相比，马妥珠单抗在不同的表位识别和结合人EGFR，而西妥昔单抗和EGF竞争结合EGFR受体。
图7(FIG.7)显示了西妥昔单抗-皂草毒蛋白的测定结果，在10nM和75nM马妥珠单抗-SO1861的固定浓度下滴定西妥昔单抗-皂草毒蛋白(图例对于图7A和7B相同并且显示在图7B旁边)。
图8(FIG.8)显示了在10pM CD71-皂草毒蛋白(DAR4)、10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白(DAR4)、10pM马妥珠单抗-香石竹毒蛋白(DAR4)、10pM珀妥珠单抗-皂草毒蛋白(DAR4)、10pM或50pM珀妥珠单抗-皂草毒蛋白(DAR4)和50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白(DAR4)的固定浓度下的SO1861滴定，其中测定了靶向蛋白毒素介导的对A)A431(EGFR++/HER2+/-/CD71+)和B)A2058(EGFR-/HER2+/-/CD71+)的细胞杀伤。
图9(FIG.9)显示了在10pM CD71-皂草毒蛋白(DAR4)、10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白(DAR4)、10pM马妥珠单抗-香石竹毒蛋白(DAR4)、10pM珀妥珠单抗-皂草毒蛋白(DAR4)、10pM或50pM珀妥珠单抗-皂草毒蛋白(DAR4)和50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白(DAR4)的固定浓度下的SO1861滴定，其中测定了靶向蛋白毒素介导的对A)SK-BR-3细胞(HER2++/EGFR+/CD71+)和B)MDA-MB-468细胞(HER2-/EGFR++/CD71+)的细胞杀伤。
具体实施方式
本发明的第一个目的是提供一种当考虑例如毒性、功效、治疗窗和/或有效剂量以及对施用包含ADC或AOC的治疗组合物的患者的安全性时改善的ADC或AOC。本发明的第二个目的是提供一种治疗患有要用ADC或AOC治疗的疾病的(人)患者的改善的方法。
本发明的一个目的是提供治疗组合物或例如两个治疗组合物的治疗组合，治疗组合物包含ADC或AOC，当将治疗组合施用给有需要的(人)患者时，其在比ADC或AOC目前所需剂量更低的剂量下具有改善的治疗效果或足够的效果。
通过提供至少两个治疗组合物的治疗组合或本发明的治疗组合物来实现至少一个上述目的。
本发明将相对于具体实施例来说明，但本发明并不受限于此而只受权利要求限制。
本发明的第一方面涉及一种治疗组合，其包含：
(a)包含缀合物的第一药物组合物，该缀合物包含第一结合分子，该第一结合分子包含用于结合细胞表面分子的第一结合位点的第一结合区，并且该缀合物包含共价结合至所述第一结合分子的至少一个皂苷，其中该皂苷是单糖链三萜糖苷或双糖链三萜糖苷；以及
(b)包含缀合物的第二药物组合物，该缀合物包含不同于该第一结合分子的第二结合分子，该第二结合分子包含不同于该第一结合区的第二结合区，该第二结合区用于结合不同于所述细胞表面分子的第一结合位点的所述细胞表面分子的第二结合位点，并且该缀合物包含与所述第二结合分子共价结合的效应分子，
该第一药物组合物和该第二药物组合物任选地进一步包含药学上可接受的赋形剂，并且任选地进一步包含药学上可接受的稀释剂。
本发明的第二方面涉及一种药物组合物，其包含：
-缀合物，该缀合物包含第一结合分子，该第一结合分子包含用于结合细胞表面分子的第一结合位点的第一结合区，并且该缀合物包含共价结合至所述第一结合分子的至少一个皂苷，其中该皂苷是单糖链类型或双糖链类型的三萜皂苷；以及
-缀合物，该缀合物包含不同于所述第一结合分子的第二结合分子，该第二结合分子包含不同于所述第一结合区的第二结合区，该第二结合区用于结合不同于所述细胞表面分子的所述第一结合位点的所述细胞表面分子的第二结合位点，并且该缀合物包含与所述第二结合分子共价结合的效应分子，
并且任选地进一步包含药学上可接受的赋形剂，并且任选地进一步包含药学上可接受的稀释剂。
在包含皂苷的缀合物中，缀合物包含至少一个与第一结合分子共价结合的皂苷部分。作为缀合物一部分的皂苷被称为“皂苷”或“皂苷部分”，这意味着皂苷共价连接于此处的第一结合分子。
药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的稀释剂在本领域中是众所周知的，并且合适的赋形剂和稀释剂例如在“Remington-The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿——药学的科学与实践]”(第22版，2013,Lippincott,Williams&Wilkins)中列出。
适合缀合的典型皂苷是双糖链型三萜皂苷，如本领域已知的从皂树中分离的双糖链三萜糖苷，或从肥皂草的根提取物中分离和纯化的双糖链三萜糖苷。
发明人确定，用包含皂苷的缀合物中的第一结合分子和包含效应分子的缀合物中的第二结合分子靶向靶细胞的细胞表面分子，提供了分别包含所述第一和第二结合分子的两个缀合物在携带细胞表面分子的细胞内的有效递送，因为第一结合分子和第二结合分子结合到细胞表面分子上的不同结合位点。由于两个缀合物均可基于单一类型细胞表面分子的靶向作用而递送至靶细胞中，因此现在可在细胞内同时向仅暴露单一(足够)特异性细胞表面分子的细胞提供作为包含第一结合分子的缀合物的一部分的皂苷和作为包含第二结合分子的缀合物的一部分的效应分子。由于第一结合分子与细胞表面分子的结合不妨碍第二结合分子与细胞表面分子的结合，作为本发明的一部分，可以将一定剂量的皂苷和效应分子递送到暴露单一类型细胞表面分子的靶细胞内，其中使用用于进入所述细胞的相同细胞表面分子。因为当皂苷和效应分子共同定位在细胞内，例如在内体或溶酶体中时，皂苷加强在细胞内例如肿瘤细胞的例如胞质溶胶中发挥其生物活性的效应分子，所以当考虑效应分子的治疗效果和/或当考虑皂苷的加强效果时，治疗组合和药物组合物提供了改善的治疗窗。发明人确定，当一定剂量的皂苷与细胞接触时，其中皂苷被包含针对细胞的细胞表面分子的结合分子的缀合物所包含，与游离皂苷在所述细胞内的递送相比，皂苷在细胞内的递送效率约高100-1000倍。因此，当考虑效应分子如BNA或(蛋白)毒素的细胞内生物学作用时，包含细胞表面分子的第一结合位点和皂苷的缀合物的有效剂量比游离皂苷的有效剂量低100-1000倍，所述效应分子同时与细胞以及游离皂苷或包含细胞表面分子的第一结合位点的缀合物接触。本发明组合了靶细胞内靶向递送皂苷的益处，当考虑到皂苷的内体逃逸增强活性时，其例如改善了治疗窗，具有用包含皂苷的缀合物和包含效应分子的缀合物同时靶向靶细胞的单个细胞表面受体的可能性，使得例如现在可以用效应分子有效地和/或改善地处理细胞，而这些细胞仅暴露单一类型的(足够)特异性细胞表面分子，这允许效应分子(充分地)特异性递送到(仅)靶细胞中。“靶向递送”在此应理解为通过第一结合分子与靶细胞的细胞表面分子的特异性结合将例如皂苷递送到细胞内，从而导致皂苷(作为缀合物的一部分)的内吞作用和皂苷在内体和/或溶酶体中的递送。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中第一结合分子是第一朊结合分子或第一非朊配体(其包含用于结合细胞表面分子的第一结合位点的第一结合区)，和/或其中第二结合分子是第二朊结合分子或第二非朊配体(其包含用于结合细胞表面分子的第二结合位点的第二结合区)。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中第一结合分子是第一朊结合分子，并且其中皂苷与第一结合分子的氨基酸残基共价结合，优选通过接头共价结合。
通常，对于本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，第一结合位点是所述细胞表面分子如细胞表面受体的第一表位，并且其中第二结合位点是所述相同细胞表面分子的第二表位，其中第二表位不同于第一表位。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中该皂苷是二糖链三萜皂苷。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中细胞表面分子是肿瘤细胞表面分子，优选肿瘤细胞特异性细胞表面分子，例如细胞表面受体。在细胞上存在细胞表面分子的情况下,“特异性”具有其常规的科学含义并且是指该分子存在于细胞上，而相同的分子不存在于其他细胞或细胞类型上，或者以较低的程度(分子的较少拷贝)存在于不同于被称为携带细胞特异性分子的细胞的细胞表面上。肿瘤细胞可能具有真正的肿瘤细胞特异性细胞表面分子，例如受体，或者可能以更高的程度表达细胞表面分子，并且与非肿瘤细胞(例如相同类型的健康细胞)相比可能在其表面上或在带有包含肿瘤细胞的肿瘤的器官中具有特异性细胞表面分子的更多拷贝。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中第一结合分子的第一结合区包含用于结合细胞表面分子的第一结合位点的配体(例如EGF或细胞因子)或由其组成，或其中第一结合分子的第一结合区包含免疫球蛋白或所述免疫球蛋白的包含用于结合细胞表面分子的第一结合位点的第一结合区的至少一个结合片段或结合结构域或由其组成，和/或其中第二结合分子的第二结合区包含用于结合细胞表面分子的第二结合位点的配体(例如EGF或细胞因子)或由其组成，或其中第二结合分子的第二结合区包含免疫球蛋白或所述免疫球蛋白的包含用于结合细胞表面分子的第二结合位点的第二结合区的至少一个结合片段或结合结构域或由其组成，其中免疫球蛋白优选是以下中的任何一种或多种：抗体，例如单克隆抗体，优选人抗体，IgG，包含单结构域抗体或由单结构域抗体组成的分子，至少一个VHH结构域，如骆驼VH，或至少一个VH结构域，如来自人源，可变重链新抗原受体(VNAR)结构域，Fab，scFv，Fv，dAb，F(ab)2，Fcab片段。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中第一结合分子的第一结合区包含以下或由以下组成：单克隆抗体、单结构域抗体、至少一个VHH结构域、至少一个VH结构域、可变重链新抗原受体(VNAR)结构域、Fab、scFv、Fv、dAb、F(ab)2或Fcab片段或，优选单克隆抗体或单结构域抗体，例如至少一个VHH结构域，和/或其中第二结合分子的第二结合区包含以下或由以下组成：单克隆抗体、单结构域抗体、至少一个VHH结构域、至少一个VH结构域、可变重链新抗原受体(VNAR)结构域、Fab、scFv、Fv、dAb、F(ab)2或Fcab片段或，优选单克隆抗体或单结构域抗体，例如至少一个VHH结构域。例如，第一结合区是马妥珠单抗，第二结合区是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的VHH 7D12，或反之亦然，或第一结合区是西妥昔单抗，第二结合区是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的VHH 9G8，或反之亦然。典型地，第一结合区是马妥珠单抗，第二结合区是西妥昔单抗，或者反之亦然。典型地，第一结合区是曲妥珠单抗，第二结合区是珀妥珠单抗，或反之亦然。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中所述免疫球蛋白的包含用于结合细胞表面分子的第一结合位点的第一结合区的至少一个结合片段或结合结构域和/或所述免疫球蛋白的包含用于结合细胞表面分子的第二结合位点的第二结合区的至少一个结合片段或结合结构域是单结构域抗体，优选至少一个VHH结构域。
典型地，对于本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，选择第一结合区和第二结合区以在第一结合位点和第二结合位点同时结合相同的细胞表面分子。也就是说，第一结合区与第一结合位点(第一表位)的结合不会阻碍或排除或阻止或阻断或竞争第二结合区与相同细胞表面分子(例如暴露在细胞表面的细胞受体)的第二结合位点(第二表位)的结合。
优选的是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中选择第一结合区与细胞表面分子的第一结合位点结合，而不竞争第二结合区与相同细胞表面分子的第二结合位点的结合，并且其中选择第二结合区与细胞表面分子的第二结合位点结合，而不竞争第一结合区与相同细胞表面分子的第一结合位点的结合。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中至少一个皂苷是属于在(皂苷的(三萜)苷元核心结构的)的位置C23具有醛官能团的12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷(糖苷)，该皂苷包含在皂苷的(三萜)苷元核心结构的)C3β-OH基团处的第一糖链，该第一糖链任选地包含葡糖醛酸部分，并且该皂苷包含连接至皂苷的((三萜)苷元核心结构的)的C28的第二糖链，并且包含单糖或线性或支化寡糖或由其组成，其中任选地，第二糖链的至少一个糖部分包含至少一个乙酰基基团，例如1、2、3或4个乙酰基基团，并且优选单个乙酰基基团。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中至少一个皂苷是从丝石竹属(Gypsophila)物种、肥皂草属(Saponaria)物种、麦仙翁属(Agrostemma)物种和皂树属(Quillaja)物种如皂树中的任何一种或多种中分离的皂苷。通常，适于缀合的皂苷从皂树的树皮提取物中分离，或者从肥皂草的根提取物中分离。因此，根据本发明，本发明缀合物中的皂苷例如是天然存在的皂苷，尽管在苷元核心结构和(多/单糖)糖结构方面具有相似结构特征的三萜糖苷也可以是合成皂苷。当然，对于缀合物来说，如果合适和可获得的话，也可以暗示化学合成的天然存在的皂苷。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中至少一个皂苷包含选自以下(一个或多个苷元(核心结构))中任何一个或多个的苷元核心结构：
2α-羟基齐墩果酸；
16α-羟基齐墩果酸；
常春藤皂苷元(23-羟基齐墩果酸)；
16α,23-二羟基齐墩果酸；
丝石竹皂苷元；
皂皮酸；
原七叶皂苷元-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-22-乙酸酯；
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21,22-双(2-甲基丁-2-烯酸酯)；
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-16,22-二乙酸酯；
洋地黄皂苷配基；
3,16,28-三羟基齐墩果-12-烯；
丝石竹酸；以及
其衍生物，
优选地，苷元核心结构选自皂皮酸和丝石竹皂苷元或其衍生物，最优选地，苷元核心结构是皂皮酸或其衍生物。发明人发现，包含在三萜结构中含有醛基团的苷元的皂苷特别适合掺入本发明的缀合物中。不希望受任何理论的束缚，当考虑将效应分子从(哺乳动物)细胞的外部递送到所述细胞内，所述细胞的内体中，随后从细胞内体出来并进入所述细胞的胞质溶胶时，皂苷中醛基团的存在可能有助于内体逃逸，增强皂苷的活性。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中至少一个皂苷包含与其苷元核心结构结合的第一糖链，该第一糖链选自：
GlcA-，
Glc-，
Gal-，
Rha-(1→2)-Ara-，
Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-，
Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-，
Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-，
Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-，
Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-，
Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-，
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，和
其任何衍生物，
和/或其中至少一个皂苷任选地包含与其苷元核心结构结合的第二糖链，该第二糖链选自：
Glc-，
Gal-，
Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-，
Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-，
Ara-，
Xyl-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc-其中R1是4E-甲氧基肉桂酸，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc-其中R2是4Z-甲氧基肉桂酸，
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-，
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-二-OAc-Fuc-，
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc-其中R3是4E-甲氧基肉桂酸，
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-，
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-，
