PT1888641E

PT1888641E - Proteínas de ligação a albumina de soro

Info

Publication number: PT1888641E
Application number: PT06742963T
Authority: PT
Inventors: Hendricus Renerus Jacobus Mattheus Hoogenboom; Els Beirnaert; Hilde Adi Pierette Revets
Original assignee: Ablynx Nv
Priority date: 2005-05-18
Filing date: 2006-05-17
Publication date: 2012-03-19
Also published as: TWI439467B; ES2379283T3; CA2608770C; SI1888641T1; HUE045710T2; CY1122672T1; IL186941A; US11472871B2; ES2384164T3; KR20080011395A; BRPI0609224A2; MX2007014359A; EP1888641B1; WO2006122787A1; EP1888640A2; US20230031229A1; PL1888641T3; SG10201708038QA; NI200700291A; JP2017186318A

Description

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DESCRIÇÃO "PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO A ALBUMINA DE SORO" A presente invenção relaciona-se com sequências de aminoácidos que são capazes de se ligarem a albumina de soro como definido na reivindicação 1, com proteínas e polipéptidos compreendendo ou consistindo essencialmente nessas sequências de aminoácidos; com ácidos nucleicos que codificam essas sequências de aminoácidos, proteínas ou polipéptidos; com composições, e em particular composições farmacêuticas, que compreendem essas sequências de aminoácidos, proteínas e polipéptidos; e com usos dessas sequências de aminoácidos, proteínas e polipéptidos.

Outros aspetos, formas de realização, vantagens e aplicações da invenção serão evidentes aqui a partir da descrição adicional.

Sequências de aminoácidos que são capazes de se ligarem a albumina de soro humano e seus usos em construções de polipéptidos com vista a aumentar a meia vida de proteínas e polipéptidos terapeuticamente relevantes são conhecidas na técnica.

Por exemplo, as WO 91/01743, WO 01/45746 e WO 02/076489 descrevem porções peptídicas ligadas a albumina de soro que podem ser ligadas a proteínas terapêuticas e outros compostos e entidades terapêuticas com vista ao aumento da meia vida destes. Porém, estas porções peptídicas são de origem bacteriana ou sintéticas, as quais são menos preferidas para uso em terapêuticos. 2 A WO 04/041865 como requerente descreve Nanocorpos® dirigidos contra albumina de soro (e em particular contra albumina de soro humana) que podem ser ligados a outras proteínas (tais como um ou mais outros Nanocorpos® dirigido contra um alvo desejado) com vista ao aumento da meia vida da referida proteína. O recetor neonatal Fc (FcRn), também chamado "recetor Brambell", está envolvido no prolongamento do tempo de vida da albumina em circulação (ver Chaudhury, et al., The Journal of Experimental Medicine, vol. 3, no. 197, 315-322 (2003)). O recetor FcRn é uma glicoproteína de membrana integral que consiste numa cadeia leve solúvel que consiste em β-microglobulina, ligada não covalentente a uma cadeia α de 43 kD com três domínios extracelulares, uma região da transmembrana e uma cauda citoplásmica de cerca de 50 aminoácidos. A cauda citoplásmica contém um sinal endocitose baseado em motivo dinucleótido implicado na internalização do recetor. A cadeia α é um membro da família de proteínas MHC I não clássica. A associação β2πι com a cadeia α é crítica para a dobragem correta do FcRn e o retículo endoplásmico existente para o encaminhamento para os endossomas e a superfície da célula. A estrutura geral do FcRn é similar à das moléculas de classe I. As regiões α-l e a-2 assemelham-se à plataforma composta por oito cadeias β antiparalelas formando uma folha única encimada por duas hélices α antiparalelas que se assemelham muito de perto da fissura do péptido nas moléculas MHC I. Devido a uma reposição completa da hélice α-l e flexão da porção C-terminal da hélice a-2 devido a uma quebra da hélice introduzida pela presença de Prol62, as hélices do FcRn estão consideravelmente próximas das hélices, ocluindo a ligação do péptido. A cadeia lateral de 3

Argl64 do FcRn oclui também a interação potencial do péptido N-terminal com a bolsa MHC. Adicionalmente, pontes salinas e interação hidrofóbica entre as hélices a-1 e a-2 podem também contribuir para o fechamento da fissura.

Portanto FcRn, não participa na apresentação do antigénio, e a fissura do péptido é aberta. 0 FcRn liga e transporta o IgG através do sincitiotrofoblasto placentário da circulação materna para a circulação fetal e protege o IgG da degradação em adultos. Para além da homeostase, o FcRn controla a transcitose de IgG nos tecidos. 0 FcRn está localizado nas células epiteliais, células endoteliais e hepatócitos.

De acordo com Chaudhury et al. (supra), a albumina liga-se ao FcRn para formar um complexo tri-molecular com IgG. Tanto a albumina como o IgG ligam-se não cooperativamente a sitios distintos no FcRn. A ligação do FcRn humano a Sepharose-HSA e Sepharose-hlgG dependeu do pH, sendo máxima a pH 5,0 e nula a pH 7,0 até pH 8. A observação que FcRn liga a albumina com o mesmo padrão dependente de pH com que se liga a IgG sugere que o mecanismo pelo qual a albumina interage com FcRn e, portanto, é protegida da degradação é idêntico ao do IgG, e mediado através de uma interação similarmente sensível a pH com o FcRn. Usando SPR para medir a capacidade dos domínios HSA individuais para ligar hFcRn solúvel imobilizado, Chaudhury mostrou que FcRn e albumina interagem via do domínio D-III da albumina num modo dependente de pH, num sítio distinto do sítio de ligação de IgG (Chaudhury, dissertação de PhD, ver http://www.andersonlab.com/biosketchCC.htm; Chaudhury et al. Biochemistry, ASAP Artigo 10.1021/bi052628y S0006- 4 2960(05)02628-0 (Data de lançamento na Web: março 22, 2006)). É objeto da presente invenção fornecer sequências de aminoácidos que são uma alternativa, e em particular uma alternativa melhorada, às sequências de aminoácidos de ligação a albumina descritas na técnica anterior citada acima.

Num aspeto, a invenção atinge este objetivo fornecendo sequências de aminoácidos, que são sequências de imunoglobulina como definido na reivindicação 1, e mais particularmente sequências do domínio variável de imunoglobulina, que podem ligar-se a ou de outro modo associar-se à albumina de soro de tal modo que, quando a sequência de aminoácidos ou a construção de polipéptido está ligada a ou de outro modo associada à molécula de albumina de soro, a ligação da referida molécula de albumina de soro ao FcRn não é (significativamente) reduzida ou inibida (i.e. comparada com a ligação da referida molécula de albumina de soro ao FcRn quando a sequência de aminoácidos ou a construção de polipéptido não está ligada ao mesmo) . Neste aspeto da invenção, por "não significativamente reduzido ou inibido" significa que a afinidade de ligação para albumina de soro ao FcRn (como medido usando um ensaio adequado, tal como SPR) não é reduzida mais que 50%, preferencialmente não reduzida mais que 30 %, ainda mais preferencialmente não reduzida mais que 10%, tal como não reduzida mais que 5%, ou essencialmente não reduzida de todo. Neste aspeto da invenção, "não significativamente reduzida ou inibida" pode também significar (ou significar adicionalmente) que a meia vida da molécula de albumina de soro não é significativamente reduzida (como definido a seguir). 5

Quando nesta descrição, é feita referência a ligação, essa ligação é preferencialmente ligação especifica, como entendido normalmente por um perito.

