CN103254309B - 针对肿瘤坏死因子α的改进的纳米体TM - Google Patents
针对肿瘤坏死因子α的改进的纳米体TM Download PDFInfo
- Publication number
- CN103254309B CN103254309B CN201210350044.8A CN201210350044A CN103254309B CN 103254309 B CN103254309 B CN 103254309B CN 201210350044 A CN201210350044 A CN 201210350044A CN 103254309 B CN103254309 B CN 103254309B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- polypeptide
- acid sequence
- nanometer body
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 title abstract description 130
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 title abstract description 16
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 555
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 544
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 544
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 158
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 claims description 273
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 212
- 101000777550 Homo sapiens CCN family member 2 Proteins 0.000 claims description 152
- 102000047612 human CCN2 Human genes 0.000 claims description 152
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 79
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 79
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 79
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 76
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 64
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 63
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 63
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 63
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 101000693967 Trachemys scripta 67 kDa serum albumin Proteins 0.000 claims description 13
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 9
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 6
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 5
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- 101150016901 ALB1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100274294 Arabidopsis thaliana CHLD gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100434646 Mus musculus Alb gene Proteins 0.000 claims description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 abstract description 207
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 abstract description 129
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 58
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 45
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 44
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 44
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 28
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 796
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 233
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 211
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 198
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 194
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 description 190
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 190
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 168
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 159
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 128
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 114
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 104
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 104
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 77
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 70
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 67
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 66
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 59
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 59
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 58
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 58
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 52
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 52
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 51
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 51
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 51
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 43
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 35
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 32
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 30
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 28
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 26
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 25
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 24
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 24
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 22
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 22
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 22
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 21
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 21
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 20
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 20
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 19
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 19
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 18
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 18
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 18
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 17
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 17
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 17
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 17
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 17
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 16
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 13
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 108010071384 Peptide T Proteins 0.000 description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 11
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 11
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 10
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 10
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 238000013461 design Methods 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 8
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 7
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 7
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 5
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 5
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 4
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- -1 methoxyl group Chemical group 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 210000002500 microbody Anatomy 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 240000007591 Tilia tomentosa Species 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Natural products N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 2
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 2
- 101100421200 Caenorhabditis elegans sep-1 gene Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101000648740 Mus musculus Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 2
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 2
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 description 2
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010913 antigen-directed enzyme pro-drug therapy Methods 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- BLFLLBZGZJTVJG-UHFFFAOYSA-N benzocaine Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 BLFLLBZGZJTVJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000000205 computational method Methods 0.000 description 2
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N fluorescin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C21 MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229940048921 humira Drugs 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 125000005395 methacrylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 102100028449 Arginine-glutamic acid dipeptide repeats protein Human genes 0.000 description 1
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 1
- 102000015790 Asparaginase Human genes 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100180402 Caenorhabditis elegans jun-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101000588316 Doryteuthis pealeii 60 kDa neurofilament protein Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100023328 G-protein coupled estrogen receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 208000003807 Graves Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000001204 Hashimoto Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 101001061654 Homo sapiens Arginine-glutamic acid dipeptide repeats protein Proteins 0.000 description 1
- 101000829902 Homo sapiens G-protein coupled estrogen receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 241000282842 Lama glama Species 0.000 description 1
- 241000446313 Lamella Species 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000288982 Loris Species 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000699729 Muridae Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035593 POU domain, class 2, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710084414 POU domain, class 2, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 240000004371 Panax ginseng Species 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 206010034038 Parotitis Diseases 0.000 description 1
- 241000721454 Pemphigus Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000006045 Spondylarthropathies Diseases 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 102100025292 Stress-induced-phosphoprotein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical class C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003272 asparaginase Drugs 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M asparaginate Chemical compound [O-]C(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- JLQUFIHWVLZVTJ-UHFFFAOYSA-N carbosulfan Chemical compound CCCCN(CCCC)SN(C)C(=O)OC1=CC=CC2=C1OC(C)(C)C2 JLQUFIHWVLZVTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008473 connective tissue growth Effects 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000036267 drug metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N fluorescamine Chemical compound C12=CC=CC=C2C(=O)OC1(C1=O)OC=C1C1=CC=CC=C1 ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 208000007475 hemolytic anemia Diseases 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 229940019452 loris Drugs 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012900 molecular simulation Methods 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000003946 protein process Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 1
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 201000005671 spondyloarthropathy Diseases 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/24—Antidepressants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
- A61P25/32—Alcohol-abuse
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
- A61P25/36—Opioid-abuse
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/16—Otologicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
- A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
- A61P31/08—Antibacterial agents for leprosy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
- A61P5/40—Mineralocorticosteroids, e.g. aldosterone; Drugs increasing or potentiating the activity of mineralocorticosteroids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
Abstract
本发明涉及针对肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)的改进的纳米体TM，以及包括或者基本上由一种或多种所述纳米体组成的多肽。本发明还涉及编码所述纳米体和多肽的核酸；涉及制备所述纳米体和多肽的方法；涉及表达或者能够表达所述纳米体和多肽的宿主细胞；涉及包括所述纳米体、多肽、核酸或宿主细胞的组合物；并且涉及所述纳米体、所述多肽、所述核酸、所述宿主细胞或所述组合物的应用，特别是用于预防、治疗或诊断目的，诸如预防、治疗或诊断目的。
Description
本申请是国际申请日为2006年5月17日，国际申请号为PCT/EP2006/004678，进入中国的日期为2008年1月8日，中国申请号为200680026278.x，发明名称为“针对肿瘤坏死因子α的改进的纳米体TM”的分案申请。
本发明涉及针对肿瘤坏死因子α(TNF-α)的改进的纳米体TM(NanobodiesTM)，以及包括或者基本上由一种或多种所述纳米体组成的多肽。[注意：NanobodyTM，NanobodiesTM和NanocloneTM为Ablynx N.V.的商标]
本发明还涉及编码所述纳米体和多肽的核酸；涉及制备所述纳米体和多肽的方法；涉及表达或者能够表达所述纳米体和多肽的宿主细胞；涉及包括所述纳米体、多肽、核酸或宿主细胞的组合物；并且涉及所述纳米体、所述多肽、所述核酸、所述宿主细胞或所述组合物的应用，特别是用于预防、治疗或诊断目的，诸如下文提及的预防、治疗或诊断目的。
本发明的其它方面、实施方案、优点和应用将通过下文的进一步描述而变得清楚。
申请人的WO 04/041862涉及针对TNF-α的纳米体，并且涉及它的制备和应用，特别是用于预防和/或治疗与TNF-α相关和/或受TNF-α调控的疾病和紊乱，诸如炎症、类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠炎综合征、多发性硬化病、艾迪生病、自体免疫肝炎、自体免疫腮腺炎、I型糖尿病、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、急性热病性多神经炎、桥本病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、男性不育、多发性硬化病、重症肌无力、天疱疮、银屑病、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦综合征、脊椎关节病、甲状腺炎、和脉管炎。
按照WO 04/041862的抗-TNF纳米体可以被人源化，并且可以是单价或多价的，其中后者导致对TNF的增加的亲和力。按照WO 04/041862的抗-TNF纳米体TM还可以是多特异性的，并且特别可以是多特异性构建体的形式，其包括针对TNF的两个或多个纳米体和针对血清蛋白诸如人血清白蛋白的另一个纳米体，这在体内导致增加的半衰期。
WO 04/041862还涉及制备抗-TNF纳米体的方法，涉及编码抗-TNF纳米体的核酸或构建体，以及涉及包括所述抗-TNF纳米体的药物组合物，所述药物组合物可以适用于静脉内、皮下、口服、舌下、局部、鼻内、阴道内或直肠给药，或者适用于通过吸入给药。按照WO04/041862的抗-TNF纳米体还可以用于诊断目的，任选地以成分试剂盒(kit-of-parts)形式。
EP 0 486 526描述了针对TNF特定表位的TNF-α结合配体。在所述结合配体中，提及单结构域抗体(“dAbs”)。
Reiter等.，J.Mol.Biol(分子生物学杂志).(1999)，290，685-698描述了从随机化噬菌体展示文库获得的针对TNF-α的单结构域抗体，其从小鼠杂交瘤起始于VH结构域支架而产生。
WO 00/29004描述了针对TNF-α的鼠单结构域抗体(“微体(microbodies)”)。
WO 04/003019尤其描述了这样的配体，即，其包括针对TNF-α的第一结合结构域，和针对血清蛋白诸如血清白蛋白的第二结合结构域。
本发明的一般目的是提供针对TNF-α的纳米体，特别是针对人TNF-α的纳米体。
具体地，本发明的一个目的是提供针对TNF-α的纳米体，特别是针对人TNF-α的纳米体，并且提供包括所述纳米体的蛋白或多肽，其适用于治疗和/或诊断应用，并且特别用于预防、治疗和/或诊断与TNF-α相关的和/或受之调控的诸如那些上文提及的一种或多种疾病和紊乱，和/或其可以用于制备预防和/或治疗与TNF-α相关的和/或受之调控的诸如上文提及的那些一种或多种疾病的药物组合物。
更具体地，本发明的目的是提供针对TNF-α的纳米体，并且提供包括所述纳米体的蛋白和多肽，其为WO 04/041862所述的针对TNF-α的纳米体和多肽的备选物，和/或与WO04/041862所述的针对TNF-α的纳米体和多肽相比，其具有一种或多种改进的性能或特性。
更具体地，本发明的一个目的是提供针对TNF-α的纳米体，并且提供包括所述纳米体的蛋白和多肽，与WO 04/041862所述的针对TNF-α的纳米体和多肽相比，其是改进的，具有下列一种或多种改进的性能或特性：
-增加的对于TNF-α的亲和力，以单价形式，以多价形式(例如以二价形式)和/或多特异性形式(例如，WO 04/041862中或下文所述的多特异性形式的一种)；
-更好的适用性，适用于以多价形式(例如，以二价形式)设计；
-更好的适用性，适用于以多特异性形式(例如，WO 04/041862或下文所述的多特异性形式的一种)设计；
-对于“人源化”取代(如本文定义那样)的提高的适用性或敏感性；
和/或
-更低的免疫原性，以单价形式，以多价形式(例如以二价形式)和/或以多价形式的多特异性形式(例如，WO 04/041862中或下文所述的多特异性形式的一种)；
-增加的稳定性，以单价形式，以多价形式(例如以二价形式)和/或以多价形式的多特异性形式(例如，WO 04/041862中或下文所述的多特异性形式的一种)；
-增加的针对TNF-α的特异性，以单价形式，以多价形式(例如以二价形式)和/或以多价形式的多特异性形式(例如，WO 04/041862中或下文所述的多特异性形式的一种)；
-减小的或在需要的情形中增加的与来自不同物种的TNF-α的交叉反应性；
和/或
-一种或多种适于医药应用(包括预防应用和/或治疗应用)和/或诊断应用(包括但不限于成像目的的应用)的其它改进的特性，以单价形式，以多价形式(例如以二价形式)和/或以多特异性形式(例如，WO 04/041862中或下文所述的多特异性形式的一种)。
这些目的通过本文所述的纳米体、蛋白和多肽而实现。这些纳米体在本文中还叫作“本发明的纳米体(Nanobodies of the invention)”；并且这些蛋白和多肽在本文中还笼统地叫作“本发明的多肽(polypeptides of the invention)”。
由于本文所述的纳米体和多肽主要意欲用于治疗和/或诊断应用，所 以它们是针对(如本文所定义的那样)人TNF-α的。然而，不排除(但也不需要)本文所述的纳米体和多肽表现出与来自一种或多种其它温血动物物种的TNF-α交叉反应，例如与来自一种或多种其它灵长类物种的TNF-α交叉反应，和/或与来自通常用作疾病动物模型的一种或多种动物物种(例如小鼠、大鼠、兔、猪或狗)特别是与TNF-α相关的疾病和紊乱的动物模型的物种(诸如本文提及的物种和动物模型)的TNF-α交叉反应。在这方面，对于有经验的技术人员应该清楚，由于这允许针对人TNF-α的纳米体和多肽可以在这样的疾病模型中进行检验，所以，从药物开发的观点来看，所述交叉反应性，当存在时，可能是有优点的。
在其最广泛的意义上，本发明也没有特别局限于或者由本发明的纳米体和多肽所针对的TNF-α的特异性抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象(当适用时)而定义。
然而，在一个优选的实施方案中，本文所述的纳米体、蛋白或多肽针对和/或可以结合TNF-α的表位，其位于和/或形成部分TNF受体结合位点(例如，TNF-RI，THF-RII的结合位点，也叫作p55或p75)。正如本领域公知的那样，TNF三聚体包括3个受体结合位点，其基本上是等价的，并且其由/在位于TNF三聚体内的2个TNF单体的接触面上形成。例如，本文所述的纳米体、蛋白或多肽优选地针对和/或可以结合TNF-α的表位，其包括下列TNF-α的氨基酸残基：位置88的Gln，位置90的Lys，和/或位置146的Glu。
特别地，本文所述的纳米体、蛋白或多肽针对和/或可以结合TNF-α三聚体的表位，其位于和/或形成部分TNF受体结合位点。例如，本文所述的纳米体、蛋白或多肽可以针对和/或可以结合TNF-α三聚体的表位，其包括下列氨基酸残基：第一个TNF单体(本文叫作“单体A”)上位置88的Gln，和位置90的Lys，以及第二个TNF单体(本文叫作“单体B”)上位置146的Glu(其中单体A和单体B在TNF三聚体中一起形成TNF受体结合位点)。
更具体地，本文所述的纳米体、蛋白或多肽针对和/或可以结合TNF-α三聚体的表位，其包括上文提及的氨基酸(单体A中位置88的Gln；单体A中位置90的Lys和单体B中位置146的Glu)，并且另外包括TNF-α 单体A的下列氨基酸残基的至少一个、优选地2个或多个、更优选地5个或多个、并且优选地全部或基本上全部：位置24的Gly，位置25的Gln，位置72的Thr，位置73的His，位置74的Val，位置75的Leu，位置77的Thr，位置79的Thr，位置83的Ile，位置89的Thr，位置91的Val，位置92的Asn，位置97的Ile，位置131的Arg，位置135的Glu，位置136的Ile，位置137的Asn，位置138的Arg，位置139的Pro，位置140的Asp和单体B中的下列残基：位置20的Pro，位置32的Arg，位置65的Lys，位置112的Lys，位置115的Tyr，位置145的Ala，位置147的Ser。
备选地，本文所述的纳米体、蛋白或多肽针对和/或可以结合TNF-α的表位，其包括上文提及的氨基酸(单体A中位置88的Gln；单体A中位置90的Lys和单体B中位置146的Glu)，并且另外包括TNF-α单体A的下列氨基酸残基的至少一个、优选地2个或多个、更优选地5个或多个、并且优选地全部或基本上全部：位置75的Leu，位置77的Thr，位置79的Thr，位置80的Ile，位置81的Ser，位置87的Tyr，位置89的Thr，位置91的Val，位置92的Asn，位置95的Ser，位置97的Ile，位置135的Glu，位置136的Ile，位置137的Asn以及单体B的下列残基：位置33的Ala，位置145的Ala，位置147的Ser。
所述表位可以通过与TNF分子复合结晶的纳米体的结构分析，或者通过其它途径诸如通过肽扫描分析进行的表位绘图而进行描绘。
通过比较，从结晶数据(未显示)可以看出WO 04/041862的纳米体3E结合与本发明优选的表位不同的表位(即，包括位置141的Tyr，位置140的Asp，位置67的Gln，位置24的Gly和位置23的Glu的表位)。
因此，另一方面，本发明涉及免疫球蛋白可变结构域(或其适当的部分)，其可以结合位于和/或形成部分TNF受体结合位点的TNF-α的表位，并且优选地结合这样的表位，即，所述表位包括下列TNF-α氨基酸残基中的至少1个、优选地2个或多个、并且优选地全部：位置88的Gln；位置90的Lys和位置146的Glu。这样的免疫球蛋白可变结构域优选地是重链可变结构域或轻链可变结构域，并且特别是重链可变结构域，其可以是任何哺乳动物的重链可变结构域，包括但不限于人重链可变结构域、小鼠重链可变结构域和骆驼科(Camelid)重链可变结构域(诸如骆驼科4-链免 疫球蛋白的重链可变结构域或所谓的重链抗体的重链可变结构域(VHH结构域))。所述免疫球蛋白可变结构域优选地是结构域抗体或单结构域抗体或者适于用作(单)结构域抗体。最优选地，所述免疫球蛋白可变结构域是纳米体(如本文定义的那样)，并且适合用于本发明这一方面的纳米体的一些优选的但非限制性的实例是PMP1C2(TNF1，SEQ ID NO：52)和PMP5F10(TNF3，SEQ ID NO：60)，以及其人源化的和其它变体(如本文进一步所述的那样)。
关于纳米体，前述免疫球蛋白可变结构域还可以是本文所述的人源化的(作为举例，并没有限制)。本发明还涉及包括或者基本上由这样的免疫球蛋白可变结构域组成的蛋白和多肽，例如，其可以如本文定义的那样。备选地，这样的可变结构域可以形成部分ScFv构建体、双特异性构建体、嵌合抗体或抗体结构以及其它免疫球蛋白构建体，例如，Hoogenboom(Nature Biotechnology(自然生物学技术)(1997)，15：125-126)综述的那些。然而，优选地，针对上述表位的免疫球蛋白可变结构域是纳米体，在这种情形中，包括这样的纳米体的蛋白和多肽可以在本文中进一步描述。
因此，本发明的一些优选的方面涉及：
I)针对TNF-α三聚体上相同的表位的纳米体，纳米体TNF1(SEQ ID NO：52)。
II)针对TNF-α三聚体上相同的表位的纳米体，纳米体TNF3(SEQ ID NO：60)。
III)针对TNF-α三聚体的表位的纳米体，所述表位至少包括下列氨基酸残基：单体A中位置88的Gln；单体A中位置90的Lys和单体B中位置146的Glu。
IV)针对TNF-α三聚体的表位的纳米体，所述表位包括下列氨基酸残基：单体A中位置88的Gln；单体A中位置90的Lys和单体B中位置146的Glu；并且其还包括至少包括TNF-α单体A下列氨基酸残基中的至少1个、优选地2个或多个、更优选地5个或多个、并且优选地全部或基本上全部：位置24的Gly，位置25的Gln，位置72的Thr，位置73的His，位置74的Val，位置75的Leu，位置77的Thr，位置79的Thr，位置83的Ile，位置89的Thr，位置91的Val，位置92的Asn， 位置97的Ile，位置131的Arg，位置135的Glu，位置136的Ile，位置137的Asn，位置138的Arg，位置139的Pro，位置140的Asp和单体B中的下列残基：位置20的Pro，位置32的Arg，位置65的Lys，位置112的Lys，位置115的Tyr，位置145的Ala，位置147的Ser。
V)针对TNF-α三聚体的表位的纳米体，所述表位包括下列氨基酸残基：单体A中位置88的Gln；单体A中位置90的Lys和单体B中位置146的Glu；并且其还包括TNF-α单体A下列氨基酸残基中的至少1个、优选地2个或多个、更优选地5个或多个、并且优选地全部或基本上全部：位置75的Leu，位置77的Thr，位置79的Thr，位置80的Ile，位置81的Ser，位置87的Tyr，位置89的Thr，位置91的Val，位置92的Asn，位置95的Ser，位置97的Ile，位置135的Glu，位置136的Ile，位置137的Asn以及单体B的下列残基：位置33的Ala，位置145的Ala，位置147的Ser
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其具有这样的关于TNF的Koff速率：好于2.10-3(l/s)，优选地好于1.10-3。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于WO 04/041862中纳米体VHH 3E(SEQ ID NO：4)在相同检测中的EC50值；或者所述纳米体的人源化变体。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于12nM；或者所述纳米体的人源化变体。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于5nM；或者所述纳米体的人源化变体。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于3nM；或者所述纳米体的人源化变体。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其为人源化的纳米体。
并且本实施方案的一些优选的方面涉及：
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其为GLEW-类纳米体。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其为人源化的GLEW-类纳米体。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其在位置103含有精氨酸残基(R)。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其在位置103含有精氨酸残基(R)，并且其是人源化的。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其为GLEW-类纳米体，并且其在位置103含有精氨酸残基(R)，并且其是人源化的。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其在位置108含有亮氨酸残基(L)。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其与氨基酸序列SEQ ID NO’s 52(TNF1)，76(TNF13)，77(TNF14)，95(TNF29)或96(TNF30)之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文定义)。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中
a)CDR1包括：
-氨基酸序列DYWMY；或
-与氨基酸序列DYWMY有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列DYWMY有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
b)CDR2包括：
-氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；或
-与氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以及
c)CDR3包括：
-氨基酸序列SPSGFN；或
-与氨基酸序列SPSGFN有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SPSGFN有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列DYWMY。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中：
-CDR1包括氨基酸序列DYWMY；并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN；或
-CDR1包括氨基酸序列DYWMY；并且CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；或
-CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列DYWMY；并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列DYWMY；CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中
a)CDR1为：
-氨基酸序列DYWMY；或
-与氨基酸序列DYWMY有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的 氨基酸序列；或
-与氨基酸序列DYWMY有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且其中：
b)CDR2为：
-氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；或
-与氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以及其中：
c)CDR3为：
-氨基酸序列SPSGFN；或
-与氨基酸序列SPSGFN有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SPSGFN有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列DYWMY。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中CDR3是氨基酸序列SPSGFN。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中：
-CDR1是氨基酸序列DYWMY；并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN；或
-CDR1是氨基酸序列DYWMY；并且CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；或
-CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列DYWMY；并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列DYWMY；CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中
-任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代；和/或
-与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
并且本实施方案的一些优选的方面涉及：
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其为KERE-类纳米体。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其为人源化的KERE-类纳米体。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其与氨基酸序列SEQ ID NO’s 50(TNF3)，83(TNF20)，85(TNF21)，85(TNF22)，96(TNF23)或98(TNF33)之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中
a)CDR1为：
-氨基酸序列NYYMG；或
-与氨基酸序列NYYMG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列NYYMG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
b)CDR2为：
-氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；或
-与氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG有至少80％、优选 地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以及
c)CDR3为：
-氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY；或
-与氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列NYYMG。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中CDR2是氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中CDR3是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中：
-CDR1是氨基酸序列NYYMG；并且CDR3是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY；或
-CDR1是氨基酸序列NYYMG；并且CDR2是氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；或
-CDR2是氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；并且CDR3是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列NYYMG；CDR2是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY并且CDR3是氨基酸序列ILPLSDDPGWNTY。
-按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其中
-任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代；和/或
-与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
并且仍有一些其它特别优选的方面为：
VI)蛋白或多肽，其包括或者基本上由按照上述I)-V)中任一项的纳米体组成。
VII)蛋白或多肽，其包括或者基本上由至少一种按照上述I)-V)中任一项的纳米体组成。
VIII)蛋白或多肽，其包括两种按照上述I)-V)中任一项的纳米体。
IX)蛋白或多肽，其包括两种按照上述I)-V)中任一项的纳米体，并且其是这样的蛋白或多肽，即，当与TNF三聚体结合时，所述蛋白或多肽能够抑制或者减少由所述TNF三聚体调控的TNF受体交联和/或由这样的受体交联调控的信号传导。
X)蛋白或多肽，其包括两种按照上述I)-V)中任一项的纳米体，并且其能够分子内结合TNF三聚体上的至少两个TNF受体结合位点。
XI)蛋白或多肽，其包括两种按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其通过适当的接头连接。
XII)蛋白或多肽，其包括两种按照上述I)-V)中任一项的纳米体，其通过适当的接头连接，并且其被聚乙二醇化(pegylated)。
XIII)蛋白或多肽，其包括两种按照上述I)-V)中任一项的纳米体，并且其还包括至少一种针对人血清白蛋白的纳米体。
XIV)蛋白或多肽，其包括两种按照上述I)-V)中任一项的纳米体，并且其还包括至少一种针对人血清白蛋白的纳米体，并且其是这样的蛋白或多肽，即，当与TNF三聚体结合时，所述蛋白或多肽能够抑制或者减少由所述TNF三聚体调控的TNF受体交联和/或这样的受体交联调控的信号传导。
XV)蛋白或多肽，其包括两种按照上述I)-V)中任一项的纳米体，并且其还包括至少一种针对人血清白蛋白的纳米体，并且其能够分子内结合TNF三聚体上的至少两个TNF受体结合位点。
XVI)蛋白或多肽，其包括两种按照上述I)-V)中任一项的纳米体，并且其还包括一种针对人血清白蛋白的纳米体，其中按照上述I)-V)中任 一项的两个纳米体的每一种都交联到，任选地通过适宜的接头，针对人血清白蛋白的一种纳米体上。
XVII)蛋白或多肽，其包括两种按照上述I)-V)中任一项的纳米体，并且其还包括一种针对人血清白蛋白的纳米体，其中按照上述I)-V)中任一项的两个纳米体每一种都交联到，任选地通过适宜的接头，针对人血清白蛋白的一种纳米体上，并且其为这样的蛋白或多肽，即，当与TNF三聚体结合时，所述蛋白或多肽能够抑制或者减少由所述TNF三聚体调控的TNF受体交联和/或这样的受体交联调控的信号传导。
XVIII)蛋白或多肽，其包括两种按照上述I)-V)中任一项的纳米体，并且其还包括一种针对人血清白蛋白的纳米体，其中按照上述I)-V)中任一项的两个纳米体每一种都交联到，任选地通过适宜的接头，针对人血清白蛋白的一种纳米体上，并且其能够分子内结合TNF三聚体上的至少两个TNF受体结合位点。
-按照上述VI)-XVIII)中任一项的蛋白或多肽，其中至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是人源化的纳米体。
-按照上述VI)-XVIII)中任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是纳米体ALB 1(SEQ ID NO：63)的人源化变体。
-按照上述VI)-XVIII)中任一项的蛋白或多肽，其中至少一种针对人血清白蛋白的纳米体选自由下列各项组成的组：ALB 3(SEQ ID NO：87)，ALB 4(SEQ ID NO：88)，ALB 5(SEQ ID NO：89)，ALB 6(SEQ ID NO：100)，ALB 7(SEQ ID NO：101)，ALB 8(SEQ ID NO：102)ALB 9(SEQID NO：103)和ALB 10(SEQ ID NO：104)。
-按照上述VI)-XVIII)中任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是ALB 8。
-按照上述VI)-XVIII)中任一项的蛋白或多肽，其包括或者基本上由两种按照上述I)-V)中任一项的人源化纳米体，以及纳米体ALB 1(SEQID NO：63)的一种人源化变体组成。
应该注意，当纳米体按上文提法作为“按照上述I)-V)中任一项(in accordancewith any one of I)to V)above)”时，它是至少按照I)-V) 中的一项，可以按照I)-V)中的两项或多项，并且还可以包括视为“按照上述I)-V)中任一项”的其它方面中的任何一个或多个。类似地，当蛋白或多肽按上文提法作为“按照上述I)-V)中任一项(in accordancewith any one of VI)to XVIII)above)”时，它是至少按照VI)-XVIII)中的一项，可以按照VI)-XVIII)中的两项或多项，并且还可以包括视为“按照上述VI)-XVIII)中任一项”的其它方面中的任何一个或多个。
下列情形也在本发明的范围内，在适用的情形中，本发明的纳米体或多肽可以结合TNF-α的两个或多个抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象。在这样的情形中，本发明的纳米体和/或多肽结合的TNF-α抗原决定簇、表位、部分、结构域或亚基可以是基本相同的(例如，如果TNF-α包含重复的结构基序或者作为多聚体存在)，或者可以是不同的(并且在后一种情形中，本发明的纳米体和多肽可以以可能相同或不同的亲和力和/或特异性与TNF-α的这样不同的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基相结合)。并且，例如，当TNF-α以活化的构象和以无活性构象存在时，本发明的纳米体和多肽可以结合这些构象的任一种，或者可以结合这两种构象(即，以可能相同或不同的亲和力和/或特异性结合)。并且，例如，本发明的纳米体和多肽可以结合这样的TNF-α构象，即在其中它与相关配体结合，可以结合这样的TNF-α构象，即在其中它不与相关配体结合，或者可以结合这两种构象(也是以可能相同或不同的亲和力和/或特异性结合)。
还期望本发明的纳米体和多肽广泛地结合所有天然存在的或合成的TNF-α类似物、变体、突变体、等位体、部分和片段，或者至少结合TNF-α的这些类似物、变体、突变体、等位体、部分和片段，所述类似物、变体、突变体、等位体、部分和片段包含与本发明的纳米体和多肽在TNF-α中(例如，在野生型TNF-α中)结合的抗原决定簇或表位基本上相同的一个或多个抗原决定簇或表位。此外，在这样的情形中，本发明的纳米体和多肽可以结合这样的类似物、变体、突变体、等位体、部分和片段，其以与本发明的纳米体结合(野生型)TNF-α的亲和力和特异性相同或不同(即，高于或低于)的亲和力和/或特异性结合。本发明的纳米体和多肽结合一些TNF-α类似物、变体、突变体、等位体、部分和片段， 而不结合其它的，这也包括在本发明的范围内。
一般地，本发明的纳米体和多肽至少结合这些形式(包括单体、多聚体及相关的形式)，所述形式从生物学和/或治疗观点来看是最相关的，这对于熟练的技术人员是清楚的。
此外，由于TNF-α以单体形式和多聚体形式存在，并且特别以三聚体形式存在，所以下述也在本发明范围内：本发明的纳米体和多肽只结合单体形式的TNF-α，或者本发明的纳米体和多肽另外还结合一种或多种这样的多聚体形式，诸如TNF的三聚体形式；或者可以只结合这样的多聚体(例如，三聚体)形式。因此，一般地，在本叙述中当提及针对TNF-α的纳米体、蛋白或多肽时，应该理解这还包括针对以其三聚体形式存在的TNF-α的纳米体(包括但不限于针对这样的三聚体的受体结合位点(例如，用于TNF-RI，THF-RII的结合位点，也叫作p55或p75)的纳米体)。在所有这些情形中，本发明的纳米体和多肽可以结合这样的多聚体或缔合的蛋白复合物，其以与本发明的纳米体和多肽与单体和非缔合状态的TNF-α结合的亲和力和/或特异性可能相同或不同(即，高于或低于)的亲和力和/或特异性而结合。
此外，一般地，包含两个或多个针对TNF-α的纳米体的本发明的多肽可以以比相对应的一个或多个单体纳米体更高的亲和力结合。
例如，并且没有局限性，包含两个或多个针对TNF-α多价(如本文所定义那样)蛋白或多肽的不同表位的纳米体的多价(如本文所定义那样)蛋白或多肽可以以比相对应的单体更高的亲和力结合TNF-α，所述TNF-α多价蛋白或多肽包含两个或多个针对不同TNF-α表位的纳米体。
更重要地，包含两个或多个针对TNF-α的纳米体的多价(如本文所定义那样)蛋白或多肽可以(并且通常应该)以比TNF-α单体更高的亲和力结合TNF-α多聚体，并且通常还应该以比相对应的单体纳米体更高的亲和力结合。在这样的多价蛋白或多肽中，例如，所述两个或多个纳米体可以针对相同的表位、基本上等价的表位或不同的表位。在这样的多价蛋白或多肽的一个实施方案中，所述两个或多个纳米体可以是相同的(并且因此针对相同的表位)。
由于已知通过TNF的信号传导的初级模式包括TNF受体与TNF分 子三聚体的交联，所述TNF分子三聚体包含3个受体结合位点(例如参见Peppel等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)，174(1991)，1483-1489；Engelmann等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，265(1990)，14497；Smith和Baglioni，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，264(1989)，14646)，所以后者特别重要。例如，如Peppel等所述那样，与单价胞外结构域相比，TNF受体的工程单价胞外结构域——其仅能够阻滞TNF三聚体上的单个受体结合位点——不能防止TNF受体与其余两个受体结合位点的交联；而包括两个这样的胞外结构域的工程蛋白——因此能够阻滞两个受体结合位点——提供了显著的功效。
在本发明中，已经发现，在体外模型中，在细胞模型中以及在先体外后体内模型中，所述单价纳米体能够以TNF活性减小的这样的方式结合TNF-α(参见下文实验部分)。尽管本发明不受限于任何具体的机制、解释或者假说，但是假设，由于它们小的大小和针对TNF-α的高亲和力，两个或三个本发明的单价纳米体能够同时占据TNF三聚体上的两个或三个不同的受体结合位点，因此防止所述三聚体起始受体交联并且由此而起始信号传导(然而，并不排除其它作用机制：例如，取决于其所针对的表位，本发明的纳米体还可以抑制TNF缔合成三聚体状态)。
还应该注意，除了结合单一TNF-三聚体上的两个或多个受体结合位点之外或者作为备选，包括或者基本上由针对TNF-α表位的两个或多个免疫球蛋白可变结构域(或其适当的片段)组成的本发明的蛋白或多肽可以结合(例如分子间地结合)在两个分开的TNF-α分子(例如，两个分开的三聚体)上的表位。
然而，按照一个特别优选的实施方案，本发明涉及这样的蛋白或多肽，即，其包括或基本上由两种或多种免疫球蛋白可变结构域(或其适当的片段)组成，所述免疫球蛋白可变结构域(或其适当的片段)的每一种都针对TNF-α上(并且特别是TNF-α三聚体上)的表位，所述表位位于和/或形成TNF三聚体受体结合位点的部分，以致当与TNF三聚体结合时，所述多肽能够抑制或者减少由所述TNF三聚体调控的TNF受体交联和/或由这样的受体交联调控的信号传导。
特别地，按照这一优选的实施方案，本发明涉及这样的蛋白或多肽， 即，其包括或基本上由两种或多种免疫球蛋白可变结构域(或其适当的片段)组成，所述免疫球蛋白可变结构域(或其适当的片段)的每一种都针对TNF-α上(并且特别是TNF-α三聚体上)的表位，所述表位位于和/或形成TNF三聚体受体结合位点的部分，其中所述免疫球蛋白可变结构域以蛋白或多肽能够同时结合单一TNF三聚体上的两个或多个受体结合位点(换言之，能够分子内结合TNF三聚体上的至少两个TNF受体结合位点)的这样的方式彼此交联。在这一实施方案中，所述两种或多种免疫球蛋白可变结构域优选地如上文定义，并且最优选地是纳米体(以致所述蛋白或多肽是多价纳米体构建体，如本文进一步所述)。此外，在这一实施方案中，所述两种或多种免疫球蛋白可变结构域可以是相同的或不同的；并且可以针对TNF受体结合位点中的不同表位，但是优选地针对相同的表位。
在这一实施方案的一个优选的方面，所述两种或多种免疫球蛋白可变结构域针对TNF-α三聚体的表位，其表位位于和/或形成TNF受体结合位点的部分。例如，所述两种或多种免疫球蛋白可变结构域优选地针对和/或可以结合TNF-α三聚体的表位，所述表位包括下列氨基酸残基：第一个TNF单体(本文叫作“单体A”)上位置88的Gln和位置90的Lys，以及第二个TNF单体(本文叫作“单体B”)上位置146的Glu(其中在TNF三聚体中单体A和单体B一起形成TNF受体结合位点)。
正如下文参考纳米体更详细的描述那样，在这样的蛋白或多肽中，所述至少两个免疫球蛋白可变结构域优选以这样的方式连接，即，在这样的蛋白或多肽中存在的两个免疫球蛋白可变结构域的N端和C端之间的距离优选地至少为50埃，并且更优选地在55-200埃区间，并且更优选地在埃区间，并且特别是65-150埃区间。
在这一实施方案的一个特别优选的方面，这两个或多个免疫球蛋白序列是纳米体，并且优选地选自本文所述的纳米体。用于本发明的这一实施方案的一些特别优选的纳米体是PMP1C2(TNF1，SEQ ID NO：52)和/或PMP5F10(TNF3，SEQ ID NO：60)，以及其人源化的和其它变体(如本文所述)；其中PMP1C2(TNF1，SEQ ID NO：52)及其人源化变体是特别优选的。
因此，现在将参考纳米体更详细地描述本实施方案。然而，技术人员应该清楚，本文的教导可以类似地应用到免疫球蛋白可变结构域。
在本发明的这一实施方案中，所述两个或多个免疫球蛋白序列通常通过一个或多个适宜的接头连接，所述接头是这样的，即，每一个免疫球蛋白序列可以结合在同一TNF三聚体上的不同受体结合位点。适宜的接头尤其取决于TNF三聚体上免疫球蛋白序列结合的表位(之间的距离)，并且基于本文的内容，可选地在一些有限程度的常规实验后，这对于技术人员是显而易见的。例如，当所述两个或多个免疫球蛋白序列是(单一)结构域抗体或纳米体时，适宜的接头可以选自本文所述的接头，但是其具有这样的接头长度，即，所述两个或多个(单一)结构域抗体或纳米体可以分别结合到同一TNF三聚体上的不同的受体结合位点。
此外，当结合到TNF-α的受体结合位点的两个或多个免疫球蛋白序列是(单一)结构域抗体或纳米体时，它们还可以通过第三(单一)结构域抗体或纳米体彼此连接(其中所述两个或多个免疫球蛋白序列可以直接与第三(单一)结构域抗体/纳米体连接或者通过适宜的接头连接)。例如，这样的第三(单一)结构域抗体或纳米体可以是提供增加的半衰期的(单一)结构域抗体或纳米体，如本文进一步所述。例如，后者(单一)结构域抗体或纳米体可以是能够结合(人)血清蛋白诸如(人)血清白蛋白的(单一)结构域抗体或纳米体，如本文进一步所述。
备选地，与TNF-α的受体结合位点结合的所述两个或多个免疫球蛋白序列可以串连连接(直接地或者通过适宜的接头)，并且所述第三(单一)结构域抗体或纳米体(其可以提供增加的半衰期，如上文所述)可以直接或者通过适宜的接头与这两个或多个前文提及的免疫球蛋白序列之一连接。这样的构建体的一些非限制性实例是SEQ ID NOS：93或94的构建体。
特别地，本发明已经发现(参见本文的结晶学数据)，当存在于本发明的多价或多特异性蛋白或多肽中的纳米体与上述特异性表位(其为TNF1及其人源化变体的表位，以及TNF3及其人源化变体的表位)相结合时，那么优选地，在这样的蛋白或多肽中存在的两个(或多个)抗-TNF纳米体应该以这样的方式连接，即，在这样的蛋白或多肽中存在的两个抗-TNF纳米体的N端和C端之间的距离应该优选地为至少50埃，并且更 优选地在55-200埃区间，并且特别在65-150埃区间(上限较不严格，并且可以出于便利的缘故进行选择，例如，考虑到蛋白的表达/生产)；或者更普遍地，所述距离应该是这样的，即，其允许蛋白或多肽进行分子内结合TNF-三聚体(即，取代分子间结合)。两个抗-TNF纳米体的N端和C端的距离可以通过任何适宜的方法确定，诸如通过结晶学或分子建模(如本文所述)。这些技术通常还使得确定特异的多价或多特异性蛋白或多肽是否能够提供分子内建模成为可能。备选地，本发明还提供使用大小排阻层析的简单实验(如Santora等，Anal.Biochem.(分析生物化学)，299：119-129所述)，其可以用来确定本发明给出的蛋白或多肽是否(最显著地)提供与TNF-三聚体的分子内结合或者(最显著地)两个或多个TNF-三聚体之间的分子间结合。因此，在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的蛋白或多肽优选是这样的，即，在这一实验中，它最显著地或者基本上专一地导致分子内结合。然而，如上文所强调，应该注意到通过独立的TNF-α分子(例如，三聚体)的分子间结合而运作的本发明的蛋白或多肽也在本发明的范围内。
因此，在另一优选的方面，本发明提供包括至少两个针对TNF-α(并且特别是TNF-α三聚体)的纳米体的多价或多特异性蛋白或多肽，其中所述纳米体优选地针对基本上与纳米体PMP1C2相同的表位(如本文所述)，并且其中所述至少两个纳米体以这样的方式连接，即，至少两个抗-TNF纳米体的N端和C端之间的距离是这样的：所述蛋白或多肽能够进行与TNF-三聚体的分子内结合(如本文所述)。优选地，在这样的蛋白或多肽中，两个抗-TNF纳米体的N端和C端之间的距离为至少50埃，并且更优选地在55-200埃区间，并且特别是65-150埃区间。
在这样的优选蛋白或多肽中，所述两个或多个纳米体可以以任何适当的方式连接，条件是可以获得在至少两个抗-TNF纳米体的N端和C端之间的优选距离，和/或条件是所述蛋白或多肽能够进行与TNF-单聚体的分子内结合(如本文所述)。
例如，在其最简单的形式中，所述至少两个纳米体通过适宜的接头或间隔直接连接，所述接头或间隔提供至少两个抗-TNF纳米体的N端和C端的优选距离，并且其可以允许所述蛋白或多肽进行与TNF-三聚体的分 子内结合(如本文所述)。本文描述了适宜的接头，并且可以——例如并且没有限制——包括一种氨基酸序列，其中氨基酸序列优选地具有14个氨基酸的长度，更优选地至少17个氨基酸，诸如约20-40个氨基酸序列(对于每一氨基酸使用3.5埃的平均距离，其分别对应49埃、59.5埃和约70埃的接头距离；基于上文提及的距离，以相同方式计算氨基酸的最大量)。优选地，这样的氨基酸序列还应该是这样的，即，其允许所述蛋白或多肽进行与TNF-三聚体的分子内结合(如本文所述)。
因此，在另一优选的方面，本发明提供包括至少两个针对TNF-α(并且特别是TNF-α三聚体)的纳米体的多价或多特异性蛋白或多肽，其中所述纳米体优选地针对基本上与纳米体PMP1C2相同的表位(如本文所提及)，并且其中所述至少两个纳米体使用适宜的接头或间隔彼此连接，以致至少两个抗-TNF纳米体的N端和C端之间的距离是这样的：所述蛋白或多肽能够进行与TNF-三聚体的分子内结合(如本文所述)。优选地，在这样的蛋白或多肽中，两个抗-TNF纳米体的N端和C端之间的距离(由此所述接头或间隔的优选长度)为至少50埃，并且更优选地在55-200埃区间，并且特别是65-150埃区间。
更优选地，在这一优选的方面，所述接头或间隔是这样的氨基酸序列，即，其包括至少14个，优选地至少17个，更优选地至少20个氨基酸(具有出于便利缘故而选择的非严格性上限，约50个，并且优选地约40个氨基酸)。在一个优选的但是非限制性实施方案中，所述接头基本上由甘氨酸和丝氨酸残基组成(如下文进一步所述)。例如，一个适宜的接头是本文所述的GS30接头，其包括30个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，所述至少两个针对TNF-α的纳米体通过另一部分(任选地通过一个或两个接头)诸如另一蛋白或多肽而彼此连接。在这一实施方案中，可以理想地在至少两个抗-TNF纳米体的N端和C端之间具有优选的距离(即，如上文提及)，例如，以便蛋白或多肽仍然可以进行与TNF-三聚体的分子内结合(如本文所述)。在这一实施方案中，所述至少两个纳米体可以直接与另一部分连接，或者使用适宜的接头或间隔而连接，条件还是仍然可以获得优选的距离和/或理想的分子内结合。所述部分可以是没有偏离所述蛋白或多肽与TNF的结合和/或所述蛋白或多 肽更理想的生物或药理学特征(太多)的任何适宜的部分。同样地，所述部分可以基本上没有活性，或者可以是生物活性的，并且同样可以或者不可以提高所述蛋白或多肽的理想的特性和/或可以赋予所述蛋白或多肽一种或多种额外的理想特性。例如，并且没有限制地，所述部分可以提高蛋白或多肽的半衰期，和/或可以减小其免疫原性或者提高任何其它理想的特性。在一个优选的实施方案中，所述部分可以是另一种纳米体(包括但不限于针对TNF-α的第三纳米体，尽管这不是必要的并且通常较不优选)，并且特别地是提高蛋白或多肽半衰期的另一种纳米体，诸如针对血清蛋白例如针对人血清蛋白的纳米体。本文描述了这样的蛋白和多肽的实例。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及包括两种或多种免疫球蛋白序列(或其适当的片段)的多价多特异性构建体，其每一种针对TNF-α(例如，TNF-α三聚体)上位于和/或形成受体结合位点的部分的表位，并且其通过提供提高的半衰期的至少一个免疫球蛋白序列(并且任选地通过一个或多个适宜的接头)彼此连接，以致当与TNF三聚体结合时，所述多肽能够抑制或者减少由所述TNF三聚体调控的TNF受体的交联和/或信号传导。这样的多肽可以是这样的，即，以便前文提及的两个或多个免疫球蛋白序列可以分别与TNF三聚体上的不同受体结合位点结合。
特别地，在这一实施方案中，所述多肽可以包括三价双特异性纳米体，其包括每一种分别针对TNF-α(并且特别是TNF-α三聚体)上位于和/或形成受体结合位点的部分的表位的两个纳米体，其中所述纳米体通过提供提高的半衰期的第三纳米体(例如，针对血清蛋白诸如人血清白蛋白的纳米体)彼此连接，其中每一前文提及的两个纳米体可以直接与所述第三纳米体连接或者通过一个或多个适宜的接头连接，以致当与TNF三聚体结合时，所述多肽能够抑制或者减少TNF受体交联和/或由所述TNF三聚体调控的信号传导。这样的多肽可以是这样的，以致前文提及的两个纳米体可以分别与TNF三聚体上的不同受体结合位点结合。此外，用于本发明的这一实施方案的一些特别优选的纳米体是PMP1C2(TNF1，SEQ IDNO：52)和/或PMP5F10(TNF3，SEQ ID NO：60)，以及其人源化的和其它变体(如本文所述)；其中PMP1C2(TNF1，SEQ ID NO：52)及其人源化变体是特别优选的；并且所述纳米体针对本文所述的人血清白蛋白。本发明的 这一实施方案的一些优选的但是非限制性的构建体是TNF24(SEQ IDNO：90)，TNF 26(SEQ ID NO：92)，TNF 27(SEQ ID NO：93)，TNF 28(SEQID NO：94)，TNF 60(SEQ ID NO：417)和TNF 62(SEQ ID NO：418)，其中TNF 60是特别优选的。
因此，本发明的这一实施方案的一些优选方面涉及：
XIX)包括或者基本上由两种或多种免疫球蛋白可变结构域(或其适当的片段)组成的蛋白或多肽，所述免疫球蛋白可变结构域(或其适当的片段)每一种针对TNF-α(并且特别是TNF-α三聚体)上位于和/或形成TNF三聚体的受体结合位点的部分的表位，以致当与TNF三聚体结合时，所述多肽能够抑制或者减少由所述TNF三聚体调控的TNF受体交联和/或由所述受体交联调控的信号传导。
XX)包括或者基本上由两种或多种免疫球蛋白可变结构域(或其适当的片段)组成的蛋白或多肽，所述免疫球蛋白可变结构域(或其适当的片段)每一种针对TNF-α(并且特别是TNF-α三聚体)上位于和/或形成TNF三聚体的受体结合位点的部分的表位，以致所述多肽能够分子内结合TNF三聚体上的至少两个TNF受体结合位点。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述免疫球蛋白可变结构域以这样的方式彼此连接，即，所述蛋白或多肽能够同时结合单一TNF三聚体上的两个或多个受体结合位点。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述免疫球蛋白可变结构域能够结合与纳米体TNF1(SEQ ID NO：52)相同的表位。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述免疫球蛋白可变结构域能够结合TNF三聚体的TNF受体结合位点内的表位，所述表位包括下列氨基酸残基：单体A中位置88的Gln；单体A中位置90的Lys和单体B中位置146的Glu。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述免疫球蛋白可变结构域能够结合TNF三聚体的TNF受体结合位点内的表位，所述表位至少包括下列氨基酸残基：单体A中位置88的Gln；单体A中位置90的Lys和单体B中位置146的Glu；并且其还包括TNF-α单体A的下列氨基酸残基的至少1个、优选地2个或多个、更优选地5 个或多个、并且优选地全部或基本上全部：位置24的Gly，位置25的Gln，位置72的Thr，位置73的His，位置74的Val，位置75的Leu，位置77的Thr，位置79的Thr，位置83的Ile，位置89的Thr，位置91的Val，位置92的Asn，位置97的Ile，位置131的Arg，位置135的Glu，位置136的Ile，位置137的Asn，位置138的Arg，位置139的Pro，位置140的Asp，以及单体B中的下列残基：位置20的Pro，位置32的Arg，位置65的Lys，位置112的Lys，位置115的Tyr，位置145的Ala，位置147的Ser。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述免疫球蛋白可变结构域能够结合TNF三聚体的TNF受体结合位点内的表位，其至少包括下列氨基酸残基：单体A中位置88的Gln；单体A中位置90的Lys和单体B中位置146的Glu；并且其还包括TNF-α单体A的下列氨基酸残基的至少1个、优选地2个或多个、更优选地5个或多个、并且优选地全部或基本上全部：位置75的Leu，位置77的Thr，位置79的Thr，位置80的Ile，位置81的Ser，位置87的Tyr，位置89的Thr，位置91的Val，位置92的Asn，位置95的Ser，位置97的Ile，位置135的Glu，位置136的Ile，位置137的Asn，以及单体B中的下列残基：位置33的Ala，位置145的Ala，位置147的Ser。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述至少两种免疫球蛋白可变结构域以这样的方式连接，即，在这样的蛋白或多肽中存在的第一免疫球蛋白可变结构域的N端和第二免疫球蛋白可变结构域的C端之间的距离为至少50埃。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中第一免疫球蛋白可变结构域的N端和第二免疫球蛋白可变结构域的C端之间的距离为55-200埃。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中第一免疫球蛋白可变结构域的N端和第二免疫球蛋白可变结构域的C端之间的距离为65-150埃。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域通过接头或间隔彼此连接。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述接头或间隔是氨基酸序列。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述接头或间隔包括至少14个氨基酸残基。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述接头或间隔包括至少17-50个氨基酸残基。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述接头或间隔基本上由甘氨酸和丝氨酸残基组成。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述接头或间隔是GS30(SEQ IDNO：69)。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域通过另一部分彼此连接。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述其它部分是蛋白或多肽部分。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述其它部分赋予所述蛋白或多肽至少一种理想的特性，或者提高所述蛋白或多肽的至少一种理想的特性。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述其它部分提高所述蛋白和/或多肽的半衰期和/或减小所述蛋白或多肽的免疫原性。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域的每一种通过接头或间隔与所述其它部分连接。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述接头或间隔是氨基酸序列。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述接头或间隔基本上由甘氨酸和丝氨酸残基组成。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述其它部分是纳米体。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述其它部分是针对人血清白蛋白的纳米体。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对 人血清白蛋白的纳米体是人源化的纳米体。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是纳米体ALB 1(SEQ ID NO：63)的人源化的变体。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体选自由下列各项组成的组：ALB 3(SEQ IDNO：87)，ALB 4(SEQ ID NO：88)，ALB 5(SEQ ID NO：89)，ALB 6(SEQ ID NO：100)，ALB 7(SEQ ID NO：101)，ALB 8(SEQ ID NO：102)ALB 9(SEQ ID NO：103)和ALB 10(SEQ ID NO：104)。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是ALB 8。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是纳米体。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是具有优于2.10-3(l/s)、优选地优于1.10-3(l/s)的对于TNF的Koff速率的纳米体；或者这样的纳米体的人源化变体。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是这样的纳米体，即，所述纳米体在WO04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于WO 04/041862的纳米体VHH 3E(SEQIDNO：4)在相同检测中的EC50值；或者这样的纳米体的人源化变体。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是这样的纳米体，即，所述纳米体在WO04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于12nM；或者这样的纳米体的人源化变体。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是这样的纳米体，即，所述纳米体在WO04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的 检测中所具有的EC50值好于5nM；或者这样的纳米体的人源化变体。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是这样的纳米体，即，所述纳米体在WO04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于3nM；或者这样的纳米体的人源化变体。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是按照上述XIX)-XX)中任一项的纳米体，其是人源化的；
这一实施方案的一些特别优选的方面为：
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是GLEW-类纳米体。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是在位置103具有精氨酸残基(R)的纳米体。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是在位置103具有精氨酸残基(R)的GLEW-类纳米体。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是与氨基酸序列SEQ ID NO’s 52(TNF1)，76(TNF13)，77(TNF14)，95(TNF29)或96(TNF30)之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的纳米体(如本文所定义)。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中：
a)CDR1包括：
-氨基酸序列DYWMY；或
-与氨基酸序列DYWMY有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的 氨基酸序列；或
-与氨基酸序列DYWMY有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
b)CDR2包括：
-氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；或
-与氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以及
c)CDR3包括：
-氨基酸序列SPSGFN；或
-与氨基酸序列SPSGFN有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SPSGFN有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
-按照上述XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列DYWMY。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述 的纳米体，其中：
-CDR1包括氨基酸序列DYWMY；并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN；或者
-CDR1包括氨基酸序列DYWMY；并且CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；或者
-CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列DYWMY；并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列DYWMY；CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG，并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中
a)CDR1为：
-氨基酸序列DYWMY；或
-与氨基酸序列DYWMY有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列DYWMY有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且其中：
b)CDR2为：
-氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；或
-与氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有至少80％、优选 地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且其中：
c)CDR3为：
-氨基酸序列SPSGFN；或
-与氨基酸序列SPSGFN有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SPSGFN有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
-按照上XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR1是基酸序列DYWMY。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR2是基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR3是基酸序列SPSGFN。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中：
-CDR1是氨基酸序列DYWMY；并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN；或
-CDR1是氨基酸序列DYWMY；并且CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；或
-CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列DYWMY；并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列DYWMY；CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG，和CDR3是氨基酸序列SPSGFN。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中
-任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代；和/或
-与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域选自由下列各项组成的组：纳米体TNF 1(SEQ IDNO：52)和纳米体TNF 1(SEQ ID NO：52)的人源化变体。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域选自由下列各项组成的组：TNF 13(SEQ ID NO：76)，TNF 14(SEQ ID NO：77)，TNF 29(SEQ ID NO：95)和TNF 30(SEQ IDNO：96)。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是TNF 30(SEQ ID NO：96)；
并且这一实施方案的一些特别优选的方面为：
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是KERE-类纳米体。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是与氨基酸序列SEQ ID NO’s 50(TNF3)，83(TNF20)，85(TNF21)，85(TNF22)，96(TNF23)或98(TNF33)之一有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序 列相同性的纳米体(如本文所定义)。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中：
a)CDR1包括：
-氨基酸序列NYYMG；或
-与氨基酸序列NYYMG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列NYYMG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
b)CDR2包括：
-氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；或
-与氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以及
c)CDR3包括：
-氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY；或
-与氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列NYYMG。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR2包括氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR3包括氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中：
-CDR1包括氨基酸序列NYYMG；并且CDR3包括氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY；或
-CDR1包括氨基酸序列NYYMG；并且CDR2包括氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；或
-CDR2包括氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；并且CDR3包括氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列NYYMG；CDR2包括氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY，和CDR3包括氨基酸序列ILPLSDDPGWNTY(SEQ ID NO：436)。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中：
a)CDR1为：
-氨基酸序列NYYMG；或
-与氨基酸序列NYYMG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列NYYMG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
b)CDR2为：
-氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；或
-与氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以及
c)CDR3为：
-氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY；或
-与氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列NYYMG。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR2是氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR3是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中：
-CDR1是氨基酸序列NYYMG；并且CDR3是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY；或
-CDR1是氨基酸序列NYYMG；并且CDR2是氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；或
-CDR2是氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；并且CDR3是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列NYYMG；CDR2是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY，和CDR3是氨基酸序列ILPLSDDPGWNTY。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域是如对于按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽所述的纳米体，其中
-任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代；和/或
-与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域选自由下列各项组成的组：纳米体TNF 3(SEQ IDNO：60)和纳米体TNF3(SEQ ID NO：60)的人源化变体。
-按照XIX)-XX)中任一项的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可变结构域选自由下列各项组成的组：TNF20(SEQ ID NO：83)，TNF21(SEQ ID NO：84)，TNF 22(SEQID NO：85)，TNF23(SEQ IDNO：86)或TNF33(SEQ ID NO：99)。
应该注意，当蛋白或多肽按上文提法作为“按照上述XIX)-XX)中任一项(inaccordance with any one of XIX)to XX)above)”时，它是至少按照XIX)-XX)中的一项，可以按照XIX)-XX)中的两项，并且还可以包括视为“按照上述XIX)-XX)中任一项”的其它方面中的任何一个或多个。
然而，应该注意，本发明不局限于任何具体的作用机制或假说。特别地，已经发现本发明的单价纳米体还可以在本文所述的检测和模型中有活性，这证实尽管在本发明的一个具体实施方案中优选，但是TNF三聚体的分子内结合不需要以获得本文所述的纳米体、蛋白和多肽的理想的作用 和效果。类似地，本文所述的蛋白和多肽通过任何适当的机制(即，通过分子内结合，分子间结合，或者甚至通过与单聚体TNF结合，由此抑制TNF三聚体的形成)实现它们的理想作用，这也包含在本发明范围内。
以下也在本发明的范围内：应用本发明的纳米体和多肽的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位体和/或衍生物，和/或应用包括或基本上由其组成的蛋白或多肽，条件是这些适于本文设想的应用。这样的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位体、衍生物、蛋白和/或多肽将在本文中进一步描述。
另一方面，本发明涉及针对TNF-α的纳米体(如本文所定义)，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
(i)CDR1是这样的氨基酸序列，其选自由SEQ ID NOS：15-21的CDR1序列组成的组或者选自由SEQ ID NOS：164-197的CDR1序列组成的组；
或者选自由与SEQ ID NOS：15-21组成的组的至少一种CDR1序列或SEQ ID NOS：164-197组成的组的至少一种CDR1序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与SEQ ID NOS：15-21组成的组的至少一种CDR1序列或SEQ ID NOS：164-197组成的组的至少一种CDR1序列有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，
其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
(ii)CDR2是这样的氨基酸序列，其选自由SEQ ID NOS：22-28的CDR2序列组成的组或者选自由SEQ ID NOS：232-265的CDR2序列组成的组；
或者选自由与SEQ ID NOS：22-28组成的组的至少一种CDR2序列或SEQ ID NOS：232-265组成的组的至少一种CDR2序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与SEQ ID NOS：22-28组成的组的至少一种CDR2序列或SEQ ID NOS：232-265组成的组的至少一种CDR2序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
(iii)CDR3是这样的氨基酸序列，其选自由SEQ ID NOS：29-33的CDR3序列组成的组或者选自由SEQ ID NOS：300-333的CDR3序列组成的组；
或者选自由与SEQ ID NOS：29-33组成的组的至少一种CDR3序列或SEQ ID NOS：300-333组成的组的至少一种CDR3序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与SEQ ID NOS：300-333组成的组的至少一种CDR3序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
或者选自由与SEQ ID NOS：34和35的CDR3序列组成的组或者选自与SEQ ID NOS：34和35的至少一种CDR3序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自与SEQ ID NOS：34和35的至少一种CDR3序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
上述以及下文进一步描述的针对TNF-α的纳米体在本文中还叫作本发明的纳米体。
在本发明的纳米体中，特别优选包括一个或多个上文明确列出的CDR’s的纳米体；更特别优选包括两个或多个上文明确列出的CDR’s的纳米体；并且最特别优选包括三个上文明确列出的CDR’s的纳米体。
在下表I中可以看出一些CDR序列的特别优选的但非限制性的结合，其列出在许多优选的(但是非限制性的)本发明纳米体中存在的CDR’s和构架序列。熟练的技术人员应该清楚，存在于同一克隆中的CDR1、CDR2和CDR3序列的结合(即，在表I中在同一行提到的CDR1、CDR2和CDR3序列)通常是优选的(尽管本发明在其最广泛意义上不限于此，并且还包括表I中提及的CDR序列的其它适当的结合)。
此外，在包括表I提及的CDR’s结合的本发明纳米体中，每一CDR可以被选自由与所提及的CDR’s有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组的CDR所取代；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与所提及的CDR(s)上述氨基酸序列之一有3个、2个或者只有1个(如在前述段落中所指示)“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
然而，熟练的技术人员应该清楚，表I中提及的CDR序列(的结合)通常是优选的。
因此，在本发明的纳米体中，至少一种存在的CDR1、CDR2和CDR3序列适当地分别选自由表I中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组；或者分别选自分别与表I中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列的至少一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的“序列相同性”(如本文所定义)的CDR1、CDR2和CDR3序列的组；和/或分别选自由分别与表I中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列的至少一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组，。在本申请上下文中，“适当地选择”意指，适用地，分别地，CDR1序列选自适当的CDR1序列(即，如本文所定义)，CDR2序列选自适当的CDR2序列(即，如本文所定义)，以及CDR3序列选自适当的CDR3序列(即，如本文所定义)。
特别地，在本发明的纳米体中，至少存在的CDR3序列适当地选自由表I列出的CDR3序列组成的组，或者选自与表I列出的至少一种CDR3序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR3序列组；和/或选自由与表I列出的至少一种CDR3序列有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR3序列组成的组。
优选地，在本发明的纳米体中，至少两种存在的CDR1、CDR2和CDR3序列适当地分别选自由表I中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组；或者分别选自由分别与表I中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列的至少一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组；和/或分别选自由分别与表I中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列的至少一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组，。
特别地，在本发明的纳米体中，至少存在的CDR3序列适当地选自由表I列出的CDR3序列组成的组，或者选自分别与表I列出的至少一种CDR3序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR3序列组；并且至少一种存在的 CDR1和CDR2序列适当地分别选自由表I列出的CDR1和CDR2序列组成的组，或者分别选自分别与表I列出的至少一种CDR1和CDR2序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR1和CDR2序列组；和/或分别选自由分别与表I列出的至少一种CDR1和CDR2序列有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR1和CDR2序列组成的组。
最优选地，在本发明的纳米体中，所有三种存在的CDR1、CDR2和CDR3序列都适当地分别选自由表I列出的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组，或者分别选自由分别与表I列出的至少一种CDR1、CDR2和CDR3序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR1、CDR2和CDR3序列组；和/或分别选自由分别与表I列出的至少一种CDR1、CDR2和CDR3序列有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。
甚至更优选地，在本发明的纳米体中，至少一种存在的CDR1、CDR2和CDR3序列适当地分别选自由表I列出的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。优选地，在这一实施方案中，至少一种或者优选地其它两种存在的CDR序列都适当地选自分别与表I列出的至少一种相应的CDR序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR序列；和/或选自由分别与表I列出的至少一种相应的CDR序列有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。
特别地，在本发明的纳米体中，至少存在的CDR3序列适当地选自由表I列出的CDR3组成的组。优选地，在这一实施方案中，存在的CDR1和CDR2序列的至少一种并且优选地二者都适当地分别选自分别与表I列出的CDR1和CDR2序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR1和CDR2序列的组；和/或分别选自由分别与表I列出的CDR1和CDR2序列的至少一种有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR1和CDR2序列组成的组。
甚至更优选地，在本发明的纳米体中，至少两种存在的CDR1、CDR2和CDR3序列适当地分别选自由表I列出的CDR1、CDR2和CDR3序列 组成的组。优选地，在这一实施方案中，其余存在的CDR序列适当地选自与表I列出的至少一种相应的CDR序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR序列的组；和/或选自由与表I列出的至少一种相应序列有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。
特别地，在本发明的纳米体中，至少CDR3序列适当地选自有表I列出的CDR3序列组成的组，并且CDR1序列或CDR2序列适当地分别选自由表I列出的CDR1和CDR2序列组成的组。优选地，在这一实施方案中，其余存在的CDR序列适当地选自与表I列出的至少一种相应的CDR序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR序列的组；和/或选自由与表I列出的相应CDR序列有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。
甚至更优选地，在本发明的纳米体中，所有三种存在CDR1、CDR2和CDR3序列都适当地分别选自由表I列出的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。
此外，通常优选在表I中所列出的CDR’s(即，在表I同一行所提及的那些)的组合。因此，通常优选，本发明纳米体中的CDR是表I提及的CDR序列，或者适当地选自与表I列出的CDR序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR序列的组；和/或选自由与表I列出的CDR序列有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组，至少一种并且优选地其余CDR’s二者都适当地选自属于表I中同一组合(即，在表I同一行提及)的CDR序列，或适当地选自与属于同一组合的CDR序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR序列的组，和/或选自由与属于同一组合的CDR序列有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。上一段落中显示的其它优选方案也适用于表I提及的CDR’s组合。
因此，通过非限制性实例的方式，例如，本发明的纳米体可以包括与表I提及的CDR1序列之一有大于80％的序列相同性的CDR1序列，与表I提及的(但是属于不同的组合)CDR2序列之一有3个、2个或1个 氨基酸差异的CDR2序列，和CDR3序列。
例如，一些优选的本发明的纳米体可以包括：(1)与表I提及的CDR1序列之一有大于80％的序列相同性的CDR1序列；与表I提及的(但是属于不同的组合)CDR2序列之一有3个、2个或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表I提及的(但是属于不同的组合)CDR3序列之一有大于80％的序列相同性的CDR3序列；或者(2)与表I提及的CDR1序列之一有大于80％的序列相同性的CDR1序列；CDR2序列以及表I列出的CDR3序列之一；或者(3)CDR1序列；与表I列出的CDR2序列之一有大于80％序列相同性的CDR2序列；和与表I提及的同所述CDR2序列属于同一组合的CDR3序列有3个、2个或1个氨基酸差异的CDR3序列。
例如，一些特别优选的本发明的纳米体可以包括：(1)与表I提及的CDR1序列之一有大于80％的序列相同性的CDR1序列；与表I提及的属于同一组合的CDR2序列有3个、2个或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表I提及的属于同一组合的CDR3序列有大于80％的序列相同性的CDR3序列；(2)CDR1序列；表I列出的CDR2序列和表I列出的CDR3序列(其中所述CDR2序列和CDR3序列可以属于不同的组合)。
例如，一些甚至更优选的本发明的纳米体可以包括：(1)与表I提及的CDR1序列之一有大于80％的序列相同性的CDR1序列；表I列出的属于同一组合的CDR2序列；和表I提及的属于不同组合的CDR3序列；或(2)表I提及的CDR1序列；与表I提及的属于同一组合的CDR2序列有3个、2个或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表I列出的属于相同不同组合的CDR3序列有大于80％的序列相同性。
例如，特别优选的本发明的纳米体包括表I提及的CDR1序列，与表I提及的属于同一组合的CDR2序列有大于80％的序列相同性的CDR2序列；和表I提及的属于同一组合的CDR3序列。
在本发明的纳米体中最优选的纳米体中，存在的CDR1、CDR2和CDR3序列适当地分别选自表I列出的CDR1、CDR2和CDR3序列的组合之一。
优选地，当CDR序列适当地选自与表I列出的CDR序列之一有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的 序列相同性(如本文所定义)的CDR序列组时；和/或当CDR序列适当地选自与表I列出的CDR序列之一有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组时：
i)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
ii)与表I列出的CDR序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
按照本发明非限制但是优选的实施方案，本发明纳米体中的CDR序列如上文定义，并且还是这样的，即，所述本发明的纳米体与TNF-α结合，具有10-5-10-12摩尔/升(M)或更小、并且优选地为10-7-10-12摩尔/升(M)或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升(M)的解离常数(KD)，和/或具有至少107M-1、优选地至少108M-1、更优选地至少109M-1诸如至少1012M-1的缔合常数(KA)；并且特别地具有低于500nM、优选地低于200nM、更优选地低于10nM诸如低于500pM的KD。本发明的纳米体针对TNF-α的KD和KA值可以以本质上已知的方式进行测定，例如使用本文所述的检测。
按照本发明另一个优选的但非限制性实施方案，(a)CDR1具有1-12个氨基酸残基的长度，并且通常在2-9个氨基酸残基之间，诸如5个、6个或7个氨基酸残基；和/或(b)CDR2具有13-24个氨基酸残基的长度，并且通常在15-21个氨基酸残基之间，诸如16个和17个氨基酸残基；和/或(c)CDR3具有2-35个氨基酸残基的长度，并且通常在3-30个氨基酸残基之间，诸如6-23个氨基酸残基。
一方面，本发明提供针对TNF-α的纳米体，其比纳米体3E，按照WO04/041862的最佳作用纳米体，作用更好。
更具体地，本发明的这一实施方案的一些优选方面为：
XXI)针对TNF-α的纳米体，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其对于TNF具有优于2.10-3(l/s)的Koff速率，优选地优于1.10-3(l/s)；或这样的纳米体的人源化变体。
XXII)针对TNF-α的纳米体，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3 个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于WO 04/041862的纳米体VHH 3E(SEQ ID NO：4)在相同检测中的EC50值；或这样的纳米体的人源化变体。
XXIII)针对TNF-α的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于12nM；或这样的纳米体的人源化变体。
XXIV)针对TNF-α的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于5nM；或这样的纳米体的人源化变体。
XXV)针对TNF-α的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于3nM；或这样的纳米体的人源化变体；
一些特别优选的方面为：
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其为GLEW-类纳米体。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其在位置103含有精氨酸残基(R)。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其为人源化的纳米体。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其在位置108含有亮氨酸残基(L)。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其与氨基酸序列SEQ ID NO’s 52(TNF1)，76(TNF13)，77(TNF14)，95(TNF29)或96(TNF30)之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中
a)CDR1包括：
-氨基酸序列DYWMY；或
-与氨基酸序列DYWMY有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列DYWMY有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
b)CDR2包括：
-氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；或
-与氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以及
c)CDR3包括：
-氨基酸序列SPSGFN；或
-与氨基酸序列SPSGFN有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SPSGFN有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列DYWMY。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中：
-CDR1包括氨基酸序列DYWMY；并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN；或
-CDR1包括氨基酸序列DYWMY；并且CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；或
-CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；并且CDR3包括 氨基酸序列SPSGFN。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列DYWMY；并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列DYWMY；CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG，并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中
a)CDR1为：
-氨基酸序列DYWMY；或
-与氨基酸序列DYWMY有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列DYWMY有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且其中：
b)CDR2为：
-氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；或
-与氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以及其中：
c)CDR3为：
-氨基酸序列SPSGFN；或
-与氨基酸序列SPSGFN有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SPSGFN有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列DYWMY。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG.