(Ara-或Xyl-)(1→3)-(Ara-或Xyl-)(1→4)-(Rha-或Fuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha-或Fuc-)(1→4)]-(Rha-或Fuc-)，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc-其中R4是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc-其中R5是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-，
6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-，
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-，
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-，
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-二-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-，
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-，
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-，
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc-其中R6是5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc-其中R7是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc-其中R8是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc-其中R9是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc-其中R10是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc-其中R11是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc-其中R12是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-，和
其衍生物，
优选地，至少一个皂苷包含这样的第一糖链并包含这样的第二糖链，它们结合到皂苷的苷元核心结构，即如上所列的苷元，优选在苷元的位置C23处具有醛基团的皂皮酸或丝石竹皂苷元。第一聚糖结合到皂苷的苷元的C3原子上，第二聚糖结合到皂苷的苷元的C28原子上。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中至少一个皂苷是以下中的任何一个或多个：皂树树皮皂苷、川续断皂苷B、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、灰毡毛忍冬皂苷A、商陆皂苷A、商陆皂苷元、七叶皂苷盐、AS6.2、NP-005236、AMA-1、AMR、α-常春藤皂苷、NP-012672、NP-017777、NP-017778、NP-017774、NP-018110、NP-017772、NP-018109、NP-017888、NP-017889、NP-018108、SA1641、AE X55、NP-017674、NP-017810、AG1、NP-003881、NP-017676、NP-017677、NP-017706、NP-017705、NP-017773、NP-017775、SA1657、AG2、SO1861、GE1741、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1862、SO1904、QS-7、QS1861、QS-7api、QS1862、QS-17、QS-18、QS-21A-apio、QS-21A-xylo、QS-21B-apio、QS-21B-xylo、β-七叶皂苷、七叶皂苷Ia、油茶籽皂苷I、油茶籽皂苷J、阿萨姆皂苷F、洋地黄皂苷、报春花酸1和AS64R、或基于其的皂苷衍生物、或它们的任何立体异构体和/或其任何组合，优选QS-21、QS-21衍生物、SO1861、SO1861衍生物、SA1641、SA1641衍生物、GE1741和GE1741衍生物中的任何一个或多个，更优选QS-21、QS-21衍生物、SO1861或SO1861衍生物，最优选SO1861或SO1861衍生物。
适于掺入包含皂苷的本发明缀合物中的皂苷通常是表A1所列的皂苷。当皂苷与暴露于效应分子的细胞接触时，这些皂苷显示出一旦被细胞摄取，例如被胞吞作用摄取，就能增强这样的效应分子的内体逃逸；或者这些列出的皂苷的分子结构(高度地)使人想起已确定具有内体逃逸增强活性的皂苷。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中第一缀合物中的(皂苷或)皂苷部分或(皂苷衍生物或)皂苷衍生物部分包含第一糖链并包含第二糖链，其中该第一糖链包含多于一个糖部分并且该第二糖链包含多于一个糖部分，并且其中皂苷的苷元核心结构是皂皮酸或丝石竹皂苷元或是皂皮酸或丝石竹皂苷元的衍生物，其中以下中的一项、两项或三项，优选一项或两项：
i.皂苷的苷元核心结构中的醛基团已被衍生化，
ii.该第一糖链中的葡糖醛酸部分的羧基基团已被衍生化，以及
iii.该第二糖链中的至少一个乙酰氧基(Me(CO)O-)基团已被衍生化。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中第一缀合物中的皂苷部分或皂苷衍生物部分包含：
i.包含醛基团的苷元核心结构，该醛基团已通过以下进行衍生化：
-还原成醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化为腙键，其中该BMPH的马来酰亚胺基团任选通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一烷酸]酰肼(KMUH)反应转化为腙键，其中该KMUH的马来酰亚胺基团任选通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
ii.第一糖链，其包含羧基基团，优选葡糖醛酸部分的羧基基团，该羧基基团已经通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化；
iii.第二糖链，其包含乙酰氧基基团(Me(CO)O-)，该乙酰氧基基团已经通过脱乙酰转化为羟基基团(HO-)而衍生化；或
iv.衍生化i、ii和iii中的两项或三项，优选两项衍生化的任何组合。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中至少一个皂苷是以下中的任何一个或多个：SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、皂树皂苷、Saponinum album、QS-18、Quil-A、Gyp1、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、或其皂苷衍生物、或其立体异构体和/或其任何组合，优选QS-21或QS-21衍生物、SO1861或SO1861衍生物、SA1641或SA1641衍生物和GE1741或GE1741衍生物中的任何一个或多个，更优选QS-21衍生物或SO1861衍生物，最优选SO1861或SO1861衍生物。通常，当细胞与本发明的药物组合或药物组合物接触时，这样的皂苷增强效应分子如BNA或(蛋白质)毒素的内体逃逸，所述药物组合或药物组合物包含含有皂苷的缀合物和含有效应分子的缀合物。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中至少一个皂苷是属于在皂苷的苷元核心结构的位置C23位具有醛官能团的12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜糖苷，其中皂苷与第一结合分子共价结合。优选地，皂苷通过皂苷中的醛官能团(优选地，苷元核心结构的位置C23的醛官能团)共价结合至第一结合分子的氨基酸残基。皂苷与第一结合分子的所述结合优选通过至少一个接头，和/或通过至少一个可切割接头，其中第一结合分子的氨基酸残基优选选自半胱氨酸和赖氨酸。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中至少一个皂苷的苷元核心结构的位置C23的醛官能团共价结合到接头EMCH上，该接头通过硫醚键共价结合到第一结合分子中的巯基基团上，例如半胱氨酸的巯基基团。这种EMCH接头的优点是，一旦这种缀合物从细胞的外部转移到所述细胞的所述内体内，包含皂苷和第一结合分子的缀合物在(哺乳动物)细胞的内体的pH条件的影响下分解。不希望受任何理论的束缚，在内体的酸性条件下，皂苷从包含通过接头连接到结合分子上的皂苷的缀合物上裂解下来，皂苷的释放导致在皂苷的苷元中出现醛基团，当考虑到(包含效应分子的缀合物的)效应分子的内体逃逸时，该醛基接头有助于内体逃逸增强活性。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中该至少一个皂苷是双糖链三萜糖苷，该双糖链三萜糖苷属于在该皂苷的苷元核心结构的位置C23具有醛官能团的12,13-脱氢齐墩果烷类型，并且在该皂苷的苷元核心结构的C3β-OH基团处的第一糖链中包含葡糖醛酸单元，其中该皂苷通过该第一糖链中葡糖醛酸单元的羧基基团，优选通过接头，共价结合到该第一结合分子的氨基酸残基上，其中该氨基酸残基优选选自半胱氨酸和赖氨酸。通过羧基基团将皂苷偶联至包含皂苷的缀合物中的第一结合分子的优点是皂苷苷元中游离醛基团的可用性。同样，不希望受任何理论的束缚，当效应分子(例如作为包含效应分子的缀合物的一部分)与包含皂苷的缀合物一起跟细胞接触时，观察到游离醛基团有助于内体逃逸增强作用。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中该至少一个皂苷在该至少一个皂苷的苷元核心结构的C3β-OH基团处的其第一糖链中包含葡糖醛酸单元，该葡糖醛酸单元与接头1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)共价结合，该接头优选通过酰胺键与该第一结合分子中的胺基团共价结合，例如如果该第一结合分子是第一朊结合分子的话，该第一结合分子的赖氨酸或N-末端的胺基团。同样，通过皂苷的糖链中葡糖醛酸单元的羧基基团，皂苷与第一结合分子如肽或蛋白质如抗体、配体如EGF的偶联在皂苷的苷元中提供了游离醛基图案。HATU是适于将皂苷偶联到朊分子上的接头的实例。本领域技术人员将会理解，其他接头同样适用于将皂苷通过其聚糖中的羧基基团连接到第一结合分子上。合适的接头例如在“Bioconjugate Techniques[生物缀合物技术]”(G.T Hermanson,第3版,2013年,爱思唯尔学术出版社(ElsevierAcademic Press))中概述。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中细胞表面分子是细胞表面受体，优选肿瘤细胞特异性细胞表面受体，更优选选自以下中任何一个或多个的受体：CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、黏结蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、PSMA、CanAg、整合素-αV、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2，最优选选自：HER2、CD71和EGFR。优选地，第一结合分子和第二结合分子能够结合朊细胞表面分子，例如表面受体，即相同的细胞表面分子。特别地，受体优选作为结合包含皂苷的缀合物和包含效应分子的缀合物的靶标，所述受体优选在靶细胞如肿瘤细胞上高度表达，或者甚至在靶细胞如肿瘤细胞上独特表达。HER2、CD71和EGFR是在肿瘤细胞上表达的受体，它们可以被包含皂苷的本发明的缀合物和包含效应分子的本发明的缀合物合适地靶向。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中第一结合分子的第一结合区和第二结合分子的第二结合区包含以下或由以下组成：抗体或其细胞表面分子结合片段或其一个或多个细胞表面分子结合结构域，和/或包含以下或由以下组成：用于结合细胞表面分子的配体，优选选自：抗CD71单克隆抗体如IgG型OKT-9和第二抗CD71抗体；抗HER2单克隆抗体如曲妥珠单抗(赫赛汀)、珀妥珠单抗和第三抗HER2单克隆抗体；抗CD20单克隆抗体如利妥昔单抗、奥法妥木单抗、托司妥莫单抗、奥比妥珠单抗、艾瑞妥莫单抗和第五抗CD20单克隆抗体；抗CA125单克隆抗体如奥戈伏单抗和第二抗CA125单克隆抗体；抗EpCAM(17-1A)单克隆抗体如依决洛单抗和第二抗EpCAM(17-1A)单克隆抗体；抗EGFR单克隆抗体如西妥昔单抗、马妥珠单抗、帕尼妥木单抗、尼妥珠单抗和第五抗EGFR单克隆抗体或EGF；抗CD30单克隆抗体如布仑妥昔单抗和第二抗CD30抗体；抗CD33单克隆抗体如吉妥珠单抗、huMy9-6和第三抗CD33单克隆抗体；抗血管整合素α-vβ-3单克隆抗体如伊瑞西珠单抗和第二抗血管整合素α-vβ-3抗体；抗CD52单克隆抗体如阿仑单抗和第二抗CD52抗体；抗CD22单克隆抗体如依帕珠单抗、匹那妥珠单抗、抗CD22抗体莫塞妥莫单抗的结合片段(Fv)、人源化单克隆抗体艾诺妥珠单抗和第五抗CD22单克隆抗体；抗CEA单克隆抗体如拉贝妥珠单抗和第二抗CEA单克隆抗体；抗CD44v6单克隆抗体如比伐珠单抗和第二抗CD44v6单克隆抗体；抗FAP单克隆抗体如西罗珠单抗和第二抗FAB单克隆抗体；抗CD19单克隆抗体如huB4和第二抗CD19单克隆抗体；抗CanAg单克隆抗体如huC242和第二抗CanAg单克隆抗体；抗CD56单克隆抗体如huN901和第二抗CD56单克隆抗体；抗CD38单克隆抗体如达雷木单抗、OKT-10抗CD38单克隆抗体和第三抗CD38单克隆抗体；抗CA6单克隆抗体如DS6和第二抗CA6单克隆抗体；抗IGF-1R单克隆抗体如西妥木单抗、3B7和第三抗CA6单克隆抗体；抗整合素单克隆抗体如CNTO 95和第二抗整合素单克隆抗体；抗黏结蛋白聚糖-1单克隆抗体如B-B4和第二抗黏结蛋白聚糖-1单克隆抗体；抗CD79b单克隆抗体如珀拉妥珠单抗和第二抗CD79b单克隆抗体，优选以下中的任一个：曲妥珠单抗和珀妥珠单抗；西妥昔单抗和马妥珠单抗；马妥珠单抗和具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VHH 7D12；西妥昔单抗和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VHH 9G8；以及EGF和马妥珠单抗，条件是第一结合区和第二结合区不同，并且条件是第一结合位点和第二结合位点不同。
如在实例部分中进一步详述的，发明人确定例如EGFR和HER2可以被能够结合到HER或EGFR上不同结合位点的第一和第二结合分子靶向。这样的不同的第一和第二结合分子在某些实施例中分别是包含皂苷的缀合物和包含效应分子的缀合物的一部分。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中第一结合分子的第一结合区能够结合细胞表面受体的第一结合位点，并且第二结合分子的第二结合区能够同时结合细胞表面受体的第二结合位点。这样，在其表面上具有暴露的细胞表面受体的靶细胞同时是包含第一结合分子的缀合物和包含第二结合分子的缀合物的结合靶标。也就是说，两个缀合物可以一起与靶细胞结合，甚至与完全相同的细胞表面受体分子结合，其中第一结合分子与细胞表面受体的结合不排斥第二结合分子与细胞表面受体的结合，并且反之亦然。优选地，在本发明的药物组合或本发明的药物组合物中，包含第一结合分子的缀合物和包含第二分子的缀合物可以同时结合相同的细胞表面分子。