Quando uma sequência de aminoácidos como aqui descrita é uma sequência de imunoglobulina monovalente (por exemplo, um nanocorpo monovalente), a referida sequência de imunoglobulina monovalente preferencialmente liga-se a albumina de soro humana com uma constante de dissociação (KD) de 1CT5 até 1CT12 moles/litro ou menos, e preferencialmente 10“7 até 1CT12 moles/litro ou menos e mais preferencialmente 10“8 até 1CT12 moles/litro, e/ou com uma afinidade de ligação de pelo menos 107 M-l, preferencialmente pelo menos 108 M-l, mais preferencialmente pelo menos 109 M-l, tal como pelo menos 1012 M-l. Qualquer valor de KD maior que 10“4 litros/mol é geralmente considerado para indicar ligação não especifica. Preferencialmente, a sequência de imunoglobulina monovalente da invenção irá ligar-se ao desejado antigénio com uma afinidade menor que 500 nM, preferencialmente menor que 200 nM, mais preferencialmente menor que 10 nM, tal como menor que 500 pM. A ligação especifica de uma proteína de ligação a antigénio a um antigénio ou determinante antigénico pode ser determinada de qualquer modo adequado conhecido em si, incluindo, por exemplo, análise Scatchard e/ou ensaio de ligação competitiva, tal como radioimunoensaios (RIA), imunoensaios de enzima (EIA) e ensaio de competição em sandwich, e as diferentes variantes destes conhecidas em si na técnica.

Num outro aspeto, a invenção fornece sequências de aminoácidos que são sequências de imunoglobulina como definido na reivindicação 1, e mais particularmente sequências do domínio variável de imunoglobulina, que podem 6 ligar-se a ou de outro modo associar-se a albumina de soro de tal modo que, quando a sequência de aminoácidos ou a construção de polipéptidos é ligada a ou de outro modo associada a uma molécula de albumina de soro, a meia vida da molécula de albumina de soro não é (significativamente) reduzida (i.e. comparada com a meia vida da molécula de albumina de soro quando a sequência de aminoácidos ou a construção de polipéptidos não está ligada ao mesmo). Neste aspeto da invenção, por "não significativamente reduzida" entende-se que a meia vida da molécula de albumina de soro (como medido usando uma técnica adequada conhecida em si) não é reduzida em mais que 50%, preferencialmente não reduzida em mais que 30 %, ainda mais preferencialmente não reduzida em mais que 10%, tal como não reduzida em mais que 5%, ou essencialmente não reduzida de todo.

Num outro aspeto, a invenção fornece sequências de aminoácidos, que são sequências de imunoglobulina como definido na reivindicação 1, e mais particularmente sequências do domínio variável de imunoglobulina, que são capazes de se ligar a resíduos de aminoácidos na albumina de soro que não estão envolvidos na ligação da albumina de soro ao FcRn. Mais em particular, este aspeto da invenção fornece sequências de aminoácidos que são capazes de se ligar a sequências de aminoácidos da albumina de soro que não fazem parte do domínio III da albumina de soro. Por exemplo, mas sem ser limitado às mesmas, este aspeto da invenção fornece sequências de aminoácidos que são capazes de se ligarem a sequências de aminoácidos da albumina de soro que fazem parte do domínio I e/ou domínio II.

As sequências de aminoácidos da invenção são preferencialmente (únicos) anticorpos do domínio ou adequados para uso como (único) anticorpo do domínio, e 7 como tal devem ser sequências do domínio variável de cadeia pesada (sequência VH) ou uma sequência do domínio variável de cadeia leve (sequência VL) , e preferencialmente são sequências VH. As sequências de aminoácidos podem por exemplo ser chamadas "dAb's".

Porém, de acordo com uma forma de realização particularmente preferida, as sequências de aminoácidos da presente invenção são Nanocorpos. Para uma descrição e definição adicional dos nanocorpos, assim como de alguns dos seus termos usados na presente descrição, é feita referência a isso tal como o copendente pedido Internacional do requerente intitulado "Improved Nanobodies™ against Tumor Necrosis Factor-alpha”, o qual tem a mesma prioridade e a mesma data de registo que o presente pedido); assim como a adicional técnica anterior aqui citada.

Como tal, podem ser Nanocorpos pertencentes à classe "KERE", à classe "GLEW" ou à classe "103-P,R,S (novamente como definido no copendente pedido de patente pelo requerente).

Preferencialmente, as sequências de aminoácidos da presente invenção são Nanocorpos humanizados (novamente como definido no copendente pedido de patente pelo requerente).

As sequências de aminoácidos aqui divulgadas podem ser usadas com vantagem como parceiros de fusão com vista a aumentar a meia vida das porções terapêuticas tais como proteínas, compostos (incluindo, sem limitação, pequenas moléculas) ou outras entidades terapêuticas.

Portanto, num outro aspeto, a invenção fornece proteínas ou polipéptidos que compreendem ou essencialmente consistem de umas sequência de aminoácidos como aqui divulgado. Em particular, a invenção fornece proteína ou construções de polipéptidos que compreendem ou essencialmente consistem em pelo menos uma sequência de aminoácidos da invenção que está ligada a pelo menos uma porção terapêutica, opcionalmente através de um ou mais ligantes ou espaçadores adequados. Tais construções de proteína ou polipéptidos podem por exemplo (sem limitação) ser uma proteína de fusão, como melhor descrito aqui. A invenção relaciona-se adicionalmente com usos terapêuticos de construções de proteína ou polipéptido ou proteínas de fusão e construções e com composições farmacêuticas compreendendo essas construções de proteína ou polipéptido ou proteínas de fusão.

Em algumas formas de realização a pelo menos uma porção terapêutica compreende ou essencialmente consiste de uma proteína, polipéptido, composto, fator ou outra entidade terapêutica. Numa forma de realização preferida a porção terapêutica é dirigida contra um desejado antigénio ou alvo, é capaz de se ligar a um antigénio desejado (e em particular capaz de se ligar particularmente a um antigénio desejado), e/ou é capaz de interatuar com o desejado alvo. Numa outra forma de realização, a pelo menos uma porção terapêutica compreende ou essencialmente consiste de uma proteína ou polipéptido terapêutico. Numa forma adicional de realização, a pelo menos uma porção terapêutica compreende ou essencialmente consiste de uma imunoglobulina ou sequência de imunoglobulina (incluindo mas não limitado a um fragmento de uma imunoglobulina) , tal como um anticorpo ou um fragmento de anticorpo (incluindo mas não 9 limitado a um fragmento ScFv). Ainda numa outra forma de realização, a pelo menos uma porção terapêutica compreende ou essencialmente consiste de um domínio variável de anticorpo, tal como um domínio variável de cadeia pesada ou domínio variável de cadeia leve.

Numa forma de realização preferida, a pelo menos uma porção terapêutica compreende ou essencialmente consiste de pelo menos um anticorpo de domínio ou um único anticorpo de domínio, "cLAb" ou Nanocorpo ®. De acordo com esta forma de realização, a sequência de aminoácidos da invenção é preferencialmente também um anticorpo de domínio ou um único anticorpo de domínio, "cLAb" ou Nanocorpo, de modo a que a construção ou proteína de fusão resultante é uma construção multivalente (como aqui descrito) e preferencialmente uma construção multiespecífica (também como aqui descrito) compreendendo pelo menos dois anticorpos do domínio, anticorpos únicos do domínio, "dAbs" ou Nanocorpos® (ou uma combinação destes), pelo menos um dos quais é dirigido contra (como aqui definido) albumina de soro.