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR3是氨基酸序列SPSGFN。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中：
-CDR1是氨基酸序列DYWMY；并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN；或
-CDR1是氨基酸序列DYWMY；并且CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；或
-CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列DYWMY；并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列DYWMY；CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG，并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中
-任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代；和/或
-与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
并且一些其它特别优选的方面为：
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其为KERE-类纳米体。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其与氨基酸序列SEQ ID NO’s 50(TNF3)，83(TNF20)，85(TNF21)，85(TNF22)，96(TNF23)或98(TNF33)之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中
a)CDR1包括：
-氨基酸序列NYYMG；或
-与氨基酸序列NYYMG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列NYYMG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
b)CDR2包括：
-氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；或
-与氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以及
c)CDR3包括：
-氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY；或
-与氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列NYYMG。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR2包括氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG.
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR3包括氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY.
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中
-CDR1包括氨基酸序列NYYMG；并且CDR3包括氨基酸序列 SILPLSDDPGWNTY；或
-CDR1包括氨基酸序列NYYMG；并且CDR2包括氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；或
-CDR2包括氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；并且CDR3包括氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列NYYMG；CDR2包括氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY，并且CDR3包括氨基酸序列ILPLSDDPGWNTY。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中
a)CDR1为：
-氨基酸序列NYYMG；或
-与氨基酸序列NYYMG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列NYYMG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
b)CDR2为：
-氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；或
-与氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以及
c)CDR3为：
-氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY；或
-与氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列NYYMG。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR2是氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR3是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中：
-CDR1是氨基酸序列NYYMG；并且CDR3是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY；或
-CDR1是氨基酸序列NYYMG；并且CDR2是氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；或
-CDR2是氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；并且CDR3是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列NYYMG；CDR2是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY，并且CDR3是氨基酸序列ILPLSDDPGWNTY。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其中
-任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代；和/或
-与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
-按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其为人源化的纳米体。
并且仍有一些其它特别优选的方面为：
XXVI)蛋白或多肽，其包括或者基本上由按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体组成。
XXVII)蛋白或多肽，其包括两种按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体。
XXVIII)蛋白或多肽，其包括两种按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，并且其是这样的蛋白或多肽，即，当与TNF三聚体结合时，所述蛋白或多肽能够抑制或者减少由所述TNF三聚体调控的TNF受体交联 和/或由这样的受体交联调控的信号传导。
XXIX)蛋白或多肽，其包括两种按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，并且其能够分子内结合TNF三聚体上的至少两个TNF受体结合位点。
XXX)蛋白或多肽，其包括两种按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其通过适当的接头连接。
XXXI)蛋白或多肽，其包括两种按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，其通过适当的接头连接，并且其被聚乙二醇化。
XXXII)蛋白或多肽，其包括两种按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，并且其还包括至少一种针对人血清白蛋白的纳米体。
XXXIII)蛋白或多肽，其包括两种按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，并且其还包括至少一种针对人血清白蛋白的纳米体，并且其是这样的蛋白或多肽，即，当与TNF三聚体结合时，所述蛋白或多肽能够抑制或者减少由所述TNF三聚体调控的TNF受体交联和/或这样的受体交联调控的信号传导。
XXXIV)蛋白或多肽，其包括两种按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，并且其还包括至少一种针对人血清白蛋白的纳米体，并且其能够分子内结合TNF三聚体上的至少两个TNF受体结合位点。
XXXV)蛋白或多肽，其包括两种按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，并且其还包括一种针对人血清白蛋白的纳米体，其中按照XXI)-XXV)中任一项的两个纳米体的每一种都交联到，任选地通过适宜的接头，针对人血清白蛋白的一种纳米体上。
XXXVI)蛋白或多肽，其包括两种按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，并且其还包括一种针对人血清白蛋白的纳米体，其中按照XXI)-XXV)中任一项的两个纳米体每一种都交联到，任选地通过适宜的接头，针对人血清白蛋白的一种纳米体上，并且其为这样的蛋白或多肽，即，当与TNF三聚体结合时，所述蛋白或多肽能够抑制或者减少由所述TNF三聚体调控的TNF受体交联和/或这样的受体交联调控的信号传导。
XXXVII)蛋白或多肽，其包括两种按照XXI)-XXV)中任一项的纳米体，并且其还包括一种针对人血清白蛋白的纳米体，其中按照XXI)-XXV) 中任一项的两个纳米体每一种都交联到，任选地通过适宜的接头，针对人血清白蛋白的一种纳米体上，并且其能够分子内结合TNF三聚体上的至少两个TNF受体结合位点。
-按照XXVI)-XXXVII)中任一项的蛋白或多肽，其中至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是人源化的纳米体。
-按照XXVI)-XXXVII)中任一项的蛋白或多肽，其中至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是纳米体ALB 1(SEQ ID NO：63)的人源化变体。
-按照XXVI)-XXXVII)中任一项的蛋白或多肽，其中至少一种针对人血清白蛋白的纳米体选自由下列各项组成的组：ALB 3(SEQ ID NO：87)，ALB 4(SEQ ID NO：88)，ALB 5(SEQ ID NO：89)，ALB 6(SEQ IDNO：100)，ALB 7(SEQ ID NO：101)，ALB 8(SEQ ID NO：102)ALB 9(SEQ ID NO：103)和ALB 10(SEQ ID NO：104)。
-按照XXVI)-XXXVII)中任一项的蛋白或多肽，其中至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是ALB 8。
-按照XXVI)-XXXVII)中任一项的蛋白或多肽，其包括或者基本上由两种按照XXI)-XXV)中任一项的人源化纳米体，以及纳米体ALB 1(SEQ ID NO：63)的一种人源化变体组成。
应该注意，当纳米体按上文提法作为“按照上述XXI)-XXV)中任一项(inaccordance with any one of XXI)to XX V)above)”时，它是至少按照XXI)-XXV)中的一项，可以按照XXI)-XXV)中的两项或多项，并且还可以包括视为“按照上述XXI)-XXV)中任一项”的其它方面中的任何一个或多个。类似地，当蛋白或多肽按上文提法作为“按照上述XXVI)-XXVII)中任一项(in accordance with any one of XXVI)to XX XVII)above)”时，它是至少按照XXVI)-XXXVII)中的一项，可以按照XXVI)-XXVII)中的两项或多项，并且还可以包括视为“按照上述XXVI)-XXXVII)中任一项”的其它方面中的任何一个或多个。
已发现特别用作抗-TNF纳米体的克隆是克隆PMP1C2(TNF1)。可以从表39中KYM-检测的比较数据看出，TNF1具有优于WO 04/41862所述的最佳单价纳米体(纳米体3E)多于4倍的EC50值，即，对于PMP1C2 的2,466nM相比较于对于3E的12nM(从表39中可以看出，在这一检测中，本发明的所有纳米体TNF1-TNF9都给出比3E更好的EC50值)。在这一点上，还应该注意，WO 04/41862的3E的纳米体属于“KERE类”(如本文所述)，并且因此可以比纳米体PMP1C2(其属于“GLEW类”)更小程度人源化。当纳米体PMP1C2与WO 04/41862的纳米体1A(GLEW-类纳米体，具有与PMP1C2的最高程度的序列相同性(在CDR’s和构架上))相比时，在KYM检测中对于PMP1C2获得的EC50值多于50倍更好，即，对于PMP1C2的2.466nM相比较于对于1A的100nM。
因此，包括一种或多种、优选地任意两种、更优选地全部3种在克隆PMP1C2中存在的CDR’s(或者衍生于其或者与其相对应的CDR序列)的纳米体在本发明中特别优选。并且，这些纳米体优选地属于“103 P，R，S组”(如本文所定义)，并且更优选地在位置103具有R，并且优选地还在位置44-47具有GLEW或GLEW-样序列。并且，当这些纳米体属于“103P，R，S组”时(并且特别当它们在位置103具有R时)，一种优选的但非限制性人源化取代是108Q到108L。这些优选的纳米体中其它优选的但非限制性人源化取代是在本文所示的TNF1人源化变体诸如TNF13、TNF14、TNF 29或TNF30中存在的那些中的一种或多种，这将从TNF1序列和这些人源化序列之间的比较而直接清楚可见。
因此，在本发明特别优选的纳米体中，至少一种存在的CDR1、CDR2和CDR3序列适当地分别选自由CDR1序列SEQ ID NO：164、CDR2序列SEQ ID NO：232和CDR3序列SEQ ID NO：300(即，克隆TNF1中存在的CDR序列)组成的组，或者分别选自分别与CDR1序列SEQ ID NO：164、CDR2序列SEQ ID NO：232和CDR3序列SEQ ID NO：300具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的“序列相同性”(如本文所定义)的CDR1、CDR2和CDR3序列的组；和/或分别选自由分别与CDR1序列SEQ ID NO：164、CDR2序列SEQ ID NO：232和CDR3序列SEQ ID NO：300具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。
优选地，在本发明的这些优选的纳米体中，至少两种存在的CDR1、CDR2和CDR3序列适当地分别选自由CDR1序列SEQ ID NO：164、CDR2 序列SEQ ID NO：232和CDR3序列SEQ IDNO：300(即，克隆TNF1中存在的CDR序列)组成的组，或者分别选自分别与CDR1序列SEQ IDNO：164、CDR2序列SEQ ID NO：232和CDR3序列SEQ ID NO：300具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR1、CDR2和CDR3序列的组；和/或分别选自由分别与CDR1序列SEQ ID NO：164、CDR2序列SEQ ID NO：232和CDR3序列SEQ ID NO：300具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。
更优选地，在本发明的这些优选的纳米体中，所有三种存在的CDR1、CDR2和CDR3序列适当地分别选自由CDR1序列SEQ ID NO：164、CDR2序列SEQ ID NO：232和CDR3序列SEQ IDNO：300(即，克隆TNF1中存在的CDR序列)组成的组，或者分别选自分别与CDR1序列SEQ IDNO：164、CDR2序列SEQ ID NO：232和CDR3序列SEQ ID NO：300具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR1、CDR2和CDR3序列的组；和/或分别选自由分别与CDR1序列SEQ ID NO：164、CDR2序列SEQ ID NO：232和CDR3序列SEQ ID NO：300具有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。
甚至更优选地，在本发明的这些优选的纳米体中，至少一种存在的CDR1、CDR2和CDR3序列适当地分别选自由CDR1序列SEQ ID NO：164、CDR2序列SEQ ID NO：232和CDR3序列SEQ ID NO：300(即，克隆TNF1中存在的CDR序列)组成的组。优选地，在这一实施方案中，至少一种或者优选地其它两种存在的CDR序列都适当地分别选自与CDR1序列SEQ ID NO：164、CDR2序列SEQ ID NO：232和CDR3序列SEQ ID NO：300具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR序列；和/或分别适当地选自由与与CDR1序列SEQ ID NO：164、CDR2序列SEQ ID NO：232和CDR3序列SEQ ID NO：300具有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。
甚至更优选地，在本发明的这些优选的纳米体中，至少两种存在的 CDR1、CDR2和CDR3序列适当地分别选自由CDR1序列SEQ ID NO：164、CDR2序列SEQ ID NO：232和CDR3序列SEQ ID NO：300(即，克隆TNF1中存在的CDR序列)组成的组。优选地，在这一实施方案中，其余存在的CDR序列适当地分别选自与CDR1序列SEQ ID NO：164、CDR2序列SEQ ID NO：232和CDR3序列SEQ ID NO：300具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR序列的组；和/或分别选自由与CDR1序列SEQ ID NO：164、CDR2序列SEQ ID NO：232和CDR3序列SEQ ID NO：300具有3个、2个或只有1个氨基酸差异的的CDR序列组成的组。
本发明特别优选的纳米体分别包括CDR1序列SEQ ID NO：164、CDR2序列SEQ IDNO：232和CDR3序列SEQ ID NO：300(即，克隆TNF1中存在的CDR序列)。
具有上述CDR序列的纳米体优选地具有如本文进一步定义的构架序列。在上述表I中可以看到一些特别优选但非限制性的构架序列的结合。熟练的技术人员应该清楚，存在于同一克隆中的FR1、FR2、FR3和FR4序列(即，表I中同一行提及的FR1、FR2、FR3和FR4序列)的结合通常是优选的(尽管在其最广泛的意义上，本发明不限于此，并且还包括表I提及的构架序列的其它适宜的结合)。
更具体地，本发明的这一实施方案的一些优选的方面为：XXXVIII)针对TNF-α的纳米体，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
a)CDR1包括：
-氨基酸序列DYWMY；或
-与氨基酸序列DYWMY有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列DYWMY有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
b)CDR2包括：
-氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；或
-与氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以及
c)CDR3包括：
-氨基酸序列SPSGFN；或
-与氨基酸序列SPSGFN有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SPSGFN有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
-按照XXXVIII)的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列DYWMY。
-按照XXXVIII)的纳米体，其中CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG。
-按照XXXVIII)的纳米体，其中CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。
-按照XXXVIII)的纳米体，其中：
-CDR1包括氨基酸序列DYWMY；并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN；或
-CDR1包括氨基酸序列DYWMY；并且CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；或
-CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。
-按照XXXVIII)的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列DYWMY；并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。
-按照XXXVIII)的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列DYWMY；CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG，并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。
-按照XXXVIII)的纳米体，其中
-任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代；和/或
-与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
-按照XXXVIII)的纳米体，其为GLEW-类纳米体。
-按照XXXVIII)的纳米体，其在位置103包含精氨酸残基(R)。
-按照XXXVIII)的纳米体，其与氨基酸序列SEQ ID NO’s 52(TNF1)，76(TNF13)，77(TNF14)，95(TNF29)或96(TNF30)之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)。
-按照XXXVIII)的纳米体，其为人源化的纳米体。
-按照XXXVIII)的纳米体，其在位置108包含亮氨酸残基(L)。
-按照XXXVIII)的纳米体，其具有优于2.10-3(l/s)、优选地优于1.10-3(l/s)的对于TNF的Koff速率；或者所述纳米体的人源化变体；
-按照XXXVIII)的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于WO 04/041862的纳米体VHH 3E(SEQ ID NO：4)在相同检测中的EC50值；或者所述纳米体的人源化变体。
-按照XXXVIII)的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于5nM；或者所述纳米体的人源化变体。
-按照XXXVIII)的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于3nM；或者所述纳米体的人源化变体。
XXXIX)针对TNF-α的纳米体，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中
a)CDR1为：
-氨基酸序列DYWMY；或
-与氨基酸序列DYWMY有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的 氨基酸序列；或
-与氨基酸序列DYWMY有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且其中：
b)CDR2为：
-氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；或
-与氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且其中
c)CDR3为：
-氨基酸序列SPSGFN；或
-与氨基酸序列SPSGFN有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SPSGFN有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
-按照XXXIX)的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列DYWMY。
-按照XXXIX)的纳米体，其中CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG。
-按照XXXIX)的纳米体，其中CDR3是氨基酸序列SPSGFN。
-按照XXXIX)的纳米体，其中：
-CDR1是氨基酸序列DYWMY；并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN；或
-CDR1是氨基酸序列DYWMY；并且CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；或
-CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG；并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN。
-按照XXXIX)的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列DYWMY；并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN。
-按照XXXIX)的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列DYWMY；CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG，并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN。
-按照XXXIX)的纳米体，其中：
-任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代；和/或
-与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
-按照XXXIX)的纳米体，其为GLEW-类纳米体。
-按照XXXIX)的纳米体，其在位置103包含精氨酸残基(R)。
-按照XXXIX)的纳米体，其与氨基酸序列SEQ ID NO’s 52(TNF1)，76(TNF13)，77(TNF14)，95(TNF29)或96(TNF30)之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)。
-按照XXXIX)的纳米体，其为人源化的纳米体。
-按照XXXIX)的纳米体，其在位置108含有亮氨酸残基(L)。
-按照XXXIX)的纳米体，其对于TNF具有优于2.10-3(l/s)的Koff速率，优选地优于1.10-3(l/s)；或这样的纳米体的人源化变体。
-按照XXXIX)的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于WO 04/041862的VHH 3E(SEQ ID NO：4)在相同检测中的EC50值，或这样的纳米体的人源化变体。
-按照XXXIX)的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于5nM；或这样的纳米体的人源化变体。
-按照XXXIX)的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于3nM；或这样的纳米体的人源化变体。
-按照XXXIX)的纳米体，其选自由TNF 13(SEQ ID NO：76)，TNF 14 (SEQ ID NO：77)，TNF 29(SEQ ID NO：95)和TNF 30(SEQ ID NO：96)组成的组。
-按照XXXIX)的纳米体，其为TNF 30(SEQ ID NO：96)；
一些其它优选的方面为：
XL)蛋白或多肽，其包括或者基本上由按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体组成。
XLI)蛋白或多肽，其包括或者基本上由至少一种按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体组成。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其包括两种按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其包括两种按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体，并且其为这样的蛋白或多肽，即，当与TNF三聚体结合时，所述蛋白或多肽能够抑制或者减少由所述TNF三聚体调控的TNF受体交联和/或由这样的受体交联调控的信号传导。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其包括两种按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体，并且其能够分子内结合TNF三聚体上的至少两个TNF受体结合位点。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其包括两种按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体，其直接彼此连接或者通过接头彼此连接。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其包括两种按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体，其通过一种氨基酸序列彼此连接。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其包括两种按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体，其通过一种氨基酸序列彼此连接(诸如，没有限制的，包括甘氨酸和丝氨酸残基的氨基酸序列)，所述氨基酸序列包括至少14个氨基酸，更优选地至少17个氨基酸，诸如约20-40个氨基酸(诸如接头GS30)。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其包括或者基本上由多肽TNF7(SEQ IDNO：73)组成，其中纳米体TNF 1都被人源化。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其包括或者基本上由多肽TNF55(SEQ IDNO：419)或TNF 56(SEQ ID NO：420)组成。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其被聚乙二醇化。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其包括两种按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体，并且其是这样的蛋白或多肽，即，当与TNF三聚体结合时，所述蛋白或多肽能够抑制或者减少由所述TNF三聚体调控的TNF受体交联和/或由这样的受体交联调控的信号传导；和/或其为这样的蛋白或多肽，即，所述蛋白或多肽能够分子内结合TNF三聚体上的至少两个TNF受体结合位点，并且所述蛋白或多肽还包括至少一种针对人血清白蛋白的纳米体。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其包括两种按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体，并且所述蛋白或多肽还包括至少一种针对人血清白蛋白的纳米体，其中所述两种按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体通过至少一种针对人血清白蛋白的纳米体彼此连接，并且其中所述两种按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体直接连接到所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体上，或者通过接头连接到所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体上。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其包括两种按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体，并且所述蛋白或多肽还包括至少一种针对人血清白蛋白的纳米体，其中所述两种按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体通过所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体彼此连接，并且其中所述两种按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体直接连接到所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体上，或者通过接头连接到所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体上，其中所述接头是一种氨基酸序列(诸如，没有限制的，包括甘氨酸和丝氨酸残基的接头)，并且特别是包括3-40个氨基酸残基诸如5-15个氨基酸残基的氨基酸序列(诸如接头GS9)。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其包括两种按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体，并且所述蛋白或多肽还包括至少一种针对人血清白蛋白的纳米体，其中所述两种按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体通过所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体彼此连接，并且其中所述两种按照XXXVIII)或XXXIX)的纳米体直接连接到所述至少一种 针对人血清白蛋白的纳米体上，或者通过接头连接到所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体上，并且所述蛋白或多肽是这样的，即，当与TNF三聚体结合时，所述蛋白或多肽能够抑制或者减少由所述TNF三聚体调控的TNF受体交联和/或由这样的受体交联调控的信号传导；和/或所述蛋白或多肽是这样的，即，所述蛋白或多肽能够分子内结合TNF三聚体上的至少两个TNF受体结合位点。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是人源化的纳米体。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是纳米体ALB 1(SEQ ID NO：63)的人源化变体。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体选自由下列各项组成的组：ALB 3(SEQ ID NO：87)，ALB 4(SEQ ID NO：88)，ALB 5(SEQID NO：89)，ALB 6(SEQ ID NO：100)，ALB 7(SEQ ID NO：101)，ALB 8(SEQ ID NO：102)ALB 9(SEQID NO：103)和ALB 10(SEQ ID NO：104)。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是ALB 8。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其包括或基本上由两种按照XL)或XLI)任一项的人源化纳米体和纳米体ALB 1(SEQ ID NO：63)的一种人源化变体组成。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其包括或基本上由多肽TNF24(SEQ ID NO：90)组成，其中纳米体TNF 1以及纳米体ALB1都已经被人源化。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其包括或基本上由两种纳米体TNF 30和一种纳米体ALB 8组成。
-按照XL)或XLI)任一项的蛋白或多肽，其包括或基本上由多肽TNF60(SEQ ID NO：417)组成。
应该注意，当纳米体按上文提法作为“按照XXXVIII”或“按照XXXIX”时，它是至少按照XXXVIII)和/或XXXIX)中的一项，并且还可以包括视为上述“按照XXXVIII)”或“按照XXXIX)”的其它方面中的任何一个 或多个。类似地，当蛋白或多肽按上文提法作为“按照上述XL)或XLI)任一项”时，它是至少按照XL)-XLI)的一项，可以按照VI)-XVIII)中的两项或多项，并且还可以包括视为上述“按照XL)或XLI)任一项”的其它方面中的任何一个或多个。
对于基于上述纳米体TNF 1的纳米体(包括但不限于人源化纳米体)，所述构架序列通常可以是本文所述的，并且优选地如下述：
a)FR1包括或者为：
-氨基酸序列SEQ ID NO：130；或
-与氨基酸序列SEQ ID NO：130有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SEQ ID NO：130只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
b)FR2包括或者为：
-氨基酸序列SEQ ID NO：198；或
-与氨基酸序列SEQ ID NO：198有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SEQ ID NO：198有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以及
c)FR3包括或者为：
-氨基酸序列SEQ ID NO：266；或
-与氨基酸序列SEQ ID NO：266有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SEQ ID NO：266只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
d)FR4包括或者为：
-氨基酸序列SEQ ID NO：334；或
-与氨基酸序列SEQ ID NO：334有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SEQ ID NO：334只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
其中在所述构架序列中存在的氨基酸差异更优选地如本文所述。
针对TNF-α的纳米体形成本发明的另一方面，所述纳米体具有上述构架区(即，类似于TNF1)，并且其中至少一个构架区(诸如任意两个、任意三个或所有四个构架区)已经被人源化。这样的纳米体可以特别具有这样的CDR’s，以致所述纳米体对于TNF具有优于2.10-3(l/s)、特别优于1.10-3(l/s)的Koff速率；和/或具有这样的CDR’s，以致所述纳米体在WO04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于WO 04/041862的纳米体VHH 3E(SEQ IDNO：4)在相同检测中的EC50值；并且特别好于12nM，更特别地好于5nM，甚至更特别地好于3nM。此外，或者备选地，这样的纳米体优选地针对TNF(即，TNF三聚体)与TNF1相同的表位。
特别地，本发明涉及一种针对TNF-α的纳米体，其为针对TNF-α的纳米体的人源化变体，所述针对TNF-α的纳米体具有下述构架序列：FR1：SEQ ID NO：130；FR2：SEQ ID NO：198；FR3：SEQ ID NO：266；和FR4：SEQ ID NO：334。这样的纳米体可以特别具有这样的CDR’s，以致所述纳米体对于TNF具有优于2.10-3(l/s)、优选优于1.10-3(l/s)的Koff速率；和/或具有这样的CDR’s，以致所述纳米体在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于WO 04/041862的纳米体VHH 3E(SEQ ID NO：4)在相同检测中的EC50值；并且特别好于12nM，更特别地好于5nM，甚至更特别地好于3nM。此外，或者备选地，这样的纳米体优选地针对TNF(即，TNF三聚体)与TNF1相同的表位。
已经发现特别用作抗-TNF纳米体的另一种克隆是克隆PMP5F10(TNF3，SEQ ID NO：60)。从表39中KYM-检测的比较数据可以看出，TNF3具有比WO 04/41862所述的最佳单价纳米体多于15倍更好的EC50值。
因此，包括一种或多种、优选地任意两种或者更优选地所有三种克隆PMP5F10中存在的CDR’s(或者衍生于其或与其相对应的CDR序列)的纳米体是本发明特别优选的。并且，这些纳米体优选地属于KERE类。
更具体地，本发明的这一实施方案的一些优选的方面为：
XLII)针对TNF-α的纳米体，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中
a)CDR1包括：
-氨基酸序列NYYMG；或
-与氨基酸序列NYYMG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列NYYMG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
b)CDR2包括：
-氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；或
-与氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以及
c)CDR3包括：
-氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY；或
-与氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
-按照XLII)的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列NYYMG。
-按照XLII)的纳米体，其中CDR2包括氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG。
-按照XLII)的纳米体，其中CDR3包括氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY。
-按照XLII)的纳米体，其中：
-CDR1包括氨基酸序列NYYMG；并且CDR3包括氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY；或
-CDR1包括氨基酸序列NYYMG；并且CDR2包括氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；或
-CDR2包括氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；并且CDR3包括氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY。
-按照XLII)的纳米体，其中CDR1包括氨基酸序列NYYMG；CDR2包括氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY，并且CDR3包括氨基酸序列ILPLSDDPGWNTY。
-按照XLII)的纳米体，其中
-任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代；和/或
-与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
-按照XLII)的纳米体，其为KERE-类纳米体。
-按照XLII)的纳米体，其与氨基酸序列S SEQ ID NO’s 50(TNF3)，83(TNF20)，85(TNF21)，85(TNF22)，96(TNF23)或99(TNF33)之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)。
-按照XLII)的纳米体，其为人源化的纳米体。
-按照XLII)的纳米体，其对于TNF具有好于2.10-3(l/s)、优选地好于1.10-3(l/s)的Koff速率；或者这样的纳米体的人源化变体。
-按照XLII)的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使 用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于WO04/041862的纳米体VHH 3E(SEQ ID NO：4)在相同检测中的EC50值；或者这样的纳米体的人源化变体。
-按照XLII)的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于5nM；或者这样的纳米体的人源化变体。
-按照XLII)的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于3nM；或者这样的纳米体的人源化变体。
XLIII)针对TNF-α的纳米体，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中
a)CDR1为：
-氨基酸序列NYYMG；或
-与氨基酸序列NYYMG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列NYYMG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
b)CDR2为：
-氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；或
-与氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以及
c)CDR3为：
-氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY；或
-与氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有至少80％、优选地至 少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
-按照XLIII)的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列NYYMG。
-按照XLIII)的纳米体，其中CDR2是氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG。
-按照XLIII)的纳米体，其中CDR3是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY。
-按照XLIII)的纳米体，其中：
-CDR1是氨基酸序列NYYMG；并且CDR3是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY；或
-CDR1是氨基酸序列NYYMG；并且CDR2是氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；或
-CDR2是氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG；并且CDR3是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY。
-按照XLIII)的纳米体，其中CDR1是氨基酸序列NYYMG；CDR2是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY，并且CDR3是氨基酸序列ILPLSDDPGWNTY。
-按照XLIII)的纳米体，其中
-任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代；和/或
-与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
-按照XLIII)的纳米体，其为KERE-类纳米体。
-按照XLIII)的纳米体，其与氨基酸序列SEQ ID NO’s 50(TNF3)，83(TNF20)，85(TNF21)，85(TNF22)，96(TNF23)或99(TNF33)之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)。
-按照XLIII)的纳米体，其为人源化纳米体。
-按照XLIII)的纳米体，其对于TNF具有好于2.10-3(l/s)、优选地好于 2.10-3(l/s)的Koff速率；或者这样的纳米体的人源化变体。
-按照XLIII)的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于WO04/041862的纳米体VHH 3E(SEQ ID NO：4)在相同检测中的EC50值；或者这样的纳米体的人源化变体。
-按照XLIII)的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于5nM；或者这样的纳米体的人源化变体。
-按照XLIII)的纳米体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于3nM；或者这样的纳米体的人源化变体。
-按照XLIII)的纳米体，其选自由下列各项组成的组：SEQ ID NO’s，83(TNF20)，85(TNF21)，85(TNF22)，96(TNF23)或98(TNF33)TNF 13(SEQ ID NO：76)，TNF 14(SEQ ID NO：77)，TNF 29(SEQ ID NO：95)和TNF 30(SEQ ID NO：96)。
一些其它优选的方面为：
XLIV)蛋白或多肽，其包括或者基本上由按照XLII)或XLIII)的纳米体组成。
XLV)蛋白或多肽，其包括或者基本上由至少一种按照XLII)或XLIII)的纳米体组成。
XLVI)蛋白或多肽，其包括两种按照XLII)或XLIII)的纳米体。
XLVII)蛋白或多肽，其包括两种按照XLII)或XLIII)的纳米体，并且其为这样的蛋白或多肽，即，当与TNF三聚体结合时，所述蛋白或多肽能够抑制或者减少由所述TNF三聚体调控的TNF受体交联和/或由这样的受体交联调控的信号传导。
XLVIII)蛋白或多肽，其包括两种按照XLII)或XLIII)的纳米体，并且其能够分子内结合TNF三聚体上的至少两个TNF受体结合位点。
-按照XLIV)或XLVIII)任一项的蛋白或多肽，其包括或基本上由多肽TNF 6(SEQID NO：72)或TNF 9(SEQ ID NO：75)组成，其中纳米体TNF3都已经被人源化。
-按照XLIV)或XLVIII)任一项的蛋白或多肽，其被聚乙二醇化。
-蛋白或多肽，其包括两种按照XLII)或XLIII)的纳米体，并且其为这样的蛋白或多肽，即，当与TNF三聚体结合时，所述蛋白或多肽能够抑制或者减少由所述TNF三聚体调控的TNF受体交联和/或由这样的受体交联调控的信号传导；和/或其为这样的蛋白或多肽，即，所述蛋白或多肽能够分子内结合TNF三聚体上的至少两个TNF受体结合位点，并且所述蛋白或多肽还包括至少一种针对人血清白蛋白的纳米体。
-按照XLIV)或XLVIII)任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是人源化的纳米体。
-按照XLIV)或XLVIII)任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是纳米体ALB 1(SEQ ID NO：63)的人源化变体。
-按照XLIV)或XLVIII)任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体选自由下列各项组成的组：ALB 3(SEQ IDNO：87)，ALB 4(SEQ ID NO：88)，ALB 5(SEQ ID NO：89)，ALB 6(SEQ ID NO：100)，ALB 7(SEQ ID NO：101)，ALB 8(SEQ ID NO：102)ALB 9(SEQ ID NO：103)和ALB 10(SEQ ID NO：104)。
-按照XLIV)或XLVIII)任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是ALB 8。
-按照XLIV)或XLVIII)任一项的蛋白或多肽，其包括或基本上由两种按照XLIV)或XLVIII)任一项的人源化纳米体和纳米体ALB 1(SEQID NO：63)的一种人源化变体组成。
-按照XLIV)或XLVIII)任一项的蛋白或多肽，其包括或基本上由多肽TNF26(SEQID NO：92)组成，其中纳米体TNF3以及纳米体ALB1都已经被人源化。
应该注意，当纳米体按上文提法作为“按照XLII”或“按照XLIII”时，它是至少按照XLII)和/或XLIII)中的一项，并且还可以包括视为上述“按照XLII)”或“按照XLIII)”的其它方面中的任何一个或多个。类似地，当蛋白或多肽按上文提法作为“按照上述XLIV)或XLVIII)任一项”时， 它是至少按照XL)-XLI)的一项，可以按照XLIV)-XLVIII)中的两项或多项，并且还可以包括视为上述“按照XLIV)或XLVIII)任一项”的其它方面中的任何一个或多个。
对于上述基于纳米体TNF3的纳米体(包括但不限于人源化纳米体)，构架序列通常可以如本文所述，并且优选地如下述：
a)FR1包括或者为：
-氨基酸序列SEQ ID NO：138；或
-与氨基酸序列SEQ ID NO：138有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SEQ ID NO：138只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
b)FR2包括或者为：
-氨基酸序列SEQ ID NO：206；或
-与氨基酸序列SEQ ID NO：206有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SEQ ID NO：206有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以及
c)FR3包括或者为：
-氨基酸序列SEQ ID NO：274；或
-与氨基酸序列SEQ ID NO：274有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SEQ ID NO：274只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
d)FR4包括或者为：
-氨基酸序列SEQ ID NO：342；或
-与氨基酸序列SEQ ID NO：342有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列SEQ ID NO：342只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
其中在所述构架序列中存在的氨基酸差异更优选地如本文所述。
另一方面，本发明涉及具有下列氨基酸序列的纳米体：所述氨基酸序列选自由SEQID NO’s：52-60组成的组，由SEQ ID NO’s：76-86组成的组，由SEQ ID NO’s：95-99组成的组，由SEQ ID NO’s 105-129组成的组，或由与SEQ ID NO’s：52-60、SEQ ID NO’s：76-86、SEQ ID NO’s：95-99或SEQ ID NO’s 105-129的一种或多种氨基酸序列有大于80％、优选地大于90％、更优选地大于95％诸如99％或更多的“序列相同性”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中后者氨基酸序列最优选地具有下文在纳米体构架序列的基本描述下进一步限定的构架序列。
按照一个具体的但非限制性实施方案，所述后者氨基酸是“人源化的”，如在本文进一步所述。
最优选地，本发明的纳米体选自由SEQ ID NO’s：52-60组成的组，由SEQ ID NO’s：76-86组成的组，由SEQ ID NO’s：95-99组成的组，或选自由SEQ ID NO’s 105-129组成的组，其中SEQ ID NO’s：76-86和SEQ IDNO’s：95-99的“人源化”纳米体特别优选。
如上文提及，本发明特别优选的纳米体是克隆PMP1C2(TNF1；SEQID NO：52)。因此，在一个优选的方面中，本发明涉及具有这样的氨基酸序列的纳米体，即，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO：52组成的组，或者选自由与SEQ ID NO：52的氨基酸序列有大于80％、优选地大于90％、更优选地大于95％诸如99％或更多“序列相同性”(如本文定义)的氨基酸序列组成的组，其中后者氨基酸序列最优选地具有下文在纳米体构架序列的基本描述下进一步限定的构架序列。
特别优选的是克隆PMP1C2(TNF1；SEQ ID NO：52)的人源化变体。 这样的人源化变体的一些优选的但非限制性的实例是克隆TNF13(SEQID NO：76)，TNF14(SEQ ID NO：77)，TNF29(SEQ ID NO：95)和TNF 30(SEQ ID NO：96)。因此，在一个优选的方面中，本发明涉及一种具有这样的氨基酸序列的人源化纳米体：即，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO’s：76，77，95或96组成的组，或选自由与氨基酸序列SEQ ID NO’s：76，77，95或96之一具有大于80％、优选地大于90％、更优选地大于95％诸如99％或更多“序列相同性”(如本文定义)的氨基酸序列组成的组，其中后者氨基酸序列最优选地具有下文在纳米体构架序列的基本描述下进一步限定的构架序列。
按照一个优选的实施方案，本发明的纳米体是纳米体TNF 1(SEQ IDNO：52)的人源化变体。
本发明这一实施方案的一些优选的方面为：
XLIX)纳米体TNF 1的人源化变体，其对于TNF具有好于2.10-3(l/s)的Koff速率，优选地好于1.10-3(l/s)。
L)纳米体TNF 1的人源化变体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于WO 04/041862的纳米体VHH 3E(SEQ IDNO：4)在相同检测中的EC50值。
LI)纳米体TNF 1的人源化变体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于5nM。
LII)纳米体TNF 1的人源化变体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于3nM。
LIII)蛋白或多肽，其包括或者基本上由至少一种纳米体组成，所述纳米体为按照XLIX)-LII)中任一项的纳米体TNF 1的人源化变体。
LIV)蛋白或多肽，其包括或者基本上由两种纳米体组成(任选地通过接头连接)，所述纳米体为按照XLIX)-LII)中任一项的纳米体TNF 1的人源化变体。
LV)蛋白或多肽，其包括或者基本上由两种纳米体组成(任选地通过接头 连接)，所述纳米体为按照XLIX)-LII)中任一项的纳米体TNF 1的人源化变体，并且其为这样的蛋白或多肽，即，当与TNF三聚体结合时，所述蛋白或多肽能够抑制或者减少由所述TNF三聚体调控的TNF受体交联和/或由这样的受体交联调控的信号传导。
LVI)蛋白或多肽，其包括或者基本上由两种纳米体组成，所述纳米体为按照XLIX)-LII)中任一项的纳米体TNF 1的人源化变体，并且所述蛋白或多肽能够分子内结合TNF三聚体上的至少两个TNF受体结合位点。
LVII)包括或者基本上由多肽TNF 7(SEQ ID NO：73)组成的蛋白或多肽，其中纳米体TNF 1都已经被人源化。
LVIII)包括或者基本上由多肽TNF 7(SEQ ID NO：73)组成的蛋白或多肽，其中纳米体TNF 1都已经被人源化，并且其被聚乙二醇化。
LIX)蛋白或多肽，其包括或者基本上由两种纳米体组成，所述纳米体为按照XLIX)-LII)中任一项的纳米体TNF 1的人源化变体，并且所述蛋白或多肽还包括至少一种针对人血清白蛋白的纳米体。
LX)蛋白或多肽，其包括或者基本上由两种纳米体组成，所述纳米体为按照XLIX)-LII)中任一项的纳米体TNF 1的人源化变体，所述纳米体每一都连接到(任选地通过接头连接)针对人血清白蛋白的一个纳米体上。
-按照LIII)-LX)任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是人源化的纳米体。
-按照LIII)-LX)任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是纳米体ALB 1(SEQ ID NO：63)的人源化变体。
-按照LIII)-LX)任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体选自由下列各项组成的组：ALB 3(SEQ ID NO：87)，ALB 4(SEQ ID NO：88)，ALB 5(SEQID NO：89)，ALB 6(SEQ ID NO：100)，ALB 7(SEQ ID NO：101)，ALB 8(SEQ ID NO：102)ALB 9(SEQID NO：103)和ALB 10(SEQ ID NO：104)。
-按照LIII)-LX)任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是ALB 8。
-按照LIII)-LX)任一项的蛋白或多肽，其包括或基本上由多肽TNF24(SEQ ID NO：90)组成，其中纳米体TNF 1以及纳米体ALB TNF 1都已经被人源化。
-按照LIII)-LX)任一项的蛋白或多肽，其包括或者基本上由两个纳米体TNF 30和一个纳米体ALB 8组成。
按照一个优选的实施方案，本发明的纳米体是纳米体TNF 3(SEQ IDNO：60)的人源化变体。
本发明的这一实施方案的一些优选的方面为：
LXI)纳米体TNF 3的人源化变体，其对于TNF具有好于2.10-3(l/s)的Koff速率，优选地好于1.10-3(l/s)。
LXII)纳米体TNF 3的人源化变体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于WO 04/041862的纳米体VHH 3E(SEQID NO：4)在相同检测中的EC50值。
LXIII)纳米体TNF 3的人源化变体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于5nM。
LXIV)纳米体TNF 3的人源化变体，其在WO 04/041862实施例1第3)中所述的使用KYM细胞进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于3nM。
LXV)蛋白或多肽，其包括或者基本上由至少一种纳米体组成，所述纳米体为按照LXI)-LXIV)中任一项的纳米体TNF 3的人源化变体。
LXVI)蛋白或多肽，其包括或者基本上由两种纳米体组成(任选地通过接头连接)，所述纳米体为按照LXI)-LXIV)中任一项的纳米体TNF 3的人源化变体。
LXVII)蛋白或多肽，其包括或者基本上由两种纳米体组成(任选地通过接头连接)，所述纳米体为按照LXI)-LXIV)中任一项的纳米体TNF3的人源化变体，并且其为这样的蛋白或多肽，即，当与TNF三聚体结合时，所述蛋白或多肽能够抑制或者减少由所述TNF三聚体调控 的TNF受体交联和/或由这样的受体交联调控的信号传导。
LXVIII)蛋白或多肽，其包括或者基本上由两种纳米体组成，所述纳米体为按照LXI)-LXIV)中任一项的纳米体TNF 3的人源化变体，并且所述蛋白或多肽能够分子内结合TNF三聚体上的至少两个TNF受体结合位点。
LXIX)包括或者基本上由多肽TNF 6(SEQ ID NO：72)或TNF 9(SEQ IDNO：75)组成的蛋白或多肽，其中纳米体TNF 3都已经被人源化。
LXX)包括或者基本上由多肽TNF 6(SEQ ID NO：72)或TNF 9(SEQ IDNO：75)组成的蛋白或多肽，其中纳米体TNF 3都已经被人源化，并且其被聚乙二醇化。
LXXI)蛋白或多肽，其包括或者基本上由两种纳米体组成，所述纳米体为按照LXI)-LXIV)中任一项的纳米体TNF 3的人源化变体，并且所述蛋白或多肽还包括至少一种针对人血清白蛋白的纳米体。
LXXII)蛋白或多肽，其包括或者基本上由两种纳米体组成，所述纳米体为按照LXI)-LXIV)中任一项的纳米体TNF 3的人源化变体，所述纳米体每一都连接到(任选地通过接头连接)针对人血清白蛋白的一个纳米体上。
-按照LXV)-LXXII)任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是人源化的纳米体。
-按照LXV)-LXXII)任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是纳米体ALB 1(SEQ ID NO：63)的人源化变体。
-按照LXV)-LXXII)任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体选自由下列各项组成的组：ALB 3(SEQ ID NO：87)，ALB 4(SEQ ID NO：88)，ALB 5(SEQ ID NO：89)，ALB 6(SEQ IDNO：100)，ALB 7(SEQ ID NO：101)，ALB 8(SEQ ID NO：102)ALB 9(SEQ ID NO：103)和ALB 10(SEQ ID NO：104)。
-按照LXV)-LXXII)任一项的蛋白或多肽，其中所述至少一种针对人血清白蛋白的纳米体是ALB 8。
-按照LXV)-LXXII)任一项的蛋白或多肽，其包括或者基本上由多肽 TNF26(SEQID NO：92)组成，其中纳米体TNF 3以及纳米体ALB 1都已被人源化。
在另一方面中，本发明涉及一种包括或者基本上由至少一种本文所定义的针对TNF-α的纳米体组成的多肽。这样的多肽在本文中也叫作“本发明的多肽”，并且可以如下文进一步描述和/或如WO 04/041862中对其中公开的纳米体的一般描述，并且例如可以是多价多肽或多特异性多肽，其也在下文中进一步描述。
优选地，本发明的多肽是二价或三价的(即，分别包括两个或三个本发明的多肽，任选地分别通过下文定义的一个或两个接头连接)或多特异性的多肽，其包括一种或两种、并且优选地两种本发明的纳米体和至少一种针对血清蛋白的纳米体，并且特别是针对人血清蛋白诸如针对人血清白蛋白的纳米体。
在一个优选的但非限制性实施方案中，在本发明的多肽中存在的本发明的纳米体选自由SEQ ID NO’s：52-60和SEQ ID NO’s 105-129组成的组或者选自其人源化变体，并且特别地选自SEQ ID NO’s 76-86和SEQ IDNO’s：95-99的“人源化”纳米体。在本发明的多肽中存在的针对人血清白蛋白的纳米体优选地如下文定义，并且更优选地选自由SEQ ID NO’s：61-67，SEQ ID NO’s：87-89和SEQ ID NO’s：100-104组成的组，并且特别是选自SEQ IDNO’s 76-86和SEQ ID NO’s 100-104的针对人血清白蛋白的“人源化”纳米体。
关于在本发明的多肽中存在的纳米体，熟练的技术人员应该清楚，本文提及为“优选的”(或者为“更优选的”、“甚至更优选的”等等)纳米体还优选地(或者更优选地，或者甚至更优选地，等等)用于本文所述的多肽中。因此，包括或者基本上由一个或多个“优选的”本发明纳米体组成的多肽通常是优选的，并且包括或基本上由一个或多个“更优选的”本发明纳米体组成的本发明多肽通常是更优选的，等等。
因此，在本发明中，特别优选这样的多肽，即，所述多肽包括一个或多个纳米体，所述纳米体基本上由克隆PMP1C2(TNF1；SEQ ID NO：52)的一个优选变体组成，其中所述优选的变体如本文所定义。甚至更优选的 是包括一个或多个基本上由克隆PMP1C2(TNF1；SEQID NO：52)的一个人源化变体组成的纳米体的多肽，其中所述人源化变体如本文所定义(实例为，没有局限性，TNF13，TNF14，TNF29和TNF30)。TNF 30是用于本发明多肽的特别优选的人源化“结构单元”。
这样的蛋白和多肽的一些优选的但非限制性的实例是PMP1C2本身、人源化变体TNF13、TNF14、TNF29和TNF30；SEQ ID NO：70(TNF4)，SEQID NO：73(TNF7)，SEQ ID NO：90(TNF24)，SEQ ID NO：93(TNF27)的构建体；以及SEQ ID NO：417(TNF60)，SEQ ID NO：419(TNF55)和SEQ IDNO：420(TNF56)的构建体，其中后三种构建体包含人源化变体TNF 30作结构单元。
如本文所提及，本文所述的纳米体和构建体可以是被聚乙二醇化的，或者包含一个或多个(额外的)允许聚乙二醇化和/或辅助聚乙二醇化的氨基酸残基。这种多肽的两个优选的但非限制性的实例是TNF55和TNF56，其都包含一个额外的半胱氨酸残基用于PEG-基团的容易附着。
本发明多肽的一些优选的但非限制性的实例是SEQ ID NO’s：70-75的本发明的二价多肽，以及SEQ ID NO’s：90-94和SEQ ID NO’s 417-420的本发明的多特异性多肽。
从下文提出的数据并且特别是从比较实施例中给出的数据可以看出，本发明的纳米体和/或多肽具有提高的特性。特别地，与商购的抗-TNF生物制剂EnbrelTM(依那西普)、HumiraTM和RemicadeTM(英夫利昔单抗)相比，本发明的蛋白和多肽可以对于人TNF-α具有提高的亲和性(在本文所示的KYM检测中表示为EC50-值)。此外，与国际公开WO 04/041862中所述的最佳作用的纳米体相比，本文所述的纳米体可以对TNF-α具有提高的亲和性。因此可以预计，与WO 04/041862中所述只包括针对TNF-α的纳米体的多肽相比，包括至少一个本发明的纳米体的本发明的多肽还将具有提高的特性。
更特别地，本文所述的多肽，其包括两个或多个(并且优选两个)本文的纳米体(并且任选地例如针对人血清白蛋白的纳米体)，在WO04/041862的实施例1第3)中所述的使用KYM进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于 和 (英夫利昔单抗)在相同 检测中的EC50值，并且优选地还好于 (依那西普)在相同检测中的EC50值。
例如，这样的蛋白或多肽优选地在WO 04/041862的实施例1第3)中所述的使用KYM进行的基于细胞的检测中所具有的EC50值好于0.2nM，特别优选地好于0.1nM，诸如好于0.7Nm，并且特别是好于0.4nM。
本申请人还表明，针对小鼠TNF-α的纳米体和包括针对小鼠TNF-α的纳米体的多肽在下列疾病模型中表现出有益的生物学活性(数据未显示)：
-结肠炎的葡聚糖硫酸钠糖(dextran sulfate sodium)(“DSS”)模型，其使用常规小鼠以及IL-10敲除小鼠，如Okayasu等(Gastroenterol (肠胃病学)1990，98(3)：694)所述；
-关节炎(“RA”)的胶原诱导的关节炎(“CIA”)模型，如Courtenay等(Nature(自然)1980，283(5748)：666)所述，其使用常规小鼠以及IL-10敲除小鼠；
-IBD的IL-10敲除小鼠模型，例如Rennick等(Clin Immunol Immunopathol(临床免疫学免疫病理学)1995，76(3 Pt 2)：S174)所述；
-RA的Kollias模型，例如Keffer等(EMBO J(胚胎学志)1991，10(13)：4025)所述；
-IBD的2，4，6-三硝基苯磺酸(“TNBS”)模型，如Elson等(J Immunol(免疫学杂志)1996，157(5)：2174)所述；
-RA的CIA模型，由Koppieters等(准备中的手稿)所述；
-衍生于滑液的成纤维细胞模型(下文所述)；和
-鼠科气囊(air pouch)模型。
优选地，本文所述的纳米体在至少一种所述模型中、并且优选在所有所述模型中优于WO 04/041862中的纳米体1A；并且更优选地，在至少一种所述模型中、并且优选在所有所述模型中优于WO 04/041862的纳米体3E。此外，本文所述的多肽优选地在至少一种所述模型中、并且优选在所有所述模型中等价于或者优于 或 (英夫利昔单抗)；更优选地，在至少一种所述模型中、并且优选在所有所述模型中等价于或者优于(依那西普)。
这些数据证实，针对TNF-α的纳米体以及包含其的多肽，诸如WO04/041862中所述的纳米体和多肽，以及特别是本文所述的纳米体和多肽，应该具有对于TNF调控的疾病和紊乱诸如上文提及的疾病和紊乱的治疗功效。
在另一方面中，本发明涉及编码本发明的纳米体和/或本发明的多肽的核酸。这样的核酸在下文中也叫作“本发明的核酸”，并且例如可以是遗传构建体的形式，如下文所定义。
在另一方面中，本发明涉及表达或者能够表达本发明的纳米体和/或本发明的多肽的宿主或宿主细胞；和/或包含编码本发明的纳米体和/或本发明的多肽的核酸的宿主或宿主细胞。这样的宿主或宿主细胞还可以类似于WO 04/041862中所述的宿主和宿主细胞，但是其表达或者能够表达本发明的纳米体和/或本发明的多肽和/或包含本文所述的核酸。