用第一结合分子和第二结合分子靶向相同的细胞表面分子有几个优点。首先，当细胞表面分子如(肿瘤细胞特异性)受体在细胞表面以相对低的程度表达时(细胞表面上存在相对少的受体拷贝)，仍然有足够的结合位点可用于第一结合分子和第二结合分子，因为这些结合分子能够结合相同的受体分子，而不会相互排斥彼此的结合。这样，当考虑靶细胞表面分子时，低表达细胞也可以被包含第一和第二结合分子的缀合物有效靶向，使得皂苷和效应分子可以一起转移到细胞内部。第二，当靶细胞如肿瘤细胞仅暴露对靶(肿瘤)细胞足够特异的单一类型的细胞表面分子如(肿瘤细胞特异性)受体时，这种单一(肿瘤)细胞特异性细胞表面分子仍可用于被包含第一结合分子和皂苷的缀合物和包含第二结合分子和效应分子的缀合物靶向，使得两个缀合物可以一起进入细胞，并且效应分子可以通过到达效应分子的细胞内靶分子而在细胞内发挥其生物活性。靶向例如具有第一结合分子和第二结合分子的单一(足够)特异性细胞表面分子避免例如包含效应分子的另一缀合物中的另一结合分子对相同靶细胞上第二细胞表面分子的靶向，该另一结合分子不同于第一和第二结合分子，其中第二表面分子对靶细胞特异性较低或无特异性。因此，对于包含第一结合分子和皂苷的缀合物和包含第二结合分子和效应分子的缀合物，靶向靶细胞的(单一)特异性细胞表面分子提供了对靶细胞的更特异性靶向，例如当考虑靶向靶细胞时，当靶细胞不包含能够提供另一结合分子的足够特异性结合的第二细胞表面分子时。包含用于结合相同细胞表面分子的第一和第二结合分子的缀合物靶向的靶细胞越特异性，脱靶细胞结合的风险就越小。在包含第一结合分子和皂苷的缀合物的伴随结合以及包含第二结合分子和效应分子的缀合物与相同细胞表面分子的结合的影响下，靶细胞上对这样的靶细胞具有足够特异性的单一细胞表面分子足以在靶细胞内特异性递送皂苷和效应分子。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中第一结合分子的第一结合区能够结合细胞表面受体的第一结合位点，而不阻断第二结合分子的第二结合区同时结合细胞表面受体的第二结合位点的能力，和/或其中第二结合分子的第二结合区能够结合细胞表面受体的第二结合位点，而不阻断第一结合分子的第一结合区同时结合细胞表面受体的第一结合位点的能力。这样，例如，即使在其表面以相对低的程度表达细胞表面分子的细胞也仍然可以被包含第一和第二结合分子的两个缀合物有效地靶向和结合。此外，包含第一结合分子和皂苷的缀合物与包含第二结合分子和效应分子的第二缀合物的组合的许多益处之一是避免了竞争性结合，其中第一和第二结合分子与靶细胞的相同细胞表面分子结合，但与所述细胞表面分子上的不同结合位点结合。也就是说，如果第一和第二结合分子将是相同的，或者将结合到相同细胞表面分子上的相同或(高度)重叠的结合位点，包含第一结合位点的缀合物的结合将例如阻止、排斥、阻碍或破坏包含第二结合分子的缀合物的结合，并且反之亦然。这可能妨碍或限制或阻止缀合物一起有效进入靶细胞内，例如至少当考虑足以达到效应分子和/或皂苷的期望效果的剂量时。当细胞表面分子在靶细胞上没有足够高的表达时，靶向细胞表面分子上完全相同或重叠的结合位点甚至可以阻止当靶细胞被本发明的缀合物靶向时所看到的有益的相加或协同效应，该缀合物结合到细胞表面受体上的第一和第二结合位点，而不妨碍用本发明的缀合物实现的彼此的相互结合。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中该效应分子包含以下或由以下组成：小分子如药物分子、毒素如蛋白毒素、寡核苷酸如BNA、异种核酸或siRNA、酶、肽、蛋白质中的至少一个或其任何组合，优选地，效应分子是毒素、酶或寡核苷酸，更优选地，效应分子包含寡核苷酸、核酸和异种核酸中的至少一种或由其组成。本发明的一部分是，效应分子可以是被选择并且能够在一旦效应分子的细胞内靶分子(结合配偶体)在所述细胞内被结合时在细胞内发挥生物效应的任何分子。这种效应分子在本领域是众所周知的，例如在ADC选择和设计领域以及在AOC、酶修复或替代疗法、基因疗法(敲入、敲出)等领域。本发明的一部分是，一旦效应分子被递送到所述细胞内，特别是递送到所述细胞的胞质溶胶中，本领域已知的能够在细胞内发挥期望的和选择的生物效应的任何效应分子都适合掺入包含第二结合分子和效应分子的缀合物中。因此，合适的是例如效应分子，对于这些效应分子，暴露第一和第二结合分子可以结合的细胞表面分子的靶细胞的内部存在靶分子。因此，合适的是例如效应分子，对于这些效应分子，已经确定它们可以在暴露第一和第二结合分子可以结合的细胞表面分子的靶细胞内发挥期望的生物效应。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中效应分子选自以下中的任何一个或多个：载体、基因、诱导细胞自杀的转基因、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、抗有义寡核苷酸(ASO，AON)、短干扰RNA(siRNA)、抗微小RNA(抗miRNA)、DNA适体、RNA适体、mRNA、小环DNA、肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯吗啉寡聚物(PMO)、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2'-脱氧-2'-氟阿拉伯糖核酸(FANA)、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-O,4'-氨基亚乙基桥接核酸、3’-氟己糖醇核酸(FHNA)、质粒、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)或其衍生物，更优选BNA，例如用于沉默HSP27蛋白表达的BNA或用于沉默载脂蛋白B表达的BNA。在包含皂苷的缀合物的影响下，这样的寡核苷酸直接或通过内吞作用后的内体逃逸被有效地递送到带有用于结合第一和第二结合分子的细胞表面分子的靶细胞的胞质溶胶中。当与游离寡核苷酸的递送或作为包含第二结合分子的缀合物的一部分的寡核苷酸(尽管没有包含皂苷的缀合物)的递送相比时，在靶向皂苷的影响下，寡核苷酸被改善地从内体(或溶酶体)递送到胞质溶胶中。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中效应分子包含至少一个朊分子或由其组成，优选选自肽、蛋白、酶和蛋白毒素中的任何一个或多个。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中效应分子包含以下中的至少一种或由以下中的至少一种组成：脲酶和Cre-重组酶、朊毒素、核糖体失活蛋白、蛋白毒素、细菌毒素、植物毒素，更优选选自以下中的任何一个或多个：病毒毒素，例如凋亡素；细菌毒素，例如志贺毒素、志贺样毒素、铜绿假单胞菌外毒素(PE)或PE的外毒素A、全长或截短的白喉毒素(DT)、霍乱毒素；真菌毒素，例如α-八叠球菌素；植物毒素，其包括核糖体失活蛋白和2型核糖体失活蛋白的A链，该2型核糖体失活蛋白是例如香石竹毒蛋白如香石竹毒蛋白-30或香石竹毒蛋白-32、皂草毒蛋白如皂草毒蛋白-S3或皂草毒蛋白-S6；bouganin或bouganin的去免疫衍生物debouganin、志贺样毒素A、商陆抗病毒蛋白、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、莫迪素(modeccin)、莫迪素A链、相思豆毒素、相思豆毒素A链、沃氏藤黄辛(volkensin)、沃氏藤黄辛A链、槲寄生凝集素、槲寄生凝集素A链；或动物或人毒素，例如青蛙RNA酶，或颗粒酶B或人血管生成素，或其任何有毒片段或有毒衍生物；优选地，蛋白毒素是香石竹毒蛋白和/或皂草毒蛋白。如实例部分进一步详述的，当包含皂苷的缀合物和包含这种效应分子的缀合物一起与带有细胞表面分子的相同细胞接触时，效应分子如蛋白毒素的细胞内生物效应得到改善和增加。在当效应分子在没有皂苷的情况下与靶细胞接触时不在靶细胞内发挥生物效应的效应分子剂量下，当效应分子和皂苷一起与靶细胞接触时，效应分子的功效得到改善。包含第一结合分子和皂苷的缀合物包含例如结合分子珀妥珠单抗、曲妥珠单抗、马妥珠单抗、西妥昔单抗、EGF中的任何一个，和/或包含第二结合分子和效应分子的缀合物包含例如结合分子珀妥珠单抗、曲妥珠单抗、马妥珠单抗、西妥昔单抗、EGF中的任何一个，其中第一和第二结合分子不同。典型的合适实例是：第一结合分子是珀妥珠单抗，第二结合分子是曲妥珠单抗，或反之亦然；第一结合分子是马妥珠单抗，第二结合分子是西妥昔单抗，或反之亦然；第一结合分子是马妥珠单抗，第二结合分子是EGF，或者反之亦然。通常，第一和第二单克隆抗体的这种组合与选自寡核苷酸如BNA或蛋白质如酶或蛋白毒素的效应分子组合包含在本发明的缀合物中。当然，选自小分子药物分子的效应分子同样适用，例如通常用作ADC一部分的效应分子。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中效应分子包含载荷或由载荷组成。载荷是效应分子，如小分子、药物分子、毒素、小分子药物、肽、他汀类等。载荷通常是ADC的一部分。通常，在实施例中，效应分子包含以下中的至少一个或由以下中的至少一个组成：靶向核糖体的毒素、靶向延伸因子的毒素、靶向微管蛋白的毒素、靶向DNA的毒素和靶向RNA的毒素、更优选以下中的任何一种或多种：厄塔毒素、帕舒托、美登素类衍生物DM1、美登素类衍生物DM4、单甲基奥瑞西汀E(MMAE、维多汀)、单甲基瑞奥西汀F(MMAF、马福多汀)、加利车霉素、N-乙酰基-γ-加利车霉素、吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0004090794230000311
(PBD)二聚体、苯并二氮杂/>
Figure BDA0004090794230000314
CC-1065类似物、倍癌霉素、多柔比星、紫杉醇、多西他赛、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷、多西他赛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、米托蒽醌、tubulysin、吲哚啉苯并二氮杂/>
Figure BDA0004090794230000315
AZ13599185、念珠藻素、根霉素、甲氨蝶呤、蒽环素、喜树碱类似物、SN-38、DX-8951f、甲磺酸依喜替康、截短形式的绿脓杆菌外毒素(PE38)、倍癌霉素衍生物、鹅膏蕈碱、α-鹅膏蕈碱、斯普利他汀、泰兰斯他汀、奥加米星、泰斯林、Amberstatin269和索星、或其衍生物。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中包含第二结合分子和效应分子的缀合物包含以下或由以下组成：抗体-药物缀合物，例如以下抗体-药物缀合物中的任何一个：吉妥珠单抗-奥加米星、布仑妥昔单抗-维多汀、曲妥珠单抗-厄塔毒素、艾诺妥珠单抗-奥加米星、莫塞妥莫单抗-帕舒托和珀拉妥珠单抗-维多汀，或包含至少药物和抗体的一个细胞表面分子结合结构域或由其组成，和/或包含至少药物和抗体的一个细胞表面分子结合片段或由其组成。例如，缀合物是珀妥珠单抗-香石竹毒蛋白、珀妥珠单抗-皂草毒蛋白、曲妥珠单抗-香石竹毒蛋白、曲妥珠单抗-皂草毒蛋白、马妥珠单抗-香石竹毒蛋白、马妥珠单抗-皂草毒蛋白、西妥昔单抗-香石竹毒蛋白、西妥昔单抗-皂草毒蛋白。当然，本发明的一部分是抗体是选择的另外的抗体，例如已知其与例如肿瘤细胞的特异性结合。此外，第一和第二结合分子可以是第一和第二抗体的结构域或片段也是本发明的一部分，这种结构域或片段具有特异性结合相同靶细胞表面分子上不同结合位点的能力。典型的片段和结构域是Fab、scFv、单结构域抗体如VHH如骆驼VH等。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中包含第一结合分子和至少一个皂苷的缀合物包含多于一个共价结合的皂苷，优选2、3、4、5、6、8、10、16、32、64、128或1-100个皂苷，或其间任何数量的皂苷，例如7、9、12个皂苷。本发明的组合和组合物即本发明的缀合物(的组合)的许多益处之一是，携带第一结合分子的缀合物所包含的皂苷部分的数量可以适应诸如细胞内有效支持和刺激效应分子在细胞内和所述细胞的胞质溶胶内递送所需的皂苷剂量的要求。当例如细胞表面受体在靶细胞表面上以相对低的程度表达时，将多于一个皂苷偶联到第一结合分子上可能是有益的。增加结合物中皂苷的数量有助于达到足够高的细胞内皂苷剂量。例如，2个、4个、8个、16个、32个或64个或其间任何数量的皂苷与第一结合分子连接。增加每个缀合物中的皂苷部分的数量也可导致包含皂苷的缀合物的有效剂量低于例如缀合物包含单一皂苷部分时的剂量。为了达到在细胞内和胞质溶胶内有效递送效应分子的细胞内剂量，与当缀合物包含单个皂苷部分时所需的剂量相比，携带多于一个皂苷的缀合物的相对更低剂量可能有助于降低副作用的风险，当例如考虑第一结合分子与不同于靶细胞的细胞上的细胞表面分子的脱靶结合时(例如，当细胞表面分子不是真正独特的靶细胞表面分子，而是也在不同细胞(例如非肿瘤细胞、健康细胞)上表达时，例如在较小程度上表达时)。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中多于一个共价结合的皂苷直接与第一结合分子的氨基酸残基共价结合，优选与半胱氨酸和/或赖氨酸共价结合，和/或通过接头和/或通过可切割接头共价结合。实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中多于一个共价结合的皂苷是共价皂苷缀合物的一部分，该缀合物包含至少一个寡聚分子或聚合分子和与其共价结合的多于一个皂苷，其中共价皂苷缀合物与第一结合分子共价结合。优选地，1-8个这样的共价皂苷缀合物与第一结合分子结合，更优选2-4个这样的共价皂苷缀合物。至少一个共价皂苷缀合物任选地基于树状突，其中任选地1-32个皂苷，优选2、3、4、5、6、8、10、16、32个皂苷，或其间任何数量的皂苷，例如7、9、12个皂苷，直接或通过接头共价结合到该至少一个共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子上。
这样的共价皂苷缀合物适于将多于一个皂苷偶联到第一结合分子上，例如偶联到第一结合分子上的单个结合位点上。这样，例如，防止了(部分)阻断第一结合分子与细胞表面分子结合的能力，当几个皂苷与结合分子上的几个独立化学基团结合时，会发生这种阻断。此外，这样的共价皂苷缀合物的应用为选择包含第一结合分子的缀合物所包含的皂苷部分的数量提供了灵活性和自由度。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中至少一个皂苷通过可切割接头共价结合到第一结合分子上。这种可切割接头的典型实例是前面详述的EMCH接头。在内体和溶酶体内部的酸性条件下，一旦缀合物被递送到内体或溶酶体内部，通过这种可切割接头与第一结合分子偶联的皂苷就从缀合物中释放出来。当考虑将效应分子递送到细胞内、内体内、溶酶体内并最终例如进入胞质溶胶时，游离皂苷可在更大程度上发挥其内体逃逸增强活性。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中该可切割接头在酸性条件、还原条件、酶促条件和/或光诱导条件下经受切割，并且优选地，该可切割接头包含选自以下的可切割键：在酸性条件下经受切割的腙键和酰肼键，和/或易进行蛋白水解的键，例如被组织蛋白酶B进行蛋白水解的键，和/或在还原条件下易被切割的键，例如二硫键。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中可切割接头在体内在哺乳动物细胞，优选人细胞的内体和/或溶酶体中存在的酸性条件下，优选在pH 4.0-6.5，更优选在pH≤5.5进行切割。例如，皂苷通过腙键与第一结合分子偶联，例如当皂苷通过EMCH接头与第一结合分子连接时存在的腙键，其中腙键在酸性pH下被切割，例如在内体和溶酶体中，从而在细胞内提供游离皂苷。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子与第一结合分子共价结合，优选与结合分子的氨基酸残基共价结合。一般来说，优选的是，单独的缀合物中的皂苷和效应分子通过共价键分别与第一和第二结合分子结合，而不是仅基于例如盐桥、氢键、范德华相互作用等中的任何一种或多种结合。基于共价键的缀合物是稳定的，并且具有降低的分解风险，例如在各自的结合分子和皂苷或效应分子中分解(当例如施用给受试者如人患者时在不同于细胞内空间(例如暴露靶细胞表面分子的靶细胞的内体或胞质溶胶)的一侧分解)。也就是说，本发明的共价缀合物通常在例如血液循环或组织、器官中足够稳定，以保持不变和完整，从而可以到达携带细胞表面分子的靶细胞，并且皂苷和效应分子可以在细胞内递送。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中至少一个皂苷通过根据本发明的可切割接头，优选EMCH接头，共价结合到共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子上。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中该至少一个皂苷通过亚胺键、腙键、酰肼键、肟键、1,3-二氧戊环键、二硫键、硫醚键、酰胺键、肽键或酯键中的任何一个或多个，优选通过接头与该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子共价结合。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中至少一个皂苷包含在位置C23含有醛官能团的苷元核心结构，并且该至少一个皂苷任选地在该至少一个皂苷的苷元核心结构的C3β-OH基团处的第一糖链中包含葡糖醛酸官能团，该醛官能团参与与该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子的共价键合，和/或，如果存在的话，该葡糖醛酸官能团参与与该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子的共价键合，该皂苷的键合通过直接共价键或通过接头。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中至少一个皂苷的苷元核心结构的位置C23的醛官能团与接头EMCH共价结合，该EMCH通过硫醚键共价结合到共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子中的巯基基团，例如半胱氨酸的巯基基团。例如，选择寡聚结构或聚合结构，其包含的游离巯基基团的数量与包含第一结合分子的缀合物所包含的皂苷部分的数量相匹配。例如，当第一结合分子具有两个用于结合共价皂苷缀合物的结合位点，并且旨在提供带有8个皂苷部分的缀合物时，选择包含四个用于偶联皂苷的结合位点的聚合结构，例如带有四个游离巯基基团的聚合分子，所述游离巯基基团用于通过EMCH接头的马来酰亚胺基团连接皂苷，所述接头又通过腙键偶联皂苷。这样的寡聚分子例如包含四个游离半胱氨酸残基。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中在该至少一个皂苷的苷元核心结构的C3β-OH基团处的第一糖链中的葡糖醛酸官能团与接头1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)共价结合，该HATU通过酰胺键共价结合到该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子中的胺基团，例如蛋白质的赖氨酸或N末端的胺基团。例如，寡聚分子是聚赖氨酸分子，包含选定数量的用于偶联皂苷的游离胺基团。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中共价皂苷缀合物的聚合分子或寡聚分子结合到第一结合分子，优选结合到第一结合分子的氨基酸残基，涉及该共价皂苷缀合物的聚合分子或寡聚分子上的点击化学基团，该点击化学基团优选选自四嗪、叠氮化物、烯烃或炔烃或这些基团的环状衍生物，更优选该点击化学基团是叠氮化物。当提供本发明的缀合物时，点击化学易于应用的益处将被技术人员理解。提供共价缀合物的点击化学类型的合适化学基团是本领域已知的，例如在手册“Bioconjugate Techniques[生物缀合物技术]”(G.T Hermanson,第3版,2013年,爱思唯尔学术出版社)。