Numa forma de realização específica, a pelo menos uma porção terapêutica compreende ou essencialmente consiste de pelo menos um nanocorpo® monovalente ou uma construção de Nanocorpos® bivalentes, multivalentes, biespecíficos ou multiespecíficos. De acordo com esta forma de realização, a sequência de aminoácidos da invenção é preferencialmente também um nanocorpo, de modo a que a construção ou proteína de fusão resulta numa construção de Nanocorpos multivalentes (como aqui descrito) e preferencialmente uma construção de Nanocorpos multiespecíficos (também como aqui descrito) compreendendo pelo menos dois Nanocorpos, pelo 10 menos uma das quais é dirigida contra (como aqui definido) albumina de soro.

De acordo com uma forma de realização da invenção, o Nanocorpo contra albumina de soro humana é um nanocorpo humanizado.

Igualmente, quando as sequências de aminoácidos, proteínas, polipéptidos ou construções da invenção são entendidas para uso farmacêutico ou de diagnóstico, os referidos são preferencialmente dirigidos contra albumina de soro humana. De acordo com uma forma de realização preferida, mas não limitante, as sequências de aminoácidos, proteínas, polipéptidos ou construções mostram uma afinidade para albumina de soro humana que é maior que a afinidade para albumina de soro de rato (determinada como descrito na Parte experimental).

De acordo com uma forma de realização preferida, mas não limitante, a sequência de aminoácidos da invenção é dirigida para o epitopo na albumina de soro humana como o clone PMP6A6 (ALB-1).

De acordo com uma forma de realização específica, mas não limitante, a sequência de aminoácidos da invenção é uma sequência de imunoglobulina (e preferencialmente um nanocorpo) que é capaz de se ligar à albumina de soro humano que consiste de 4 regiões estruturais (FRl até FR4 respetivamente) e 3 regiões determinantes complementares (CDR1 até CDR3 respetivamente), nas quais: a) CDR1 é uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 10 e na qual: 11 b) CDR2 é uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NOS: 24 e na qual: c2) CDR3 é uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 38 e na qual as sequências da estrutura podem ser quaisquer sequências de estrutura adequadas, tais como as sequências da estrutura de um (único) anticorpo de domínio e em particular de um nanocorpo.

Nas sequências de aminoácidos acima: (1) qualquer substituição aminoácido é preferencialmente uma substituição aminoácido conservativa (como aqui definido); e/ou (2) a referida sequência de aminoácidos preferencialmente contém somente substituições de aminoácido, e nenhumas deleções ou inserções de aminoácidos, comparadas com as sequências de aminoácidos acima.

Algumas combinações de sequências CDR nos Nanocorpos, e algumas combinações de CDR e sequências de estruturas nos Nanocorpos podem ser vistas a partir da Tabela I a seguir. A Tabela II a seguir lista alguns Nanocorpos. A Tabela III abaixo lista alguns Nanocorpos preferidos humanizados da invenção. 12

Tabela I - Combinações de sequências CCR e combinações preferidas de sequências CCR e sequências de estruturas

CU3NE to FR1 IO CDR1 IO PR2 IOÍCDR2 PMPSA8{AL82) 1 avolvesggglvggggslrlacmserifo 6 mm 15 WYRQGPGNERFLVA 22 iTCnVGQSTNYADSVKG PMP8B4 2 EVaiV£SGGGLVQ6S6SLRlACW^RiWD s ifllLS 16 WYRQGPGNERÊIVA 23 j TÍTVGDSTSYADSVKG PMPSA6(ALS1) 3 AVQtVESGGGLVOPGNSLRLSCMSGFTFR 10 1? WVRQAPGKEPEWVS 24 SISGSGSDTLYADSVKG PMP6C1 4 AVQLVOSGGGIVQPGÔStRLSCMSGFSFG 11 $F(* 18 WVAQVPGKEPEWV6 2S} SÍKGRGODTRYAOSVKG PMP6G8 5 AVQtt/ESGGGLVOPSGSLHLTCTASGFTFR 12 SFGMS 18 YWRQAPÔKDQEYVVS 2S l AiSADSSTKNYAOSWG PMP6Â5 B QVGLAESGGGiVQPGSSLRLTCTASGFTFG 13 SF0MS zo WRGAPGEGIÉWVS PMPÊG? 7 GVQLVESGGGlVQPGGSLRLSCAÁ.SGFTfS 14 tmiw 21 WVRVAPGKGLERIS 23! RDIST GGGYSYYADSVKG

CLQNE condi J ÍÒ FR3 é CDR3 iS1 FR4 PMP6A8{AL82) 28 RFTtSMDYTKGTWLHMNSLPPEDTGLYYCKf 36 RPTWHSEL 43 WGQGTQVfVSS PMP884 30 RFTISROYDKNUYlGMNSLRPgOTGLYYCki 3T RRTWHSEl 44 WGQGTQVTVSS PÍSpSÃIMfil) 31 RFTlSRDRAkmYlQMNÈLkPÉOTAVYYCfl 38 GGSLSR 45 SSQGTQVTVSS «WC1 32 33 SRSVSRS 1Γ RTQGTQVTVSS PMPBOB 33 RptlSRONAKKfAYLEMNSU^EDTAVYYCVI 48 GRGGP 4Ϊ SSPC'QVTVSS PMP6AS 34 RFTiSRONAKKMYLEMNSLKSEDTAVYYCyi 41 GSGSP 48 ASQGTQVTVSS FMF6GT 35 RFt !SRD;N AKNT LYÍ.OMP4 SLKPEDTALYYCAk 42 DRSAQVDTIDFOY 48 RGGGTOVTVSS 13

Tabela II: Nanocorpos.

PMP6A8 (ALB2) 50 AVQLVESGGGLVQGGGSLRLACAASERIFDLNLMGWYRQGPGNERE LVATCITVG.DSTNYADSVXGRFTISMDYTKQTVYLHMNSLRPEDT GLYYCKIRRTWHSELWGQGTQVTVSS PMP6B4 51 EVQLVES GGGLVQEGGS LRLACAAS ER IWDINLLGWYRQGPGNERE LVATITVG.DSTSYADSVKGRFTISRDYDKNTLYLQMNSLRPEDTG LYYCKIRRTWHSELWGQGTQVTVSS PMP6A6 (ALB1) 52 avqlvesggglvqpgnslrlscaasgftfrsfgmswvrqapgkepe wvssisgsgsdtlyadsvkgrftisrdnakttlylqmmslkpedta VYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS PMP6C1 53 AVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFGSFGMSWVRQYPGKEPE WVSSINGRGDDTRYADSVKGRFSISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTA EYYCTIGRSVSRSRTQGTQVTVSS PMP6G8 54 AVQLVESGGGLVQPGGSLRLTCTASGFTFRS FGMSWVRQAPGKDQE WVS AI SADSSTKNYADS VKGRFTISRDNAKKMLYLEMNS LKPEDTA VYYCVIGRGSPSSPGTQVTVSS PMP6A5 55 QVQLAESGGGLVQPGGS LRLTCTASGFTFGSfgmswvrqapgegle wvsaisadssdkryadsvkgrftisrdnakkmlylemnslksedta VYYCVIGRGSPASQGTQVTVSS PMP6G7 56 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMYWVRVAPGKGLE RISRDISTGGGYSYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDT ALYYCAKDREAQVDTLDFDYRGOGTQVTVSS 14