本发明还涉及包含或者包括本发明的纳米体、本发明的多肽；和/或本发明的核酸的产品或组合物。例如，这样的产品或组合物可以是药物组合物(如下文所述)或用于诊断用途的产品或组合物(也如下文所述)。这样的产品或组合物还可以类似于WO 04/041862中所述的产品和组合物，但是其包含或者包括本发明的纳米体、本发明的多肽或本发明的核酸。
本发明还涉及制备或者产生本文所述的纳米体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的方法，所述方法在下文中进一步描述。此外，一般地，本文所述的纳米体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物还可以以同WO 04/041862中所述的方式类似的方式进行制备和应用。
本发明还涉及本文所述的上述纳米体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的应用和用途，所述应用和用途包括，但不限于，下文所述的应用和用途和/或WO 04/041862中对于针对TNF-α的纳米体和/或对于包含其的多肽的其它用途和应用。
从下文的进一步描述中，本发明的其它方面、实施方案、优点和应用将清楚可见。
发明详述
本发明的上述和其它方面以及实施方案将通过下文的进一步描述而 清楚，其中：
a)除非指明或另外定义，使用的所有术语具有它们在本领域中的通用意义，其对于熟练的技术人员是清楚可见的。例如，参考可以参见标准手册，诸如Sambrook等″Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)″(第二版)，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版)(1989)；F.Ausubel等，eds.，″Current protocols in molecular biology(现代分子生物学方法)″，GreenPublishing and Wiley Interscience，New York(1987)；Lewin，“Genes II(基因II)”，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，(纽约)(1985)；Old等，“Principles of GeneManipulation：An Introduction to Genetic Engineering(基因操作原理：遗传工程入门)”，第二版，University of California Press(加利福尼亚大学出版)，Berkeley，CA(1981)；Roitt等，“Immunology(免疫学)”(第六版)，Mosby/Elsevier，Edinburgh(2001)；Roitt等，Roitt’s Essential Immunology(Roitt’s基础免疫学)，第十版.BlackwellPublishing，UK(2001)；和Janeway等，“Immunobiology(免疫学)”(第六版)，GarlandScience Publishing/Churchill Livingstone，New York(2005)，以及本文所引用的综合背景技术；
b)除非另外指明，术语“免疫球蛋白序列”——不管其在本文中用来指重链抗体或常规的4链抗体——用作一般术语，包括完整大小的抗体、其单独的链、以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原-结合结构域或片段，分别诸如VHH结构域或VH/VL结构域)。另外，术语“序列”用于本文时(例如在类似“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”的术语中)通常应该理解为包括相关的氨基酸序列以及编码所述氨基酸序列的核酸序列或核苷酸序列，除非上下文需要更狭义的解释；
c)除非另外指明，所有没有具体详细描述的方法、步骤、技术和操作可以以本质上已知的方式进行并且已经进行，这对于熟练的技术人员是清楚的。例如，仍旧参考标准手册，参考上文和其中所引用的参考文献的综合背景技术；
d)氨基酸残基按照标准的三字母或一字母的氨基酸密码显示，如表1提及；
表1：一字母和三字母氨基酸密码
e)出于比较两种或多种核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列相同性”百分数通过用【第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置的核苷酸相同的核苷酸数目】除以【第一核苷酸序列中的核苷酸总数】并且乘以【100％】而计算，其中第二核苷酸序列中核苷酸的每一删除、插入、取代或添加——与第一核苷酸序列相比——都视作在单一核苷酸(位置)的差异。
备选地，两种或多种核苷酸序列之间的序列相同性程度可以使用已知的用于序列比对的使用标准设置的计算机算法进行计算，诸如NCBIBlast v2.0。
例如，在WO 04/037999，EP 0 9672 84，EP 1 085 089，WO 00/55318，WO 00/78972，WO 98/49185和GB 2 357 768-A中描述了用于确定序列相同性程度的一些其它的技术、计算机算法和设置。
通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种核苷酸序列之间的“序列相同性”的百分数的目的，将具有最大核苷酸数目的核苷酸序列视作“第一”核苷酸序列，并且将另一种核苷酸序列视作“第二”核苷酸序列；
f)出于比较两种或多种氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列相同性”百分数通过用【第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸数目】除以【第一氨基酸序列中的氨基酸残基总数】并且乘以【100％】而计算，其中第二氨基酸序列中氨基酸的每一删除、插入、取代和添加——与第一氨基酸序列相比——都视作在单一氨基酸残基(位置)上的差异，即，视作下文所定义的“氨基酸差异”。
备选地，两种氨基酸序列之间的序列相同性程度可以使用已知的计算机算法进行计算，诸如上文提及的用于确定核苷酸序列相同性程度的那些，其仍旧使用标准设置。
通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种氨基酸序列之间的“序列相同性”的百分数的目的，将具有最大氨基酸残基数目的氨基酸序列视作“第一”核苷酸序列，并且将另一种氨基酸序列视作“第二”氨基酸序列。
此外，在确定两种氨基酸序列之间的序列相同性程度时，熟练的技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可以描述为这样的氨基酸取代，即，其中氨基酸残基被具有相似化学结构的另一种氨基酸残基取代，并且其对所述多肽的功能、活性或其它生物学特性几乎没有或者基本上没有影响。这种保守氨基酸取代是本领域内公知的，例如，从WO04/037999，GB-A-2 357 768，WO 98/49185，WO 00/46383和WO 01/09300中可知；并且可以基于WO 04/037999以及WO 98/49185和其中所引用的其它参考文献的相关技术而选择这种取代的(优选)类型和/或结合。
这种保守取代优选地是这样的取代，即，其中下列组(a)-(e)内的一个氨基酸被同组内的另一氨基酸残基取代：(a)小的脂肪族、非极性或微极性的残基：Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp，Asn，Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基：His，Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met，Leu，Ile，Val和Cys；以及(e)芳族残基：Phe，Tyr和Trp。
特别优选的保守取代如下：Ala取代成Gly或取代成Ser；Arg取代成Lys；Asn取代成Gln或取代成His；Asp取代成Glu；Cys取代成Ser；Gln取代成Asn；Glu取代成Asp；Gly取代成Ala或取代成Pro；His取代成Asn或取代成Gln；Ile取代成Leu或取代成Val；Leu取代成Ile或取代成Val；Lys取代成Arg，取代成Gln或取代成Glu；Met取代成Leu，取代成Tyr或取代成Ile；Phe取代成Met，取代成Leu或取代成Tyr；Ser取代成Thr；Thr取代成Ser；Trp取代成Tyr；Tyr取代成Trp；和/或Phe取代成Val，取代成Ile或取代成Leu。
用于本文所述的多肽的任何氨基酸取代还可以基于Schulz等，Principles ofProtein Structure(蛋白质结构原理)，Springer-Verlag，1978研究的不同物种的同源蛋白之间的氨基酸变异频率的分析，基于Chou和Fasman，Biochemistry(生物化学)13：211，1974和Adv.Enzymol.(高级酶学)，47：45-149，1978研究的结构形成潜力的分析，和基于Eisenberg等，Proc.Nad.Acad Sci.USA(美国国家科学院学报)81：140-144，1984；Kyte和Doolittle；J Molec.Biol(分子生物学杂志).157：105-132，1981，以及Goldman等，Ann.Rev.Biophys.Chem(物理化学年刊综述).15：321-353， 1986研究的蛋白中疏水模式的分析，所有这些完全结合于此作为参考。在本文描述和上文引用的综合背景技术中给出关于纳米体的一级、二级和三级结构的信息。此外，出于这一目的，例如，Desmyter等，NatureStructural Biology(自然结构生物学)，卷3，9，803(1996)；Spinelli等，NaturalStructural Biology(自然结构生物学)(1996)；3，752-757；和Decanniere等，Structure(结构)，卷7，4，361(1999)给出美洲驼(llama)的VHH结构域的晶体结构。关于在常规VH结构域中形成VH/VL界面的一些氨基酸残基和在这些位置的潜在的骆驼化(camelizing)取代的其它信息可以在本文引用的关于纳米体的现有技术中找到；
g)如果在它们的全长有100％的序列相同性(如本文所定义)，那么认为氨基酸序列和核酸序列“完全相同”；
h)当比较两种氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比，在第一序列位置上的单个氨基酸残基的插入、删除或取代；应该理解两种氨基酸序列可以包含1个、2个或多个这种氨基酸差异；
i)核酸序列或氨基酸序列视作“(以)基本上分离的(形式)”——例如，与其天然生物来源和/或其从中获得的反应介质或培养介质相比——此时其已经与其通常在所述来源或介质中与之缔合的至少一种其它成分(诸如另一种核酸，另一种蛋白/多肽，另一种生物成分或高分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)分离。特别地，当它已被纯化至少2倍，特别是至少10倍，更特别地至少100倍，并且达到1000倍或更多时，认为核酸序列或氨基酸序列“基本上分离”。当使用适当技术确定时，诸如适当的层析技术，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，“以基本上分离形式”的核酸序列或氨基酸序列优选地基本上是均相的；
j)当用于本文时，术语“结构域”通常是指抗体链的球状区域，并且特别是指重链抗体的球状区域，或者指基本上由所述球状区域组成的多肽。通常，例如，这样的结构域包括作为片层或通过二硫键而稳定的肽环(例如3或4个肽环)；
k)术语‘抗原决定簇’是指抗原上由抗原-结合分子(诸如本发明的纳米体或多肽)并且特别是所述分子的抗原-结合位点而识别的表位。术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中还可以互换地使用；
l)对于特定的抗原决定簇、表位、抗原或蛋白(或对于至少其的一部分、片段或表位)可以结合、具有亲和性和/或具有特异性的氨基酸序列(诸如本发明的纳米体、抗体、多肽，或通常为抗原结合蛋白或多肽或其片段)认为是“针对(against)”或者“针对(directedagainst)”所述抗原决定簇、表位、抗原或蛋白。
m)术语“特异性”是指特定的抗原-结合分子或抗原-结合蛋白(诸如本发明的纳米体或多肽)分子可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。一种抗原-结合蛋白的特异性可以依据亲和力和/或抗体亲抗原性(avidity)而确定。亲和力，表示为抗原与抗原-结合蛋白的解离平衡常数(KD)，是抗原决定簇和所述抗原-结合蛋白上抗原-结合位点之间的结合强度的测量：KD值越小，抗原决定簇和抗原-结合分子之间的结合强度越强(备选地，亲和力还可以表示为亲和常数(KA)，其为1/KD)。熟练的技术人员应该清楚(例如，基于本文的进一步公开)，亲和力可以以本质上已知的方式确定，其取决于目的特异性抗原。抗体亲抗原性是抗原-结合分子(诸如本发明的纳米体或多肽)和相关抗原之间的结合强度的测量。抗体亲抗原性与抗原决定簇及其在抗原-结合分子上的抗原结合位点以及在所述抗原-结合分子上存在的相关结合位点的数目相关。典型地，抗原-结合蛋白(诸如本发明的纳米体和/或多肽)将以10-5-10-12摩尔/升(M)或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升(M)或更小并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)而结合，和/或以至少107M-1、优选地至少108M-1、更优选地至少109M-1诸如至少1012M-1的缔合常数(KA)而结合。任何大于10-4M的KD值通常认为指示非特异性结合。优选地，本发明的纳米体或多肽将以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于10nM诸如小于500pM的KD与理想的抗原结合。抗原-结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本质上已知的任何适当的方法确定，其包括，例如，斯卡查德分析和/或竞争结合检测，诸如放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和三明治竞争测定，以及本领域本质上已知的其不同的变化。
n)如下文进一步所述，可以认为——然而并不限于此——纳米体的氨基酸序列和结构由4个构架区或“FR’s”组成，其在本领域和下文中分别叫作“构架区1”或“FR1”；叫作“构架区2”或“FR2”；叫作“构架区 3”或“FR3”；以及叫作“构架区4”或“FR4”；所述构架区被3个互补决定区或“CDR’s”中断，其在本领域分别叫作“互补决定区1”或“CDR1”；叫作“互补决定区2”或“CDR2”；以及叫作“互补决定区3”或“CDR3”；
o)也如下文所述，纳米体中氨基酸残基总数可以在110-120区间，优选112-115，并且最优选113。然而，应该注意纳米体的部分、片段或类似物(如下文进一步所述)不特别局限于它们的长度和/或大小，只要这样的部分、片段或类似物满足下文列出的深层要求，并且还优选地适于本文所述的目的；
p)纳米体的氨基酸残基按照Kabat等(“Sequence of proteins ofimmunological interest(免疫学目的蛋白的序列)”，US Public Health Services(美国公众健康服务中心)，NIH Bethesda，MD，Publication No.91)给出的关于VH结构域的通用编号方式进行编号，参考上文，这种编号方式在Riechmann和Muyldermans的文章中用于来自骆驼科的VHH结构域(例如，参见所述参考文献的图2)。按照这种编号方式，纳米体的FR1包括位置1-30的氨基酸残基，纳米体的CDR1包括位置31-36的氨基酸残基，纳米体的FR2包括位置36-49的氨基酸残基，纳米体的CDR2包括位置50-65的氨基酸残基，纳米体的FR3包括位置66-94的氨基酸残基，纳米体的CDR3包括位置95-102的氨基酸残基，以及，纳米体的FR4包括位置103-113的氨基酸残基。【在这一方面，应该注意——如在本领域内关于VH结构域和关于VHH结构域公知的——每一CDR’s中的氨基酸残基的总数可以不同，并且可以不与由Kabat编号方式指示的氨基酸残基的总数相对应(即，按照Kabat编号方式的一个或多个位置可能不占据在实际序列中，或者实际序列可能包含比由Kabat编号方式允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，按照Kabat的编号方式可能或可能不与实际序列中的氨基酸残基的实际编号方式相对应。然而，通常可以说，按照Kabat的编号方式并且不考虑CDR’s中的氨基酸编号，按照Kabat编号方式的位置1对应FR1的起点，并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置36对应FR2的起点，并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置66对应FR3的起点，并且反之亦然，以及按照Kabat编号方式的位置103 对应FR4的起点，并且反之亦然。】。
用于编号VH结构域的氨基酸残基的备选方法是由Chothia等(Nature(自然)342，877-883(1989))所述的方法，即所谓的“AbM定义”和所谓的“联系定义”，所述方法还可以以类似的方式用于来自骆驼科的VHH结构域以及用于纳米体。然而，在本说明书，权利要求和附图中，遵循由Riechmann和Muyldermans用于VHH结构域的按照Kabat的编号方式，除非另外指明；并且
q)给出附图、序列表和实验部分/实施例只是进一步举例说明本发明，并且不应该被以任何方式解释为或者认为限制本发明和/或附上的权利要求的范围，除非本文中另外明确指明。
关于重链抗体及其可变结构域的概括描述，其中对下列参考文献进行参考，其作为概括背景技术提及：Vrije Universiteit Brussel的WO 94/04678，WO 95/04079和WO96/34103；Unilever的WO 94/25591，WO 99/37681，WO 00/40968，WO 00/43507，WO 00/65057，WO 01/40310，WO 01/44301，EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voorBiotechnologie(VIB)的WO 97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO 03/054016 andWO03/055527；Algonomics N.V.和本申请人的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会的WO01/90190；抗体研究所的WO 03/025020(＝EP 1 433 793)；以及本申请人的WO 04/041867，WO 04/041862，WO 04/041865，WO04/041863，WO 04/062551和本申请人发表的其它专利申请；
Hamers-Casterman等，Nature(自然)1993 June 3；363(6428)：446-8；Davies和Riechmann，FEBS Lett.1994 Feb 21；339(3)：285-90；Muyldermans等，Protein Eng.(蛋白质工程)1994 Sep；7(9)：1129-3；Davies和Riechmann，Biotechnology(生物技术)(NY)1995May；13(5)：475-9；Gharoudi等，9th Forum of Applied Biotechnology(第9届应用生物技术大会)，Med.Fac.Landbouw Univ.Gent.1995；60/4a部分I：2097-2100；Davies和Riechmann，Protein Eng.(蛋白质工程)1996 Jun；9(6)：531-7；Desmyter等，Nat StructBiol.(自然结构生物学)1996 Sep；3(9)：803-11；Sheriff等，Nat Struct Biol.(自然结构生物学)1996 Sep；3(9)：733-6；Spinelli等，Nat Struct Biol.(自然结构生物学)1996Sep；3(9)：752-7；Arbabi Ghahroudi等，FEBS Lett.1997 Sep 15；414(3)：521-6；Vu等，MolImmunol.(分子免疫学)1997 Nov-Dec；34(16-17)：1121-31；Atarhouch等，Journal ofCamel Practice and Research(骆驼应用和研究杂志)1997；4：177-182；Nguyen等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)1998 Jan 23；275(3)：413-8；Lauwereys等，EMBO J.(胚胎学杂志)1998 Jul 1；17(13)：3512-20；Frenken等，Res Immunol.(免疫学研究)1998 Jul-Aug；149(6)：589-99；Transue等，Proteins(蛋白质)1998 Sep 1；32(4)：515-22；Muyldermans和Lauwereys，J.Mol.Recognit.(分子识别杂志)1999Mar-Apr；12(2)：131-40；van der Linden等，Biochim.Biophys.Acta 1999Apr 12；1431(1)：37-46.；Decanniere等，Structure Fold.Des.1999 Apr 15；7(4)：361-70；Ngyuen等，Mol.Immunol.(分子免疫学)1999 Jun；36(8)：515-24；Woolven等，Immunogenetics(免疫遗传学)1999 Oct；50(1-2)：98-101；Riechmann和Muyldermans，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)1999 Dec 10；231(1-2)：25-38；Spinelli等，Biochemistry(生物化学)2000Feb 15；39(6)：1217-22；Frenken等，J.Biotechnol.(生物技术杂志)2000 Feb28；78(1)：11-21；Nguyen等，EMBO J.(胚胎学杂志)2000 Mar 1；19(5)：921-30；van der Linden等，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)2000 Jun23；240(1-2)：185-95；Decanniere等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)2000Jun 30；300(1)：83-91；van der Linden等，J.Biotechnol.(生物技术杂志)2000 Jul14；80(3)：261-70；Harmsen等，Mol.Immunol.(分子免疫学)2000Aug；37(10)：579-90；Perez等，Biochemistry(生物化学)2001 Jan 9；40(1)：74-83；Conrath等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)2001 Mar 9；276(10)：7346-50；Muyldermans等，Trends Biochem Sci.(生物化学科学趋势)2001Apr；26(4)：230-5；Muyldermans S.，J.Biotechnol.(生物技术杂志)2001Jun；74(4)：277-302；Desmyter等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)2001 Jul13；276(28)：26285-90；Spinelli等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)2001 Aug3；311(1)：123-9；Conrath等，Antimicrob Agents Chemother.(抗微生物试剂化学治疗)2001 Oct；45(10)：2807-12；Decanniere等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)2001 Oct 26；313(3)：473-8；Nguyen等，AdvImmunol.(高级免疫学)2001；79：261-96；Muruganandam等，FASEB J.2002 Feb；16(2)：240-2；Ewert等，Biochemistry(生物化学)2002 Mar 19；41(11)：3628-36； Dumoulin等，Protein Sci.(蛋白质科学)2002 Mar；11(3)：500-15；Cortez-Retamozo等，Int.J.Cancer(癌症国际杂志).2002 Mar 20；98(3)：456-62；Su等，Mol.Biol.Evol.(分子生物学进化)2002 Mar；19(3)：205-15；van der Vaart JM.，Methods Mol Biol.(分子生物学方法)2002；178：359-66；Vranken等，Biochemistry(生物化学)2002 Jul 9；41(27)：8570-9；Nguyen等，Immunogenetics(免疫遗传学)2002 Apr；54(1)：39-47；Renisio等，Proteins(蛋白质)2002 Jun 1；47(4)：546-55；Desmyter等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)2002 Jun28；277(26)：23645-50；Ledeboer等，J.Dairy Sci.(每日科学杂志)2002 Jun；85(6)：1376-82；De Genst等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)2002 Aug 16；277(33)：29897-907；Ferrat等，Biochem.J.(生物化学杂志)2002 Sep 1；366(Pt 2)：415-22；Thomassen等，Enzyme andMicrobial Technol.(酶和微生物技术)2002；30：273-8；Harmsen等，Appl.Microbiol.Biotechnol.(应用微生物生物技术)2002 Dec；60(4)：449-54；Jobling等，Nat Biotechnol(天然生物技术).2003 Jan；21(1)：77-80；Conrath等，Dev.Comp.Immunol.(发展和比较免疫学)2003 Feb；27(2)：87-103；Pleschberger等，Bioconjug.Chem.(生物缀合物化学)2003 Mar-Apr；14(2)：440-8；Lah等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)2003 Apr 18；278(16)：14101-11；Nguyen等，Immunology.(免疫学)2003 May；109(1)：93-101；Joosten等，Microb.Cell Fact(微生物细胞学实况).2003 Jan 30；2(1)：1；Li等，Proteins(蛋白质)2003 Jul 1；52(1)：47-50；Loris等，Biol Chem.(生物化学)2003 Jul 25；278(30)：28252-7；van Koningsbruggen等，J.Immunol.Methods.(免疫学方法杂志)2003 Aug；279(1-2)：149-61；Dumoulin等，Nature.(自然)2003 Aug 14；424(6950)：783-8；Bond等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)2003 Sep 19；332(3)：643-55；Yau等，J.Immunol.Methods.(免疫学方法杂志)2003 Oct 1；281(1-2)：161-75；Dekker等，J.Virol.(病毒学杂志)2003 Nov；77(22)：12132-9；Meddeb-Mouelhi等.，Toxicon.2003Dec；42(7)：785-91；Verheesen等，Biochim.Biophys.Acta(生物化学生物物理学学报)2003Dec 5；1624(1-3)：21-8；Zhang等，J Mol Biol.(分子生物学杂志)2004 Jan 2；335(1)：49-56；Stijlemans等，J Biol Chem.(生物化学杂志)2004 Jan 9；279(2)：1256-61；Cortez-Retamozo等， Cancer Res.(癌症研究)2004 Apr 15；64(8)：2853-7；Spinelli等，FEBSLett.2004 Apr 23；564(1-2)：35-40；Pleschberger等，Bioconjug.Chem.(生物缀合物化学)2004 May-Jun；15(3)：664-71；Nicaise等，Protein Sci.(蛋白质科学)2004 Jul；13(7)：1882-91；Omidfar等，Tumour Biol.(肿瘤生物学)2004Jul-Aug；25(4)：179-87；Omidfar等，Tumour Biol.(肿瘤生物学)2004Sep-Dec；25(5-6)：296-305；Szynol等，Antimicrob Agents Chemother.(抗微生物试剂化学治疗)2004 Sep；48(9)：3390-5；Saerens等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)2004 Dec 10；279(50)：51965-72；De Genst等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)2004 Dec 17；279(51)：53593-601；Dolk等，Appl.Environ.Microbiol.(应用环境微生物学)2005 Jan；71(1)：442-50；Joosten等，ApplMicrobiol Biotechnol.(应用微生物生物技术)2005 Jan；66(4)：384-92；Dumoulin等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)2005 Feb 25；346(3)：773-88；Yau等，J Immunol Methods.(免疫学方法杂志)2005 Feb；297(1-2)：213-24；De Genst等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)2005 Apr 8；280(14)：14114-21；Huang等，Eur.J.Hum.Genet.(欧洲人类遗传学杂志)2005 Apr 13；Dolk等，Proteins.(蛋白质)2005 May 15；59(3)：555-64；Bond等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)2005 May 6；348(3)：699-709；Zarebski等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)2005 Apr 21；[E-公布先于印刷出版]。
按照上述参考文献中所用的术语学，在天然存在的重链抗体中存在的可变结构域还叫作“VHH结构域”，以将它们与在常规的4-链抗体中存在的重链可变结构域(其在下文中叫作“VH结构域”)区分，以及与在常规4-链抗体中存在的轻链可变结构域(其在下文中叫作“VL结构域”)区分。
如在上文提到的现有技术中提及，VHH结构域具有许多独特的结构特点和功能特性，这使得分离的VHH结构域(以及基于此的纳米体，其与天然存在的VHH结构域一起具有这些结构特点和功能特性)以及包含其的蛋白高度有利地用作功能性抗原-结合结构域或蛋白。特别地，并且不限于此，VHH结构域(其生来就“设计”为与抗原功能性结合，而无需存在轻链可变结构域，并且无需与轻链可变结构域相互作用)和纳米体可以作用为单一的、相对小的、功能性抗原-结合结构单位、结构域或蛋白。这将 VHH结构域与常规4-链抗体的VH和VL结构域区分开，其本身通常不适合作为单一抗原-结合蛋白或结构域用于实际应用，但是需要以某种形式或另一结构域结合以提供功能性抗原-结合单位(例如，在常规抗体片段诸如Fab片段中；在ScFv’s片段中，其由共价连接到VL结构域上的VH结构域组成)。
由于这些独特的特性，VHH结构域和纳米体用作单一抗原-结合蛋白或用作抗原-结合结构域(即，作为更大的蛋白或多肽的部分)提供许多优于常规VH和VL结构域、scFv’s或常规抗体片段(诸如Fab-或F(ab’)2-片段)应用的显著优点：
-只有单结构域需要以高亲和力和高选择性结合抗原，以致不需要存在两个分开的结构域，或者不需要保证这两个结构域以正确的空间构象和构型(即，通过使用专门设计的接头，如同scFv’s)存在；
-VHH结构域和纳米体可以从单一基因表达，并且需要翻译后折叠或修饰；
-VHH结构域和纳米体可以容易地加工成多价和多特异性形式(如本文进一步所讨论)；
-VHH结构域和纳米体高度可溶，并且没有聚集倾向(如同Ward等，Nature(自然)，341卷，1989，第544页所述的来源于小鼠的抗原-结合结构域)；
-VHH结构域和纳米体对热、pH、蛋白酶和其它变性剂或条件高度稳定(参见，例如，Ewert等，同前所述)；
-VHH结构域和纳米体制备容易并且相对廉价，即使以生产需要的规模制备。例如，VHH结构域、纳米体和包含其的蛋白/多肽可以使用微生物发酵生产(例如，下文进一步所述)，并且不需要使用哺乳动物表达系统，如同例如常规抗体片段；
-与常规4-链抗体及其抗原-结合片段相比，VHH结构域和纳米体相对小(大约15kDa，或比常规IgG小10倍)，并且因此表现出比所述常规4-链抗体及其抗原-结合片段更高的组织(包括但不限于实体瘤和其它致密组织)穿透性；
-VHH结构域和纳米体可以表现出所谓的洞隙-结合(cavity-binding)特 性(与常规VH结构域相比，尤其由于它们延长的CDR3环)，并且因此还可以接近常规4-链抗体及其抗原-结合片段不能接近的靶点和表位。例如，已经表明VHH结构域和纳米体可以抑制酶(参见，例如，WO 97/49805；Transue等，(1998)，同前所述；Lauwereys等，(1998)，同前所述)。
如上文提及，本发明通常涉及针对TNF-α的纳米体，以及包括或基本上由一个或多个这样的纳米体组成的多肽，其可以用于下文以及WO04/041862中所述的预防、治疗和/或诊断目的。
还如上文提及以及下文进一步所述，本发明还涉及编码这样的纳米体和多肽的核酸，制备这样的纳米体和多肽的方法，表达或能够表达这样的纳米体或多肽的宿主细胞，这样的纳米体、多肽、核酸或宿主细胞的应用，以及涉及包括这样的纳米体、多肽、核酸或宿主细胞的组合物。
通常，应该注意，当用于本文时，术语纳米体在其最广泛意义上不限于具体的生物来源或具体的制备方法。例如，如下文更详细地讨论，本发明的纳米体可以这样获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)通过表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)通过将天然存在的VHH结构域“人源化”(如下文所述)或者通过表达编码这样的人源化VHH结构域的核酸；(4)通过将来自于任何动物物种特别是哺乳动物物种诸如来自于人类的天然存在的VH结构域“骆驼源化(camelization)”(如下文所述)，或者通过表达编码这样的骆驼源化的VH结构域的核酸；(5)通过如Ward等(同前所述)所述将“结构域抗体”或“Dab”“骆驼源化”，或者通过表达编码这样的骆驼源化VH结构域的核酸；(6)应用合成或半合成技术制备蛋白、多肽或其它氨基酸序列；(7)通过应用核酸合成技术制备编码纳米体的核酸，然后表达这样获得的核酸；和/或(8)通过前述的任何结合。基于本文的公开，熟练的技术人员应该清楚实行前述的适当的方法和技术，以及例如包括下文更详细描述的方法和技术。。
然而，按照一个具体的实施方案，本发明的纳米体不具有与天然存在的VH结构域的氨基酸序列诸如来自于哺乳动物并且特别是来自于人类的天然存在的VH结构域的氨基酸序列完全相同(即，与之100％的序列相 同性程度)的氨基酸序列。
本发明纳米体的一种特别优选的种类包括具有与天然存在的VHH结构域的氨基酸序列相对应的但是已被“人源化”的氨基酸序列的纳米体，“人源化”即，用在来自于人类的常规4-链抗体的VH结构域中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基替换所述天然存在的VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基(例如，上文所示)。这可以以本质上已知的方式进行，这对于熟练的技术人员是清楚的，例如，基于下文的进一步描述以及本文引用的关于人源化的现有技术。此外，应该注意，本发明这样的人源化纳米体可以以本质上已知的任何适当方法获得(即，在上文(1)-(8)点下所示)，并且因此没有严格地限于使用包括天然存在的VHH结构域的多肽作为起始原料而获得的多肽。
对于属于103 P，R，S-组和/或GLEW-组的纳米体(如本文定义)的优选但非限制性的人源化取代是108Q-108L。
本发明纳米体的另一种特别优选的种类包括具有与天然存在的VH结构域的氨基酸序列相对应但已被“骆驼源化”的氨基酸序列的纳米体，“骆驼源化”即，用在重链抗体的VHH结构域中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基替换常规4-链抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以以本质上已知的方式进行，这对于熟练的技术人员是清楚的，例如，基于下文的进一步描述。还可以参考WO94/04678。这样的骆驼源化可能优先发生在存在于VH-VL界面的氨基酸位置以及所谓的骆驼科(Camelidae)标志残基(也参见例如WO 94/04678)，也如下文所提及。优选地，用作产生或设计所述骆驼源化纳米体的起始原料或起点的VH结构域或序列优选地是来自哺乳动物的VH序列，更优选地是人类的VH序列。然而，应该注意，这种骆驼源化的本发明纳米体可以以本质上已知的任何适当方式获得(即，在上文(1)-(8)点下所示)，并且因此没有严格地限于使用包括天然存在的VH结构域的多肽作为起始原料而获得的多肽。
例如，又如下文进一步所述，“人源化”和“骆驼源化”可以这样进行：通过提供分别编码所述天然存在的VHH结构域或VH结构域的核苷酸序列，并且然后以本质上已知的方式改变所述核苷酸序列中的一个或多个 密码子，以致新核苷酸序列分别编码人源化的或骆驼源化的本发明的纳米体，并且然后以本质上已知的方式表达这样获得的核苷酸序列，以提供理想的本发明的纳米体。备选地，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列，可以分别设计理想的人源化或骆驼源化的本发明的纳米体的氨基酸序列，然后应用本质上已知的肽合成技术从头开始合成。此外，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，可以分别设计编码所述理想的人源化或骆驼源化的本发明的纳米体的核苷酸序列，然后应用本质上已知的核酸合成技术从头开始合成，之后可以以本质上已知的方式表达这样获得的核苷酸序列，以提供理想的本发明的纳米体。
熟练的技术人员应该清楚从天然存在的VH结构域或优选的VHH结构域(的氨基酸序列)和/或从编码其的核苷酸序列和/或核酸序列起始而获得本发明的纳米体和/或编码其的核苷酸序列和/或核酸的其它适宜方法，并且例如，可以包括将来自天然存在的VH结构域的一个或多个氨基酸序列和/或核苷酸序列(诸如一个或多个FR’s和/或CDR’s)与来自天然存在的VHH结构域的一个或多个氨基酸序列和/或核苷酸序列(诸如一个或多个FR’s或CDR’s)以适当方式组合，以提供本发明的纳米体(编码其的核苷酸序列或核酸)。
按照本发明方面的一个优选的但非限制性的方面，纳米体在其最广泛意义上通常可以定义为这样的多肽，其包括：
a)由被3个互补决定区/序列中断的4个构架区/序列组成的氨基酸序列，其中在按照Kabat编号方式的位置108的氨基酸残基是Q；
和/或
b)由被3个互补决定区/序列中断的4个构架区/序列组成的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；
和/或：
c)由被3个互补决定区/序列中断的4个构架区/序列组成的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组，并且特别选自由R和S组成的组。
因此，在第一优选的但非限制性的方面，本发明的纳米体可以具有结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中
i)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
和/或其中：
ii)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；
和/或其中：
iii)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组，并且特别选自由R和S组成的组；
并且其中
iv)CDR1，CDR2和CDR3如上文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
特别地，按照本发明针对TNF-α的纳米体可以具有结构：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中
i)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
和/或其中：
ii)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；
和/或其中：
iii)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成 的组，并且特别选自由R和S组成的组；
并且其中
iv)CDR1，CDR2和CDR3如上文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
特别地，按照本发明方面的一个优选的但非限制性的方面，纳米体通常可以定义为包括由被3个互补决定区/序列中断的4个构架区/序列而组成的氨基酸序列的多肽，其中：
a-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由G，E，D，G，Q，R，S，L组成的组；并且优选地选自由G，E或Q组成的组；和
a-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R或C组成的组；并且优选地选自由L或R组成的组；和
a-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R或S组成的组；并且优选地选自由W或R组成的组，以及最优选地为W；
a-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
或者其中：
b-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由E和Q组成的组；和
b-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；和
b-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R和S组成的组；并且优选地为W；
b-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；并且优选地为Q；
或者其中：
c-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由G，E，D，Q，R，S和L组成的组；并且优选地由G，E和Q组成的组；和
c-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R和C组成的组；并且优选地选自由L和R组成的组；和
c-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组；并且特别选自由R和S组成的组；和
c-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的 组；优选地为Q。
因此，在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米体可以具有结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
i)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由G，E，D，G，Q，R，S，L组成的组；并且优选地选自由G，E或Q组成的组；
并且其中：
ii)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R或C组成的组；并且优选地选自由L或R组成的组；
并且其中：
iii)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R或S组成的组；并且优选地为W或R，并且最优选地为W；
并且其中
iv)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
并且其中：
v)CDR1，CDR2和CDR3如上文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在另一个优选的但非限制性方面中，本发明的纳米体可以具有结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
i)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由E和Q组成的组；
并且其中
ii)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；
并且其中：
iii)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R和S组成的组；并且优选地为W；
并且其中：
iv)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
并且其中
v)CDR1，CDR2和CDR3如上文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在另一个优选的但非限制性方面中，本发明的纳米体可以具有结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
i)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由G，E，D，Q，R，S和L组成的组；并且优选地选自由G，E和Q组成的组；
并且其中：
ii)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R和C组成的组；并且优选地选自由L和R组成的组；
并且其中：
iii)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组；并且特别选自由R和S组成的组；
并且其中：
iv)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；优选地为Q；
并且其中：
v)CDR1，CDR2和CDR3如上文定义，并且优选地如按照上述一种优选 的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
本发明纳米体的两种特别优选的但非限制性的组是按照上述a)；按照上述I)到a-4)；按照上述b)；按照上述b-1)到b-4)；按照上述c)；和/或按照上述c-1)到c-4)的那些，其中：
a)按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列GLEW(或如下文定义的GLEW-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q；
或者其中：
b)按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE(或KERE-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q或L，并且优选地为Q。
因此，在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米体可以具有结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
i)按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列GLEW(或如下文定义的GLEW-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q；并且其中：
ii)CDR1，CDR2和CDR3如上文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在另一个优选的但非限制性方面中，本发明的纳米体可以具有结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
i)按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE(或KERE-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q或L，并且优选地为Q；
并且其中：
ii)CDR1，CDR2和CDR3如上文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在其中按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE的本发明的纳米体中，位置37的氨基酸残基最优选地为F。在其中按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列GLEW的本发明的纳米体中，位置37的氨基酸残基选自由Y，H，I，V或F组成的组，并且最优选地为F。
因此，无论如何不限于此，基于存在于上述提及的位置的氨基酸残基，本发明的纳米体通常可以基于下列3组进行分类：
a)“GLEW-组”：按照Kabat编号方式在位置44-47具有氨基酸序列GLEW并且按照Kabat编号方式在位置108具有Q的纳米体。如本文进一步所述，在这一组内的纳米体通常在位置37具有V，并且可以在位置103具有W，P，R或S，并且优选地在位置103具有W。所述GLEW组还包括一些GLEW-样的序列，诸如下表2中提及的那些；
b)“KERE-组”：按照Kabat编号方式在位置43-46具有氨基酸序列KERE或KQRE并且按照Kabat编号方式在位置108具有Q或L的纳米体。如本文进一步所述，在这一组内的纳米体通常在位置37具有F，在位置47具有L或F；并且可以在位置103具有W，P，R或S，并且优选地在位置103具有W；
c)“103 P，R，S-组”：在位置103具有P，R或S的纳米体。这些纳米体可以在按照Kabat编号方式的位置44-47具有氨基酸序列GLEW或者在按照Kabat编号方式的位置43-46具有氨基酸序列KERE或KQRE，后者最优选地与位置37的F和位置47的L或F结合(如关于KERE-组所定义)；并且可以在按照Kabat编号方式的位置108具有Q或L，并且优选地具有Q。
因此，在一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米体可以是属于GLEW-组(如本文所定义)的纳米体，并且其中CDR1，CDR2和CDR3如上文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米体可以是属于KERE-组(如本文所定义)的纳米体，并且其中CDR1，CDR2和CDR3如上文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
因此，在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米体可以是属于103P，R，S-组(如本文所定义)的纳米体，并且其中CDR1，CDR2和CDR3如上文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
此外，更一般地，并且除了上文提及的108Q，43E/44R和103P，R，S残基之外，本发明的纳米体可以在常规VH结构域中形成(部分)VH/VL界面的一个或多个位置包含一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基比在相对应的天然存在的VH或VHH结构域同一位置天然存在的氨基酸残基更加高度带电荷，并且特别是一个或多个带电荷的氨基酸残基(如表1中提及)。
这样的取代包括，但不限于下表2中提及的GLEW-样序列；以及国际申请WO 00/29004中所述关于所谓的“微体(microbodies)”的取代，例如在位置108的Q和在位置44-47的KLEW。
在本发明的纳米体的一些实施方案中，在位置83的氨基酸残基选自由L，M，S，V和W组成的组；并且优选地为L。
此外，在本发明的纳米体的一些实施方案中，位置83的氨基酸残基选自由R，K，N，E，I和Q组成的组；并且最优选地为K或E(对于与天然存在的VHH结构域相对应的纳米体)或R(对于“人源化”纳米体，如下文所述)。在一些实施方案中位置84的氨基酸残基选自由P，A，R，S，D和V组成的组，并且最优选地是P(对于与天然存在的VHH结构域相对应的纳米体)或R(对于“人源化”纳米体，如下文所述)。
此外，在本发明的纳米体的一些实施方案中，位置104的氨基酸残基 选自由G和D组成的组；并且最优选地是G。
总而言之，在所述纳米体中如上文提及的在位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的氨基酸残基在本文中还叫作“标志残基”。所述标志残基以及在最接近的相关的人VH结构域、VH3的相对应的位置的氨基酸残基总结在表2中。
在天然存在的VHH结构域中存在的这些标志残基的一些特别优选的组合在表3中提及。为了比较，叫作DP-47的人VH3的相对应氨基酸残基以斜体显示。
表2：纳米体中的标志残基
注释：
(1)：特别地，但是不排除，与在位置43-46的KERE(SEQ ID NO：437)或KQRE(SEQ IDNO：438)组合。
(2)：在位置44-47通常为GLEW(SEQ ID NO：439)。
(3)：在位置43-46通常为KERE或KQRE，例如，在位置43-47为KEREL(SEQ ID NO：440)，KEREF(SEQ ID NO：441)，KQREL(SEQ IDNO：442)，KQREF(SEQ ID NO：443)或KEREG(SEQID NO：444)。备选地，还可能是序列诸如TERE(SEQ ID NO：445)(例如TEREL(SEQ IDNO：446))，KECE(SEQ ID NO：447)(例如KECEL(SEQ ID NO：448)或KECER(SEQ ID NO：449))，RERE(SEQ ID NO：450)(例如REREG(SEQ ID NO：451))，QERE(SEQ ID NO：452)(例如QEREG(SEQ ID NO：453))，KGRE(SEQ ID NO：454)(例如KGREG(SEQ ID NO：455))，KDRE(SEQ IDNO：456)(例如KDREV(SEQ ID NO：457))。一些其它可能的但较不优选的序列包括例如DECKL(SEQ ID NO：458)和NVCEL(SEQ ID NO：459)。
(4)：具有在位置44-47的GLEW和在位置43-46的KERE或KQRE。
(5)：通常作为在天然存在的VHH结构域的位置83-84的KP或EP。
(6)：特别地，但是不排除，与在位置44-47的GLEW组合。
(7)：具有附加条件：当位置44-47为GLEW时，位置108总是Q。
(8)：所述GLEW组还在位置44-47包含GLEW-样序列，诸如例如GVEW(SEQ ID NO：460)，EPEW(SEQ ID NO：461)，GLER(SEQ IDNO：462)，DQEW(SEQ ID NO：463)，DLEW(SEQ IDNO：464)，GIEW(SEQ ID NO：465)，ELEW(SEQ ID NO：466)，GPEW(SEQ IDNO：467)，EWLP(SEQID NO：468)，GPER(SEQ ID NO：469)，GLER(SEQ ID NO：470)和ELEW。
在所述纳米体中，除了所述标志残基外在任何其它位置的每一氨基酸残基可以是在天然存在的VHH结构域的相应位置(按照Kabat编号方式)天然存在的任何氨基酸残基。
对于熟练的技术人员这样的氨基酸残基应该是清楚的。表4-7提及一些非限制性的残基，其可以存在于天然存在的VHH结构域的FR1、FR2、FR3和FR4的任一位置(按照Kabat编号方式)。对于任一位置，在天然存在的VHH结构域的任一位置最经常存在的氨基酸残基(并且其在纳米体中对于所述位置是最优选的氨基酸残基)以粗体显示；并且对于每一位置的其它优选的氨基酸残基已加下划线(注意：在天然存在的VHH结构域的位置26-30发现的氨基酸残基的数目支持构成编号方式Chothia(同前所述)的基础的假说，即，在这些位置的残基已经形成部分CDR1。)
在表4-7中，还提及可以在人VH3结构域的任一位置存在的一些非限制性的残基。此外，对于每一位置，在天然存在的人VH3结构域的每一位置最经常存在的氨基酸残基以粗体显示；并且其它优选的氨基酸残基加下划线。
表4：FR1中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表2的脚注)
表4：FR1中的氨基酸残基的非限制性实例(续表)
表5：FR2中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表2的脚注)
表6：FR3中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表2的脚注)
表7：FR4中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表2的脚注)
因此，在另一个优选的但非限制性的方面中，本发明的纳米体可以具有结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
i)标志残基如上文所定义；
并且其中：
ii)CDR1，CDR2和CDR3如上文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在另一个优选的但非限制性方面中，本发明的纳米体可以具有结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
并且其中
i)FR1选自由下述氨基酸序列组成的组：
[1]QVQLQESGGGXVQAGGSLRLSCAASG[26] [SEQ ID NO：1]
或者选自由与上述氨基酸序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸 取代，并没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
ii)FR2选自由下述氨基酸序列组成的组：
[36]WXRQAPGKXXEXVA[49] [SEQ ID NO：2]
或者选自由与上述氨基酸序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表5所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表5所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
iii)FR3选自由下述氨基酸序列组成的组：
[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSLXXEDTAVYYCAA[94] [SEQ ID NO：3]
或者选自由与上述氨基酸序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
iv)FR4选自由下述氨基酸序列组成的组：
[103]XXQGTXVTVSS[113] [SEQ ID NO：4]
或者选自由与上述氨基酸序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表7所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表7所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
v)CDR1，CDR2和CDR3如上文定义，并且优选地如按照上述一种优选
的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义；其中所述标志残基用“X”表示，并且如上文所定义，并且其中括号内的数字是指按照Kabat编号方式的氨基酸位置。
在另一个优选的但非限制性的方面中，本发明的纳米体具有结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
并且其中
i)FR1选自由下述氨基酸序列组成的组：
[1]QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG[26] [SEQ ID NO：5]
或者选自由与上述氨基酸序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置上的标志残基如在上述序列中所示；
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置上的标志残基如在上述序列中所示；
并且其中：
ii)FR2选自由下述氨基酸序列组成的组：
[36]WFRQAPGKERELVA[49] [SEQ ID NO：6]
[36]WFRQAPGKEREFVA[49] [SEQ ID NO：7]
[36]WFRQAPGKEREGA[49] [SEQ ID NO：8]
[36]WFRQAPGKQRELVA[49] [SEQ ID NO：9]
[36]WFRQAPGKQREFVA[49] [SEQ ID NO：10]
[36]WYRQAPGKGLEWA[49] [SEQ ID NO：11]
或者选自由与上述氨基酸序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表5所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置37，44，45和47的标志残基如在上述每一种序列中所示；和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表5所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置37，44，45和47的标志残基如在上述每一种序列中所示；
并且其中：
iii)FR3选自由下述氨基酸序列组成的组：：
[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA[94] [SEQ ID NO：12]
或者选自由与上述氨基酸序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置83和84的标志残基如在上述每一序列中所示；
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置83和84的标志残基如在上述每一序列中所示；
并且其中：
iv)FR4选自由下述氨基酸序列组成的组：
[103]WGQGTQVTVSS[113] [SEQ ID NO：13]
[103]WGQGTLVTVSS[113] [SEQ ID NO：14]
或者选自由与上述氨基酸序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置103，104和108的标志残基如在上述每一序列中所示；和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置103，104和108的标志残基如在上述每一序列中所示；
并且其中：
v)CDR1，CDR2和CDR3如上文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米体可以具有结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
并且其中
i)FR1选自由下述氨基酸序列组成的组：
[1]QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG[26] [SEQ ID NO：5]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置上的标志残基如在上述序列中所示；
并且其中：
ii)FR2选自由下述氨基酸序列组成的组：
[36]WFRQAPGKERELVA[49] [SEQ ID NO：6]
[36]WFRQAPGKEREFVA[49] [SEQ ID NO：7]
[36]WFRQAPGKEREGA[49] [SEQ ID NO：8]
[36]WFRQAPGKQRELVA[49] [SEQ ID NO：9]
[36]WFRQAPGKQREFVA[49] [SEQ ID NO：10]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表5所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置37，44，45和47的标志残基如在上述每一序列中所示；
并且其中：
iii)FR3选自由下述氨基酸序列组成的组：
[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA[94] [SEQ ID NO：12]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置83和84的标志残基如在上述每一序列中所示；
并且其中：
iv)FR4选自由下述氨基酸序列组成的组：
[103]WGQGTQVTVSS[113] [SEQ ID NO：13]
[103]WGQGTLVTVSS[113] [SEQ ID NO：14]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表7所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置103，104和108的标志残基如在上述每一序列中所示；
并且其中：
v)CDR1，CDR2和CDR3如上文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在另一个优选的但非限制性的方面中，本发明的纳米体可以具有结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
并且其中
i)FR1选自由下述氨基酸序列组成的组：：
[1]QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG[26] [SEQ ID NO：5]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置上的标志残基如在上述序列中所示；
并且其中：
ii)FR2选自由下述氨基酸序列组成的组：
[36]WYRQAPGKGLEWA[49][ SEQ ID NO：11]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表5所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置37，44，45和47的标志残基如在上述每一序列中所示；
并且其中：
iii)FR3选自由下述氨基酸序列组成的组：
[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA[94] [SEQ ID NO：12]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置83和84的标志残基如在上述每一序列中所示；
并且其中：
iv)FR4选自由下述氨基酸序列组成的组：
[103]WGQGTQVTVSS[113] [SEQ ID NO：13]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表7所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置103，104和108的标志残基如在上述每一序列中所示；
并且其中：
v)CDR1，CDR2和CDR3如上文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在本发明的纳米体中存在的一些其它构架序列可以在上文提及的欧洲专利EP656 946中找到(参见，例如，也就是授权的US等价专利5,759,808)。
在另一个优选的但非限制性的方面中，本发明的纳米体可以具有结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
并且其中
i)FR1选自由存在于SEQ ID NO’s 52-60，SEQ ID NO’s 76-86或SEQ IDNO’s 95-99的纳米体中、并且特别是存在于SEQ ID NO’s 76-86或SEQ ID NO’s 95-99的人源化纳米体中的FR1序列组成的组，或者选自由与所述FR1序列的一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守 氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与所述FR1序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置上的标志残基如在所述FR1序列中所示；
和/或选自由与所述FR1序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与所述FR1序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置上的标志残基如在所述FR1序列中所示；
并且其中：
ii)FR2选自由存在于SEQ ID NO’s 52-60，SEQ ID NO’s 76-86或SEQ IDNO’s 95-99的纳米体中、并且特别是存在于SEQ ID NO’s 76-86或SEQ ID NO’s 95-99的人源化纳米体中的FR2序列组成的组，或者选自由与所述FR2序列的一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表5所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与所述FR2序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置37，44，45和47上的标志残基如在所述FR2序列中所示；
和/或选自由与所述FR2序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守 氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表5所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与所述FR2序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置37，44，45和47上的标志残基如在所述FR2序列中所示；
并且其中：
iii)FR3选自由存在于SEQ ID NO’s 52-60，SEQ ID NO’s 76-86或SEQ IDNO’s95-99的纳米体中、并且特别是存在于SEQ ID NO’s 76-86或SEQ ID NO’s 95-99的人源化纳米体中的FR3序列组成的组，或者选自由与所述FR3序列的一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与所述FR3序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置83和84上的标志残基如在所述FR3序列中所示；
和/或选自由与所述FR3序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与所述FR3序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置83和84上的标志残基如在所述FR3序列中所示；
并且其中：
iv)FR4选自由存在于SEQ ID NO’s 52-60，SEQ ID NO’s 76-86或SEQ IDNO’s 95-99的纳米体中、并且特别是存在于SEQ ID NO’s 76-86或 SEQ ID NO’s 95-99的人源化纳米体中的FR4序列组成的组，或者选自由与所述FR4序列的一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与所述FR4序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置103，104和108上的标志残基如在所述FR4序列中所示；
和/或选自由与所述FR4序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与所述FR4序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置103，104和108上的标志残基如在所述FR4序列中所示；
并且其中：
v)CDR1，CDR2和CDR3如上文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
一些特别优选的本发明的纳米体可以选自由氨基酸序列SEQ IDNO’s 52-60，SEQID NO’s 76-86或SEQ ID NO’s 95-99，并且特别是在SEQID NO’s 76-86或SEQ ID NO’s95-99的人源化纳米体中的氨基酸序列组成的组，或者选自由与氨基酸序列SEQ ID NO’s52-60，SEQ ID NO’s 76-86或SEQ ID NO’s 95-99中的一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)所述标志残基可以如在上述表2中所示；