实施例是本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其中共价皂苷缀合物的聚合分子或寡聚分子包含选自以下的聚合结构和/或寡聚结构：线性聚合物、支化聚合物和/或环状聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、树状突、树状突化聚合物、树状突化寡聚物、DNA、多肽、聚赖氨酸、聚乙二醇、寡聚乙二醇(OEG)，例如OEG3、OEG4和OEG5，或这些聚合结构和/或寡聚结构的组装，该组装优选通过共价交联构建，优选该共价皂苷缀合物的聚合分子或寡聚分子是树状突，例如聚酰胺基胺(PAMAM)树枝状聚合物。本领域技术人员将会理解，这样的寡聚分子和，这样的聚合分子特别适合于提供共价皂苷缀合物，该缀合物在寡聚分子或聚合分子上带有选定数量的共价结合皂苷，例如共价皂苷缀合物中的2、4、8、16、32、64或128个皂苷部分。此外，寡聚结构或聚合结构可基于将单个或多个共价皂苷缀合物偶联至第一结合分子的目的来选择。也就是说，共价皂苷缀合物上用于偶联第一结合分子的化学基团可以适应第一结合分子上用于结合这样的一个或多个共价皂苷缀合物的一个或多个化学基团的可用性。这样，本发明提供了缀合物的组合，其包含含有第一结合分子的缀合物和选定数量的共价皂苷缀合物，其中单一或每个共价皂苷缀合物包含选定数量的皂苷部分。因此，本发明在包含第一结合分子的缀合物所包含的皂苷部分的数量方面提供了很大的灵活性。此外，皂苷或共价皂苷缀合物和第一结合分子之间的共价键类型可以随意从众多选项中选择。优选的是可切割共价键，例如在内体或溶酶体内存在的酸性条件下可切割的键，这样皂苷最终可以以游离形式递送，不与第一结合分子结合。
本发明的一个方面涉及本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，其用作药物。当例如效应分子是抗肿瘤药物分子、(蛋白)毒素等时，并且当将有效量的包含第一结合分子和皂苷的缀合物和包含第二结合分子和效应分子的缀合物施用给需要这种抗肿瘤治疗的癌症患者时，这两个缀合物的组合例如适合用作药物，例如用于治疗人受试者的癌症。
本发明的一个方面涉及本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，用于治疗或预防癌症、自身免疫疾病、与蛋白质(过)表达相关的疾病、与异常细胞如肿瘤细胞或患病肝细胞相关的疾病、与突变基因相关的疾病、与基因缺陷相关的疾病、与突变蛋白相关的疾病、与(功能性)蛋白质不存在相关的疾病、与(功能性)蛋白质缺乏相关的疾病。如前所述，包含第二结合分子的缀合物所包含的选定效应分子的类型由例如目前用于治疗或预防以下中的任何一种或多种的已知效应分子的可用性来确定：癌症、自身免疫疾病、与蛋白质(过)表达相关的疾病、与异常细胞如肿瘤细胞或患病肝细胞相关的疾病、与突变基因相关的疾病、与基因缺陷相关的疾病、与突变蛋白相关的疾病、与(功能性)蛋白质不存在相关的疾病、与(功能性)蛋白质缺乏相关的疾病。在包含第二结合分子的缀合物中包含这样的效应分子，例如上文概述的任何一种效应分子，并将包含所选效应分子的所述缀合物与包含皂苷的缀合物组合，提供了本发明的治疗组合或本发明的药物组合物，当与仅用效应分子(所述效应分子为游离分子或作为例如ADC、AOC的一部分)治疗有需要的患者相比时，其具有改善的功效。在此，改善的功效被理解为，例如，在施用本发明的缀合物的患者中，与以除作为包含第二结合分子的缀合物(该缀合物与包含皂苷的缀合物组合施用)的一部分之外的形式施用的效应分子的剂量相比，以更低的效应分子剂量获得的所期望的或足够的治疗效果。
实施例是用于本发明的用途的治疗组合或用于本发明的用途的药物组合物，其中：
-所述用途用于治疗或预防人受试者的癌症；和/或
-所述用途是在有需要的患者中治疗或预防癌症，其中细胞表面分子是肿瘤细胞表面分子，优选肿瘤细胞特异性表面分子；和/或
-将该药物组合或药物组合物，优选治疗有效量的该药物组合或药物组合物，施用给有需要的患者，优选人患者。
本发明的药物组合或药物组合物的几个益处之一是，在施用所述组合或组合物的患者中例如在与例如将效应分子作为ADC的一部分施用时所需的剂量相比更低效应分子剂量下达到了期望的治疗效果，和/或例如与以不同形式(例如作为ADC、AOC的一部分)向患者施用效应分子时所能达到的治疗效果相比达到了更好和更高的程度的治疗效果(当例如考虑效应分子的治疗窗时)。在皂苷的影响下，效应分子更高程度地发挥其细胞内生物效应，和/或对有需要的患者施用较低剂量的效应分子可实现效应分子的期望治疗效果。由于第一结合分子和第二结合分子结合到相同的细胞表面分子，而不会相互干扰包含第一和第二结合分子的两个缀合物的同时结合，所以当考虑用治疗分子(即本发明的缀合物)靶向时，与疾病相关的其表面上仅具有对靶细胞足够特异的单一细胞表面分子的细胞，例如肿瘤细胞，现在可以有益地被本发明的缀合物靶向。这为例如癌症患者提供了目前还没有的治疗选择。例如，包含用于结合HER2、CD71或EGRF的第二结合分子的ADC(其用于治疗患有肿瘤的癌症患者，所述肿瘤包含仅暴露这样的肿瘤细胞特异性受体之一的肿瘤细胞)现在可以通过将ADC与本发明的包含这样的肿瘤细胞受体的第一结合位点和皂苷的缀合物组合来增强。这种组合拓宽了ADC的治疗窗。类似地，AOC被增强。
本发明的一个方面涉及成套试剂盒，其包含本发明的药物组合或本发明的药物组合物，以及任选的所述药物组合或所述药物组合物的使用说明书。例如，该成套试剂盒包括该组合或组合物治疗或预防任何前述疾病如癌症的使用说明书。
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实例和示例性实施例
非竞争性1靶标2组分系统(1T2C，非竞争性)是mAb1-SO1861和mAb2-蛋白毒素的组合治疗，其中mAb1和mAb2都靶向并结合相同的受体，但识别受体上的不同表位，从而排除了mAb受体结合竞争(图1)。在图1中，用于结合细胞表面分子(受体)的第一配体L1与皂苷或多于一个皂苷部分结合，缩写为：L1-(S)n，如与SO1861连接的第一抗体或第一VHH：mAb1-SO1861。用于在细胞内发挥生物效应的效应分子E与用于结合相同细胞表面分子(受体)的第二配体L2连接，尽管结合侧不同于L1：L2-E，例如与第二抗体或第二VHH连接的蛋白毒素：mAb2-毒素。“mAb”是指单克隆抗体。在图1中，“mAb1-(L-SO1861)n”描述了通过“不稳定的”接头L与SO1861部分结合的抗体或VHH，这表明接头L在细胞中，即在内体和溶酶体中存在pH下被切割。
VHH 7D12是结合表皮生长因子(EGFR)的(人)受体的单结构域抗体，该7D12具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:1-VHH 7D12
QVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSS
单结构域抗体(sdAb)7D12[SEQ ID NO:1]不与单克隆抗体马妥珠单抗竞争结合EGFR(R.Heukers等人,Endocytosis of EGFR requires its kinase activity and N-terminal transmembrane dimerization motif[EGFR的胞吞作用需要其激酶活性和N-末端跨膜二聚化基序](2013),Journal of Cell Science 126[细胞科学杂志],4900–4912)。因此，sdAb7D12和马妥珠单抗或马妥珠单抗的EGFR结合结构域或EGFR结合片段的组合是用于结合相同细胞表面分子(受体)的第一配体L1和非竞争性第二配体L2的组合的典型实例，尽管结合侧不同于L1，其中例如L1与皂苷缀合，L2与效应部分缀合，或反之亦然。可替代地，例如，如果7D12是第一配体L1，基于EGFR结合性马妥珠单抗的EGFR结合性Fab片段或EGFR结合性scFv可以用作配体L2。例如，多价配体L1是适用的，其包含sdAb 7D12的两个或更多个重复，例如两个或三个线性缀合的7D12结构域，其中L2是马妥珠单抗，或者例如马妥珠单抗的EGFR结合结构域或EGFR结合片段，或者基于EGFR结合性马妥珠单抗的EGFR结合性Fab片段或EGFR结合性scFv。
VHH 9G8是结合表皮生长因子(EGFR)的(人)受体的单结构域抗体，该9G8具有如SEQID NO:2所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2-VHH 9G8
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVVAINWSSGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGYQINSGNYNFKDYEYDYWGQGTQVTVSS
单结构域抗体(sdAb)9G8[SEQ ID NO:2]不与单克隆抗体西妥昔单抗竞争结合EGFR(R.Heukers等人,Endocytosis of EGFR requires its kinase activity and N-terminal transmembrane dimerization motif[EGFR的胞吞作用需要其激酶活性和N-末端跨膜二聚化基序](2013),Journal of Cell Science 126[细胞科学杂志],4900–4912)。因此，sdAb9G8和西妥昔单抗或西妥昔单抗的EGFR结合结构域或EGFR结合片段的组合是用于结合相同细胞表面分子(受体)的第一配体L1和非竞争性第二配体L2的组合的典型实例，尽管结合侧不同于L1，其中例如L1与皂苷缀合，L2与效应部分缀合，或反之亦然。可替代地，例如，如果9G8是第一配体L1，基于EGFR结合性西妥昔单抗的EGFR结合性Fab片段或EGFR结合性scFv可以用作配体L2。例如，多价配体L1是适用的，其包含sdAb 9G8的两个或更多个重复，例如两个或三个线性缀合的9G8结构域，其中L2是西妥昔单抗，或者例如西妥昔单抗的EGFR结合结构域或EGFR结合片段，或者基于EGFR结合性西妥昔单抗的EGFR结合性Fab片段或EGFR结合性scFv。
实例1.1T2C，非竞争性HER2靶向
SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与珀妥珠单抗缀合，其中DAR 4(珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4)。在50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白(曲妥珠单抗缀合至蛋白毒素皂草毒蛋白，DAR4)的固定浓度下滴定珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4。珀妥珠单抗和曲妥珠单抗在不同的表位识别并结合人类HER2(非竞争性)。测定靶向蛋白毒素介导的对HER2表达细胞(SK-BR-3，HER2++)和非表达细胞(MDA-MB-468，HER2-)的细胞杀伤。这揭示了在低和高浓度的珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4(SK-BR-3:IC50＝0,5nM；图2A)的强烈细胞杀伤，而同等浓度的珀妥珠单抗、珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,9或珀妥珠单抗+50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白不能在HER2表达细胞中诱导任何细胞杀伤活性。当我们将这些数据与曲妥珠单抗(Cys-L-SO1861)4+50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白的组合进行比较时，我们观察到在高浓度曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,9下，细胞杀伤活性由于两种曲妥珠单抗抗体缀合物结合HER2受体的竞争而降低。对于任何处理，在MDA-MB-468细胞(无HER2表达)中没有观察到细胞杀伤(MDA-MB-468:IC50>1000nM；图2B)。
所有这些表明，使用识别相同受体但结合不同表位(不同结合位点)的两种不同抗体，在高HER2表达细胞中在低和高浓度的珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4与固定低浓度(50pM)的曲妥珠单抗-皂草毒蛋白组合下有效诱导细胞杀伤，但在不表达HER2的细胞中不诱导细胞杀伤。因此，使用根据本发明的两种缀合物的组合省略了对受体结合的竞争，并显示了在低浓度和高浓度的珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4下的活性。
接下来，在2,5nM和75nM珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4的固定浓度下滴定曲妥珠单抗-皂草毒蛋白，并测定靶向蛋白毒素介导的对HER2表达细胞(SK-BR-3，HER2++)和HER2非表达细胞(MDA-MB-468，HER2-)的细胞杀伤。这揭示了在SK-BR-3(HER2++；IC50＝0,5pM；图3A)中低浓度曲妥珠单抗-皂草毒蛋白与2,5nM或75nM珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4组合时的有效细胞杀伤；而曲妥珠单抗-皂草毒蛋白或曲妥珠单抗-皂草毒蛋白+2,5nM或75nM珀妥珠单抗在SK-BR-3细胞中仅在高浓度下显示细胞杀伤(IC50>1000pM；图3A)。当将这些数据与曲妥珠单抗-皂草毒蛋白+2.5nM或75nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,9的组合进行比较时，当与75nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,9组合时，细胞杀伤活性强烈降低。在MDA-MB-468细胞(HER2-)中，对于任何处理没有观察到细胞杀伤(MDA-MB-468:IC50>10.000pM；图3B)。
所有这些表明低浓度曲妥珠单抗-皂草毒蛋白+2.5nM珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4或75nM珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4的组合在高HER2表达细胞中诱导有效的细胞杀伤。因此，使用根据本发明的两种缀合物的组合省略了对受体结合的竞争，并显示了在低浓度和高浓度的珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4下的有效细胞杀伤。
实例2.1T2C，非竞争性HER2靶向
接下来，在50pM珀妥珠单抗-香石竹毒蛋白(珀妥珠单抗缀合至蛋白毒素香石竹毒蛋白，DAR4)的固定浓度下滴定珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4或曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4。测定靶向蛋白毒素介导的对HER2表达细胞(SK-BR-3，HER2++)和非表达细胞(MDA-MB-468，HER2-)的细胞杀伤。这揭示了在低浓度的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4或珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4时的强烈细胞杀伤(SK-BR-3:IC50<0,1nM；图4A)。在较高浓度的珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4时细胞杀伤活性降低，而较高浓度的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4仍然有效。同等浓度的珀妥珠单抗、珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,9或珀妥珠单抗+50pM珀妥珠单抗-香石竹毒蛋白在HER2表达细胞中无效(SK-BR-3:IC50>1000nM；图4A)。对于任何处理，在MDA-MB-468细胞(HER2-)中没有观察到细胞杀伤(MDA-MB-468:IC50>1000nM；图4B)。
所有这些表明，使用识别相同受体但结合不同表位的两种不同抗体，在高HER2表达细胞中在低浓度和高浓度的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4与固定低浓度(50pM)的珀妥珠单抗-香石竹毒蛋白组合下有效地诱导细胞杀伤。