Tabela III: Nanocorpos humanizados preferidos, mas não limitantes da invenção

ALB3 (ALB1 HUM1) 57! | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPE | WVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTA | VYYCTIGGSI/SRSSQGTQVTVSS ALB4 (ALB1 HUM2) 58 | I EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGfCEPE | WVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTA | VYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS ALB5 (ALB1 HUM3) 59 ] | evqlvesggglvqpggslrlscaasgptfrsfgmswvrqapgkgle I WVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTA | VYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS ALB6( ALB1 HUM1) 60 | I EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGLE j WVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTA | VYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS ALB7 (ALB1 HUM2) 611 I EVQLVESGGGLVQPGNS LRLSCAASGFTFRS FGMSWVRQAPGKGLE I WVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTA | VYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS ALB8 (ALB1 HUM3) 62 | \ EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLE \ WVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTA I VYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS ALB9 (ALB1 HUM4) 63 | j EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAFGKGLE | WVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTA | VYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS ALB10 (ALB1 HUM5) 64 | I EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLE | WVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTA | VYYCTIGGSLSRSGOGTLVTVSS

Portanto, num outro aspeto, uma sequência de aminoácidos aqui descrita é um nanocorpo, que tem pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95%, mesmo mais preferencialmente pelo menos 99% 15 de identidade de sequência (como aqui definido) com pelo menos uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO's 50 até 64.

Assim, num outro aspeto, uma sequência de aminoácidos aqui descrita é um nanocorpo, que tem pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95%, ainda mais preferencialmente pelo menos 99% de identidade de sequência (como aqui definido) com pelo menos uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NO's 50 até 64, nas quais: • as sequências CDR1 presentes nesses Nanocorpos são escolhidas a partir de sequências CDR1 da SEQ ID NOS: 8 até 14 ou a partir de sequências de aminoácidos com diferença somente de 1 aminoácido da sequência CDR i; • as sequências CDR2 presentes nesses Nanocorpos são escolhidas a partir de sequências CDR1 das SEQ ID NOS: 22 até 28 ou a partir de sequências de aminoácidos com diferença somente de 1 aminoácido da sequência CDR2; • e as sequências CDR1 presentes nesses Nanocorpos são escolhidas a partir das sequências CDR1 das SEQ ID NOS: 23 até 42 ou a partir de sequências de aminoácidos com diferença somente de CDR3.

Num outro aspeto, uma sequência de aminoácidos aqui descrita é um nanocorpo, o qual tem pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95%, ainda mais preferencialmente pelo menos 99% de identidade de sequência (como aqui definido) com pelo menos uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO's 50 até 64, nas quais: 16

16 Nanocorpos das SEQ ID Nanocorpos das SEQ ID Nanocorpos das SEQ ID • as sequências CDR1 presentes nesses são escolhidas a partir das sequências CDR1 NOS: 8 até 14; • as sequências CDR2 presentes nesses são escolhidas a partir das sequências CDR1 NOS: 22 até 28; • e as sequências CDR1 presentes nesses são escolhidas a partir das sequências CDR1 NOS: 23 até 42.

Um grupo particularmente preferido dos nanocorpos para uso na presente invenção compreende o clone PMP6A6 (ALB1; SEQ ID NO: 52) e variantes humanizadas deste, incluindo mas não limitado aos clones ALB 3 (SEQ ID NO: 57); ALB 4 (SEQ ID NO: 58); ALB 5 (SEQ ID NO: 59); ALB 6 (SEQ ID NO: 60); ALB 7 (SEQ ID NO: 61); ALB 8 (SEQ ID NO: 62); ALB 9 (SEQ ID NO: 63); e ALB 10 (SEQ ID NO: 64), dos quais ALB 8 (SEQ ID NO: 62) é particularmente preferido.

Assim, num aspeto preferido, a invenção relaciona-se com uma sequência de aminoácidos, a qual tem pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95%, ainda mais preferencialmente pelo menos 99% de identidade de sequência (como aqui definido) com pelo menos uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NO's 52 e 57 até 64.

Assim, a sequência de aminoácidos da invenção preferencialmente é uma sequência de imunoglobulina (e preferencialmente um nanocorpo) que é capaz de se ligar a albumina de soro humano que consiste em 4 regiões estruturais (FR1 até FR4 respetivamente) e 3 regiões determinantes complementares (CDR1 até CDR3 respetivamente), nas quais: 17 a) CDR1 compreende, é ou essencialmente consiste em: a sequência de aminoácidos SFGMS; e em que: b) CDR2 compreende, é ou essencialmente consiste em: a sequência de aminoácidos SISGSGSDTLYADSVKG; e em que: c) CDR3 compreende, é ou essencialmente consiste em: a sequência de aminoácidos GGSLSR; ou

Mais em particular, a invenção relaciona-se com um tal Nanocorpo, em que CDR1 compreende ou é a sequência de aminoácidos SFGMS; e CDR3 compreende ou é a sequência de aminoácidos GGSLSR; ou em que: CDR1 compreende ou é a sequência de aminoácidos SFGMS; e CDR2 compreende ou é a sequência de aminoácidos SISGSGSDTLYADSVKG; ou em que: CDR2 compreende ou é a sequência de aminoácidos SISGSGSDTLYADSVKG; e CDR3 compreende ou é a sequência de aminoácidos GGSLSR. 18

Ainda mais em particular, a invenção relaciona-se com um tal Nanocorpo, no qual CDR1 compreende ou é a sequência de aminoácidos SFGMS; CDR2 compreende ou é a sequência de aminoácidos SISGSGSDTLYADSVKG e CDR3 compreende ou é a sequência de aminoácidos GGSLSR.

Estas sequências de aminoácidos novamente preferencialmente têm pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95%, ainda mais preferencialmente pelo menos 99% de identidade de sequência (como aqui definido) com pelo menos uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO's 52 e 57 até 64.

Também, novamente, estas sequências de aminoácidos são preferencialmente humanizadas, como descrito nos pedidos copendentes pelo requerente. Algumas substituições de humanização preferidas serão evidentes para um perito, por exemplo a partir da comparação da sequência não humanizada da SEQ ID NO: 52 com as correspondentes sequências humanizadas das SEQ ID NOS: 57-64.

Quando a sequência de aminoácidos é uma sequência de imunoglobulina tal como uma sequência do domínio variável da imunoglobulina, pode também ser usado um fragmento adequado (i.e. adequado para os fins aqui mencionados) de uma tal sequência. Por exemplo, quando a sequência de aminoácidos é um nanocorpo, um tal fragmento pode ser essencialmente como descrito na WO 04/041865. A invenção relaciona-se também com uma proteína ou polipéptido que compreende ou essencialmente consiste numa sequência de aminoácidos como aqui descrita, ou um fragmento adequado destes. 19

Como aqui mencionado, as sequências de aminoácidos aqui descritas podem ser usadas com vantagem como parceiros de fusão com vista a aumentar a meia vida das porções terapêuticas tais como proteínas, compostos (incluindo, sem limitação, moléculas pequenas) ou outras entidades terapêuticas. Portanto, uma forma de realização da invenção relaciona-se com uma construção ou proteína de fusão que compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos da invenção e pelo menos uma porção terapêutica. Uma tal construção ou proteína de fusão preferencialmente tem tempo de vida aumentado, em comparação com o da porção terapêutica em si. Geralmente, essas proteínas de fusão e construções podem ser (preparadas e usadas) como descrito na técnica anterior citada acima, mas com uma sequência de aminoácidos da invenção em vez das porções com meia vida aumentada descritas na técnica anterior.

Geralmente, as construções ou proteínas de fusão aqui descritas preferencialmente têm uma meia vida que é pelo menos 1,5 vezes, preferencialmente pelo menos 2 vezes, tal como pelo menos 5 vezes, por exemplo pelo menos 10 vezes ou mais que 20 vezes, maior que a meia vida da correspondente porção terapêutica em si.