(2)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4-7所限定的氨基酸取代；和/或
(3)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入。
一些甚至更特别优选的本发明的纳米体可以选自由氨基酸序列SEQID NO’s 52-60，SEQ ID NO’s 76-86或SEQ ID NO’s 95-99，并且特别是在SEQ ID NO’s 76-86或SEQ IDNO’s 95-99的人源化纳米体中的氨基酸序列组成的组，或者选自由与氨基酸序列SEQ IDNO’s 52-60，SEQ ID NO’s76-86或SEQ ID NO’s 95-99中的一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)所述标志残基如在选自SEQ ID NO’s 52-60，SEQ ID NO’s 76-86或SEQ IDNO’s 95-99的相关序列中所示；
(2)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4-7所限定的氨基酸取代；和/或
(3)与选自SEQ ID NO’s 52-60，SEQ ID NO’s 76-86或SEQ ID NO’s95-99的相关序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入。
一些最优选的本发明的纳米体可以选自由氨基酸序列SEQ ID NO’s52-60，SEQ IDNO’s 76-86或SEQ ID NO’s 95-99组成的组，并且特别选自SEQ ID NO’s 76-86或SEQ IDNO’s 95-99的人源化纳米体。
从上文应该清楚，当用于本文时，术语本发明的纳米体在其最广泛意义上还包括在SEQ ID NO’s 52-60，SEQ ID NO’s 76-86或SEQ ID NO’s95-99中提及的纳米体的天然的或合成的突变体、变体、等位体、类似物和直向同源物(下文笼统叫作“类似物”)。
一般地，例如，所述类似物可以包括纳米体的同源序列、功能性片段或同源序列的功能性片段(如下文进一步所定义)。通常，在所述类似物 中，在每一构架区的每一氨基酸残基(除标志残基之外)可以被任何氨基酸残基取代，条件是所述构架区的序列相同性的总程度保持如上文所限定。然而，优选地，在所述类似物中：
-上述构架序列中的一个或多个氨基酸残基被在天然存在的VHH结构域中的同一位置上天然存在的一个或多个氨基酸残基取代。这样的取代的一些实例在上述表4-7中提及；
和/或：
-上述构架序列中的一个或多个氨基酸残基被可以视为“保守”氨基酸取代的一个或多个氨基酸残基取代，如上文所述；
和/或：
-上述构架序列中的一个或多个氨基酸残基被在天然存在的人类VH结构域中的同一位置上天然存在的一个或多个氨基酸残基取代。这通常叫作在天然存在的VHH/纳米体以及特别在所述位置的“人源化”，并且将在下文中更详细地讨论；
并且：
-对于所述VH结构域和VHH结构域在上述表4-7中都只提及1个氨基酸残基的位置优选地不被取代。
此外，尽管一般较不优选，但是在所述类似物中，一个或多个氨基酸残基可以从所述构架区删除，和/或插入到构架区(任选地除了上文提及的一个或多个氨基酸取代)，条件是所述构架区的序列相同性的总程度保持如上文所限定。标志残基不应该删除。此外，最优选地，对于所述VH结构域和VHH结构域在上述表4-7中都只提及1个氨基酸残基的位置优选地不被删除。
优选地，所述类似物应该是这样的，以致它们仍然可以结合TNF-α，对TNF-α具有亲和性和/或具有特异性，即，当应用适当的检测确定时，所述检测例如确定所述类似物与TNF的结合的检测，并且特别是下述实施例中所用的检测中的一种，具有是SEQ ID No’s 52-60，SEQ ID NO’s76-86或SEQ ID NO’s 95-99的纳米体中至少一种的亲和性和/或特异性的至少10％、优选地至少50％、更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、诸如至少90％、至少95％、至少99％或更多的亲和性和/或特异性。
通常，例如，所述类似物可以这样获得：通过提供编码天然存在的VHH结构域的核酸，将要被人源化的一个或多个氨基酸残基的密码子改变成相对应的人氨基酸残基的密码子，在适当的宿主或表达系统中表达这样获得的核酸/核苷酸序列；并且任选地分离和/或纯化这样获得的类似物，以提供基本上分离形式(如上文所定义)的所述类似物。这通常可以应用本质上已知的方法和技术而进行，所述方法和技术应该是熟练的技术人员所清楚的，例如从手册和本文所引用的参考文献和/或从下文的进一步描述中可知。备选地，并且例如，编码类似物的核酸可以以本质上已知的方法合成(例如使用用于合成预先确定氨基酸序列的核酸序列的自动装置)，并且可以在适当的宿主或表达系统中表达，在其中可以任选地分离和/或纯化这样获得的类似物，以提供基本上分离形式(如上文所定义)的所述类似物。另一种提供所述类似物的方法包括相关氨基酸序列的化学合成，其应用本质上已知的肽合成技术，诸如下文所提及的那些技术。
熟练的技术人员一般还应该清楚，纳米体(包括其类似物)还可以从人VH序列(即，氨基酸序列或相对应的核苷酸序列)起始制备，所述人VH序列诸如例如人VH3序列，诸如DP-47、DP-51、DP-54或DP-29，通过改变所述人VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，以提供具有下列各项的氨基酸序列：(a)在位置108具有Q；和/或(b)在位置44具有E和/或在位置45具有R，并且优选地在位置44具有E和在位置45具有R；和/或(c)在位置103具有P，R或S，如上文所定义。此外，这通常可以应用前段中提到的各种方法和技术进行，其应用人VH结构域的氨基酸序列和/或核苷酸序列作为起点。
当用于本文时，术语纳米体以其最广泛的意义还包括如上文所定义的本发明的纳米体(包括类似物)的部分或片段，其可能也如在下文中进一步所述。
通常，所述纳米体和/或类似物的部分或片段具有这样的氨基酸序列，即，与相对应的全长纳米体或类似物的氨基酸序列相比，其中已经删除和/或去除N末端的一个或多个氨基酸残基，C末端的一个或多个氨基酸残基，一个或多个邻接的内部氨基酸残基，或者其任何组合。还可以将一个或多个这样的部分或片段组合以提供本发明的纳米体。
优选地，包含全长纳米体和/或类似物的一个或多个部分或片段的纳米体的氨基酸序列应该与相对应的全长纳米体的氨基酸序列有至少50％、优选地至少60％、更优选地至少70％、诸如至少80％、至少90％或至少95％的序列相同性程度。
此外，包含全长纳米体和/或类似物的一个或多个部分或片段的纳米体的氨基酸序列应该优选地是这样，以致其包括相对应的全长纳米体的氨基酸序列的至少10个邻接的氨基酸残基，优选地至少20个邻接的氨基酸残基，更优选地至少30个邻接的氨基酸残基，诸如至少40个邻接的氨基酸残基。
通常，本发明的纳米体的这样的部分或片段应该具有这样的氨基酸序列，即，与相对应本发明的全长纳米体的氨基酸序列相比，其中已经删除和/或去除N末端的一个或多个氨基酸残基，C末端的一个或多个氨基酸残基、一个或多个邻接的内部氨基酸残基，或其任何组合。还可以将一个或多个这样的部分或片段组合，以提供本发明的纳米体。
按照一个优选的实施方案，当用于本文时，片段包括至少一个存在于本发明的全长纳米体中的CDR’s，优选地至少两个存在于本发明的全长纳米体中的CDR’s，更优选地至少存在于本发明的全长纳米体中的CDR2和CDR3，诸如例如所有三个存在于本发明的全长纳米体中的CDR’s。
按照另一个特别优选但非限制性的实施方案，这样的部分或片段包括至少本发明的相对应的全长纳米体的FR3、CDR3和FR4，即，例如在国际申请WO 03/050531(Lasters等)中所述。
优选地，这样的部分或片段应该是这样的，以致它们仍然可以结合TNF-α，对TNF-α具有亲和性和/或具有特异性，即，例如确定所述类似物与TNF的结合的检测，并且特别是下述实施例中所用的检测中的一种，具有是本发明的相对应的全长的纳米体的亲和性和/或特异性的至少10％、优选地至少50％、更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、诸如至少90％、至少95％、至少99％或更多的亲和性和/或特异性。
从上文的描述，应该清楚，本文所用的纳米体的氨基酸序列在至少一个构架区中的至少一个氨基酸位置不同于天然存在的VH结构域的氨基酸序列，诸如来自人类的抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列。特别 地，应该清楚，本文所用的纳米体的氨基酸序列在至少一个标志残基不同于天然存在的VH结构域的氨基酸序列，诸如来自骆驼科和/或人类的抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列。
因此，按照一个具体的实施方案，本发明的纳米体具有在一个构架区的至少一个氨基酸位置不同于天然存在的VH结构域的氨基酸序列的氨基酸序列。按照本发明一个更具体的但非限制性的实施方案，本发明的纳米体具有在至少一个标志残基不同于天然存在的VH结构域的氨基酸序列的氨基酸序列。
从上文的描述，还应该清楚，一些本发明的纳米体的氨基酸序列，诸如本发明的人源化纳米体，应该在至少一个构架区的至少一个氨基酸位置(即，在标志残基位置或在另一位置)不同于天然存在的VHH结构域的氨基酸序列。因此，按照一个具体的但非限制性的实施方案，本发明的纳米体具有在一个构架区的至少一个氨基酸位置不同于天然存在的VHH结构域的氨基酸序列的氨基酸序列。按照本发明一个更具体的但非限制性的实施方案，本发明的纳米体具有在至少一个标志残基不同于天然存在的VHH结构域的氨基酸序列的氨基酸序列。
本发明在其最广泛意义上还包括本发明的纳米体的衍生物。这样的衍生物通常可以通过本发明的纳米体和/或形成本发明的纳米体的一个或多个氨基酸残基的修饰而获得，并且特别是通过化学和/或生物(例如，酶促)修饰。
熟练的技术人员应该清楚这样的修饰的实例，以及纳米体序列中可以以这样的方式修饰的氨基酸残基的实例(即，在蛋白骨架上但是优选地在侧链上)，可以用来引入所述修饰的方法和技术以及所述修饰的潜在用途和优点。
例如，这样的修饰可以包括向本发明的纳米体内或向本发明的纳米体上引入(例如，通过共价连接或以其它适当的方式)一个或多个官能团、残基或部分，并且特别是赋予本发明的纳米体一种或多种理想的特性或官能性的一个或多个官能团、残基或部分。熟练的技术人员应该清楚所述官能团的实例。
例如，所述修饰可以包括引入(例如，通过共价结合或以任何其它适当的方式)一个或多个这样的官能团，即，所述官能团增加本发明的纳米体的半衰期、溶解性和/或吸收，减少本发明的纳米体的免疫原性和/或毒性，消除或减弱本发明的纳米体的任何不理想的副作用，和/或赋予本发明的纳米体和/或多肽其它的有利特性和/或减少本发明的纳米体和/或多肽的不理想特性；或者两种或多种上述的任何组合。所述官能团的实例以及引入所述官能团的技术的实例应该为熟练的技术人员清楚，并且通常包括上文引用的综合背景技术中提及的所有官能团和技术，以及本质上已知的用于修饰药物蛋白并且特别用于修饰抗体或抗体片段(包括ScFv’s和单结构域抗体)的官能团和技术，关于其的参考文献例如参考Remington′s Pharmaceutical Sciences(Remington′s药物科学)，第16版，MackPublishing Co.，Easton，PA(1980)。例如，所述官能团可以直接连接(例如共价地)到本发明的纳米体上，或者任选地通过适当的接头或间隔，这也为熟练的技术人员所清楚。
关于增加半衰期和/或减少药物蛋白的免疫原性最广泛应用的一种技术包括适当的药用聚合物诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(诸如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)的附着。一般地，可以应用聚乙二醇化作用的任何适当的形式，诸如本领域中用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv’s)的聚乙二醇化作用；参考例如可以参考Chapman，Nat.Biotechnol.，54，531-545(2002)；Veronese和Harris，Adv.Drug Deliv.Rev.54，453-456(2003)，Harris和Chess，Nat.Rev.Drug.Discov.，2，(2003)以及在WO 04/060965中。用于蛋白聚乙二醇化的各种试剂还可以商购，例如从美国Nektar Therapeutics购得。
优选地，应用定向聚乙二醇化，特别是通过半胱氨酸-残基(参见例如Yang等，Protein Engineering，16，10，761-770(2003))。例如，出于这一目的，PEG可以附着到本发明的纳米体中天然存在的半胱氨酸残基上，本发明的纳米体可以这样进行修饰，以适当地引入一个或多个用于PEG附着的半胱氨酸残基，或者可以将包括一个或多个用于PEG附着的半胱氨酸残基的氨基酸序列融合到本发明的纳米体的N-和/或C-端，熟练的技术人员本质上已知所有应用的蛋白质加工技术。
优选地，对于本发明的纳米体和蛋白，使用具有大于5000的分子量的PEG，诸如大于10,000并且小于200,000，诸如小于100,000；例如在20,000-80,000范围。
关于聚乙二醇化，应该注意，通常本发明还包括已经在一个或多个氨基酸位置被聚乙二醇化的任何本发明的纳米体和/或本发明的多肽，优选地以这样的方式，即，所述聚乙二醇化(1)增加体内半衰期；(2)减少免疫原性；(3)提供关于聚乙二醇化本质上已知的一种或多种更有利的其它特性；(4)基本上不影响所述纳米体和/或多肽对TNF-α的亲和性(例如，当通过适当的检测测定时，诸如下述实施例中所述的那些检测，没有减小大于90％的所述亲和力，优选地没有减小大于50％的所述亲和力，并且更优选地没有减小大于10％的所述亲和力)；和/或(5)没有影响本发明的纳米体和/或多肽的任何其它理想的特性。熟练的技术人员应该清楚适宜的PEG-基团以及特异性地或非特异性地附着其的方法。例如，用于所述聚乙二醇化的适宜的试剂盒和试剂可以从Nektar(CA，USA)获得。
另外，通常较不优选的修饰包括N-连接或O-连接的糖基化作用，通常作为共-翻译和/或翻译后修饰的部分，其取决于用于表达本发明的纳米体或多肽的宿主细胞。
另一种修饰可以包括引入一种或多种可检测的标记或其它信号-产生基团或部分，其取决于所标记纳米体的目的用途。适宜的标记以及附着、使用和检测它们的技术是熟练的技术人员所清楚的，并且例如包括但不限于，荧光标记(诸如荧光素、异硫氰酸盐、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛(o-phthaldehyde)、以及荧光胺和荧光素金属诸如152Eu或其它来自镧系的金属)，磷光性标记、化学发光标记或生物发光标记(诸如鲁米那、异鲁米诺、theromatic acridinium ester、咪唑、acridinium盐、草酸酯、二氧杂环丁烷或GFP及其类似物)，放射性-同位素(诸如3H，125I，32P，35S，14C，51Cr，36Cl，57Co，58Co，59Fe和75Se)，金属、金属螯合物或金属阳离子(例如金属阳离子诸如99mTc，123I，111In，131I，97Ru，67Cu，67Ga和68Ga，或其它特别适合用于体内、体外或原位诊断和成像的金属或金属阳离子，诸如(157Gd，55Mn，162Dy，52Cr和56Fe))，以及发色团和酶(诸如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-V-类固醇异构酶、酵母 醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、生物素-抗生物素蛋白过氧化酶、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶)。其它适宜的标记为熟练的技术人员所清楚，并且例如包括可以应用NMR或ESR光谱检测的部分。
例如，这样标记的本发明的纳米体和多肽可以用于体外、体内或原位检测(包括本质上已知的免疫检测，诸如ELISA，RIA，EIA和其它“三明治检测”等)，以及体内诊断和成像目的，这取决于特定的标记的选择。
熟练的技术人员应该清楚，另一种修饰可以包括引入螯合基团，例如以螯合上文提到的金属或金属阳离子之一。例如，适当的螯合基团包括但不限于二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
另一种修饰可以包括引入作为特异性结合对诸如生物素-(链霉)抗生物素蛋白结合对的一部分的官能团。这样的官能团可以用来将本发明的纳米体与另一种蛋白、多肽或化学化合物结合，所述另一种蛋白、多肽或化学化合物与所述结合对的另一半结合，即，通过形成所述结合对。例如，本发明的纳米体可以缀合到生物素上，并且连接到与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的另一种蛋白、多肽、化合物或载体上。例如，这样缀合的纳米体可以用作报道子，例如在可检测的信号产生剂与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的诊断系统中用作报道子。例如，这种结合对还可以用来将本发明的纳米体与载体结合，包括适用于药物目的的载体。一个非限制性的实例是Cao和Suresh，Journal of DrugTargetting(药物靶向杂志)，8，4，257(2000)所述的脂质体制剂。这种结合对还可以用来将治疗活性剂与本发明的纳米体结合。
对于一些应用，特别是对于意欲杀死表达本发明的纳米体所针对的靶点的细胞(例如，在治疗癌症时)，或者意欲减少或减缓所述细胞的生长和/或增殖的应用中，本发明的纳米体还可以与毒素或者毒性残基或部分连接。例如，可以与本发明的纳米体连接以提供细胞毒性化合物的毒性部分、化合物或残基的实例对于熟练的技术人员是清楚的，并且例如，可以在上文引用的现有技术和/或本文的进一步描述中找到。一个实例是所谓的ADEPTTM技术WO 03/055527。
熟练的技术人员应该清楚其它可能的化学和酶促修饰。这种修饰还可以为研究目的引入(例如，为了研究功能-活性关系)。例如，参考参见Lundblad和Bradshaw，Biotechnol.Appl.Biochem.(生物技术应用生物化学)，26，143-151(1997)。
如上文提及，本发明还涉及包括至少一种VHH结构域(即，如使用本发明的方法所鉴定)或至少一个基于其的纳米体的蛋白或多肽。
按照本发明的一个非限制性的实施方案，所述本发明的多肽基本上由纳米体组成。“基本上由……组成”意指本发明的多肽的氨基酸序列与纳米体的氨基酸序列(如上文提及)完全相同，或者与纳米体的氨基酸序列相对应，其中有限数目的氨基酸残基，诸如1-10个氨基酸残基并且优选地1-6个氨基酸残基，诸如1，2，3，4，5或6个氨基酸残基，已经添加到所述纳米体的氨基酸序列的氨基末端、羧基末端或者氨基末端和羧基末端两端。
所述氨基酸残基可以或者不可以变化、改变或者另外影响所述纳米体的(生物学)特性，并且可以或者不可以为所述纳米体添加其它的官能性。例如，所述氨基酸残基：
a)可以包括N-端Met残基，例如，因此在异源宿主细胞或宿主生物体内表达；
b)可以形成信号序列或前导序列，当合成时其引导所述多肽纳米体从宿主细胞中分泌。适宜的分泌性前导肽应该是熟练的技术人员所清楚的，并且可以是本文进一步所述的。通常，这样的前导序列与所述纳米体的N端连接，尽管本发明在其最广泛意义上不限于此；
c)可以形成这样的序列或信号，即，所述序列或信号允许所述纳米体导向和/或透过或进入特异性的器官、组织、细胞、或者细胞的部分或区室，和/或所述序列或信号允许所述纳米体透过或穿过生物屏障诸如细胞膜、细胞层诸如上皮细胞层、肿瘤包括实体瘤、或血脑屏障。所述氨基酸序列的实例对于熟练的技术人员是清楚的。一些非限制性的实例是在WO 03/026700和Temsamani等，Expert Opin.Biol.Ther.(生物学治疗的专家观点)，1，773(2001)；Temsamani和Vidal，Drug Discov.Today(今日药物发现)，9，1012(004)以及Rousselle，J.Pharmacol.Exp.Ther.(药理学和 实验治疗学杂志)，296，124-131(2001)中所述的小肽载体(“Pep-trans载体”)，和由Zhao等，Apoptosis(程序性细胞死亡)，8，631-637(2003)所述的膜易位体序列。例如，用于抗体片段细胞内靶向的C端和N端氨基酸序列由Cardinale等，Methods(方法)，34，171(2004)所述。关于细胞内靶向的其它适宜的技术包括所谓的“胞内抗体”的表达和/或应用，所述“胞内抗体”包括本发明的纳米体，如下文所提及；
d)可以形成“标记”，例如允许或促进所述纳米体的纯化的氨基酸序列或残基，例如使用针对所述序列或残基的亲和技术进行纯化。然后，所述序列或残基可以被去除(例如，通过化学或酶促分裂)，以提供纳米体序列(为了这一目的，所述标记可以任选地通过可分裂的接头序列与所述纳米体序列连接或包含可分裂的基序)。这种残基的一些优选的但非限制性的实例是多组氨酸残基、谷胱甘肽(glutatione)残基以及myc-标记诸如AAAEQKLISEEDLNGAA[SEQ ID NO：476]；
e)可以是已经被官能化和/或可以作为官能团附着的位点的一个或多个氨基酸残基。适宜的氨基酸残基和官能团应该是熟练的技术人员所清楚的，并且包括但不限于，本文为本发明的纳米体的衍生物提及的氨基酸残基和官能团。
按照另一个实施方案，本发明的多肽包括本发明的纳米体，所述多肽在其氨基末端、在其羧基末端、或者在其氨基末端和其羧基末端两端融合至少一个其它氨基酸序列，即，以提供包括所述本发明的纳米体和一个或多个其它氨基酸序列的融合蛋白。这种融合体在本文还叫作“纳米体融合体”。
所述一个或多个其它氨基酸序列可以是任何适宜的和/或理想的氨基酸序列。所述其它氨基酸序列可以或不可以变化、改变或另外影响所述纳米体的(生物学)特性，并且可以或不可以为本发明的纳米体或多肽加入其它的官能性。优选地，所述其它氨基酸序列是这样的，以致它赋予本发明的纳米体或多肽一种或多种理想的特性或官能性。
这样的氨基酸序列的实例是熟练的技术人员所清楚的，并且通常可以包括基于常规抗体及其片段(包括但不限于ScFv’s和单结构域抗体)的 用于肽融合的所有氨基酸序列。例如，参考参见Holliger和Hudson，Nature Biotechnology(自然生物技术)，23，9，1126-1136(2005)的综述。
例如，与本发明的纳米体本质上相比，这样的氨基酸序列可以是这样的氨基酸序列，即，其增加本发明的多肽的半衰期、溶解性、或吸收，减少本发明的多肽的免疫原性或毒性，消除或减弱本发明的多肽的不理想的副作用，和/或赋予本发明的多肽其它有利的特性和/或减少本发明的多肽的不理想特性。所述氨基酸序列的一些非限制性实例为血清蛋白，诸如人血清白蛋白(参见，例如WO 00/27435)或半抗原分子(例如被循环抗体识别的半抗原，参见例如WO 98/22141)。
所述其它的氨基酸序列还可以提供第二结合位点，所述结合位点可以针对任何理想的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或表位(包括但不限于本发明的纳米体所针对的相同的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或表位，或者不同的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或表位)。例如，所述其它氨基酸序列可以提供针对血清蛋白(诸如例如，人血清白蛋白或另一种血清蛋白，诸如IgG)的第二结合位点，以在血清中提供增加的半衰期。例如，参考参见EP 0 368684，WO 91/01743，WO 01/45746和WO 04/003019(其中提及各种血清蛋白)，本申请人的题目为“NanobodiesTM against amyloid-beta and polypeptides comprising the samefor the treatment of degenerative neural diseases such as Alzheimer’s disease(用于治疗退行性神经疾病诸如阿尔茨海默病的针对β-淀粉样蛋白的纳米体TM及包含其的多肽)”的国际申请(其中提到各种其它的蛋白)，以及Harmsen等，Vaccine(疫苗)，23(41)；4926-42。
按照另一个实施方案，所述一个或多个其它氨基酸序列可以包括常规4-链抗体(并且特别是人抗体)的和/或重链抗体的一个或多个部分、片段或结构域。例如，尽管通常较不优选，本发明的纳米体可以连接常规的(优选人的)VH或VL结构域，或者连接VH或VL结构域的天然的或合成的类似物，同样任选地通过接头序列(包括但不限于其它(单一)结构域抗体，诸如Ward等所述的dAb’s)而连接。
所述至少一个纳米体还可以连接一个或多个(优选人的)CH1，CH2和/或CH3结构域，任选地通过接头序列连接。例如，连接适当的CH1结 构域的纳米体，例如——同适当的轻链一起——用来产生类似于常规Fab片段或F(ab’)2片段的抗体片段/结构，但是其中一个或者(F(ab’)2片段的情形中)一个或两个常规VH结构域已被本发明的纳米体取代。此外，两个纳米体可以连接到CH3结构域上(任选地通过接头)，以提供具有增加的体内半衰期的构建体。
按照本发明的多肽的一个具体的实施方案，一个或多个本发明的纳米体可以连接一个或多个抗体部分、片段或结构域，所述抗体部分、片段或结构域赋予本发明的多肽一种或多种效应器功能和/或可以赋予与一个或多个Fc受体结合的能力。例如，为了这一目的，并且不限于此，所述一个或多个其它氨基酸序列可以包括抗体的一个或多个CH2和/或CH3结构域，诸如来自重链抗体(如本文所述)，并且更优选地来自常规的人4-链抗体；和/和可以形成(部分)和Fc区，例如来自IgG，来自IgE或来自另一种人Ig。例如，WO 94/04678描述包括骆驼VHH结构域或其人源化衍生物(即，纳米体)的重链抗体，其中所述骆驼科CH2和/或CH3结构域已被人CH2和CH3结构域取代，以提供由2个重链组成的免疫球蛋白，每一重链包括纳米体和人CH2和CH3结构域(但不是CH1结构域)，所述免疫球蛋白具有由所述CH2和CH3结构域提供的效应器功能，并且所述免疫球蛋白可以在没有任何轻链存在时起作用。可以适当地连接到本发明的纳米体上以提供效应器功能的其它氨基酸序列是熟练的技术人员所清楚的，并且可以基于理想的效应器功能进行选择。例如，参考参见WO04/058820，WO 99/42077和WO 05/017148，以及Holliger和Hudson，同前所述.的综述。与本发明相对应的纳米体相比，本发明的纳米体与Fc片段的偶联也可以导致增加的半衰期。对于一些应用，使用赋予增加的半衰期而没有任何生物学显著的效应器功能的Fc片段和/或恒定结构域(即，CH2和/或CH3结构域)也可以是适宜的或者甚至是优选的。包括具有增加的体内半衰期的一个或多个纳米体和一个或多个恒定结构域的其它适宜的构建体应该是熟练的技术人员所清楚的，并且例如，可以包括任选地通过接头序列连接到CH3结构域上的2个纳米体。通常，具有增加的半衰期的任何融合蛋白或衍生物优选地具有大于50kD的分子量，肾吸收的截断值。
所述其它氨基酸序列还可以形成信号序列或前导序列，当合成时其引导本发明的纳米体或多肽从宿主细胞中分泌(例如，以提供本发明的多肽的前-(pre-)、原-(pro-)或前原-(prepro-)形式，这取决于用来表达本发明的多肽的宿主细胞)。
所述其它氨基酸序列还可以形成这样的序列或信号，即，所述序列或信号允许本发明的纳米体或多肽导向和/或透过或进入特异性的器官、组织、细胞、或者细胞的部分或区室，和/或所述序列或信号允许本发明的纳米体或多肽透过或穿过生物屏障诸如细胞膜、细胞层诸如上皮细胞层、肿瘤包括实体瘤、或血脑屏障。所述氨基酸序列的适当的实例应该是熟练的技术人员所清楚的，并且例如包括但不限于，上文提及的“Peptrans”载体，由Cardinale等所述的序列，以及本质上已知可以用来表达或生产本发明的纳米体和多肽的氨基酸序列和抗体片段，即所谓的“胞内抗体”，例如在WO 94/02610，WO 95/22618，US-A-7004940，WO 03/014960，WO99/07414；WO 05/01690；EP 1 512 696；以及在Cattaneo，A.&Biocca，S.(1997)Intracellular Antibodies：Development and Applications(细胞内抗体：发展和应用).Landes and Springer-Verlag；和在Kontermann，Methods(方法)34，(2004)，163-170，以及本文所述的其它参考文献中所述。
对于一些应用，特别是对于意欲杀死表达本发明的纳米体所针对的靶点的细胞(例如，在治疗癌症时)，或者意欲减少或减缓所述细胞的生长和/或增殖的应用中，本发明的纳米体还可以与(细胞)毒性蛋白或多肽连接。例如，可以与本发明的纳米体连接以提供细胞毒性多肽的所述毒性蛋白和多肽的实例对于熟练的技术人员是清楚的，并且例如，可以在上文引用的现有技术和/或本文的进一步描述中找到。一个实例是所谓的ADEPTTM技术WO 03/055527。
按照一个非限制性的实施方案，在本发明的纳米体或多肽的氨基酸序列中可以加入、插入和/或取代一个或多个氨基酸残基，以提供用于PEG-基团附着的一个或多个特异性的氨基酸残基。
蛋白药物的功效取决于其中和靶点的能力，并且取决于潜在药物固有的药物代谢动力学。由于肾脏通常滤出低于60,000道尔顿(Da)的分子，所以减少清除的努力集中在增加生物药物的分子量上，其通过蛋白融合 (Syed等，1997)，糖基化或使用聚乙二醇聚合物进行修饰，即，聚乙二醇化作用(Lee等，1999；Abuchowski等，1977；Nucci等，1991；Lecolley，等，Chem Commun(化学通讯)，2004；Tao等，J Am Chem Soc(美国化学会杂志)，2004；Mantovani等，2005)。这些方法成功地延长了生物药物的体内暴露。
备选地，半衰期可以使用另一种聚乙二醇化试剂POLY PEG进行延长，POLY PEG用于二价纳米体TNF56或TNF55的缀合。POLY PEG是栉状聚合物，在甲基丙烯酸骨架上具有PEG齿。POLY PEGs可以在PEG链长度上不同，在甲基丙烯酸骨架上不同，以及在活性末端基团上不同，其决定将POLY PEG与所述纳米体缀合的方法。与存在于所述纳米体中的C-端半胱氨酸的位点-特异性缀合可以通过在POLY PEG中的活性马来酰亚胺末端-基团而实现。
本发明还包括在一个或多个氨基酸位置糖基化的任何本发明的纳米体和/或本发明的多肽，糖基化通常取决于用来表达本发明的纳米体或多肽的宿主(如下文进一步所述)。
按照一个非限制性的实施方案，可以将一个或多个氨基酸残基添加到、插入和/或取代在本发明的纳米体或多肽的氨基酸序列中，以提供可以被所用的宿主生物体糖基化的一个或多个特异的氨基酸残基和/或位点。通过一个优选的但非限制性的实例，例如，在本发明的纳米体的CDR2内位置50上的N-残基可以被Q、D或S残基取代，以提供糖基化位点，例如，用于通过毕赤酵母(Pichia)糖基化。
按照另一个实施方案，本发明的多肽可以包括纳米体的氨基酸序列，其在其氨基末端、在其羧基末端、或者在其氨基末端和其羧基末端两端融合至少一个其它氨基酸序列。
此外，所述其它氨基酸序列可以或不可以变化、改变或者另外影响所述纳米体的(生物学)特性，并且可以或者不可以为所述纳米体添加其它的官能性。
例如，按照一个优选的但非限制性的实施方案，所述其它氨基酸序列可以包括至少一个其它纳米体，以提供包括至少2个，诸如3个、4个或 5个纳米体的本发明的多肽，其中所述纳米体可以任选地通过一个或多个接头序列(如本文所定义)连接。
包括两个或多个纳米体的本发明的多肽在本文还叫作“多价”多肽。例如，本发明的“二价”多肽包括2个纳米体，任选地通过一个接头序列连接，而本发明的“三价”多肽包括3个纳米体，任选地通过两个接头序列连接；等等。
在本发明的多价多肽中，所述两个或多个纳米体可以是相同的或不同的。例如，在本发明的多价多肽中的两个或多个纳米体：
-可以针对同一抗原，即，针对所述抗原的相同部分或表位或者针对所述抗原的两个或多个不同部分或表位；和/或：
-可以针对不同的抗原；
或其组合。
因此，例如，本发明的二价多肽：
-可以包括2个相同的纳米体；
-可以包括针对抗原的第一部分或表位的第一纳米体和针对所述抗原的同一部分或表位或者针对所述抗原的另一部分或表位的第二纳米体；
-或者可以包括针对第一抗原的第一纳米体和针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第二纳米体；
然而，例如，本发明的三价多肽：
-可以包括针对同一抗原的相同的或不同的部分或表位的3个相同的或不同的纳米体；
-可以包括针对第一抗原的相同的或不同的部分或表位的2个相同的或不同的纳米体和针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第三纳米体；或
-可以包括针对第一抗原的第一纳米体，针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第二纳米体，和针对与所述第一和第二抗原不同的第三抗原的第三纳米体。
包含至少两个纳米体的本发明的多肽，其中至少一个纳米体针对第一抗原，并且至少一个纳米体针对不同于所述第一抗原的第二抗原，还叫 作“多特异性”纳米体。因此，“双特异性”纳米体是包括至少一个针对第一抗原的纳米体和至少一个针对第二抗原的其它纳米体的纳米体，而“三特异性”纳米体是这样的纳米体，即，其包括至少一个针对第一抗原的纳米体，至少一个针对第二抗原的其它纳米体，和至少一个针对第三抗原的其它纳米体；等等。
因此，在它们最简单的形式中，本发明的双特异性多肽是本发明的二价多肽(如本文所定义)，其包括针对第一抗原的第一纳米体，和针对第二抗原的第二纳米体，其中所述第一和第二纳米体可以任选地通过一个接头序列(如本文所定义)而连接；而最简单的形式的本发明的三特异性多肽是本发明的三价多肽(如本文所定义)，其包括针对第一抗原的第一纳米体，针对第二抗原的第二纳米体，和针对第三抗原的第三纳米体，其中所述第一、第二和第三纳米体可以任选地通过一个或多个，并且特别是一个或多个特别是两个接头序列连接。
然而，从上文所述应该清楚，本发明并不限于此，在这种意义上，本发明的多特异性多肽可以包括任何数目的针对两个或多个不同抗原的纳米体。
关于包含一个或多个VHH结构域的多价和多特异性多肽及其制备，参考还参见Conrath等，J.Biol.Chem.(生物的化学杂志)，卷276，10.7346-7350，以及EP 0 822 985。
在本发明的多肽中，所述一个或多个纳米体和所述一个或多个多肽可以直接彼此连接(例如在WO 99/23221中所述)和/或可以通过一个或多个适宜的间隔或接头或其任意组合而彼此连接。
用于多价和多特异性多肽的适宜的间隔或接头应该是熟练的技术人员所清楚的，并且通常可以是本领域用来连接氨基酸序列的任何接头或间隔。优选地，所述接头或间隔适合用于构建意欲药用的蛋白或多肽。
一些特别优选的间隔包括本领域中用于连接抗体片段或抗体结构域的间隔和接头。这些包括上文所引用的综合背景技术中提及的接头，以及例如在本领域中用于构建双抗体或ScFv片段的接头(在这一方面，然而，应该注意，尽管在双抗体和在ScFv片段中，所用的接头序列应该具有某种长度、某种程度的挠性以及允许相关的VH和VL结构域靠近在一起形成 完整的抗原-结合位点的其它特性，但是，由于每一纳米体本身形成完整的抗原-结合位点，所以对于用于本发明的多肽的接头的长度和挠性没有特别的限制)。
其它适宜的接头通常包括有机化合物或聚合物，特别是适用于药用蛋白的那些。例如，聚(乙二醇)部分已经用来连接抗体结构域，参见例如WO 04/081026。
下列情形也在本发明范围内，所用接头赋予本发明的多肽一种或多种其它有利特性或官能性，和/或提供用于形成衍生物和/或用于官能团附着的一个或多个位点(例如，如本文关于本发明的纳米体的衍生物的描述)。例如，包含一个或多个带电荷氨基酸残基(参见上表A-3)的接头可以提供提高的亲水特性，而形成或包含小的表位或标记的接头可以用于检测、鉴定和/或纯化目的。并且，基于本文的公开，熟练的技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头，任选地在基于一些有限的常规实验之后。
最后，当两个或多个接头用于本发明的多肽时，这些接头可以相同或不同。并且，基于本文的公开，熟练的技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头，任选地在基于一些有限的常规实验之后。
用于多价和多特异性多肽的接头应该是熟练的技术人员所清楚的，并且例如包括gly-ser接头，例如(glyxsery)z类型，诸如例如(gly4ser)3或(gly3ser2)3，如在WO 99/42077中所述；铰链样区域，诸如天然存在的重链抗体的铰链区或类似的序列。关于其它适宜的接头，参考还参见上文所引用的综合背景技术。一些特别优选的接头在SEQ ID NO’s 68和69中给出。
接头还可以为所述多价或多特异性多肽提供一些官能性。例如，包含一个或多个带电荷氨基酸残基(参见上表1)的接头可以提供增加的亲水特性，而形成或包含小的表位或标记的接头可以用于检测、鉴定和/或纯化目的。
如本文所提及，在本发明的蛋白或多肽中，本文提及的抗-TNF纳米体优选地以这样的方式连接，即，当与TNF三聚体结合时，所述蛋白或多肽能够抑制或者减少由所述TNF三聚体调控的TNF受体交联和/或由这 样的受体交联调控的信号传导；和/或以这样的方式连接，即，所述蛋白或多肽能够分子内结合TNF三聚体上的至少两个TNF受体结合位点。适当的接头如本文所述。
还如本文所提及，蛋白或多肽是否提供分子间结合或分子之外的结合可以通过大小排阻层析而评定(至少初步评定)。通过大小排阻层析，可以分析TNF-α和抗体的复合体，以确定在所述复合体中抗体和TNF-α分子的数目和比例。从这些数据可以推论出分子间或分子内结合是否发生，如同Santora和同事(Santora，L.C.，等，Anal Biochem(生物化学年刊).2001)关于建立单克隆抗体D2E7(Humira)与TNF-α在不同的抗体和靶点比例结合的化学计量学所做。从所述复合体的分子量推论出三个抗体分子与三个TNF三聚体复合，由此表明所述抗体以分子间模式结合。使用二价纳米体进行相似的实验，其中很短的接头诱导大分子复合体的形成，所述大分子复合体通过分子间键合而获得。然而，具有更长的接头的相同的二价纳米体构建体作为不连续的小复合体从凝胶过滤柱上洗脱下来，由此证明形成分子内键合。与生物检测数据结合，其中所述包含纳米体TNF1的更长的接头具有最佳效果(在所述检测中完全中和所用的TNF的量，即，10pM)，可以推测出二价纳米体的分子内结合有效地防止两个细胞结合的受体的交联以及缔合的受体的活化。已知的单克隆抗体诸如Humira或Remicade不能形成这种分子内键合，在三聚体TNF分子上总是留下两个受体结合位点，在某种程度上可以与细胞结合的受体相互作用，当在所述生物检测中测定时其转化成较少效力的中和。
备选地，蛋白或多肽是否提供分子间结合或分子之外的结合，可以通过结晶学和/或分子模拟(或其它适宜的计算机芯片技术)而评估。基于单聚体野生型TNF1/TNF-α复合体的晶体结构，产生三聚体TNF30/TNF-α复合体的模型。从这一结构，模拟最终TNF30-接头-ALB8-接头-TNF30构建体。所述TNF30-接头-ALB8-接头-TNF30构建体从结合两个TNF30分子的TNFα三聚体开始模拟。由于ALB8的结构未知，所以使用第三个TNF30分子代替，其沿N-和C-端之间的直线位于另两个纳米体之间。然后人工添加9个氨基酸的接头。
所述模型在图62中显示，清楚的是，所述9个氨基酸的接头与ALB8 一起提供充分的空间，足以跨越与TNFα结合的两个TNF30结构域之间的大约 ALB8本身已经跨越并且在充分延伸的构象中，每一接头可以跨越另一 结果，ALB8具有非常好的运动挠性，并且预计其与白蛋白的结合不会对与TNFα的结合妨碍太多。
此外，可能地，所述接头可以被缩短而不影响抗体亲抗原性，尤其是在作为ALB8的C-端的接头的情形中。由于第二个TNF30与不同的TNFα缔合的可能性随着接头的长度而增加，所以，相对交联的三聚体，这可以具有增加与相同的TNFα三聚体的结合的有利的作用。
还如本文进一步所述，与相对应的单价纳米体相比，针对理想的抗原并且针对至少一种血清蛋白诸如下文提及的血清蛋白，并且特别是针对人血清白蛋白的本发明的多特异性多肽，可以在血清中表现出增加的半衰期。
如上文所提及，本文所述的方法特别适用于产生本发明的这种多价的多特异性的多肽。
在本发明的多肽中，所述至少一个纳米体还可以与常规VH结构域或者与VH结构域的天然的或合成的类似物连接，任选地通过接头序列连接。
在本发明的多肽中，所述至少一个纳米体还可以与VL结构域或者与VL结构域的天然的或合成的类似物连接，任选地通过接头序列，以提供这样的本发明的多肽，即，所述本发明的多肽以与常规scFv片段类似的形式但是包含纳米体而不是VH结构域。
在本发明的多肽中，所述至少一个纳米体还可以与一个或多个CH1、CH2和/或CH3结构域连接，任选地通过接头序列。例如，与适宜的CH1结构域连接的纳米体，例如——同适当的轻链一起——用来产生类似于常规Fab片段或F(ab’)2片段的抗体片段/结构，但是其中一个或者(F(ab’)2片段的情形中)一个或两个常规VH结构域已被纳米体取代。这种片段还可以是异种特异性或双特异性的，即，针对两种或更多种抗原。与适宜的CH2和CH3结构域(例如来源于骆驼科的)连接的纳米体，可以用来形成单特异性或双特异性的重链抗体。最后，与适宜的CH1、CH2和CH3结构域(例如来源于人类的)连接的纳米体，——与适宜的轻链一起——可以用来形成这样的抗体，即，其与常规4-链抗体类似，但是其中一个或 两个常规VH结构域已被纳米体取代。
此外，除了所述一个或多个纳米体之外，本发明的多肽还可以包含官能团、部分或残基，例如治疗活性物质，诸如下文提及的那些，和/或标记或标志，诸如荧光标记、同位素等等，如下文进一步所述。
本发明的纳米体、本发明的多肽、以及编码其的核酸，可以以本质上已知的方式制备，熟练的技术人员应该从本文的进一步描述中而清楚。关于制备所述纳米体、多肽和核酸的一些优选的但非限制性的方法包括上文提及的和/或下文进一步所述的方法和技术。
熟练的技术人员应该清楚，用于制备本发明的纳米体和/或多肽的一种特别有用的方法通常包括步骤：
-在适宜的宿主细胞或宿主生物体(本文还叫作“本发明的宿主”)中或在另一种适宜的表达系统中，表达编码所述本发明的纳米体或多肽的核酸(本文还叫作“本发明的核酸”)，任选地接着进行：
-分离和/或纯化这样获得的本发明的纳米体或多肽。
特别地，这样的方法可以包括步骤：
-在某种条件下培养和/或维持本发明的宿主，所述条件是这样的，以致所述本发明的宿主表达和/或生产至少一种本发明的纳米体和/或多肽；
任选地接着进行：
-分离和/或纯化这样获得的本发明的纳米体或多肽。
本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式，并且优选地是双链DNA形式。例如，本发明的核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA或合成的DNA(诸如具有特别适用于在要用的宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子应用的DNA)。
按照本发明的一个实施方案，本发明的核酸是基本上分离的形式，如上文所定义。
本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于和/或是载体的部分，诸如例如质粒、黏端质粒或YAC，其也可以是基本上分离的形式。
本发明的核酸可以以本质上已知的方法制备或获得，其基于关于本文给出的本发明的多肽的氨基酸序列的信息，和/或可以从适当的天然来源分离。为了提供类似物，例如，编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列 可以进行基因定点诱变，以提供编码所述类似物的本发明的核酸。并且，熟练的技术人员应该清楚，为了制备本发明的核酸，一些核苷酸序列，诸如至少一种编码纳米体的核苷酸序列，以及例如编码一种或多种接头的核酸，还可以以适当的方法连接在一起。
用于产生本发明的核酸的技术应该是熟练的技术人员所清楚的，并且例如可以包括但不限于，自动DNA合成；基因定点诱变；将两个或多个天然存在的和/和合成的序列(或者其两个或多个部分)结合，引入引起剪截表达产物表达的突变；引入一个或多个限制性位点(例如，以产生可以使用适宜的限制性酶容易地消化和/或连接的盒和/或区)，和/或通过PCR反应的方法引入突变，所述PCR反应使用一个或多个“错配”引物，使用例如天然存在的GPCR的序列作为模板。这些以及其它技术应该是熟练的技术人员所清楚的，并且参考也参见上文提及的标准手册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及下文的实施例。
本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于和/或是遗传构建体的部分，这对于本领域的技术人员应该是清楚的。这样的遗传构建体通常包括至少一种本发明的核酸，其任选地与本质上已知的一个或多个遗传构建体元件连接，诸如例如一个或多个适宜的调控元件(诸如适当的启动子、增强子、终止子、等等)和下文提到的其它遗传构建体元件。包括至少一种本发明的核酸的所述遗传构建体在本文也叫作“本发明的遗传构建体”。
本发明的遗传构建体可以是DNA或RNA，并且优选地是双链DNA。本发明的遗传构建体还可以是适于转化要用的宿主细胞或宿主生物体的形式，适于结合到要用的宿主细胞的基因组DNA中的形式，或者适于在要用的宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传构建体可以是载体形式，诸如例如质粒、黏端质粒、YAC、病毒载体或转座子。特别地，所述载体可以是表达载体，即，可以提供体外和/或体内表达的载体(例如，在适宜的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)。
在一个优选的但非限制性的实施方案中，本发明的遗传构建体包括
a)至少一种本发明的核酸；其可操作性地连接
b)一个或多个调控元件，诸如启动子和任选地适宜的终止子；
c)并且任选地还有
d)本质上已知的一个或多个遗传构建体的其它元件；
其中术语“调控元件”、“启动子”、“终止子”和“可操作性地连接”具有它们在本领域中的通用意思(如下文进一步所述)；并且其中存在于遗传构建体中的所述“其它元件”，例如，可以是3’-或5’-UTR序列、前导序列、选择标记、表达标记/报道子基因、和/或可以促进或增加转化或结合(效率)的元件。用于所述遗传构建体的这些和其它适宜的元件对于熟练的技术人员应该是清楚的，并且例如可能取决于所用的构建体、要用的宿主细胞或宿主生物体的类型；本发明的目的核苷酸序列在其中表达的方式(例如，通过组成型的、瞬时的或可诱导的表达)；和/或要用的转化技术。
优选地，在本发明的遗传构建体中，所述至少一种本发明的核酸和所述调控元件，以及任选地所述一个或多个其它元件，彼此“可操作性地连接”，这通常意指它们彼此是功能性关系。例如，如果所述启动子能够起始或者另外控制/调控编码序列的转录和/或表达，那么启动子被视为与编码序列“可操作性地连接”(其中所述编码序列应该理解为“受控于”所述启动子)。一般地，当两个核苷酸序列可操作性地连接时，它们应该在相同的方向，并且通常还在同一阅读框中。它们通常还应该基本上邻接，尽管这也可以不是必需的。
优选地，本发明的遗传构建体的调控以及其它元件是这样的，即，它们能够在要用的宿主细胞或宿主生物体内提供它们需要的生物学功能。
例如，在要用的宿主细胞或宿主生物体中，启动子、增强子或终止子应该是“可操作的”，这意味着(例如)所述启动子应该能够起始或者另外控制/调控与其可操作性地连接(如本文所定义)的核苷酸序列——例如，编码序列——的转录和/或表达。
一些特别优选的启动子包括但不限于，本质上已知用于在细菌细胞中表达的启动子，诸如下文提及的那些和/或在实施例中所用的那些。
选择标记应该是这样的，即，其允许——即，在适当的选择条件下——已经(成功地)转化本发明的核苷酸序列的宿主细胞和/或宿主生物体与没有(成功地)转化的宿主细胞和/或宿主生物体区分开来。所述标记的一些优选的但非限制性的实例是提供针对抗生素(诸如卡那霉素或氨苄青 霉素)的抗性的基因，提供温度抗性的基因，或者在培养基中不存在某些因子、化合物和/或(食物)成分时允许所述宿主细胞或宿主生物体维持的基因，所述培养基是未转化的细胞或生物体生存所必需的。
前导序列应该是这样的，以致——在要用的宿主细胞或宿主生物体中——其允许理想的翻译后修饰和/或以致其将转录的mRNA导向细胞的理想部分或细胞器。前导序列还可以允许从所述细胞分泌表达产物。同样地，前导序列可以是在所述宿主细胞或宿主生物体中可操作的任何原-(pro-)、前-(pre-)或前原-(prepro-)序列。对于在细菌细胞中表达，前导序列可以不是必需的。
表达标记或报道子基因应该是这样的，即，——在宿主细胞或宿主生物体中——其允许检测所述遗传构建体(上存在的基因或核苷酸序列)的表达。表达标记任选地还可以允许表达产物的定位，例如，在细胞的特定部分或细胞器中和/或在多细胞生物体的特定细胞、组织、器官或部分中。所述报道子基因还可以表达为与本发明的氨基酸序列融合的蛋白。一些优选的但非限制性的实例包括荧光蛋白诸如GFP。
适宜的启动子、终止子和其它元件的一些优选的但非限制性的实例包括下述实施例中所用的那些。关于可以存在于/用于本发明的遗传构建体的启动子、选择标记、前导序列、表达标记和其它元件的一些(其它)非限制性的实例——诸如终止子、转录和/或翻译增强子和/或结合因子——参考参见上文提及的通用手册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及WO95/07463，WO 96/23810，WO 95/07463，WO 95/21191，WO 97/11094，WO97/42320，WO98/06737，WO 98/21355，US-A-6,207,410，US-A-5,693,492和EP 1 085 089中给出的实例。其它实例对于熟练的技术人员应该是显而易见的。参考也参见上文引用的综合背景技术和下文引用的其它参考文献。
本发明的遗传构建体通常可以通过将本发明的核苷酸序列与上文所述的一个或多个其它元件适当地连接而提供，例如应用上文提及的通用手册诸如Sambrook等和Ausubel等中所述的技术。
通常，本发明的遗传构建体通过将本发明的核苷酸序列插入到本质上已知的适当的(表达)载体中而获得。适当的表达载体的一些优选的但非 限制性的实例是下述实施例中所用的那些，以及下文提及的那些。
本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可以用于转化宿主细胞或宿主生物体。所述宿主细胞或宿主生物体可以是任何适当的(真菌的、原核的或真核的)细胞或细胞系或者任何适当的真菌的、原核的或真核的生物体，例如：
-细菌菌株，其包括但不限于革兰氏-阴性菌株，诸如大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株；变形菌属(Proteus)菌株，例如奇异变形菌(Proteus mirabilis)菌株；假单胞菌属(Pseudomonas)菌株，例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株；以及革兰氏-阳性菌株诸如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株或短芽孢杆菌(Bacillus brevis)菌株；链霉菌属(Streptomyces)菌株，例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)菌株；葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株，例如肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)菌株；以及乳球菌属(Lactococcus)菌株，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株；
-真菌细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：木霉属(Trichoderma)，例如Trichoderma reesei的物种；脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；粪壳属(Sordaria)，例如大孢粪壳(Sordaria macrospora)；曲霉菌(Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillus niger)或酱油曲霉(Aspergillus sojae)；或其它丝状真菌；
-酵母细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：酵母属(Saccharomyces)，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；毕赤酵母属(Pichia)，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或Pichia methanolica；汉逊酵母属(Hansenula)，例如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)；Arxula，例如Arxula adeninivorans；Yarrowia，例如Yarrowialipolytica；
-两栖类细胞或细胞系，诸如爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)；
-来源于昆虫的细胞或细胞系，诸如衍生于鳞翅目(lepidoptera)的细胞/细胞系，包括但不限于贪夜蛾(Spodoptera)SF9和Sf21细胞，或者衍生于果蝇属(Drosophila)的细胞/细胞系，诸如Schneider和Kc细胞；
-植物或植物细胞，例如在烟草(tobacco)植物中；和/或
-哺乳动物细胞或细胞系，例如来源于人、来源于哺乳动物的细胞或细胞系，包括但不限于CHO-细胞、BHK-细胞(例如BHK-21细胞)，
以及人细胞或细胞系，诸如HeLa，COS(例如COS-7)和PER.C6细胞；以及本质上已知的用于表达和生产抗体及抗体片段(包括但不限于(单一)结构域抗体和ScFv片段)的所有其它宿主或宿主细胞，这对于熟练的技术人员应该是清楚的。参考还参见上文引用的综合背景技术，以及例如WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken等，(1998)，同前所述；Riechmann和Muyldermans，(1999)，同前所述；van der Linden，(2000)，同前所述；Thomassen等，(2002)，同前所述；Joosten等，(2003)，同前所述；Joosten等，(2005)，同前所述；以及本文所应用的其它参考文献。
本发明的纳米体和多肽还可以被引入多细胞生物体的一个或多个细胞、组织或器官中并且在其中表达，例如用于预防和/或治疗目的(例如，作为基因治疗)。为了这一目的，可以将本发明的核苷酸序列以任何适当的方式引入到细胞或组织中，例如照此(例如使用脂质体)或者在它们插入到适当的基因治疗载体(例如，衍生于反转录病毒诸如腺病毒，或者细小病毒诸如腺伴随病毒)中之后。同样对于熟练的技术人员应该是清楚的，这样的基因治疗可以在体内进行和/或在患者体内原位进行，其通过给患者或患者的特定细胞或特定组织或器官施用本发明的核酸或者编码其的适当的基因治疗载体而进行；或者适宜的细胞(通常取自要治疗的患者的机体，诸如移植的淋巴细胞、骨髓吸出物或活组织切片)可以用本发明的核苷酸序列在体外进行治疗，然后适当地(重新)引入回到所述患者的机体内。所有这些可以使用熟练的技术人员公知的基因治疗载体、技术和递送系统进行，例如，Culver，K.W.，″Gene Therapy(基因治疗)″，1994，p.xii，Mary Ann Liebert，Inc.，Publishers，New York，N.Y.Giordano，Nature F Medicine 2(1996)，534-539；Schaper，Circ.Res(循环研究).79(1996)，911-919；Anderson，Science(科学)256(1992)，808-813；Verma，Nature(自然)389(1994)，239；Isner，Lancet 348(1996)，370-374；Muhlhauser，Circ.Res(循环研究).77(1995)，1077-1086；Onodera，Blood(血液学)91；(1998)，30-36；Verma，Gene Ther(基因治疗).5(1998)，692-699；Nabel，Ann.N.Y.Acad.Sci.(纽约科学院年刊)：811(1997)，289-292；Verzeletti，Hum.Gene Ther.(人类基因治疗)9(1998)，2243-51；Wang，Nature Medicine 2(自然医学2)(1996)，714-716；WO 94/29469；WO 97/00957，US5,580,859；US505895466；或Schaper，Current Opinion in Biotechnology 7(现代生物技术观点7)(1996)，635-640。例如，在本领域中已描述ScFv片段(Afanasieva等，Gene Ther.(基因治疗)，10，1850-1859(2003))和双抗体(Blanco等，J.Immunol(免疫学杂志)，171，1070-1077(2003))的原位表达。
对于纳米体在细胞中的表达，它们还可以作为所谓的“胞内抗体”表达，例如在WO94/02610，WO 95/22618和US-A-7004940；WO 03/014960中所述；在Cattaneo，A.和Biocca，S.(1997)Intracellular Antibodies：Development and Applications(细胞内抗体：发展和应用).Landes and Springer-Verlag；以及在Kontermann，Methods(方法)34，(2004)，163-170中所述。
对于生产，例如，本发明的纳米体和多肽还可以在转基因哺乳动物的乳中产生，例如在兔、母牛、山羊或绵羊的乳中(对于将转基因引入哺乳动物的通用技术参见例如US-A-6,741,957，US-A-6,304,489和US-A-6,849,992)，在植物中和植物的部分中产生，所述植物部分包括但不限于它们的叶、花、果、种子、根或块茎(例如在烟草、玉米、大豆或紫花苜蓿中)中，或者例如在蚕Bombyx mori的蛹中。
此外，本发明的纳米体和多肽还可以在不含细胞的表达系统中表达和/或生产，并且这样的系统的适当的实例应该是熟练的技术人员所清楚的。一些优选的但非限制性的实例包括在麦芽系统中的表达；在兔网织红细胞裂解物中表达；或者在大肠杆菌(E.coli)Zubay系统中表达。
如上文提及，应用纳米体的一个优点在于，基于此的多肽可以通过在适宜的细菌系统中表达而制备，并且适宜的细菌表达系统、载体、宿主细 胞、调控元件等对熟练的技术人员是清楚的，例如参考上文引用的参考文献。然而，应该注意，本发明在其最广泛意义上并不限于在细菌系统中表达。
优选地，在本发明中，应用(体内或体外)表达系统，诸如细菌表达系统，其以适于药用的形式提供本发明的多肽，并且所述表达系统也是熟练的技术人员所清楚的。也是熟练的技术人员所清楚的，适于药用的本发明的多肽可以使用肽合成技术制备。
对于工业规模的生产，用于纳米体或包含纳米体的蛋白治疗物的(工业)生产的优选的异源宿主包括大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae)的菌株，其适用于大规模表达/生产/发酵，并且特别适用于大规模药物表达/生产/发酵。所述菌株的适当的实例是熟练的技术人员所清楚的。所述菌株以及生产/表达系统也可从公司诸如Biovitrum(Uppsala，Sweden)获得。
备选地，哺乳动物细胞系，特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可以用于大规模表达/生产/发酵，并且特别用于大规模药物表达/生产/发酵。并且，所述表达/生产系统也可从上文提及的一些公司获得。
具体的表达系统的选择部分取决于特定的翻译后修饰的需要，更具体地是糖基化的需要。生产包含纳米体的重组蛋白，对于所述蛋白糖基化是理想的或者必需的，将使得应用具有将所表达的蛋白糖基化的能力的哺乳动物表达宿主成为必要。在这一方面，熟练的技术人员应该清楚，获得的糖基化模式(即，附着的残基的种类、数量和位置)将取决于表达所用的细胞或细胞系。优选地，使用人细胞或细胞系(即，形成基本上具有人糖基化模式的蛋白)，或者使用另一种哺乳动物细胞系，其可以提供基本上和/或功能上与人糖基化作用相同的糖基化模式或者至少模拟人糖基化作用。一般地，原核宿主诸如大肠杆菌不具有将蛋白糖基化的能力，并且应用更低等真核细胞诸如酵母通常导致与人糖基化作用不同的糖基化模式。不过，应该理解，所有前述宿主细胞和表达系统可以用于本发明，这取决于要获得的理想的纳米体或蛋白。
因此，按照本发明的一个非限制性实施方案，本发明的纳米体或多肽被糖基化。按照本发明的另一个非限制性实施方案，本发明的纳米体或多 肽未被糖基化。
按照本发明的一个优选的但非限制性的实施方案，本发明的纳米体或多肽在细菌细胞中生产，特别是在适于大规模药物生产的细菌细胞，诸如上文提及的菌株的细胞中生产。
按照本发明另一个优选的但非限制性的实施方案，本发明的纳米体或多肽在酵母细胞中生产，特别是在适于大规模药物生产的酵母细胞，诸如上文提及的物种的细胞中生产。
按照本发明另一个优选的但非限制性的实施方案，本发明的纳米体或多肽在哺乳动物细胞中生产，特别是在人细胞或人细胞系的细胞中，并且更特别是在适于大规模药物生产的人细胞或人细胞系的细胞中，诸如上文提及的细胞系中生产。
当在宿主细胞中的表达用来生产本发明的纳米体和蛋白时，本发明的纳米体和蛋白可以在细胞内产生(例如，在细胞溶胶中，在外周胞质或在内含体中)，然后从宿主细胞分离，并且任选地进一步纯化；或者可以在细胞外产生(例如，在培养所述宿主细胞的培养基中)，然后从培养基分离，并且任选地进一步纯化。当使用真核宿主细胞时，由于这极大地促进进一步的分离以及获得的纳米体和蛋白的下游处理，所以通常优选细胞外生产。除了少数种类的蛋白诸如毒素和溶血素之外，细菌细胞诸如上文提及的大肠杆菌的菌株一般不向细胞外分泌蛋白，并且在大肠杆菌内的分泌生产是指蛋白穿过内膜易位到外周胞质空间。外周胞质生产相对于细胞溶胶生产提供一些优点。例如，在通过特异的信号肽酶将分泌信号序列分裂之后，所分泌的产物的N-端氨基酸序列可以与天然基因产物相同。此外，在外周胞质中比在细胞质中似乎存在少得多的蛋白酶活性。另外，由于在外周胞质中更少的污染蛋白，所以蛋白纯化更简单。另一个优点是，由于外周胞质提供比细胞质更加氧化性的环境，所以可以形成正确的二硫键。在大肠杆菌中过量表达的蛋白通常在不溶的聚集体，即所谓的内含体中发现。这些内含体可以位于细胞溶胶中或在外周胞质中；从这些内含体回收生物活性蛋白需要变性/重折叠步骤。许多重组蛋白，包括治疗性蛋白，是从内含体回收的。备选地，熟练的技术人员应该清楚，可以使用细菌的重组菌株，其已被遗传修饰，以分泌理想的蛋白，并且特别是本发明的纳 米体或多肽。
因此，按照本发明的一个非限制性实施方案，本发明的纳米体或多肽是在细胞内产生并且从宿主细胞分离，并且特别是从细菌细胞或者从细菌细胞中的内含体中分离的纳米体或多肽。按照本发明的另一个非限制性的实施方案，本发明的纳米体或多肽是在细胞外产生并且从培养宿主细胞的培养基中分离的纳米体或多肽。
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的启动子包括，
-用于在大肠杆菌中表达：lac启动子(及其衍生物，诸如lacUV5启动子)；阿拉伯糖启动子；噬菌体λ的左向-(PL)和右向(PR)启动子；trp操纵子的启动子；杂合lac/trp启动子(tac和trc)；T7-启动子(更具体地是T7-噬菌体基因10的启动子)以及其它T-噬菌体启动子；Tn10四环素抗性基因的启动子；上述启动子的工程变体，其包括一个或多个拷贝的外来调控操纵基因序列；
-用于在酿酒酵母中表达：组成型：ADH1(醇脱氢酶1)，ENO(烯醇化酶)，CYC1(异-1细胞色素c)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)；PGK1(磷酸甘油酸激酶)，PYK1(丙酮酸激酶)；调控型：GAL1，10，7(半乳糖代谢酶)，ADH2(醇脱氢酶2)，PHO5(酸性磷酸酶)，CUP1(铜金属硫蛋白)；异源型：CaMV(花椰菜花叶病毒35S启动子)；
-用于在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达：AOX1启动子(醇氧化酶I)；
-用于在哺乳动物细胞中表达：人巨细胞病毒(hCMV)即时早期增强子/启动子；人巨细胞病毒(hCMV)即时早期启动子变体，其包含两个四环素操纵基因序列，以致所述启动子可以受Tet抑制基因调控；单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)启动子；劳斯肉瘤病毒长末端重复(RSV LTR)增强子/启动子；来自于人、黑猩猩、小鼠或大鼠的延伸因子1α(hEF-1α)启动子；SV40早期启动子；HIV-1长末端重复启动子；β-肌动蛋白启动子；
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的载体包括：
-用于在哺乳动物细胞中表达的载体：pMAMneo(Clontech)，pcDNA3(Invitrogen)，pMC1neo(Stratagene)，pSG5(Stratagene)，EBO-pSV2-neo(ATCC 37593)，pBPV-1(8-2)(ATCC 37110)，pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224)，pRSVgpt(ATCC37199)，pRSVneo(ATCC37198)，pSV2-dhfr(ATCC 37146)，pUCTag(ATCC 37460)和1ZD35(ATCC37565)，以及基于病毒的表达系统，诸如基于腺病毒的那些；
-用于在细菌细胞中表达的载体：pET载体(Novagen)和pQE载体(Qiagen)；
-用于在酵母或其它真菌细胞中表达的载体：pYES2(Invitrogen)和毕赤表达载体(Invitrogen)；
-用于在昆虫细胞中表达的载体：pBlueBacII(Invitrogen)和其它杆状病毒载体；
-用于在植物或植物细胞中表达的载体：例如基于花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒的载体，适宜的农杆菌(Agrobacterium)菌株，或基于Ti-质粒的载体。
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的分泌序列包括：
-用于细菌细胞诸如大肠杆菌：PelB，Bla，OmpA，OmpC，OmpF，OmpT，StII，PhoA，PhoE，MalE，Lpp，LamB等；TAT信号肽，溶血素C-端分泌信号；
-用于酵母：α-交配因子前原-序列(α-mating factor prepro-sequence)，磷酸酶(pho1)，转化酶(Suc)，等；
-用于哺乳动物细胞：在靶点蛋白是真核起源的情形中固有的信号(indigenoussignal)；鼠Igκ-链V-J2-C信号肽；等。
用于转化本发明的宿主或宿主细胞的适宜的技术对熟练的技术人员是清楚的，并且取决于要用的宿主细胞/宿主生物体和要用的遗传构建体。参考也参见上文提及的手册和专利申请。
转化后，可以进行检测并且选择已经成功转化本发明的核苷酸序列/遗传构建体的那些宿主细胞或宿主生物体的步骤。例如，这可以是基于存在于本发明的遗传构建体中的选择标记的选择步骤，或者是包括检测本发明的氨基酸序列的步骤，例如，使用特异的抗体进行。
转化的宿主细胞(其可以是稳定的细胞系的形式)或宿主生物体(其可以是稳定的突变系或株系的形式)形成本发明的另一方面。
优选地，这些宿主细胞或宿主生物体是这样的，以致它们表达或者(至 少)能够表达(例如，在适宜的条件下)本发明的氨基酸序列(并且在宿主生物体的情形中：在它的至少一种细胞、部分、组织或器官中)。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物体的其它世代、后代和/或子代，例如，其可以通过细胞分裂或者通过有性或无性生殖获得。
为了生产/获得本发明的氨基酸序列的表达，所述转化的宿主细胞或转化的宿主生物体通常可以在本发明(理想的)氨基酸序列得到表达/生产的条件下保藏、维持和/或培养。适宜的条件对熟练的技术人员是清楚的，并且通常取决于所用的宿主细胞/宿主生物体，以及取决于控制本发明的(相关)核苷酸序列表达的调控元件。此外，参考参见在上文关于本发明的遗传构建体段落中提及的手册和专利申请。
一般地，适宜的条件可以包括使用适宜的培养基，存在适宜的食物来源和/或适宜的营养素，使用适当的温度，并且任选地存在适当的诱导因子或化合物(例如，在本发明的核苷酸序列在可诱导启动子的控制下的情形中)；所有这些可以由熟练的技术人员选择。此外，在这样的条件下，本发明的氨基酸序列可以以组成型方式、以瞬时方式、或者只在适当地诱导时表达。
熟练的技术人员还应该清楚，本发明的氨基酸序列可以(首先)以不成熟的形式(如上文提及)产生，其然后可以进行翻译后修饰，这取决于所用的宿主细胞/宿主生物体。并且，本发明的氨基酸序列可以被糖基化，这也取决于所用的宿主细胞/宿主生物体。
然后，本发明的氨基酸序列可以从宿主细胞/宿主生物体和/或从培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基中分离，这使用本质上已知的蛋白分离和/或纯化技术，诸如(制备)层析和/或电泳技术、差别沉淀技术、亲和技术(例如，使用与本发明的氨基酸序列融合的特异性的、可分裂的氨基酸序列)和/或制备免疫学技术(即，使用针对要被分离的氨基酸序列的抗体)。
通常，对于药物应用，本发明的多肽可以配制成药物制剂，其包括至少一种本发明的多肽和至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且任选地一种或多种其它药物活性多肽和/或化合物。通过非限制性实例的方式，这样的制剂可以是适于下列各项的形式：口服给药，肠胃外给 药(诸如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)，局部给药，通过吸入、皮肤贴片、移植物、栓剂给药，等等。所述适宜的给药形式——其可以是固体、半固体或液体，取决于给药的方式——以及制备其所用的方法和载体，对熟练的技术人员是清楚的，并且在下文中进一步描述。
通常，本发明的纳米体和多肽可以以本质上已知的任何适当的方法配制和施用，例如，关于其的参考文献参见上文引用的综合背景技术(并且特别参见WO 04/041862，WO04/041863，WO 04/041865和WO04/041867)，以及参见标准手册，诸如Remington’sPharmaceutical Sciences(Remington’s药物科学)，第18版，Mack Publishing Company，USA(1990)或Remington，the Science and Practice of Pharmacy(Remington，制药科学和实践)，第21版，Lippincott Williams and Wilkins(2005)。
例如，本发明的纳米体和多肽可以本质上已知的用于常规抗体及抗体片段(包括ScFv’s和双抗体)和其它药物活性蛋白的任何方法配制和施用。所述制剂以及制备其的方法对于熟练的技术人员是清楚的，并且例如，包括适于肠胃外给药(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内给药)或适于局部(及透皮的或皮内)给药的制剂。
例如，用于肠胃外给药的制剂可以是适于输注或注射的无菌溶液、混悬液、分散液或乳剂。例如，用于所述制剂的适宜的载体或稀释剂包括但不限于，无菌水以及水性缓冲液和溶液，诸如生理磷酸盐缓冲液水、Ringer′s溶液、葡萄糖溶液、和Hank′s溶液；水油(wateroils)；甘油；乙醇；二醇诸如丙二醇，或者以及矿物油，动物油和植物油例如花生油、豆油，及其适宜的混合物。通常优选水性溶液或混悬液。
本发明的纳米体和多肽还可以使用递送的基因治疗方法进行施用。参见，例如，美国专利No.5,399,346，其完全结合作为参考。使用递送的基因治疗方法，转染编码本发明的纳米体或多肽的基因的初级细胞另外可以用组织特异性启动子转染靶点特异的器官、组织、移植物、肿瘤或细胞，并且另外可以使用用于亚细胞定位表达的信号和稳定序列进行转染。
因此，本发明的纳米体和多肽可以全身施用，例如，口服地，与药用赋形剂诸如惰性稀释剂或可同化的食用载体结合。它们可以包封在硬或软壳的白明胶胶囊中，可以压缩成片剂，或者可以直接与患者日常饮食的食 物结合。对于口服治疗性施用，本发明的纳米体和多肽可以与一种或多种赋形剂结合，并且以可吸收的片剂、口腔片剂、药片、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。所述组合物和制剂应该包含至少0.1％的本发明的纳米体或多肽。当然，所述组合物和制剂的百分数可以变化，并且可以便利地在所给单位剂型的约2-约60重量％之间。本发明的纳米体或多肽在这样的治疗有效组合物中的量是这样的，以致获得有效的剂量水平。
所述片剂、药片、丸剂、胶囊等还可以包含下列各项：粘合剂，诸如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或白明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；并且可以加入甜味剂，诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦，或者调味剂，诸如欧薄荷、冬青油、或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的物质之外，它还可以包含液体载体，诸如植物油或聚乙二醇。各种其它物质可以作为涂层存在，或者另外修饰所述固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂、或胶囊可以用白明胶、蜡、紫胶或糖等包被。糖浆或酏剂可以包含本发明的纳米体和多肽，作为甜味剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的甲基和丙基对羟基苯甲酸酯类，染料和调味剂诸如樱桃或橙味调味剂。当然，在制备任何单位剂型中所用的任何物质都应该是药物可接受的，并且在所用的量上基本上无毒。另外，本发明的纳米体和多肽可以结合在持续释放的制剂和装置中。
用于口服给药的制备物和制剂还可以被提供以肠衣，所述肠衣允许本发明的构建体抵抗胃环境，并且进入肠内。更一般地，用于口服给药的制备物和制剂可以适当地配置成用于递送到胃肠道的任何理想的部分。另外，适宜的栓剂可以用于递送到胃肠道内。