接下来，在2.5nM和25nM珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4或曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4的固定浓度下滴定珀妥珠单抗-香石竹毒蛋白，并测定靶向蛋白毒素介导的对HER2表达细胞(SK-BR-3，HER2++)和非表达细胞(MDA-MB-468，HER2-)的细胞杀伤。这揭示了在低浓度的珀妥珠单抗-香石竹毒蛋白与2,5nM的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4或2,5nM的珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4组合时对SK-BR-3细胞(HER2++)的有效细胞杀伤(分别为IC50＝0,5pM；IC50＝0,5pM，图5A)，而珀妥珠单抗-香石竹毒蛋白+25nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4显示出比珀妥珠单抗-香石竹毒蛋白+25nM珀妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4的组合更有效的细胞杀伤。同等浓度的珀妥珠单抗-香石竹毒蛋白或珀妥珠单抗-香石竹毒蛋白+25nM珀妥珠单抗仅在高浓度下在SK-BR-3细胞中显示出一些轻微的细胞杀伤活性(IC50>10.000pM；图5A)。在MDA-MB-468细胞(HER2-)中，对于任何处理没有观察到细胞杀伤(MDA-MB-468:IC50>10.000pM；图5B)。
所有这些表明，根据本发明的组合省略了受体竞争，揭示了非常有效的内体逃逸和胞质毒素递送，导致非常有效和选择性的肿瘤细胞杀伤。
实例3.1T2C，非竞争性EGFR靶向
SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与马妥珠单抗缀合，DAR 3,3(马妥珠单抗-SO1861)。在10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白(西妥昔单抗缀合至蛋白毒素皂草毒蛋白，DAR4)或10pM EGF香石竹毒蛋白(重组毒素融合蛋白)的固定浓度下滴定马妥珠单抗-SO1861。与西妥昔单抗和EGF相比，马妥珠单抗在不同的表位识别和结合人EGFR，而西妥昔单抗和EGF竞争结合EGFR受体。测定了靶向蛋白毒素介导的对EGFR表达细胞(A431，EGFR++)和非表达细胞(A2058，EGFR-)的细胞杀伤。这揭示了在A431细胞中在低浓度和高浓度的马妥珠单抗-(SO1861)+10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白或10pM EGF香石竹毒蛋白下的强烈细胞杀伤(IC50＝2nM；图6A)，而同等浓度的马妥珠单抗、马妥珠单抗-SO1861、马妥珠单抗+10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白或马妥珠单抗+10pM EGF香石竹毒蛋白不能在A431细胞中诱导任何细胞杀伤活性(IC50>1000nM；图6A)。当我们将这些数据与西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4+10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白或西妥昔单抗-SO1861+10pM EGF-香石竹毒蛋白的组合进行比较时，我们观察到在较高浓度的西妥昔单抗-SO1861下，由于西妥昔单抗缀合物和EGF竞争结合EGFR受体，细胞杀伤活性降低。对于任何处理，在A2058细胞(EGFR-)中没有观察到细胞杀伤(IC50>1000nM；图6B)。所有这些表明，使用识别相同受体但结合不同表位的两种不同抗体或抗体/配体组合，在EGFR++表达细胞中在低和高浓度的马妥珠单抗-SO1861与固定低浓度(10pM)的西妥昔单抗-皂草毒蛋白或EGF香石竹毒蛋白组合下有效诱导细胞杀伤。因此，根据本发明的组合的使用省略了对受体结合的竞争，并揭示了非常有效的内体逃逸和胞质毒素递送，导致有效和选择性的肿瘤细胞杀伤。
接下来，在10nM和75nM马妥珠单抗-SO1861的固定浓度下滴定西妥昔单抗-皂草毒蛋白，并测定靶向蛋白毒素介导的对EGFR表达细胞(A431，EGFR++)的细胞杀伤。这表明，10nM和75nM的马妥珠单抗-SO1861与低浓度的西妥昔单抗-皂草毒蛋白组合在表达EGFR的细胞中诱导了有效的细胞杀伤(A431:IC50＝0,5pM；图7A)，而西妥昔单抗-皂草毒蛋白或西妥昔单抗-皂草毒蛋白+10nM或75nM马妥珠单抗仅在高浓度下显示细胞杀伤(IC50＝1000pM，图3A)。当我们将这些数据与西妥昔单抗-皂草毒蛋白+10nM和75nM西妥昔单抗-SO1861的组合进行比较时，细胞杀伤活性随着西妥昔单抗-SO1861浓度的增加而降低。在A2058细胞(EGFR-)中，没有观察到细胞杀伤(A2058:IC50>1000pM；图7B)。
所有这些表明，根据本发明的组合省略了受体竞争，揭示了非常有效的内体逃逸和胞质毒素递送，导致非常有效和选择性的肿瘤细胞杀伤。
材料与方法
SO1861由分析发现有限公司(Analyticon Discovery GmbH)从肥皂草获得的原植物提取物中分离和纯化。马妥珠单抗购自绝对抗体公司(Absolute Antibody Ltd)英国，曲妥珠单抗(Tras，
Figure BDA0004090794230000471
罗氏公司(Roche))，西妥昔单抗(Cet，/>
Figure BDA0004090794230000472
默克公司(Merck KGaA))和珀妥珠单抗(购自大学药房，柏林)香石竹毒蛋白-cys是从法国Proteogenix公司生产和购买，根据标准程序从大肠杆菌中生产EGF香石竹毒蛋白。西妥昔单抗-皂草毒蛋白和曲妥珠单抗-皂草毒蛋白缀合物从先进靶向系统公司(AdvancedTargeting Systems)(圣地亚哥，加利福尼亚州)生产和购买。
三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP，98％，西格玛-奥尔德里奇公司)，5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB，埃尔曼试剂，99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，ZebaTM旋转脱盐柱(2mL，赛默飞世尔公司)，NuPAGETM4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶(赛默飞世尔公司)，NuPAGETMMES SDS运行缓冲液(赛默飞世尔公司)，NovexTMSharp预染色蛋白标准品(赛默飞世尔公司)，PageBlueTM蛋白质染色溶液(赛默飞世尔公司)，PierceTMBCA蛋白检测试剂盒(赛默飞世尔公司)，N-乙基马来酰亚胺(NEM，98％，西格玛-奥尔德里奇公司)，1,4-二硫苏糖醇(DTT，98％，西格玛-奥尔德里奇公司)，Sephadex G25(通用电气医疗保健公司)，Sephadex G50 M(通用电气医疗保健公司)、Superdex 200P(通用电气医疗保健公司)，异丙醇(IPA，99.6％，VWR)，三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris，99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，三(羟基甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris.HCL，西格玛-奥尔德里奇公司)，L-组氨酸(99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，D-(+)-海藻糖脱水物(99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，聚乙二醇脱水山梨醇单月桂酸酯(吐温20，西格玛-奥尔德里奇公司)，杜尔贝克氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS，赛默飞世尔公司)，盐酸胍(99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(EDTA-Na2，99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，0.2微米和0.45微米无菌过滤器(赛多利斯公司(Sartorius))，琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC，赛默飞世尔公司)，香石竹毒蛋白-Cys(Dia-Cys，具有单个C-末端半胱氨酸的香石竹毒蛋白突变体由法国Proteogenix公司生产)，Vivaspin T4和T15浓缩器(赛多利斯公司)，Superdex200PG(通用电气医疗保健公司)，四(乙二醇)琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(PEG4-SPDP，赛默飞世尔公司)，HSP27 BNA二硫化物寡核苷酸(生物合成)，[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N,N-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐](HATU，97％，西格玛-奥尔德里奇公司)，二甲基亚砜(DMSO，99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐(AEM，98％，西格玛-奥尔德里奇公司)，L-半胱氨酸(98.5％，西格玛-奥尔德里奇公司)，去离子水(DI)是从超纯实验室水系统中新鲜取出的(密理博公司(MilliQ)，默克公司(Merck))，镍-氨三乙酸琼脂糖(Ni-NTA琼脂糖，Protino公司)，甘氨酸(99.5％，VWR)，5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸(埃尔曼试剂，DTNB，98％，西格玛-奥尔德里奇公司)，S-乙酰基巯基琥珀酸酐荧光素(SAMSA试剂，英杰公司)碳酸氢钠(99.7％，西格玛-奥尔德里奇公司)，碳酸钠(99.9％，西格玛-奥尔德里奇公司)，具有Sephadex G-25树脂的PD MiniTrap脱盐柱(通用电气医疗保健公司)，PD10 G25脱盐柱(通用电气医疗保健公司)、Zeba旋转脱盐柱(0.5、2、5、和10mL(赛默飞世尔公司)，Vivaspin离心过滤器T4 10kDa MWCO，T4 100kDaMWCO，和T15(赛多利斯公司)，Biosep s3000 aSEC柱(菲罗门公司(Phenomenex))，Vivacell超滤装置10和30kDa MWCO(赛多利斯公司)，Nalgene快速流动过滤器(赛默飞世尔公司)，
SO1861-EMCH合成
向SO1861(121mg，0.065mmol)和EMCH.TFA(110mg，0.325mmol)中添加甲醇(特干，3.00mL)和TFA(0.020mL，0.260mmol)。在室温下搅拌反应混合物。1.5小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC。1将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体的标题化合物(120mg，90％)。基于LC-MS的纯度为96％。
LRMS(m/z)：2069[M-1]1-
LC-MSr.t.(min)：1.084
mAb-SO1861合成
向马妥珠单抗中加入新鲜制备的TCEP溶液(1.00mg/ml，1.971摩尔当量，2.80×10-5mmol)。将反应混合物短暂涡旋，然后在20℃用辊混合孵育90分钟。孵育后(在添加SO1861-EMCH之前)，取出0.5mg(0.101ml)等份的马妥珠单抗-SH，并使用zeba旋转脱盐柱洗脱通过凝胶过滤纯化至TBS pH 7.5中。通过UV-vis分析和Ellman测定对该等份进行表征。向主体马妥珠单抗-SH中加入等份的新鲜制备的SO1861-EMCH溶液(2.00mg/ml，8摩尔当量，8.54×10-5mmol，0.089ml)，将混合物短暂涡旋，然后在20℃孵育120分钟。除了缀合反应之外，两等份脱盐的马妥珠单抗-SH(0.10mg，0.022ml，6.70×10-7mmol)与NEM(8.00当量，5.36×10-6mmol，0.67μg，2.7μl 0.25mg/ml溶液)或TBS pH 7.5缓冲液(2.7μl)在20℃反应120分钟，分别作为阳性和阴性对照。孵育后(在添加NEM之前)，取出约60μg(0.020ml)等份的马妥珠单抗-SO1861混合物，并通过Ellman测定以及阳性和阴性对照进行表征，以获得SO1861掺入。向马妥珠单抗-SO1861混合物中加入等份的新鲜制备的NEM溶液(0.25mg/ml，5摩尔当量，5.34×10-5mmol，0.007mg)以淬灭反应。将缀合物通过zeba 40K MWCO旋转柱纯化，用DPBS pH 7.5洗脱，得到纯化的马妥珠单抗-SO1861缀合物。将产物归一化至2.0mg/ml并过滤至0.2μm，以提供马妥珠单抗-SO1861(总产率＝1.10mg，52％，马妥珠单抗:SO1861-EMCH＝3.3)。
按照类似的程序生产珀妥珠单抗-SO1861(DAR4)、西妥昔单抗-SO1861(DAR4)、曲妥珠单抗-SO1861(DAR4)
珀妥珠单抗-香石竹毒蛋白合成
使用vivaspin T15过滤管(3,000g，20℃，10分钟)通过超滤浓缩香石竹毒蛋白-Cys(17.0ml，约9.6mg)。使用zeba 10ml旋转柱对所得的3.25ml等份进行凝胶过滤，用TBSpH 7.5洗脱。
用DPBS pH 7.5将珀妥珠单抗(0.30ml，约10mg)稀释至10mg/ml，通过zeba5ml旋转柱脱盐，用DPBS pH 7.5洗脱，并归一化至2.50mg/ml。向Pert(5.00mg，3.30×10-5mmol，2.593mg/ml)的等份中加入等份的在DMSO中新鲜制备的SMCC溶液(1.00mg/ml，4.20摩尔当量，13.9×10-5mmol)，将混合物短暂涡旋，然后用辊混合在20℃孵育60分钟。之后，通过添加等份的在DPBS pH 7.5中新鲜制备的甘氨酸溶液(2.0mg/ml，5.0摩尔当量，69.5×10-5mmol)来淬灭反应。在使用zeba 10ml旋转柱进行凝胶过滤(用TBS pH 7.5洗脱)后获得了Pert-SMCC(4.27mg，2.80×10-5mmol，1.514mg/ml)。
向香石竹毒蛋白-Cys(7.54mg，25.3×10-5mmol，2.258mg/ml)中加入等份的在TBSpH 7.5中新鲜制备的TCEP溶液(1.00mg/ml，0.5摩尔当量，12.6×10-5mmol)，将混合物短暂涡旋，然后用辊混合在20℃下孵育60分钟。之后，通过使用zeba 10ml旋转柱进行凝胶过滤(用TBS pH 7.5洗脱)获得香石竹毒蛋白-SH(6.0mg，20.2×10-5mmol，1.722mg/ml，香石竹毒蛋白:SH＝1.1)。
向主体Pert-SMCC中加入等份的香石竹毒蛋白-SH(7.20摩尔当量)，将混合物短暂涡旋，然后在20℃孵育过夜。约16小时后，通过添加等份的在TBS pH 7.5中新鲜制备的NEM溶液(2.50mg/ml，5.0摩尔当量，101×10-5mmol)来淬灭反应。将反应混合物过滤至0.45μm，然后使用vivaspin T15过滤管(3,000g，20℃，15分钟)通过超滤浓缩至<2ml。使用1.6×35cm Superdex 200PG柱通过凝胶过滤(用DPBS pH 7.5洗脱)纯化缀合物。
细胞活力测定
处理后，将细胞在37℃下孵育72小时，然后根据制造商的说明(CellTiter
Figure BDA0004090794230000501
水性单溶液细胞增殖测定，普洛麦格公司(Promega))通过MTS测定确定细胞活力。简而言之，在不含酚红(泛生物技术公司(PAN-Biotech GmbH))的补充有10％FBS的DMEM中将MTS溶液稀释20倍。用200μL/PBS孔洗涤细胞一次，之后每孔加入100μL稀释的MTS溶液。将板在37℃下孵育约20-30分钟。随后，在赛默飞世尔科技公司Multiskan FC平板读数器(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))上测量492nm处的OD。为了定量，在计算处理/未处理细胞的细胞活力百分比之前，通过将处理孔的背景校正信号除以未处理孔的背景校正信号，从所有其他孔中减去“仅培养基”孔的背景信号(x100)。
FACS分析
将细胞以适合每个细胞系的密度接种于T75烧瓶中的补充有10％胎牛血清(泛生物技术公司)和1％青霉素/链霉素(泛生物技术公司)的DMEM(泛生物技术公司)中，并孵育72-84小时(5％CO2，37℃)，直到达到90％的汇合。接下来，将细胞进行胰蛋白酶化(TryplEExpress，吉布科赛默飞世尔科技公司(Gibco Thermo Scientific))成单细胞，转移到15mLfalcon管中，并离心(1,400rpm，3分钟)。弃去上清液，同时让细胞沉淀浸没。将500.000个细胞转移到圆底FACS管中，并用3mL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)洗涤。将细胞以1800rpm在4℃离心3分钟，并重悬浮在200μL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)或200μL抗体溶液中；在195μL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)中含有5μL抗体。APC小鼠IgG1，κAPC抗人EGFR(#352906，百进公司(Biolegend))用于染色EGFR受体。APC抗人CD340(erbB2/HER-2)(#324406百进公司)用于染色HER2受体，APC小鼠IgG1a，κ同种型Ctrl FC(#400112，百进公司)针对两者用作其匹配的同种型对照。样品在4℃下在管辊混合器上孵育30分钟。之后，用冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)将细胞洗涤2x，并使用PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)中的2％PFA溶液在室温下固定20分钟。用冷PBS洗涤细胞1x，并重悬浮在1000μL冷PBS中用于FACS分析。用BDFACSCanto II流式细胞仪系统(BD生物科学公司(BD Biosciences))和FlowJo软件分析样品。用FACS分析确定的各种细胞的EGFR和HER2的表达水平总结在表A2中。