Também, preferencialmente, qualquer dessas proteínas de fusão ou construções têm uma meia vida que é aumentada em mais que 1 hora, preferencialmente em mais que 2 horas, mais preferencialmente mais que 6 horas, tal como mais que 12 horas, em comparação com a meia vida da correspondente porção terapêutica em si.

Também, preferencialmente, qualquer proteína de fusão ou construção tem uma meia vida que é mais que 1 hora, preferencialmente mais que 2 horas, mais preferencialmente 20 de mais que 6 horas, tal como mais que 12 horas, e por exemplo de cerca de um dia, dois dias, uma semana, duas semanas ou três semanas, e preferencialmente não mais que 2 meses, embora a última possa ser menos crítica. A meia vida pode geralmente ser definida como o tempo necessário para que a concentração do polipéptido no soro seja reduzida em 50%, em vivo, por exemplo devido à degradação do ligando e/ou libertação ou sequestração do ligando por mecanismos naturais. Métodos para análise farmacocinética e determinação da meia vida são familiares dos especialistas na técnica. Podem ser encontrados pormenores em Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists e em Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996). É feita referência a "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, publicada por Mareei Dekker, 2a edição revista (1982).

Também, como mencionado acima, quando a sequência de aminoácidos da invenção é um nanocorpo, podem ser usados "cLAb's" ou Nanocorpos, para aumentar a meia vida das sequências de imunoglobulina, tais como anticorpos do domínio, únicos anticorpos do domínio.

Portanto, uma forma de realização da invenção relaciona-se com uma construção ou proteína de fusão que compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos da invenção e pelo menos uma sequência de imunoglobulina, tais como anticorpos do domínio, único anticorpo do domínio, "dAb's" ou Nanocorpos. A sequência de imunoglobulina é preferencialmente dirigida contra um alvo desejado (o qual é preferencialmente um alvo terapêutico), e/ou outra sequência de imunoglobulina que é 21 útil ou adequada para fins terapêuticos, profiláticos e/ou de diagnóstico.

Portanto, num outro aspeto, a invenção relaciona-se com uma construção de Nanocorpos multiespecifica (e em particular biespecifica) que compreende pelo menos um nanocorpo como aqui descrito, e pelo menos um outro Nanocorpo, na qual o referido pelo menos um outro Nanocorpo é preferencialmente dirigido contra um alvo desejado (o qual é preferencialmente um alvo terapêutico), e/ou outro Nanocorpo que é útil ou adequado para fins terapêuticos, profiláticos e/ou de diagnóstico.

Para uma descrição geral de polipéptidos multivalentes e multiespecificos contendo um ou mais Nanocorpos e sua preparação, é também feita referência a Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302; assim como a por exemplo WO 96/34103 e WO 99/23221. Alguns outros exemplos de alguns polipéptidos específicos multiespecificos e/ou multivalentes da invenção podem ser encontrados nos pedidos copendentes pelo requerente. Em particular, para uma descrição geral de construções multivalentes e multiespecificas compreendendo pelo menos um nanocorpo contra uma proteína de soro para aumentar a meia vida, de ácidos nucleicos que codificam a mesma e, de composições compreendendo a mesma, da preparação dos acima mencionados, e usos dos acima mencionados, é feita referência ao pedido International WO 04/041865 pelo requerente mencionado acima. As sequências de aminoácidos aqui descritas podem geralmente ser usadas analogamente aos Nanocorpos de meia vida aumentada aqui descritos. 22

Numa forma de realização não limitante, o referido outro Nanocorpo é dirigido contra o fator alfa da necrose tumoral (TNF-alfa), na forma monomérica e/ou multimérica (i.e. trimérica). Alguns exemplos dessas construções de Nanocorpos podem ser encontrados no copendente pedido Internacional pelo requerente intitulado "Improved Nanobodies™ against Tumor Necrosis Factor-alpha", o qual tem a mesma prioridade e a mesma data de registo internacional do presente pedido. A invenção relaciona-se também com sequências de nucleótidos ou ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos, proteínas de fusão e construções aqui descritas. A invenção inclui adicionalmente construções genéticas que incluem as antecedentes sequências de nucleótidos ou ácidos nucleicos e um ou mais elementos para contruções genéticas conhecidas em si. A construção genética pode ser na forma de um plasmídeo ou vetor. Novamente, essas construções geralmente podem ser como descrito nos copendentes pedidos de patente pelo requerente aqui descritos, tais como WO 04/041862 ou o copendente pedido Internacional pelo requerente intitulado ''Improved Nanobodies™ against Tumor Necrosis Factor-alpha''. A invenção relaciona-se também com hospedeiros ou células hospedeiras que contêm essas sequências de nucleótidos ou ácidos nucleicos, e/ou que expressam (ou são capazes de expressar), as sequências de aminoácidos, proteínas de fusão e construções aqui descritas. Novamente, essas células hospedeiras geralmente podem ser como descrito nos copendentes pedidos de patente pelo aplicante aqui descritos, tais como a WO 04/041862 ou o copendente pedido Internacional pelo requerente intitulado ''Improved Nanobodies™ against Tumor Necrosis Factor-alpha''. 23 A invenção relaciona-se também com um método para preparar uma sequência de aminoácidos, proteína de fusão ou construção como aqui descritas, cujo método compreende cultivar ou manter uma célula hospedeira como aqui descrita sob condições tais que a referida célula hospedeira produz ou expressa uma sequência de aminoácidos, proteína de fusão ou construção como aqui descrito, e opcionalmente compreende adicionalmente isolar a sequência de aminoácidos, proteína de fusão ou construção assim produzidas. Novamente, tais métodos podem ser realizados como descrito geralmente nos copendentes pedidos de patente pelo requerente aqui descritos, tais como a WO 04/041862 ou o copendente pedido Internacional pelo requerente intitulada "Improved Nanobodies™ against Tumor Necrosis Factor-alpha". A invenção relaciona-se também com uma composição farmacêutica que compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos, proteína de fusão ou construção como aqui descritas, e opcionalmente pelo menos um transportador, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Tais preparações, transportadores, excipientes e diluentes podem geralmente ser como descrito nos copendentes pedidos de patente pelo requerente aqui descritos, tais como a WO 04/041862 ou o copendente pedido Internacional pelo requerente intitulado "Improved Nanobodies™ against Tumor Necrosis Factor-alpha".

Porém, dado que as sequências de aminoácidos, proteínas de fusão ou construções aqui descritas têm meias vidas aumentadas, são preferencialmente administradas na circulação. Como tal, podem ser administradas em qualquer modo adequado que permita às sequências de aminoácidos, 24 proteínas de fusão ou construções entrarem na circulação, tais como intravenosamente, via injeção ou infusão, ou em qualquer outro modo adequado (incluindo administração oral, administração através da pele, administração intranasal, administração por via pulmonar, etc.) que permita que as sequências de aminoácidos, proteínas de fusão ou construções entrem em circulação. Métodos adequados e vias de administração serão evidentes para um perito, novamente por exemplo também a partir do ensinamento da WO 04/041862 ou do copendente pedido Internacional pelo requerente intitulado "Improved Nanobodies™ against Tumor Necrosis Factor-alpha".