本发明的纳米体和多肽还可以通过输注或注射进行静脉内或腹膜内施用，本发明的纳米体和多肽或者它们的盐的溶液可以在水中制备，任选地与无毒表面活性剂混合。分散剂还可以在甘油、液体聚乙二醇、三醋精及其混合物中以及在油中制备。在普通的保存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射或输注的药物剂型可以包括无菌的水溶液或分散液或者包 含活性成分的无菌粉剂，其适合即时制备无菌注射或输注溶液或分散液，任选地包封在脂质体中。在所有情形中，在制备和保存条件下，最终剂型必须是无菌的、流动的和稳定的。液体载体或赋形剂可以是溶剂或液体分散介质，例如，其包括水、乙醇、多醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其适当的混合物。可以保持适当的流动性，例如，通过形成脂质体，在分散剂的情形中通过保持需要的颗粒大小或者通过使用表面活性剂。防止微生物作用可以通过各种抗细菌和抗真菌试剂获得，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情形中，优选地包括等渗剂，例如，糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收剂例如单硬脂酸镁和白明胶而获得。
无菌注射溶液通过将需要量的本发明的纳米体和多肽结合在适当的溶剂中，当需要时，与上文列举的其它成分一起结合，然后进行过滤除菌而制备。在用无菌粉剂制备无菌注射溶液的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上在先前的无菌过滤溶液中存在的任何其它理想的成分的粉剂。
对于局部给药，本发明的纳米体和多肽可以以纯的形式应用，即，在它们是液体的情形中。然而，通常理想地将它们作为与皮肤病学可接受的载体结合的组合物或制剂施用到皮肤上，所述载体可以是固体或液体。
有用的固体载体包括细碎分裂的固体，诸如滑石、粘土、微晶纤维素、硅石、矾土等。有用的液体载体包括水、羟烷类或二醇类或水-醇/二醇掺合剂，其中本发明的纳米体和多肽可以以有效水平溶解或分散，任选地在无毒表面活性剂的帮助下。可以添加佐剂诸如香味剂和其它抗微生物剂，以将给定用途的特性最优化。得到的液体组合物可以用作吸收衬垫，用于浸渍的绷带及其它敷料，或者使用泵型或气溶胶喷雾器喷到感染区域。
增稠剂诸如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐及酯、脂肪醇、改性纤维素或改性的矿物质还可以与液体载体一起使用，以形成易涂开的糊剂、凝胶、药膏、皂剂等，用于直接涂覆到使用者的皮肤。
可以用于将本发明的纳米体和多肽递送到皮肤的有用的皮肤病学组合物的实例是本领域已知的；例如，参见Jacquet等(U.S.Pat.No.4,608,392)， Geria(U.S.Pat.No.4,992,478)，Smith等(U.S.Pat.No.4,559,157)和Wortzman(U.S.Pat.No.4,820,508)。
本发明的纳米体和多肽的有用剂量可以通过比较它们的体外活性和在动物模型中的体内活性而确定。将在小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人的方法是本领域已知的；例如，参见U.S.Pat.No.4,938,949。
通常，本发明的纳米体和多肽在液体组合物诸如洗液中的浓度约0.1-25wt-％，优选地约0.5-10wt-％。在半固体或固体组合物诸如凝胶或粉剂中的浓度约0.1-5wt-％，优选地约0.5-2.5wt-％。
需要用于治疗的本发明的纳米体和多肽的量不但随着所选的特定的纳米体或多肽而变化，而且随着施用途径、要治疗的病况的性质以及患者的年龄和病况而变化，并且最终取决于随从医生或临床医生的判断力。此外，本发明的纳米体和多肽的剂量变化取决于靶点细胞、肿瘤、组织、移植物或器官。
理想的剂量可以便利地以单一剂量或作为在适当的时间间隔施用的分割的剂量而存在，例如，作为每天2、3、4次或更多的亚剂量。所述亚剂量本身可以进一步分割，例如，分割成许多次不连续的宽松间隔的施用；诸如从吸入器多次吸入，或者通过使用多滴到眼睛中。
施用方案可以包括长期的、日常的治疗。“长期”意指至少2周，并且优选地几个星期、月或年的持续时间。在这一剂量范围的必要的修改可以由本领域的普通技术人员仅仅使用本文的教导所给的常规实验而确定。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(Remington’s药物科学)(Martin，E.W.，ed.4)，Mack Publishing Co.，Easton，PA。在任何并发症情形中，剂量还可以由个别医生进行调整。
在另一方面中，本发明涉及预防和/或治疗本文提及的至少一种TNF-相关的疾病或紊乱的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的纳米体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。
在本发明的内容中，术语“预防和/或治疗”不但包括预防和/或治疗疾病，而且通常包括预防所述疾病的发作，减缓或逆转疾病进程，防止或减缓与所述疾病相关的一种或多种症状的发作，减少和/或减轻与所述疾 病相关的一种或多种症状，减少所述疾病和/或与之相关的任何症状的严重性和/或持续时间，和/或防止所述疾病的严重性和/或与之相关的任何症状的进一步增加，防止、减少或逆转由所述疾病以及通常对治疗患者有益的任何药理作用而引起的任何生理损害。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，并且更特别是人类。熟练的技术人员应该清楚，待治疗的受试者特别是患有或者有危险患有本文提及的疾病和紊乱的人。
本发明还涉及预防和/或治疗至少一种可以通过给患者施用本发明的纳米体或多肽而预防和/或治疗的疾病或紊乱的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的纳米体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。
更特别地，本发明涉及预防和/或治疗选自由本文列出的疾病和紊乱组成的组的至少一种疾病或紊乱的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的纳米体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及免疫治疗的方法，并且特别涉及被动免疫治疗的方法，所述方法包括给患有或者有危险患有本文提及的疾病和紊乱的受试者施用药物活性量的本发明的纳米体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。
在上述方法中，本发明的纳米体和/或本发明的多肽和/或包含其的组合物可以以任何适当的方式施用，这取决于要用的特定的药物制剂或组合物。因此，例如，本发明的纳米体和/或本发明的多肽和/或包含其的组合物可以口服、腹膜内(例如，静脉内、皮下、肌内、或者通过避开胃肠道的任何其它施用途径)、鼻内、透皮地、局部施用，通过栓剂、通过吸入方式施用，这也取决于要用的特定药物制剂或组合物。临床医生能够选择适当的施用途径和用于所述施用的适当的药物制剂或组合物，这取决于要预防或治疗的疾病或紊乱以及临床医生公知的其它因素。
本发明的纳米体和/或多肽和/或包含其的组合物按照治疗方案进行施用，所述治疗方案适于预防和/或治疗要被预防或治疗的疾病或紊乱。临床医生通常能够确定适宜的治疗方案，取决于下列因素，诸如要被预防或 治疗的疾病或紊乱，要被治疗的疾病的严重性和/或其症状的严重性，要用的本发明的特定的纳米体或多肽，要用的特定的施用途径和药物制剂(pharmaceutical formulation)或组合物，患者的年龄、性别、体重、饮食、综合病况，以及临床医生公知的类似因素。
一般地，所述治疗方案包括以一种或多种药物有效量或剂量施用一种或多种本发明的纳米体和/或多肽，或者包含其的一种或多种组合物。施用的具体量或剂量由临床医生确定，同样基于上文引用的因素。
通常，对于预防和/或治疗本文提及的疾病和紊乱，并且取决于要治疗的具体疾病或紊乱，要用的特定的本发明的纳米体和多肽的功效，具体的施用途径和使用的特定的药物制剂或组合物，本发明的纳米体和多肽一般以每天每kg体重1克-0.01微克的量施用，优选地每天每kg体重0.1克-0.1微克，诸如每天每kg体重约1，10，100或1000微克，作为单一的每日剂量连续施用(例如，通过输注)或者在一天内作为多次分割的剂量施用。临床医生通常能够确定适宜的日常剂量，这取决于本文提及的因素。还应该清楚，在具体的情形中，临床医生可以选择偏离这些量，例如，基于上文引用的因素以及它的专业判断。一般地，关于施用量的一些指导可从通过基本上相同的施用途径通常施用的相当的针对相同靶点的常规抗体或抗体片段的量而获得，但是要考虑亲和性/抗体亲抗原性、功效、生物分布、半衰期以及熟练的技术人员公知的类似因素的不同。
通常，在上述方法中，将使用单一的本发明的纳米体或多肽。然而，使用组合的两种或多种本发明的纳米体和/或多肽也在本发明范围之内。
本发明的纳米体和多肽还可以与一种或多种其它药物活性化合物或原理(principles)组合应用，即，作为组合治疗方案，其可以或者不可以引起增强效应。并且，基于上文所引用的因素及其专业判断，临床医生能够选择所述的其它化合物或原理，以及适宜的组合治疗方案。
特别地，本发明的纳米体和多肽可以与其它药物活性化合物或原理组合应用，所述其它药物活性化合物或原理是或者能够用于预防和/或治疗本文所引用的疾病和紊乱，结果可以或不可以获得增强效应。所述化合物和原理的实例，以及施用其的途径、方法和药物制剂或组合物是临床医生所清楚的。
当两种或多种物质或原理用作组合治疗方案的一部分时，它们可以通过相同的施用途径或者通过不同的施用途径在基本上相同的时间或在不同时间(例如，基本上同时地、连续地、或者按照交互方案)施用。当所述物质或原理通过相同的施用途径同时施用时，它们可以作为不同的药物制剂或组合物或者组合药物制剂或组合物的一部分进行施用，这是熟练的技术人员所清楚的。
并且，当两种或多种活性物质或原理作为组合治疗方案的一部分使用时，每一物质或原理可以以相同的量施用，并且按照与当所述化合物或原理单独使用时相同的方案施用，并且所述组合应用可以或不可以引起增强效应。然而，当所述两种或多种活性物质或原理的组合应用引起增强效应时，还可以可能地减少要施用的一种、多种或全部物质或原理的量，同时仍旧获得理想的治疗作用。例如，这可以用于避免、限制或减少当以它们的常规用量使用时与一种或多种所述物质或原理的应用相关的任何不需要的副作用，同时仍旧获得理想的药物或治疗效果。
按照本发明所用的治疗方案的效果可以以对于涉及的疾病或紊乱本质上已知的任何方式进行确定和/或遵循，这是临床医生所清楚的。在适当的并且基于病例/病例基础的情形中，临床医生还应该能够改变或改进特定的治疗方案，以便获得理想的治疗效果，避免、限制或减少副作用，和/或实现一方面获得理想的治疗效果与另一方面避免、限制或减少不理想的副作用之间的适当的平衡。
通常，应该遵循所述治疗方案，直到获得理想的治疗效果和/或持续所述理想的治疗效果需要保持的那么久。并且，这可以由临床医生确定。
因此，在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含至少一种本发明的纳米体，或至少一种本发明的多肽，以及至少一种适宜的载体(即，用于兽医应用的载体)，和任选地一种或多种其它活性物质。
本发明还涉及本发明的纳米体和/或本发明的多肽在制备药物组合物中的应用，特别是在制备用于预防和/或治疗(包括但不限于减轻至少一种症状)由TNF-α调控的和/或与TNF-α相关的(例如，与TNF-α的异常活性、TNF-α的异常水平、TNF-α的异常表达和/或针对TNF-α的异常的敏感性或反应)疾病或紊乱、或与TNF-α相关的一种生物现象相关，诸如上文提及的一种疾病或紊乱的药物组合物中的应用。
本发明还涉及用于预防和/或治疗(包括但不限于减轻至少一种症状)由TNF-α调控的和/或与TNF-α相关的(例如，与TNF-α的异常活性、TNF-α的异常水平、TNF-α的异常表达和/或针对TNF-α的异常的敏感性或反应、或与TNF-α相关的一种生物现象相关)疾病或紊乱，诸如上文提及的一种疾病或紊乱的方法，所述方法包括给需要所示方法的受试者施用治疗活性量的本发明的纳米体、本发明的多肽、和/或上文所述的药物组合物。
本发明提供包括一种或多种针对肿瘤坏死因子α(TNF-α)的多肽。本发明还涉及它们在诊断和治疗中的应用。这样的抗体可以具有与人构架序列高度同源性的构架序列。仅包括针对肿瘤坏死因子α(TNF-α)的抗体或与其它药物组合的组合物是理想的。
据信，肿瘤坏死因子α(TNF-α)在多种紊乱中起重要作用，例如，在炎性紊乱诸如类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎和多发性硬化病中。TNF-α和受体(CD120a，CD120b)都已经得到非常详细地研究。生物活性形式的TNF-α是三聚体，并且由相邻亚基形成的沟对于细胞因子-受体相互作用是重要的。已经研发了一些拮抗细胞因子作用的策略，并且目前正用于治疗各种疾病状况。
对TNF-α具有充分的特异性和选择性的TNF-α抑制因子可以是用于预防或治疗其中TNF-α参与作为病因剂的紊乱的有效的预防或治疗药物化合物。已经描述通过针对TNF-α的抗体的方式治疗毒性休克(EP 486526)，肿瘤衰退，抑制细胞毒性(US 6448380，US6451983，US 6498237)，自体免疫疾病诸如RA和局限性回肠炎(EP 663836，US 5672347，US5656272)，移植物抗宿主反应(US 5672347)，细菌性脑膜炎(EP 585705)的方法。
但是，目前还没有可用的药物对于自体免疫疾病的治疗完全有效，并且大部分受到严重毒性的限制。另外，研发针对这样的靶点序列具有充分的效果和选择性的新化学个体(NCE)是极端困难和长久的过程。另一方面，由于它们对它们的靶点具有高度特异性和低内在毒性，所以基于抗体的治疗作为药物具有显著的潜能。另外，当与新化学个体(NCE’s)的研发相比，研发时间可以极大地减少。然而，常规抗体很难针对多聚体蛋白而产生，在所述多聚体蛋白中配体的受体-结合结构域包埋在沟中，如同 TNF-α的情形。本发明中所述的衍生于骆驼科的重链抗体已知具有腔-结合倾向(WO97/49805；Lauwereys等，EMBO J(胚胎学杂志).17，5312，1998)。因此，这样的重链抗体天生适于结合诸如TNF的配体的受体结合结构域。另外，已知所述抗体在长的时间段内稳定，因而增加它们的保存寿命(Perez等，Biochemistry(生物化学)，40，74，2001)。此外，与哺乳动物细胞培养发酵相比，这样的重链抗体片段可以使用廉价的表达系统在发酵罐里‘en-masse’生产，所述廉价的表达系统诸如酵母或其它微生物(EP 0698 097)。
使用来源于资源诸如小鼠、绵羊、山羊、兔等的抗体，及其人源化衍生物作为需要调节炎症的病况的治疗由于一些原因是成问题的。传统抗体在室温下不稳定，并且必须冷冻制备和保存，这需要必要的冷冻实验室设备、保存和转运，这构成时间和费用。在发展中国家冷冻有时并不可行。此外，由于对于表达完整和活性抗体必需的哺乳动物细胞系统在时间和设备上需要高水平的支持，并且产量很低，所以所述抗体的制备或小规模生产费用高。此外，常规抗体的大的尺寸将限制组织渗透，例如，在发炎组织的位点。并且，传统抗体具有依赖于pH值的结合活性，并且因此对于用于常规生理pH值范围之外的环境不稳定，所述环境诸如例如在治疗胃出血、胃手术中。此外，传统抗体在低或高pH值不稳定，并且因此不适用于口服施用。然而，已经证明，骆驼科抗体抵抗苛刻条件，诸如极端pH值、变性试剂和高温(Dumoulin等，Protein Science(蛋白质科学)11，500，2002)，因此使得它们适于通过口服施用递送。此外，传统抗体具有依赖于温度的结合活性，并且因而不适合用于在生物活性-温度范围之外的温度(例如37±20℃)操作的检测或试剂盒。
由于它们针对它们的靶点具有高度特异性并且低内在毒性，多肽治疗剂以及特别是基于抗体的治疗剂作为药物具有显著的潜力。然而，为了制备其用于人类治疗，熟练的技术人员已知为治疗有用靶点获得的抗体需要额外的修饰，以避免当施用其时在人类个体中的不希望的免疫反应。所述修饰过程通常叫作“人源化”。熟练的技术人员已知，在除人之外的物种中获得的抗体需要人源化，以使得所述抗体治疗性地用于人类((1)CDR移植：蛋白质设计实验室(Protein Design Labs)：US 6180370，US 5693761； Genentech US 6054297；Celltech：460167，EP 626390，US 5859205；(2)镶盖术(Veneering)：Xoma：US 5869619，US5766886，US 5821123)。存在对于生产避免基本上需要人源化的或者完全排除人源化的需要的抗体生产方法的需求。存在对于具有确定的构架区或氨基酸残基并且可以施用给人类受试者而不需要基本上人源化或者完全不需要人源化的新抗体种类的需求。
常规抗体的另一种重要的缺点在于它们是复合的、大分子，并且因此相对不稳定，并且它们对于蛋白酶的降解敏感。这意味着，由于它们在这些位点不抗低pH，在这些位点和在血液中的蛋白酶作用和/或由于它们大的尺寸，所以常规抗体药物不能口服、舌下、局部、鼻、阴道、直肠或通过吸入施用。它们必须通过注射(静脉内、皮下等)施用，以克服这些问题中的一些。通过注射施用需要专业训练，以正确并且安全地使用皮下注射器或针头。还需要无菌设备，治疗性多肽的液体制剂，所述多肽无菌和稳定形式的小瓶包装，以及受试者的进入针头的适宜位点。此外，在接受注射之前以及在接受注射时，受试者通常经历身体和心理压力。因此，存在对于递送避免需要注射的治疗性多肽的方法的需要，所述方法不但节省成本/时间，而且其对于受试者还是更加便利和更加舒服的。
由于它们具有针对它们的靶点的高度特异性和低内在毒性，基于纳米体的治疗剂具有作为药物的显著潜力。然而，进一步提高它们的内在和功能亲和性可以导致对于患者的许多益处，诸如减少治疗剂的剂量，加速治疗，并且减少副作用。
本发明的一个实施方案是抗-TNF-α纳米体，所述纳米体优选地如上文进一步限定。
本发明的一个实施方案是包括至少一个抗-TNF-α纳米体的抗-TNF-α多肽，所述多肽优选地如上文进一步限定。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽，其还包括至少一个针对血清白蛋白的纳米体。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽，其中所述血清蛋白是血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素-结合蛋白、运铁蛋白、或凝血因子I中的任何一种。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽，其还包括至少一种选自由抗-IFN-γ纳米体、抗-TNF-α受体纳米体和抗-IFN-γ受体纳米体组成的组的纳米体。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽，其中针对TNF-α的纳米体数目是至少2个。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽，其中至少一个纳米体是人源化的骆驼科VHHs。
本发明的另一个实施方案是一种组合物，其包括上文所述的抗-TNF-α多肽和至少一种选自由抗-IFN-γ纳米体、抗-TNF-α受体纳米体和抗-IFN-γ受体纳米体组成的组的纳米体，所述多肽和纳米体同时、分开或顺序地施用给受试者。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽，或者上文所述的组合物，其中所述纳米体是全长纳米体的同源序列、功能片段或同源序列的功能片段。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽，或者上文所述的组合物，其中所述抗-TNF-α多肽是全长抗-TNF-α多肽的同源序列、功能片段或同源序列的功能片段。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽，或者上文所述的组合物，其中至少一个纳米体是骆驼科VHH。
本发明的另一个实施方案是编码上文所述的抗-TNF-α多肽的核酸。
本发明的另一个实施方案是鉴定调控上文所述的抗-TNF-α多肽与肿瘤坏死因子-α的结合的试剂的方法，所述方法包括步骤：
(a)在允许所述多肽和靶点之间的结合的条件下，在存在和不存在候选调节剂时，将上文所述的抗-TNF-α多肽与靶点-肿瘤坏死因子-α接触，和
(b)测定步骤(a)的多肽和靶点之间的结合，其中相对于不存在所述候选调节剂时的结合，在存在所述候选调节剂时的结合中的减少，鉴定所述候选调节剂作为调控上文所述的抗-TNF-α多肽和肿瘤坏死因子-α的结合的试剂。
本发明的另一个实施方案是鉴定通过上文所述的抗-TNF-α多肽与肿瘤坏死因子-α的结合而调控肿瘤坏死因子-α-调控的紊乱的试剂，其包括：
(a)在允许所述多肽和靶点之间的结合的条件下，在存在和不存在候选调节剂时，将上文所述的抗-TNF-α多肽与靶点-肿瘤坏死因子-α接触，和
(b)测定步骤(a)的多肽和靶点之间的结合，其中相对于不存在所述候选调节剂时的结合，在存在所述候选调节剂时的结合中的减少，鉴定所述候选调节剂作为调控肿瘤坏死因子-α-调控的紊乱的试剂。
本发明的另一个实施方案是鉴定通过上文所述的抗-TNF-α多肽与肿瘤坏死因子-α的结合而调控肿瘤坏死因子-α与其受体的结合的试剂的方法，其包括：
(a)在允许所述多肽和靶点之间的结合的条件下，在存在和不存在候选调节剂时，将上文所述的抗-TNF-α多肽与靶点-肿瘤坏死因子-α接触，和
(b)测定步骤(a)的多肽和靶点之间的结合，其中相对于不存在所述候选调节剂时的结合，在存在所述候选调节剂时的结合中的减少，鉴定所述候选调节剂作为调节肿瘤坏死因子-α与其受体的结合的试剂。
本发明的另一个实施方案是用于筛选调控肿瘤坏死因子-α-调控的紊乱的试剂的试剂盒，所述试剂盒包括上文所述的抗-TNF-α多肽和肿瘤坏死因子-α。
本发明的另一个实施方案是一种按照上述方法鉴定的调控上述抗-TNF-α多肽与肿瘤坏死因子-α的结合的未知试剂。
本发明的另一个实施方案是一种按照上述方法鉴定的调控肿瘤坏死因子-α-调控的紊乱的未知试剂。
本发明的另一个实施方案是一种上文所述的未知试剂，其中所述紊乱是炎症、类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠炎综合征和多发性硬化病中的一种或多种。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽，或上文所述的核酸，或上文所述的组合物，或上文所述用于治疗和/或预防和/或减轻与炎性进程相关的紊乱的试剂。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽，或上文所述的核酸，或上文所述的组合物，或上文所述的试剂在制备用于治疗和/或预防和/或减轻与炎性进程相关的紊乱的药物中的应用。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽或上文所述的 组合物，其用于治疗和/或预防和/或减轻对能够通过胃环境而没有物质失活的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽或上文所述的组合物用于制备治疗、预防和/或减轻对能够通过胃环境而没有物质失活的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状的药物中的应用。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽或上文所述的组合物，其用于治疗和/或预防和/或减轻对递送至阴道和/或直肠道的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽或上文所述的组合物用于制备治疗、预防和/或减轻对递送至阴道和/或直肠道的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状的药物中的应用。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽或上文所述的组合物，其用于治疗和/或预防和/或减轻对递送至鼻、上呼吸道和/或肺的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽或上文所述的组合物用于制备治疗、预防和/或减轻对递送至鼻、上呼吸道和/或肺的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状的药物中的应用。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽或上文所述的组合物，其用于治疗和/或预防和/或减轻对递送至肠黏膜的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱，其中所述紊乱增加肠黏膜的渗透性。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽或上文所述的组合物用于制备治疗、预防和/或减轻对递送至肠黏膜的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状的药物中的应用，其中所述紊乱增加肠黏膜的渗透性。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽或上文所述的组合物，其用于治疗和/或预防和/或减轻对能够有效通过舌下组织的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽或上文所述的组合物用于制备治疗、预防和/或减轻对能够有效通过舌下组织的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状的药物中的应用。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽或上文所述的组合物，其用于治疗和/或预防和/或减轻对能够有效通过皮肤的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽或上文所述的组合物用于制备治疗、预防和/或减轻对能够有效通过皮肤的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状的药物中的应用。
本发明的另一个实施方案是上文所述的方法，上文所述的试剂盒，上文所述的核酸或试剂，上文所述的核酸或试剂的应用，上文所述的组合物，上文所述的组合物的应用，上文所述的抗-TNF-α多肽，上文所述的抗-TNF-α多肽的应用，其中所述紊乱是炎症、类风湿性关节炎、COPD、哮喘、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠炎综合征、多发性硬化病、艾迪生病、自体免疫肝炎、自体免疫腮腺炎、I型糖尿病、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、急性热病性多神经炎、桥本病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、男性不育、多发性硬化病、重症肌无力、天疱疮、银屑病、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦综合征、脊椎关节病、甲状腺炎和脉管炎中的任何一种。
本发明的另一个实施方案是一种包括上述核酸或试剂、上述抗-TNF-α多肽或上述组合物，和适当的药物赋形剂的组合物。
本发明的另一个实施方案是一种诊断以肿瘤坏死因子-α的功能障碍为特征的紊乱的方法，所述方法包括：
(a)将样品与上述抗-TNF-α多肽接触，
(b)检测所述多肽与所述样品的结合，和
(c)将在步骤(b)中检测的结合与标准进行比较，其中相对于所述样品在结合中的差异是以肿瘤坏死因子-α的功能障碍为特征的紊乱的诊断。
本发明的另一个实施方案是用于筛选上文引用的紊乱的试剂盒，其使用上文所述的方法。
本发明的另一个实施方案是用于筛选上文引用的紊乱的试剂盒，其包括上文所述的分离的抗-TNF-α多肽。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽用于纯化所述肿瘤坏死因子-α的应用。
本发明的另一个实施方案是上文所述的抗-TNF-α多肽用于抑制肿瘤坏死因子-α与一个或多个肿瘤坏死因子-α受体之间的相互作用的应用。
本发明的另一个实施方案是用于生产上文所述的抗-TNF-α多肽的方法，所述方法包括步骤：
(a)获得编码针对肿瘤坏死因子-α的骆驼科VHH的双链DNA，
(b)克隆并表达步骤(b)中选择的DNA。
本发明的另一个实施方案是生产上文所述的抗-TNF-α多肽的方法，其包括：
(a)在允许所述多肽表达的条件下，培养包含能够编码上述抗-TNF-α多肽的核酸的宿主细胞，和
(b)从所述培养物回收所产生的多肽。
本发明的另一个实施方案是上文所述的方法，其中所述宿主细胞是细菌或酵母。
本发明的另一个实施方案是用于筛选炎症、类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠炎综合征或多发性硬化病中的任一种的试剂盒，其包括上述抗-TNF-α多肽。
VHHs，按照本发明，并且按照熟练的技术人员已知的，是衍生于天然没有轻链的免疫球蛋白的重链可变结构域，诸如来源于骆驼科的那些，如在WO 94/04678中所述(并且下文叫作VHH结构域或纳米体)。VHH分子比IgG分子小约10×。它们是单一多肽，并且非常稳定，抗极端pH值和温度条件。并且，它们抗蛋白酶的作用，对于常规抗体没有这种情形。此外，VHHs的体外表达产生高产量、正确折叠的功能VHHs。另外，在骆驼中产生的抗体识别除了通过应用抗体文库或通过除骆驼之外的哺乳动物免疫而产生的抗体所识别的那些以外的表位(WO 9749805)。同样地，抗-TNF-αVHH’s可以比常规抗体更有效地与TNF-α相互作用，由此更有效地阻滞其与TNF-α受体的相互作用。
TNF-α还是能够激发免疫应答的TNF-α片段。TNF-α还是能够结合针对全长TNF-α的纳米体的TNF-α片段。
针对TNF-α的纳米体意指能够以好于10-6M的亲和力结合TNF-α的纳米体。
本发明的一个实施方案是一种抗-TNF多肽，其中所述纳米体包括针对TNF-α的骆驼科VHH。
一个或多个针对TNF-α的抗-TNF多肽的纳米体可以是相同的序列。备选地，它们可以完全不具有相同的序列。在本发明范围之内，抗-TNF多肽包括抗-TNF-α-纳米体，其完全不共有相同的序列，但是其针对相同的靶点，一个或多个它的抗原。
本发明还涉及抗-TNF-α多肽，其中所述纳米体是针对TNF-α的VHH，其中所述VHH属于具有人样序列的种类。所述种类特征在于，VHHs在位置45携带来自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺组成的组的氨基酸，诸如例如L45，和在位置103的色氨酸，按照Kabat编号方式。在WO03035694中描述另一种人样种类的骆驼科纳米体，并且其包含典型地在人源或来自其它物种的常规抗体中发现的疏水性FR2残基，但是通过取代存在于来自双链抗体的VH中的保守色氨酸残基的位置103的带电荷的精氨酸残基而补偿这一亲水性损失。同样地，属于这两个种类的肽表现出针对人VH构架区的高氨基酸序列同源性，并且所述肽可以直接施用给人，没有来自于其的不利的免疫反应的预料，并且没有进一步人源化的负担。本发明还涉及能够编码所述多肽的核酸。
本发明所用的任何VHHs可以是传统种类或人样骆驼科抗体种类。所述抗体可以针对完整的TNF-α或其片段，或其同源序列的片段。这些多肽包括全长骆驼科抗体，即Fc和VHH结构域，具有人Fc结构域或VHH’s本身或衍生片段的重链骆驼科抗体的嵌合译本。
抗-血清白蛋白VHH’s可以比已知为载体蛋白的常规抗体更有效的方式与血清白蛋白相互作用。作为载体蛋白，血清白蛋白的一些表位可以通过结合的蛋白、肽以及小化学化合物而不可接近。由于VHH’s已知结合到‘不同寻常的’或非常规的表位诸如腔中(WO 97/49805)，所以可增加所述VHH’s与循环白蛋白的亲和性。
本发明还涉及这样的发现，即，本文所述的还包括一个或多个针对受试者的一种或多种血清蛋白的纳米体的抗-TNF多肽，与当没有部分所述构建体时的抗-TNF-α纳米体的半衰期相比较，令人吃惊地在所述受试者 的循环中具有显著延长的半衰期。此外，发现所述多肽表现出同样有利的纳米体特性，诸如在小鼠中保持完整的高稳定性、极端pH抗性、高温稳定性和高靶点亲和性。
血清蛋白可以是在受试者血清中找到的任何适宜的蛋白。在本发明的一方面中，所述血清蛋白是血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素-结合蛋白、运铁蛋白、或凝血因子I。取决于目的应用，诸如对于有效的治疗和/或靶点抗原的区分(compartimentalisation)所需要的半衰期，VHH-伴侣可以针对上述血清蛋白中的一种。
按照本发明的一个具体的但非限制性的方面，针对人血清白蛋白的纳米体由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
iv)CDR1是选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：
SFGMS [SEQ ID NO：36]
LNLMG [SEQ ID NO：37]
INLLG [SEQ ID NO：38]
NYWMY； [SEQ ID NO：39]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
v)CDR2是选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：
SISGSGSDTLYADSVKG [SEQ ID NO：40]
TITVGDSTNYADSVKG [SEQ ID NO：41]
TITVGDSTSYADSVKG [SEQ ID NO：42]
SINGRGDDTRYADSVKG [SEQ ID NO：43]
AISADSSTKNYADSVKG [SEQ ID NO：44]
AISADSSDKRYADSVKG [SEQ ID NO：45]
RISTGGGYSYYADSVKG [SEQ ID NO：46]
或者选自由与上述氨基酸序列之一有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
vi)CDR3是选自由下述组成的组的氨基酸序列：
DREAQVDTLDFDY [SEQ ID NO：47]
或者选自由与上述氨基酸序列之一有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/ 或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
或者选自由下列各项组成的组：
GGSLSR [SEQ ID NO：48]
RRTWHSEL [SEQ ID NO：49]
GRSVSRS [SEQ ID NO：50]
GRGSP [SEQ ID NO：51]
和/或选自由与上述氨基酸序列之一具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
在另一方面中，本发明涉及针对人血清白蛋白的纳米体，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其选自由分别具有下述CDR1，CDR2和CDR3组合之一的结构域抗体和/或单一结构域抗体组成的组：
-CDR1：SFGMS；CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG；CDR3：GGSLSR；
-CDR1：LNLMG；CDR2：TITVGDSTNYADSVKG；CDR3：RRTWHSEL；
-CDR1：INLLG；CDR2：TITVGDSTSYADSVKG；CDR3：RRTWHSEL；
-CDR1：SFGMS；CDR2：SINGRGDDTRYADSVKG；CDR3：GRSVSRS；
-CDR1：SFGMS；CDR2：AISADSSDKRYADSVKG；CDR3：GRGSP；
-CDR1：SFGMS；CDR2：AISADSSDKRYADSVKG；CDR3：GRGSP；
-CDR1：NYWMY；CDR2：RISTGGGYSYYADSVKG；CDR3：
DREAQVDTLDFDY。
在包括上文提及的CDR’s组合的本发明的纳米体中，每一CDR可以被选自由与所提及的CDR’s有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基 酸序列组成的组的CDR所替代；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一所提及的CDR(s)具有3个、2个或只有1个(如前段所示)“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
然而，在包括上文提及的CDR’s组合的本发明的纳米体中，特别优选包括一个或多个上文列出的CDR’s的纳米体；更特别优选包括两个或多个上文列出的CDR’s的纳米体；并且最特别优选包括3个上文列出的CDR’s的纳米体。
在这些针对人血清白蛋白的纳米体中，构架区FR1-FR4优选地按照上文对于本发明的纳米体的定义。
特别优选的针对人血清白蛋白的纳米体选自由SEQ ID NO’s：61-67，SEQ ID NO’s87-89和SEQ ID NO’s 100-104组成的组。在这些纳米体中存在的CDR’s和构架区的优选的组合还在表II中列出。
本发明的另一方面是本文公开的抗-TNF-α多肽，其还包括选自由下列各项组成的组的至少一种多肽：抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受体多肽和抗-IFN-γ受体多肽。
按照本发明的一个方面，纳米体针对TNF-α受体。所述纳米体可以是骆驼科VHH。
按照本发明的一个方面，纳米体针对IFN-γ受体。所述纳米体可以是骆驼科VHH。
本发明的另一方面是治疗本文所引用的自体免疫疾病或病况的方法，其包括给患者施用有效量的抗-TNF-α多肽，所述抗-TNF-α多肽还包括选自由下列各项组成的组的至少一种多肽：抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受体多肽和抗-IFN-γ受体多肽，所述多肽按照下文所述彼此连接。
作为炎症治疗化合物，所述多-特异性构建体可以具有比单-特异性构建体提高的功效。
本发明的一个方面是一种组合物，其包括本文公开的抗-TNF-α多肽和选自由下列各项组成的组的至少一种多肽：抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受体多肽和抗-IFN-γ受体多肽，用于同时、分开或顺序地施用给受试者。
本发明的一个方面是治疗自体免疫疾病的方法，所述方法包括同时、分开或顺序地给个体施用有效量的抗-TNF-α多肽和选自由下列各项组成的组的至少一种多肽：抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受体多肽和抗-IFN-γ受体多肽。
本发明的另一个方面是一种试剂盒，其包含抗-TNF-α多肽和选自由下列各项组成的组的至少一种多肽：抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受体多肽和抗-IFN-γ受体多肽，用于同时、分开或顺序地施用给受试者。所述试剂盒可以按照本发明进行使用是本发明的一个方面。所述试剂盒可以用来治疗本文所引用的疾病是本发明的一个方面。
同时施用意指将所述多肽同时施用给受试者。例如，作为多肽的混合物或包括所述多肽的组合物。实例包括但不限于，静脉内施用的溶液，片剂，液体，局部乳膏等，其中每一制备物包括目的多肽。
分开施用意指将所述多肽同时或基本上同时施用给受试者。多肽作为分开的、未混合的制剂存在于试剂盒中。例如，不同的多肽可以作为个体 片剂存在于试剂盒中。所述片剂可以通过同时吞咽两片片剂或者一片片剂直接跟着另一片而施用给受试者。
顺序施用意指将所述多肽顺序地施用给受试者。多肽作为分开的、未混合的制剂存在于试剂盒中。在给药之间存在时间间隔。例如，一种多肽可以在另一种成分后达336，312，288，264，240，216，192，168，144，120，96，72，48，24，20，16，12，8，4，2，1或0.5小时施用。
在顺序施用中，在另一种多肽施用之前和/或之后，一种多肽可以施用一次，或者任何次数，并且以不同剂量施用。顺序施用可以与同时或顺序施用结合。
下文所述的抗-TNF-α多肽的医药用途，还适用于包含本文公开的抗-TNF-α多肽和选自由抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受体多肽和抗-IFN-γ受体多肽组成的组的至少一种多肽的组合物，用于按照上文所公开同时、分开或顺序地施用给受试者。
按照本发明的一个方面，抗-IFN-γ多肽，抗-TNF-α，一种针对IFN-γ的纳米体。所述纳米体可以是骆驼科VHH。
按照本发明的一个方面，抗-TNF-α，针对TNF-α受体的纳米体。所述纳米体可以是骆驼科VHH。
按照本发明的一个方面，抗-IFN-γ受体多肽，抗-TNF-α，一种针对IFN-γ受体的纳米体。所述纳米体可以是骆驼科VHH。
本发明的另一个实施方案是本文公开的抗-TNF-α多肽，其中针对TNF-α的纳米体的数目为2个或多个。与它们的单价负体相比，所述多价抗-TNF-α多肽具有对于靶点的特别高的功能亲和性的优点，表现出比预计的高得多的抑制性特性。
多价抗-TNF-α多肽具有比单价亲本抗-TNF-α多肽高出几个数量级的功能亲和性。本发明人发现这些多价多肽的功能亲和性比在现有技术中关于二价和多价抗体所报道的那些高得多。令人吃惊地，直接或者通过短接头序列彼此连接的本发明的抗-TNF-α多肽表现出理论上预计地针对多价常规4-链抗体的高功能亲和性。
本发明人发现所述极大增加的功能活性可以优选地使用由多结构域和多价蛋白组成的抗原进行检测，在直接结合检测中或在功能性检测中， 例如细胞毒性检测。
所述纳米体可以使用本领域内已知的方法或任何其它方法而连接形成本文公开的包含多于一种纳米体的任何多肽。例如，它们可以通过将氨基酸残基与有机衍生剂反应而通过化学交联进行融合，诸如Blattler等，Biochemistry(生物化学)24，1517-1524；EP294703所述。备选地，所述纳米体可以在DNA水平上遗传融合，即形成编码完整的多肽构建体的多聚核苷酸构建体，所述完整的多肽构建体包括一个或多个抗-靶点纳米体和一个或多个抗-血清蛋白纳米体。用于生产二价或多价VHH多肽构建体的方法在PCT专利申请WO96/34103中公开。一种连接多个纳米体的方法是通过遗传途径，直接地或通过肽接头而连接纳米体编码序列。例如，第一纳米体的C-端可以连接到下一个纳米体的N-末端。这种连接模式可以延长，以连接其它的纳米体，构建和产生三-、四-等功能性构建体。
按照本发明的一个方面，所述纳米体直接彼此连接，没有使用接头。与连接大的常规抗体相反，其中接头序列需要在两个亚基中保持结合活性，本发明的多肽可以直接连接，由此避免接头序列的潜在问题，诸如当施用给人受试者时的抗原性，导致亚基解离的接头序列的不稳定性。
按照本发明的另一个方面，所述纳米体通过肽接头序列彼此连接。所述接头序列可以是天然存在的序列或非天然存在的序列。预计所述接头序列在施用抗-TNF-α多肽的受试者中是非-免疫原性的。所述接头序列可以提供针对多价抗-TNF-α多肽的充分的挠性，同时抗蛋白水解降解。接头序列的一个非限制性实例是可以衍生于WO 96/34103中所述的VHHs铰链区的一种。
按照本发明的另一个方面，包括多于2个纳米体的多价纳米体可以直接地或者通过接头序列彼此连接。这样的构建体很难用常规抗体产生，并且由于大亚基的空间位阻，与单价构建体相比，功能性将失去或者极大地减少，而不是如用本发明的VHH’s可见的相当大地增加。
本文公开的多肽构建体可以由熟练的技术人员按照本领域已知的方法或任何其它方法制备。例如，VHHs可以使用本领域已知的方法获得，诸如通过免疫骆驼并且获得来自于其的杂交瘤，或者通过使用本领域内已知的分子生物学技术克隆纳米体文库，并且随后通过使用噬菌体展示而进 行选择。
按照本发明的一个方面，抗-TNF-α多肽可以是全长抗-TNF-α多肽的同源序列。按照本发明的另一个方面，抗-TNF-α多肽可以是全长抗-TNF-α多肽的功能片段。按照本发明的另一个方面，抗-TNF-α多肽可以是全长抗-TNF-α多肽的同源序列。按照本发明的另一个方面，抗-TNF-α多肽可以是全长抗-TNF-α多肽的同源序列的功能片段。按照本发明的一个方面，抗-TNF-α多肽可以包含抗-TNF-α多肽的序列。
按照本发明的一个方面，用于形成抗-TNF-α多肽的纳米体可以是完整纳米体(例如VHH)或其同源序列。按照本发明的另一个方面，用于形成多肽构建体的纳米体可以是完整纳米体的功能性片段。按照本发明的另一个方面，用于形成多肽构建体的纳米体可以是完整纳米体的同源序列。按照本发明的另一个方面，用于形成多肽构建体的纳米体可以是完整纳米体的同源序列的功能片段。
当用于本文时，本发明的同源序列可以包括加入、删除或取代一个或多个氨基酸，其基本上不改变本发明的多肽的功能特征。氨基酸删除或取代的数目优选地达到1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69或70个氨基酸。
按照本发明的同源序列可以是通过加入、删除或取代氨基酸而修饰的多肽，与未修饰的多肽相比较，所述修饰基本上不改变功能性特征。
按照本发明的同源序列可以是通过加入、删除或取代氨基酸而修饰的多肽，与未修饰的多肽相比较，所述修饰基本上不改变功能性特征。
按照本发明的同源序列可以是存在于其它骆驼科物种中的序列，诸如例如，骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼、栗色羊驼等。
在同源序列指示序列相同性的情形中，它意指与亲本序列存在高序列相同性(大于70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％的序列相同性)的某种序列，并且优选地特征在于亲本序列的相似特性，即，亲和性、使用已知方法计算的所述相同性。
备选地，同源序列还可以是允许在亲本序列的许多位置进行取代而获 得的任何氨基酸序列，其按照下述规则：
Ser被Ser，Thr，Gly，和Asn取代；
Arg被Arg，His，Gln，Lys，和Glu中的一种取代；
Leu被Leu，Ile，Phe，Tyr，Met，和Val中的一种取代；
Pro被Pro，Gly，Ala，和Thr中的一种取代；
Thr被Thr，Pro，Ser，Ala，Gly，His，和Gln中的一种取代；
Ala被Ala，Gly，Thr，和Pro中的一种取代；
Val被Val，Met，Tyr，Phe，Ile，和Leu中的一种取代；
Gly被Gly，Ala，Thr，Pro，和Ser中的一种取代；
Ile被Ile，Met，Tyr，Phe，Val，和Leu中的一种取代；
Phe被Phe，Trp，Met，Tyr，Ile，Val，和Leu中的一种取代；
Tyr被Tyr，Trp，Met，Phe，Ile，Val，和Leu中的一种取代；
His被His，Glu，Lys，Gln，Thr，和Arg中的一种取代；
Gln被Gln，Glu，Lys，Asn，His，Thr，和Arg中的一种取代；
Asn被Asn，Glu，Asp，Gln，和Ser中的一种取代；
Lys被Lys，Glu，Gln，His，和Arg中的一种取代；
Asp被Asp，Glu，和Asn中的一种取代；
Glu被Glu，Asp，Lys，Asn，Gln，His，和Arg中的一种取代；
Met被Met，Phe，Ile，Val，Leu，和Tyr中的一种取代。
按照本发明的同源核苷酸序列可以是指，在严格杂交条件下，多于50，100，200，300，400，500，600，800或1000个能够与编码亲本序列的核苷酸序列的反向-互补序列杂交的核苷酸的核苷酸序列(诸如Sambrook等，Molecular Cloning，Laboratory Manuel(分子克隆，实验室手册)，Cold Spring，Harbor Laboratory press(冷泉港实验室出版)，NewYork(纽约)所述的那些)。
当用于本文时，功能性片段是指大小足够以致目的相互作用保持在1×10-6M或更好的亲和性的纳米体的序列。
备选地，功能性片段包含完整氨基酸序列的部分删除，并且仍然保持对于同靶点结合和相互作用必需的结合位点和蛋白结构域。
当用于本文时，功能性片段是指小于完整序列的100％(例如，99％， 90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％，5％，1％等)，但是包括5个或更多个氨基酸或者15个或更多个核苷酸。
当本文提及时，靶点，诸如TNF-α、TNF-α受体、血清蛋白(例如，血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素-结合蛋白、运铁蛋白、凝血因子I)和IFN-γ、IFN-γ受体可以是所述靶点的片段。因此，靶点还是所述靶点的片段，能够激发免疫应答。靶点还是所述靶点的片段，能够结合针对全长靶点的纳米体。
当用于本文时，片段是指小于序列的100％(例如，99％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％等)，但是包括5，6，7，8，9，10，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25个或更多个氨基酸。片段长度足够，以致目的相互作用保持1×10-6M或更好的亲和性。
当用于本文时，片段还指任选的插入、删除和取代一个或多个基本上不改变所述靶点结合针对野生型靶点的纳米体的能力的氨基酸。氨基酸插入、删除或取代的数目优选地达到1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69或70个氨基酸。
本发明的同源序列可以包括已被人源化的抗-TNF-α多肽。当施用时，新种类VHHs抗体的人源化还将减少在人个体中不利的免疫反应的可能性。
本发明的一个实施方案涉及基于λ抗体制备修饰的多肽的方法，其通过确定抗体可变结构域(VHH)的氨基酸残基，所述氨基酸残基可以被修饰而不减少所述结构域对于抗原的天然亲和力，并且同时减少其关于异源物种的免疫原性；涉及在鉴定的残基具有修饰的VHHs的应用，所述VHHs用于施用给异源物种；并且涉及这样修饰的VHH。
更具体地，本发明涉及制备修饰的VHHs，其被修饰用于施用给人，涉及得到的VHH本身，以及所述“人源化”VHHs在治疗人类疾病中的应用。人源化意指突变，以致在施用时在人类患者中的免疫原性较小或不存在。按照本发明，将多肽人源化包括下述步骤：用在人共有序列中发现的它们的人类负体取代一个或多个骆驼科氨基酸，而所述多肽没有失去其典型性特征，即，人源化没有显著地影响得到的多肽的抗原结合能力。这样的方法是熟练的技术人员所知的。
骆驼科纳米体的人源化需要在单一多肽链中引入和诱变有限数量的氨基酸。这与scFv，Fab，(Fab)2和IgG的人源化相反，其需要在两个链，轻链和重链中引入氨基酸变化，以及这两条链的装配的保存。
如在WO 04/041862中所述，抗-TNF纳米体可以被人源化。例如，人源化可以涉及FR1中位置1和5的残基诱变，其通过用于所有组成成分克隆的引物而引入，并且不天然存在于美洲驼序列中。那些残基的诱变没有导致结合和/或抑制活性的丧失。人源化还可以涉及FR3中位置74，76，83，84，93的残基诱变。那些残基的诱变没有导致结合和/或抑制活性的显著丧失。因此，FR1和FR3的突变的组合没有影响结合和/或抑制活性。人源化还可以涉及FR4中位置108的残基诱变。Q108L的诱变导致在大肠杆菌中更低的生产水平。在骆驼VHH中，位置108暴露于溶剂，而在人抗体中，这一位置包埋在VH-VL界面(Spinelli，1996；Nieba，1997)。在分离的VHs中位置108暴露于溶剂。引入非极性疏水Leu代替极性不带电荷的Gln可以对分子的内在折叠/稳定性有显著的影响。此外，在位置44和45用人的疏水残基取代亲水残基(E44G和R45L)，对结合和/或抑制没有影响。然而，当引入F37V和F47W时，观察到结合和/或抑制活性的丧失。模型数据证实重要残基37保持CDR3环构象的完整性，并且因此有活性(所有编号方式按照Kabat)。
按照本发明的一个实施方案，人源化涉及单独或组合地取代任何下述残基：
-FR1位置1，5，28和30，
-在FR2中位置44和45的标志氨基酸，
-FR3残基74，75，76，83，84，93和94，
-和FR4中位置103，104，108和111；
-编号方式按照Kabat编号方式。
本发明的一个实施方案是抗-TNF-α多肽，或者能够编码所述多肽的核酸，用于治疗、预防和/或减轻与炎症进程相关的疾病的症状。TNF-α参与炎症进程，并且阻滞TNF-α作用可以具有抗炎效果，这在某些疾病状 况诸如例如局限性回肠炎中非常理想。本实例证明按照本发明的VHHs结合TNF-α，并且，阻滞其与TNF-α受体的结合。
本发明的抗-TNF-α多肽可应用于自体免疫疾病，诸如艾迪生病(肾上腺)、耳的自体免疫疾病(耳)、眼睛的自体免疫疾病(眼睛)、自体免疫肝炎(肝)，自体免疫腮腺炎(腮腺)、局限性回肠炎(肠)、I型糖尿病(胰腺)、附睾炎(附睾)、肾小球肾炎(肾)、格雷夫斯病(甲状腺)、急性热病性多神经炎(神经细胞)、桥本病(甲状腺)、溶血性贫血(红血细胞)、系统性红斑狼疮(多组织)、男性不育(精子)、多发性硬化病(神经细胞)、重症肌无力(肌神经接点)、天疱疮(原皮肤(primarily skin))、银屑病(皮肤)、风湿热(心脏和关节)、类风湿性关节炎(关节内里(joint lining))、结节病(多组织和器官)、硬皮病(皮肤和结缔组织)、斯耶格伦综合征(外分泌腺和其它组织)、脊椎关节病(中轴骨骼和其它组织)、甲状腺炎(甲状腺)和脉管炎(血管)。
括号中是所述疾病影响的组织。自体免疫疾病的这一列表意欲是示例性的而不是包含一切的。
本发明的抗-TNF-α多肽适用的自体免疫病况包括，例如，AIDS，遗传性变态反应，支气管哮喘，湿疹，麻风，精神分裂症，遗传性抑郁症，组织和器官移植，慢性疲劳综合征，阿尔茨海默病，帕金森病，心肌梗塞，休克，孤独症，癫痫症，阿图斯现象，过敏反应，和酒精和药物成瘾。在以上鉴定的自体免疫病况中，影响的组织是一级靶点，在其它情形中，它是二级靶点。这些病况部分或大部分是自体免疫综合征。因此，在治疗它们时，可能使用相同的方法，或者此处公开的相同方法的方面，有时与其它方法组合。
本发明的另一个实施方案是应用按照本发明的抗-TNF-α多肽或编码所述多肽的核酸用于制备治疗与炎症进程相关的紊乱的药物。紊乱的实例包括类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠炎综合征和多发性硬化病。
按照本发明的多肽和核酸可以通过常规途径施用给受试者，诸如静脉内施用。然而，本发明抗-TNF-α多肽特异的特性在于它们穿过障碍，诸如组织膜和/或肿瘤，并且在其上局部起作用，并且它们足够稳定，足以 耐受极端环境，诸如在胃中。因此，本发明的另一方面涉及抗-TNF-α多肽的递送。
当本发明的纳米体和/或多肽用于，或者意欲用于预防或治疗胃肠道疾病和紊乱时，特别是通过口服或其它施用方式施用道胃肠道时，通常不必要使用在血清中具有增加的半衰期的本发明的多肽(即，其已被聚乙二醇化或其包含针对血清蛋白的纳米体)。因此，对于这样的指征，可以应用只包含本发明的纳米体的本发明的多肽。特别地，已发现，对于口服施用预防和治疗与TNF-α相关和/或由TNF-α调控的胃肠道疾病或紊乱(诸如IBD和上文提及的其它胃肠道疾病和紊乱)，应用本发明的单价纳米体或应用基本上由本发明的单价纳米体组成的本发明的多肽可以是优选的。对于其它指征，诸如治疗类风湿性关节炎(RA)，使用本发明的二价纳米体可以是优选的。当这样的纳米体必须通过血流到达其目的作用位点时，应用在血清中具有增加的半衰期的本发明的多肽可以是优选的。
按照本发明的受试者可以是对通过治疗性多肽治疗敏感的任何哺乳动物。
口服递送本发明的抗-TNF-α多肽导致在结肠中受所述紊乱影响的局部位点提供活性形式的所述分子。这些位点可以是高度发炎并且包含TNF-α-生产的细胞。结合TNF-α的本发明的抗-TNF-α多肽可以局部中和TNF-α，避免遍及全身的分布，并且因此限制消极的副作用。遗传修饰的微生物诸如乳微球菌(Micrococcus lactis)能够分泌抗体或其功能性片段。这样修饰的微生物可以用作抗体或其功能性片段在小肠中局部生产和递送的赋形剂。通过使用产生抗-TNF-α多肽的菌株，可以治疗炎性肠综合征。
本发明的另一个方面涉及递送抗-TNF多肽，其通过利用在非侵入性细菌诸如革兰氏-阳性生物体比如乳球菌物种(Lactococcus spec.)上的表面表达或从其分泌，使用诸如WO00/23471中所述的载体而递送。
本发明的一个实施方案是本文公开的抗-TNF-α多肽用于治疗、预防和/或减轻对本发明的纳米体或多肽调控敏感的紊乱的症状，本发明的纳米体或多肽能够通过胃环境而所述物质不失活。
紊乱的实例是引起炎症的任一种，包括但不限于，类风湿性关节炎、 局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化病。如本领域熟练的技术人员所知，一旦拥有所述多肽构建体，配制技术可以用来在正确位置(在胃中，在结肠中，等等)释放最大量的多肽。这种递送方法对于治疗、预防和/或减轻其靶点位于内脏系统的紊乱的症状很重要。
本发明的一个方面是治疗、预防和/或减轻对本发明的纳米体或多肽调控敏感的紊乱的症状的方法，本发明的纳米体或多肽能够通过胃环境而没有失活，所述方法通过给受试者口服施用本文公开的抗-TNF-α多肽而进行。
本发明的另一个实施方案是本文公开的抗-TNF-α多肽用于制备治疗、预防和/或减轻对能够通过胃环境而没有失活的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状的药物中的应用。
本发明的一个方面是将本发明的纳米体或多肽递送至内脏系统而所述物质不失活的方法，其通过给受试者口服施用本文公开的抗-TNF-α多肽而进行。
本发明的一个方面是将本发明的纳米体或多肽递送至受试者的血流而所述物质不失活的方法，其通过给受试者口服施用本文公开的抗-TNF-α多肽而进行。
本发明的另一个实施方案是本文公开的抗-TNF-α多肽用于治疗、预防和/或减轻对递送至阴道和/或直肠道的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的症状或紊乱。
紊乱的实例是引起炎症的任一种，其包括但不限于，类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化病。在一个非限制性实例中，按照本发明的制剂包括本文公开的抗-TNF-α多肽，以凝胶、乳膏、栓剂、薄膜形式，或者以海绵形式或作为随时间缓慢释放活性成分的阴道环(这样的制剂在EP 707473，EP 684814，US 5629001中所述)。
本发明的一个方面是治疗、预防和/或减轻对递送至阴道和/或直肠道的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状的方法，其通过对受试者阴道和/或直肠施用本文公开的抗-TNF-α多肽而进行。
本发明的另一个实施方案是本文公开的抗-TNF-α多肽用于制备治疗、预防和/或减轻对递送至阴道和/或直肠道的本发明的纳米体或多肽的 调控而敏感的紊乱症状的药物中的应用。
本发明的一个方面是将本发明的纳米体或多肽递送至阴道和/或直肠道而所述物质没有失活的方法，其通过将本文公开的抗-TNF-α多肽施用至受试者的阴道和/或直肠道而进行。
本发明的一个方面是将本发明的纳米体或多肽递送至受试者的血流而所述物质没有失活的方法，其通过将本文公开的抗-TNF-α多肽施用至受试者的阴道和/或直肠道而进行。
本发明的另一个实施方案是本文公开的抗-TNF-α多肽，其用于治疗、预防和/或减轻对递送至鼻、上呼吸道和/或肺的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱的症状。
紊乱的实例是引起炎症的任一种，其包括但不限于，类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化病。在一个非限制性实例中，一种按照本发明的制剂，包括鼻喷雾(例如气溶胶)或吸入器形式的本文公开的抗-TNF-α多肽。由于所述多肽构建体小，它可以比治疗性IgG分子更加有效得多地到达其靶点。
本发明的一个方面是用于治疗、预防和/或减轻对递送至上呼吸道和肺的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状的方法，所述方法通过给受试者施用本文公开的抗-TNF-α多肽，这通过嘴或鼻吸入而进行。
本发明的另一个实施方案是本文公开的抗-TNF-α多肽用于制备治疗、预防和/或减轻对递送至鼻、上呼吸道和/或肺而所述多肽没有失活的的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状的药物中的应用。
本发明的一个方面是用于将本发明的纳米体或多肽递送至鼻、上呼吸道和肺而不失活的方法，其通过将本文公开的抗-TNF-α多肽施用至受试者的鼻、上呼吸道和/或肺而进行。
本发明的一个方面是用于将本发明的纳米体或多肽递送至受试者的血流而不失活的方法，其通过将本文公开的抗-TNF-α多肽施用至受试者的鼻、上呼吸道和/或肺而进行。
本发明的一个实施方案是本文公开的抗-TNF-α多肽，其用于治疗、预防和/或减轻对递送至肠黏膜的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状，其中所述紊乱增加肠黏膜的渗透性。由于它们小的大小，本文 公开的抗-TNF-α多肽可以穿过肠黏膜，并且更有效地到达患有引起肠黏膜渗透性增加的紊乱例如局限性回肠炎的患者中的血流。
本发明的一个方面是用于治疗、预防和/或减轻对递送至肠黏膜的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状的方法，其中所述紊乱增加肠黏膜的渗透性，所述方法通过对受试者口服施用本文公开的抗-TNF-α多肽而进行。
这一过程甚至可以通过本发明的另一个方面——活性转运载体的应用——而进一步增强。在本发明的这一方面，将VHH融合到增强通过肠壁进入血流的转运的载体上。在一个非限制性实例中，这一“载体”是融合到治疗性VHH上的第二VHH。这种融合构建体使用本领域已知的方法制备。“载体”VHH特异性结合肠壁上的受体，所述受体诱导通过壁的活性转运。
本发明的另一个实施方案是本文公开的抗-TNF-α多肽用于制备治疗、预防和/或减轻对递送至肠黏膜的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状的药物中的应用，其中所述紊乱增加肠黏膜的渗透性。
本发明的一方面是将本发明的纳米体或多肽递送至肠黏膜而没有失活的方法，其通过给受试者口服施用本发明的抗-TNF-α多肽而进行。
本发明的一个方面是将本发明的纳米体或多肽递送至受试者的血流而没有失活的方法，其通过给受试者口服施用本发明的抗-TNF-α多肽而进行。
这一过程甚至可以通过本发明的另一个方面——活性转运载体的应用——而进一步增强。在本发明的这一方面，将本文公开的抗-TNF-α多肽融合到增强通过肠壁进入血流的转运的载体上。在一个非限制性实例中，这一“载体”是融合到所述多肽上的VHH。这种融合构建体使用本领域已知的方法制备。“载体”VHH特异性结合肠壁上的受体，所述受体诱导通过壁的活性转运。
本发明的一个实施方案是本文公开的抗-TNF-α多肽，其用于治疗、预防和/或减轻对能够有效通过舌下组织的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状。
紊乱的实例是引起炎症的任一种，其包括但不限于，类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化病。本文公开 的所述多肽构建体的制剂，例如，将片剂、喷雾剂、滴剂置于舌下，并且通过黏膜吸收到舌下毛细管网。
本发明的一个方面是用于治疗、预防和/或减轻对能够有效通过舌下组织的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状的方法，其通过对受试者舌下施用本文公开的抗-TNF-α多肽而进行。
本发明的另一个实施方案是本文公开的抗-TNF-α多肽用于制备治疗、预防和/或减轻对能够通过舌下组织的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状的药物中的应用。
本发明的一个方面是将本发明的纳米体或多肽递送至舌下组织而没有失活的方法，其通过对受试者舌下递送本文公开的抗-TNF-α多肽而进行。
本发明的一个方面是将本发明的纳米体或多肽递送至受试者的血流而没有失活的方法，其通过对受试者口服施用本文公开的抗-TNF-α多肽而进行。
本发明的一个实施方案是本文公开的抗-TNF-α多肽用于治疗、预防和/或减轻对能够有效通过皮肤的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱的症状。
紊乱的实例是引起炎症的任一种，其包括但不限于，类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化病。将所述多肽构建体的制剂，例如，乳膏、薄膜、喷雾剂、滴剂、贴片，放置在皮肤上，并且透过皮肤。
本发明的一个方面是用于治疗、预防和/或减轻对能够有效通过皮肤的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状的方法，其通过对受试者局部施用本文公开的抗-TNF-α多肽而进行。
本发明的另一个实施方案是本文公开的抗-TNF-α多肽用于制备治疗、预防和/或减轻对能够有效通过皮肤的本发明的纳米体或多肽的调控而敏感的紊乱症状的药物中的应用。
本发明的一个方面是将本发明的纳米体或多肽递送至皮肤而没有失活的方法，其通过对受试者局部施用本文公开的抗-TNF-α多肽而进行。
本发明的一个方面是将本发明的纳米体或多肽递送至受试者的血流 的方法，其通过对受试者局部施用本文公开的抗-TNF-α多肽而进行。
在本发明的另一个实施方案中，抗-TNF-α多肽还包含载体纳米体(例如VHH)，其作用为活性转运载体用于将所述抗-TNF-α多肽从肺内腔转运至血液中。
还包括载体的抗-TNF-α多肽特异性地与黏膜表面(支气管上皮细胞)上存在的受体结合，导致所述多肽从肺内腔到血液的活性转运。所述载体纳米体可以融合到所述多肽构建体上。这种融合构建体可以使用本领域已知的方法制备，并且在本文描述。所述“载体”纳米体特异性地与黏膜表面上的受体结合，其诱导通过所述表面的活性转运。
本发明的另一个方面是确定在鼻施用时将哪一种纳米体(例如VHHs)活性转运至血流中的方法。类似地，首次用于实验的或免疫VHH噬菌体文库可以进行鼻施用，并且在施用后的不同时间点，可以分离血液或器官，以拯救已经被活性转运到血流的噬菌体。用于从肺内腔到血流的活性转运的受体的非限制性实例是Fc受体N(FcRn)。本发明的一个方面包括通过所述方法鉴定的VHH分子。然后所述VHH可以用作载体VHH，用于在鼻施用时，将治疗性VHH递送到血流中相对应的靶点。
在本发明的一个方面，可以应用本文公开的抗-TNF-α多肽，以筛选调控所述多肽与TNF-α的结合的试剂。当在单独测定结合或所述多肽的置换的检测中鉴定时，必须将试剂进行功能性测试，以确定它们是否在体内调控抗原作用。
在置换实验的一个实例中，在存在或不存在增加浓度的候选调节剂时，将表达TNF-α或其片段的噬菌体或细胞在结合缓冲液中与已经标记的本发明的多肽一起培养。为了验证和校准所述检测，可以进行对照竞争反应，其使用增加浓度的并且未标记的所述多肽。在培养后，将细胞彻底清洗，并且在适于所给的标记时(例如，液闪计数、荧光等)，检测结合的、标记的多肽。在存在候选调节剂时所结合的标记的多肽的量中至少10％的减少表示所述候选调节剂对结合的置换。如果在1μM或更低的浓度下它们置换50％的标记的多肽(亚饱和多肽剂量)，那么就认为候选调节剂在这一检测或本文所述的其它检测中特异性地结合。
备选地，结合或结合的置换可以通过表面等离振子共振(SPR)进行监 测。表面等离振子共振检测可以用作定量方法，通过在固定的传感器附近由来自水相的本发明的多肽与固定在所述传感器膜中的TNF-α的结合或失去结合而引起的质量变化而检测两种分子之间的结合。在注射或移除所述多肽或候选调节剂后，并且使用Biacore Biosensor(BiacoreAB)测定后，这种质量变化测定为相对于时间的共振单位。例如，按照由Salamon等(Salamon等，1996，Biophys J.(生物物理学杂志)71：283-294；Salamon等，2001，Biophys.J.(生物物理学杂志)80：1557-1567；Salamon等，1999，Trends Biochem.Sci.(生物化学科学趋势)24：213-219，其中每一文献通过引用结合于此。)所述的方法，TNF-α可以固定在薄膜脂质膜中的传感器芯片上(例如，研究级CM5芯片；Biacore AB)。Sarrio等证明SPR可以用来检测与固定在芯片上脂质层中的GPCR A(1)腺苷受体结合的配体(Sarrio等.，2000，Mol.Cell.Biol.(分子细胞生物学)20：5164-5174，其通过引用结合于此)。对于SPR检测中本发明的多肽与TNF-α的结合的条件可以由本领域的技术人员使用Sarrio等报道的条件作为起点而细微调整。
SPR可以以至少两种方法检测结合的调节剂。第一，本发明的多肽可以预结合固定的TNF-α，然后注射浓度范围0.1nM-1μM的候选调节剂。结合的多肽的置换可以量化，允许检测调节剂结合。备选地，膜-结合的TNF-α可以与候选调节剂一起预培养，并且用本发明的多肽激活。所述多肽和与所述调节剂预培养的TNF-α之间的结合亲和力的差异，与不存在所述调节剂时所述多肽和TNF-α之间的结合亲和力相比较，将证明在存在调节剂时所述多肽的结合或置换。在每一检测中，相对于在不存在候选调节剂时结合的所述多肽的量，在存在候选调节剂时结合的所述多肽的量中10％或更多的减少，表明所述候选调节剂抑制TNF-α与所述多肽的相互作用。
例如，检测对本发明丰余序列与TNF-α的结合的抑制的另一种方法使用荧光共振能量迁移(FRET)。FRET是一种量子机制现象，如果D的放射光谱与A的激发光谱交迭，在彼此最接近的(通常分开 )荧光供体(D)和荧光受体(A)之间存在所述现象。要被检测的分子，例如，本发明的多肽和TNF-α用供体和受体荧光团的互补对进行标记。当通过TNF-α：多肽相互作用而紧密地结合在一起时，当激发供体荧光团时发出的荧光具 有与在所述多肽与TNF-α未结合时应答所述激发波长而发出的荧光不同的波长，这通过测定在每一波长的发射强度而提供结合的相对未结合的分子的量化。标记TNF-α的供体荧光团是本领域公知的。其中特别感兴趣的是A.Victoria GFP的变体，已知为蓝绿FP(CFP，供体(D))和黄色FP(YFP，受体(A))。作为一个实例，YFP变体可以与TNF-α制备成融合蛋白。用于表达作为融合体的GFP变体(Clontech)的载体以及荧光团-标记的试剂(Molecular Probes)是本领域已知的。将候选调节剂加入到荧光-标记的多肽和YFP-TNF-α的混合物中将导致对能量迁移的抑制，例如，这由相对于没有候选调节剂的样品YFP荧光的减少而证实。在使用FRET检测TNF-α：多肽相互作用的检测中，相对于没有候选调节剂的样品，在包含候选调节剂的样品中在受体波长的荧光发射强度的10％或更多的减少，表明所述候选调节剂抑制TNF-α：多肽相互作用。
当用于此处时，样品可以是包含TNF-α的任何生物样品，诸如临床的(例如，细胞级分、全血、血浆、血清、组织、细胞等)，来自于临床的，农业的，法庭的，科研或其它可能的样品。所述临床样品可以是人或动物来源的。所分析的样品可以本质上是固体或液体的。明显地，当使用固体物质时，这些要首先溶解在适当的溶液中。
关于FRET的一种变化使用荧光猝灭来监测分子相互作用。相互作用对中的一个分子可以用荧光团标记，并且另一个分子用当与其靠近并置时猝灭所述荧光团的荧光的分子标记。当激发时荧光的变化是在标记荧光团的分子：猝灭剂对的缔合中的变化的指示。通常，标记的TNF-α的荧光中的增加是携带猝灭剂的抗-TNF-α多肽已被置换的指示。对于猝灭检测，相对于没有候选调节剂的样品，在包含候选调节剂的样品中荧光发射强度的10％或更多的增加，表明所述候选调节剂抑制TNF-α：抗-TNF-α多肽相互作用。
除了表面等离振子共振和FRET方法之外，荧光极化检测用于量化结合。对于荧光-标记的分子的荧光极化值取决于旋光相关时间(rotational correlation time)或斜率。复合物，诸如由TNF-α与荧光标记的抗-TNF-α多肽缔合形成的那些，具有比未复合的、标记的多肽更高的极化值。如果候选抑制剂中断或抑制TNF-α与所述多肽的相互作用，那么，相对于没有 候选抑制剂的混合物，包含TNF-α：抗-TNF-α多肽相互作用的候选抑制剂导致荧光极化的减少。荧光极化非常适用于鉴定中断TNF-α：抗-TNF-α多肽复合物形成的小分子。相对于缺少所述候选调节剂的样品中的荧光极化，在包含候选调节剂的样品中的荧光极化的10％或更多的减少，表明所述候选调节剂抑制TNF-α：抗-TNF-α多肽相互作用。
用于监测TNF-α的另外的备选方案：抗-TNF-α多肽相互作用的另一种备选方案使用生物传感器检测。ICS生物传感器已在本领域内描述(Australian MembraneBiotechnology Research Institute(澳大利亚膜生物技术研究所)；Cornell B，Braach-Maksvytis V，King L，Osman P，Raguse B，Wieczorek L，和Pace R.″A biosensor thatuses ion-channel switches(使用离子-通道转换的生物传感器)″Nature(自然)1997，387，580)。在这一技术中，TNF-α和抗-TNF-α多肽的缔合与关闭悬浮的双分子层膜中的短杆菌肽-辅助的离子通道偶联，并且因此达到生物传感器导纳(admittance)(类似于阻抗(impedance))的可检测的变化。这种方法在六个数量级的导纳变化上是线性的，并且理想地适用于小分子组合文库的大规模、高通量筛选。相对于缺少候选调节剂的样品的导纳，在包含候选调节剂的样品中的导纳的10％或更大的变化(增加或减少)，表明所述候选调节剂抑制TNF-α与所述多肽的相互作用。重要地要注意，在检测TNF-α与抗-TNF-α多肽的相互作用的检测中，可能地，所述相互作用的调节剂不必必要地直接与同所述多肽物理相互作用的蛋白的结构域相互作用。还可能地，调节剂将在远离相互作用位点的位置相互作用，并且引起，例如，TNF-α中的构象变化。尽管如此，以这种方式作用的调节剂(抑制剂或拮抗剂)还是调节TNF-α与其受体的结合的感兴趣的试剂。
所述的任何结合检测可以用来确定某种试剂在某种样品例如组织样品中的存在，所述试剂结合TNF-α，或者影响，例如，本发明的多肽与TNF-α的结合。为了做得这样，在存在或不存在所述样品时，将TNF-α与所述多肽反应，并且在适于要用的结合检测时检测多肽结合。在所述多肽的结合中的10％或更多的减少表明所述样品包含调控所述多肽与TNF-α的结合的试剂。当然，上述普遍化的方法可以容易地适用于筛选改变任何本发明的抗-TNF-α多肽、其同源序列、其功能性片段或其同源序列的功 能性片段与TNF-α或其片段之间的结合的候选调节剂。
本发明的一个实施方案是通过本文公开的方法鉴定的未知试剂。
本发明的一个实施方案是通过本文公开的方法鉴定的未知试剂用于治疗、预防和/或减轻与炎症进程相关的紊乱的症状。
本发明的另一个实施方案是通过本文公开的方法鉴定的未知试剂的应用，其用于治疗、预防和/或减轻与炎症进程相关的紊乱的症状。
紊乱的实例包括类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠炎综合征和多发性硬化病。