表A2.不同细胞中EGFR、HER2的表达水平
Figure BDA0004090794230000511
Figure BDA0004090794230000521
非竞争性1靶标2组分系统(1T2C，非竞争性)是mAb1-SO1861和mAb2-蛋白毒素的组合治疗，其中mAb1和mAb2都靶向并结合相同的受体，但识别受体上的不同表位，从而排除了mAb受体结合竞争(图1)。术语“mAb1”和“mAb2”在此指单克隆抗体，并且mAb也可以是任何结合分子，例如抗体、IgG、其结合结构域、其结合片段、Fab、scFv、单结构域抗体(单价、多价，例如二价或三价)，例如VHH结构域或VH结构域等。优选的是单克隆抗体和单结构域抗体如VHH。例如，mAb1可以是单克隆抗体，mAb2可以是VHH，并且反之亦然。mAb1类型和mAb2类型的任何组合都是合适的。
实例4.SO1861+EGFR/HER2/CD71靶向单克隆抗体
在10pM CD71-皂草毒蛋白(DAR4)、10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白(DAR4)、10pM马妥珠单抗-香石竹毒蛋白(DAR4)、10pM珀妥珠单抗-皂草毒蛋白(DAR4)、10pM或50pM珀妥珠单抗-皂草毒蛋白(DAR4)和50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白(DAR4)的固定浓度下滴定SO1861，并且测定了靶向蛋白毒素介导的对A431(EGFR++/HER2+/-/CD71+)和A2058(EGFR-/HER2+/-/CD71+)的细胞杀伤。在A431细胞(EGFR++/HER2+/-/CD71+)中，这揭示了对所有EGFR靶向抗体-毒素(10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白和10pM马妥珠单抗-香石竹毒蛋白)以及10pM CD71-皂草毒蛋白和50pM珀妥珠单抗-皂草毒蛋白而言在SO1861:IC50＝200nM的细胞杀伤活性，而50pM曲妥珠单抗或10pM珀妥珠单抗-皂草毒蛋白分别在IC50＝250nM和IC50＝300nM显示活性(图8A)，在A2058细胞中(EGFR-/HER2+/-/CD71+)，EGFR靶向抗体-毒素(10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白和10pM马妥珠单抗-香石竹毒蛋白)没有活性，但是10pM CD71mab-皂草毒蛋白、10或50pM珀妥珠单抗-皂草毒蛋白和50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白在SO1861:IC50＝200nM都显示活性(图8B)。
接下来，在SK-BR-3细胞(HER2++/EGFR+/CD71+)和MDA-MB-468细胞(HER2-/EGFR++/CD71+)上进行类似的实验。在SK-BR-3细胞(HER2++/EGFR+/CD71+)中，这揭示了对所有HER2靶向抗体-毒素(10或50pM珀妥珠单抗-皂草毒蛋白和50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白)以及10pMCD71-皂草毒蛋白、10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白和10pM马妥珠单抗-香石竹毒蛋白而言在SO1861:IC50＝200nM的细胞杀伤活性(图9A)。在MDA-MB-468细胞(HER2-/EGFR++/CD71+)中，HER2靶向抗体-毒素(10或50pM珀妥珠单抗-皂草毒蛋白和50pM曲妥珠单抗-皂草毒蛋白)仅在非常高的浓度下显示活性(SO1861:IC50>1000nM)，而10pM西妥昔单抗-皂草毒蛋白和10pM马妥珠单抗-香石竹毒蛋白和10pM CD71mab-皂草毒蛋白在SO1861:IC50＝200nM显示强烈活性(图9B)。
材料与方法
SO1861由分析发现有限公司(Analyticon Discovery GmbH)从肥皂草获得的原植物提取物中分离和纯化。马妥珠单抗购自绝对抗体公司(Absolute Antibody Ltd)英国，曲妥珠单抗(Tras，
Figure BDA0004090794230000531
罗氏公司(Roche))，西妥昔单抗(Cet，/>
Figure BDA0004090794230000532
默克公司(Merck KGaA))和珀妥珠单抗(购自大学药房，柏林)，抗人CD71(OKT-9),BioXCell。西妥昔单抗-皂草毒蛋白CD71mab-皂草毒蛋白，珀妥珠单抗-皂草毒蛋白曲妥珠单抗-皂草毒蛋白缀合物从先进靶向系统公司(Advanced Targeting Systems)(圣地亚哥，加利福尼亚州)生产和购买。香石竹毒蛋白-cys是根据标准程序从法国Proteogenix公司生产和购买。
三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP，98％，西格玛-奥尔德里奇公司)，5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB，埃尔曼试剂，99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，ZebaTM旋转脱盐柱(2mL，赛默飞世尔公司)，NuPAGETM4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶(赛默飞世尔公司)，NuPAGETMMES SDS运行缓冲液(赛默飞世尔公司)，NovexTMSharp预染色蛋白标准品(赛默飞世尔公司)，PageBlueTM蛋白质染色溶液(赛默飞世尔公司)，PierceTMBCA蛋白检测试剂盒(赛默飞世尔公司)，N-乙基马来酰亚胺(NEM，98％，西格玛-奥尔德里奇公司)，1,4-二硫苏糖醇(DTT，98％，西格玛-奥尔德里奇公司)，Sephadex G25(通用电气医疗保健公司)，Sephadex G50 M(通用电气医疗保健公司)、Superdex 200P(通用电气医疗保健公司)，异丙醇(IPA，99.6％，VWR)，三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris，99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，三(羟基甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris.HCL，西格玛-奥尔德里奇公司)，L-组氨酸(99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，D-(+)-海藻糖脱水物(99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，聚乙二醇脱水山梨醇单月桂酸酯(吐温20，西格玛-奥尔德里奇公司)，杜尔贝克氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS，赛默飞世尔公司)，盐酸胍(99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(EDTA-Na2，99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，0.2微米和0.45微米无菌过滤器(赛多利斯公司(Sartorius))，琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC，赛默飞世尔公司)，香石竹毒蛋白-Cys(Dia-Cys，具有单个C-末端半胱氨酸的香石竹毒蛋白突变体由法国Proteogenix公司生产)，Vivaspin T4和T15浓缩器(赛多利斯公司)，Superdex200PG(通用电气医疗保健公司)，四(乙二醇)琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(PEG4-SPDP，赛默飞世尔公司)，HSP27 BNA二硫化物寡核苷酸(生物合成)，[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N,N-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐](HATU，97％，西格玛-奥尔德里奇公司)，二甲基亚砜(DMSO，99％，西格玛-奥尔德里奇公司)，N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐(AEM，98％，西格玛-奥尔德里奇公司)，L-半胱氨酸(98.5％，西格玛-奥尔德里奇公司)，去离子水(DI)是从超纯实验室水系统中新鲜取出的(密理博公司(MilliQ)，默克公司(Merck))，镍-氨三乙酸琼脂糖(Ni-NTA琼脂糖，Protino公司)，甘氨酸(99.5％，VWR)，5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸(埃尔曼试剂，DTNB，98％，西格玛-奥尔德里奇公司)，S-乙酰基巯基琥珀酸酐荧光素(SAMSA试剂，英杰公司)碳酸氢钠(99.7％，西格玛-奥尔德里奇公司)，碳酸钠(99.9％，西格玛-奥尔德里奇公司)，具有Sephadex G-25树脂的PD MiniTrap脱盐柱(通用电气医疗保健公司)，PD10 G25脱盐柱(通用电气医疗保健公司)、Zeba旋转脱盐柱(0.5、2、5、和10mL(赛默飞世尔公司)，Vivaspin离心过滤器T4 10kDa MWCO，T4 100kDaMWCO，和T15(赛多利斯公司)，Biosep s3000 aSEC柱(菲罗门公司(Phenomenex))，Vivacell超滤装置10和30kDa MWCO(赛多利斯公司)，Nalgene快速流动过滤器(赛默飞世尔公司)，
马妥珠单抗-香石竹毒蛋白合成
使用vivaspin T15过滤管(3,000g，20℃，10分钟)通过超滤浓缩香石竹毒蛋白-Cys(17.0ml，约9.6mg)。使用zeba 10ml旋转柱对所得的3.25ml等份进行凝胶过滤，用TBSpH 7.5洗脱。
用DPBS pH 7.5将马妥珠单抗(0.30ml，约10mg)稀释至10mg/ml，通过zeba5ml旋转柱脱盐，用DPBS pH 7.5洗脱，并归一化至2.50mg/ml。向Pert(5.00mg，3.30×10-5mmol，2.593mg/ml)的等份中加入等份的在DMSO中新鲜制备的SMCC溶液(1.00mg/ml，4.20摩尔当量，13.9×10-5mmol)，将混合物短暂涡旋，然后用辊混合在20℃孵育60分钟。之后，通过添加等份的在DPBS pH 7.5中新鲜制备的甘氨酸溶液(2.0mg/ml，5.0摩尔当量，69.5×10-5mmol)来淬灭反应。在使用zeba 10ml旋转柱进行凝胶过滤(用TBS pH 7.5洗脱)后获得了Pert-SMCC(4.27mg，2.80×10-5mmol，1.514mg/ml)。
向香石竹毒蛋白-Cys(7.54mg，25.3×10-5mmol，2.258mg/ml)中加入等份的在TBSpH 7.5中新鲜制备的TCEP溶液(1.00mg/ml，0.5摩尔当量，12.6×10-5mmol)，将混合物短暂涡旋，然后用辊混合在20℃下孵育60分钟。之后，通过使用zeba 10ml旋转柱进行凝胶过滤(用TBS pH 7.5洗脱)获得香石竹毒蛋白-SH(6.0mg，20.2×10-5mmol，1.722mg/ml，香石竹毒蛋白:SH＝1.1)。
向主体Pert-SMCC中加入等份的香石竹毒蛋白-SH(7.20摩尔当量)，将混合物短暂涡旋，然后在20℃孵育过夜。约16小时后，通过添加等份的在TBS pH 7.5中新鲜制备的NEM溶液(2.50mg/ml，5.0摩尔当量，101×10-5mmol)来淬灭反应。将反应混合物过滤至0.45μm，然后使用vivaspin T15过滤管(3,000g，20℃，15分钟)通过超滤浓缩至<2ml。使用1.6×35cm Superdex 200PG柱通过凝胶过滤(用DPBS pH 7.5洗脱)纯化缀合物。
细胞活力测定
处理后，将细胞在37℃下孵育72小时，然后根据制造商的说明(CellTiter
Figure BDA0004090794230000551
水性单溶液细胞增殖测定，普洛麦格公司(Promega))通过MTS测定确定细胞活力。简而言之，在不含酚红(泛生物技术公司(PAN-Biotech GmbH))的补充有10％FBS的DMEM中将MTS溶液稀释20倍。用200μL/PBS孔洗涤细胞一次，之后每孔加入100μL稀释的MTS溶液。将板在37℃下孵育约20-30分钟。随后，在赛默飞世尔科技公司Multiskan FC平板读数器(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))上测量492nm处的OD。为了定量，在计算处理/未处理细胞的细胞活力百分比之前，通过将处理孔的背景校正信号除以未处理孔的背景校正信号，从所有其他孔中减去“仅培养基”孔的背景信号(x100)。
FACS分析
将细胞以适合每个细胞系的密度接种于T75烧瓶中的补充有10％胎牛血清(泛生物技术公司)和1％青霉素/链霉素(泛生物技术公司)的DMEM(泛生物技术公司)中，并孵育72-84小时(5％CO2，37℃)，直到达到90％的汇合。接下来，将细胞进行胰蛋白酶化(TryplEExpress，吉布科赛默飞世尔科技公司(Gibco Thermo Scientific))成单细胞，转移到15mLfalcon管中，并离心(1,400rpm，3分钟)。弃去上清液，同时让细胞沉淀浸没。将500.000个细胞转移到圆底FACS管中，并用3mL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)洗涤。将细胞以1800rpm在4℃离心3分钟，并重悬浮在200μL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)或200μL抗体溶液中；在195μL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)中含有5μL抗体。APC小鼠IgG1，κAPC抗人EGFR(#352906，百进公司(Biolegend))用于染色EGFR受体。PE抗人HER2 APC抗人CD340(erbB2/HER-2)(#324408百进公司)用于染色HER2受体，PE小鼠IgG2a，κ同种型Ctrl FC(#400212，百进公司)用作其匹配的同种型对照。样品在4℃下在管辊混合器上孵育30分钟。之后，用冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)将细胞洗涤2x，并使用PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)中的2％PFA溶液在室温下固定20分钟。用冷PBS洗涤细胞1x，并重悬浮在1000μL冷PBS中用于FACS分析。用BD FACSCanto II流式细胞仪系统(BD生物科学公司(BD Biosciences))和FlowJo软件分析样品。所有FACS数据见表A2。
序列表
<110> 萨普雷米科技有限公司（Sapreme Technologies B.V.）
<120> 抗体-药物缀合物和抗体-皂苷缀合物的组合
<130> P6092647PCT
<150> NL 2025905
<151> 2020-06-24
<160> 2
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH 7D12
<400> 1
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH 9G8
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Val Ala Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Tyr Gln Ile Asn Ser Gly Asn Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr
100 105 110
Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

Claims (54)

1.一种治疗组合，其包含：
(a)包含缀合物的第一药物组合物，该缀合物包含第一结合分子，该第一结合分子包含用于结合细胞表面分子的第一结合位点的第一结合区，并且该缀合物包含共价结合至所述第一结合分子的至少一个皂苷，其中该皂苷是单糖链三萜糖苷或双糖链三萜糖苷；以及
(b)包含缀合物的第二药物组合物，该缀合物包含不同于该第一结合分子的第二结合分子，该第二结合分子包含不同于该第一结合区的第二结合区，该第二结合区用于结合不同于所述细胞表面分子的第一结合位点的所述细胞表面分子的第二结合位点，并且该缀合物包含与所述第二结合分子共价结合的效应分子，
该第一药物组合物和该第二药物组合物任选地进一步包含药学上可接受的赋形剂，并且任选地进一步包含药学上可接受的稀释剂。
2.一种药物组合物，其包含：
-缀合物，该缀合物包含第一结合分子，该第一结合分子包含用于结合细胞表面分子的第一结合位点的第一结合区，并且该缀合物包含共价结合至所述第一结合分子的至少一个皂苷，其中该皂苷是单糖链类型或双糖链类型的三萜皂苷；以及