Portanto, num outro aspeto, a invenção relaciona-se com o uso de um método para a prevenção e/ou tratamento de pelo menos uma doença ou distúrbio que podem ser prevenidos ou tratados pelo uso de uma proteína de fusão ou construção como aqui descrito, cujo uso compreende administrar, a um indivíduo com essa necessidade, uma quantidade farmaceuticamente ativa de uma proteína de fusão ou construção da invenção, e/ou de uma composição farmacêutica compreendendo a mesma. As doenças e distúrbios que podem ser prevenidos ou tratados pelo uso de uma proteína de fusão ou construção como aqui descritas serão geralmente as mesmas que as doenças e distúrbios que podem ser prevenidos ou tratados pelo uso da porção terapêutica que está presente na proteína de fusão ou construção da invenção.

No contexto da presente invenção, o termo "prevenção e/ou tratamento" não compreende somente prevenir e/ou tratar a doença, mas também geralmente compreende prevenir o início da doenças, abrandamento ou regressão do progresso da doença, prevenir ou abrandar o inicio de um ou mais sintomas associados à doença, reduzir e/ou aliviar um ou 25 mais sintomas associados à doença, reduzir a gravidade e/ou a duração da doença e/ou de quaisquer sintomas a ela associados e/ou prevenir um aumento adicional da gravidade da doença e/ou de quaisquer sintomas a ela associados, prevenir, reduzir ou reverter qualquer dano fisiológico causado pela doença, e geralmente qualquer ação farmacológica que seja benéfica para o doente a ser tratado. 0 indivíduo a ser tratado pode ser qualquer animal de sangue quente, mas em particular é um mamífero, e mais particularmente um ser humano. Como será evidente para o perito, o indivíduo a tratar deve em particular ser uma pessoa que sofra de, ou em risco de sofrer, das doenças e distúrbios aqui mencionados.

Numa outra forma de realização, a invenção relaciona-se com o uso de um método para imunoterapia, e em particular para imunoterapia passiva, cujo método compreende administrar, a um indivíduo que sofra ou em risco de sofrer das doenças ou distúrbios aqui mencionados, uma quantidade farmaceuticamente ativa de uma proteína de fusão ou construção da invenção, e/ou de uma composição farmacêutica compreendendo a mesma. A proteína de fusão ou construção e/ou as composições compreendendo a mesma são administradas de acordo com um regime de tratamento que seja adequado para prevenir e/ou tratar a doença ou distúrbio a ser prevenido ou tratado. 0 clínico deverá geralmente ser capaz de determinar um regime de tratamento adequado, dependendo de fatores tais como a doença ou distúrbio a ser prevenido ou tratado, da gravidade da doenças a ser tratada e/ou da gravidade dos sintomas desta, do Nanocorpo ou do polipéptido específicos 26 da invenção a serem usados, da via administração especifica e da formulação ou composição farmacêutica a ser usada, da idade, do género, peso, dieta, condição geral do doente, e fatores similares bem conhecidos do clínico.

Geralmente, o regime de tratamento deve compreender a administração de uma ou mais proteínas de fusão ou construções da invenção, ou de uma ou mais composições compreendendo as mesmas, numa ou mais quantidades ou doses farmaceuticamente eficazes. As quantidades ou doses específicas a administrar podem ser determinadas pelo clínico, novamente com base nos fatores citados acima. Geralmente, para a prevenção e/ou tratamento das doenças e distúrbios aqui mencionados e dependendo da doença ou distúrbio específico a ser tratado, a potência e/ou a meia vida das proteínas de fusão ou construções específicas a usar, da via de administração específica e da composição ou formulação farmacêutica específica usada, dos nanocorpos e dos polipéptidos da invenção deverá geralmente ser administrada numa quantidade entre 1 grama e 0,01 microgramas por kg de peso corporal por dia, preferencialmente entre 0,1 gramas e 0,1 microgramas por kg de peso corporal por dia, tal como cerca de 1, 10, 100 ou 1000 microgramas por kg de peso corporal por dia, quer continuadamente (e.g. por infusão), como uma dose única diária ou como múltiplas doses divididas durante o dia. O clínico deverá geralmente ser capaz de determinar uma dose diária adequada, dependendo dos fatores aqui mencionados. Será evidente que em casos específicos, o clínico pode escolher desviar-se destas quantidades, por exemplo com base nos fatores citados acima e na sua experiência. Geralmente, alguns guias das doses a serem administradas podem ser obtidas a partir de quantidades usualmente administradas para fragmentos de anticorpo ou anticorpos 27 convencionais comparáveis contra o mesmo alvo administrados através essencialmente da mesma via, tendo em conta porém diferenças na afinidade/avidez, eficácia, biodistribuição, meia vida e fatores similares bem conhecidos do perito.

Usualmente, no método acima, deve ser usado um único Nanocorpo ou polipéptido da invenção. Está no âmbito da invenção o uso de dois ou mais Nanocorpos e/ou polipéptidos da invenção em combinação.

Os Nanocorpos e os polipéptidos da invenção podem também ser usados em combinação com um ou mais compostos ou princípios farmaceuticamente ativos adicionais, i.e. como um regime de tratamento combinado, o qual pode ou não conduzir a um efeito sinérgico. Novamente, o clinico deverá ser capaz de selecionar esses compostos ou princípios adicionais, assim como o regime de tratamento combinado adequado, com base nos fatores citados acima com base na sua experiência.

Em particular, os Nanocorpos e os polipéptidos da invenção podem ser usados em combinação com outros compostos ou princípios farmaceuticamente ativos que podem ser usados para a prevenção e/ou tratamento das doenças ou distúrbios que podem ser prevenidos ou tratados com as proteínas de fusão ou construções da invenção, e em resultado dos quais um efeito sinérgico pode ou não ser obtido. A eficácia do regime de tratamento usado de acordo com a invenção pode ser determinada e/ou seguida por qualquer modo conhecido em si para a doença ou distúrbio envolvidos, como será evidente para o clínico. 0 clínico deverá ser também capaz, onde apropriado e ou numa base caso a caso, de mudar ou modificar um regime de tratamento particular, 28 de modo a atingir o desejado efeito terapêutico, evitar, limitar ou reduzir efeitos secundários não desejados, e/ou atingir um equilíbrio terapêutico apropriado entre atingir o desejado efeito terapêutico por um lado e evitar, limitar ou reduzir efeitos secundários indesejados por outro lado.

Geralmente, o regime de tratamento deve ser seguido até o desejado efeito terapêutico ser atingido e/ou ao longo do tempo em que o efeito terapêutico desejado é para ser mantido. Novamente, isto pode ser determinado pelo clínico. 0 indivíduo a ser tratado pode ser qualquer animal de sangue quente, mas em particular um mamífero, e mais particularmente um ser humano. Como será evidente para o perito, o indivíduo a ser tratado deve em particular ser uma pessoa que sofre de, ou em risco de, as doenças ou distúrbios mencionados acima.

Parte experimental

Exemplo 1: Identificação de Nanocorpos específicos da albumina de soro

Os Nanocorpos específicos da albumina foram identificados a partir de um lama imunizado com albumina de soro humana. 0 rastreio dos nanocorpos individuais foi realizado por ELISA usando albumina humana, de macacos Rhesus e de rato, produzindo um painel de Nanocorpos de reação cruzada com a albumina de soro de várias espécies.