按照本发明使用的细胞优选地选自由下列各项组成的组：细菌细胞诸如例如大肠杆菌，酵母细胞诸如例如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)，昆虫细胞或哺乳动物细胞。
按照本发明使用的细胞可以是任何细胞，其中可以引入按照本发明编码本发明包括抗-TNF-α的多肽的核酸序列、其同源序列、其功能性片段或其同源序列的功能性片段，以致所述多肽在天然水平或高于天然水平表达，如本文所定义。优选地，在细胞中表达的本发明的多肽表现出正常的或接近正常的药性，如本文所定义。
按照本发明的一个优选的实施方案，细胞选自由下列各项组成的组：COS7-细胞，aCHO细胞，a LM(TK-)细胞，a NIH-3T3细胞，HEK-293细胞，K-562细胞或1321N1星细胞瘤细胞，以及其它可转染的细胞系。
大体上，“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”意指获得理想的一项或多项结果(调节TNF-α结合；治疗或预防炎症)所需要的量。本领域的普通技术人员应该意识到，效果，并且因此，“有效量”可以关于本发明中所用的调节TNF-α结合的不同的化合物而不同。本领域的技术人员可以容易地评估所述化合物的效果。
当用于此处时，术语“化合物”是指本发明的抗-TNF-α多肽，组合物，或能够编码所述多肽的核酸，或者按照本文所述的筛选方法鉴定的试剂，或者包括一个或多个衍生的氨基酸的所述多肽。
“药用”意指非生物性或另外不理想的物质，即，所述物质可以与化合物一起施用给个体，而不引起任何不理想的生物作用或不以有害方式与其中所包含的药物组合物的任何其它成分相互作用。
本文公开的抗-TNF-α多肽用于治疗或预防受试者中的病况，并且包括施用药物学有效量的化合物或组合物。
本发明的抗-TNF多肽用于治疗或预防受试者中与类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠炎综合征和多发性硬化病相关的病况，并且包括施用药物学有效量的结合TNF-α的化合物或组合物。
本文公开的抗-TNF-α多肽用于治疗或预防受试者中的病况，并且包括施用与另一种化合物诸如例如阿司匹林组合的药物学有效量的化合物。
本文公开的抗-TNF-α多肽用于治疗或预防受试者中与类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠炎综合征和多发性硬化病相关的病况，并且包括施用与另一种化合物诸如例如阿司匹林组合的药物学有效量的化合物。
本发明不限于施用包括单一的本发明的化合物的制剂。在本发明的范围内，提供组合治疗，其中将包括多于一种本发明的化合物的制剂施用给需要其的患者。
由TNF-α调控的病况包括但不限于，类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠炎综合征和多发性硬化病。
用于本发明的化合物可以配制成药物组合物，并且以各种适合所选的施用途径的形式施用给哺乳动物宿主，诸如人患者或家畜，所述施用途径即，口服或肠胃外、通过鼻内通过吸入、静脉内、肌内、局部或皮下途径。
本发明的化合物还可以应用递送的基因治疗方法施用。参见，例如，美国专利No.5,399,346，其通过引用完全结合。应用递送的基因治疗方法，转染了用于本发明的化合物的基因的初级细胞另外可以转染组织特异性启动子，以靶向特异的器官、组织、移植物、肿瘤或细胞。
因此，本化合物可以全身施用，例如，口服，与药用赋形剂诸如惰性稀释剂或可同化的食用载体组合。它们可以封装在硬或软壳白明胶胶囊中，可以压缩成片剂，或者可以直接与患者的日常饮食的食物结合。对于口服治疗性施用，活性化合物可以与一种或多种赋形剂结合，并且以可吸收的片剂、口腔片剂、药片、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。这种组合物和制剂应该包含至少0.1％的活性化合物。当然，所述组合物和制剂的百分数可以改变，并且可以便利地在所给单位剂型的 约2-约60重量％。活性化合物在所述治疗用组合物中的量如此，以致将获得有效的剂量水平。
所述片剂、药片、丸剂、胶囊等还可以包含下述：粘合剂，诸如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或白明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；并且可以加入甜味剂，诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦，或者调味剂，诸如欧薄荷、冬青油、或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的物质之外，它还可以包含液体载体，诸如植物油或聚乙二醇。各种其它物质可以作为涂层存在，或者另外修饰所述固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂、或胶囊可以用白明胶、蜡、紫胶或糖等包被。糖浆或酏剂可以包含所述活性化合物，作为甜味剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的甲基和丙基对羟基苯甲酸酯类，染料和调味剂诸如樱桃或橙味调味剂。当然，在制备任何单位剂型中所用的任何物质都应该是药物可接受的，并且在所用的量上基本上无毒。另外，活性化合物可以结合在持续释放的制剂和装置中。
所述活性化合物还可以通过输注或注射进行静脉内或腹膜内施用。本活性化合物或者其盐的溶液可以在水中制备，任选地与无毒表面活性剂混合。分散剂还可以在甘油、液体聚乙二醇、三醋精及其混合物中以及在油中制备。在普通的保存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射或输注的药物剂型可以包括无菌的水溶液或分散液或者包含活性成分的无菌粉剂，其适合即时制备无菌可注射或可输注溶液或分散液，任选地包封在脂质体中。在所有情形中，在制备和保存条件下，最终剂型必须是无菌的、流动的和稳定的。液体载体或赋形剂可以是溶剂或液体分散介质，例如，其包括水、乙醇、多醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其适当的混合物。可以保持适当的流动性，例如，通过形成脂质体，在分散剂的情形中通过保持需要的颗粒大小或者通过使用表面活性剂。防止微生物作用可以通过各种抗细菌和抗真菌试剂获得，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情形中，优选地包括等渗剂，例如，糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收剂例如 单硬脂酸镁和白明胶而获得。
无菌可注射溶液通过将需要量的活性化合物结合在适当的溶剂中，当需要时，与上文列举的各种其它成分一起结合，然后进行过滤除菌而制备。在用无菌粉剂制备无菌可注射溶液的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上在先前的无菌过滤溶液中存在的任何其它理想的成分的粉剂。
对于局部给药，本化合物可以以纯的形式应用，即，在它们是液体的情形中。然而，通常理想地将它们作为与皮肤病学可接受的载体结合的组合物或制剂施用到皮肤上，所述载体可以是固体或液体。
有用的固体载体包括细碎分裂的固体，诸如滑石、粘土、微晶纤维素、硅石、矾土等。有用的液体载体包括水、羟烷类或二醇类或水-醇/二醇掺合剂，其中所述化合物可以以有效水平溶解或分散，任选地在无毒表面活性剂的帮助下。可以添加佐剂诸如香味剂和其它抗微生物剂，以将给定用途的特性最优化。得到的液体组合物可以用作吸收衬垫，用于浸渍的绷带及其它敷料，或者使用泵型或气溶胶喷雾器喷到感染区域。
增稠剂诸如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐及酯、脂肪醇、改性纤维素或改性的矿物质还可以与液体载体一起使用，以形成易涂开的糊剂、凝胶、药膏、皂剂等，用于直接涂覆到使用者的皮肤。
可以用于将所述化合物递送到皮肤的有用的皮肤病学组合物的实例是本领域已知的；例如，参见Jacquet等(U.S.Pat.No.4,608,392)，Geria(U.S.Pat.No.4,992,478)，Smith等(U.S.Pat.No.4,559,157)和Wortzman(U.S.Pat.No.4,820,508)。
所述化合物的有用剂量可以通过比较它们的体外活性和在动物模型中的体内活性而确定。将在小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人的方法是本领域已知的；例如，参见U.S.Pat.No.4,938,949。
通常，所述化合物在液体组合物诸如洗液中的浓度约0.1-25wt-％，优选地约0.5-10wt-％。在半固体或固体组合物诸如凝胶或粉剂中的浓度约0.1-5wt-％，优选地约0.5-2.5wt-％。
需要用于治疗的所述化合物或其活性盐或衍生物的量不但随着所选的特定的盐而变化，而且随着施用途径、要治疗的病况的性质以及患者的 年龄和病况而变化，并且最终取决于随从医生或临床医生的判断力。此外，所述化合物的剂量变化取决于靶点细胞、肿瘤、组织、移植物或器官。
理想的剂量可以便利地以单一剂量或作为在适当的时间间隔施用的分割的剂量而存在，例如，作为每天2、3、4次或更多的亚剂量。所述亚剂量本身可以进一步分割，例如，分割成许多次不连续的宽松间隔的施用；诸如从吸入器多次吸入，或者通过使用多滴到眼睛中。
施用方案可以包括长期的、日常的治疗。“长期”意指至少2周，并且优选地几个星期、数月或数年的持续时间。在这一剂量范围的必要的修改可以由本领域的普通技术人员仅仅使用本文的教导所给的常规实验而确定。参见Remington’s PharmaceuticalSciences(Remington’s药物科学)(Martin，E.W.，第4版)，Mack Publishing Co.，Easton，PA。在任何并发症情形中，剂量还可以由个别医生进行调整。
本发明提供一种作为 TNF-α-受体相互作用的调节剂的试剂。
所述候选试剂可以是合成试剂、或试剂的混合物，或可以是天然产物(例如，植物提取物或培养物上层清液)。按照本发明的候选试剂包括可以合成的小分子、天然提取物、肽、蛋白、碳水化合物、脂质等。
可以从合成的或天然试剂的大文库筛选候选调节剂。目前应用许多方法来随机和定向地合成糖、肽和基于核酸的试剂。合成试剂文库可以从许多公司商购，包括MaybridgeChemical Co.(Maybridge化学公司)(Trevillet，Cornwall，UK)，Comgenex(Princeton，NJ)，Brandon Associates(Merrimack，NH)，和Microsource(New Milford，CT)。一种稀有的化学文库可从Aldrich(Milwaukee，WI)获得。组合文库可用并且可以制备。备选地，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然试剂的文库可从例如Pan Laboratories(Bothell，WA)或MycoSearch(NC)获得，或者通过本领域公知的方法容易地生产。另外，天然和合成产生的文库和试剂通过常规化学、物理和生化方法而容易地修饰。
有用的试剂可以在许多化学种类中找到。有用的试剂可以是有机试剂或小的有机试剂。小的有机试剂具有大于50而小于约2,500道尔顿的分子量，优选地小于约750，更优选地小于约350道尔顿。示例性种类包括杂环、肽、糖、类固醇等。所述试剂可以被修饰，以提高功效、稳定性、 药物相容性等。试剂的结构识别可以用来鉴定、产生或筛选其它试剂。例如，在肽试剂得以鉴定的情形中，它们可以以各种方式进行修饰，以提高它们的稳定性，诸如使用非天然氨基酸，诸如D-氨基酸，特别是D-丙氨酸，通过官能化氨基或羧基端，例如，对于氨基、酰化或烷化，并且对于羧基，酯化或酰胺化(amidification)，等等。
对于初级筛选，按照本发明的候选试剂的有用浓度是从约10mM到约100μM或更大(即1mM，10mM，100mM，1M等)。初级筛选浓度将用作上限，与9个其它浓度一起，其中所述其它浓度通过以半-对数间隔减少所述初级筛选浓度而确定(例如，对于9个其它浓度)，用于二级筛选或用于产生浓度曲线。
按照本发明的高通量的筛选试剂盒包括用于进行检测调节 受体相互作用的试剂的所有必要的装置和介质，其中所述调节通过在存在多肽时，多肽优选地在1μM-1mM的浓度范围，与TNF-α相互作用而进行。
所述试剂盒包括下述。本发明的重组细胞，其包括并且表达编码TNF-α的核苷酸序列，按照所述试剂盒，所述重组细胞在固体支持物上生长，诸如微量滴定平板，更优选地在96孔微量滴定平板上生长，按照本领域技术人员公知的方法，特别是在WO 00/02045中所述。备选地，TNF-α以纯的形式提供，例如，由本领域熟练的技术人员固定在96孔微量滴定平板上。备选地，所述试剂盒中提供预先固定，例如，预先固定在96孔微量滴定平板上的TNF-α。TNF-α可以是完整的TNF-α或其片段。
将按照本发明的调节剂，以从约1μM到1mM或更高的浓度，加入到限定的孔中，其中存在适当浓度的抗-TNF-α多肽，其同源序列、其功能片段或其同源序列的功能片段，所述多肽的所述浓度优选地在1μM-1mM范围。试剂盒可以包含一种或多种本发明的抗-TNF-α多肽。
结合检测按照本文已经公开的方法进行，并且将结果与基线水平比较，所述基线水平例如，为TNF-α结合抗-TNF-α多肽、其同源序列、其功能性片段或其同源序列的功能性片段的水平，但是不存在加入的调节剂。(例如)当与不存在调节剂的活性水平相比较时，选择在TNF-α-多肽结合中表现出至少2倍、优选地5倍、更优选地10倍和最优选地100倍 或更大的增加或减少的孔用于进一步分析。
本发明提供用于筛选TNF-α/TNF-α受体结合的调节剂的其它试剂盒，以及用于诊断以TNF-α功能紊乱为特征的紊乱的试剂盒。本发明还提供用于筛选紊乱的调节剂的试剂盒，以及用于它们的诊断的试剂盒，所述紊乱特征在于涉及TNF-α的一个或多个进程。按照本发明应用的试剂盒可以包括分离的TNF-α。备选地，或者另外，试剂盒可以包括转化表达TNF-α的细胞。在另一个实施方案中，按照本发明的试剂盒可以包括编码TNF-α的多聚核苷酸。在另一个实施方案中，按照本发明的试剂盒可以包括用于TNF-α扩增的特异引物。按照本发明应用的试剂盒可以包括分离的TNF-α多肽，其同源物，或其功能性片段。按照本发明的试剂盒可以包括转化表达所述多肽的细胞。试剂盒可以包含多于一种的多肽。在另一个实施方案中，按照本发明的试剂盒可以包括编码TNF-α的多聚核苷酸。在另一个实施方案中，按照本发明的试剂盒可以包括用于大分子诸如例如TNF-α扩增的特异引物。因此所有按照本发明的试剂盒应该包括规定的项目或项目组合，以及包装物质。试剂盒还包括使用说明。
此外，熟练的技术人员还应该清楚，可以可能地将上文提及的用于本发明的纳米体的一个或多个CDR’s“移植”到其它“支架”上，所述支架包括但不限于人支架或非-免疫球蛋白支架。用于这种CDR移植的适宜的支架和技术是熟练的技术人员所清楚的，并且是本领域公知的，参见，例如US-A-7,180,370，WO 01/27160，EP 0 605 522，EP 0 460 167，US-A-7,054,297，Nicaise等，Protein Science(蛋白质科学)(2004)，13：1882-1891；Ewert等，Methods(方法)，2004 Oct；34(2)：184-199；Kettleborough等，Protein Eng.(蛋白质工程)1991 Oct；4(7)：773-783；O’Brien和Jones，Methods Mol.Biol.(分子生物学方法)2003：207：81-100；和Skerra，J.Mol.Recognit.(分子识别杂志)2000：13：167-187，和Saerens等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)2005 Sep 23；352(3)：597-607，以及本文引用的其它参考文献。例如，可以以相似的方式应用本质上已知的关于将小鼠或大鼠的CDR’s移植到人构架和支架上的技术，以提供包括一个或多个本发明的纳米体的CDR’s和一个或多个人构架区或序列的嵌合蛋白。
因此，在另一个实施方案中，本发明包括一种嵌合多肽，其包含至少 一种选自由本文提及的用于本发明的纳米体的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列组成的组的CDR序列。优选地，这样的嵌合多肽包括至少一种选自由本文提及的用于本发明的纳米体的CDR3序列组成的组的CDR序列，并且任选地还包括至少一种选自由本文提及的用于本发明的纳米体的CDR1序列和CDR2序列组成的组的CDR序列。例如，这样的嵌合多肽可以包括一个选自由本文提及的用于本发明的纳米体的CDR3序列组成的组的CDR序列，一个选自由本文提及的用于本发明的纳米体的CDR1序列组成的组的CDR序列，和一个选自由本文提及的用于本发明的纳米体的CDR1序列和CDR2序列组成的组的CDR序列。对于这些嵌合多肽，本文提及的对于本发明的纳米体优选的CDR’s的组合通常也是优选的。
在所述嵌合多肽中，所述CDR’s可以与其它氨基酸丰余序列连接和/或通过氨基酸序列彼此连接，其中所述氨基酸优选地是构架序列或作用为构架序列的氨基酸序列，或者一起形成用于递呈所述CDR’s的支架。参考也参见在前段中提及的现有技术。按照一个优选的实施方案，所述氨基酸序列是人构架序列，例如，VH3构架序列。然而，还可以使用非人的、合成的、半-合成的或非-免疫球蛋白构架序列。优选地，所用的构架序列如此，以致：(1)所述嵌合多肽能够结合xxxx，即，以相对应的本发明的纳米体的亲和力的至少1％、优选地至少5％、更优选地至少10％，诸如至少25％，并且达到50％或90％或更大的亲和力；(2)所述嵌合多肽适于药用；和(3)在用于其药用(即，指征、施用模式、剂量和治疗方案)的目的条件下(其可以基本上类似于本文所述的关于应用本发明的纳米体的条件)，所述嵌合多肽优选地基本上无免疫原性。
按照一个非限制性实施方案，所述嵌合多肽包括通过至少一个构架序列连接的至少两个CDR序列(如上文所提及)，其中优选地所述两个CDR序列中的至少一个是CDR3序列，另一CDR序列为CDR1或CDR2序列。按照一个优选的但非限制性的实施方案，所述嵌合多肽包括至少两个构架序列连接的至少两个CDR序列(如上文提及)，其中优选地所述三个CDR序列中的至少一个是CDR3序列，其余两个CDR序列是CDR1或CDR2序列，并且优选地是一个CDR1序列和一个CDR2序列。按照一个特别优选的但非限制性的实施方案，所述嵌合多肽具有结构FR1’-CDR1-FR2’- CDR2-FR3’-CDR3-FR4’，其中CDR1，CDR2和CDR3如本文关于本发明的纳米体的CDR’s的定义，而FR1’，FR2’，FR3’和FR4’是构架序列。特别地，FR1’，FR2’，FR3’和FR4’可以分别是人抗体(诸如VH3序列)构架1，构架2，构架3和构架4序列，和/或所述构架序列的部分或片段。还可以使用具有结构FR1’-CDR1-FR2’-CDR2-FR3’-CDR3-FR4的嵌合多肽的部分或片段。优选地，这样的部分或片段如此，以致它们满足在前述段落中列出的标准。
本发明还涉及包括和/或基本上由所述嵌合多肽组成的蛋白和多肽，涉及编码所述蛋白或多肽的核酸；涉及制备所述蛋白和多肽的方法；涉及表达或能够表达所述蛋白或多肽的宿主细胞；涉及组合物，并且特别是包含所述蛋白或多肽、核酸或宿主细胞的药物组合物；并且涉及所述蛋白或多肽、所述核酸、所述宿主细胞和/或所述组合物的应用，特别是用于预防、治疗或诊断目的，诸如本文提及的预防、治疗或诊断目的。例如，所述蛋白、多肽、核酸、方法、宿主细胞、组合物和应用可以与本文关于本发明的纳米体所述的蛋白、多肽、核酸、方法、宿主细胞、组合物和应用相似。
还应该注意，当本发明的纳米体包含除上文提及的优选的CDR序列之外的一个或多个其它CDR序列时，这些CDR序列可以是任何适宜的(即，适用于本文所述的目的)CDR序列和/或这些CDR序列可以以本质上已知的任何方法获得，例如，从纳米体(优选)，来自常规抗体(并且特别来自人抗体)的VH结构域，重链抗体，常规4-链抗体(诸如常规人4-链抗体)或针对TNF的其它免疫球蛋白序列。针对xxxx的这种免疫球蛋白序列可以以任何本质上已知的方法产生，如熟练的技术人员所清楚的，即，通过用TNF免疫或通过用TNF筛选免疫球蛋白序列的适宜的文库，或其任何的组合。任选地，这可以接着进行技术诸如随机或位点定向诱变和/或其它本质上已知的用于亲和力成熟的技术。产生这样的免疫球蛋白序列的适宜的技术是熟练的技术人员所清楚的，并且例如包括Hoogenboom，Nature Biotechnology(自然生物技术)，23，9，1105-1116(2005)综述的筛选技术。产生针对指定的靶点的免疫球蛋白的其它技术包括，例如，纳米体技术(例如，在未预先公布的美国临时专利申请60/648,922)，所谓的SLAM技术(例如欧洲专利申请0 542 810中所述)，应用表达人免疫球蛋白的转基因小鼠或者公知的杂交瘤技术(参见，例如Larrick等，Biotechnology(生物技术)，卷7，1989，第934页)。所有这些技术可以用来产生针对TNF的免疫球蛋白，并且这种免疫球蛋白的CDR’s可以用于本发明的纳米体，即，如上文列出的。例如，这样的CDR序列可以被确定、合成和/或分离，并且插入到本发明的纳米体的序列中(例如，以便取代相对应的天然CDR)，所有应用的技术本质上已知，诸如本文所述的那些，或者包含所述CDR’s的本发明的纳米体(或编码其的核酸)可以从头合成，也应用本文提及的技术。
现在将通过下述非限制性实例和附图的方法对本发明进一步描述，其中所述附图显示：
单价TNFα纳米体
图1：人TNFα纳米体的序列比对
图2：血清白蛋白特异性TNFα纳米体的序列比对
图3：白蛋白特异性TNFα纳米体与人血清白蛋白的结合
图4：白蛋白特异性TNFα纳米体与恒河猴血清白蛋白的结合
图5：白蛋白特异性TNFα纳米体与小鼠血清白蛋白的结合
图6：TNFα和血清白蛋白纳米体的纯度(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)
图7：TNFα和血清白蛋白纳米体的蛋白质印迹分析
图8：TNFα纳米体与人TNFα的结合(ELISA)
图9：TNFα纳米体与恒河猴TNFα的结合(ELISA)
图10：对依那西普关于人TNFα的受体-抑制检测
图11：对依那西普关于恒河猴TNFα的受体-抑制检测
图12：TNFα纳米体与人TNFα的结合(Biacore)
图13：TNFα纳米体与恒河猴TNFα的结合(Biacore)
图14：TNFα纳米体与蛋白质A的结合(Biacore)
图15：TNFα和血清白蛋白纳米体的温度处理(蛋白质印迹)
图16：稳定性：TNFα纳米体的温度处理(ELISA)
图17：血清白蛋白纳米体的温度处理(Biacore)
二价TNFα纳米体
图18：二价TNFα纳米体的纯度(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)
图19：二价TNFα纳米体的蛋白质印迹分析
图20：对依那西普关于二价TNFα纳米体的受体-抑制检测
图21：稳定性：二价TNFα纳米体的温度处理(ELISA)
人源化的单价TNFα纳米体
图22：TNF1人源化纳米体的多序列比对
图23：TNF2人源化纳米体的多序列比对
图24：TNF3人源化纳米体的多序列比对
图25：ALB1人源化纳米体的多序列比对
图26：人源化TNFα和血清白蛋白纳米体的纯度(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)
图27：人源化TNFα和血清白蛋白纳米体的蛋白质印迹分析
图28：人源化TNFα纳米体与人TNFα的结合
图29：人源化血清白蛋白纳米体与人血清白蛋白的结合
图30：稳定性：人源化TNFα纳米体的温度处理(ELISA)
三价TNFα纳米体
图31：三价TNFα纳米体的纯度(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)
图32：三价TNFα纳米体的蛋白质印迹分析
图33：稳定性：三价TNFα纳米体的温度处理(ELISA)
人源化单价TNFα纳米体(第二轮)
图34：TNF1人源化纳米体的多序列比对
图35：TNF2人源化纳米体的多序列比对
图36：TNF3人源化纳米体的多序列比对
图37：ALB1人源化纳米体的多序列比对
图38：人源化TNFα纳米体的纯度(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)
图39：人源化TNFα纳米体的蛋白质印迹分析
图40：人源化TNFα纳米体与人TNFα的结合
图41：稳定性：人源化TNEα纳米体的温度处理(ELISA)
图42：纯化的TNF60在银染色的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶上的分析(A)考马斯染色的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶(B)并且在使用抗-NB的蛋白质印迹分析中(C)检测
图43：TNF60在Superdex HR75上的分析型大小排阻层析
图44：TNF60与人TNF-α的结合
图45：与Enbrel(依那西普)，Humira(阿达木单抗)和Remicade(英夫利昔单抗)相比，使用纳米体TM TNF60在使用人TNFα的细胞毒性检测中获得剂量应答曲线
图46：与Enbrel(依那西普)，Humira(阿达木单抗)和Remicade(英夫利昔单抗)相比，使用纳米体TM TNF60在使用恒河猴TNFα的细胞毒性检测中获得剂量应答曲线
图47：TNF60在小鼠中的药物代谢动力学图表
图48：TNF60在小鼠中的免疫原性图表
图49：纯化的TNF56-PEG40，TNF56-PEG60，TNF56-biotine，TNF55-PEG40，TNF55-PEG60和TNF55-biotine在考马斯染色的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上的分析
图50：纯化的TNF56-PEG40在使用银染色的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上的分析(A)考马斯染色(B)并且在使用抗-NB的蛋白质印迹分析中(C)检测
图51：TNF56-PEG40在Superdex HR75上的分析型大小排阻层析
图52：TNF56-PEG40在Superdex HR200上的分析型大小排阻层析
图53：与Enbrel(依那西普)，Humira(阿达木单抗)和Remicade(英夫利昔单抗)相比，使用纳米体TM TNF56-PEG40和单价野生型纳米体TM TNF1在使用人TNFα的细胞毒性检测中获得剂量应答曲线
图54：与Enbrel(依那西普)，Humira(阿达木单抗)和Remicade(英夫利昔单抗)相比，使用纳米体TM TNF56-PEG40在使用恒河猴TNFα的细胞毒性检测中获得剂量应答曲线
图55：在小鼠中静脉内施用后聚乙二醇化的二价纳米体TM TNF56-PEG40和TNF56-PEG60的药物代谢动力学分析
图56：在小鼠中静脉内施用后聚乙二醇化的二价纳米体TM 3E-3E-PEG40和双特异性纳米体TM 3E-3E-AR1的药物代谢动力学分析
图57：TNF56-PEG40和TNF56-PEG60在小鼠中的免疫原性图表
图58：TNF60在小鼠预防慢性多发性关节炎的效果
图59：TNF60在小鼠中治疗慢性多发性关节炎的效果
图60：TNF60纳米体TM关于在小鼠中预防慢性多发性关节炎中的效果的格式化作用
图61：纳米体TM PMP1C2，3E，1A和3G的序列比对
图62：TNF-60的分子模型
后附的表格组成本说明书的完整部分，并且如下：
单价TNFα纳米体
表8：TNFα纳米体的序列表
表9：人TNFα纳米体的Koff值
表10：TNFα和血清白蛋白纳米体与人种系序列的同源性
表11：TNFα和血清白蛋白纳米体的表达水平
表12：人和恒河猴TNFα的ELISA结合
表13：TNFα纳米体的受体-抑制检测
表14：TNFα纳米体的Biacore分析
表15：TNFα纳米体与TNFα的结合(KD-值)
表16：TNFα纳米体中和人(a)和恒河猴(b)TNFα的能力
表17：温度处理后TNFα和血清白蛋白纳米体的OD280nm
表18：温度处理后TNFα纳米体的能力
二价TNFα纳米体
表19：二价TNFα纳米体和连接序列的序列表
表20：二价TNFα纳米体构建体
表21：二价TNFα纳米体的表达水平
表22：二价TNFα纳米体的受体-抑制检测
表23：TNFα纳米体中和人(a)和恒河猴(b)TNFα的能力
表24：二价TNFα纳米体的OD280nm
人源化的单价TNFα纳米体
表25：人源化单价TNFα和血清白蛋白纳米体的序列表
表26：人源化TNFα和血清白蛋白纳米体的表达水平
表27：TNFα纳米体中和人TNFα的能力
表28：人源化TNFα和血清白蛋白纳米体的OD280nm
三价TNFα纳米体
表29：三价TNFα纳米体的序列表
表30：三价TNFα纳米体构建体
表31：三价TNFα纳米体的表达水平
表32：三价TNFα纳米体中和人TNFα的能力
表33：三价纳米体与血清白蛋白的结合(KD-值)
表34：三价TNFα纳米体的OD280nm
人源化单价TNFα纳米体(第二轮)
表35：第二轮人源化的单价TNFα纳米体的序列表
表36：人源化TNFα纳米体的表达水平
表37：TNFα纳米体中和人TNFα的能力
表38：人源化TNFα纳米体的OD280nm
表39：比较纳米体的生物活性
其它表格
表40：用于格式化三价纳米体TM的寡聚核苷酸的概括
表41：用于克隆三价纳米体TM的寡聚核苷酸的概括
表42：与商购对照(依那西普，英夫利昔单抗，Humira)相比较，在使用三价纳米体TMTNF60的细胞毒性检测中获得的EC50值
表43：在Biacore中TNF60和TNF24关于人血清白蛋白的亲和力确定。
Nd，未确定。
表44：用于格式化二价纳米体TM的寡聚核苷酸的概括。
表45：与商购对照(依那西普，英夫利昔单抗，Humira)相比较，在使用二价纳米体TM的细胞毒性检测中获得的EC50值
表46：来自于成纤维细胞研究的滑膜结果
表47：鼠气囊研究的结果
实施例
实施例1：TNFα和血清白蛋白特异性纳米体的鉴定
使用两只用人TNFα免疫的美洲驼(Llama glama)鉴定拮抗性纳米体，所述美洲驼以一周的时间间隔注射6次的100μg细胞因子进行免疫。筛选使用基于竞争的检测进行，其中分析单个纳米体抑制标记的TNFα与其受体结合的能力。白蛋白特异性纳米体从用人血清白蛋白免疫的美洲驼鉴定。单个纳米体的筛选通过使用人、恒河猴和小鼠白蛋白的ELISA进行，产生与各种物种的血清白蛋白交叉反应的一组纳米体。
实施例2：分离的纳米体的序列分析
基于序列分析(图1)鉴定不同种类的纳米体，所述分析使用BLOSUM62评分矩阵，并且相似度显著值截断点≥60％：种类I(PMP1 C2，PMP1 G11，PMP1 H6)，种类II(PMP1 G5，PMP1 H2，PMP3 G2)，种类IIb(PMP1 D2)，种类III(PMP3 D10，PMP5 F10)。表8列出这些TNFα纳米体的序列(SEQ ID NOs：52-60)。
基于序列分析(图2)，鉴定不同种类的血清白蛋白纳米体，其使用BLOSUM62评分矩阵，并且相似度显著值截断点≥60％。表8列出这些血清白蛋白纳米体的序列(SEQ ID NOs：61-67)。
实施例3：Biacore分析
TNFα
纳米体与TNFα的结合特征在于在Biacore 3000设备中的表面等离振子共振。来自不同物种的TNF通过胺基偶联共价结合CM5传感器芯片表面，直到达到增加250个应答单位。保持反应性的基团失活。评估纳米体在一种浓度(1/1,000稀释)的结合。每一纳米体注射4分钟，流速45μl/分钟，以允许与芯片-结合的抗原的结合。无纳米体的结合缓冲液以相同的流速流过芯片4小时，以允许结合的纳米体的自动解离。从关于不同纳米体获得的sensorgrams计算Koff-值。
在每一种类的纳米体中，未纯化的蛋白在Biacore中分析。Koff数据在表9中列出。
基于Koff值，保留每一种类的代表性纳米体用于进一步的分析。对于种类I，选择PMP1C2(TNF1)；选择PMP1G5(TNF2)作为种类II的代表；选择PMP5F10(TNF3)作为种类III的代表。
血清白蛋白
结合按照上述进行检测，除了使用1/20稀释之外。图3，4和5举例说明使用未纯化的蛋白筛选相对于人、恒河猴和小鼠血清白蛋白的白蛋白特异性TNFα纳米体。
所述纳米体按照Koff-值排列，参见下表III。
| 种类 | 人 | 恒河猴 | 小鼠 |
| C | PMP6A8 | PMP6A8 | PMP6B4 |
| C | PMP6B4 | PMP6B4 | PMP6A8 |
| B | PMP6A6 | PMP6A6 | PMP6A6 |
| B | PMP6C1 | PMP6C1 | PMP6C1 |
| A | PMP6G8 | PMP6G8 | PMP6G8 |
| A | PMP6A5 | PMP6A5 | PMP6A5 |
| D | PMP6G7 | PMP6G7 | PMP6G7 |
表III
对于家族C和家族B的成员获得最佳koff。对于这些家族的成员，还观察到小鼠、人和恒河猴血清白蛋白之间的交叉-反应性。确定来自种类B和C的代表性纳米体用于进一步分析：选择PMP6A6(ALB1)作为种类B的代表，并且选择PMP6A8(ALB2)作为种类C的代表。
实施例4：在pAX051中克隆单价纳米体
大肠杆菌表达载体的描述
pAX051是pUC19的衍生物。它包含能够使用IPTG进行可控的表达诱导的LacZ启动子。所述载体具有氨苄青霉素或羧苄青霉素的抗性基因。多克隆位点携带一些限制性位点，其中SfiI和BstEII通常用于克隆纳米体TM。符合NB编码序列的阅读框，所述载体编码C-端c-myc标记和(His)6标记。信号肽是gen3前导序列，其将表达的纳米体TM转运到细胞 周质。
将编码所选择的纳米体TNF1(PMP1C2)，TNF2(PMP1G5)，TNF3(PMP5F10)，ALB1(PMP6A6)和ALB2(PMP6A8)的DNA克隆到pAX051中，并且将构建体转化到TG1电感受态细胞中。分析克隆的PCR插入，并且在4个阳性克隆中确定核苷酸序列。从包含正确序列的克隆制备甘油储液，并且保存在-80℃。
实施例5：单价纳米体的表达
通过将表达代表性纳米体的克隆的单菌落在37℃接种在LB，氨苄青霉素/羧苄青霉素(100μg/ml)和2％葡萄糖中过夜而开始预培养。这一预培养物用来接种。接种体是生产培养物(TB培养基+氨苄青霉素/羧苄青霉素+0.1％葡萄糖)的1％(v/v)。将所述生产培养物在37℃生长直到达到OD600nm 5-10，并且通过加入IPTG(1mM终浓度)诱导纳米体表达。允许蛋白表达在37℃持续4小时或在28℃过夜，在所述时刻通过离心收集细胞并且将湿细胞团保存在-20℃。
通过将沉淀物重悬在Peri-缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，调整pH值到8.0)，将所述混合物在4℃旋转30分钟，并且使用制备离心机(Sorvall RC-3C Plus，具有H-6000A转子)离心所述混合物以沉淀细胞，而制备所述-20℃保存的湿细胞团的预制备细胞周质提取物。收集代表细胞外周间隙的粗提取物的上层清液，用于进一步纯化。
将His(6)-标记的纳米体在固定的金属亲和层析(IMAC)上纯化。按照厂商的说明处理TALON树脂(Clontech)。将所述提取物与树脂一起在旋转器上在RT温育30分钟。将树脂用PBS洗涤，并且转移到柱上。将填装的树脂用15mM咪唑洗涤。使用150mM咪唑将纳米体从柱上洗脱下来。通过点样在Hybond膜上并且用丽春红显现而分析洗脱的级分。收集包含蛋白的级分，并且针对PBS进行透析。收集透析的蛋白，过滤除菌，确定浓度，并且将等分试样保存在-20℃。
单价TNFα纳米体的特征性描述
实施例6：与人种系序列同源
将纳米体的氨基酸序列与人种系序列比较，如表10所述。在与人序列同源的顺序中，纳米体排列如下：对于TNFα纳米体，TNF1＞TNF2＞TNF3；对于血清白蛋白纳米体ALB1＞ALB2。
实施例7：表达水平
计算表达水平，并且在表11中描述。在产量顺序中，纳米体排列如下：对于TNFα纳米体，TNF1＞TNF2＞TNF3；对于血清白蛋白纳米体ALB1＞ALB2。
实施例8：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
为了确定纯度，将蛋白样品在15％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上分析。将10μl Laemmli样品缓冲液加入到10μl(1ug)纯化的蛋白中，将样品在95℃加热10分钟，冷却，并且上样到15％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上。凝胶按照通用步骤处理，并且用考马斯亮蓝(CBB)染色。图6描绘TNFα-特异性和血清白蛋白-特异性纳米体的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
实施例9：蛋白质印迹分析
将100ng纯化的蛋白上样在凝胶上。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，使用Mini 电泳转移元件(Biorad)将蛋白转移到硝基纤维素膜上。将所述膜在4℃在PBS，1％酪蛋白中封闭过夜。
由于所有的构建体都融合c-myc标记，所以将小鼠单克隆抗-myc抗体用作检测工具。另外，兔多克隆抗-纳米体(R23)用作检测工具。将印迹在室温下在1/2000稀释在PBS中的抗-myc抗体中或在PBS中的1/2000抗-纳米体抗体，1％酪蛋白中搅拌温育1小时。在应用二抗(兔-抗-小鼠IgG碱性磷酸酶缀合物，Sigma，A1902，1/1000稀释在PBS中，或者山羊抗-兔IgG碱性磷酸酶缀合物，Sigma，A8025，1％酪蛋白)之前将所述膜在PBS中洗涤5次。在室温轻微搅拌温育1小时后，将所述膜在PBS中洗涤5次。使用BCIP/NBT溶液显现印迹，并且当条带清楚可见时，通过用milliQ水洗涤所述印迹而终止反应。图7描绘蛋白质印迹分析。
实施例10：在ELISA中与人和恒河猴TNFα的结合
进行ELISA，检验与人和恒河猴TNFα的结合。将96-孔Maxisorp平板用在PBS中的2μg/ml Neutravidin在4℃包被过夜(ON)。将平板用1％的酪蛋白在室温封闭2小时。将生物素酰化的TNFα(400ng/ml)加入到孔中，并且在室温温育1小时。使用1/3稀释并且从2μg/ml起始稀释纳米体样品。使用小鼠抗-myc(1/2000稀释)和兔抗-小鼠碱性磷酸酶(1/2000稀释，Sigma，A1902)和pNPP(2mg/ml)作为底物检测纳米体。图9和10描述ELISA中与人和恒河猴TNFα的结合。
结果总结在表12中。TNF1和TNF3表现出与人和恒河猴TNFα都结合。TNF2结合人TNFα，但是只微弱地与恒河猴TNFα反应。
实施例11：受体-抑制检测
分析恒河猴和人TNFα抑制受体-配体相互作用的能力。将96-孔Maxisorp平板用在PBS中的2μg/ml依那西普在4℃包被过夜。将平板用1％酪蛋白在室温封闭2小时。纳米体样品与起始浓度为5μg/ml并且使用1/2稀释的生物素酰化的TNFα(10ng/ml)在室温预温育30分钟。将样品添加到平板中，并且在室温温育1小时。使用Extravidin碱性磷酸酶(1/2000稀释)和pNPP(2mg/ml)作为底物检测生物素酰化的TNFα。图11和12描绘对于人和恒河猴TNFα的抑制性ELISA。结果总结在表13中。关于人和恒河猴TNF的TNF1和TNF3观察到配体/受体结合的抑制，而TNF2只抑制人TNFα。
实施例12：Biacore分析
TNFα结合
所述分析按照实施例3所述进行。图13和14通过Biacore分析举例说明与人和恒河猴TNFα的结合。结果总结在表14中。Biacore中的结合实验证实ELISA结果：对于TNF1和TNF3交叉-反应结合，而TNF2只显著性地结合人TNFα。
血清白蛋白
结合按照上述进行检测，除了使用不同浓度系列之外。每一浓度注射4分钟，流速45μl/分钟，以允许与芯片-结合的抗原的结合。将无分析物的结合缓冲液以相同流速流过所述芯片，以允许结合的纳米体的解离。15分钟后，通过注射再生溶液(25mM NaOH)而去除残留的结合分析物。
当达到平衡时，通过稳态亲和力从每一分析物的不同浓度获得的sensorgrams计算KD-值。
结果总结在表15中。对于ALB1和ALB2观察到交叉-反应性。对于ALB2，观察到与人和恒河猴TNFα的最高亲和力。然而，对于ALB2(因子400)，在对于人/恒河猴相对于小鼠血清白蛋白的亲和性中的差异更明显，而对于ALB1，只观察到因子12的不同。
实施例13：生物-检测
TNFα敏感的小鼠成纤维细胞细胞系L929s用于检测所选纳米体的抗-TNFα活性。在培养基中存在足够高浓度的TNFα时，即，细胞毒性剂量，L929s细胞经历坏死。TNFα与其受体的相互作用的抑制通过在将混合物加入到细胞中之前将一系列抗体稀释物与细胞毒性浓度的TNFα预温育而确定。放射菌素D在培养基中的存在使得细胞对TNFα更敏感，导致对于游离TNFα的增加的生物检测敏感性。
将L929细胞生长至几乎汇合，以每孔5000个细胞接种在96-孔微量滴定平板上，并且培养过夜。向细胞中加入放射菌素D，终浓度为1μg/ml。将要检测的所述纳米体的连续稀释液与细胞毒性浓度的TNFα(最终检测浓度为0.5ng/ml或15IU/ml)混合。在37℃温育至少30分钟后，将这一混合物添加到接种的孔中。将平板在37℃和5％ CO2培养24小时。通过使用四唑盐WST-1确定细胞的生存能力。剂量-应答曲线和EC50值用Graphpad Prism计算。
关于人和恒河猴TNFα结果总结在表16中。基于它们中和细胞毒性活性的能力，分子排列如下：对于人TNFα，TNF3＞TNF1＞TNF2，并且对于恒河猴TNFα，TNF1＝TNF3＞TNF2。
实施例14：蛋白质A结合
图14描绘按照实施例12所述在Biacore中分析的蛋白质A结合。对于TNF1，TNF2，ALB1获得阳性结合。对于TNF3和ALB2观察到没有结合或微弱的结合。
实施例15；温度稳定性
将样品稀释为200μg/ml，并且分成包含500μl的8个等分试样。不同的小瓶分别在从室温到90℃范围的给定温度温育。处理后，将样品在室温冷却2小时，将它们保存在4℃。通过在14,000rpm离心30min去除沉淀。将上清液(SN)仔细地去除并且进一步分析。
OD280nm
检测280nm的OD，并且计算浓度。结果总结在表17中。对于TNF2和TNF3从80℃开始观察到蛋白含量的减少，而对于ALB2，从70℃开始观察到减少。
蛋白质印迹
将2μg处理的蛋白在15％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离，并且转移到硝基纤维素膜上，并且按照上述处理。使用多克隆抗-纳米体(R23，1/2000稀释)和抗-兔辣根过氧化物酶(DAKO，P0448，1/2000稀释)进行检测。图15描绘蛋白质印迹分析。对于在70，80和90℃处理的ALB2观察到蛋白浓度的明显的下降。对于在70，80和90℃处理的TNF1；对于在90℃处理的TNF3；对于在90℃处理的ALB1，也观察到聚集，意味着上清液仍然包含痕量的沉淀物，这导致更高的OD280nm读取值。这解释为什么对于在这些更高的温度处理的TNF1、TNF3和ALB1当在OD280nm检测时蛋白浓度不减少。
ELISA
检测与人TNFα结合的ELISA基本上按照实施例10所述进行。结果在图16中描绘。对于TNF1，TNF2，TNF3，从80℃开始，人TNFα结合 下降。
生物-检测
生物-检测按照实施例13所述进行。结果总结在表18中。对于TNF1从70℃开始；对于TNF2和TNF3从80℃开始，纳米体的效果降低。
Biacore
按照实施例12所述确定与人血清白蛋白的结合。使用固定的浓度(1/50稀释)。结果在图17中描绘。对于ALB1，温度处理不影响与血清白蛋白的结合。对于ALB2，所述处理从T＝70℃开始对有kon影响。
二价纳米体
实施例16：二价TNFα特异性纳米体的格式化
将TNF1，TNF2和TNF3格式化成二价纳米体。9AA GlySer接头(表19 SEQ ID No：68)或30 AA GlySer接头(表19 SEQ ID No：69)用作两个结构单元之间的间隔。这产生由表20代表的构建体。表19列出这些二价TNFα纳米体的序列(SEQ ID NOs：70-75)。
实施例17：二价TNFα特异性纳米体的表达
表达按照实施例5中所述进行。将His(6)-标记的纳米体在固定的金属亲和层析(IMAC)上纯化。按照厂商的说明处理Ni-NTA树脂(Qiagen)。将所述提取物与树脂一起在旋转器上在室温温育30min。将树脂用PBS洗涤，并且转移到柱上。将填装的树脂用PBS(1/10稀释)洗涤。柱用15mM咪唑预洗脱。使用25mM柠檬酸pH＝4将纳米体从柱上洗脱下来。通过点样在Hybond膜上并且用丽春红显现而分析洗脱的级分。合并包含蛋白的级分，并且通过阳离子交换然后大小排阻而进一步纯化。收集纯化的蛋白，过滤除菌，确定浓度，并且将等分试样保存在-20℃。
二价TNFα特异性纳米体的特征性描述
实施例18：表达水平
表21中计算并且描述二价TNFα纳米体的表达水平。接头对纳米体的表达水平没有显著影响。
实施例19：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳按照实施例8中所述进行。图18显示十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。
实施例20：蛋白质印迹
蛋白质印迹分析按照实施例9中所述进行。图19描绘蛋白质印迹结果。
实施例21：受体-抑制检测
所述检测按照实施例11中所述进行。图20和表22描绘结果。与单价形式相比，对于所有二价纳米体观察到配体/受体结合抑制的增强。
实施例22：生物-检测
所述检测按照实施例13中所述进行。结果总结在表23中。基于它们中和细胞毒性活性的潜力，TNF8，TNF7，TNF9和TNF5在依那西普范围内具有潜力。
实施例23：温度稳定性
样品按照实施例15中所述进行分析。
OD280nm
检测280nm处OD并且计算浓度。结果总结在表24中。对于TNF4和TNF7从70℃开始观察到蛋白含量的减少，而对于TNF5，TNF6，TNF8和TNF9从80℃开始观察到减少。
蛋白质印迹
按照实施例15中所述分析样品中聚集物的存在。
ELISA
检测与人TNFα结合的ELISA基本上按照上述进行。结果在图21中描绘。对于TNF5，TNF6，TNF8和TNF9从80℃开始，对于TNF4和TNF7从70℃开始，人TNFα结合下降。
人源化的单价纳米体
实施例24：鉴定TNFα和血清白蛋白特异性纳米体中的非-人氨基酸位置
图22(TNF1)，图23(TNF2)，图24(TNF3)和图25(ALB1)描述使用DP51，DP53，DP54和DP29序列的多序列比对(Clustal W 1.7)。
除了氨基酸突变，进行密码子最优化，产生表25 SEQ ID NOs：76-89的序列(分别针对TNFα和人血清白蛋白的纳米体)。
实施例25：产生密码子最优化的突变体
合成跨越纳米体的完整序列的寡聚核苷酸。
实施例26：表达二价TNFα特异性纳米体
表达按照实施例5中所述进行。
人源化纳米体的特征性描述
实施例27：表达水平
表26描述计算的表达水平。以3.5-11.7mg/ml范围的产量实现表达。诱导时间不影响产量。
实施例28：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳按照实施例8中所述进行。图26描绘十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶。
实施例29：蛋白质印迹
蛋白质印迹分析按照实施例9中所述进行。图27描绘蛋白质印迹结 果。
实施例30：生物-检测
所述检测按照实施例13中所述进行。
人源化纳米体的结果总结在表27中。包括野生型纳米体作为参照。
实施例31：Biacore
所述分析按照实施例12中所述进行。图28和31显示Biacore结果。
实施例32：温度稳定性
样品按照实施例15中所述进行分析。
OD280nm
检测280nm的OD，并且计算浓度。结果总结在表28中。
对于人源化的TNF1纳米体(TNF13-14)，在蛋白浓度中没有观察到显著减小。对于人源化的TNF2(TNF15-19)和TNF3(TNF20-23)从80℃开始观察到蛋白浓度的减小。对于人源化的ALB1(ALB4-5)从70℃开始，和对于ALB3从60℃开始观察到蛋白浓度的减小。
蛋白质印迹
按照实施例15中所述分析样品中聚集物的存在。
ELISA
检测与人TNFα的结合的ELISA基本上按照实施例15中所述进行。结果在图30中描绘。
对于温度处理的野生型TNF1和人源化的TNF13和14；对于温度处理的野生型TNF2和人源化的TNF15-19；人TNFα结合相当；与温度处理的野生型TNF3相比，对于TNF21和22，人TNFα结合下降，并且对于TNF23下降到更低程度，而对于TNF20没有观察到影响。
三价TNFα纳米体
实施例33：三价TNFα特异性纳米体的格式化
将TNF1，TNF2，TNF3和ALB1格式化成三价纳米体。9AA GlySer接头(表19 SEQ IDNo：68)或30 AA GlySer接头(表19 SEQ ID No：69)用作两个结构单元之间的间隔。这产生表30中的构建体。表29列出这些三价TNFα纳米体的序列(SEQ ID NOs：91-94)。
实施例34：三价TNFα特异性纳米体的表达
表达按照实施例5中所述进行。将His(6)-标记的纳米体在固定的金属亲和层析(IMAC)上纯化。按照厂商的说明处理Ni-NTA树脂(Qiagen)。将所述提取物与树脂一起在旋转器上在室温温育30分钟。将树脂用PBS洗涤，并且转移到柱上。将填装的树脂用PBS(1/10稀释)洗涤。用15mM咪唑预洗脱。使用25mM柠檬酸pH＝4将纳米体从柱上洗脱下来。通过点样在Hybond膜上并且用丽春红显现而分析洗脱的级分。合并包含蛋白的级分，并且通过阳离子交换然后大小排阻而进一步纯化。收集纯化的蛋白，过滤除菌，确定浓度，并且将等分试样保存在-20℃.
三价TNFα/SA特异性纳米体的特征性描述
实施例35：表达水平
在表31中计算并且描述表达水平。
实施例36：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳按照实施例8中所述进行。图31显示SDS-PAGE凝胶。
实施例37：蛋白质印迹分析
蛋白质印迹分析按照实施例9中所述进行。图32描绘蛋白质印迹结果。
实施例38：生物-检测
所述检测按照实施例13中所述进行。
二价纳米体的结果总结在表32中。基于它们中和细胞毒性活性的潜力，所述分子潜力相等，并且相当于它们作为二价分子的潜力。
实施例39：结合人血清白蛋白
结合按照上述进行检测，除了使用不同浓度系列之外。每一浓度注射4分钟，流速45μl/min，以允许与芯片-结合的抗原的结合。接下来将无分析物的结合缓冲液以相同流速流过所述芯片，以允许结合的纳米体的解离。15分钟后，通过注射再生溶液(25mM NaOH)而去除残留的结合分析物。
当达到平衡时，通过稳态亲和力从每一分析物的不同浓度获得的sensorgrams计算KD-值。
结果总结在表33中。与野生型ALB1相比，对于格式化的ALB1粘合剂观察到亲和力的减小。然而，所述亲和力仍然在7.2-14nM范围内。
实施例40：温度稳定性
样品按照实施例15中所述进行分析。
OD280nm
检测280nm处OD并且计算浓度。结果总结在表34中。对于TNF24，TNF27和TNF28从60℃开始，而对于TNF25和TNF26从70℃开始观察到蛋白含量的减少。
蛋白质印迹
按照实施例15中所述分析样品中聚集物的存在。
ELISA
检测与人TNFα结合的ELISA基本上按照上述进行。结果在图33中描绘。对于TNF24和TNF27从60℃开始，对于TNF25，TNF26和TNF28从70℃开始，人TNFα结合下降。
人源化的单价纳米体(第二轮)
实施例41：鉴定TNFα和血清白蛋白特异性纳米体中的非-人氨基酸位置
图34(TNF1)，图35(TNF2)，图36(TNF3)和图37(ALB1)描述使用DP51，DP53，DP54和DP29序列的多序列比对(Clustal W 1.7)。突变的分子按照上述表达和纯化，产生表35 SEQID NOs：95-104的序列(分别针对TNFα和人血清白蛋白)。
人源化纳米体的特征性描述
实施例42：表达水平
表36描述计算的表达水平。以0.5-2.7mg/ml范围的产量实现表达。
实施例43：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳按照实施例8中所述进行。图38描绘SDS-Page凝胶。
实施例44：蛋白质印迹
蛋白质印迹分析按照实施例9中所述进行。图39描绘蛋白质印迹结果。
实施例45：生物-检测
所述检测按照实施例13中所述进行。
人源化纳米体的结果总结在表37中。包括野生型纳米体和第一轮人源化纳米体作为参照。
实施例46：Biacore
所述分析按照实施例12中所述进行。图40显示Biacore结果。
实施例47：温度稳定性
样品按照实施例15中所述进行分析。
OD280nm
检测280nm的OD，并且计算浓度。结果总结在表28中。
对于人源化的TNF1纳米体(TNF29-30)，在蛋白浓度中没有观察到显著减小。对于人源化TNF2(TNF31-32)和TNF3(TNF33)从80℃开始观察到蛋白浓度的减小。
蛋白质印迹
按照实施例15中所述分析样品中聚集物的存在。
ELISA
检测与人TNFα的结合的ELISA基本上按照实施例15中所述进行。
结果在图41中描绘。
对于野生型TNF1和人源化的TNF29和30；对于野生型TNF2和人源化的TNF31和TNF32；并且还对于野生型TNF3和人源化的TNF33，人TNFα结合相当。
比较实施例
在这一比较实施例中，将本发明的9个纳米体与WO 04/041862的分别叫作“VHH#1A”或“1A”，“VHH3E”或“3E”和“VHH#3G”或“3G”(在WO04/041862中，SEQ ID NOS：1，4和5)的3个纳米体进行比较。所用检测是使用WO 04/41862中提到的KYM-细胞的基于细胞的检测(例如，参见实施例1中第3))。结果在下表39中提到。可以看出，本发明的纳米体在这一检测中具有比3E的EC50值好18倍的EC50值，3E是按照WO04/41862表现最好的纳米体。
实施例48：产生三价双特异性人源化的纳米体TM
将三价双特异性纳米体格式化，并且首先克隆在大肠杆菌表达载体pAX054中，然后通过PCR拯救(rescued)，并且克隆在pPICZαA表达载体中。
大肠杆菌表达载体的描述
pAX54是pUC19的衍生物。它包含能够使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行可控的表达诱导的LacZ启动子。所述载体具有氨苄青霉素或羧苄青霉素的抗性基因。多克隆位点携带一些限制性位点，其中SfiI和BstEII通常用于克隆纳米体TM。信号肽是gen3前导序列，其将表达的纳米体TM转运到细胞周质。
巴斯德毕赤酵母表达载体的描述
pPICZαA包含允许在大肠杆菌中增殖的pUC-来源的复制起点。它包含Pichiapastoris AOX1(醇氧化酶1)基因的启动子。这一942bp的启动子区(i)允许目的基因的甲醇-诱导的、高水平的表达，并且(ii)在用5′AOX1启动子区内线性化的载体DNA转化Pichia后，将质粒结合靶向AOX1基因座。注意，pPICZα载体不包含酵母的复制起点，并且因此，如果在所述质粒和毕赤酵母基因组之间发生重组，可以只分离转化体。在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母宿主细胞中，所述载体指定对抗生素Zeocin的抗性。所述载体结合酿酒酵母α-交配因子的分泌信号，所述分泌信号允许大部分蛋白向培养基有效分泌。α-因子信号序列的起始ATG对应AOX1基因的天然起始ATG。多克隆位点拥有一些限制性位点，其中XhoI/EcoR1或XhoI/NotI典型地用于将纳米体TM编码序列与分泌信号融合。多克隆位点之后接AOX1转录终止区。关于这一表达载体的更多详情可以在Invitrogen网址(http:// www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/ppiczalpha_man.pdf)上找到。
格式化三价纳米体
使用在WPA-0012中显示的寡聚物组合，建立3个独立的PCR反应，以扩增N-端、中间和C-端纳米体TM亚基。N-端纳米体TM使用M13_rev/Rev_9GlySer_L108扩增；中间纳米体TM使用For_GlySer/Short和Rev_15BspEI_L108扩增；C-端纳米体TM使用For_BspEI/M13_扩增。准备PCR反应：1μl质粒DNA(50-100ng)，1.5μl正向引物(10μM→300nM)， 1.5μl反向引物(10μM→300nM)，1μl dNTPs(10mM→0.2mM)，5μl缓冲液(10x→1x)，0.75μl酶(3.5U/μl→2.6U/μl)和39.25μl H2O，总体积50μl。引物序列在表40中给出。PCR程序以在94℃2分钟起始。94℃30秒，50℃30秒和72℃1分钟的循环重复30次，并且接着在72℃10分钟。通过在2％琼脂糖凝胶上分离5μl PCR反应液而检验扩增。使用QIAquick PCR纯化试剂盒按照厂商的用法说明纯化PCR产物。使用一个柱子，并且用50μl EB缓冲液洗脱。N-端VHH片段通过将50μl DNA和2μlBamHI(10U/μl)在厂商推荐的适当的缓冲液中在37℃温育2小时而制备。随后，加入2μlSfiI(10U/μl)，并且将混合物在55℃温育2小时。中间VHH片段通过将50μl DNA和2μl BamHI(10U/μl)和2μl BspEI(10U/μl)在厂商推荐的适当的缓冲液中在37℃温育2小时而制备。C-端VHH片段通过将50μl DNA和2μl BspEI(10U/μl)在厂商推荐的适当的缓冲液中在37℃温育2小时而制备。随后，加入2μl BstEII(10U/μl)，并且将混合物在60℃温育1小时。将先前的消化反应物在2％琼脂凝胶上分离。将VHH条带(350-450bp)从凝胶上切下，并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒按照厂商的用法说明纯化DNA。使用一个柱子(每个柱最大400mg琼脂糖凝胶)，并且用50μl EB缓冲液洗脱结合的DNA。通过测定OD260而确定DNA浓度(1 OD单位＝50μg/ml)。准备终体积10μl的连接混合物，其包含100ng载体pAX54，12ng N-端VHH，12ng中间VHH片段，12ng C-端VHH丰余序列，1μl连接缓冲液和1μl连接酶(3U)，并且在室温温育2小时。使用2μl连接混合物转化大肠杆菌TG1。按照WPA-0010所述使用PCR分析克隆。对 阳性克隆进行序列分析。使用Qiaprep spinMiniprep试剂盒(Qiagen)按照厂商的用法说明和上文所述进行质粒制备。在VIB测序设备，Antwerp，Belgium进行测序。
扩增编码DNA
将克隆在pAX054大肠杆菌表达载体中的纳米体TM编码区使用适当的引物对通过PCR进行拯救。为了确保所述纳米体TM表达具有天然N-端，将所述编码区符合阅读框地克隆在分泌信号的Kex2切割位点。正向引物将所述分泌信号的C-端部分，直到Xho1识别位点，与所述纳米体TM编码 区融合。准备PCR反应：1μl质粒DNA(50-100ng)，1.5μl正向引物(10μM→300nM)，1.5μl反向引物(10μM→300nM)，1μl dNTPs(10mM→0.2mM)，5μl缓冲液(10x→1x)，0.75μl酶(3.5U/μl→2.6U/μl)和39.25μlH2O，总体积50μl。引物序列在表41中给出。PCR程序以在94℃2分钟起始。94℃30秒，50℃30秒和72℃2分钟的循环重复20次，并且接着在72℃10分钟。通过在2％琼脂糖凝胶上分离5μl PCR反应物而检验扩增。使用QIAquick PCR纯化试剂盒按照厂商的用法说明纯化PCR产物。使用一个柱子，并且用50μl EB缓冲液洗脱结合的DNA。
克隆策略
将编码NB的DNA片段以及pPICZαA表达载体用适当的限制酶(XhoI+NotI)消化。插入片段通过将50μl PCR产物与2μl XhoI(10U/μl)和2μlNotI(10U/μl)在厂商推荐的适当的缓冲液中在37℃温育3小时而获得。载体类似地获得，使限制酶的量适应质粒的量。纯化载体和NB编码片段，并且使用BioPhotometer(Eppendorf)定量DNA浓度。将所述片段和接纳载体以等摩尔比例使用1单位T4连接酶(Promega)在室温下连接30分钟或者在16℃连接过夜。将所述DNA(20-30ng)转化TG1细胞。使用3’AOX1R和5’AOX1 F引物通过PCR分析菌落。关于阳性克隆进行序列分析。将TNF30，TNF33和ALB8格式化成三价双特异性纳米体TM。9AA GlySer接头用作结构单元之间的间隔。
转化巴斯德毕赤酵母
为了分离质粒DNA，通过将所述克隆的单菌落接种在50ml LB+氨苄青霉素或羧苄青霉素(100μg/ml)+2％葡萄糖中并且在37℃培养过夜而起始预培养。使用Plasmid Midi试剂盒(Qiagen)按照厂商的用法说明制备质粒DNA。通过将30μg质粒DNA与6μl BstX1(10U/μl)按照厂商用法说明在适当缓冲液中在45℃温育3小时而将所述DNA线性化。将消化的DNA使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)按照厂商说明纯化。所述DNA使用EtOH沉淀按照标准步骤进行浓缩。将10μg线性化的DNA X-33电转化感受态细胞，并且允许细胞在包含Zeocin(100/250/500μg/ml)的选择 性YPD琼脂平板上生长48小时。X-33是野生型巴斯德毕赤酵母菌株；所述菌株本身以及所衍生的重组菌株包含天然AOX1基因，并且能够代谢甲醇(Mut+)。
通过在24-孔平板中将单菌落接种在1ml BGCM中，并且将它们在30℃120rpm生长48小时来筛选克隆的表达水平。离心细胞，并且向所述细胞中加入新鲜的BGCM，在30℃120rpm生长48小时。然后，加入MeOH至终浓度0.5％，并且细胞在30℃120rpm生长8小时，之后再次加入MeOH至终浓度0.5％。细胞在30℃ 120rpm生长过夜。离心细胞，并且收集上层清液，并且按照实施例10中所述在ELISA中分析。
实施例49：三价双特异性人源化纳米体TM的表达和纯化
在巴斯德毕赤酵母中生产
缓冲液、溶液和其它的组合物可以在Invitrogen网址(http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/ppiczalpha_man.pdf)上 找到。
通过将来自平板的单菌落接种在5ml YPD中而开始预培养。培养物在180rpm和30℃生长过夜。第二天，将预培养物稀释到50ml YPD中，并且在180rpm和30℃生长过夜。生产培养物通过将预培养物接种至最终OD600nm＝0.04-0.08而开始。培养物在BGCM中在30℃180rpm生长24小时，并且在4,500rpm离心30分钟。将细胞以初始体积的1/3重悬在BGCM培养基中，最终OD600nm＝15-20。将细胞在规律性时间点用MeOH诱导，典型地3次/天，从不超过1％MeOH浓度。诱导50个小时后收集上层清液。
在巴斯德毕赤酵母中表达的纳米体的纯化
培养物上清在.22μm过滤膜Micro过滤器(Hydrosart，Sartorius)上过滤。使用在10kDa超滤膜(HydroSart，Sartorius)上的渗滤浓缩样品，并且浓缩至0.5-1L。将纳米体TM使用蛋白质A亲和层析(MabSelect Xtra，GE Healthcare)进行纯化，其使用PBS作为运行缓冲液，而甘氨酸[100mM pH＝2.5]洗脱。使用1.5M Tris pH＝8.8中和样品。纳米体TM在阴离子交换层析(Source 30Q，GE Healthcare)中进一步处理。将样品用10mM哌嗪pH＝10.2稀释10-倍，并且用1M NaOH调整至pH＝10.2，并且用MilliQ水调整至电导率＜2mS/cm。
将纳米体在大小排阻层析(Superdex 75pg，Hiload XK26/60，GEHealthcare)中处理，并且通过阴离子交换层析(Source 30Q，GE Healthcare)通过流过5ml柱而去除LPS，所述柱用1M NaOH净化，并且在Dulbecco PBS中平衡。
为了确定纯度，蛋白样品按照实施例8中所述在15％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上进行分析。所述凝胶使用SilverQuestTM按照厂商(Invitrogen)所述的通用步骤进行处理。备选地，凝胶使用如实施例8和9中所述的考马斯亮蓝或在蛋白质印迹中进行分析。结果在图42中给出。
实施例50：三价双特异性人源化纳米体TM的特征性描述
TNF60由363个氨基酸组成。所述蛋白具有38,441Da的分子量。pI为8.71。280nm的消光系数是1.736。
质谱
蛋白质量按照标准步骤在ESI-MS中确定。TNF60的理论质量是38,441Da。所述蛋白具有2个S-S桥，这将在ESI-MS中导致38,435Da的质量。对于来源于3种不同批次的TNF60，实验确定的质量在38,433Da-38,435Da范围，与理论质量最大差别0.005％。
N-端测序
N-端测序通过Edman降解按照标准步骤进行。N-端测序表明，前7个氨基酸的蛋白序列如下：EVQLVES。这与理论蛋白序列一致，其显示正确的N-端处理。
分析大小
样品(100ug)在高分辨Superdex75柱上分析，以描述不同批次的纳米体TM的性质。纳米体TM的大小排阻层析典型地产生对称峰，在Superdex75上的保留时间为11.5min。典型地记录在280，254和214nm的吸收。214nm检测允许更高的检测灵敏度。在PBS中的分析大小提供对称峰。没有观察到污染物。对于3种不同批次观察到的保留时间为11,5-11,55min。代表性的图表在图43中显示。
实施例51：ELISA中TNF60与人TNFα的结合
TNF60的官能性，即，与人TNFα的结合，按照实施例10所述在ELISA中进行分析。结果总结在图44中，并且清楚地显示2批次TNF60与人TNFα的剂量-依赖性的和饱和的结合。
实施例52：在基于细胞的检测中的官能性
在实施例13所述的基于细胞的检测中分析中和TNFα的细胞毒性活性的效力。结果总结在表42中和图45和46中。
数据表明TNF60具有在Enbrel/依那西普范围的效力，和比Humira/阿达木单抗和Remicade/英夫利昔单抗10倍更好的效力。
实施例53：TNF60与血清白蛋白的结合
与人和恒河猴血清白蛋白的结合如实施例12中所述在Biacore中进行分析。KD，kon和koff值在表43中描述。将TNF60与TNF24比较，TNF24是具有野生型结构元件的三价双特异性亲本纳米体TM。
TNF60对人和恒河猴血清白蛋白的亲和力相似。与对于TNF24观察到的亲和力相比较，亲和力低2倍，所述TNF24是TNF60的野生型类似物。对于这两种分子，Kon相同，而koff对于TNF60高2倍。
实施例54：三价双特异性人源化的纳米体在小鼠中的药物代谢动力学和免疫原性分析
动物
DBA1或BALBc小鼠在红外灯下温暖，并且在尾部静脉内注射200μl纳米体TM(每只小鼠100μg)。通过在尾部切小口并将血液收集到微管中，而在不同的时间点获得样品。典型地，血液在t＝15分钟，2小时，4小时，6小时，1天，2天，3天，4天，7天，14天取样。血清按照标准步骤制备。
确定小鼠血清中的纳米体TM浓度
将微量滴定平板(NUNC，Maxisorb)用2μg/ml neutravidin在4℃包被过夜。平板用PBS/0.05％吐温-20洗涤5次，并且在室温用PBS/1％酪蛋白封闭2小时。将生物素酰化的人TNFα(1/2000在PBS/0.2％酪蛋白中；400ng/ml)涂覆到孔上，并且在室温温育1小时。应用标准参照纳米体TM，从浓度5μg/ml起始，并且使用在包含1％小鼠血浆的PBS中的5倍稀释。允许纳米体TM在室温结合2小时。将所述平板洗涤5次，并且在室温应用2000倍稀释的兔多克隆抗-纳米体(R23)1小时。洗涤平板之后，在室温用3000倍稀释的山羊-多克隆-抗-兔HRP(DAKO)检测结合1小时，并且用ABTS/H2O2染色。检测OD405nm。
这一第一次ELISA用来确定标准参照的线性范围。在第二次ELISA中，所述标准参照使用在这一线性范围的浓度，并且典型地使用2倍稀释液。在这种第二次ELISA中，将血清检测样品稀释100倍，并且还在1％小鼠血浆中制备5倍稀释液，以确定其中所述血清样品提供在标准曲线的线性范围内的读出数的稀释液。在第三次ELISA中，将血清样品以在所述第二次ELISA中确定的适当浓度进行稀释，并且使用2倍稀释液，以精确确定所述血清样品中的纳米体TM浓度。
进行实验，确定TNF60在小鼠(n＝3)中的药物代谢动力学曲线。在施用后15分钟达到103,84±31μg/ml的Cmax值。半衰期(t1/2β)确定为1.9天，与小鼠血清白蛋白的半衰期相似，表明TNF60适应血清白蛋白的半衰期。数据在图47中描绘。
确定小鼠中的抗-纳米体抗体
纳米体TM以在PBS中5μg/ml在4℃包被过夜。平板用PBS/0.05％吐温-20洗涤5次，并且在室温用PBS/1％酪蛋白封闭2小时。血清样品稀 释100倍，并且涂覆到孔上，在室温温育1小时。检测使用1000倍稀释的多克隆兔抗-小鼠-HRP(DAKO，P0260)和使用ABTS作为底物而进行。
血清样品稀释50倍，并且分析小鼠抗-TNF60抗体的存在。对于TNF60证明缺乏免疫原性。数据在图48中描绘。
实施例55：产生二价长半衰期人源化的纳米体TM
巴斯德毕赤酵母表达载体的描述
参见实施例48
格式化二价纳米体TM
使用在WPA-0011中显示的步骤，建立两个独立的PCR反应，以扩增N-端和C-端纳米体TM亚基。对于扩增所述N-端纳米体TM，使用PiForLong和Rev_30GlySer_L108作为引物组合；对于扩增所述C-端纳米体TM，使用For_GlySer和PiRevCys1hum或者备选地使用For_GlySer和PiRevCys2hum，引入格式化所需要的限制性位点和C-端修饰所需要的游离半胱氨酸残基。
准备PCR反应：1μl质粒DNA(50-100ng)，1.5μl正向引物(10μM→300nM)，1.5μl反向引物(10μM→300nM)，1μl dNTPs(10mM→0.2mM)，5μl缓冲液(10x→1x)，0.75μl酶(3.5U/μl→2.6U/μl)和39.25μlH2O，总体积50μl。引物序列在表44中给出。PCR程序以在94℃2分钟起始。94℃30秒，50℃30秒和72℃1分钟的循环重复30次，并且接着在72℃10分钟。通过在2％琼脂糖凝胶上分离5μl PCR反应物而检验扩增。使用QIAquick PCR纯化试剂盒按照厂商的用法说明纯化PCR产物。使用一个柱子，并且用50μl EB缓冲液洗脱。N-端VHH片段通过将50μlDNA和2μl BamHI(10U/μl)以及2μl XhoI(10U/μl)在厂商推荐的适当的缓冲液中在37℃温育1.5小时而制备。C-端VHH片段通过将50μl DNA和2μl BamHI(10U/μl)以及2μl EcoRI(10U/μl)在厂商推荐的适当的缓冲液中在37℃温育1小时而制备。将先前的消化反应物在2％琼脂糖凝胶上分离。将所述VHH条带(350-450bp)从凝胶上切下，并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒按照厂商的用法说明纯化DNA。使用一个柱子(每个柱 最大400mg琼脂糖凝胶)，并且用50μl EB缓冲液洗脱结合的DNA。通过测定OD260而确定DNA浓度(1 OD单位＝50μg/ml)。准备终体积10μl的连接混合物，其包含100ng载体pPICZαA，其被XhoI/EcoRI线性化，30ng N-端VHH，30ng C-端VHH丰余序列，1μl连接缓冲液和1μl连接酶(3U)，并且在室温温育1小时。使用2μl连接混合物转化大肠杆菌TG1。按照WPA-0010所述使用PCR分析克隆，但是使用AOXIFor/AOXIRev引物组合。对阳性克隆进行序列分析。使用Qiaprep spin Miniprep试剂盒(Qiagen)按照厂商的用法说明和上文所述进行质粒制备。在VIB测序设备，Antwerp，Belgium进行测序。
转化巴斯德毕赤酵母
参见实施例48。
将TNF30格式化成二价纳米体TM。30AA GlySer接头用作两个结构单元之间的间隔。为了允许C-端位点-特异性修饰，引入游离的半胱氨酸，作为纳米体TM的最后AA，或者具有由GlyGlyGlyCys(SEQ ID NO：471)组成的额外的间隔。
实施例56：二价长半衰期人源化的纳米体TM的表达和纯化
在巴斯德毕赤酵母中生产
参见实施例49。
纯化二价纳米体
培养基通过离心和0.22μm过滤而不含细胞。无菌培养基保存在4℃直到进一步处理。低分子量的污染物通过在10kDa超滤(UF)膜(HydroSart Sartocon Slice Cassette，Sartorius)上超滤而减少，如下述：将4升培养基浓缩至0.5-1升，然后用5升PBS稀释，并且再次浓缩至0.5升。这一操作进行两次。
UF的滞留物通过尼龙47mm膜0,45μm(Alltech #2024)过滤。
在下一步骤中，通过蛋白质A亲和纯化(使用MabSelectXtraTM，GE Healthcare)而从浓缩的培养基捕获二价纳米体TM。柱[35X100mm]在PBS 中平衡，并且在样品应用后用PBS彻底清洗。使用甘氨酸[100mM，pH＝2.5]洗脱TNF56。
MabSelectXtraTM的洗脱级分用Tris[1,5M，pH 8,8]中和，并且保存在4℃。将TNF56浓缩，并且通过AEX(A＝10mM哌嗪，pH 10,8和B＝1MNaCl在50mM Tris中，pH 7,5)使用Source 30Q(GE Healthcare)进行纯化。为了这一目的，纳米体TM级分用A缓冲液(10mM哌嗪，pH 10,8)稀释至5mS/cm电导率，并且将pH调整到10,8。在将样品上样到柱上之前，将柱[25X100mm]在A缓冲液中平衡。TNF56用5个柱体积(CV)梯度洗脱。将收集的级分的pH用1MTris pH＝7.8调整到7.8。
在巴斯德毕赤酵母中表达的二价纳米体TM的聚乙二醇化
还原C-端半胱氨酸
将二硫苏糖醇(Dithiotreitol)(DTT，Aldrich Cat 15，046-0)加入到中和的级分中，以减少在纳米体TM的羧基端半胱氨酸之间形成的潜在的二硫桥(通常约20％)。发现终浓度10mM的DTT和在4℃温育过夜是最优化的。还原通过分析型大小排阻层析(SEC)进行评估。因此，将25μl还原的纳米体TM加入到75μl D-PBS中，并且注射到在Dulbecco’s PBS(D-PBS，GibcoTM REF 14190-094)中平衡的Sup75 10/300 GL柱上。
未还原的纳米体TM和DTT通过在D-PBS平衡的Hiload 26/60Superdex75制备级柱上的制备型SEC而去除。
还原的纳米体TM的浓度通过检测280nm的吸收而测定。使用Uvikon943 DoubleBeam UV/VIS分光光度计(方法：参见SOP ABL-0038)。吸收在波长扫描245-330nm测定。使用由Quartz 元件制成的两个精密(Precision)元件(Hellma型号：104-QS；光径：10mm)。首先，通过放置两个装满900μl D-PBS的元件而在280nm测定空白的吸收。样品通过将100μl样品加入到第一个元件中而稀释(1/10)。样品的吸收在280nm检测。
浓度用下式计算：
对于TNF55：ε＝1,85
对于TNF56：ε＝1,83.