-缀合物，该缀合物包含不同于所述第一结合分子的第二结合分子，该第二结合分子包含不同于所述第一结合区的第二结合区，该第二结合区用于结合不同于所述细胞表面分子的所述第一结合位点的所述细胞表面分子的第二结合位点，并且该缀合物包含与所述第二结合分子共价结合的效应分子，
并且任选地进一步包含药学上可接受的赋形剂，并且任选地进一步包含药学上可接受的稀释剂。
3.如权利要求1所述的治疗组合或如权利要求2所述的药物组合物，其中该第一结合分子是第一朊结合分子或第一非朊配体，该第一朊结合分子或第一非朊配体包含用于结合该细胞表面分子的第一结合位点的第一结合区，和/或其中该第二结合分子是第二朊结合分子或第二非朊配体，该第二朊结合分子或第二非朊配体包含用于结合该细胞表面分子的第二结合位点的第二结合区。
4.如权利要求1或3所述的治疗组合或如权利要求2或3所述的药物组合物，其中该第一结合分子是第一朊结合分子，并且其中该皂苷与该第一结合分子的氨基酸残基共价结合，优选通过接头共价结合。
5.如权利要求1、3或4所述的治疗组合或如权利要求2-4中任一项所述的药物组合物，其中该第一结合位点是所述细胞表面分子如细胞表面受体的第一表位，并且其中该第二结合位点是所述相同细胞表面分子的第二表位，其中该第二表位不同于该第一表位。
6.如权利要求1或3-5中任一项所述的治疗组合或如权利要求2-5中任一项所述的药物组合物，其中该皂苷是双糖链三萜皂苷。
7.如权利要求1或3-6中任一项所述的治疗组合或如权利要求2-6中任一项所述的药物组合物，其中该细胞表面分子是肿瘤细胞表面分子，优选肿瘤细胞特异性表面分子。
8.如权利要求1或3-7中任一项所述的治疗组合或如权利要求2-7中任一项所述的药物组合物，其中该第一结合分子的第一结合区包含用于结合该细胞表面分子的第一结合位点的配体例如EGF或由其组成，或其中该第一结合分子的第一结合区包含免疫球蛋白或所述免疫球蛋白的包含用于结合该细胞表面分子的第一结合位点的第一结合区的至少一个结合片段或结合结构域或由其组成，和/或其中该第二结合分子的第二结合区包含用于结合该细胞表面分子的第二结合位点的配体例如EGF或细胞因子或由其组成，或其中该第二结合分子的第二结合区包含免疫球蛋白或所述免疫球蛋白的包含用于结合该细胞表面分子的第二结合位点的第二结合区的至少一个结合片段或结合结构域或由其组成，
其中该免疫球蛋白优选是以下中的任何一种或多种：抗体，例如单克隆抗体，优选人抗体，IgG，包含单结构域抗体或由单结构域抗体组成的分子，至少一个VHH结构域或至少一个VH结构域，可变重链新抗原受体(VNAR)结构域，Fab，scFv，Fv，dAb，F(ab)2，Fcab片段。
9.如权利要求1或3-8中任一项所述的治疗组合或如权利要求2-8中任一项所述的药物组合物，其中该第一结合分子的第一结合区包含以下或由以下组成：单克隆抗体、单结构域抗体、至少一个VHH结构域、至少一个VH结构域、可变重链新抗原受体(VNAR)结构域、Fab、scFv、Fv、dAb、F(ab)2或Fcab片段或，优选单克隆抗体或单结构域抗体，例如至少一个VHH结构域，和/或其中该第二结合分子的第二结合区包含以下或由以下组成：单克隆抗体、单结构域抗体、至少一个VHH结构域、至少一个VH结构域、可变重链新抗原受体(VNAR)结构域、Fab、scFv、Fv、dAb、F(ab)2或Fcab片段或，优选单克隆抗体或单结构域抗体，例如至少一个VHH结构域。
10.如权利要求8所述的治疗组合或如权利要求8所述的药物组合物，其中所述免疫球蛋白的包含用于结合该细胞表面分子的第一结合位点的第一结合区的至少一个结合片段或结合结构域和/或所述免疫球蛋白的包含用于结合该细胞表面分子的第二结合位点的第二结合区的至少一个结合片段或结合结构域是单结构域抗体，优选至少一个VHH结构域。
11.如权利要求1或3-10中任一项所述的治疗组合或如权利要求2-10中任一项所述的药物组合物，其中选择该第一结合区和该第二结合区以在该第一结合位点和该第二结合位点同时结合相同的细胞表面分子。
12.如权利要求1或3-11中任一项所述的治疗组合或如权利要求2-11中任一项所述的药物组合物，其中选择该第一结合区与该细胞表面分子的第一结合位点结合，而不竞争该第二结合区与相同细胞表面分子的第二结合位点的结合，并且其中选择该第二结合区与该细胞表面分子的第二结合位点结合，而不竞争该第一结合区与相同细胞表面分子的第一结合位点的结合。
13.如权利要求1或3-12中任一项所述的治疗组合或如权利要求2-12中任一项所述的药物组合物，其中该至少一个皂苷是属于在位置C23具有醛官能团的12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷，该皂苷包含在该皂苷的C3β-OH基团处的第一糖链，该第一糖链任选地包含葡糖醛酸部分，并且该皂苷包含连接至该皂苷的C28的第二糖链，并且包含单糖或线性或支化寡糖或由其组成，其中任选地，该第二糖链的至少一个糖部分包含至少一个乙酰基基团，例如1、2、3或4个乙酰基基团。
14.如权利要求1或3-13中任一项所述的治疗组合或如权利要求2-13中任一项所述的药物组合物，其中该至少一个皂苷是从丝石竹属物种、肥皂草属物种、麦仙翁属物种和皂树属物种如皂树中的任何一种或多种中分离的皂苷。
15.如权利要求1或3-14中任一项所述的治疗组合或如权利要求2-14中任一项所述的药物组合物，其中该至少一个皂苷包含选自以下中任何一种或多种的苷元核心结构：
2α-羟基齐墩果酸；
16α-羟基齐墩果酸；
常春藤皂苷元(23-羟基齐墩果酸)；
16α,23-二羟基齐墩果酸；
丝石竹皂苷元；
皂皮酸；
原七叶皂苷元-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-22-乙酸酯；
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21,22-双(2-甲基丁-2-烯酸酯)；
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-16,22-二乙酸酯；
洋地黄皂苷配基；
3,16,28-三羟基齐墩果-12-烯；
丝石竹酸；以及
其衍生物，
优选地，该苷元核心结构选自皂皮酸和丝石竹皂苷元或其衍生物，最优选地，该苷元核心结构是皂皮酸或其衍生物。
16.如权利要求1、3-15中任一项所述的药物组合或如权利要求2-15中任一项所述的药物组合物，其中该至少一个皂苷包含与其苷元核心结构结合的第一糖链，该第一糖链选自：
GlcA-，
Glc-，
Gal-，
Rha-(1→2)-Ara-，
Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-，
Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-，
Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-，
Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-，
Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-，
Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-，
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，和
其任何衍生物，
和/或其中该至少一个皂苷任选地包含与其苷元核心结构结合的第二糖链，该第二糖链选自：
Glc-，
Gal-，
Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-，
Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-，
Ara-，
Xyl-，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc-其中R1是4E-甲氧基肉桂酸，
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc-其中R2是4Z-甲氧基肉桂酸，
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-，
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-二-OAc-Fuc-，
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc-其中R3是4E-甲氧基肉桂酸，
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-，
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-，
(Ara-或Xyl-)(1→3)-(Ara-或Xyl-)(1→4)-(Rha-或Fuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha-或Fuc-)(1→4)]-(Rha-或Fuc-)，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc-其中R4是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc-其中R5是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-，
6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-，
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-，
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-，
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-二-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-，
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-，
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-，
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc-其中R6是5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc-其中R7是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc-其中R8是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc-其中R9是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc-其中R10是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc-其中R11是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc-其中R12是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)，
Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-，和
其衍生物，
优选地，该至少一个皂苷包含与如权利要求13或15所述的皂苷的苷元核心结构结合的这样的第一糖链和这样的第二糖链。
17.如权利要求1、3-16中任一项所述的药物组合或如权利要求2-16中任一项所述的药物组合物，其中该至少一个皂苷是以下中的任何一个或多个：皂树树皮皂苷、川续断皂苷B、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、灰毡毛忍冬皂苷A、商陆皂苷A、商陆皂苷元、七叶皂苷盐、AS6.2、NP-005236、AMA-1、AMR、α-常春藤皂苷、NP-012672、NP-017777、NP-017778、NP-017774、NP-018110、NP-017772、NP-018109、NP-017888、NP-017889、NP-018108、SA1641、AE X55、NP-017674、NP-017810、AG1、NP-003881、NP-017676、NP-017677、NP-017706、NP-017705、NP-017773、NP-017775、SA1657、AG2、SO1861、GE1741、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1862、SO1904、QS-7、QS1861、QS-7api、QS1862、QS-17、QS-18、QS-21A-apio、QS-21A-xylo、QS-21B-apio、QS-21B-xylo、β-七叶皂苷、七叶皂苷Ia、油茶籽皂苷I、油茶籽皂苷J、阿萨姆皂苷F、洋地黄皂苷、报春花酸1和AS64R、或基于其的皂苷衍生物、或它们的任何立体异构体和/或其任何组合，优选QS-21、QS-21衍生物、SO1861、SO1861衍生物、SA1641、SA1641衍生物、GE1741和GE1741衍生物中的任何一个或多个，更优选QS-21、QS-21衍生物、SO1861或SO1861衍生物，最优选SO1861或SO1861衍生物。
18.如权利要求1、3-17中任一项所述的药物组合或如权利要求2-17中任一项所述的药物组合物，其中该第一缀合物中的皂苷部分或皂苷衍生物部分包含该第一糖链并包含该第二糖链，其中该第一糖链包含多于一个糖部分并且该第二糖链包含多于一个糖部分，并且其中该皂苷的苷元核心结构是皂皮酸或丝石竹皂苷元或是皂皮酸或丝石竹皂苷元的衍生物，其中以下中的一项、两项或三项，优选一项或两项：
i.该皂苷的苷元核心结构中的醛基团已被衍生化，
ii.该第一糖链中的葡糖醛酸部分的羧基基团已被衍生化，以及
iii.该第二糖链中的至少一个乙酰氧基(Me(CO)O-)基团已被衍生化。
19.如权利要求1、3-18中任一项所述的药物组合或如权利要求2-18中任一项所述的药物组合物，其中该第一缀合物中的皂苷部分或皂苷衍生物部分包含：
i.包含醛基团的苷元核心结构，该醛基团已通过以下进行衍生化：
-还原成醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化为腙键，其中该BMPH的马来酰亚胺基团任选通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一烷酸]酰肼(KMUH)反应转化为腙键，其中该KMUH的马来酰亚胺基团任选通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
ii.第一糖链，其包含羧基基团，优选葡糖醛酸部分的羧基基团，该羧基基团已经通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化；
iii.第二糖链，其包含乙酰氧基基团(Me(CO)O-)，该乙酰氧基基团已经通过脱乙酰转化为羟基基团(HO-)而衍生化；或
iv.衍生化i、ii和iii中的两项或三项，优选两项衍生化的任何组合。
20.如权利要求1、3-19中任一项所述的药物组合或如权利要求2-19中任一项所述的药物组合物，其中该至少一个皂苷是以下中的任何一个或多个：SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、皂树皂苷、Saponinum album、QS-18、Quil-A、Gyp1、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、或其皂苷衍生物、或其立体异构体和/或其任何组合，优选QS-21或QS-21衍生物、SO1861或SO1861衍生物、SA1641或SA1641衍生物和GE1741或GE1741衍生物中的任何一个或多个，更优选QS-21衍生物或SO1861衍生物，最优选SO1861或SO1861衍生物。
21.如权利要求1、3-20中任一项所述的药物组合或如权利要求2-20中任一项所述的药物组合物，其中该至少一个皂苷是属于在该皂苷的苷元核心结构的位置C23具有醛官能团的12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜糖苷，其中该皂苷通过该皂苷中的醛官能团，优选该苷元核心结构的位置C23的所述醛官能团，优选通过至少一个接头，和/或通过至少一个可切割接头共价结合到该第一结合分子，优选共价结合到该第一结合分子的氨基酸残基，其中该氨基酸残基优选选自半胱氨酸和赖氨酸。
22.如权利要求21所述的药物组合或如权利要求21所述的药物组合物，其中该至少一个皂苷的苷元核心结构的位置C23的醛官能团共价结合到接头EMCH上，该接头通过硫醚键共价结合到该第一结合分子中的巯基基团上，例如半胱氨酸的巯基基团。
23.如权利要求1、3-22中任一项所述的药物组合或如权利要求2-22中任一项所述的药物组合物，其中该至少一个皂苷是双糖链三萜糖苷，该双糖链三萜糖苷属于在该皂苷的苷元核心结构的位置C23具有醛官能团的12,13-脱氢齐墩果烷类型，并且在该皂苷的苷元核心结构的C3β-OH基团处的第一糖链中包含葡糖醛酸单元，其中该皂苷通过该第一糖链中葡糖醛酸单元的羧基基团，优选通过接头，共价结合到该第一结合分子的氨基酸残基上，其中该氨基酸残基优选选自半胱氨酸和赖氨酸。
24.如权利要求23所述的药物组合或如权利要求23所述的药物组合物，其中该至少一个皂苷在该至少一个皂苷的苷元核心结构的C3β-OH基团处的其第一糖链中包含葡糖醛酸单元，该葡糖醛酸单元与接头1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)共价结合，该接头优选通过酰胺键与该第一结合分子中的胺基团共价结合，例如如果该第一结合分子是第一朊结合分子的话，该第一结合分子的赖氨酸或N-末端的胺基团。