Exemplo 2: Análise em Biacore A ligação dos Nanocorpos a albumina de soro foi caracterizada por ressonância plasmónica de superfície num instrumento Biacore 3000. A albumina de soro das diferentes espécies ligou-se covalentemente à superfície dos chips de 29 sensor CM5 via acoplamento de amina até que um aumento de 250 unidades de resposta fosse atingido. Os grupos reativos restantes foram inativados. A ligação do Nanocorpo foi medida a uma concentração (1 em 20 diluído). Cada Nanocorpo foi injetado durante 4 minutos a uma taxa de fluxo de 45 μΐ/min para permitir a ligação ao antigénio ligado ao chip. 0 tampão de ligação sem Nanocorpos foi lançado sobre o chip à mesma taxa de fluxo para permitir a dissociação espontânea do nanocorpo ligado durante 4 horas. Os valores Koff foram calculados a partir dos sensorgramas obtidos para os diferentes nanocorpos. Os nanocorpos testados são classificados de acordo com os valores koff, ver Tabela IV a seguir: 30

Tabela IV:

Numa experiência de acompanhamento, a ligação foi avaliada como descrito acima exceto que foram usadas séries de diferentes concentrações. Cada concentração foi injetada durante 4 minutos a uma taxa de fluxo de 45 μΐ/min para permitir a ligação ao antigénio ligado a chip. O tampão de ligação sem analito foi enviado sobre o chip à mesma taxa de fluxo para permitir a dissociação do nanocorpo ligado. Após 15 minutos, o analito ligado restante foi removido por injeção da solução de regeneração (25 mM NaOH). A partir dos sensorgramas obtidos para as diferentes concentrações de cada analito os valores KD foram calculados via afinidade de estado estacionário quando o equilíbrio foi alcançado.

Os resultados estão sumariados na Tabela V. A reatividade cruzada é observada para ALB1 E ALB2. A afinidade mais alta é observada para ALB2 em TNFa humano e de macacos Rhesus. Porém, a diferença de afinidade para a albumina de soro humana/macacos Rhesus versus rato é mais pronunciada para ALB2 (fator 400), enquanto que para ALB1 é observada uma diferença de um fator 12. 31

Tabela V:

Albumina humana Albumina de macaco jRhesus Albumina de rato ALB1 KD (nM) 0, 57 | 0,52 6,5 ~~ ka (1/Ms) kd (1/s) 1,11E+06 6,30E-04 \l,05E+06 |5,46E-04 1,11E+06 7,25E-03 ALB2 KD (nM) 0,092 \0,036 15,7 ka (1/Ms) kd (1/s) 8,15E+05 7,52E-05 \l,94E+06 | 7,12E-05 1,95E+05 3,07E-03

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> <120> <130> <160> <17 0> <210> <211> <212> <213> <400>

Ablynx N.V.

Proteínas de ligação a albumina de soro P 06-008 PCT 64

Patentln version 3.1 1 30

PRT

Artificial 1

Ala Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Gly Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Phe Asp 20 25 30

<210> <211> <212> <213> <400> Glu I 2 30

PRT

Artificial 2

Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Glu Gly Gly 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Trp Asp 20 25 30 32 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <400> 3

Ala Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Asn 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg 20 25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <400> 4

Ala Vai Gin Leu Vai Asp Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Gly 20 25 30 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <400> 5

Ala Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg 20 25 30 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <400> 6

Gin Vai Gin Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly 20 25 30 33 <2 10> 7 <2 11> 30 <2 12> PRT <2 13> Artificial <4 00> 7

Gin Vai Gin Leu Vai Glu 1 5

Ser Gly Gly

Gly Leu Vai 10

Gin Pro Gly Gly 15

Gly Phe Thr Phe Ser 30

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <2 10 > 8 <2 11 > 5 <2 12 > PRT <2 13 > Artificial <4 00 > 8

Leu Asn Leu Met Gly 1 s <2 10> 9 <2 11> 5 <2 12> PRT <2 13> Artificial <4 00> 9

Ile Asn Leu Leu Gly 1 5 <2 10> 10 <2 11> 5 <2 12> PRT <2 13> Artificial <4 00> 10

Ser Phe Gly Met Ser 1 5 <2 10> 11 <2 11> 5 <2 12> PRT <2 13> Artificial <4 00> 11

Ser Phe Gly Met Ser 1 5 34 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial 34 <4 0 0> 12 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <400> 13

Ser Phe Gly Met Ser 1 5

<210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <4 Ο 0> 14

Asn Tyr Trp Met Tyr 1 5

<210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <4 O 0> 15

Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Vai Ala 15 10 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <400> 16

Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Vai Ala 15 10 <210> 17 <211> 14 35 <212> PRT <213> Artificial <400> 17 Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210 > 18 <211 > 14 <212> PRT <213> Artificial <400> 18 Trp Vai Arg Gin Tyr Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <400> 19 Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Asp Gin Glu Trp Vai Ser 1 5 10 <210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <4 0 0> 20 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <400> 21 Trp Val Arg Val Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Ile Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <400> 22 36

Thr Cys Ile Thr Vai Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 15 10 15

Gly <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <400> 23

Thr Ile Thr Vai Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys Gly 15 10 15 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <400> 24

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 15 10 15

Gly <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <400> 25

Ser Ile Asn Gly Arg Gly Asp Asp Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 15 10 15

Gly <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <400> 26

Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 15 10 15

Gly 37 <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <400> 27

Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 15 10 15

Gly <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <400> 28

Arg Asp Ile Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 15 10 15

Lys Gly <210> 29 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <400> 29

Arg Phe Thr Ile Ser Met Asp Tyr Thr Lys Gin Thr Vai Tyr Leu His 15 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Lys Ile 20 25 30 <210> 30 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <400> 30

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Asp Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 15 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Lys Ile 20 25 30 38 <210> 31 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <400> 31

Arg phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gin 15 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Thr ile 20 25 30 <210> 32 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <400> 32

Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 15 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Glu Tyr Tyr Cys Thr Ile 20 25 30 <210> 33 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <400> 33

Arg phe Thr ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Leu Tyr Leu Glu 15 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Vai Ile 20 25 30 <210> 34 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <400> 34 39

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Leu Tyr Leu Glu 15 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr cys Vai Ile 20 25 30 <210> 35 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <400> 35

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 15 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys 20 25 30 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <400> 3 6

Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <400> 37

Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu 1 5 <210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <400> 38

Gly Gly Ser Leu Ser Arg 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial 40 <400> 39

Gly Arg Ser Vai Ser Arg Ser 1 5 <2 10> 40 <2 11> 5 <2 12> PRT <2 13> Artificial <4 00> 40

Gly Arg Gly Ser Pro 1 5 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <400> 41 Gly Arg Gly Ser Pro 1 5 <210> 42 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <4 0 0> 42 Asp Arg Glu Ala Gin Vai Asp Thr Leu Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <4 0 0> 43 Trp Gly Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 1 5 10 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <400> 44 41

Trp Gly Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 15 10 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <400> 45

Ser Ser Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 1 5 10 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <4 0 0> 46 Arg Thr Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 1 5 10 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <4 0 0> 47 Ser Ser Pro Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 1 5 10 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <4 0 0> 48

Ala Ser Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 15 10 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <400> 49 42

Arg Gly Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 1 5 10 <210> 50 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <400> 50

Ala Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Gly Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Phe Asp Leu Asn 20 25 30

Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Vai 35 40 45

Ala Thr Cye Ile Thr Vai Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Met Asp Tyr Thr Lys Gin Thr Vai Tyr 65 70 75 80

Leu His Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95

Lys Ile Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu Trp Gly Gin Gly Thr Gin 100 105 110

Vai Thr val Ser Ser 115 <210> 51 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <400> 51 43

Glu Vai Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Glu Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Trp Asp Ile Asn 20 25 30 Leu Leu Gly Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Asp Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Lys 85 90 95 Ile Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val 100 105 110

Thr Vai Ser Ser 115 <210> 52 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <400> 52 44

Ala Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Asn 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30

Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Ser ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Gin Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser 115 <210> 53 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <400> 53 45 Ala Vai Gin Leu Vai Asp Ser Gly Gly Gly Leu 15 10

Vai Gin Pro Gly Gly 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala ser Gly Phe 20 25

Ser Phe Gly Ser Phe 30

Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Tyr Pro Gly Lys 35 40

Glu Pro Glu Trp Vai 45

Ser Ser Ile Asn Gly Arg Gly Asp Asp Thr Arg 50 55

Tyr Ala Asp Ser Vai 60

Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala 65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr 85 90

Ala Glu Tyr Tyr Cys 95

Thr Ile Gly Arg Ser Vai Ser Arg Ser Arg Thr 100 105

Gin Gly Thr Gin Vai 110

Thr Vai Ser Ser 115 <210> 54 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <400> 54

Ala Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu 15 10

Vai Gin Pro Gly Gly 15 46

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30

Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Asp Gin Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 val Ile Gly Arg Gly Ser Pro Ser Ser Pro Gly Thr Gin Vai Thr Vai 100 105 110

Ser Ser <210> 55 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <400> 55

Gin Val Gin Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Phe 20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Leu Tyr 65 70 75 80 47

Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Vai Ile Gly Arg Gly Ser Pro Ala Ser Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai 100 105 110

Ser Ser <210> 56 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <400> 56

Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Trp Met Tyr Trp Vai Arg Vai Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Ile 35 40 45

Ser Arg Asp Ile Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 55 60

Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Lys Asp Arg Glu Ala Gin Vai Asp Thr Leu Asp Phe Asp Tyr 100 105 110

Arg Gly Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 57 <211> 115 48 <212> PRT <213> Artificial <4Ο0> 57

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30

Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Gin Vai Thr 100 105 lio

Val Ser Ser 115 <210> 58 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <400> 58

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 49

Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Gin Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser 115 <210> 59 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <400> 59

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30

Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 50

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Gin Vai Thr 100 105 no

Vai Ser Ser 115 <210> 60 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <400> 60

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Asn 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30

Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser 115 <210> 61 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <400> 61 51

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Asn 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30

Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser 115 <210> 62 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <400> 62

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Asn 15 10 15

Ser Leu Arg

Gly Met Ser 35

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30

Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 40 45 52

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser 50 55

Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Vai 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70

Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro 85

Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg 100

Ser Ser Gin Gly Thr Leu Vai Thr 105 110

Vai Ser Ser 115 <210> 63 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <4 0 0> 63

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Asn 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30

Gly Met Ser Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp vai 35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser 115 53 <210> 64 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <400> 64

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Asn 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30

Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser 115

Lisboa, 6 de Março de 2012

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Sequência de aminoácidos que é uma sequência de imunoglobulina que é capaz de se ligar a albumina de soro humano e que consiste de 4 regiões estruturais, FR1 até FR4 respetivamente, e 3 regiões determinantes de complementaridade, CDR1 até CDR3 respetivamente, nas quais: (i) CDR1 compreende ou é a sequência de aminoácidos SFGMS; CDR2 compreende ou é a sequência de aminoácidos SISGSGSDTLYADSVKG; e CDR3 compreende ou é a sequência de aminoácidos GGSLSR e em que (ii) a sequência de aminoácidos tem pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95%, ainda mais preferencialmente pelo menos 99% de identidade de sequência com pelo menos uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NO's 52 e 57 até 64; e (iii) a sequência de aminoácidos é a sequência PMP6A6 de acordo com a SEQ ID NO: 52, ou uma variante humanizada da sequência PMP6A6 de acordo com a SEQ ID NO: 52.

2. Sequência de aminoácidos de acordo com a reivindicação 1, que é uma variante humanizada da sequência PMP6A6 de acordo com a SEQ ID NO: 52.

3. Sequência de aminoácidos de acordo com a reivindicação 2, a qual é escolhida a partir do grupo compreendendo os clones ALB 3 de acordo com a SEQ ID NO: 57; ALB 4 2 de acordo com a SEQ ID NO: 58/ ALB 5 de acordo com a SEQ ID NO: 59; ALB 6 de acordo com a SEQ ID NO: 60; ALB 7 de acordo com a SEQ ID NO: 61; ALB 8 de acordo com a SEQ ID NO: 62; ALB 9 de acordo com a SEQ ID NO: 63; e ALB 10 de acordo com a SEQ ID NO: 64.

4. Sequência de aminoácidos de acordo com a reivindicação 3, que é ALB 8 de acordo com a SEQ ID NO: 62.

5. Sequência de aminoácidos de acordo com a reivindicação 1 ou 2, a qual é o único anticorpo de domínio ou um nanocorpo.

6. Proteína de fusão ou construção, a qual compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer das reivindicações 1-5 e pelo menos uma porção terapêutica.

7. Proteína de fusão ou construção de acordo com a reivindicação 6, na qual a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer das reivindicações 1-5 está ou diretamente ligada a pelo menos uma porção terapêutica ou está ligada a pelo menos uma porção terapêutica via um ligante ou espaçador.

8. Proteína de fusão ou construção de acordo com a reivindicação 6 ou 7, na qual a porção terapêutica compreende uma sequência de imunoglobulina ou um fragmento desta.

9. Proteína de fusão ou construção de acordo com a reivindicação 8, na qual a porção terapêutica compreende um anticorpo de domínio, preferencialmente um único anticorpo de domínio. 3

10. Construção de nanocorpos multivalentes e multiespecíficas, compreendendo pelo menos uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer das reivindicações 1-5 a qual é um nanocorpo e pelo menos um nanocorpo adicional.

11. Construção de nanocorpos multivalentes e multiespecíficos de acordo com a reivindicação 10, na qual a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer das reivindicações 1-5 que é um nanocorpo está ou diretamente ligada a pelo menos um nanocorpo adicional ou está ligada ao pelo menos um nanocorpo adicional via um ligante ou espaçador.

12. Construção de nanocorpos multivalentes e multiespecíficos de acordo com a reivindicação 11, na qual a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer das reivindicações 1-5 que é um nanocorpo está ligada a pelo menos um nanocorpo adicional via um ligante ou espaçador, e na qual o ligante é uma sequência de aminoácidos.

13.Sequência de nucleótidos ou ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos, proteína de fusão ou construção de acordo com qualquer das reivindicações 1-12.

14.Hospedeiros ou células hospedeiras que contêm uma sequência de nucleótidos ou ácido nucleico de acordo com a reivindicação 13, e/ou que expressam, ou são capazes de expressar, uma sequência de aminoácidos, proteína de fusão ou construção de acordo com qualquer das reivindicações 1-12. 4

15. Método para preparar uma sequência de aminoácidos, proteína de fusão ou construção de acordo com qualquer das reivindicações 1-12, cujo método compreende cultivar ou manter uma célula hospedeira como aqui descrito sob condições de modo a que a referida célula hospedeira produza ou expresse uma sequência de aminoácidos, proteína de fusão ou construção de acordo com qualquer das reivindicações 1-12, e opcionalmente compreende adicionalmente isolar a sequência de aminoácidos, a proteína de fusão ou a construção assim produzidas.

16. Composição farmacêutica que compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos, proteína de fusão ou construção de acordo com qualquer das reivindicações 1-12, e opcionalmente pelo menos um transportador farmaceuticamente aceitável, diluente ou excipiente.

17. Uso de uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 5 como um parceiro de fusão com vista a aumentar a meia vida das porções terapêuticas.

18. Método para aumentar a meia vida da porção terapêutica compreendendo o uso de uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 5 como parceiro de fusão. Lisboa, 6 de Março de 2012