聚乙二醇化
为了将纳米体TM聚乙二醇化，将5X摩尔过量的新鲜配制的1mMPEG40溶液添加到还原的纳米体TM溶液中。(NEKTARTM转化治疗法的MPEG2-MAL-40K(2D3YOTO1)Mw＝40,000g/mol；NEKTARTM转化治疗法的MPEG2-MAL-60K(2D3YOVO1)Mw＝60,000g/mol)。
纳米体TM-PEG混合物轻微搅拌在室温(RT)温育1小时，然后转移到4℃。PEG化通过分析型SEC评估。因此，将25μl纳米体TM加到75μl D-PBS中，并且注射到在D-PBS中平衡的Sup75HR 10/300柱上。聚乙二醇化的纳米体TM在所述柱的排斥体积范围内(＞75kDa)洗脱。
PEG化和未PEG化的纳米体TM通过阳离子交换层析(CEX，使用Source30S，GEHealthcare；A缓冲液＝25mM柠檬酸pH＝4和B＝1M NaCl在PBS中)分离。样品稀释至＜5mS/cm的电导率，并且将pH调整到4,0。将柱[25X100mm]平衡，并且在样品应用之后用A-缓冲液彻底清洗。聚乙二醇化的纳米体TM用3CV梯度洗脱。收集的纳米体TM在D-PBS平衡的Hiload26/60 Superdex 75制备级柱上通过SEC缓冲(buffer)交换到D-PBS中。
最后，通过流经阴离子交换柱(Source30Q)而将所述纳米体TM制成没有LPS的。柱(10x100mm)在NaOH[1M]中净化过夜，并且之后在没有内毒素的D-PBS中平衡。
生物素酰化
为了将纳米体TM生物素酰化，将来自10mM储液的5X摩尔过量的生物素(Maleimide-PO2-生物素，Pierce #21901)加到所述还原的纳米体TM中(见5.5.1)。将生物素-纳米体TM混合物轻微搅拌在室温温育1小时，然后在4℃保存。
生物素酰化的纳米体TM的纯度通过分析型SEC控制。因此，将25μl生物素酰化的纳米体TM加到75μl D-PBS中，并且注射到在D-PBS中平衡的Sup75HR 10/300柱上。从所获得的色谱可以推出，纳米体TM-生物素 不需要进一步纯化：没有检测到通过自由巯基(sulfidrils)氧化的纳米体 TM二聚化。通过流经脱盐柱葡聚糖凝胶G25精细(fine)(90ml)柱将缓冲液变换成D-PBS。
最后，通过流经阴离子交换柱(Source30Q，GE Healthcare)而将所述纳米体TM-生物素制成没有LPS的。柱(1x10cm)在1M NaOH中净化过夜，然后在D-PBS中平衡。
为了确定纯度，蛋白样品按照实施例8和49所述在15％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上分析。结果在图49和50中描绘。
实施例57：二价长半衰期人源化的纳米TM的特征性描述
生化特征性描述
TNF55由260个氨基酸组成。所述蛋白具有27,106Da的分子量。pI为8.67。280nm的消光系数是1.850。
TNF56由264个氨基酸组成。所述蛋白具有27,365Da的分子量。pI为8.67。280nm的消光系数是1.830。
质谱
TNF55的理论质量是27,106Da。TNF55-生物素蛋白具有2个S-S桥和一个生物素修饰，其在ESI-MS中导致27,627Da的质量。对于TNF55-生物素实验确定的质量为27,627Da。
TNF56的理论质量是27,365Da。TNF55-生物素蛋白具有2个S-S桥和一个生物素修饰，其在ESI-MS中导致27,886Da的质量。对于TNF55-生物素实验确定的质量为27,886Da。
N-端测序
TNF56-PEG40的N-端测序表明，前7个氨基酸的蛋白序列如下：EVQLVES。这与理论蛋白序列一致，其显示正确的N-端处理。
分析大小
TNF56-PEG40在PBS中的分析大小提供对称峰。没有观察到污染物。在Superdex HR75上的保留时间为8.5ml，并且在Superdex HR 200上为10.32ml。代表性的图表在图51和52中显示。
实施例58：在基于细胞的检测中的官能性
在基于细胞的检测中分析中和TNFα的细胞毒性活性的效力。在摩尔基础上在不同浓度的纳米体TM以及商购的依那西普，Humira和英夫利昔单抗检验效力。观察到的EC50越高，化合物中和TNFα的活性越低。
结果总结在表45中和图53和54中。
数据表明，当与单价纳米体TM TNF1相比较时，对于二价纳米体TM效力的增加。TNF55衍生物的效力与TNF56衍生物相似，其在依那西普范围内，并且比Humira和英夫利昔单抗好10倍。
实施例59：二价长半衰期人源化的纳米体在小鼠中的药物代谢动力学和免疫原性分析
参见实施例54。
进行实验，以检验聚乙二醇化的纳米体TM在小鼠中的半衰期。二价TNF56-PEG40的半衰期与TNF56-PEG60的半衰期比较。两种纳米体TM具有相当的半衰期，～2天。结果在图55中描绘。
另外，研究聚乙二醇化二价3E-3E的半衰期。在静脉内施用100μg纳米体TM后，比较3E-3E-PEG20的半衰期和3E-3E-PEG40的半衰期。3E-3E-PEG20具有17小时的半衰期，而3E-3E-PEG40具有21天的半衰期，与3E-3E-MSA21的半衰期相当。结果在图56中描绘。
血清样品稀释100倍，并且分析小鼠抗-TNF56-PEG40或抗-TNF56-PEG60抗体的存在。对于这两种分子证明缺少免疫原性。数据在图57中描绘。
实施例60：抗-TNF-α纳米体TNF60(TNF60)在预防慢性多发性关节炎中的功效
携带并且表达3′-修饰的人肿瘤坏死因子(hTNF-α，cachectin)转基因的转基因小鼠品系用作研究TNF60(TNF60)在预防关节炎的发展中的功效的模型(EMBO J.10，4025-4031)。已经显示这些小鼠在4-7周龄以100％的发生率发展慢性多发性关节炎。
从第三周龄，将转基因小鼠的幼仔分成8只动物的组。在开始研究之前，对每一组计算平均体重。从那时起，在整个研究过程中，对于每一组动物体重每周记录一次。
为了检测TNF60在预防慢性多发性关节炎中的功效，对于特定组的每一只动物给予腹膜内注射，每周两次，按照下述方案：
-组1(阴性对照)：磷酸盐缓冲液(PBS)(配制缓冲液)
-组2(纳米体治疗)：TNF60终剂量30mg/kg
-组3(纳米体治疗)：TNF60终剂量10mg/kg
-组4(纳米体治疗)：TNF60终剂量3mg/kg
-组5(第一阳性对照)：依那西普终剂量30mg/kg
-组6(第一阳性对照)：依那西普终剂量10mg/kg
-组7(第二阳性对照)：英夫利昔单抗终剂量30mg/kg
-组8(第二阳性对照)：英夫利昔单抗终剂量10mg/kg
-组9(第二阳性对照)：英夫利昔单抗终剂量3mg/kg
对于每一组，记录注射日期和注射体积。
注射持续7周。在这一期间，通过观察每只动物的关节形态中的肉眼可见的变化而记录临床得分。
在10周龄，将所有小鼠处死，并且收集血清和关节。血清保存在-70℃，而踝关节保存在福尔马林中。
对于所选的组，将踝关节包埋在石蜡中并且切片。随后踝关节切片用于疾病进展的组织病理学评估。
结果在图58中描述。
实施例61：抗-TNF-α纳米体TNF60(TNF60)在治疗性治疗慢性多发性关节炎中的功效
携带并且表达3′-修饰的人肿瘤坏死因子(hTNF-α，cachectin)转基因的 转基因小鼠品系用作研究TNF60(TNF60)在治疗性治疗关节炎中的功效的模型(EMBO J.10，4025-4031)。已经显示这些小鼠在4-7周龄以100％的发生率发展慢性多发性关节炎。
从第六周龄，将转基因小鼠的幼仔分成8只动物的组。在开始研究之前，对每一组计算平均体重。从那时起，在整个研究过程中，对于每一组动物体重每周记录一次
为了检测TNF60在治疗性治疗慢性多发性关节炎中的功效，对于特定组的每一只动物给予腹膜内注射，每周两次，按照下述方案：
-组1(阴性对照)：磷酸盐缓冲液(PBS)(配制缓冲液)
-组2(纳米体治疗)：TNF60终剂量30mg/kg
-组3(纳米体治疗)：TNF60终剂量10mg/kg
-组4(第一阳性对照)：依那西普终剂量30mg/kg
-组5(第二阳性对照)：英夫利昔单抗终剂量30mg/kg
对于每一组，记录注射日期和注射体积。
注射持续7周。在这一期间，通过观察每只动物的关节形态中的肉眼可见的变化而记录临床得分。
在13周龄，将所有小鼠处死，并且收集血清和关节。血清保存在-70℃，而踝关节保存在福尔马林中。
对于所选的组，将踝关节包埋在石蜡中并且切片。随后踝关节切片用于疾病进展的组织病理学评估。
结果在图59中描述。
实施例62：格式化对抗-TNF-α纳米体在预防慢性多发性关节炎中的功效的影响
携带并且表达3′-修饰的人肿瘤坏死因子(hTNF-α，cachectin)转基因的转基因小鼠品系用作研究以不同方法格式化的抗-TNF-α纳米体在预防慢性多发性关节炎中的功效的模型(EMBO J.10，4025-4031)。已经显示这些小鼠在4-7周龄以100％的发生率发展慢性多发性关节炎。
从第三周龄，将转基因小鼠的幼仔分成8只动物的组。在开始研究之前，对每一组计算平均体重。从那时起，在整个研究过程中，对于每一组 动物体重每周记录一次。
为了研究不同形式的抗-TNF-α纳米体在预防慢性多发性关节炎中的功效，对于特定组的每一只动物给予腹膜内注射，每周两次，按照下述方案：
-组1(阴性对照)：磷酸盐缓冲液(PBS)(配制缓冲液)
-组2(纳米体形式1)：TNF60终剂量10mg/kg
-组3(纳米体形式1)：TNF60终剂量2.5mg/kg
-组4(纳米体形式1)：TNF60终剂量1mg/kg
-组5(纳米体形式2)：TNF56-PEG40终剂量10mg/kg
-组6(纳米体形式2)：TNF56-PEG40终剂量1.8mg/kg
-组7(纳米体形式2)：TNF56-PEG40终剂量0.7mg/kg
-组8(纳米体形式3)：TNF56-biot终剂量1.8mg/kg
-组9(纳米体形式4)：TNF30终剂量1mg/kg
-组10(纳米体形式5)：TNF1终剂量1mg/kg
-组11(第一阳性对照)：依那西普终剂量10mg/kg
-组12(第二阳性对照)：英夫利昔单抗终剂量10mg/kg
对于每一组，记录注射日期和注射体积。
注射持续7周。在这一期间，通过观察每只动物的关节形态中的肉眼可见的变化而记录临床得分。
在10周龄，将所有小鼠处死，并且收集血清和关节。血清保存在-70℃，而踝关节保存在福尔马林中。
对于所选的组，将踝关节包埋在石蜡中并且切片。随后踝关节切片用于疾病进展的组织病理学评估。
结果在图60中描述。
实施例63：抗-TNF-α纳米体TNF60(TNF60)和TNF56-PEG40在恒河猴中的药物代谢动力学研究
捕获-饲养的恒河猴(Macaca mulatta)用来确定TNF60和TNF56-PEG40的药物代谢动力学曲线。
16只动物用于这一研究(8只雄性和8只雌性)，并且分成4组(每 组2只雄性和2只雌性)。所有动物称重大约5kg，并且至少在使用之前6周没有疾病。 Privegetarisch V3994作为食物。每只猴子提供60g/kg b.w.。去除残渣。在规律的时间间隔(一年至少2次)基于EPA/USA通过LUFA-ITL分析食物的污染物。提供自来水作为随意食水(adlibitum.)。将每一治疗组的动物笼养在猴群内的一批几个相邻的笼子里。猴子单独饲养在90cmx82cmx96cm大小的V2A钢铁笼内。室温保持在23℃±3℃(最大范围)，并且相对湿度在60％±20％(最大范围)。例如，在清洁程序中引起的最大范围的偏离在SOPs中处理。房间光照和黑暗分别12个小时。
两组输注TNF60，两组输注TNF56-PEG40。使用留置导管和TSE输注泵(参见下文)将TNF60和TNF56-PEG40(溶解在PBS中)静脉内输注到右臂或左臂的头静脉，以2mg/kg的固定剂量给予。
进行4次单独的施用，由至少14天的淘汰期(wash-out)分开。在最后施用后，继续期至少8周。所述4组中的2组用与甲氨喋呤(MTX)(溶解在PBS中)结合的TNF60或TNF56-PEG40治疗。组2用TNF 60和MTX治疗；组4用TNF56-PEG40和MTX治疗。MTX以0.2mg/kg每周静脉内给药。在给药那天，MTX在施用之前大约30分钟给药。给药在第一次纳米体施用时开始，并且将持续到第四次给药后的整个8周的淘汰期。存在14次单独的MTX施用，由从第一次测试项目施用开始的至少一周的淘汰期分开。
实施例64：来源于滑膜的成纤维细胞研究
在这一研究中，评估抗-TNF生物制剂，ALX0071和依那西普减少来源于RA-滑膜的成纤维细胞的TNFα-诱导的IL-6生产的能力。
分离滑膜成纤维细胞
将来自同意的RA患者的滑膜关节组织在4℃保存在具有抗生素的基于DMEM-的培养基中，直到关节置换手术后96小时。滑膜细胞通过在37℃胶原酶消化2小时而从解剖的滑膜分离。然后，通过系列离心和重悬步骤洗涤得到的细胞混悬液，然后，将得到的细胞在37℃培养在补充 10％ FCS(v/v)的基于DMEM的培养基中。获得的成纤维细胞以第二次或第三次传代而用于后续实验。将来自4个供体的细胞用于单独的实验。将成纤维细胞接种在96孔平底聚苯乙烯平板上，每孔1.5×104个细胞，在终体积250μL的补充10％ FCS(v/v)的基于DMEM的培养基中，并且培养过夜。
滑膜成纤维细胞的刺激
然后将细胞在单独以50ng/mL补充TNFα(3nM(R&D Systems210-TA/CF)或在增加剂量的ALX0071(0.575-1920ng/mL；0.015-50nM)或依那西普(Wyeth Labs；3.75-11250ng/mL；0.025-75nM)存在下的基于DMEM的培养基中培养72小时。每一孔的终体积是250μL，并且每一评估进行三次。72小时后，去除上层清液培养基，并且在用IL-6ELISA(R&DSystems)分析之前保存在-40℃。确定对TNFα-诱导的IL-6生产的抑制作用，并且计算对于ALX0071和依那西普的IC50值。
结果总结
ALX10071和依那西普都剂量-依赖性地减少来自于所有4个供体的RA滑膜来源的成纤维细胞的TNFα-诱导的IL-6生产。在这些检测条件下，在所述两种试剂之间存在相似的功效。
实施例65：鼠气囊研究
在这一研究中，评估抗-TNF生物制剂，ALX0071和依那西普减少TNFα-诱导的细胞向鼠气囊侵入的能力。
产生气囊
气囊通过皮下(s.c.)注射2.5mL无菌空气到麻醉雄性C57Bl/6/J小鼠(25-30g，Harlan)的背面而形成。3天后，通过注射2.5mL无菌空气而使所述囊再膨胀起来。
TNFα刺激
在最初产生气囊后6天，将动物麻醉，并且所述囊注射1ml含有0.1 μg重组人TNFα(R & D Systems，210-TA-050/CF)的0.5％羧甲基纤维素(CMC)赋形剂。在另外3组动物中，在注射TNFα前19小时，皮下注射ALX0071(0.0625，0.125和0.25mg/kg)。第二个三组动物在注射TNFα前立即注射(皮下)依那西普(Wyeth Labs，0.125，0.25和0.5mg/kg)。
TNFα注射后24小时，将小鼠用增加浓度的CO2杀死(culled)。囊用2ml冰冷的没有内毒素的含有5IU/ml肝素的无菌PBS灌洗。记录体积，并且分离0.5ml等分试样，用于在Sysmex XT-Vet细胞计数器上计数总白血细胞(WBC)群体。每ml吸出的灌洗液计算对于每一组总WBC计数的平均值和平均值的标准误差(SEM)。统计学分析通过具有Kruskal-Wallis后检验(Kruskal-Wallis post-test)的ANOVA关于未转换的数据进行。
结果总结
ALX10071和依那西普都减弱TNFα-诱导的WBC向气囊的侵入(表)。然而，这一减弱在0.125(P＜0.01)和0.25mg/kg(P＜0.05)ALX0071剂量组都达到统计学显著性，而对于任何依那西普剂量组没有观察到统计学显著性。
表8
表9
表10
| 纳米体 | 种系序列 | #AA差异/总#AA | ％AA相同性 |
| ALB1 | DP51/DP53 | 13/87 | 85.1 |
| ALB2 | DP54 | 26/87 | 70.2 |
| TNF1 | DP51/DP53 | 6/87 | 93.2 |
| TNF2 | DP54 | 16/87 | 81.7 |
| TNF3 | DP29 | 18/87 | 79.4 |
表11
| 纳米体 | 诱导时间 | 产量(mg/L) |
| ALB1 | 短/37℃ | 18 |
| ALB2 | 短/37℃ | 4 |
| TNF1 | 短/37℃ | 8.3 |
| TNF2 | 短/37℃ | 5 |
| TNF3 | 短/37℃ | 0.8 |
表12
表13
表14
表15
表16
检测：L929s+Act D(5000c/w)
TNF：人TNFα@0.5ng/ml
检测：L929s+Act D(5000c/w)
TNF：恒河猴TNFα@0.5ng/ml
表17
| ％ | 未处理的 | 室温 | 37℃ | 50℃ | 60℃ | 70℃ | 80℃ | 90℃ |
| TNF1 | 100 | 98 | 98 | 98 | 98 | 95 | 92 | 90 |
| TNF2 | 100 | 99 | 100 | 99 | 97 | 96 | 63 | 50 |
| TNF3 | 100 | 96 | 97 | 98 | 96 | 94 | 75 | 70 |
| ALB1 | 100 | 101 | 102 | 101 | 100 | 64 | 94 | 90 |
| ALB2 | 100 | 100 | 102 | 100 | 100 | 28 | 8 | 17 |
表18
表19
表20
| ID | 形式 | 接头 |
| TNF4 | TNF1-TNF1 | 9AA GlySer |
| TNF5 | TNF2-TNF2 | 9AA GlySer |
| TNF6 | TNF3-TNF3 | 9AA GlySer |
| TNF7 | TNF1-TNF1 | 30AA GlySer |
| TNF8 | TNF2-TNF2 | 30AA GlySer |
| TNF9 | TNF3-TNF3 | 30AA GlySer |
表21
| 纳米体TM | 诱导时间 | 产量(mg/L) |
| TNF4 | 过夜/28℃ | 3.2 |
| TNF5 | 短/37℃ | 5.5 |
| TNF6 | 短/37℃ | 1.19 |
| TNF7 | 过夜/28℃ | 2.7 |
| TNF8 | 短/37℃ | 6.6 |
| TNF9 | 过夜/28℃ | 1.3 |
表22
| 50％抑制(ng/ml) | |
| ID | 人TNFα |
| TNF4 | 13 |
| TNF5 | 6.3 |
| TNF6 | 30 |
| TNF7 | 16 |
| TNF8 | 23 |
| TNF9 | 18 |
表23
检测：L929s+Act D(5000c/w)
TNF：人TNFa@0.5ng/ml
检测：L929s+ActD(5000c/w)
TNF：恒河猴 TNFa @0.5ng/ml
表24
| ％ | 未处理的 | 室温 | 37℃ | 50℃ | 60℃ | 70℃ | 80℃ | 90℃ |
| TNF4 | 100 | 99 | 99 | 99 | 98 | 55 | 34 | 17 |
| TNF5 | 100 | 99 | 101 | 99 | 98 | 92 | 26 | 22 |
| TNF6 | 100 | 103 | 104 | 103 | 105 | 99 | 7 | 7 |
| TNF7 | 100 | 100 | 100 | 98 | 96 | 66 | 33 | 40 |
| TNF8 | 100 | 99 | 100 | 99 | 100 | 89 | 11 | 8 |
| TNF9 | 100 | 101 | 101 | 101 | 101 | 99 | 17 | 18 |
表25
表26
| 纳米体 | 诱导时间 | 产量(mg/L) |
| TNF13 | 过夜/28℃ | 8.8 |
| TNF14 | 过夜/28℃ | 7 |
| TNF15 | 短/37℃ | 7.6 |
| TNF16 | 短/37℃ | 8.7 |
| TNF17 | 短/37℃ | 7.2 |
| TNF18 | 短/37℃ | 4.8 |
| TNF19 | 短/37℃ | 8 |
| TNF20 | 过夜/28℃ | 3.5 |
| TNF21 | 过夜/28℃ | 7.5 |
| TNF22 | 过夜/28℃ | 6 |
| TNF23 | 过夜/28℃ | 2.8 |
| ALB3 | 过夜/28℃ | 11.8 |
| ALB4 | 过夜/28℃ | 9 |
| ALB5 | 过夜/28℃ | 11.7 |
表27
检测：L929s+Act D(5000c/w)
TNF：人TNFa@0.5ng/ml
表28
| ％ | 未处理的 | 室温 | 37C | 50C | 60C | 70C | 80C | 90C |
| TNF13 | 100 | 104 | 99 | 98 | 99 | 84 | 93 | 93 |
| TNF14 | 100 | 98 | 101 | 95 | 99 | 96 | 99 | 90 |
| TNF15 | 100 | 100 | 91 | 99 | 95 | 90 | 59 | 46 |
| TNF16 | 100 | 97 | 102 | 101 | 94 | 101 | 58 | 48 |
| TNF17 | 100 | 102 | 98 | 100 | 90 | 90 | 69 | 59 |
| TNF18 | 100 | 100 | 101 | 97 | 91 | 93 | 63 | 50 |
| TNF19 | 100 | 102 | 111 | 98 | 92 | 91 | 60 | 49 |
| TNF20 | 100 | 94 | 93 | 93 | 93 | 92 | 85 | 67 |
| TNF21 | 100 | 98 | 99 | 101 | 98 | 96 | 36 | 40 |
| TNF22 | 100 | 102 | 101 | 105 | 99 | 93 | 25 | 31 |
| TNF23 | 100 | 98 | 97 | 99 | 97 | 98 | 87 | 55 |
| ALB3 | 100 | 100 | 99 | 98 | 25 | 18 | 60 | 62 |
| ALB4 | 100 | 100 | 100 | 100 | 99 | 29 | 61 | 55 |
| ALB5 | 100 | 100 | 100 | 99 | 94 | 32 | 61 | 48 |
表29
表30
| ID | 形式 |
| TNF24 | TNF1-9GS-ALB1-9GS-TNF1 |
| TNF25 | TNF2-9GS-TNF2-9GS-ALB1 |
| TNF26 | TNF3-9GS-ALB1-9GS-TNF3 |
| TNF27 | TNF1-30GS-TNF1-9GS-ALB1 |
| TNF28 | TNF3-30GS-TNF3-9GS-ALB1 |
表31
| 纳米体 | 诱导时间 | 产量(mg/L) |
| TNF24 | ON/28℃ | 1.7 |
| TNF25 | 短/37℃ | 0.445 |
| TNF26 | 短/37℃ | 0.167 |
| TNF27 | ON/28℃ | 2.2 |
| TNF28 | 短/37℃ | 1 |
表32
检测：L929s+ActD(5000c/w)
TNF：人TNFa@0.5ng/ml
表33
| 人白蛋白 | KD(nM) | ka(1/Ms) | kd(1/s) |
| 6A6(ALB1) | 0,57 | 1,11E+6 | 6,30E-4 |
| 1C2-GS-6A6-GS-1C2(TNF24) | 11 | 2,26E+05 | 2,48E-03 |
| 1G5-GS-1G5-GS-6A6(TNF25) | 7,2 | 2,91E+05 | 2,10E-03 |
| 5F10-GS-6A6-GS-5F10(TNF26) | 7,3 | 2,81E+05 | 2,05E-03 |
| 1C2-GS6-1C2-GS-6A6(TNF27) | 8,9 | 3,19E+05 | 2,84E-03 |
| 5F10-GS6-5F10-GS-6A6(TNF28) | 14 | 1,55E+05 | 2,13E-03 |
表34
| ％ | 未处理的 | 室温 | 37C | 50C | 60C | 70C | 80C | 90C |
| TNF24 | 100 | 100 | 99 | 98 | 5 | 3 | 8 | 18 |
| TNF25 | 100 | nd | 103 | 102 | 95 | 5 | 4 | 6 |
| TNF26 | 100 | 109 | 115 | 112 | 107 | 10 | 8 | 10 |
| TNF27 | 100 | 102 | 103 | 102 | 22 | 9 | 26 | 34 |
| TNF28 | 100 | 97 | 99 | 99 | 66 | 3 | 6 | 10 |
表35
表36
| 纳米体TM | 诱导时间 | 产量 |
| TNF29 | ON/28C | 2.1mg/L |
| TNF30 | ON/28C | 2.7mg/L |
| TNF31 | ON/28C | 2mg/L |
| TNF32 | ON/28C | 1.5mg/L |
| TNF33 | ON/28C | 0.5mg/L |
表37
检测：L929s+Act D(5000c/w)
TNF：人TNFa@0.5ng/ml
表38
| 未处理的 | 室温 | 37C | 50C | 60C | 70C | 80C | 90C | |
| TNF29 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 96 | 91 | 89 |
| TNF30 | 100 | 100 | 100 | 99 | 100 | 96 | 92 | 89 |
| TNF31 | 100 | 100 | 100 | 98 | 91 | 84 | 56 | 43 |
| TNF32 | 100 | 99 | 98 | 97 | 87 | 78 | 45 | 39 |
| TNF33 | 100 | 98 | 97 | 97 | 94 | 91 | 79 | 49 |
表39
检测：alphaKYM(10000c/w)
TNF：人TNFa@1ng/ml
WO 04/41862的结果
表40
表41
表42
表43
表44
表45
表46
| DS534 P4 | DS592 P4 | DS605 P3 | KM05-179 P4 | |
| p[IC]50 | ||||
| Etanercept | 9.55 | 9.49 | 9.51 | 9.51 |
| Accipiter | 9.88 | 9.44 | 9.37 | 9.27 |
| pM | ||||
| Etanercept | 282 | 324 | 309 | 309 |
| Acclpiter | 132 | 363 | 427 | 537 |
表47
*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0.1μg人TNFα
应用不多于常规实验，本领域的那些技术人员应该意识到，或者能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等价实施方案。这样的等价实施方案意欲被下述权利要求所包括。
本文公开的所有参考文献通过全文引用完全结合于此。
Claims (37)
1.针对人血清白蛋白的纳米抗体，其由4个构架区和3个互补性决定区组成，所述4个构架区分别为FR1-FR4，所述3个互补性决定区分别为CDR1-CDR3，其中：CDR1是SEQ ID NO：36的氨基酸序列SFGMS；CDR2是SEQ ID NO：40的氨基酸序列SISGSGSDTLYADSVKG；和CDR3是SEQID NO：48的氨基酸序列GGSLSR。
2.权利要求1的纳米抗体，其是VHH、人源化的VHH或骆驼源化的VH。
3.针对人血清白蛋白的纳米抗体，其选自由下列各项组成的组：SEQ ID NO：63的ALB1，SEQ ID NO：87的ALB 3，SEQ ID NO：88的ALB 4，SEQ ID NO：89的ALB 5，SEQ ID NO：100的ALB 6，SEQ ID NO：101的ALB 7，SEQ ID NO：102的ALB 8，SEQ ID NO：103的ALB 9和SEQ IDNO：104的ALB 10。
4.权利要求3的针对人血清白蛋白的纳米抗体，其中所述纳米抗体是SEQ ID NO：102的ALB 8。
5.权利要求1至4中任一项的针对人血清白蛋白的纳米抗体，其中：
(i)FR1是或包括选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：370，368，369，371，372，373和374；
(ii)FR2是或包括选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：384，383和385-388；
(iii)FR3是或包括选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：398，396，397，399，400和402；和
(iv)FR4是或包括选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：412，410，411和413-416。
6.权利要求1至4中任一项的针对人血清白蛋白的纳米抗体，其中：
i)FR1
选自由下列氨基酸序列组成的组：
SEQ ID NO：1的QVQLQESGGGXVQAGGSLRLSCAASG和
SEQ ID NO：5的QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG；或
选自由与SEQ ID NO：1或5有至少80％序列相同性的氨基酸序列组成的组；
和/或
选自由与上述氨基酸序列之一有3个，2个或只有1个“氨基酸差异”的氨基酸序列组成的组，
其中X表示标志残基并选自L，M，S，V，W，F，N，P，T或Y；
和其中：
ii)FR2
选自由下列氨基酸序列组成的组：
SEQ ID NO：2的WXRQAPGKXXEXVA
SEQ ID NO：6的WFRQAPGKERELVA
SEQ ID NO：7的WFRQAPGKEREFVA
SEQ ID NO：8的WFRQAPGKEREGA
SEQ ID NO：9的WFRQAPGKQRELVA
SEQ ID NO：10的WFRQAPGKQREFVA
SEQ ID NO：11的WYRQAPGKGLEWA；或
选自由与SEQ ID NO：2和6-11有至少80％序列相同性的氨基酸序列组成的组；和/或
选自由与上述氨基酸序列之一有3个，2个或只有1个“氨基酸差异”的氨基酸序列组成的组，
其中位置37的X表示标志残基并选自F，Y，H，I，A，L，P，S或V；位置44的X表示标志残基并选自G，E，D，Q，R，S，L，A，F，K，M，N，P，V，W或Y；位置45的X表示标志残基并选自L，R，C，I，L，P，Q，V，D，E，G，H，K或T；位置47的X表示标志残基并选自W，L，F，A，G，I，M，R，S，D，E，H，K，Q，T，V或Y；
和其中：
iii)FR3
选自由下列氨基酸序列组成的组：
SEQ ID NO：3的RFTISRDNAKNTVYLQMNSLXXEDTAVYYCAA和
SEQ ID NO：12的RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA；或
选自由与SEQ ID NO：3或12有至少80％序列相同性的氨基酸序列组成的组；
和/或
选自由与上述氨基酸序列之一有3个，2个或只有1个“氨基酸差异”的氨基酸序列组成的组，
其中位置83的X表示标志残基并选自R，K，N，E，I，M，A，D，G，L，Q，S，T或Q；位置84的X表示标志残基并选自P，A，L，R，S，D，V，F，G，H，N，T或Y；
和其中：
iv)FR4
选自由下列氨基酸序列组成的组：
SEQ ID NO：4的XXQGTXVTVSS
SEQ ID NO：13的WGQGTQVTVSS和
SEQ ID NO：14的WGQGTLVTVSS；或
选自由与SEQ ID NO：4，13和14有至少80％序列相同性的氨基酸序列组成的组：
和/或
选自由与上述氨基酸序列之一有3个，2个或只有1个“氨基酸差异”的氨基酸序列组成的组；
其中位置103的X表示标志残基并选自W，P，R，S，F，G，K，L，N，Q，V或Y；位置104的X表示标志残基并选自G，A，R，S，T或D；位置108的标志残基选自Q，L，E，H，N，P，T或R，
其中数字是指按照Kabat编号方式的氨基酸位置。
7.权利要求6的针对人血清白蛋白的纳米抗体，其中：
(1)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；和/或
(2)除标志位置之外的任何位置的FR1中的任何氨基酸取代是保守氨基酸取代和/或表示氨基酸的人源化或骆驼源化；和/或
(3)除标志位置之外的任何位置的FR2中的任何氨基酸取代是保守氨基酸取代和/或表示氨基酸的人源化或骆驼源化；和/或
(4)除标志位置之外的任何位置的FR3中的任何氨基酸取代是保守氨基酸取代和/或表示氨基酸的人源化或骆驼源化；和/或
(5)除标志位置之外的任何位置的FR4中的任何氨基酸取代是保守氨基酸取代和/或表示氨基酸的人源化或骆驼源化。
8.权利要求6或7的针对人血清白蛋白的纳米抗体，其中FR1与SEQ ID NO：1的序列相同性为至少90％，FR2与SEQ ID NO：2和6-11的序列相同性为至少90％，FR3与SEQ ID NO：3或12的序列相同性为至少90％，或FR4与SEQ ID NO：4，13和14的序列相同性为至少90％。
9.权利要求6或7的针对人血清白蛋白的纳米抗体，其中FR1与SEQ ID NO：1的序列相同性为至少95％，FR2与SEQ ID NO：2和6-11的序列相同性为至少95％，FR3与SEQ ID NO：3或12的序列相同性为至少95％，或FR4与SEQ ID NO：4，13和14的序列相同性为至少95％。
10.权利要求6或7的针对人血清白蛋白的纳米抗体，其中FR1与SEQ ID NO：1的序列相同性为至少99％，FR2与SEQ ID NO：2和6-11的序列相同性为至少99％，FR3与SEQ ID NO：3或12的序列相同性为至少99％，或FR4与SEQ ID NO：4，13和14的序列相同性为至少99％。
11.权利要求1-4中任一项的纳米抗体，其为GLEW-类纳米抗体。
12.权利要求1-4中任一项的纳米抗体，其在位置103包含精氨酸残基。
13.权利要求1-4中任一项的纳米抗体，其在位置108包含亮氨酸残基。
14.蛋白或多肽，其包括或者由权利要求1-13中任一项的纳米抗体组成。
15.权利要求14的蛋白或多肽，其包括或者由至少一种权利要求1-13中任一项的纳米抗体组成。
16.包括两种以上纳米抗体的蛋白或多肽，所述蛋白或多肽包括至少一种权利要求1-13中任一项的纳米抗体。
17.权利要求16的包括两种以上纳米抗体的蛋白或多肽，其中所述纳米抗体通过接头序列连接。
18.权利要求16的蛋白或多肽，其中所述蛋白或多肽包括两种权利要求1-13中任一项的纳米抗体。
19.包括三种纳米抗体的蛋白或多肽，所述蛋白或多肽包括至少一种权利要求1-13中任一项的纳米抗体。
20.权利要求19的包括三种纳米抗体的蛋白或多肽，其中所述纳米抗体通过两个接头序列连接。
21.权利要求19的蛋白或多肽，其中所述蛋白或多肽包括两种或三种权利要求1-13中任一项的纳米抗体。
22.双特异性多肽，其包括权利要求1-13中任一项的第一纳米抗体和针对第二抗原的第二纳米抗体。
23.权利要求22的双特异性多肽，其中所述第一纳米抗体和第二纳米抗体通过接头序列连接。
24.三特异性多肽，其包括权利要求1-13中任一项的第一纳米抗体，针对第二抗原的第二纳米抗体和针对第三抗原的第三纳米抗体。
25.权利要求24的三特异性多肽，其中所述第一纳米抗体，第二纳米抗体和第三纳米抗体通过一个以上接头序列连接。
26.权利要求25的三特异性多肽，其中所述第一纳米抗体，第二纳米抗体和第三纳米抗体通过两个接头序列连接。
27.蛋白或多肽，其包括权利要求1-13中任一项的纳米抗体，还包括至少一种其它纳米抗体，其中所述纳米抗体直接彼此连接或者通过接头彼此连接。
28.权利要求16-27中任一项的蛋白或多肽，其中所述接头是氨基酸序列。
29.权利要求28的蛋白或多肽，其中所述接头是包括至少14个氨基酸的氨基酸序列。
30.权利要求28的蛋白或多肽，其中所述接头是包括至少17个氨基酸的氨基酸序列。
31.权利要求28的蛋白或多肽，其中所述接头是20-40个氨基酸。
32.权利要求28的蛋白或多肽，其中所述接头包括甘氨酸和丝氨酸残基。
33.权利要求14-32中任一项的蛋白或多肽，其中至少一种针对人血清白蛋白的纳米抗体的CDR序列与SEQ ID NO：102的ALB 8中存在的CDR序列相同。
34.权利要求14-32中任一项的蛋白或多肽，其中至少一种针对人血清白蛋白的纳米抗体是人源化的纳米抗体。
35.权利要求14-32中任一项的蛋白或多肽，其中至少一种针对人血清白蛋白的纳米抗体是SEQ ID NO：63的纳米抗体ALB 1的人源化变体。
36.权利要求14-32中任一项的蛋白或多肽，其中至少一种针对人血清白蛋白的纳米抗体选自由下列各项组成的组：SEQ ID NO：87的ALB 3，SEQ ID NO：88的ALB 4，SEQ ID NO：89的ALB 5，SEQ ID NO：100的ALB 6，SEQ ID NO：101的ALB 7，SEQ ID NO：102的ALB 8，SEQ IDNO：103的ALB 9和SEQ ID NO：104的ALB 10。
37.权利要求14-32中任一项的蛋白或多肽，其中至少一种针对人血清白蛋白的纳米抗体是SEQ ID NO：102的ALB 8。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US68233205P | 2005-05-18 | 2005-05-18 | |
| US60/682,332 | 2005-05-18 | ||
| CN200680026278XA CN101248087B (zh) | 2005-05-18 | 2006-05-17 | 针对肿瘤坏死因子α的改进的纳米体TM |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200680026278XA Division CN101248087B (zh) | 2005-05-18 | 2006-05-17 | 针对肿瘤坏死因子α的改进的纳米体TM |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103254309A CN103254309A (zh) | 2013-08-21 |
| CN103254309B true CN103254309B (zh) | 2017-09-26 |
Family
ID=36954329
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200680026278XA Active CN101248087B (zh) | 2005-05-18 | 2006-05-17 | 针对肿瘤坏死因子α的改进的纳米体TM |
| CN201210350044.8A Active CN103254309B (zh) | 2005-05-18 | 2006-05-17 | 针对肿瘤坏死因子α的改进的纳米体TM |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200680026278XA Active CN101248087B (zh) | 2005-05-18 | 2006-05-17 | 针对肿瘤坏死因子α的改进的纳米体TM |
Country Status (30)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US8188223B2 (zh) |
| EP (7) | EP2172484A3 (zh) |
| JP (4) | JP5047950B2 (zh) |
| KR (1) | KR101308771B1 (zh) |
| CN (2) | CN101248087B (zh) |
| AT (2) | ATE537188T1 (zh) |
| AU (1) | AU2006249144B2 (zh) |
| BR (2) | BRPI0609224B1 (zh) |
| CA (2) | CA2962819C (zh) |
| CR (1) | CR9519A (zh) |
| CY (1) | CY1122672T1 (zh) |
| DK (3) | DK1888640T3 (zh) |
| EC (1) | ECSP077910A (zh) |
| ES (3) | ES2384164T3 (zh) |
| HK (2) | HK1113685A1 (zh) |
| HU (1) | HUE045710T2 (zh) |
| IL (3) | IL186941A (zh) |
| LT (1) | LT2949668T (zh) |
| MX (3) | MX342271B (zh) |
| NI (1) | NI200700291A (zh) |
| NO (2) | NO338568B1 (zh) |
| NZ (1) | NZ562695A (zh) |
| PL (3) | PL1888640T3 (zh) |
| PT (2) | PT2949668T (zh) |
| RU (2) | RU2464276C2 (zh) |
| SG (2) | SG184709A1 (zh) |
| SI (3) | SI1888641T1 (zh) |
| TW (2) | TWI439467B (zh) |
| WO (2) | WO2006122787A1 (zh) |
| ZA (3) | ZA200709867B (zh) |
Families Citing this family (276)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005289809A (ja) * | 2001-10-24 | 2005-10-20 | Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) | 突然変異重鎖抗体 |
| US9321832B2 (en) * | 2002-06-28 | 2016-04-26 | Domantis Limited | Ligand |
| US9453251B2 (en) | 2002-10-08 | 2016-09-27 | Pfenex Inc. | Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens |
| US9320792B2 (en) | 2002-11-08 | 2016-04-26 | Ablynx N.V. | Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof |
| EP2336179A1 (en) | 2002-11-08 | 2011-06-22 | Ablynx N.V. | Stabilized single domain antibodies |
| US20060034845A1 (en) | 2002-11-08 | 2006-02-16 | Karen Silence | Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor |
| JP2008507294A (ja) | 2004-07-26 | 2008-03-13 | ダウ グローバル テクノロジーズ インコーポレイティド | 菌株遺伝子操作による改善されたタンパク質発現のための方法 |
| CA2962819C (en) | 2005-05-18 | 2021-07-27 | Ablynx Nv | Improved nanobodies against human serum albumin |
| DE102005023617A1 (de) * | 2005-05-21 | 2006-11-23 | Aspre Ag | Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display |
| US20070269422A1 (en) * | 2006-05-17 | 2007-11-22 | Ablynx N.V. | Serum albumin binding proteins with long half-lives |
| CA2663042A1 (en) * | 2006-09-08 | 2008-03-13 | Ablynx N.V. | Serum albumin binding proteins with long half-lives |
| ATE536369T1 (de) * | 2006-10-11 | 2011-12-15 | Ablynx Nv | Im wesentlichen ph-wert-unabhängigerweise an serumproteine bindende aminosäuresequenzen, verbindungen, die diese enthalten, und deren verwendung |
| AU2007331596A1 (en) * | 2006-12-13 | 2008-06-19 | Ablynx N.V. | Polypeptides specific for complexes involved in receptor-mediated signaling, such as the IL-6/IL-6 receptor complex |
| CA2672595A1 (en) * | 2006-12-15 | 2008-06-19 | Guy Hermans | Amino acid sequences that modulate the interaction between cells of the immune system |
| EP2557090A3 (en) | 2006-12-19 | 2013-05-29 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against GPCRs and polypeptides comprising the same for the treatment of GPCR-related diseases and disorders |
| US9512236B2 (en) | 2006-12-19 | 2016-12-06 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against GPCRS and polypeptides comprising the same for the treatment of GPCR-related diseases and disorders |
| WO2008074840A2 (en) | 2006-12-19 | 2008-06-26 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against a metalloproteinase from the adam family and polypeptides comprising the same for the treatment of adam-related diseases and disorders |
| WO2008074868A1 (en) * | 2006-12-20 | 2008-06-26 | Ablynx N.V. | Oral delivery of polypeptides |
| AU2008219216A1 (en) * | 2007-02-21 | 2008-08-28 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against vascular endothelial growth factor and polypeptides comprising the same for the treatment of conditions and diseases characterized by excessive and/or pathological angiogenesis or neovascularization |
| KR101530395B1 (ko) | 2007-04-27 | 2015-06-19 | 피페넥스 인크. | 향상된 수율 및(또는) 품질로 이종 단백질을 발현하는 특정 균주를 동정하기 위해 미생물 숙주를 신속히 스크리닝하는 방법 |
| US9580719B2 (en) | 2007-04-27 | 2017-02-28 | Pfenex, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
| NZ581097A (en) * | 2007-05-24 | 2012-03-30 | Ablynx Nv | Amino acid sequences directed against rank-l and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders |
| EP2173772A2 (en) | 2007-07-03 | 2010-04-14 | Ablynx N.V. | Providing improved immunoglobulin sequences by mutating cdr and/or fr positions |
| US8629246B2 (en) | 2007-09-26 | 2014-01-14 | Ucb Pharma S.A. | Dual specificity antibody fusions |
| JP2011504740A (ja) | 2007-11-27 | 2011-02-17 | アブリンクス エン．ヴェー． | ヘテロ二量体サイトカイン及び／又はこれらの受容体に指向性を有するアミノ酸配列、並びにこれを含むポリペプチド |
| WO2009109635A2 (en) * | 2008-03-05 | 2009-09-11 | Ablynx Nv | Novel antigen binding dimer-complexes, methods of making and uses thereof |
| GB0809069D0 (en) | 2008-05-19 | 2008-06-25 | Univ Leuven Kath | Gene signatures |
| US8557965B2 (en) | 2008-04-07 | 2013-10-15 | Ablynx N.V. | Single variable domains against notch pathway members |
| US8217140B2 (en) | 2008-04-17 | 2012-07-10 | Ablynx N.V. | Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same |
| US8444976B2 (en) | 2008-07-02 | 2013-05-21 | Argen-X B.V. | Antigen binding polypeptides |
| ES2620603T3 (es) | 2008-09-26 | 2017-06-29 | Ucb Biopharma Sprl | Productos biológicos |
| AU2013202856B2 (en) * | 2008-10-29 | 2016-02-11 | Ablynx N.V. | Formulations of single domain antigen binding molecules |
| MX345226B (es) * | 2008-10-29 | 2017-01-20 | Ablynx Nv | Formulaciones de moleculas de union a antigeno de dominio sencillo. |
| CN102272154A (zh) * | 2008-10-29 | 2011-12-07 | 惠氏有限责任公司 | 单域抗原结合性分子的纯化方法 |
| EP2403873A1 (en) | 2009-03-05 | 2012-01-11 | Ablynx N.V. | Novel antigen binding dimer-complexes, methods of making/avoiding and uses thereof |
| US9265834B2 (en) * | 2009-03-05 | 2016-02-23 | Ablynx N.V. | Stable formulations of polypeptides and uses thereof |
| WO2010115998A2 (en) | 2009-04-10 | 2010-10-14 | Ablynx Nv | Improved amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of il-6r related diseases and disorders |
| PT2424889E (pt) | 2009-04-30 | 2015-11-12 | Ablynx Nv | Método de produção de anticorpos de domínio |
| CN105061592A (zh) | 2009-06-05 | 2015-11-18 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 用于预防和/或治疗呼吸道感染的单价、二价和三价抗人呼吸道合胞病毒(hrsv)纳米抗体构建体 |
| US9150640B2 (en) | 2009-07-10 | 2015-10-06 | Ablynx N.V. | Method for the production of variable domains |
| LT2805731T (lt) | 2009-09-03 | 2019-02-11 | Ablynx N.V. | Stabilios polipeptidų kompozicijos ir jų panaudojimas |
| GB201005063D0 (en) | 2010-03-25 | 2010-05-12 | Ucb Pharma Sa | Biological products |
| US20110172398A1 (en) | 2009-10-02 | 2011-07-14 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Bispecific binding molecules for anti-angiogenesis therapy |
| US20110195494A1 (en) | 2009-10-02 | 2011-08-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Dll4-binging molecules |
| EP2507262A1 (en) | 2009-11-30 | 2012-10-10 | Ablynx N.V. | Improved amino acid sequences directed against human respiratory syncytial virus (hrsv) and polypeptides comprising the same for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections |
| US8962807B2 (en) | 2009-12-14 | 2015-02-24 | Ablynx N.V. | Single variable domain antibodies against OX40L, constructs and therapeutic use |
| WO2011083140A1 (en) | 2010-01-08 | 2011-07-14 | Ablynx Nv | Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4 |
| CN102781959A (zh) | 2010-02-05 | 2012-11-14 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 能够结合血清白蛋白的肽和包含所述肽的化合物、构建体和多肽 |
| US9120855B2 (en) | 2010-02-10 | 2015-09-01 | Novartis Ag | Biologic compounds directed against death receptor 5 |
| US20130012916A1 (en) | 2010-02-11 | 2013-01-10 | Glide Pharmaceutical Technologies Limited | Delivery of immunoglobulin variable domains and constructs thereof |
| PT3501499T (pt) | 2010-02-11 | 2022-11-22 | Ablynx Nv | Métodos e composições para a preparação de aerossóis |
| PE20130527A1 (es) | 2010-03-03 | 2013-05-09 | Boehringer Ingelheim Int | Polipeptidos de union a a-beta biparatopicos |
| EP2552962B1 (en) | 2010-03-26 | 2016-03-23 | Ablynx N.V. | Immunoglobulin single variable domains directed against cxcr7 |
| US9556273B2 (en) | 2010-03-29 | 2017-01-31 | Vib Vzw | Anti-macrophage mannose receptor single variable domains for targeting and in vivo imaging of tumor-associated macrophages |
| US9101674B2 (en) | 2010-03-29 | 2015-08-11 | Vib Vzw | Targeting and in vivo imaging of tumor-associated macrophages |
| WO2013174537A1 (en) | 2012-05-24 | 2013-11-28 | Vib Vzw | Anti-macrophage mannose receptor single variable domains for targeting and in vivo imaging of tumor-associated macrophages |
| SG185354A1 (en) | 2010-05-20 | 2012-12-28 | Ablynx Nv | Biological materials related to her3 |
| WO2011161263A1 (en) | 2010-06-25 | 2011-12-29 | Ablynx Nv | Pharmaceutical compositions for cutaneous administration |
| JP2013536175A (ja) * | 2010-07-16 | 2013-09-19 | アブリンクス エン．ヴェー． | 修飾された単一ドメイン抗原結合分子及びその使用 |
| US20120225081A1 (en) | 2010-09-03 | 2012-09-06 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Vegf-binding molecules |
| WO2012042026A1 (en) | 2010-09-30 | 2012-04-05 | Ablynx Nv | Biological materials related to c-met |
| US11644471B2 (en) | 2010-09-30 | 2023-05-09 | Ablynx N.V. | Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains |
| DK2632946T3 (en) | 2010-10-29 | 2018-03-12 | Ablynx Nv | PROCEDURE FOR MANUFACTURING VARIABLE IMMUNGLOBULIN SINGLE DOMAINS |
| SG189981A1 (en) * | 2010-11-08 | 2013-06-28 | Novartis Ag | Cxcr2 binding polypeptides |
| EP3514169B1 (en) | 2010-11-26 | 2024-03-06 | Molecular Partners AG | Designed repeat proteins binding to serum albumin |
| AU2012234284B2 (en) | 2011-03-28 | 2015-10-08 | Ablynx Nv | Bispecific anti-CXCR7 immunoglobulin single variable domains |
| EP2691415B1 (en) | 2011-03-28 | 2018-07-11 | Ablynx N.V. | Method for producing solid formulations comprising immunoglobulin single variable domains |
| JP6130350B2 (ja) * | 2011-03-30 | 2017-05-17 | アブリンクス エン．ヴェー． | ＴＮＦαに対する単一ドメイン抗体で免疫障害を処置する方法 |
| US9527925B2 (en) | 2011-04-01 | 2016-12-27 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2 |
| US20130078247A1 (en) | 2011-04-01 | 2013-03-28 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Bispecific binding molecules binding to dii4 and ang2 |
| UA117218C2 (uk) | 2011-05-05 | 2018-07-10 | Мерк Патент Гмбх | Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f |
| EP3590950A1 (en) | 2011-05-09 | 2020-01-08 | Ablynx NV | Method for the production of immunoglobulin single varible domains |
| RU2661677C2 (ru) | 2011-05-27 | 2018-07-18 | Аблинкс Нв | Ингибирование резорбции кости с помощью связывающих rank-l пептидов |
| EP4350345A2 (en) | 2011-06-23 | 2024-04-10 | Ablynx N.V. | Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobin single variable domains |
| EP4218933A1 (en) | 2011-06-23 | 2023-08-02 | Ablynx NV | Serum albumin binding proteins |
| EP3363812A1 (en) | 2011-06-23 | 2018-08-22 | Ablynx NV | Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobin single variable domains |
| IN2014CN00437A (zh) | 2011-06-23 | 2015-04-03 | Ablynx Nv | |
| US20180009888A9 (en) | 2011-06-23 | 2018-01-11 | Ablynx N.V. | Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains |
| EP3311837A1 (en) | 2011-09-23 | 2018-04-25 | Ablynx NV | Prolonged inhibition of interleukin-6 mediated signaling |
| AU2012310328A1 (en) | 2011-09-23 | 2014-04-10 | Technophage, Investigação E Desenvolvimento Em Biotecnologia, S.A. | Anti-Tumor Necrosis Factor-alpha agents and uses thereof |
| CA2850261C (en) | 2011-09-30 | 2021-04-20 | Ablynx Nv | C-met immunoglobulin single variable domains |
| US9346884B2 (en) | 2011-09-30 | 2016-05-24 | Ablynx N.V. | Biological materials related to c-Met |
| EP2820046B1 (en) | 2012-02-27 | 2022-06-15 | Ablynx N.V. | Cx3cr1-binding polypeptides |
| JP5970734B2 (ja) | 2012-03-30 | 2016-08-17 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | Ａｎｇ２結合分子 |
| WO2013167883A1 (en) | 2012-05-07 | 2013-11-14 | The University Court Of The University Of Aberdeen | Single domain binding molecule |
| US9328174B2 (en) | 2012-05-09 | 2016-05-03 | Novartis Ag | Chemokine receptor binding polypeptides |
| WO2013172967A1 (en) | 2012-05-17 | 2013-11-21 | Extend Biosciences, Inc | Carriers for improved drug delivery |
| RU2530553C2 (ru) * | 2012-11-07 | 2014-10-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Рекомбинантное однодоменное антитело, способное специфически связывать фактор некроза опухолей человека, и его производные |
| US9315280B2 (en) * | 2012-11-20 | 2016-04-19 | Lockheed Martin Corporation | Heat pipe with axial wick |
| WO2014087010A1 (en) | 2012-12-07 | 2014-06-12 | Ablynx N.V. | IMPROVED POLYPEPTIDES DIRECTED AGAINST IgE |
| EP3514175A1 (fr) | 2012-12-17 | 2019-07-24 | Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies | Utilisation d'anticorps monoclonaux pour le traitement de l'inflammation et d'infections bacteriennes |
| WO2014111550A1 (en) | 2013-01-17 | 2014-07-24 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Modified anti-serum albumin binding proteins |
| PL2951201T3 (pl) | 2013-01-30 | 2018-03-30 | Vib Vzw | Nowe polipeptydy chimeryczne do celów badań przesiewowych i odkrywania leków |
| DK2953973T3 (da) | 2013-02-05 | 2019-08-12 | Vib Vzw | Muskarine acetylcholinreceptor-bindemidler og anvendelser deraf |
| CN105308071A (zh) | 2013-02-13 | 2016-02-03 | 法国化学与生物科技实验室 | 高度半乳糖基化的抗her2抗体及其用途 |
| ES2755181T3 (es) | 2013-02-13 | 2020-04-21 | Lab Francais Du Fractionnement | Anticuerpos anti-TNF-alfa altamente galactosilados y usos de los mismos |
| CA2900915A1 (en) | 2013-02-13 | 2014-08-21 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Cetuximab with modified glycosylation and uses thereof |
| USRE48805E1 (en) | 2013-03-06 | 2021-11-02 | Vision Global Holdings Ltd. | Method for cancer targeting treatment and detection of arginine using albumin-binding arginine deiminase fusion protein |
| US9255262B2 (en) | 2013-03-06 | 2016-02-09 | Vision Global Holdings Ltd. | Albumin-binding arginine deminase and the use thereof |
| EP3919070A1 (en) | 2013-03-14 | 2021-12-08 | Children's Medical Center, Corp. | Use of cd36 to identify cancer subjects for treatment |
| CA2906259C (en) | 2013-03-15 | 2022-12-06 | Vib Vzw | Anti-mmr single variable domains for prognosis and monitoring of cardiovascular diseases |
| CA2909921C (en) | 2013-04-23 | 2022-12-06 | The University Court Of The University Of Aberdeen | Synthetic library of specific binding molecules |
| NL1040254C2 (en) | 2013-05-17 | 2014-11-24 | Ablynx Nv | Stable formulations of immunoglobulin single variable domains and uses thereof. |
| KR20230010003A (ko) | 2013-10-21 | 2023-01-17 | 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 | 자가면역 질환의 진단 및 치료 |
| EP3099707B1 (en) | 2014-01-30 | 2021-12-29 | Vib Vzw | Opioid receptor binding agents and uses thereof |
| BR112016022055A2 (pt) * | 2014-03-26 | 2017-10-24 | Cell Medica Switzerland Ag | elementos de ligação ao tnf alfa |
| CA2946887A1 (en) | 2014-04-24 | 2015-10-29 | Immusant, Inc. | Compositions comprising gluten peptides and uses thereof |
| BR122018009619B1 (pt) | 2014-05-16 | 2024-01-02 | Ablynx N.V | Domínios variáveis de imunoglobulina aperfeiçoados |
| US11009511B2 (en) * | 2014-05-16 | 2021-05-18 | Ablynx N.V. | Methods for detecting and/or measuring anti-drug antibodies, in particular treatment-emergent anti-drug antibodies |
| EP4043011A1 (en) | 2014-05-16 | 2022-08-17 | Children's Hospital Medical Center | Methods for assessing responsiveness to asthma treatment based on vnn-1 expression and promoter methylation |
| CN113717280A (zh) | 2014-05-16 | 2021-11-30 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 改进的免疫球蛋白可变结构域 |
| NL2013661B1 (en) | 2014-10-21 | 2016-10-05 | Ablynx Nv | KV1.3 Binding immunoglobulins. |
| WO2016012363A1 (en) | 2014-07-22 | 2016-01-28 | Vib Vzw | Methods to select for agents that stabilize protein complexes |
| WO2016057398A1 (en) | 2014-10-07 | 2016-04-14 | Immunomedics, Inc. | Neoadjuvant use of antibody-drug conjugates |
| US20170224758A1 (en) | 2014-10-17 | 2017-08-10 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods of treating muscular dystrophy |
| US9789197B2 (en) | 2014-10-22 | 2017-10-17 | Extend Biosciences, Inc. | RNAi vitamin D conjugates |
| EP3220961B1 (en) | 2014-10-22 | 2023-07-05 | Extend Biosciences, Inc. | Therapeutic vitamin d conjugates |
| US9616109B2 (en) | 2014-10-22 | 2017-04-11 | Extend Biosciences, Inc. | Insulin vitamin D conjugates |
| CN111848793B (zh) | 2014-10-23 | 2023-08-18 | 辛格生物技术有限公司 | 针对细胞内抗原的单域抗体 |
| US20170267784A1 (en) | 2014-10-23 | 2017-09-21 | Singh Molecular Medicine, Llc | Single domain antibodies directed against intracellular antigens |
| EP3230457B1 (en) | 2014-12-09 | 2021-06-30 | New York University | Clostridial neurotoxin fusion proteins, propeptide fusions, their expression, and use |
| ES2772348T3 (es) | 2014-12-19 | 2020-07-07 | Ablynx Nv | Dímeros de Nanobody con uniones cisteína |
| EA035638B1 (ru) | 2015-03-31 | 2020-07-20 | ВиЭйчСКВЕАРД ЛИМИТЕД | Полипептиды |
| CA2979602C (en) | 2015-04-02 | 2022-12-20 | Molecular Partners Ag | Designed ankyrin repeat domains with binding specificity for serum albumin |
| EP3286224A4 (en) | 2015-04-22 | 2018-11-14 | Immunomedics, Inc. | Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating trop-2-positive cancer cells |
| EP3294319B1 (en) | 2015-05-13 | 2024-04-24 | Ablynx NV | T cell recruiting polypeptides based on cd3 reactivity |
| RS59376B1 (sr) | 2015-05-13 | 2019-11-29 | Ablynx Nv | Polipeptidi koji regrutuju t-ćelije na bazi tcr-alfa/beta reaktivnosti |
| CA2986575A1 (en) | 2015-05-21 | 2016-11-24 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Trispecific binding proteins and methods of use |
| GB201510758D0 (en) | 2015-06-18 | 2015-08-05 | Ucb Biopharma Sprl | Novel TNFa structure for use in therapy |
| US10973912B2 (en) | 2015-06-29 | 2021-04-13 | President And Fellows Of Harvard College | Treatment for myopathy |
| EP3316885B1 (en) | 2015-07-01 | 2021-06-23 | Immunomedics, Inc. | Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker |
| US10746739B2 (en) | 2015-09-14 | 2020-08-18 | Leukemia Therapeutics, LLC | Identification of novel diagnostics and therapeutics by modulating RhoH |
| TWI746473B (zh) | 2015-11-02 | 2021-11-21 | 美商辛分子醫藥有限公司 | 針對細胞內抗原之單域抗體 |
| NO2768984T3 (zh) | 2015-11-12 | 2018-06-09 | ||
| PL3374392T3 (pl) | 2015-11-13 | 2022-03-28 | Ablynx Nv | Ulepszone domeny zmienne immunoglobuliny wiążące albuminę surowicy |
| KR20190008171A (ko) * | 2015-11-13 | 2019-01-23 | 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 | 항-bcma 폴리펩티드 및 단백질 |
| RU2755724C2 (ru) | 2015-11-18 | 2021-09-20 | Мерк Шарп И Доум Корп. | Pd1/ctla4-связывающие вещества |
| CR20180279A (es) | 2015-11-18 | 2018-08-24 | Merck Sharp & Dohme | Enlazadores de ctla4 |
| CN108473564B (zh) * | 2015-11-18 | 2022-04-08 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 改进的血清白蛋白结合剂 |
| JO3744B1 (ar) | 2015-11-18 | 2021-01-31 | Merck Sharp & Dohme | مواد ربط لـpd1 و/ أو lag3 |
| KR20180080337A (ko) | 2015-11-27 | 2018-07-11 | 아블린쓰 엔.브이. | Ｃｄ40ｌ을 억제하는 폴리펩티드 |
| HUE051777T2 (hu) | 2015-12-04 | 2021-03-29 | Boehringer Ingelheim Int | Tumorsejtekben WNT-jelátvitelt antagonizáló biparatópos polipeptidek |
| GB201522394D0 (en) * | 2015-12-18 | 2016-02-03 | Ucb Biopharma Sprl | Antibodies |
| EP3411407B1 (en) | 2016-02-05 | 2024-04-03 | Orionis Biosciences BV | Bispecific signaling agents and uses thereof |
| US10465003B2 (en) * | 2016-02-05 | 2019-11-05 | Janssen Biotech, Inc. | Anti-TNF antibodies, compositions, methods and use for the treatment or prevention of type 1 diabetes |
| EP4276114A3 (en) | 2016-03-07 | 2024-02-21 | Vib Vzw | Cd20 binding single domain antibodies |
| US20190127447A1 (en) | 2016-05-02 | 2019-05-02 | Ablynx N.V. | Treatment of rsv infection |
| CN109563141A (zh) | 2016-05-13 | 2019-04-02 | 奥里尼斯生物科学公司 | 对非细胞结构的治疗性靶向 |
| US11623958B2 (en) | 2016-05-20 | 2023-04-11 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Single chain variable fragment CD3 binding proteins |
| SG11201810327XA (en) | 2016-05-20 | 2018-12-28 | Harpoon Therapeutics Inc | Single domain serum albumin binding protein |
| CA3024683A1 (en) | 2016-05-20 | 2017-11-23 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Single chain variable fragment cd3 binding proteins |
| SG11201811280QA (en) | 2016-06-23 | 2019-01-30 | Ablynx Nv | Improved pharmacokinetic assays for immunoglobulin single variable domains |
| WO2018007442A1 (en) | 2016-07-06 | 2018-01-11 | Ablynx N.V. | Treatment of il-6r related diseases |
| WO2018029182A1 (en) | 2016-08-08 | 2018-02-15 | Ablynx N.V. | Il-6r single variable domain antibodies for treatment of il-6r related diseases |
| EP3512880A1 (en) | 2016-09-15 | 2019-07-24 | Ablynx NV | Immunoglobulin single variable domains directed against macrophage migration inhibitory factor |
| WO2018060453A1 (en) | 2016-09-30 | 2018-04-05 | Vhsquared Limited | Compositions |
| US11840569B2 (en) | 2016-11-16 | 2023-12-12 | Ablynx N.V. | T cell recruiting polypeptides capable of binding CD123 and TCR alpha/beta |
| BR112019010604A2 (pt) | 2016-11-23 | 2019-12-17 | Harpoon Therapeutics Inc | proteína de ligação ao antígeno da membrana próstata-específico |
| CN110198737A (zh) | 2016-11-23 | 2019-09-03 | 哈普恩治疗公司 | 靶向psma的三特异性蛋白质及使用方法 |
| WO2018099968A1 (en) | 2016-11-29 | 2018-06-07 | Ablynx N.V. | Treatment of infection by respiratory syncytial virus (rsv) |
| WO2018104444A1 (en) * | 2016-12-07 | 2018-06-14 | Ablynx Nv | Improved serum albumin binding immunoglobulin single variable domains |
| GB201621907D0 (en) | 2016-12-21 | 2017-02-01 | Ucb Biopharma Sprl And Sanofi | Antibody epitope |
| CN107674122A (zh) * | 2016-12-28 | 2018-02-09 | 天津天锐生物科技有限公司 | 一种识别人血清白蛋白的单域抗体 |
| SG10202108972RA (en) | 2017-01-17 | 2021-09-29 | Ablynx Nv | Improved serum albumin binders |
| KR20230165374A (ko) | 2017-01-17 | 2023-12-05 | 아블린쓰 엔.브이. | 개선된 혈청 알부민 결합제 |
| KR102642385B1 (ko) | 2017-02-06 | 2024-03-04 | 오리오니스 바이오사이언시스 엔브이 | 표적화된 키메라 단백질 및 이의 용도 |
| AU2018220516A1 (en) | 2017-02-16 | 2019-09-19 | Sonnet BioTherapeutics, Inc. | Albumin binding domain fusion proteins |