25.如权利要求1、3-24中任一项所述的药物组合或如权利要求2-24中任一项所述的药物组合物，其中该细胞表面分子是细胞表面受体，优选肿瘤细胞特异性细胞表面受体，更优选选自以下中任何一个或多个的受体：CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、黏结蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、PSMA、CanAg、整合素-αV、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2，最优选选自：HER2、CD71和EGFR。
26.如权利要求1、3-25中任一项所述的药物组合或如权利要求2-25中任一项所述的药物组合物，其中该第一结合分子的第一结合区和该第二结合分子的第二结合区包含以下或由以下组成：抗体或其细胞表面分子结合片段或其一个或多个细胞表面分子结合结构域，和/或包含以下或由以下组成：用于结合该细胞表面分子的配体，优选选自：抗CD71单克隆抗体如IgG型OKT-9和第二抗CD71抗体；抗HER2单克隆抗体如曲妥珠单抗(赫赛汀)、珀妥珠单抗和第三抗HER2单克隆抗体；抗CD20单克隆抗体如利妥昔单抗、奥法妥木单抗、托司妥莫单抗、奥比妥珠单抗、艾瑞妥莫单抗和第五抗CD20单克隆抗体；抗CA125单克隆抗体如奥戈伏单抗和第二抗CA125单克隆抗体；抗EpCAM(17-1A)单克隆抗体如依决洛单抗和第二抗EpCAM(17-1A)单克隆抗体；抗EGFR单克隆抗体如西妥昔单抗、马妥珠单抗、帕尼妥木单抗、尼妥珠单抗和第五抗EGFR单克隆抗体或EGF；抗CD30单克隆抗体如布仑妥昔单抗和第二抗CD30抗体；抗CD33单克隆抗体如吉妥珠单抗、huMy9-6和第三抗CD33单克隆抗体；抗血管整合素α-vβ-3单克隆抗体如伊瑞西珠单抗和第二抗血管整合素α-vβ-3抗体；抗CD52单克隆抗体如阿仑单抗和第二抗CD52抗体；抗CD22单克隆抗体如依帕珠单抗、匹那妥珠单抗、抗CD22抗体莫塞妥莫单抗的结合片段(Fv)、人源化单克隆抗体艾诺妥珠单抗和第五抗CD22单克隆抗体；抗CEA单克隆抗体如拉贝妥珠单抗和第二抗CEA单克隆抗体；抗CD44v6单克隆抗体如比伐珠单抗和第二抗CD44v6单克隆抗体；抗FAP单克隆抗体如西罗珠单抗和第二抗FAB单克隆抗体；抗CD19单克隆抗体如huB4和第二抗CD19单克隆抗体；抗CanAg单克隆抗体如huC242和第二抗CanAg单克隆抗体；抗CD56单克隆抗体如huN901和第二抗CD56单克隆抗体；抗CD38单克隆抗体如达雷木单抗、OKT-10抗CD38单克隆抗体和第三抗CD38单克隆抗体；抗CA6单克隆抗体如DS6和第二抗CA6单克隆抗体；抗IGF-1R单克隆抗体如西妥木单抗、3B7和第三抗CA6单克隆抗体；抗整合素单克隆抗体如CNTO 95和第二抗整合素单克隆抗体；抗黏结蛋白聚糖-1单克隆抗体如B-B4和第二抗黏结蛋白聚糖-1单克隆抗体；抗CD79b单克隆抗体如珀拉妥珠单抗和第二抗CD79b单克隆抗体，优选以下中的任一个：曲妥珠单抗和珀妥珠单抗；西妥昔单抗和马妥珠单抗；马妥珠单抗和具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VHH 7D12；西妥昔单抗和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VHH 9G8；以及EGF和马妥珠单抗，
条件是该第一结合区和该第二结合区不同，并且条件是该第一结合位点和该第二结合位点不同。
27.如权利要求26所述的药物组合或如权利要求26所述的药物组合物，其中该第一结合区与该第一结合位点的结合不与该第二结合区与相同细胞表面分子上的第二结合位点的结合竞争，并且反之亦然。
28.如权利要求1、3-27中任一项所述的药物组合或如权利要求2-27中任一项所述的药物组合物，其中该第一结合分子的第一结合区能够结合该细胞表面受体的第一结合位点，并且该第二结合分子的第二结合区能够同时结合该细胞表面受体的第二结合位点。
29.如权利要求1、3-28中任一项所述的药物组合或如权利要求2-28中任一项所述的药物组合物，其中该第一结合分子的第一结合区能够结合该细胞表面受体的第一结合位点，而不阻断该第二结合分子的第二结合区同时结合该细胞表面受体的第二结合位点的能力，和/或其中该第二结合分子的第二结合区能够结合该细胞表面受体的第二结合位点，而不阻断该第一结合分子的第一结合区同时结合该细胞表面受体的第一结合位点的能力。
30.如权利要求1、3-29中任一项所述的药物组合或如权利要求2-29中任一项所述的药物组合物，其中包含该第一结合分子的缀合物和包含该第二分子的缀合物可以同时结合相同细胞表面分子。
31.如权利要求1、3-30中任一项所述的药物组合或如权利要求2-30中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子包含以下或由以下组成：小分子如药物分子、毒素如蛋白毒素、寡核苷酸如BNA、异种核酸或siRNA、酶、肽、蛋白质中的至少一个或其任何组合，优选地，该效应分子是毒素、酶或寡核苷酸，更优选地，该效应分子包含寡核苷酸、核酸和异种核酸中的至少一个或由其组成。
32.如权利要求1、3-32中任一项所述的药物组合或如权利要求2-32中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子选自以下中的任何一个或多个：载体、基因、诱导细胞自杀的转基因、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、抗有义寡核苷酸(ASO，AON)、短干扰RNA(siRNA)、抗微小RNA(抗miRNA)、DNA适体、RNA适体、mRNA、小环DNA、肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯吗啉寡聚物(PMO)、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2'-脱氧-2'-氟阿拉伯糖核酸(FANA)、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-O,4'-氨基亚乙基桥接核酸、3’-氟己糖醇核酸(FHNA)、质粒、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)或其衍生物，更优选BNA，例如用于沉默HSP27蛋白表达的BNA或用于沉默载脂蛋白B表达的BNA。
33.如权利要求1、3-33中任一项所述的药物组合或如权利要求2-33中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子包含至少一个朊分子，或当从属于权利要求1、3-30中任一项时，由至少一个朊分子组成，优选选自肽、蛋白、酶和蛋白毒素中的任何一个或多个。
34.如权利要求1、3-33中任一项所述的药物组合或如权利要求2-33中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子包含以下中的至少一个，或当从属于权利要求1、3-30中任一项时，由以下中的至少一个组成：脲酶和Cre-重组酶、朊毒素、核糖体失活蛋白、蛋白毒素、细菌毒素、植物毒素，更优选选自以下中的任何一个或多个：病毒毒素，例如凋亡素；细菌毒素，例如志贺毒素、志贺样毒素、铜绿假单胞菌外毒素(PE)或PE的外毒素A、全长或截短的白喉毒素(DT)、霍乱毒素；真菌毒素，例如α-八叠球菌素；植物毒素，其包括核糖体失活蛋白和2型核糖体失活蛋白的A链，该2型核糖体失活蛋白是例如香石竹毒蛋白如香石竹毒蛋白-30或香石竹毒蛋白-32、皂草毒蛋白如皂草毒蛋白-S3或皂草毒蛋白-S6；bouganin或bouganin的去免疫衍生物debouganin、志贺样毒素A、商陆抗病毒蛋白、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、莫迪素、莫迪素A链、相思豆毒素、相思豆毒素A链、沃氏藤黄辛、沃氏藤黄辛A链、槲寄生凝集素、槲寄生凝集素A链；或动物或人毒素，例如青蛙RNA酶，或颗粒酶B或人血管生成素，或其任何有毒片段或有毒衍生物；优选地，该蛋白毒素是香石竹毒蛋白和/或皂草毒蛋白。
35.如权利要求1、3-34中任一项所述的药物组合或如权利要求2-34中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子包含至少一个载荷，或当从属于权利要求1、3-30中任一项时，由至少一个载荷组成。
36.如权利要求1、3-35中任一项所述的药物组合或如权利要求2-35中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子包含以下中的至少一个，或当从属于权利要求1、3-30中任一项时，由以下中的至少一个组成：靶向核糖体的毒素、靶向延伸因子的毒素、靶向微管蛋白的毒素、靶向DNA的毒素和靶向RNA的毒素、更优选以下中的任何一种或多种：厄塔毒素、帕舒托、美登素类衍生物DM1、美登素类衍生物DM4、单甲基奥瑞西汀E(MMAE、维多汀)、单甲基瑞奥西汀F(MMAF、马福多汀)、加利车霉素、N-乙酰基-γ-加利车霉素、吡咯并苯并二氮杂
Figure FDA0004090794200000141
(PBD)二聚体、苯并二氮杂/>
Figure FDA0004090794200000142
、CC-1065类似物、倍癌霉素、多柔比星、紫杉醇、多西他赛、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷、多西他赛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、米托蒽醌、tubulysin、吲哚啉苯并二氮杂/>
Figure FDA0004090794200000151
、AZ13599185、念珠藻素、根霉素、甲氨蝶呤、蒽环素、喜树碱类似物、SN-38、DX-8951f、甲磺酸依喜替康、截短形式的绿脓杆菌外毒素(PE38)、倍癌霉素衍生物、鹅膏蕈碱、α-鹅膏蕈碱、斯普利他汀、泰兰斯他汀、奥加米星、泰斯林、Amberstatin269和索星、或其衍生物。
37.如权利要求1、3-36中任一项所述的药物组合或如权利要求2-36中任一项所述的药物组合物，其中包含该第二结合分子和该效应分子的缀合物包含以下，或者当从属于权利要求1、3-30中任一项时由以下组成：抗体-药物缀合物，例如以下抗体-药物缀合物中的任一个：吉妥珠单抗-奥加米星、布仑妥昔单抗-维多汀、曲妥珠单抗-厄塔毒素、艾诺妥珠单抗-奥加米星、莫塞妥莫单抗-帕舒托和珀拉妥珠单抗-维多汀，或包含至少该药物和该抗体的一个细胞表面分子结合结构域或由其组成，和/或包含至少该药物和该抗体的一个细胞表面分子结合片段或由其组成。
38.如权利要求1、3-37中任一项所述的药物组合或如权利要求2-37中任一项所述的药物组合物，其中包含该第一结合分子和该至少一个皂苷的缀合物包含多于一个共价结合的皂苷，优选2、3、4、5、6、8、10、16、32、64、128或1-100个皂苷，或其间任何数量的皂苷，例如7、9、12个皂苷。
39.如权利要求38所述的药物组合或如权利要求38所述的药物组合物，其中该多于一个共价结合的皂苷直接与该第一结合分子的氨基酸残基共价结合，优选与半胱氨酸和/或赖氨酸共价结合，和/或通过接头和/或可切割接头共价结合，和/或作为共价皂苷缀合物的一部分，该共价皂苷缀合物包含至少一个寡聚分子或聚合分子和与其共价结合的多于一个皂苷，其中该共价皂苷缀合物共价结合到该第一结合分子，优选1-8个这样的共价皂苷缀合物结合到该第一结合分子，更优选2-4个这样的共价皂苷缀合物，其中该至少一个共价皂苷缀合物任选地基于树状突，其中任选地1-32个皂苷，优选2、3、4、5、6、8、10、16、32个皂苷，或其间任何数量的皂苷，例如7、9、12个皂苷，直接或通过接头共价结合到该至少一个共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子上。
40.如权利要求1、3-39中任一项所述的药物组合或如权利要求2-39中任一项所述的药物组合物，其中该至少一个皂苷通过可切割接头共价结合到该第一结合分子。
41.如权利要求40所述的药物组合或如权利要求40所述的药物组合物，其中该可切割接头在酸性条件、还原条件、酶促条件和/或光诱导条件下经受切割，并且优选地，该可切割接头包含选自以下的可切割键：在酸性条件下经受切割的腙键和酰肼键，和/或易进行蛋白水解的键，例如被组织蛋白酶B进行蛋白水解的键，和/或在还原条件下易被切割的键，例如二硫键。
42.如权利要求40或41所述的药物组合或如权利要求40或41所述的药物组合物，其中该可切割接头在体内在如哺乳动物细胞，优选人细胞的内体和/或溶酶体中存在的酸性条件下，优选在pH 4.0-6.5，更优选在pH≤5.5经受切割。
43.如权利要求39或从属于权利要求39时权利要求40-42中任一项所述的药物组合，或如权利要求39或从属于权利要求39时权利要求40-42中任一项所述的药物组合物，其中该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子与该第一结合分子共价结合，优选与该结合分子的氨基酸残基共价结合。
44.如权利要求42或43所述的药物组合或如权利要求42或43所述的药物组合物，其中该至少一个皂苷通过如权利要求39-42中任一项所述的可切割接头与该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子共价结合。
45.如权利要求42-44中任一项所述的药物组合或如权利要求42-44中任一项所述的药物组合物，其中该至少一个皂苷通过亚胺键、腙键、酰肼键、肟键、1,3-二氧戊环键、二硫键、硫醚键、酰胺键、肽键或酯键中的任何一个或多个，优选通过接头与该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子共价结合。
46.如权利要求39-45中任一项所述的药物组合或如权利要求39-45中任一项所述的药物组合物，其中该至少一个皂苷包含在位置C23含有醛官能团的苷元核心结构，并且该至少一个皂苷任选地在该至少一个皂苷的苷元核心结构的C3β-OH基团处的第一糖链中包含葡糖醛酸官能团，该醛官能团参与与该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子的共价键合，和/或，如果存在的话，该葡糖醛酸官能团参与与该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子的共价键合，该皂苷的键合通过直接共价键或通过接头。
47.如权利要求46所述的药物组合或如权利要求46所述的药物组合物，其中该至少一个皂苷的苷元核心结构的位置C23的醛官能团与接头EMCH共价结合，该EMCH通过硫醚键共价结合到该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子中的巯基基团，例如半胱氨酸的巯基基团。
48.如权利要求46或47所述的药物组合或如权利要求46或47所述的药物组合物，其中在该至少一个皂苷的苷元核心结构的C3β-OH基团处的第一糖链中的葡糖醛酸官能团与接头1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)共价结合，该HATU通过酰胺键共价结合到该共价皂苷缀合物的寡聚分子或聚合分子中的胺基团，例如蛋白质的赖氨酸或N-末端的胺基团。
49.如权利要求43-48中任一项所述的药物组合或如权利要求43-48中任一项所述的药物组合物，其中该共价皂苷缀合物的聚合分子或寡聚分子结合到该第一结合分子，优选结合到该第一结合分子的氨基酸残基，涉及该共价皂苷缀合物的聚合分子或寡聚分子上的点击化学基团，该点击化学基团优选选自四嗪、叠氮化物、烯烃或炔烃或这些基团的环状衍生物，更优选该点击化学基团是叠氮化物。
50.如权利要求43-49中任一项所述的药物组合或如权利要求43-49中任一项所述的药物组合物，其中该共价皂苷缀合物的聚合分子或寡聚分子包含选自以下的聚合结构和/或寡聚结构：线性聚合物、支化聚合物和/或环状聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、树状突、树状突化聚合物、树状突化寡聚物、DNA、多肽、聚赖氨酸、聚乙二醇、寡聚乙二醇(OEG)，例如OEG3、OEG4和OEG5，或这些聚合结构和/或寡聚结构的组装，该组装优选通过共价交联构建，优选该共价皂苷缀合物的聚合分子或寡聚分子是树状突，例如聚酰胺基胺(PAMAM)树枝状聚合物。
51.如权利要求1-50中任一项所述的药物组合，或如权利要求1-50中任一项所述的药物组合物，用作药物。
52.如权利要求1-50中任一项所述的药物组合或如权利要求1-50中任一项所述的药物组合物，用于治疗或预防癌症、自身免疫疾病、与蛋白质(过)表达相关的疾病、与异常细胞如肿瘤细胞或患病肝细胞相关的疾病、与突变基因相关的疾病、与基因缺陷相关的疾病、与突变蛋白相关的疾病、与(功能性)蛋白质不存在相关的疾病、与(功能性)蛋白质缺乏相关的疾病。
53.用于如权利要求52所述使用的药物组合，或用于如权利要求52所述使用的药物组合物，其中：
-所述用途用于治疗或预防人受试者的癌症；和/或
-所述用途是在有需要的患者中治疗或预防癌症，其中该细胞表面分子是肿瘤细胞表面分子，优选肿瘤细胞特异性表面分子；和/或
-将该药物组合或该药物组合物，优选治疗有效量的该药物组合或该药物组合物，施用给有需要的患者，优选人患者。
54.一种成套试剂盒，其包含如权利要求1、3-50中任一项所述的药物组合或如权利要求2-50中任一项所述的药物组合物，以及任选地所述药物组合或所述药物组合物的使用说明。
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