| EP3589662A4 (en) | 2017-02-28 | 2020-12-30 | Harpoon Therapeutics, Inc. | INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN |
| JP7186401B2 (ja) | 2017-02-28 | 2022-12-09 | フエー・イー・ベー・フエー・ゼツト・ウエー | タンパク質の経口送達のための手段及び方法 |
| CA3056727A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Ablynx N.V. | Improved immunogenicity assays |
| US11891451B2 (en) | 2017-05-11 | 2024-02-06 | Vib Vzw | Glycosylation of variable immunoglobulin domains |
| EP3621648A4 (en) | 2017-05-12 | 2021-01-20 | Harpoon Therapeutics, Inc. | TRISPECIFIC PROTEINS MSLN AND METHOD OF USE |
| JP7090347B2 (ja) | 2017-05-12 | 2022-06-24 | ハープーン セラピューティクス，インク． | メソテリン結合タンパク質 |
| KR20200011933A (ko) | 2017-05-31 | 2020-02-04 | 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 | 종양 세포에서 wnt 신호 전달을 길항하는 폴리펩티드 |
| BR112019025097A2 (pt) | 2017-06-02 | 2020-07-28 | Merck Patent Gmbh | imunoglobulinas de ligação a mmp13 |
| AR112069A1 (es) | 2017-06-02 | 2019-09-18 | Ablynx Nv | Inmunoglobulinas que fijan aggrecan |
| KR20200013231A (ko) | 2017-06-02 | 2020-02-06 | 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 | 항암 조합 요법 |
| TWI826376B (zh) | 2017-06-02 | 2023-12-21 | 德商麥克專利有限公司 | 與ａｄａｍｔｓ５、ｍｍｐ１３及聚集蛋白聚醣結合的多肽 |
| CN111032695A (zh) | 2017-06-02 | 2020-04-17 | 默克专利股份有限公司 | 结合adamts的免疫球蛋白 |
| GB201710973D0 (en) | 2017-07-07 | 2017-08-23 | Avacta Life Sciences Ltd | Scaffold proteins |
| KR102625929B1 (ko) | 2017-07-19 | 2024-01-16 | 브이아이비 브이지더블유 | 혈청 알부민 결합제 |
| PE20201183A1 (es) | 2017-10-13 | 2020-11-03 | Harpoon Therapeutics Inc | Proteinas trispecificas y metodos de uso |
| KR102429747B1 (ko) | 2017-10-13 | 2022-08-05 | 하푼 테라퓨틱스, 인크. | B 세포 성숙화 항원 결합 단백질 |
| KR20200091400A (ko) | 2017-10-31 | 2020-07-30 | 브이아이비 브이지더블유 | 신규한 항원-결합 키메라 단백질 및 이의 방법 및 용도 |
| US20210070854A1 (en) * | 2017-12-29 | 2021-03-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Antimicrobial nanobodies |
| WO2019152979A1 (en) | 2018-02-05 | 2019-08-08 | Orionis Biosciences, Inc. | Fibroblast binding agents and use thereof |
| WO2019155041A1 (en) | 2018-02-12 | 2019-08-15 | Vib Vzw | Gβγ COMPLEX ANTIBODIES AND USES THEREOF |
| WO2019165105A1 (en) * | 2018-02-26 | 2019-08-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Ligands of the urokinase receptor and their use in treating, detecting, and imaging cancer |
| JP2021514649A (ja) | 2018-03-01 | 2021-06-17 | ブレイエ・ユニバージテイト・ブリュッセルＶｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌ | ヒトｐｄ−ｌ１結合免疫グロブリン |
| US20210231683A1 (en) * | 2018-04-20 | 2021-07-29 | Unm Rainforest Innovations | Rap1-GTP, Rac1-GTP and FMS-like Tyrosine Kinase 3 ligand (FLT3-L) As Biomarkers For Early Detection of Sepsis |
| CN110613838A (zh) * | 2018-06-19 | 2019-12-27 | 姜石松 | 增强细胞通透性的多肽及其应用 |
| DE102018122275A1 (de) * | 2018-09-12 | 2020-03-12 | Osram Opto Semiconductors Gmbh | Lichtemittierendes bauteil und verfahren zum betreiben eines lichtemittierenden bauteils |
| JP7425049B2 (ja) | 2018-09-25 | 2024-01-30 | ハープーン セラピューティクス，インク． | Ｄｌｌ３結合タンパク質および使用方法 |
| EP3636657A1 (en) | 2018-10-08 | 2020-04-15 | Ablynx N.V. | Chromatography-free antibody purification method |
| CN111138536B (zh) * | 2018-11-06 | 2021-07-09 | 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 | 抗人血清白蛋白单域抗体的制备及其应用 |
| CN111138537B (zh) * | 2018-11-06 | 2021-07-09 | 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 | 一种抗人血清白蛋白抗体片段、制备方法和应用 |
| GB201818460D0 (en) * | 2018-11-13 | 2018-12-26 | Crescendo Biologics Ltd | Single domain antibodies that bind human serum albumin |
| CN111423509B (zh) * | 2019-01-10 | 2021-07-09 | 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 | 抗hsa单域抗体及其融合蛋白的亲和层析纯化方法 |
| CN109627334B (zh) * | 2019-01-29 | 2020-07-17 | 康元医疗科技(大连)有限公司 | 一种纳米抗体、以该纳米抗体为配基的吸附剂及其用途 |
| GB201901306D0 (en) | 2019-01-30 | 2019-03-20 | Immunocore Ltd | Multi-domain binding molecules |
| EP3947455A1 (en) | 2019-03-29 | 2022-02-09 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Anticancer combination therapy |
| WO2020200998A1 (en) | 2019-03-29 | 2020-10-08 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anticancer combination therapy |
| AU2020266750A1 (en) | 2019-04-29 | 2021-11-25 | Confo Therapeutics N.V. | Screening methods and assays for use with transmembrane proteins, in particular with GPCRS |
| US20220289837A1 (en) | 2019-04-30 | 2022-09-15 | Vib Vzw | Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Stabilizing Agents |
| EP3976067A1 (en) | 2019-05-28 | 2022-04-06 | Vib Vzw | Cd8+ t-cells lacking plexins and their application in cancer treatment |
| WO2020239945A1 (en) | 2019-05-28 | 2020-12-03 | Vib Vzw | Cancer treatment by targeting plexins in the immune compartment |
| KR20220066035A (ko) | 2019-06-21 | 2022-05-23 | 소리소 파마슈티컬스 인크. | 폴리펩타이드 |
| JP2022538083A (ja) | 2019-06-21 | 2022-08-31 | ソリッソ ファーマシューティカルズ，インク． | ポリペプチド |
| AU2020295767A1 (en) | 2019-06-21 | 2022-02-17 | Sorriso Pharmaceuticals, Inc. | Compositions |
| CN112409480A (zh) * | 2019-08-20 | 2021-02-26 | 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 | 结合血清白蛋白的蛋白及其用途 |
| WO2021039574A1 (ja) * | 2019-08-23 | 2021-03-04 | 株式会社カネカ | Ｏ結合型糖鎖修飾が抑制された重鎖抗体 |
| CN110642946A (zh) * | 2019-09-30 | 2020-01-03 | 中国药科大学 | 一种人源化纳米抗体及其制备方法 |
| WO2021074695A1 (en) | 2019-10-16 | 2021-04-22 | Avacta Life Sciences Limited | PD-L1 INHIBITOR - TGFβ INHIBITOR BISPECIFIC DRUG MOIETIES. |
| WO2021078786A1 (en) | 2019-10-21 | 2021-04-29 | Vib Vzw | Nanodisc-specific antigen-binding chimeric proteins |
| US20220386594A1 (en) | 2019-11-11 | 2022-12-08 | Ibi-Ag Innovative Bio Insecticides Ltd. | Insect control nanobodies and uses thereof |
| CA3158991A1 (en) | 2019-11-27 | 2021-06-03 | Vib Vzw | Positive allosteric modulators of the calcium-sensing receptor |
| KR20220111313A (ko) * | 2019-12-06 | 2022-08-09 | 아블린쓰 엔.브이. | TNFα 및 OX40L을 표적으로 하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드 |
| MX2022006880A (es) | 2019-12-06 | 2022-07-11 | Ablynx Nv | Polipeptidos que comprenden dominios variables unicos de inmunoglobulina dirigidos a tnf alfa e il-23. |
| IL293548A (en) | 2019-12-09 | 2022-08-01 | Ablynx Nv | Polypeptides comprising immunoglobulin with single variable domains targeting 13 il and tsl |
| GB201918279D0 (en) | 2019-12-12 | 2020-01-29 | Vib Vzw | Glycosylated single chain immunoglobulin domains |
| CN110988361B (zh) * | 2019-12-13 | 2020-09-18 | 山东民康生物科技有限公司 | 人血清白蛋白去除试剂盒 |
| WO2021123360A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Vib Vzw | Nanobody exchange chromatography |
| CN112300289B (zh) * | 2019-12-30 | 2022-06-10 | 中国药科大学 | RGD4C融合抗TNFα纳米抗体蛋白、制备方法及其应用 |
| WO2021140205A1 (en) | 2020-01-10 | 2021-07-15 | Confo Therapeutics N.V. | Methods for generating antibodies and antibody fragments and libraries comprising same |
| WO2021156490A2 (en) | 2020-02-06 | 2021-08-12 | Vib Vzw | Corona virus binders |
| MX2022010175A (es) | 2020-02-21 | 2022-09-12 | Harpoon Therapeutics Inc | Proteinas de union a flt3 y metodos de uso. |
| KR20230012464A (ko) | 2020-02-25 | 2023-01-26 | 브이아이비 브이지더블유 | 류신-풍부 반복 키나제 2 알로스테릭 조절제 |
| EP4144758A1 (en) | 2020-04-22 | 2023-03-08 | Mabwell (Shanghai) Bioscience Co., Ltd. | Single variable domain antibody targeting human programmed death ligand 1 (pd-l1) and derivative thereof |
| WO2021229104A1 (en) | 2020-05-15 | 2021-11-18 | Université de Liège | Anti-cd38 single-domain antibodies in disease monitoring and treatment |
| GB202101299D0 (en) | 2020-06-09 | 2021-03-17 | Avacta Life Sciences Ltd | Diagnostic polypetides and methods |
| WO2022003156A1 (en) | 2020-07-02 | 2022-01-06 | Oncurious Nv | Ccr8 non-blocking binders |
| WO2022063957A1 (en) | 2020-09-24 | 2022-03-31 | Vib Vzw | Biomarker for anti-tumor therapy |
| WO2022063947A1 (en) | 2020-09-24 | 2022-03-31 | Vib Vzw | Combination of p2y6 inhibitors and immune checkpoint inhibitors |
| KR20230074527A (ko) | 2020-09-25 | 2023-05-30 | 아블린쓰 엔.브이. | Il-13 및 ox40l을 표적으로 하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드 |
| CN115244076B (zh) | 2020-10-27 | 2023-08-04 | 北京质肽生物医药科技有限公司 | Gdf15融合蛋白及其用途 |
| WO2022098743A1 (en) | 2020-11-03 | 2022-05-12 | Indi Molecular, Inc. | Compositions, imaging, and therapeutic methods targeting folate receptor 1 (folr1) |
| WO2022098745A1 (en) | 2020-11-03 | 2022-05-12 | Indi Molecular, Inc. | Compositions, delivery systems, and methods useful in tumor therapy |
| US20240018248A1 (en) | 2020-12-02 | 2024-01-18 | Vib Vzw | An ltbr agonist in combination therapy against cancer |
| WO2022117569A1 (en) | 2020-12-02 | 2022-06-09 | Oncurious Nv | A ccr8 antagonist antibody in combination with a lymphotoxin beta receptor agonist antibody in therapy against cancer |
| TW202241947A (zh) | 2020-12-18 | 2022-11-01 | 比利時商艾伯霖克斯公司 | 包含靶向磷脂醯肌醇蛋白聚糖—３和ｔ細胞受體的免疫球蛋白單可變結構域的多肽 |
| TW202239763A (zh) | 2020-12-18 | 2022-10-16 | 比利時商艾伯霖克斯公司 | 包含靶向ＩＬ－６和ＴＮＦ－α的免疫球蛋白單可變結構域的多肽 |
| EP4263610A1 (en) | 2020-12-18 | 2023-10-25 | Ablynx N.V. | T cell recruiting polypeptides based on tcr alpha/beta reactivity |
| GB202020502D0 (en) | 2020-12-23 | 2021-02-03 | Vib Vzw | Antibody composistion for treatment of corona virus infection |
| WO2022136649A1 (en) | 2020-12-24 | 2022-06-30 | Oncurious Nv | Non-blocking human ccr8 binders |
| WO2022136650A1 (en) | 2020-12-24 | 2022-06-30 | Oncurious Nv | Murine cross-reactive human ccr8 binders |
| EP4267617A1 (en) | 2020-12-24 | 2023-11-01 | Vib Vzw | Human ccr8 binders |
| US20240101647A1 (en) | 2021-02-05 | 2024-03-28 | Vib Vzw | Sarbecovirus binders |
| CN117794566A (zh) | 2021-02-05 | 2024-03-29 | Vib研究所 | 沙贝病毒结合剂 |
| CN117241804A (zh) | 2021-02-17 | 2023-12-15 | 非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所 | 在癌症治疗中slc4a4的抑制 |
| IL305318A (en) | 2021-02-19 | 2023-10-01 | Vib Vzw | Cation-independent mannose-6-phosphate receptor binders |
| WO2022199804A1 (en) | 2021-03-24 | 2022-09-29 | Vib Vzw | Nek6 inhibition to treat als and ftd |
| WO2022234003A1 (en) | 2021-05-07 | 2022-11-10 | Avacta Life Sciences Limited | Cd33 binding polypeptides with stefin a protein |
| WO2022242892A1 (en) | 2021-05-17 | 2022-11-24 | Université de Liège | Anti-cd38 single-domain antibodies in disease monitoring and treatment |
| CA3225194A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-29 | Vib Vzw | Means and methods for selection of specific binders |
| CN117580865A (zh) | 2021-06-29 | 2024-02-20 | 山东先声生物制药有限公司 | Cd16抗体及其应用 |
| WO2023284822A1 (en) * | 2021-07-14 | 2023-01-19 | Beijing Ql Biopharmaceutical Co., Ltd. | Fusion polypeptides for metabolic disorders |
| CN113527502B (zh) * | 2021-07-20 | 2023-01-17 | 福建医科大学 | 一种用于治疗类风湿性关节炎的纳米抗体重组蛋白 |
| CN117751143A (zh) | 2021-07-30 | 2024-03-22 | 山东先声生物制药有限公司 | 抗pvrig/抗tigit双特异性抗体和应用 |
| WO2023016828A2 (en) | 2021-07-30 | 2023-02-16 | Vib Vzw | Cation-independent mannose-6-phosphate receptor binders for targeted protein degradation |
| TW202332694A (zh) | 2021-10-07 | 2023-08-16 | 英商阿凡克塔生命科學公司 | 血清半衰期延長之ｐｄ－ｌ１結合多肽 |
| TW202334196A (zh) | 2021-10-07 | 2023-09-01 | 英商阿法克塔生命科學有限公司 | Pd-l1結合多肽 |
| CN113912730B (zh) * | 2021-12-14 | 2022-03-04 | 北京科诺信诚科技有限公司 | 缓释的抗FcRn抗体或抗原结合片段及其应用 |
| WO2023111266A1 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Ablynx Nv | POLYPEPTIDES COMPRISING IMMUNOGLOBULIN SINGLE VARIABLE DOMAINS TARGETING TCRαβ, CD33 AND CD123 |
| WO2023135198A1 (en) | 2022-01-12 | 2023-07-20 | Vib Vzw | Human ntcp binders for therapeutic use and liver-specific targeted delivery |
| WO2023148397A1 (en) | 2022-02-07 | 2023-08-10 | Vib Vzw | Engineered stabilizing aglycosylated fc-regions |
| CN116925215A (zh) * | 2022-03-31 | 2023-10-24 | 普米斯生物技术(珠海)有限公司 | 抗血清白蛋白纳米抗体及其衍生物 |
| WO2023198848A1 (en) | 2022-04-13 | 2023-10-19 | Vib Vzw | An ltbr agonist in combination therapy against cancer |
| WO2023218243A1 (en) | 2022-05-12 | 2023-11-16 | Avacta Life Sciences Limited | Lag-3/pd-l1 binding fusion proteins |
| WO2023222825A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Vib Vzw | Sarbecovirus spike s2 subunit binders |
| CN115028719B (zh) * | 2022-05-27 | 2023-01-13 | 深圳市人民医院 | 血清白蛋白结合纳米抗体及其制备方法与应用 |
| WO2023242247A1 (en) | 2022-06-14 | 2023-12-21 | Ablynx Nv | Immunoglobulin single variable domains targeting t cell receptor |
| WO2024003873A1 (en) * | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Intrexon Actobiotics Nv D/B/A Precigen Actobio | Single variable domain antibodies against tumor necrosis factor-alpha |
| WO2024008755A1 (en) | 2022-07-04 | 2024-01-11 | Vib Vzw | Blood-cerebrospinal fluid barrier crossing antibodies |
| WO2024023271A1 (en) | 2022-07-27 | 2024-02-01 | Ablynx Nv | Polypeptides binding to a specific epitope of the neonatal fc receptor |
| WO2024038112A1 (en) | 2022-08-17 | 2024-02-22 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Improved anti-albumin nanobodies and their uses |
| WO2024068744A1 (en) | 2022-09-27 | 2024-04-04 | Vib Vzw | Antivirals against human parainfluenza virus |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004003019A2 (en) * | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Domantis Limited | Immunoglobin single variant antigen-binding domains and dual-specific constructs |
| WO2004041862A2 (en) * | 2002-11-08 | 2004-05-21 | Ablynx N.V. | Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor |
Family Cites Families (153)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US460167A (en) | 1891-09-29 | Car-mover | ||
| DE321017C (zh) | 1917-05-15 | 1920-05-11 | Aloysius Petrus Van Leuven | |
| SE307996B (zh) | 1965-11-30 | 1969-01-27 | Asea Ab | |
| US4352678A (en) | 1978-10-02 | 1982-10-05 | Lever Brothers Company | Thickened abrasive bleaching compositions |
| US4722896A (en) | 1981-01-26 | 1988-02-02 | The Beth Israel Hospital Association | Method for affinity purification of hybridoma antibodies |
| US4559157A (en) | 1983-04-21 | 1985-12-17 | Creative Products Resource Associates, Ltd. | Cosmetic applicator useful for skin moisturizing |
| LU84979A1 (fr) | 1983-08-30 | 1985-04-24 | Oreal | Composition cosmetique ou pharmaceutique sous forme aqueuse ou anhydre dont la phase grasse contient un polyether oligomere et polyethers oligomeres nouveaux |
| US5672347A (en) | 1984-07-05 | 1997-09-30 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor antagonists and their use |
| US4735898A (en) | 1985-07-16 | 1988-04-05 | The University Of Virginia Alumini Patents Foundation | Monoclonal antibodies and method of identifying species using the same |
| JPS62175426A (ja) | 1986-01-27 | 1987-08-01 | Kazufumi Shimizu | 抗体及びこれを有効成分とするスプレ−剤 |
| ATE122238T1 (de) | 1987-06-10 | 1995-05-15 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Bifunktionelle antikörperkonstruktionen und verfahren zur selektiven tötung von zellbeständen. |
| US4820508A (en) | 1987-06-23 | 1989-04-11 | Neutrogena Corporation | Skin protective composition |
| US4992478A (en) | 1988-04-04 | 1991-02-12 | Warner-Lambert Company | Antiinflammatory skin moisturizing composition and method of preparing same |
| US4938949A (en) | 1988-09-12 | 1990-07-03 | University Of New York | Treatment of damaged bone marrow and dosage units therefor |
| AU634186B2 (en) | 1988-11-11 | 1993-02-18 | Medical Research Council | Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors |
| US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
| US5399346A (en) | 1989-06-14 | 1995-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Gene therapy |
| SE509359C2 (sv) | 1989-08-01 | 1999-01-18 | Cemu Bioteknik Ab | Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel |
| CA2064915C (en) | 1989-08-07 | 2001-05-29 | Deborah A. Rathjen | Tumour necrosis factor binding ligands |
| US6451983B2 (en) | 1989-08-07 | 2002-09-17 | Peptech Limited | Tumor necrosis factor antibodies |
| GB8928874D0 (en) | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
| US5859205A (en) | 1989-12-21 | 1999-01-12 | Celltech Limited | Humanised antibodies |
| NZ234246A (en) | 1990-03-16 | 1992-06-26 | Flexitech Consulting Services | Form filling powdered material packages using interleaved plastics/paper packaging |
| GB9016299D0 (en) | 1990-07-25 | 1990-09-12 | Brien Caroline J O | Binding substances |
| EP0542810A1 (en) | 1990-08-02 | 1993-05-26 | B.R. Centre Limited | Methods for the production of proteins with a desired function |
| US5656272A (en) | 1991-03-18 | 1997-08-12 | New York University Medical Center | Methods of treating TNF-α-mediated Crohn's disease using chimeric anti-TNF antibodies |
| WO1994004679A1 (en) | 1991-06-14 | 1994-03-03 | Genentech, Inc. | Method for making humanized antibodies |
| CA2110899C (en) | 1991-06-21 | 2006-08-08 | Jacob G. Michael | Orally administrable therapeutic proteins and method of making |
| DE69229477T2 (de) | 1991-09-23 | 1999-12-09 | Cambridge Antibody Tech | Methoden zur Herstellung humanisierter Antikörper |
| US5869619A (en) | 1991-12-13 | 1999-02-09 | Xoma Corporation | Modified antibody variable domains |
| CA2103887C (en) | 1991-12-13 | 2005-08-30 | Gary M. Studnicka | Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof |
| EP0568332B1 (en) | 1992-04-28 | 1999-07-28 | Sumitomo Rubber Industries, Ltd. | Solid golf ball |
| AU687010B2 (en) | 1992-07-17 | 1998-02-19 | Dana-Farber Cancer Institute | Method of intracellular binding of target molecules |
| EP0584421A1 (en) | 1992-08-21 | 1994-03-02 | Cécile Casterman | Immunoglobulins devoid of light chains |
| DK0656946T4 (da) | 1992-08-21 | 2010-07-26 | Univ Bruxelles | Immunoglobuliner uden lette kæder |
| ATE172880T1 (de) | 1992-08-28 | 1998-11-15 | Bayer Ag | Verwendung von monoklonalen anti-tnf-antikörpern für die behandlung von bakteriellen meningitiden |
| EP0663836B1 (en) | 1992-10-08 | 1997-07-09 | The Kennedy Institute Of Rheumatology | Treatment of autoimmune and inflammatory disorders |
| EP0672142B1 (en) | 1992-12-04 | 2001-02-28 | Medical Research Council | Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use |
| AU6268894A (en) | 1993-02-22 | 1994-09-14 | Alza Corporation | Compositions for oral delivery of active agents |
| WO1994025591A1 (en) | 1993-04-29 | 1994-11-10 | Unilever N.V. | PRODUCTION OF ANTIBODIES OR (FUNCTIONALIZED) FRAGMENTS THEREOF DERIVED FROM HEAVY CHAIN IMMUNOGLOBULINS OF $i(CAMELIDAE) |
| EP0698097B1 (en) | 1993-04-29 | 2001-08-16 | Unilever N.V. | Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of camelidae |
| GB9311454D0 (en) | 1993-06-03 | 1993-07-21 | Agricultural & Food Res | Pharmaceutical compositions |
| DE69434447T2 (de) | 1993-06-07 | 2006-05-18 | Vical, Inc., San Diego | Für die gentherapie verwendbare plasmide |
| DE69426527T2 (de) | 1993-06-09 | 2001-08-30 | Unilever Nv | Verfahren zur herstellung von fusionsproteinen, die scfv fragmente enthalten, in transformierten schimmelpilzen |
| CA2168202A1 (en) | 1993-07-30 | 1995-03-16 | Joseph Dougherty | Efficient gene transfer into primary lymphocytes |
| FR2708622B1 (fr) | 1993-08-02 | 1997-04-18 | Raymond Hamers | Vecteur recombinant contenant une séquence d'un gène de lipoprotéine de structure pour l'expression de séquences de nucléotides. |
| US6091639A (en) | 1993-08-27 | 2000-07-18 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Non-volatile semiconductor memory device and data programming method |
| US6146826A (en) | 1993-09-10 | 2000-11-14 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Green fluorescent protein |
| WO1995021191A1 (en) | 1994-02-04 | 1995-08-10 | William Ward | Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein |
| AU1925195A (en) | 1994-02-22 | 1995-09-04 | Dana-Farber Cancer Institute | Nucleic acid delivery system, method of synthesis and uses thereof |
| US5625048A (en) | 1994-11-10 | 1997-04-29 | The Regents Of The University Of California | Modified green fluorescent proteins |
| WO1996022307A1 (en) | 1995-01-19 | 1996-07-25 | The Research Foundation Of State University Of New York | Genes encoding an insect calcium channel |
| EP0739981A1 (en) | 1995-04-25 | 1996-10-30 | Vrije Universiteit Brussel | Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes |
| US5693492A (en) | 1995-05-05 | 1997-12-02 | Merck & Co., Inc. | DNA encoding glutamate gated chloride channels |
| CA2225460A1 (en) | 1995-06-23 | 1997-01-09 | Winston Campbell Patterson | Transcriptional regulation of genes encoding vascular endothelial growth factor receptors |
| ATE184613T1 (de) | 1995-09-22 | 1999-10-15 | Novo Nordisk As | Varianten des grünen fluoreszenzproteins, gfp |
| US7368111B2 (en) | 1995-10-06 | 2008-05-06 | Cambridge Antibody Technology Limited | Human antibodies specific for TGFβ2 |
| US6027881A (en) | 1996-05-08 | 2000-02-22 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Mutant Aequorea victoria fluorescent proteins having increased cellular fluorescence |
| EP0937140B1 (en) | 1996-06-27 | 2007-09-26 | Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. | Antibody molecules which interact specifically with the active site or cleft of a target molecule |
| US6124128A (en) | 1996-08-16 | 2000-09-26 | The Regents Of The University Of California | Long wavelength engineered fluorescent proteins |
| US6417337B1 (en) | 1996-10-31 | 2002-07-09 | The Dow Chemical Company | High affinity humanized anti-CEA monoclonal antibodies |
| WO1998021355A1 (en) | 1996-11-15 | 1998-05-22 | Life Technologies, Inc. | Mutants of green fluorescent protein |
| EP1027073A2 (en) | 1996-11-19 | 2000-08-16 | Sangstat Medical Corporation | Enhanced effects for hapten conjugated therapeutics |
| US6262238B1 (en) | 1997-01-14 | 2001-07-17 | Roche Diagnostic, Gmbh | Process for modifying the stability of antibodies |
| US6329516B1 (en) | 1997-04-28 | 2001-12-11 | Fmc Corporation | Lepidopteran GABA-gated chloride channels |
| FR2766826B1 (fr) | 1997-08-04 | 2001-05-18 | Pasteur Institut | Vecteurs derives d'anticorps pour le transfert de substances dans les cellules |
| US5895466A (en) | 1997-08-19 | 1999-04-20 | At&T Corp | Automated natural language understanding customer service system |
| GB9722131D0 (en) | 1997-10-20 | 1997-12-17 | Medical Res Council | Method |
| ATE461282T1 (de) | 1997-10-27 | 2010-04-15 | Bac Ip Bv | Multivalente antigenbindende proteine |
| BR9907241A (pt) | 1998-01-26 | 2000-10-17 | Unilever Nv | Biblioteca de expressão, processo para preparar a mesma, uso de uma fonte não imunizada de sequências de ácido nucleico, e, processos para preparar fragmentos de anticorpos e, para preparar um anticorpo |
| CA2321199A1 (en) | 1998-02-19 | 1999-08-26 | William A. Brady | Compositions and methods for regulating lymphocyte activation |
| EP0967284A1 (en) | 1998-05-28 | 1999-12-29 | Pfizer Limited | Phosphodiesterases |
| DK1145002T4 (da) | 1998-07-06 | 2009-03-16 | Perkinelmer Cellular Sciences | Bioluminescenstest for agonister eller antagonister til en calciumkoblet receptor |
| CN1323355A (zh) | 1998-08-13 | 2001-11-21 | 美国吉诺米克斯公司 | 光学鉴定聚合物 |
| GB9824632D0 (en) | 1998-11-10 | 1999-01-06 | Celltech Therapeutics Ltd | Biological compounds |
| IL127127A0 (en) | 1998-11-18 | 1999-09-22 | Peptor Ltd | Small functional units of antibody heavy chain variable regions |
| AU3041100A (en) | 1999-01-05 | 2000-07-24 | Unilever Plc | Binding of antibody fragments to solid supports |
| DE60013767T3 (de) | 1999-01-19 | 2009-07-09 | Unilever N.V. | Verfahren zur herstellung von antikörperfragmenten |
| WO2000046383A2 (en) | 1999-02-05 | 2000-08-10 | Rijksuniversiteit Leiden | Method of modulating metabolite biosynthesis in recombinant cells |
| DE1100895T1 (de) | 1999-03-15 | 2001-09-06 | Univ British Columbia | Abc1 polypeptide und verfahren und reagenzien zur modulation des cholesterolgehalts |
| CN100434441C (zh) | 1999-04-22 | 2008-11-19 | 荷兰联合利华有限公司 | 利用单价抗原-结合蛋白抑制病毒感染 |
| WO2000073430A2 (de) | 1999-05-27 | 2000-12-07 | Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin | Vakzine gegen konformationsabhängige antigene sowie gegen antigene, die keine oder nicht ausschliesslich proteine oder peptide sind |
| KR100476519B1 (ko) | 1999-06-18 | 2005-03-17 | 씨브이 쎄러퓨틱스, 인코포레이티드 | Ａｔｐ 결합 카세트 트랜스포터 단백질 ａｂｃ１을사용하여 콜레스테롤 유출을 증가시키고 ｈｄｌ을상승시키기 위한 조성물 및 방법 |
| AU6322900A (en) | 1999-08-02 | 2001-02-19 | Keygene N.V. | Method for generating resistance against cgmmv in plants, genetic constructs for use in said method, and cgmmv-resistant plants obtained via said method |
| GB9922124D0 (en) | 1999-09-17 | 1999-11-17 | Pfizer Ltd | Phosphodiesterase enzymes |
| US6479280B1 (en) | 1999-09-24 | 2002-11-12 | Vlaams Interuniversitair Institutuut Voor Biotechnologie Vzw | Recombinant phages capable of entering host cells via specific interaction with an artificial receptor |
| US6849425B1 (en) | 1999-10-14 | 2005-02-01 | Ixsys, Inc. | Methods of optimizing antibody variable region binding affinity |
| DE19955408A1 (de) | 1999-11-18 | 2001-05-23 | Bayer Ag | GABA-B-Rezeptoren |
| WO2001040310A2 (en) | 1999-11-29 | 2001-06-07 | Unilever Plc | Immobilisation of proteins using a polypeptide segment |
| EP1233987B1 (en) | 1999-11-29 | 2009-08-19 | Bac Ip B.V. | Immobilized single domain antigen-binding molecules |
| UA76708C2 (uk) * | 1999-12-08 | 2006-09-15 | Сінгента Патисипейшонс Аг | Антитіло, яке застосовується в імунологічному аналізі зразка для визначення неонікотиноїдного інсектициду, білковий кон'югат для одержання антитіла, спосіб визначення концентрації неонікотиноїдного інсектициду в зразку та набір для визначення кількості неонікотиноїдного інсектициду |
| ATE422369T1 (de) | 1999-12-24 | 2009-02-15 | Genentech Inc | Verfahren und zusammensetzungen zur verlängerung der entsorgungshalbwertszeit von biowirksamen verbindungen |
| US7229619B1 (en) | 2000-11-28 | 2007-06-12 | Medimmune, Inc. | Methods of administering/dosing anti-RSV antibodies for prophylaxis and treatment |
| ES2324280T3 (es) | 2000-03-14 | 2009-08-04 | Unilever N.V. | Dominios variables de la cadena pesada de anticuerpos frente a lipasas dieteticas humanas y sus usos. |
| US7097840B2 (en) | 2000-03-16 | 2006-08-29 | Genentech, Inc. | Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates |
| WO2001090190A2 (en) | 2000-05-26 | 2001-11-29 | National Research Council Of Canada | Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies |
| US6741957B1 (en) | 2000-07-21 | 2004-05-25 | Daimlerchrysler Corporation | Analytical tire model for vehicle durability and ride comfort analysis |
| EP1328248A1 (fr) | 2000-10-20 | 2003-07-23 | Firmenich Sa | Composition parfumante sans alcool |
| DK1360207T3 (da) | 2000-12-13 | 2011-09-05 | Bac Ip B V | Proteinarray af variable domæner af tunge immunoglobulinkæder fra kameler |
| US7054297B1 (en) | 2000-12-28 | 2006-05-30 | Cisco Technology, Inc. | Distribution of packets to high data rate communications devices using multicast protocols |
| US7829084B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-11-09 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding constructs and methods for use thereof |
| JP4336771B2 (ja) | 2001-03-09 | 2009-09-30 | モルフォシス アーゲー | 血清アルブミン結合部分 |
| US20050271663A1 (en) | 2001-06-28 | 2005-12-08 | Domantis Limited | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
| US20100081792A1 (en) | 2001-06-28 | 2010-04-01 | Smithkline Beecham Corporation | Ligand |
| DK1399484T3 (da) | 2001-06-28 | 2010-11-08 | Domantis Ltd | Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne |
| WO2003005053A1 (de) | 2001-07-04 | 2003-01-16 | Siemens Aktiengesellschaft | Verfahren zur intensitätskorrektur eines magnetresonanzbildes |
| AU2002355477B2 (en) | 2001-08-03 | 2008-09-25 | Medical Research Council | Method of identifying a consensus sequence for intracellular antibodies |
| US7371849B2 (en) | 2001-09-13 | 2008-05-13 | Institute For Antibodies Co., Ltd. | Methods of constructing camel antibody libraries |
| FR2829940A1 (fr) | 2001-09-27 | 2003-03-28 | Synt Em | Compositions pour la vectorisation d'anticorps a travers la barriere hematoencephalique et leur utilisation pour le diagnostic ou le traitement des maladies du systeme nerveux central |
| US7084257B2 (en) | 2001-10-05 | 2006-08-01 | Amgen Inc. | Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity |
| JP2005289809A (ja) | 2001-10-24 | 2005-10-20 | Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) | 突然変異重鎖抗体 |
| PL369739A1 (en) | 2001-11-12 | 2005-05-02 | Merck Patent Gmbh | Modified anti-tnf alpha antibody |
| US7365167B2 (en) | 2001-11-26 | 2008-04-29 | Cell Matrix, Inc. | Humanized collagen antibodies and related methods |
| KR100599789B1 (ko) | 2001-12-03 | 2006-07-12 | 삼성에스디아이 주식회사 | 방열효율이 향상된 플라즈마 디스플레이 장치 및 그 제조방법 |
| WO2003048902A2 (en) | 2001-12-03 | 2003-06-12 | Dyax Corporation | Library screening |
| US7393648B2 (en) | 2001-12-03 | 2008-07-01 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Hybrid antibodies |
| WO2003050531A2 (en) | 2001-12-11 | 2003-06-19 | Algonomics N.V. | Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts |
| EP1456237A2 (en) | 2001-12-21 | 2004-09-15 | Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. | Method for cloning of variable domain sequences |
| WO2003055527A2 (en) | 2002-01-03 | 2003-07-10 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw | Immunoconjugates useful for treatment of tumours |
| DE10225567B4 (de) | 2002-06-10 | 2006-07-06 | Endress + Hauser Conducta Gesellschaft für Mess- und Regeltechnik mbH + Co. KG | Kommunikationsverfahren und System hierfür |
| CA2490009A1 (en) * | 2002-06-21 | 2003-12-31 | Dyax Corporation | Serum protein-associated target-specific ligands and identification method therefor |
| US20060002935A1 (en) | 2002-06-28 | 2006-01-05 | Domantis Limited | Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor |
| US20080008713A1 (en) | 2002-06-28 | 2008-01-10 | Domantis Limited | Single domain antibodies against tnfr1 and methods of use therefor |
| EP1388571A1 (de) | 2002-08-08 | 2004-02-11 | Ciba Spezialitätenchemie Pfersee GmbH | Polyorganosiloxanzusammensetzung enthaltend quaternäre Ammoniumgruppen |
| US7004940B2 (en) | 2002-10-10 | 2006-02-28 | Ethicon, Inc. | Devices for performing thermal ablation having movable ultrasound transducers |
| US7521543B2 (en) | 2002-10-23 | 2009-04-21 | Ludwig Institute For Cancer Research | A34 and A33-like 3 DNA, proteins, antibodies thereto and methods of treatment using same |
| US20060034845A1 (en) | 2002-11-08 | 2006-02-16 | Karen Silence | Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor |
| ES2466716T3 (es) | 2002-11-08 | 2014-06-11 | Ablynx N.V. | Anticuerpos de un solo dominio estabilizados |
| AU2003286004A1 (en) | 2002-11-08 | 2004-06-07 | Ablynx N.V. | Single domain antibodies directed against interferon- gamma and uses therefor |
| US20060228355A1 (en) | 2003-11-07 | 2006-10-12 | Toon Laeremans | Camelidae single domain antibodies vhh directed against epidermal growth factor receptor and uses therefor |
| GB0230203D0 (en) | 2002-12-27 | 2003-02-05 | Domantis Ltd | Fc fusion |
| DE60329627D1 (de) | 2002-12-31 | 2009-11-19 | Nektar Therapeutics Al Corp | Hydrolysestabile maleimidendgruppen-enthaltende polymere |
| AU2004204262B2 (en) | 2003-01-10 | 2010-11-04 | Ablynx N.V. | Recombinant VHH single domain antibody from camelidae against von willebrand factor (vWF) or against collagen |
| CA2529819A1 (en) | 2003-06-30 | 2004-09-23 | Domantis Limited | Pegylated single domain antibodies |
| US7539903B2 (en) | 2003-06-30 | 2009-05-26 | Siemens Aktiengesellschaft | Method for monitoring the execution of a program by comparing a request with a response and introducing a falsification in a response |
| EP1512696A1 (en) | 2003-08-14 | 2005-03-09 | Diatos | Amino acid sequences facilitating penetration of a substance of interest into cells and/or cell nuclei |
| US7432238B2 (en) | 2004-04-16 | 2008-10-07 | Stc.Unm | Human Kunitz-type inhibitor with enhanced antifibrinolytic activity |
| US7180370B2 (en) | 2004-09-01 | 2007-02-20 | Micron Technology, Inc. | CMOS amplifiers with frequency compensating capacitors |
| US7563443B2 (en) | 2004-09-17 | 2009-07-21 | Domantis Limited | Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof |
| SG157423A1 (en) | 2004-12-02 | 2009-12-29 | Domantis Ltd | Bispecific domain antibodies targeting serum albumin and glp-1 or pyy |
| GB0521621D0 (en) | 2005-10-24 | 2005-11-30 | Domantis Ltd | Tumor necrosis factor receptor 1 antagonists for treating respiratory diseases |
| CA2962819C (en) | 2005-05-18 | 2021-07-27 | Ablynx Nv | Improved nanobodies against human serum albumin |
| DE102005023617A1 (de) | 2005-05-21 | 2006-11-23 | Aspre Ag | Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display |
| US20070269422A1 (en) | 2006-05-17 | 2007-11-22 | Ablynx N.V. | Serum albumin binding proteins with long half-lives |
| BRPI0812398A2 (pt) | 2007-06-06 | 2019-09-24 | Domantis Ltd | domínio variável simples de imunoglobulina anti-vegf, antagonista anti-vegf, domínio variável simples de imunoglobulina resistente à protease, uso do antagonista vegf, método para a dispensação oral ou dispensação de um medicamento ao trato gi de um paciente ou ao pulmão ou tecido pulmonar ou olho de um paciente, dispositivo de dispensação pulmonar, formulação oral, ligando específico duplo, ácido nucleico isolado ou recombinante, vetor, célula hospedeira, método para produzir polipeptídeo, composição farmacêutica, polipeptídeo, e, proteína de fusão |
| CA2688434A1 (en) | 2007-06-06 | 2008-12-11 | Domantis Limited | Polypeptides, antibody variable domains and antagonists |
| GB0724331D0 (en) | 2007-12-13 | 2008-01-23 | Domantis Ltd | Compositions for pulmonary delivery |
| JP2011504740A (ja) | 2007-11-27 | 2011-02-17 | アブリンクス エン．ヴェー． | ヘテロ二量体サイトカイン及び／又はこれらの受容体に指向性を有するアミノ酸配列、並びにこれを含むポリペプチド |
| HUE029982T2 (en) | 2008-07-18 | 2017-04-28 | Bristol Myers Squibb Co | Monovalent compositions and methods of use for CD28 binding |
| KR20130048242A (ko) | 2010-07-22 | 2013-05-09 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 항-종양 항원 항체 및 이용 방법 |
| EA035638B1 (ru) * | 2015-03-31 | 2020-07-20 | ВиЭйчСКВЕАРД ЛИМИТЕД | Полипептиды |
| WO2017167997A1 (en) * | 2016-03-31 | 2017-10-05 | Vhsquared Limited | Compositions |
-
2006
- 2006-05-17 CA CA2962819A patent/CA2962819C/en active Active
- 2006-05-17 EP EP09173976A patent/EP2172484A3/en not_active Withdrawn
- 2006-05-17 EP EP20100175950 patent/EP2365000A3/en not_active Withdrawn
- 2006-05-17 EP EP06742962A patent/EP1888640B1/en active Active
- 2006-05-17 DK DK06742962.1T patent/DK1888640T3/da active
- 2006-05-17 ES ES06742962T patent/ES2384164T3/es active Active
- 2006-05-17 JP JP2008511627A patent/JP5047950B2/ja active Active
- 2006-05-17 CN CN200680026278XA patent/CN101248087B/zh active Active
- 2006-05-17 DK DK15172289T patent/DK2949668T3/da active
- 2006-05-17 MX MX2012000384A patent/MX342271B/es unknown
- 2006-05-17 WO PCT/EP2006/004679 patent/WO2006122787A1/en not_active Application Discontinuation
- 2006-05-17 AT AT06742963T patent/ATE537188T1/de active
- 2006-05-17 SI SI200631287T patent/SI1888641T1/sl unknown
- 2006-05-17 US US11/587,749 patent/US8188223B2/en active Active
- 2006-05-17 MX MX2007014359A patent/MX2007014359A/es active IP Right Grant
- 2006-05-17 ES ES15172289T patent/ES2778123T3/es active Active
- 2006-05-17 SI SI200631334T patent/SI1888640T1/sl unknown
- 2006-05-17 LT LT15172289T patent/LT2949668T/lt unknown
- 2006-05-17 PT PT151722899T patent/PT2949668T/pt unknown
- 2006-05-17 WO PCT/EP2006/004678 patent/WO2006122786A2/en active Application Filing
- 2006-05-17 PL PL06742962T patent/PL1888640T3/pl unknown
- 2006-05-17 HU HUE15172289A patent/HUE045710T2/hu unknown
- 2006-05-17 NZ NZ562695A patent/NZ562695A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-05-17 PT PT06742963T patent/PT1888641E/pt unknown
- 2006-05-17 SG SG2012064283A patent/SG184709A1/en unknown
- 2006-05-17 ES ES06742963T patent/ES2379283T3/es active Active
- 2006-05-17 EP EP15172289.9A patent/EP2949668B1/en active Active
- 2006-05-17 KR KR1020077026738A patent/KR101308771B1/ko active IP Right Grant
- 2006-05-17 EP EP20110163652 patent/EP2479191A3/en not_active Withdrawn
- 2006-05-17 RU RU2007142444/10A patent/RU2464276C2/ru active
- 2006-05-17 SG SG10201708038QA patent/SG10201708038QA/en unknown
- 2006-05-17 CN CN201210350044.8A patent/CN103254309B/zh active Active
- 2006-05-17 BR BRPI0609224-1A patent/BRPI0609224B1/pt active IP Right Grant
- 2006-05-17 BR BR122013001996-0A patent/BR122013001996B1/pt active IP Right Grant
- 2006-05-17 AU AU2006249144A patent/AU2006249144B2/en active Active
- 2006-05-17 AT AT06742962T patent/ATE549357T1/de active
- 2006-05-17 EP EP19184376.2A patent/EP3613767A1/en active Pending
- 2006-05-17 CA CA2608770A patent/CA2608770C/en active Active
- 2006-05-17 EP EP06742963A patent/EP1888641B1/en active Active
- 2006-05-17 MX MX2016001166A patent/MX363423B/es unknown
- 2006-05-17 SI SI200632355T patent/SI2949668T1/sl unknown
- 2006-05-17 DK DK06742963.9T patent/DK1888641T3/da active
- 2006-05-17 PL PL06742963T patent/PL1888641T3/pl unknown
- 2006-05-17 PL PL15172289T patent/PL2949668T3/pl unknown
- 2006-05-18 TW TW101148771A patent/TWI439467B/zh active
- 2006-05-18 TW TW095117592A patent/TWI395755B/zh active
-
2007
- 2007-10-25 IL IL186941A patent/IL186941A/en active IP Right Grant
- 2007-11-14 NI NI200700291A patent/NI200700291A/es unknown
- 2007-11-14 CR CR9519A patent/CR9519A/es not_active Application Discontinuation
- 2007-11-14 NO NO20075853A patent/NO338568B1/no unknown
- 2007-11-15 ZA ZA200709867A patent/ZA200709867B/xx unknown
- 2007-11-19 EC EC2007007910A patent/ECSP077910A/es unknown
-
2008
- 2008-08-15 HK HK08109098.4A patent/HK1113685A1/xx unknown
-
2009
- 2009-02-12 ZA ZA200901011A patent/ZA200901011B/xx unknown
-
2011
- 2011-01-14 ZA ZA2011/00385A patent/ZA201100385B/en unknown
-
2012
- 2012-05-02 JP JP2012105089A patent/JP5788359B2/ja active Active
- 2012-06-26 RU RU2012126722A patent/RU2634381C2/ru active
-
2013
- 2013-03-20 IL IL225347A patent/IL225347A/en active IP Right Grant
-
2014
- 2014-02-27 US US14/191,907 patent/US9067991B2/en active Active
-
2015
- 2015-05-07 JP JP2015094805A patent/JP6420200B2/ja active Active
- 2015-05-12 US US14/709,870 patent/US20150353635A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-04-06 HK HK16103906.9A patent/HK1215953A1/zh unknown
- 2016-06-17 NO NO20161028A patent/NO345340B1/no unknown
-
2017
- 2017-03-05 IL IL250946A patent/IL250946B/en active IP Right Grant
- 2017-03-28 JP JP2017063172A patent/JP6484660B2/ja active Active
- 2017-07-10 US US15/644,890 patent/US20170342146A1/en not_active Abandoned
-
2019
- 2019-05-28 US US16/423,596 patent/US11472871B2/en active Active
- 2019-11-13 CY CY20191101193T patent/CY1122672T1/el unknown
-
2022
- 2022-05-27 US US17/826,258 patent/US20230031229A1/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004003019A2 (en) * | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Domantis Limited | Immunoglobin single variant antigen-binding domains and dual-specific constructs |
| WO2004041862A2 (en) * | 2002-11-08 | 2004-05-21 | Ablynx N.V. | Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Efficient Cancer Therapy with a Nanobody-Based Conjugate;Virna Cortez-Retamozo et al.;《CANCER RESEARCH》;20040415;第64卷;2853-2857 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103254309B (zh) | 针对肿瘤坏死因子α的改进的纳米体TM | |
| US8703131B2 (en) | Nanobodies against tumor necrosis factor-alpha | |
| US20090286727A1 (en) | DP-78-Like Nanobodies | |
| AU2014259481B2 (en) | Improved NanobodiesTM against tumor necrosis factor-alpha | |
| RU2794974C2 (ru) | СВЯЗЫВАЮЩИЙ TNF-α ПОЛИПЕПТИД И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С TNF-α ЗАБОЛЕВАНИЙ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20130821 Assignee: Eddingpharm (Asia) Macao Commercial Offshore Services Ltd. Assignor: Ablynx NV Contract record no.: 2013990000689 Denomination of invention: Improved nano TM for tumor necrosis factor alpha License type: Common License Record date: 20131017 |
|
| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |