TW202241947A - 包含靶向磷脂醯肌醇蛋白聚糖—３和ｔ細胞受體的免疫球蛋白單可變結構域的多肽 - Google Patents
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Abstract
本發明技術旨在提供用於治療患有癌症的受試者的新型藥物。具體地，所述技術提供包含至少四個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）的多肽，其特徵在於一個ISVD結合至TCR且至少兩個ISVD結合至GPC3。本發明技術還提供核酸、載體和組成物。
Description
本發明技術涉及靶向磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）和T細胞受體（TCR）的多肽。本發明技術還涉及編碼所述多肽的核酸分子和包含所述核酸的載體，以及包含所述多肽、核酸或載體的組成物。所述技術還涉及用於治療患有涉及異常細胞如癌性細胞或感染細胞的疾病的受試者的方法中的這些產品。此外，所述技術涉及產生這些產品的方法。
細胞毒性T細胞（CTL）是殺傷癌細胞、被感染細胞（特別是被病毒感染）或以其他方式受損的細胞的T淋巴細胞。T淋巴細胞（也稱為T細胞）在細胞表面上表現T細胞受體（TCR）和CD3受體。αβ TCR-CD3複合物（或」「TCR複合物」）由六種不同的I型單一跨膜蛋白構成：形成負責配體識別的TCR異二聚體的TCRα和TCRβ鏈，以及帶有胞質序列基序的非共價締合的CD3γ、CD3δ、CD3ε和ζ鏈，所述胞質序列基序在受體活化時發生酪胺酸磷酸化並募集大量信號傳導組分（Call等人 2004, Molecular Immunology 40: 1295-1305）。
異二聚T細胞受體（TCR）的α鏈和β鏈二者都是由恆定結構域和可變結構域組成。T細胞在由自身MHC分子呈獻的同源肽的TCR識別時被活化，伴隨由酪胺酸磷酸化的CD3複合物活化的訊號傳遞，從而導致T細胞增殖和分化。
雙特異性抗體已經被工程化，其在一個臂（目標結合臂）上具有腫瘤識別部分，而所述分子的另一個臂具有對T細胞抗原（通常是CD3）的特異性（效應子結合臂）。這些雙特異性抗體，即所謂的T細胞接合器（TCE），是增強患者對惡性細胞的免疫反應的多重靶向分子。多特異性抗體與T細胞和腫瘤細胞的共接合導致所述T細胞與所述腫瘤細胞之間的溶細胞性突觸的形成，所述溶細胞性突觸誘發T細胞活化並導致腫瘤細胞殺傷。
儘管大多數活化T細胞的雙特異性抗體靶向T細胞上的CD3複合物，但是一些靶向αβ T細胞受體的恆定結構域的雙特異性結合物已經描述於WO 2016/180969 A1中。
磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）是GPI錨定的細胞表面糖蛋白，其由硫酸乙醯肝素GAG鏈和核心蛋白組成。其牽涉於胚胎發生和早期發育中，控制細胞生長和分化。儘管GPC3的表現在發育期間高，但其表現在正常成年組織中幾乎不存在，且在腎近端小管和支氣管細胞中具有中/低表現。與其在早期發育中的作用一致，在胎盤中也表現高水準的GPC3。
GPC3經由多種訊號傳遞級聯類似地調節早期發育，所述訊號傳遞級聯包括Wnt、Hh和YAP途徑。另外，GPC3能夠與基本生長因子如FGF2相互作用以調節細胞生長。在實驗環境中，GPC3的過表現可以抑制FGF2誘導的細胞增殖。相比之下，GPC3還負調節抑制性生長因子BMP7。總之，GPC3的活性可能與背景高度相關，因為其不僅能夠抑制細胞增殖，還可以在肝癌和其他形式的癌症中促進致癌作用。
GPC3表現在來自肝細胞癌（HCC）的腫瘤組織中尤其普遍，所述疾病具有顯著未滿足的需求。可溶GPC3在HCC患者的血清中也可以被檢測到，並且已經用於區分肝病與不同的病原學。
已經提出了多種形式的雙特異性抗體構建體。例如，雙特異性抗體形式可能涉及兩種抗體或其片段的化學綴合（Brennan, M等人, Science, 1985. 229(4708): 第81-83頁；Glennie, M. J.等人, J Immunol, 1987. 139(7): 第2367-2375頁）。
然而，這樣的雙特異性抗體形式的缺點包括高分子量和在高濃度下的高粘度，使得例如皮下投予具有挑戰性，並且缺點在於每個結合單元需要兩個可變結構域的相互作用以實現特異性和高親和力結合，這對多肽穩定性和生產效率有影響。這樣的雙特異性抗體形式也可能潛在地導致與低生產效率和低效價和/或輕鏈錯配或重鏈錯配相關的CMC問題。
因此，存在對以足夠親和力結合目標細胞和T細胞二者以誘發細胞毒性反應的抗體構建體的需要。同時，這樣的構建體不應誘導對非目標細胞的細胞毒性反應，所述非目標細胞即不表現靶抗原或僅以低水準表現靶抗原的細胞。由此，可以在功效與安全性之間達成平衡。另外可期望，這樣的構建體可以例如在微生物宿主中有效產生。這樣的構建體應理想地還在要治療的受試者中展現足夠長以使得可以方便地間隔開連續治療的半衰期。此外，可期望限制這樣的構建體與要治療的受試者中預先存在的抗體（即在首次用抗體構建體治療之前存在於受試者中的抗體）的反應性。此外，所述多肽應不發揮不期望的副作用或僅發揮極小不期望的副作用，例如由對非目標細胞的細胞毒性活性引起的副作用。
本案發明人發現，同時特異性靶向GPC3和TCR的多肽在體外導致對GPC3表現細胞的有效的T細胞介導的殺傷。所述多肽可以被有效產生（例如在微生物宿主中）。此外，可以顯示這樣的多肽展現與要治療的受試者中的預先存在的抗體（即，在首次用抗體構建體治療之前存在於受試者中的抗體）的有限反應性。在較佳實施例中，這樣的多肽在要治療的受試者中展現足夠長以使得可以方便地間隔開連續治療的半衰期。此外，這樣的多肽僅顯示對不表現GPC3或表現低水準GPC3的細胞的有限活性。這表明了誘發針對GPC3陽性癌症目標細胞的高特異性的T細胞介導的細胞毒性反應，同時展現有利的安全性概況的可能性。
在一態樣，所述多肽包含至少三個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成，其中至少兩個ISVD特異性結合至GPC3並且一個ISVD特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域。較佳地，特異性結合至GPC3的所述至少兩個ISVD特異性結合至人GPC3，並且特異性結合至TCR的所述ISVD特異性結合至人TCR。更佳地，特異性結合至GPC3的所述至少兩個ISVD是不同的ISVD。在另一態樣，包含至少三個ISVD或由其組成的所述多肽較佳地還包含一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元任選地經由一或多個肽連接子來連接，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。例如，所述結合單元可以是結合至血清蛋白、較佳地結合至人血清蛋白如人血清白蛋白的ISVD。
在一態樣，本發明技術提供一種包含特異性結合至GPC3的至少一個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成的多肽。在另一實施例中，本發明技術的多肽包含特異性結合至GPC3的至少兩個ISVD或由其組成，其中所述兩個ISVD任選地經由肽連接子來連接。較佳地，特異性結合至GPC3的所述兩個ISVD是不同的ISVD。此外，所述多肽較佳地還包含一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元任選地經由一或多個肽連接子來連接，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。例如，所述結合單元可以是結合至血清蛋白、較佳地結合至人血清蛋白如人血清白蛋白的ISVD。
在另一態樣，本發明技術的多肽包含特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域的ISVD和特異性結合至GPC3的至少一個ISVD或由其組成，其中所述兩個ISVD任選地經由肽連接子來連接。這樣的多肽可以用於重定向T細胞用於表現GPC3的細胞的殺傷。理想地，結合至TCR的ISVD是特異性結合至例如人T細胞的所述多肽中包含的唯一結合部分。此外，實例顯示，在特異性結合至TCR的ISVD位於這樣的多肽的N末端處時，與相同抗TCR ISVD不位於所述N末端處時相比，實現更好的T細胞介導的細胞毒性。特異性結合至TCR的ISVD因此較佳地位於特異性結合至GPC3的至少一個ISVD的N末端。最佳地，特異性結合至TCR的ISVD位於包含所述ISVD的多肽的N末端。此外，所述多肽較佳地還包含一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元任選地經由一或多個肽連接子來連接，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。例如，所述結合單元可以是結合至血清蛋白、較佳地結合至人血清蛋白如人血清白蛋白的ISVD。
還提供一種能夠表現所述多肽的核酸分子、一種包含所述核酸的核酸或載體以及一種包含所述多肽、所述核酸或所述載體的組成物。所述組成物較佳地是醫藥組成物。
還提供一種包含編碼如本文所公開的多肽的核酸或載體的宿主細胞或（非人）宿主。
進一步提供一種用於產生如本文所公開的多肽的方法，所述方法至少包括以下步驟：
a. 在合適的宿主細胞或宿主生物體中或在另一種合適的表現系統中表現編碼所述多肽的核酸序列；任選地之後進行：
b. 分離和/或純化所述多肽。
此外，本發明技術提供所述多肽、包含所述多肽的組成物或者包含含有編碼所述多肽的核苷酸序列的核酸或載體的組成物，用作藥物。較佳地，所述多肽或組成物用於癌症的治療，如肝癌或肺癌。
另外，提供一種治療癌症的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者投予醫藥活性量的根據本公開文本的多肽或組成物。所述癌症較佳地選自肝癌或肺癌。在一些實施例中，所述方法還包括投予一種或多種另外的治療劑。
進一步提供所述多肽或組成物在用於治療癌症（較佳地肝癌或肺癌）的醫藥組成物的製備中的用途。
特別地，本發明技術提供以下實施例：
實施例1. 一種包含至少三個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成的多肽，其中所述ISVD中的每一個包含三個互補決定區（分別是CDR1至CDR3），其中所述至少三個ISVD任選地經由一或多個肽連接子來連接，並且其中：
a) 第一ISVD包含
i. 作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 6的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 10的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3；
b) 第二ISVD包含
iv. 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
v. 作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
vi. 作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3；並且
c) 第三ISVD包含
vii. 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
viii. 作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
ix. 作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，
其中所述ISVD的順序指示從所述多肽的N末端至C末端來看，所述ISVD與彼此的相對位置，其中所述第一ISVD任選地位於所述多肽的N末端處。
實施例2. 根據實施例1所述的多肽，其中：
a) 所述第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3；
b) 所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3；並且
c) 所述第三ISVD包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3。
實施例3. 根據實施例1或2中任一項所述的多肽，其中：
a) 所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 2超過90%的序列同一性；
b) 所述第二ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 3超過90%的序列同一性；並且
c) 所述第三ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 4超過90%同一性的序列同一性。
實施例4. 根據實施例1至3中任一項所述的多肽，其中：
a) 所述第一ISVD由SEQ ID NO: 2的胺基酸序列組成；
b) 所述第二ISVD由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成；並且
c) 所述第三ISVD由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成。
實施例5. 根據實施例1至4中任一項所述的多肽，其中所述第一ISVD和所述第二ISVD經由由少於10個胺基酸、較佳地少於6個胺基酸組成的連接子彼此連接，其中所述連接子最佳地是5GS連接子。
實施例6. 根據實施例1至5中任一項所述的多肽，其中所述多肽還包含一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元任選地經由一或多個肽連接子來連接，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。
實施例7. 根據實施例6所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元選自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可以結合至血清蛋白的結合單元、Fc部分以及可以結合至血清蛋白的小蛋白或肽。
實施例8. 根據實施例6或7中任一項所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他結合單元選自可以結合至血清白蛋白（如人血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（如IgG）的結合單元。
實施例9. 根據實施例8所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述結合單元是結合至人血清白蛋白的ISVD。
實施例10. 根據實施例9所述的多肽，其中結合至人血清白蛋白的所述ISVD包含
i. 作為SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 9的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 13的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 17的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3。
實施例11. 根據實施例9或10中任一項所述的多肽，其中結合至人血清白蛋白的所述ISVD包含作為SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3。
實施例12. 根據實施例9至11中任一項所述的多肽，其中結合至人血清白蛋白的所述ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 5超過90%的序列同一性。
實施例13. 根據實施例9至12中任一項所述的多肽，其中結合至人血清白蛋白的所述ISVD由SEQ ID NO: 5的胺基酸序列組成。
實施例14. 根據實施例1至13中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含展現與SEQ ID NO: 1超過90%的序列同一性的胺基酸序列或由其組成。
實施例15. 根據實施例1至14中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列或由其組成。
實施例16. 一種包含至少一個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成的多肽，其中所述ISVD包含三個互補決定區（分別是CDR1至CDR3），並且其中所述至少一個ISVD包含：
a) 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，或者
b) 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3。
實施例17. 根據實施例16所述的多肽，其中所述至少一個ISVD包含：
a) 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3，或者
b) 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3。
實施例18. 根據實施例16或17中任一項所述的多肽，其中所述至少一個ISVD的胺基酸序列包含：
a) 與SEQ ID NO: 3超過90%的序列同一性，或者
b) 與SEQ ID NO: 4超過90%同一性的序列同一性。
實施例19. 根據實施例16至18中任一項所述的多肽，其中所述至少一個ISVD包含以下或由以下組成：
a) SEQ ID NO: 3的胺基酸序列，或
b) SEQ ID NO: 4的胺基酸序列。
實施例20.一種包含至少兩個ISVD或由其組成的多肽，其中所述ISVD中的每一個包含三個互補決定區（分別是CDR1至CDR3），其中所述至少兩個ISVD任選地經由一或多個肽連接子來連接，並且其中：
a) 第一ISVD和第二ISVD包含
i. 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，
b) 第一ISVD和第二ISVD包含
i. 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，
c) 第一ISVD包含
i. 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且
第二ISVD包含
iv. 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
v. 作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
vi. 作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，
d) 第一ISVD包含
i. 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且
第二ISVD包含
iv. 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
v. 作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
vi. 作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，
e) 第一ISVD包含
i. 作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 6的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 10的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且
第二ISVD包含
iv. 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
v. 作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
vi. 作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，
f) 第一ISVD包含
i. 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且
第二ISVD包含
iv. 作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 6的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
v. 作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 10的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
vi. 作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，
g) 第一ISVD包含
i. 作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 6的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 10的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且
第二ISVD包含
iv. 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
v. 作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
vi. 作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，或者
h) 第一ISVD包含
i. 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且
第二ISVD包含
iv. 作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 6的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
v. 作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 10的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
vi. 作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，
其中所述ISVD的順序指示從所述多肽的N末端至C末端來看，所述ISVD與彼此的相對位置。
實施例21. 根據實施例20所述的多肽，其中：
a) 所述第一ISVD和所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3，
b) 所述第一ISVD和所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3，
c) 所述第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3，
d) 所述第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3，
e) 所述第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3，
f) 所述第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3，
g) 所述第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3，或者
h) 所述第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3。
實施例22. 根據實施例20或21中任一項所述的多肽，其中：
a) 所述第一ISVD和所述第二ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 3超過90%的序列同一性，
b) 所述第一ISVD和所述第二ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 4超過90%的序列同一性，
c) 所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 3超過90%的序列同一性，並且所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 4超過90%同一性的序列同一性，
d) 所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 4超過90%的序列同一性，並且所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 3超過90%同一性的序列同一性，
e) 所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 2超過90%的序列同一性，並且所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 3超過90%同一性的序列同一性，
f) 所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 3超過90%的序列同一性，並且所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 2超過90%同一性的序列同一性，
g) 所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 2超過90%的序列同一性，並且所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 4超過90%同一性的序列同一性，或者
h) 所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 4超過90%的序列同一性，並且所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 2超過90%同一性的序列同一性。
實施例23. 根據實施例20至22中任一項所述的多肽，其中：
a) 所述第一ISVD和所述第二ISVD由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成，
b) 所述第一ISVD和所述第二ISVD由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成，
c) 所述第一ISVD由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成，並且所述第二ISVD由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成，
d) 所述第一ISVD由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成，並且所述第二ISVD由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成，
e) 所述第一ISVD由SEQ ID NO: 2的胺基酸序列組成，並且所述第二ISVD由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成，
f) 所述第一ISVD由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成，並且所述第二ISVD由SEQ ID NO: 2的胺基酸序列組成，
g) 所述第一ISVD由SEQ ID NO: 2的胺基酸序列組成，並且所述第二ISVD由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成，或者
h) 所述第一ISVD由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成，並且所述第二ISVD由SEQ ID NO: 2的胺基酸序列組成。
實施例24. 根據實施例20至23中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含選自SEQ ID NO: 1、49-72和78-81的胺基酸序列或由其組成。
實施例25. 根據實施例16至24中任一項所述的多肽，其中所述多肽還包含一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元任選地經由一或多個肽連接子來連接，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。
實施例26. 根據實施例25所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元選自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可以結合至血清蛋白的結合單元、Fc部分以及可以結合至血清蛋白的小蛋白或肽。
實施例27. 根據實施例25至26中任一項所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他結合單元選自可以結合至血清白蛋白（如人血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（如IgG）的結合單元。
實施例28. 根據實施例27所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述結合單元是結合至人血清白蛋白的ISVD。
實施例29. 根據實施例28所述的多肽，其中結合至人血清白蛋白的所述ISVD包含
i. 作為SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 9的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 13的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 17的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3。
實施例30. 根據實施例28至29中任一項所述的多肽，其中結合至人血清白蛋白的所述ISVD包含作為SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3。
實施例31. 根據實施例28至30中任一項所述的多肽，其中結合至人血清白蛋白的所述ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 5超過90%的序列同一性。
實施例32. 根據實施例28至31中任一項所述的多肽，其中結合至人血清白蛋白的所述ISVD由SEQ ID NO: 5的胺基酸序列組成。
實施例33. 一種包含編碼根據實施例1至32中任一項、較佳地根據實施例1至15中任一項所述的多肽的核苷酸序列的核酸。
實施例34. 一種包含根據實施例33所述的核酸的宿主或宿主細胞。
實施例35. 一種用於產生根據實施例1至32中任一項、較佳地根據實施例1至15中任一項所述的多肽的方法，所述方法至少包括以下步驟：
a) 在合適的宿主細胞或宿主生物體中或在另一種合適的表現系統中表現根據實施例33所述的核酸；任選地之後進行：
b) 分離和/或純化根據實施例1至32中任一項、任選地根據實施例1至15中任一項所述的多肽。
實施例36. 一種包含至少一種根據實施例1至32中任一項、任選地根據實施例1至15中任一項所述的多肽或者根據實施例33所述的核酸的組成物。
實施例37. 根據實施例36所述的組成物，其是如下醫藥組成物，所述醫藥組成物還包含至少一種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，並且任選地包含一種或多種其他醫藥活性多肽和/或化合物。
實施例38. 根據實施例1至32中任一項、任選地根據實施例1至15中任一項所述的多肽或者根據實施例36或37所述的組成物，其用作藥物。
實施例39. 根據實施例1至32中任一項、任選地根據實施例1至15中任一項所述的多肽或者根據實施例36或37所述的組成物，其用於癌症、較佳地肝癌或肺癌的治療中。
實施例40. 根據實施例39所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述肝癌是肝細胞癌（HCC）。
實施例41. 根據實施例39所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述肺癌是非小細胞肺癌（NSCLC），較佳地鱗狀細胞癌（SCC）。
實施例42. 一種治療癌症、較佳地肝癌或肺癌的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者投予醫藥活性量的根據實施例1至32中任一項、較佳地根據實施例1至15中任一項所述的多肽或者根據實施例36或37所述的組成物。
實施例43. 根據實施例42所述的方法，其中所述肝癌是肝細胞癌。
實施例44. 根據實施例42所述的方法，其中所述肺癌是非小細胞肺癌（NSCLC），較佳地鱗狀細胞癌（SCC）。
實施例45. 根據實施例1至32中任一項、較佳地根據實施例1至15中任一項所述的多肽或者根據實施例36或37所述的組成物在藥物製備中的用途。
實施例46. 根據實施例1至32中任一項、較佳地根據實施例1至15中任一項所述的多肽或者根據實施例36或37所述的組成物用於製備治療癌症、較佳地肝癌或肺癌的醫藥組成物的用途。
實施例47. 根據實施例46所述的多肽或組成物的用途，其中所述肝癌是肝細胞癌。
實施例48. 根據實施例46所述的多肽或組成物的用途，其中所述肺癌是非小細胞肺癌（NSCLC），較佳地鱗狀細胞癌（SCC）。
本發明技術旨在提供用於治療癌症如肝癌或肺癌的新型藥物。
本案發明人發現，同時特異性靶向GPC3和TCR的多肽在體外導致對GPC3表現細胞的有效的T細胞介導的殺傷。所述多肽可以被有效產生（例如在微生物宿主中）。此外，可以顯示這樣的多肽展現與要治療的受試者中的預先存在的抗體（即，在首次用抗體構建體治療之前存在於受試者中的抗體）的有限反應性。在較佳實施例中，這樣的多肽在要治療的受試者中展現足夠長以使得可以方便地間隔開連續治療的半衰期。此外，這樣的多肽僅顯示對不表現GPC3或表現低水準GPC3的細胞的有限活性。這表明誘導針對GPC3陽性目標細胞的高特異性的T細胞介導的細胞毒性反應的可能性。
除上文外，本文公開的GPC3結合ISVD提供與人和食蟹猴GPC3的高親和力結合，並且因此可以容易地以單價或多價形式用於其中需要與GPC3的結合的其他應用。
5.1 多肽 單特異性 - 單價多肽
在一態樣，所述多肽是單特異性和單價的。
術語」「
單特異性」是指與一種（特定）類型的一或多個靶分子的結合。單特異性多肽由此特異性結合至GPC3。
術語」「
單價」指示存在僅一種（特異性）靶向分子如ISVD的結合單元/構建塊。
因此，在一態樣，本發明技術提供一種包含特異性結合至GPC3、較佳地人GPC3的一個ISVD或由其組成的單特異性-單價多肽，所述ISVD包含三個互補決定區（分別是CDR1至CDR3）。所述ISVD可以選自包含以下的ISVD：
a) 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3；或者
b) 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3。
較佳地，特異性結合至GPC3的所述ISVD選自包含以下的ISVD：
a) 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3；或者
b) 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3。
在所述技術的此方面的另一實施例中，特異性結合至GPC3的ISVD選自包含以下的ISVD：
a) 具有與SEQ ID NO: 3超過90%的序列同一性的胺基酸序列，較佳地其中所述ISVD包含SEQ ID NO: 3的胺基酸序列或由其組成；或者
b) 具有與SEQ ID NO: 4超過90%的序列同一性的胺基酸序列，較佳地其中所述ISVD包含SEQ ID NO: 4的胺基酸序列或由其組成。
在另一態樣，本發明技術提供一種包含特異性結合至T細胞上的TCR（較佳地人TCR）的恆定結構域的一個ISVD或由其組成的單特異性-單價多肽，所述ISVD包含三個互補決定區（分別是CDR1至CDR3）。所述ISVD可以是包含以下的ISVD：作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 6的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 10的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3。
較佳地，特異性結合至TCR的ISVD是包含以下的ISVD：作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3。
在所述技術的此方面的另一實施例中，特異性結合至TCR的ISVD是包含以下的ISVD：具有與SEQ ID NO: 2超過90%的序列同一性的胺基酸序列，較佳地其中所述ISVD包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列或由其組成。
這些單價化合物也可以用作多價和/或多特異性多肽的構建塊。
位於包含ISVD的（單價或多價）多肽的N末端的所述ISVD較佳地在其N末端處不展現麩胺酸（E）。因此，在位於所述多肽N末端的ISVD中，在位置1處的麩胺酸（E）典型地被天門冬胺酸（D）取代。因此，例如，如果SEQ ID NO: 3、4或5位於所述多肽的N末端處，那麼這些序列將典型地展現E1D取代。相反，如果SEQ ID NO: 2不位於N末端處，那麼這個序列將典型地展現D1E突變。因此，通常，SEQ ID NO: 2-5的第一位置可以是E或D，根據這些序列是否位於N末端處而定。在較佳實施例中，本發明技術的多肽中包含的第一ISVD的第一胺基酸是天門冬胺酸（D）。
單特異性 - 多價多肽
在另一態樣，所述多肽是單特異性的並且至少二價的，但是也可以是例如三價、四價、五價、六價等。
術語」「
二價」、」「
三價」、」「
四價」、」「
五價」或」「
六價」都落在術語」「
多價」的範圍內，並且分別指示兩個、三個、四個、五個或六個結合單元/構建塊如ISVD的存在。
因此，在一態樣，本發明技術提供一種包含特異性結合至GPC3、較佳地人GPC3的兩個ISVD或由其組成的單特異性-二價多肽，其中所述兩個ISVD中的每一個包含三個互補決定區（分別是CDR1至CDR3），其中所述兩個ISVD較佳地經由一或多個肽連接子來連接，並且其中：
a) 第一ISVD和第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3；
b) 第一ISVD和第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3；
c) 第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且
第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3；或者
d) 第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且
第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3。
較佳地，所述單特異性-二價多肽包含特異性結合至GPC3的兩個ISVD或由其組成，其中：
a) 所述第一ISVD和所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3；
b) 所述第一ISVD和所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3；
c) 所述第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3；或者
d) 所述第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3。
在所述技術的此方面的另一實施例中，所述單特異性-二價多肽包含特異性結合至GPC3的兩個ISVD或由其組成，其中：
a) 所述第一ISVD和所述第二ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 3超過90%的序列同一性，其中所述第一ISVD和所述第二ISVD較佳地由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成；
b) 所述第一ISVD和所述第二ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 4超過90%的序列同一性，其中所述第一ISVD和所述第二ISVD較佳地由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成；
c) 所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 3超過90%的序列同一性並且所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 4超過90%同一性的序列同一性，較佳地其中所述第一ISVD由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成並且所述第二ISVD由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成；或者
d) 所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 4超過90%的序列同一性並且所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 3超過90%同一性的序列同一性，較佳地其中所述第一ISVD由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成並且所述第二ISVD由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成。
就此而言，術語」「第一ISVD」和」「第二ISVD」僅指示具體列舉的結合至GPC3的ISVD與彼此的相對位置，其中編號是從多肽的N末端開始。因此，」「第一ISVD」比」「第二ISVD」更靠近N末端。因此，」「第二ISVD」由此比」「第一ISVD」更靠近C末端。因為編號不是絕對的並且僅指示兩個ISVD的相對位置，其不排除多肽中可能存在另外的結合單元/構建塊（如分別結合至GPC3、TCR或血清白蛋白的ISVD）的可能性。此外，其不排除可以將其他結合單元/構建塊如ISVD置於其間的可能性。例如，如下文進一步描述（特別參見，章節」「多特異性-多價多肽」和5.4」「（體內）半衰期延長」），所述多肽還可以包含可以甚至位於」「第一ISVD」與」「第二ISVD」之間的另一個結合至人血清白蛋白的ISVD（這樣的構建體隨後被稱為多特異性的，如後續章節中所述）。
在較佳實施例中，單特異性-多價多肽、特別是上述單特異性-二價多肽的（至少兩個）ISVD是經由肽連接子來連接。使用肽連接子來連接兩個或更多個（多）肽是業內熟知的。可以與單特異性-多價多肽、特別是與上述單特異性-二價多肽一起使用的示例性肽連接子顯示於表A-5中。一類常用肽連接子被稱為」「Gly-Ser」或」「GS」連接子。這些是基本上由甘胺酸（G）和絲胺酸（S）殘基組成的連接子，並且通常包含肽基序如GGGGS（SEQ ID NO: 100）基序的一或多個重複（例如，展現式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)
n，其中n可以是1、2、3、4、5、6、7或更大）。這樣的GS連接子的一些常用例子是9GS連接子（GGGGSGGGS，SEQ ID NO: 103）、15GS連接子（n=3）和35GS連接子（n=7）。例如，參考Chen等人, Adv. Drug Deliv. Rev. 2013年10月15日; 65(10): 1357-1369；以及Klein等人, Protein Eng. Des. Sel. (2014) 27 (10): 325-330。在一個實施例中，單特異性-多價多肽、特別是單特異性-二價多肽的ISVD經由表A-5中所示的連接子來連接。在一個實施例中，（至少）兩個ISVD經由35GS或9GS連接子來連接。在較佳實施例中，（至少）兩個ISVD經由一或多個9GS連接子來連接。
多特異性 - 多價多肽
在另一態樣，所述多肽是至少雙特異性的，但是也可以是例如三特異性、四特異性、五特異性等。此外，所述多肽是至少二價的，但是也可以是例如三價、四價、五價、六價等。
術語」「
雙特異性」、」「
三特異性」、」「
四特異性」、」「
五特異性」等都落在術語」「
多特異性」的範圍內，並且分別是指結合至兩個、三個、四個、五個等不同的靶分子。
術語」「
二價」、」「
三價」、」「
四價」、」「
五價」、」「
六價」等都落在術語」「
多價」的範圍內，並且分別指示兩個、三個、四個、五個、六個等結合單元/構建塊如ISVD的存在。
例如，所述多肽可以是雙特異性-二價的，如包含兩個ISVD或由其組成的多肽，其中一個ISVD特異性結合至GPC3並且一個ISVD特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域，其中所述GPC3和TCR較佳地是人GPC3和人TCR。所述多肽也可以是雙特異性-三價的，如包含三個ISVD或由其組成的多肽，其中兩個ISVD特異性結合至GPC3並且一個ISVD特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域，其中所述GPC3和TCR較佳地是人GPC3和人TCR。在另一個例子中，所述多肽可以是三特異性-四價的，如包含四個ISVD或由其組成的多肽，其中兩個ISVD特異性結合至人GPC3，一個ISVD特異性結合至T細胞上的人TCR的恆定結構域並且一個ISVD結合至人血清白蛋白。這樣的多肽可以同時是雙互補位的，例如在兩個ISVD結合人GPC3上的兩個不同表位的情況下。術語」「雙互補位」是指結合至同一靶分子的兩個不同部分（例如，表位）。較佳的三特異性-四價多肽是例如包含特異性結合至人GPC3的兩個ISVD的ISVD構建體A022600424，一個ISVD特異性結合至T細胞上的人TCR的恆定結構域，一個ISVD結合至人血清白蛋白，並且所述ISVD構建體對於結合至GPC3是雙互補位的。
在一個實施例中，本發明技術提供一種包含至少兩個ISVD或由其組成的雙特異性-二價多肽，其中所述ISVD中的每一個包含三個互補決定區（分別是CDR1至CDR3），其中所述至少兩個ISVD任選地經由一或多個肽連接子來連接，並且其中：
a) 第一ISVD包含
i. 作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 6的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 10的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且
第二ISVD包含
iv. 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
v. 作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
vi. 作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，
b) 第一ISVD包含
i. 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且
第二ISVD包含
iv. 作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 6的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
v. 作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 10的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
vi. 作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，
c) 第一ISVD包含
i. 作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 6的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 10的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且
第二ISVD包含
iv. 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
v. 作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
vi. 作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，或者
d) 第一ISVD包含
i. 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且
第二ISVD包含
iv. 作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 6的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
v. 作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 10的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
vi. 作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3。
在較佳實施例中，這樣的多肽包含或由其組成至少兩個ISVD，其中所述ISVD中的每一個包含三個互補決定區（分別是CDR1至CDR3），其中所述至少兩個ISVD任選地經由一或多個肽連接子來連接，並且其中
a) 所述第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3，
b) 所述第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3，
c) 所述第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3，或者
d) 所述第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3。
因此，這樣的多肽可以是多肽，其中：
a) 所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 2超過90%的序列同一性，並且所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 3超過90%同一性的序列同一性，
b) 所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 3超過90%的序列同一性，並且所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 2超過90%同一性的序列同一性，
c) 所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 2超過90%的序列同一性，並且所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 4超過90%同一性的序列同一性，或者
d) 所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 4超過90%的序列同一性，並且所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 2超過90%同一性的序列同一性。
較佳地，在這樣的多肽中：
a) 所述第一ISVD由SEQ ID NO: 2的胺基酸序列組成，並且所述第二ISVD由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成，
b) 所述第一ISVD由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成，並且所述第二ISVD由SEQ ID NO: 2的胺基酸序列組成，
c) 所述第一ISVD由SEQ ID NO: 2的胺基酸序列組成，並且所述第二ISVD由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成，或者
d) 所述第一ISVD由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成，並且所述第二ISVD由SEQ ID NO: 2的胺基酸序列組成。
在另一態樣，本發明技術提供一種三特異性-三價多肽，其包含上述的雙特異性-二價多肽和如下文所詳述的結合至人血清白蛋白的第三ISVD（章節5.4；」「（體內）半衰期延長」）。
在一個實施例中，本發明技術提供一種包含至少三個ISVD或由其組成的雙特異性-三價多肽，其中所述ISVD中的每一個包含三個互補決定區（分別是CDR1至CDR3），其中所述至少三個ISVD任選地經由一或多個肽連接子來連接，並且其中：
a) 第一ISVD特異性結合T細胞上的TCR的恆定結構域，並且包含作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 6的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 10的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3；
b) 第二ISVD特異性結合GPC3，並且包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3；並且
c) 第三ISVD特異性結合GPC3，並且包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，
其中由所述多肽結合的所述TCR和GPC3較佳地分別是人TCR和人GPC3。
在多特異性-多價多肽的較佳實施例中：
a) 所述第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3；
b) 所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3；並且
c) 所述第三ISVD包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3。
在多特異性-多價多肽的另一態樣：
a) 所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 2超過90%的序列同一性，其中較佳地所述第一ISVD由SEQ ID NO: 2的胺基酸序列組成；
b) 所述第二ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 3超過90%的序列同一性，其中較佳地所述第二ISVD由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成；並且
c) 所述第三ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 4超過90%同一性的序列同一性，其中較佳地所述第三ISVD由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成。
就此而言，術語」「第一ISVD」、」「第二ISVD」、」「第三ISVD」等僅指示所述ISVD與彼此的相對位置，其中編號是從多肽的N末端開始。因此，」「第一ISVD」比」「第二ISVD」更靠近N末端，而」「第二ISVD」比」「第三ISVD」更靠近N末端。因此，當從C末端來看時，ISVD排列是相反的。由於編號不是絕對的並且僅指示至少四個ISVD的相對位置，其不排除其他結合單元/構建塊（如另外的結合至GPC3的ISVD或結合至另一目標的ISVD）可能存在於多肽中。此外，其不排除可以將其他結合單元/構建塊如ISVD置於其間的可能性。例如，如下文進一步描述（特別參見，下文章節5.4」「（體內）半衰期延長」），所述多肽還可以包含另一個結合至人血清白蛋白的ISVD，其可以甚至位於例如」「第三ISVD」與」「第四ISVD」之間。
在另一態樣，本發明技術由此提供一種三特異性-四價多肽，其包含上述的雙特異性-三價多肽和如下文所詳述的結合至人血清白蛋白的第四ISVD（章節5.4；」「（體內）半衰期延長」）。
在較佳實施例中，結合至TCR的第一ISVD位於所述多肽的N末端。
在另一態樣，本發明技術提供一種雙特異性-二價多肽，其包含如上文針對單特異性-單價多肽所詳述的特異性結合至GPC3的ISVD（章節5.1；」「單特異性-單價多肽」）和如下文所詳述的結合至人血清白蛋白的ISVD（章節5.4；」「（體內）半衰期延長」）。
在另一態樣，本發明技術提供一種雙特異性-三價多肽，其包含上述的單特異性-二價多肽（章節5.1；」「單特異性-二價多肽」）和如下文所詳述的結合至人血清白蛋白的ISVD（章節5.4；」「（體內）半衰期延長」）。
本文所述的所述多特異性-多價多肽的組分（較佳地ISVD）可以通過一或多個合適的連接子如肽連接子彼此連接。
使用連接子來連接兩個或更多個（多）肽是業內熟知的。示例性肽連接子顯示於表A-5中。一類常用肽連接子被稱為」「Gly-Ser」或」「GS」連接子。這些是基本上由甘胺酸（G）和絲胺酸（S）殘基組成的連接子，並且通常包含肽基序如GGGGS（SEQ ID NO: 100）基序的一或多個重複（例如，展現式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)
n，其中n可以是1、2、3、4、5、6、7或更大）。這樣的GS連接子的一些常用例子是9GS連接子（GGGGSGGGS，SEQ ID NO: 103）、15GS連接子（n=3）和35GS連接子（n=7）。例如，參考Chen等人, Adv. Drug Deliv. Rev. 2013年10月15日; 65(10): 1357-1369；以及Klein等人, Protein Eng. Des. Sel. (2014) 27 (10): 325-330。在本文公開的一種或多種多肽中，使用5GS和9GS連接子將所述多肽的組分彼此連接是較佳的。較佳地，使用少於10個胺基酸、如少於6個胺基酸的連接子（特別是5GS連接子）將特異性結合至TCR的第一ISVD連接至特異性結合至GPC3的第二ISVD。
在多特異性-多價多肽的一態樣，包含至少三個ISVD或由其組成的多肽包含特異性結合至GPC3的至少兩個ISVD和特異性結合至TCR的一個ISVD。在所述技術的此方面，結合至TCR的ISVD經由5GS連接子被連接至結合至GPC3的至少兩個ISVD中的一個，而特異性結合至GPC3的至少兩個ISVD經由9GS連接子彼此連接。在另一態樣，多特異性-多價多肽還包含結合至白蛋白的ISVD，所述ISVD經由9 GS連接子進一步連接至不與結合至TCR的ISVD連接的結合至GPC3的ISVD（如下文章節5.4」「（體內）半衰期延長」中所述）。本案發明人令人驚訝地發現，這樣的組態可以增加所述多肽在引發T細胞介導的細胞毒性反應中的效率。
因此，較佳地，所述多肽按從多肽N末端開始的順序包含以下或由以下組成：特異性結合至TCR的第一ISVD、特異性結合至GPC3的第二ISVD、特異性結合至GPC3的第三ISVD以及為所述多肽提供如本文所定義的增加的半衰期的可選結合單元。為所述多肽提供增加的半衰期的結合單元較佳地是較佳地結合至血清白蛋白的ISVD。
甚至更佳地，所述多肽按從多肽N末端開始的順序包含以下或由以下組成：特異性結合至TCR的ISVD、連接子、特異性結合至GPC3的第二ISVD、連接子、特異性結合至GPC3的第三ISVD、連接子以及結合至人血清白蛋白的ISVD，其中所述第一ISVD與第二ISVD之間的連接子較佳地是5GS連接子，而其他連接子較佳地是9GS連接子。
所述多肽的這樣的組態可以提供關於治療癌症的強效力以及與預先存在的抗體的低結合。
較佳地，所述多特異性-多價多肽展現與人血清中預先存在的抗體的降低的結合。為此，在一個實施例中，所述多肽在至少一個ISVD中（並且較佳地在所述多肽C末端的ISVD），但較佳地在每個ISVD中展現在胺基酸位置11處的擷胺酸（V）和在胺基酸位置89處的白胺酸（L）（根據Kabat編號）。在另一個實施例中，所述多肽在C末端ISVD的C末端處展現1至5個（較佳地天然存在的）胺基酸的延長，如單一丙胺酸（A）延長。ISVD的C末端通常是VTVSS（SEQ ID NO: 116）。在另一個實施例中，所述多肽在至少一個ISVD中展現在位置110處的離胺酸（K）或麩醯胺酸（Q）（根據Kabat編號）。在另一個實施例中，在至少一個ISVD中，所述ISVD展現在位置112處的離胺酸（K）或麩醯胺酸（Q）（根據Kabat編號）。在這些實施例中，所述ISVD的C末端是VKVSS（SEQ ID NO: 117）、VQVSS（SEQ ID NO: 118）、VTVKS（SEQ ID NO: 119）、VTVQS（SEQ ID NO: 120）、VKVKS（SEQ ID NO: 121）、VKVQS（SEQ ID NO: 122）、VQVKS（SEQ ID NO: 123）或VQVQS（SEQ ID NO: 124），使得在添加單一丙胺酸後，所述多肽的C末端例如展現序列VTVSSA（SEQ ID NO: 125）、VKVSSA（SEQ ID NO: 126）、VQVSSA（SEQ ID NO: 127）、VTVKSA（SEQ ID NO: 128）、VTVQSA（SEQ ID NO: 129）、VKVKSA（SEQ ID NO: 130）、VKVQSA（SEQ ID NO: 131）、VQVKSA（SEQ ID NO: 132）或VQVQSA（SEQ ID NO: 133），較佳地VTVSSA（參見表A-7）。在另一個實施例中，所述多肽在至少C末端ISVD中展現在胺基酸位置11處的擷胺酸（V）和在胺基酸位置89處的白胺酸（L）（根據Kabat編號），任選地在至少一個ISVD中在位置110處的離胺酸（K）或麩醯胺酸（Q）（根據Kabat編號），並且在C末端ISVD的C末端處展現1至5個（較佳地天然存在的）胺基酸的延長，如單一丙胺酸（A）延長（使得所述多肽的C末端例如由序列VTVSSA、VKVSSA或VQVSSA組成，較佳地由VTVSSA組成）。關於這方面的其他資訊，參見例如WO 2012/175741和WO 2015/173325。
在較佳實施例中，多特異性-多價多肽包含展現與SEQ ID NO: 1超過90%（如超過95%或超過99%）的序列同一性的胺基酸序列或由其組成，其中更佳地，四個ISVD的CDR如分別在下文章節」「5.2 免疫球蛋白單可變結構域」和」「5.4 （體內）半衰期延長」中所述的項目A至D中使用Abm定義所定義（或者A'至D'，在使用Kabat定義的情況下），其中特別地：
• 特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域的第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3；
• 特異性結合至GPC3的第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3；
• 特異性結合至GPC3的第三ISVD包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3；並且
• 結合至人血清白蛋白的第四ISVD包含作為SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3，
或者可替代地，如果使用Kabat定義：
• 特異性結合至TCR的第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 31的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 35的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3；
• 特異性結合至GPC3的第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 36的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3；
• 特異性結合至GPC3的第三ISVD包含作為SEQ ID NO: 33的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 37的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3；並且
• 結合至人血清白蛋白的第四ISVD包含作為SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3。
在一些方面，所述多肽包含選自SEQ ID NO: 1、49-72和78-81的胺基酸序列或由其組成。
較佳地，所述多肽包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列或由其組成（參見表A-3）。在最佳實施例中，所述多肽由SEQ ID NO: 1的胺基酸序列組成。
如與由SEQ ID NO: 1的胺基酸組成的多肽相比，所述多肽對人TCR和對人GPC3較佳地展現至少一半的結合親和力，更佳地至少相同的結合親和力，其中所述結合親和力是使用相同方法如表面電漿共振（SPR）來測量。
5.2 免疫球蛋白單可變結構域
術語」「免疫球蛋白單可變結構域」（ISVD）可與」「單可變結構域」互換使用，其定義其中抗原結合位點存在於單一免疫球蛋白結構域上並且由其形成的免疫球蛋白分子。這使免疫球蛋白單可變結構域與」「常規」免疫球蛋白（例如單株抗體）或其片段（如Fab、Fab'、F(ab')
2、scFv、di-scFv）區分開來，其中兩個免疫球蛋白結構域、特別是兩個可變結構域，相互作用以形成抗原結合位點。典型地，在常規免疫球蛋白中，重鏈可變結構域（V
H）和輕鏈可變結構域（V
L）相互作用以形成抗原結合位點。在這種情況下，V
H和V
L二者的互補決定區（CDR）將促成抗原結合位點，即總共6個CDR將參與抗原結合位點形成。
鑒於以上定義，常規4鏈抗體（如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；本領域已知的）的抗原結合結構域或者源自這種常規4鏈抗體的Fab片段、F(ab')
2片段、Fv片段（如二硫化物連接的Fv或scFv片段）或雙抗體（業內全部已知的）將通常不被視為免疫球蛋白單可變結構域，因為在這些情形中，不是一個（單個）免疫球蛋白結構域發生與相應抗原表位的結合，而是一對（締合的）免疫球蛋白結構域（如輕鏈和重鏈可變結構域）即免疫球蛋白結構域的V
H-V
L對發生與相應抗原表位的結合，其共同地與相應抗原表位結合。
相比之下，免疫球蛋白單可變結構域能夠在不與另外的免疫球蛋白可變結構域配對的情況下特異性結合至抗原的表位。免疫球蛋白單可變結構域的結合位點是由單一V
H、單一V
HH或單一V
L結構域形成。
因此，所述單可變結構域可以是輕鏈可變結構域序列（例如，V
L序列）或其合適片段；或者重鏈可變結構域序列（例如，V
H序列或V
HH序列）或其合適片段；只要其能夠形成單一抗原結合單元（即，功能性抗原結合單元，其基本上由單可變結構域組成，使得單一抗原結合結構域不需要與另一可變結構域相互作用以形成功能性抗原結合單元）。
免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）可以例如是重鏈ISVD，如V
H、V
HH，包括駝類化V
H或人類化V
HH。較佳地，其為V
HH，包括駝類化V
H或人類化V
HH。重鏈ISVD可以源自常規四鏈抗體或重鏈抗體。
例如，免疫球蛋白單可變結構域可以是單一結構域抗體（或適合用作單一結構域抗體的胺基酸序列）、」「dAb」或dAb（或適合用作dAb的胺基酸序列）；其他單可變結構域，或其任一種的任何合適片段。
特別地，免疫球蛋白單可變結構域可以是免疫球蛋白單可變結構域（如V
HH，包括人類化V
HH或駝類化V
H）或其合適片段。Nanobody®、Nanobodies®和Nanoclone®是Ablynx N.V.的注冊商標。
」「V
HH結構域」，也稱為V
HH、V
HH抗體片段和V
HH抗體，最初被描述為」「重鏈抗體」（即，」「沒有輕鏈的抗體」；Hamers-Casterman等人 Nature 363: 446-448, 1993）的抗原結合免疫球蛋白可變結構域。已經選擇術語」「V
HH結構域」以將這些可變結構域與常規4鏈抗體中存在的重鏈可變結構域（其在本文中被稱為」「V
H結構域」）和常規4鏈抗體中存在的輕鏈可變結構域（其在本文中被稱為」「V
L結構域」）區分開來。對於V
HH的進一步描述，參考Muyldermans的綜述文章（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001）。
典型地，免疫球蛋白的生成涉及實驗動物的免疫接種、產生免疫球蛋白的細胞的融合以產生雜交瘤以及針對所需特異性的篩選。可替代地，免疫球蛋白可以通過篩選幼稚或合成文庫，例如通過噬菌體展示來生成。
免疫球蛋白序列的生成已經在各種出版物中被廣泛描述，其中WO 94/04678、Hamers-Casterman等人 1993和Muyldermans等人 2001可以作為例證。在這些方法中，用靶抗原對駱駝科動物進行免疫接種以誘導針對所述靶抗原的免疫反應。將從所述免疫接種獲得的VHH的庫針對結合所述靶抗原的VHH進行進一步篩選。
在這些情況下，抗體的生成需要純化的抗原用於免疫接種和/或篩選。抗原可以從天然來源純化，或者在重組生產的過程中純化。
免疫球蛋白序列的免疫接種和/或篩選可以使用這樣的抗原的肽片段來進行。
本發明技術可以使用不同來源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驢、人和駱駝科動物免疫球蛋白序列。所述技術還包括完全人、人類化或嵌合序列。例如，所述技術包括駱駝科動物免疫球蛋白序列和人類化駱駝科動物免疫球蛋白序列，或者駝類化結構域抗體，例如如Ward等人所述的駝類化dAb（參見例如WO 94/04678以及Davies和Riechmann (1994和1996)）。此外，所述技術還使用融合的免疫球蛋白序列，例如形成多價和/或多特異性構建體（關於含有一或多個V
HH結構域的多價和多特異性多肽及其製備，也參考Conrath等人, J. Biol. Chem., 第276卷, 10. 7346-7350, 2001，以及例如WO 96/34103和WO 99/23221），以及包含標籤或其他功能部分（例如毒素、標記、放射性化學物質等）的免疫球蛋白序列，它們可從本發明技術的免疫球蛋白序列衍生。
」「人類化V
HH」包含對應於天然存在的V
HH結構域的胺基酸序列但已經被」「人類化」的胺基酸序列，即通過用在來自人類的常規4鏈抗體（例如，如上所指出）的V
H結構域的一或多個相應位置出現的一或多個胺基酸殘基替代所述天然存在的V
HH序列的胺基酸序列中（並且特別是在架構序列中）的一或多個胺基酸殘基來進行。這能以本身已知的方式進行，這對於業內熟習此項技術者來說是清楚的，例如基於本文的進一步描述和現有技術（例如WO 2008/020079）。同樣，應注意，這樣的人類化V
HH可以以任何本身已知的合適方式來獲得，並且因此並不嚴格限於已經使用包含天然存在的VHH結構域作為起始材料的多肽獲得的多肽。
」「駝類化V
H」包含對應於天然存在的V
H結構域的胺基酸序列但已經被」「駝類化」的胺基酸序列，即通過用在重鏈抗體的V
HH結構域的一或多個相應位置出現的一或多個胺基酸殘基替代來自常規4鏈抗體的天然存在的V
H結構域的胺基酸序列中的一或多個胺基酸殘基來進行。這能以本身已知的方式進行，這對於業內熟習此項技術者來說是清楚的，例如基於本文的進一步描述和現有技術（例如WO 2008/020079）。如本文所定義，這樣的」「駝類化」取代較佳地插入於形成和/或存在於V
H-V
L介面的胺基酸位置處和/或所謂的駱駝科標誌殘基處，如本文所定義（參見例如WO 94/04678以及Davies和Riechmann (1994和1996)，同上）。較佳地，用作用於產生或設計駝類化V
H的起始材料或起點的V
H序列較佳地是來自哺乳動物的V
H序列，更佳地人類的V
H序列，如V
H3序列。然而，應注意，可以以任何本身已知的合適方式獲得這樣的駝類化V
H，並且因此並不嚴格限於使用包含天然存在的V
H結構域作為起始材料的多肽獲得的多肽。
免疫球蛋白單可變結構域序列的較佳結構可以認為是由四個架構區（」「FR」）構成，其在本領域和本文中分別稱為」「架構區1」（」「FR1」）、」「架構區2」（」「FR2」）、」「架構區3」（」「FR3」）和」「架構區4」（」「FR4」），所述架構區被三個互補決定區（」「CDR」）中斷，所述三個互補決定區在本領域和本文中分別稱為」「互補決定區1」（」「CDR1」）、」「互補決定區2」（」「CDR2」）和」「互補決定區3」（」「CDR3」）。
如WO 08/020079的第58頁和第59頁的段落q) 中進一步描述的，免疫球蛋白單可變結構域的胺基酸殘基可以根據由Kabat等人（」Sequence of proteins of immunological interest」, US Public Health Services, NIH貝塞斯達, 馬里蘭州, 出版號91）給出的用於V
H結構域的通用編號進行編號，如在Riechmann和Muyldermans, 2000（J. Immunol. Methods 240 (1-2): 185-195；參見例如該出版物的圖2）的文章中應用於來自駱駝科動物的V
HH結構域。應注意，如本領域對於V
H結構域和對於V
HH結構域眾所周知的，每個CDR中胺基酸殘基的總數可以變化，並且可以不對應由Kabat編號指示的胺基酸殘基的總數（即，根據Kabat編號的一或多個位置可能不會在實際序列中被佔用，或者實際序列可含有比Kabat編號允許的數目更多的胺基酸殘基）。這意味著，通常，根據Kabat的編號可以對應於或可以不對應於實際序列中胺基酸殘基的實際編號。V
H結構域和V
HH結構域中的胺基酸殘基的總數通常將在110至120的範圍內，通常在112至115之間。然而，應注意，更小和更長的序列也可能適用於本文所述的目的。
在本申請中，除非另有說明，否則CDR序列是根據如Kontermann和Dübel（編輯 2010, Antibody Engineering, 第2卷, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, 第3章, 第33-51頁）中所述的AbM定義確定的。根據此方法，FR1包含位置1-25處的胺基酸殘基，CDR1包含位置26-35處的胺基酸殘基，FR2包含位置36-49處的胺基酸，CDR2包含位置50-58處的胺基酸殘基，FR3包含位置59-94處的胺基酸殘基，CDR3包含位置95-102處的胺基酸殘基，並且FR4包含位置103-113處的胺基酸殘基。
CDR區的確定也可以根據不同的方法進行。在根據Kabat的CDR測定中，免疫球蛋白單可變結構域的FR1包含位置1-30處的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的CDR1包含位置31-35處的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的FR2包含位置36-49處的胺基酸，免疫球蛋白單可變結構域的CDR2包含位置50-65處的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的FR3包含位置66-94處的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的CDR3包含位置95-102處的胺基酸殘基，並且免疫球蛋白單可變結構域的FR4包含位置103-113處的胺基酸殘基。
在這樣的免疫球蛋白序列中，架構序列可以是任何合適的架構序列，並且合適的架構序列的例子對於熟習此項技術者將是清楚的，例如基於標準手冊以及本文中提及的其他公開內容和現有技術。
架構序列較佳地是免疫球蛋白架構序列（的合適組合），或者（例如，通過人類化或駝類化）源自免疫球蛋白架構序列的架構序列。例如，架構序列可以是源自輕鏈可變結構域（例如V
L序列）和/或重鏈可變結構域（例如V
H序列或V
HH序列）的架構序列。在一個特別較佳的方面，架構序列是源自V
HH序列的架構序列（其中所述架構序列可以任選地被部分或完全人類化），或者是已經駝類化的常規V
H序列（如本文所定義）。
特別地，所述技術中使用的ISVD序列中存在的架構序列可以含有一或多個標誌殘基（如本文所定義），使得所述ISVD序列是V
HH，包括人類化V
HH或駝類化V
H。這樣的架構序列（的合適組合）的一些較佳但非限制性的例子將從本文的其他公開文本變得清楚。
同樣，如本文針對免疫球蛋白序列的大概描述，也可以使用前述任一項的合適片段（或片段的組合），如含有一或多個CDR序列的片段，其適當地被一或多個架構序列側接和/或經由一或多個架構序列來連接（例如，以與這些CDR和架構序列可能在衍生所述片段的全尺寸免疫球蛋白序列中出現的相同順序）。
然而，應注意，關於ISVD序列（或用於表現所述ISVD序列的核苷酸序列）的來源，以及關於生成或獲得（或者已經生成或獲得）所述ISVD序列或核苷酸序列的方式，所述技術不受限。因此，ISVD序列可以是天然存在的序列（來自任何合適的物種）或者合成的或半合成的序列。在特定但非限制性的方面，ISVD序列是天然存在的序列（來自任何合適的物種）或者合成的或半合成的序列，包括但不限於」「人類化」（如本文所定義）免疫球蛋白序列（如部分或完全人類化的小鼠或兔免疫球蛋白序列，並且特別是部分或完全人類化的V
HH序列）、」「駝類化」（如本文所定義）免疫球蛋白序列，以及通過諸如以下的技術獲得的免疫球蛋白序列：親和力成熟（例如，從合成的、隨機的或天然存在的免疫球蛋白序列開始）、CDR移植、鑲面、組合源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重疊引子的PCR組裝，以及熟習此項技術者熟知的工程化免疫球蛋白序列的類似技術；或前述任一項的任何合適組合。
類似地，核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或者合成的或半合成的序列，並且可以是例如通過PCR從合適的天然存在的範本分離的序列（例如從細胞分離的DNA或RNA）、已經從文庫（並且特別是，表現文庫）分離的核苷酸序列、已經通過將突變引入天然存在的核苷酸序列製備的核苷酸序列（使用本身已知的任何合適的技術，如錯配PCR）、已經通過使用重疊引子的PCR製備的核苷酸序列，或者已經使用本身已知的DNA合成技術製備的核苷酸序列。
如上所述，ISVD可以是Nanobody®或其合適片段。關於Nanobodies的大概描述，參考下文的進一步描述，以及本文引用的現有技術。然而，在這方面，應注意，此描述和現有技術主要描述了所謂的」「V
H3類」的Nanobodies（即與V
H3類的人種系序列如DP-47、DP-51或DP-29具有高度序列同源性的Nanobodies）。然而，應注意，所述技術在其最廣泛的意義上通常可以使用任何類型的Nanobody，並且例如還使用屬於所謂的」「V
H4類」的Nanobodies（即與V
H4類的人種系序列如DP-78具有高度序列同源性的Nanobodies），如例如WO 2007/118670中所述。
通常，Nanobodies（特別是V
HH序列，包括（部分）人類化V
HH序列和駝類化V
H序列）的特徵可以是在一或多個架構序列（同樣如本文進一步所述）中存在一或多個」「標誌殘基」（如本文所述）。因此，通常可以將Nanobody定義為具有以下（通用）結構的免疫球蛋白序列
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中標誌殘基中的一或多個是如本文進一步所定義的。
特別地，Nanobody可以是具有以下（通用）結構的免疫球蛋白序列
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中所述架構序列是如本文進一步所定義的。
更特別地，Nanobody可以是具有以下（通用）結構的免疫球蛋白序列
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中：
根據Kabat編號，在位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108處的胺基酸殘基中的一或多個選自下表A-0中提及的標誌殘基。
表
A-0
：
Nanobodies
中的標誌殘基
| 位置 | 人 V H3 | 標誌殘基 |
| 11 | L、V；主要是L | L、S、V、M、W、F、T、Q、E、A、R、G、K、Y、N、P、I；較佳地是L |
| 37 | V、I、F；通常是V | F (1)、Y、V、L、A、H、S、I、W、C、N、G、D、T、P，較佳地是F (1)或Y |
| 44 (8) | G | E (3)、Q (3)、G (2)、D、A、K、R、L、P、S、V、H、T、N、W、M、I； 較佳地G (2)、E (3)或Q (3)；最佳地是G (2)或Q (3) 。 |
| 45 (8) | L | L (2)、R (3)、P、H、F、G、Q、S、E、T、Y、C、I、D、V；較佳地是L (2)或R (3) |
| 47 (8) | W、Y | F (1)、L (1)或W (2)G、I、S、A、V、M、R、Y、E、P、T、C、H、K、Q、N、D；較佳地是W (2)、L (1)或F (1) |
| 83 | R或K；通常是R | R、K (5)、T、E (5)、Q、N、S、I、V、G、M、L、A、D、Y、H；較佳地是K或R；最佳地是K |
| 84 | A、T、D；主要是A | P (5)、S、H、L、A、V、I、T、F、D、R、Y、N、Q、G、E；較佳地是P |
| 103 | W | W (4)、R (6)、G、S、K、A、M、Y、L、F、T、N、V、Q、P (6)、E、C；較佳地是W |
| 104 | G | G、A、S、T、D、P、N、E、C、L；較佳地是G |
| 108 | L、M或T；主要是L | Q、L (7)、R、P、E、K、S、T、M、A、H；較佳地是Q或L (7) |
| 注意：(1) 特別地，但非排他地，在位置43至46處與KERE或KQRE組合。 (2) 通常在位置44至47處為GLEW。 (3) 通常在位置43至46處為KERE或KQRE，例如在位置43至47處為KEREL、KEREF、KQREL、KQREF、KEREG、KQREW或KQREG。可替代地，諸如以下的序列也是可能的：TERE（例如TEREL）、TQRE（例如TQREL）、KECE（例如KECEL或KECER）、KQCE（例如KQCEL）、RERE（例如REREG）、RQRE（例如RQREL、RQREF或RQREW）、QERE（例如QEREG）、QQRE（例如QQREW、QQREL或QQREF）、KGRE（例如KGREG）、KDRE（例如KDREV）。一些其他可能的但不較佳的序列包括例如DECKL和NVCEL。 (4) 具有位置44至47處的GLEW和位置43至46處的KERE或KQRE二者。 (5) 在天然存在的VHH結構域的位置83至84處通常為KP或EP。 (6) 特別地，但非排他地，在位置44至47處與GLEW組合。 (7) 前提是當位置44至47為GLEW時，在還含有103處的W的（非人類化）VHH序列中，位置108始終為Q。 (8) GLEW組還在位置44至47處含有GLEW樣序列，如例如GVEW、EPEW、GLER、DQEW、DLEW、GIEW、ELEW、GPEW、EWLP、GPER、GLER和ELEW。 |
所述技術尤其使用可以結合至TCR的恆定結構域或GPC3的ISVD。在本發明技術的情況下，」「結合至」某種靶分子具有業內如在抗體及其相應抗原的情況下所理解的常見含義。
多特異性-多價多肽可以包含特異性結合至GPC3的一或多個ISVD。例如，所述多肽可以包含特異性結合至GPC3的兩個ISVD和特異性結合至TCR的ISVD。
所述技術中使用的ISVD可以形成多肽的一部分，所述多肽包含至少兩個ISVD或由其組成，使得所述多肽可以特異性結合至GPC3和TCR。
因此，所述技術中使用的ISVD的靶分子分別是GPC3和TCR的恆定結構域。結合至TCR可以例如通過結合至TCRα亞基和/或TCRβ亞基來實現。例子是哺乳動物GPC3和TCR。儘管人GPC3（Uniprot登錄號P51654，參見表A-8）和人TCR（參見表A-8）是較佳的，來自其他物種的形式也適用於本發明技術，例如來自以下物種的GPC3和TCR：小鼠、大鼠、兔、貓、狗、山羊、綿羊、馬、豬、非人靈長類動物如食蟹猴（本文中也稱為」「
cyno」）或者駱駝科動物如美洲駝或羊駝。
可以用於所述技術中的特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域的ISVD的具體例子如以下項目A中所述：
A. 一種特異性結合至人TCR並且包含以下的ISVD
i. 作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 6的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 10的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，
較佳地作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3。
在較佳實施例中，所述ISVD結合至SEQ ID NO: 135的人TCR-α和/或SEQ ID NO: 136的TCR-β的恆定結構域或其多態性變異體或亞型。
這樣的特異性結合至人TCR的ISVD的較佳例子包含如表A-2中針對ISVD TCE01所指示的一或多個（並且較佳地所有）架構區（以及如前述項目A中所定義的CDR），並且最佳地是由ISVD TCE01的完整胺基酸序列（SEQ ID NO: 2；參見表A-1和表A-2）組成的ISVD。
同樣，在較佳實施例中，特異性結合至人TCR的ISVD的胺基酸序列可以展現與SEQ ID NO: 2超過90%（如超過95%或超過99%）的序列同一性，其中所述CDR如前述項目A中所定義。特別地，特異性結合至TCR的ISVD最佳地是SEQ ID NO: 2的胺基酸序列。
在這樣的結合至TCR的ISVD在至少一個CDR中相對於相應參考CDR序列（上文項目A）展現2個或1個胺基酸差異時，與SEQ ID NO: 2中所示的構建體TCE01相比，所述ISVD對人TCR較佳地展現至少一半的結合親和力，更佳地至少相同的結合親和力，其中所述結合親和力是使用相同方法如SPR來測量。
可以用於所述技術中的特異性結合至GPC3的ISVD的具體例子如以下項目B和項目C中所述：
B. 一種特異性結合至人GPC3並且包含以下的ISVD
i. 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，
較佳地作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3。
C. 一種特異性結合至人GPC3並且包含以下的ISVD
i. 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，
較佳地作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3。
在較佳實施例中，所述ISVD結合至SEQ ID NO: 134的人GPC3。
這樣的特異性結合至人GPC3的ISVD的較佳例子包含如表A-2中分別針對ISVD A022600351和A022600314所指示的一或多個（並且較佳地所有）架構區（以及分別如前述項目B和項目C中所定義的CDR），並且最佳地是由ISVD A022600351或A022600314（SEQ ID NO: 3或4，參見表A-1和表A-2）的完整胺基酸序列組成的ISVD。
同樣，在較佳實施例中，特異性結合至人GPC3的一或多個ISVD的胺基酸序列可以分別展現與SEQ ID NO: 3或4超過90%（如超過95%或超過99%）的序列同一性，其中所述CDR分別如前述項目B或項目C中所定義。特別地，結合至人GPC3的ISVD最佳地是SEQ ID NO: 3或4的胺基酸序列。
在這樣的結合至人GPC3的ISVD在至少一個CDR中相對於相應參考CDR序列（上文項目B或項目C）展現2個或1個胺基酸差異時，與分別於SEQ ID NO: 3和4中所示的構建體A022600351或A022600314相比，所述ISVD對人GPC3較佳地展現至少一半的結合親和力，更佳地至少相同的結合親和力，其中所述結合親和力是使用相同方法如SPR來測量。
較佳地，如在上文項目A至項目C下所定義的ISVD中的每一個包含於所述多肽中。
與由SEQ ID NO: 1的胺基酸組成的多肽相比，這樣的包含如在上文項目A至項目C下所定義的ISVD中的每一個的多肽對人TCR和對人GPC3較佳地展現至少一半的結合親和力，更佳地至少相同的結合親和力，其中所述結合親和力是使用相同方法如SPR來測量。
上文項目A至項目C和下文項目D（參見章節5.4 」「（體內）半衰期延長」）中所提及的SEQ ID NO是基於根據AbM定義的CDR定義（參見表A-2）。應注意，定義根據Kabat定義的相同CDR的SEQ ID NO（參見表A-2-1）同樣可以用於上文項目A至項目C和下文項目D（參見章節5.4 」「（體內）半衰期延長」）。
因此，如上文使用AbM定義所述的可以用於所述技術中的特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域或GPC3的ISVD的具體例子也可以使用如下文專案A'至項目C'中所示的Kabat定義來描述：
A'. 一種特異性結合至人TCR並且包含以下的ISVD
i. 作為SEQ ID NO: 31的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 31的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 35的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 35的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，
較佳地作為SEQ ID NO: 31的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 35的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3。
這樣的特異性結合至人TCR的ISVD的較佳例子包含如表A-2-1中分別針對ISVD TCE01所指示的一或多個（並且較佳地所有）架構區（以及如前述項目A'中所定義的CDR），並且最佳地是由ISVD TCE01的完整胺基酸序列（SEQ ID NO: 2；參見表A-1和表A-2-1）組成的ISVD。
B'. 一種特異性結合至人GPC3並且包含以下的ISVD
i. 作為SEQ ID NO: 32的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 32的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 36的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 36的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，
較佳地作為SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 36的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3。
C'. 一種特異性結合至人GPC3並且包含以下的ISVD
i. 作為SEQ ID NO: 33的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 33的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 37的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 37的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，
較佳地作為SEQ ID NO: 33的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 37的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3。
這樣的特異性結合至人GPC3的一或多個ISVD的較佳例子包含如表A-2-1中分別針對ISVD A022600351和A022600314所指示的一或多個（並且較佳地所有）架構區（以及分別如前述項目B'和項目C'中所定義的CDR），並且最佳地是由ISVD A022600351或A022600314（SEQ ID NO: 3或4，參見表A-1和表A-2-1）的完整胺基酸序列組成的ISVD。
第一胺基酸序列與第二胺基酸序列之間的」「
序列同一性」的百分比可以通過將[
第一胺基酸序列中與第二胺基酸序列中相應位置處的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的數量]除以[
第一胺基酸序列中胺基酸殘基的總數]並乘以[
100%]來計算，其中第二胺基酸序列中胺基酸殘基的每個缺失、插入、取代或添加（與第一胺基酸序列相比）被認為是單個胺基酸殘基（即單個位置處）的差異。
通常，出於根據上文概述的計算方法確定兩個胺基酸序列之間」「序列同一性」的百分比的目的，將具有最大胺基酸殘基數量的胺基酸序列作為」「第一」胺基酸序列，並將另一個胺基酸序列作為」「第二」胺基酸序列。
如本文所用的」「胺基酸差異」是指單個胺基酸殘基相對於參考序列的缺失、插入或取代，並且較佳地是取代。
胺基酸取代較佳地是保守取代。這樣的保守取代較佳地是其中以下 (a) - (e) 組中的一個胺基酸被同一組中的另一個胺基酸殘基取代的取代：(a) 小的脂族、非極性或微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b) 極性、帶負電荷的殘基及其（不帶電荷的）醯胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c) 極性、帶正電荷的殘基：His、Arg和Lys；(d) 大的脂族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；以及 (e) 芳族殘基：Phe、Tyr和Trp。
特別較佳的保守取代如下；Ala變成Gly或變成Ser；Arg變成Lys；Asn變成Gln或變成His；Asp變成Glu；Cys變成Ser；Gln變成Asn；Glu變成Asp；Gly變成Ala或變成Pro；His變成Asn或變成Gln；Ile變成Leu或變成Val；Leu變成Ile或變成Val；Lys變成Arg,變成Gln或變成Glu；Met變成Leu,變成Tyr或變成Ile；Phe變成Met,變成Leu或變成Tyr；Ser變成Thr；Thr變成Ser；Trp變成Tyr；Tyr變成Trp；和/或Phe變成Val、變成Ile或變成Leu。
5.3 特異性
術語」「特異性」、」「特異性地結合」或」「特異性結合」是指特定結合單元（如ISVD）可以以足夠高的親和力結合的來自相同生物體的不同靶分子（如抗原）的數量（參見下文）。」「
特異性」、」「
特異性地結合」或」「
特異性結合」在本文中可與」「
選擇性」、」「
選擇性地結合」或」「
選擇性結合」互換使用。結合單元如ISVD較佳地特異性結合至其指定目標。
結合單元的特異性/選擇性可以基於親和力來確定。親和力表示分子相互作用的強度或穩定性。親和力通常通過KD或解離常數給出，以mol/公升（或M）的單位來表示。親和力也可以表示為締合常數KA，其等於1/KD並且以（mol/公升）
-1（或M
-1）的單位來表示。
親和力是部分與靶分子上的結合位點之間的結合強度的量度：KD值越低，靶分子與靶向部分之間的結合強度越強。
典型地，本發明技術中使用的結合單元（如ISVD）將以10
-5至10
-12mol/L或更低、並且較佳10
-7至10
-12mol/L或更低、並且更佳10
-8至10
-12mol/L的解離常數（KD）（即以10
5至10
12L/mol或更高、並且較佳10
7至10
12L/mol或更高、並且更佳10
8至10
12L/mol的締合常數（KA））結合至其目標。
通常認為任何大於10
-4mol/L的KD值（或任何小於10
4L/mol的KA值）指示非特異性結合。
被認為具有特異性的生物學相互作用（如免疫球蛋白序列與抗原的結合）的KD典型地在10
-5莫耳/公升（10000 nM或10µM）至10
-12莫耳/公升（0.001 nM或1 pM）或更低的範圍內。
因此，特異性/選擇性結合可能意味著，使用相同的測量方法例如SPR，結合單元（或包含其的多肽）以10
-5至10
-12莫耳/公升或更低的KD值結合至TCR和/或GPC3，並且以大於10
-4莫耳/公升的KD值結合至相關目標。GPC3的相關目標的例子是GPC1、GPC2、GPC4、GPC5或GPC6。因此，在所述技術的實施例中，所述多肽中包含的結合至GPC3的ISVD以10
-5至10
-12莫耳/公升或更低的KD值結合至GPC3，並且以大於10
-4莫耳/公升的KD值結合至相同物種的GPC1、GPC2、GPC4、GPC5和GPC6。
因此，如與由SEQ ID NO: 1的胺基酸組成的多肽相比，所述多肽對人TCR和對人GPC3較佳地展現至少一半的結合親和力，更佳地至少相同的結合親和力，其中所述結合親和力是使用相同方法如SPR來測量。
與來自某個物種的某種目標的特異性結合並不排除結合單元也可以與來自不同物種的類似目標特異性地結合。例如，與人TCR特異性結合不排除結合單元（或包含所述結合單元的多肽）也可以與來自食蟹猴的TCR特異性結合。同樣，例如，與人GPC3的特異性結合不排除結合單元（或包含所述結合單元的多肽）也可以與來自食蟹猴（」「cyno」）的GPC3特異性地結合。
結合至人TCR並且包含於當前技術的多肽中的具有SEQ ID NO: 2的ISVD展現與WO 2016/180969 A1中所述的ISVD T0170056G05相比改進的結合特徵。更特定地，具有SEQ ID NO: 2的ISVD源自T017056G05並且在CDR1和CDR3中包含特定突變，所述特定突變導致與ISVD T0170056G05相比改進的對於與人TCR和非人靈長類動物（如食蟹猴）TCR結合的交叉反應性。
在稱ISVD展現與另一個ISVD相比」「改進的對於與人TCR和非人靈長類動物TCR結合的交叉反應性」時，其意味著對於所述ISVD，對人TCR和對非人靈長類動物TCR的結合活性（如表示為KD或k
off）的比率低於在相同測定中針對其他ISVD計算的該相同比率。
對於與人TCR和非人靈長類動物TCR結合的良好交叉反應性允許在對非人靈長類動物進行的臨床前研究中評估多特異性T細胞接合多肽的毒性。
結合單元與其指定目標的特異性結合可以以本身已知的任何合適方式來確定，所述方式包括例如Scatchard分析和/或競爭性結合測定，如放射免疫測定（RIA）、酶免疫測定（EIA）和夾層法競爭測定，以及它們在業內本身已知的不同變體；以及本文提及的其他技術。
如熟習此項技術者將清楚的，解離常數可以是實際的或表觀的解離常數。用於確定解離常數的方法對熟習此項技術者將是清楚的，並且例如包括以下提及的技術。在此方面，還將清楚的是，可能不可以測量大於10
-4莫耳/公升或10
-3莫耳/公升（例如，10
-2莫耳/公升）的解離常數。任選地，如熟習此項技術者還將清楚的，可以基於（實際或表觀）締合常數（KA），借助關係式[KD = 1/KA]來計算（實際或表觀）解離常數。
可以經由本身已知的不同技術（如熟知的表面電漿共振（SPR）生物感測器技術）來測量兩個分子之間的分子相互作用的親和力（參見例如Ober等人 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559）。如本文所用，術語」「表面電漿共振」是指一種光學現象，其允許通過檢測生物感測器矩陣內蛋白質濃度的改變來分析即時生物特異性相互作用，其中一個分子固定在生物感測器晶片上，並且另一個分子在流動條件下經過固定的分子，從而得到k
on、k
off測量值，並且因此得到K
D（或K
A）值。例如，這可以使用熟知的BIAcore®系統（BIAcore International AB，一家GE Healthcare公司，烏普薩拉，瑞典和皮斯卡塔韋，新澤西州）進行。關於進一步描述，參見Jonsson等人（1993, Ann. Biol. Clin. 51: 19-26）、Jonsson等人（1991 Biotechniques 11: 620-627）、Johnsson等人（1995, J. Mol. Recognit. 8: 125-131）和Johnnson等人（1991, Anal. Biochem. 198: 268-277）。
另一種熟知的確定生物分子相互作用的親和力的生物感測器技術是生物膜干涉法（bio-layer interferometry，BLI）（參見例如Abdiche等人 2008, Anal. Biochem. 377: 209-217）。如本文所用，術語」「生物層干涉法」或」「BLI」是指無標籤光學技術，其分析從兩個表面反射的光的干涉圖案：內部參考層（參考光束）和生物感測器尖端上的固定蛋白質的層（信號光束）。結合到生物感測器尖端的分子數量的變化會導致干涉圖案的偏移，報告為波長偏移（nm），其幅度是結合到生物感測器尖端表面的分子數量的直接量度。由於可以即時測量相互作用，因此可以確定締合和解離速率和親和力。例如，BLI可以使用熟知的Octet®系統（ForteBio，Pall Life Sciences的分公司，門洛派克，美國）來進行。
可替代地，可以使用KinExA®平臺（Sapidyne Instruments Inc，博伊西，美國），在動力學排斥測定法（KinExA）中測量親和力（參見例如Drake等人 2004, Anal. Biochem., 328: 35-43）。如本文所用，術語」「KinExA」是指測量未修飾分子的真實平衡結合親和力和動力學的基於溶液的方法。使抗體/抗原複合物的平衡溶液通過具有用抗原（或抗體）預包被的珠的柱，從而允許游離的抗體（或抗原）與被包被的分子結合。用結合抗體（或抗原）的螢光標記的蛋白完成了對如此捕獲的抗體（或抗原）的檢測。
GYROLAB®免疫測定系統為自動化生物分析和快速樣品周轉提供了平臺（Fraley等人 2013, Bioanalysis 5: 1765-74）。
5.4 （體內）半衰期延長
所述多肽還可以包含一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元任選地經由一或多個肽連接子來連接，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的（體內）半衰期。體內半衰期延長意指，例如，所述多肽在投予後在哺乳動物如人受試者中展現增加的半衰期。半衰期可以表示為例如t1/2β。
基團、殘基、部分或結合單元的類型通常不受限，並且可以例如選自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可以結合至血清蛋白的結合單元、Fc部分以及可以結合至血清蛋白的小蛋白或肽。
更特定地，為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元可以選自可以結合至血清白蛋白如人血清白蛋白或者血清免疫球蛋白如IgG的結合單元，並且較佳地是可以結合至人血清白蛋白的結合單元。所述結合單元較佳地是ISVD。
例如，WO 04/041865描述了與血清白蛋白（並且特別是針對人血清白蛋白）結合的Nanobodies®，其可以與其他蛋白質（如與所需目標結合的一種或多種其他Nanobodies）連接，以增加所述蛋白質的半衰期。
國際申請WO 06/122787描述針對（人）血清白蛋白的多種Nanobodies®。這些Nanobodies®包括稱為Alb-1的Nanobody®（WO 06/122787中的SEQ ID NO: 52）及其人類化變異體，如Alb-8（WO 06/122787中的SEQ ID NO: 62）。同樣，這些可以用於延長治療性蛋白質和多肽以及其他治療性實體或部分的半衰期。
此外，WO2012/175400描述Alb-1的另一種改進形式，稱為Alb-23。
在較佳實施例中，所述多肽包含選自以下的血清白蛋白結合部分：Alb-1、Alb-3、Alb-4、Alb-5、Alb-6、Alb-7、Alb-8、Alb-9、Alb-10和Alb-23，較佳地Alb-8或Alb-23或其變異體，如WO 2012/175400的第7-9頁中所示，以及WO 2012/175741、WO 2015/173325、WO 2017/080850、WO 2017/085172、WO 2018/104444、WO 2018/134235、WO 2018/134234中所述的白蛋白結合物。一些較佳的血清白蛋白結合物也顯示於表A-4中。所述多肽的特別較佳的其他組分如項目D中所述：
D. 一種結合至人血清白蛋白並且包含以下的ISVD
i. 作為SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 9的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 13的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 17的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3；
較佳地作為SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3。
這樣的結合至人血清白蛋白的ISVD的較佳例子包含如表A-2中針對ISVD ALB23002所指示的一或多個（並且較佳地所有）架構區（以及如前述項目D中所定義的CDR），並且最佳地是由ISVD ALB23002完整胺基酸序列（SEQ ID NO: 5，參見表A-1和表A-2）組成的ISVD。
項目D也可以使用Kabat定義被描述為：
D'. 一種結合至人血清白蛋白並且包含以下的ISVD
i. 作為SEQ ID NO: 34的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 34的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1；
ii. 作為SEQ ID NO: 38的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 38的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及
iii. 作為SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 17的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3；
較佳地作為SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3。
這樣的結合至人血清白蛋白的ISVD的較佳例子包含如表A-2-1中針對ISVD ALB23002所指示的一或多個（並且較佳地所有）架構區（以及如前述項目D'中所定義的CDR），並且最佳地是由ISVD ALB23002完整胺基酸序列（SEQ ID NO: 5，參見表A-1和表A-2-1）組成的ISVD。
同樣，在較佳實施例中，結合至人血清白蛋白的ISVD的胺基酸序列可以展現與SEQ ID NO: 5超過90%（如超過95%或超過99%）的序列同一性，其中所述CDR如前述項目D或項目D'中所定義。特別地，結合至人血清白蛋白的ISVD較佳地是SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。
在這樣的結合至人血清白蛋白的ISVD在至少一個CDR中相對於相應參考CDR序列（上文項目D或項目D'）展現2個或1個胺基酸差異時，如與SEQ ID NO: 5中所示的構建體ALB23002相比，所述ISVD對人血清白蛋白展現至少一半的結合親和力，較佳地至少相同的結合親和力，其中所述結合親和力是使用相同方法如SPR來測量。
在這樣的結合至人血清白蛋白的ISVD位於C末端位置處時，其可以展現C末端丙胺酸（A）或甘胺酸（G）延長（較佳地A）並且較佳地選自SEQ ID NO: 83、85、87、89、91、93、95、96和98，最佳地SEQ ID NO: 96，其表示具有單一丙胺酸延長的SEQ ID NO: 5（參見下表A-4）。在一些實施例中，結合至人血清白蛋白的ISVD位於與所述C末端位置不同的另一位置處（即並非所述多肽的C末端ISVD）並且選自SEQ ID NO: 5、82、84、86、88、90、92、94和97（參見下表A-4）。
5.5 核酸分子
還提供一種編碼如本文所公開的多肽的核酸分子。
」「核酸分子」（可與」「核酸」互換使用）是經由磷酸酯主鏈彼此連接以形成核苷酸序列的核苷酸單體的鏈。核酸可以用於轉化/轉染宿主細胞或宿主生物體，例如用於多肽的表現和/或生產。用於生產目的的合適的宿主或宿主細胞對熟習此項技術者將是清楚的，並且可以例如是任何合適的真菌、原核或真核細胞或細胞株或任何合適的真菌、原核或真核生物體。包含編碼所述多肽的核酸的宿主或宿主細胞也被所述技術涵蓋。
核酸可以是例如DNA、RNA或其雜合體，並且還可以包含（例如化學地）修飾的核苷酸，如PNA。其可以是單鏈或雙鏈的，並且較佳地呈雙鏈DNA的形式。例如，核苷酸序列可以是基因組DNA或cDNA。
核酸可以以本身已知的方式來製備或獲得，和/或可以從合適的天然來源分離。編碼天然存在的（多）肽的核苷酸序列可以例如進行定點誘變，以便提供編碼具有序列變異的多肽的核酸分子。同樣，如熟習此項技術者將清楚的，為了製備核酸，也可以以合適的方式將數個核苷酸序列，如至少一個編碼靶向部分的核苷酸序列和例如編碼一或多個連接子的核酸連接在一起。
用於生成核酸的技術對熟習此項技術者將是清楚的，並且可以例如包括但不限於自動化DNA合成；定點誘變；組合兩個或更多個天然存在的和/或合成的序列（或其兩個或更多個部分），引入導致截短的表現產物表現的突變；引入一或多個限制性位點（例如，以產生可能易於使用合適的限制性酶消化和/或連接的盒和/或區域），和/或借助使用一或多個」「錯配」引子的PCR反應引入突變。
5.6 載體
還提供一種包含編碼如本文所公開的多肽的核酸分子的載體。如本文所用的載體是適用於將遺傳物質攜帶到細胞中的媒介物。載體包括裸核酸，如質體或mRNA，或嵌入到更大結構如脂質體或病毒載體中的核酸。
載體通常包含至少一種核酸，其任選地連接到一或多個調節元件，如例如一或多個合適的啟動子、增強子、終止子等。載體較佳地是表現載體，即適用於在合適的條件下（例如當所述載體被引入（例如人）細胞中時）表現編碼的多肽或構建體的載體。對於基於DNA的載體，這通常包括用於轉錄（例如啟動子和多聚腺苷酸信號）和翻譯（例如Kozak序列）的元件的存在。
較佳地，在載體中，所述至少一種核酸和所述調節元件彼此」「可操作地連接」，這通常意指它們彼此之間具有功能關係。例如，如果啟動子能夠啟動或以其他方式控制/調節編碼序列的轉錄和/或表現，則所述啟動子被認為與編碼序列」「可操作地連接」（其中，所述編碼序列應理解為」「在所述啟動子的控制下」）。通常，當兩個核苷酸序列可操作地連接時，它們處於相同定向，並且通常也處於同一閱讀框中。它們通常也是基本上連續的，但這也可能不是必需的。
較佳地，載體的任何調節元件使得它們能夠在預期的宿主細胞或宿主生物體中提供其預期的生物學功能。
例如，啟動子、增強子或終止子在預期的宿主細胞或宿主生物體中應是」「可操作的」，這意味著例如所述啟動子應能夠啟動或以其他方式控制/調節與其可操作地連接的核苷酸序列（例如編碼序列）的轉錄和/或表現。
5.7 組成物
所述技術還提供一種的組成物，其包含至少一種如本文所公開的多肽、編碼如本文所公開的多肽的至少一種核酸分子或包含這樣的核酸分子的至少一種載體。所述組成物可以是醫藥組成物。所述組成物還可以包含至少一種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，並且任選地包含一種或多種其他醫藥活性多肽和/或化合物。
5.8 宿主生物體
所述技術還涉及宿主細胞或宿主生物體，其包含如本文所公開的多肽、編碼如本文所公開的多肽的核酸和/或包含編碼如本文所公開的多肽的核酸分子的載體。
合適的宿主細胞或宿主生物體對熟習此項技術者是清楚的，並且是例如任何合適的真菌、原核或真核細胞或細胞株或任何合適的真菌、原核或真核生物體。具體例子包括HEK293細胞、CHO細胞、大腸桿菌（
Escherichia coli）或巴斯德畢赤酵母（
Pichia pastoris）。最佳的宿主是巴斯德畢赤酵母。
5.9 所述多肽的方法和用途
所述技術還提供一種用於產生如本文所公開的多肽的方法。所述方法可以包括用編碼所述多肽的核酸轉化/轉染宿主細胞或宿主生物體，在宿主中表現所述多肽，任選地隨後進行一或多個分離和/或純化步驟。具體地，所述方法可以包括：
a) 在合適的宿主細胞或宿主生物體中或在另一種合適的表現系統中表現編碼所述多肽的核酸序列；任選地之後進行：
b) 分離和/或純化所述多肽。
用於生產目的的合適的宿主細胞或宿主生物體對熟習此項技術者將是清楚的，並且可以例如是任何合適的真菌、原核或真核細胞或細胞株或任何合適的真菌、原核或真核生物體。具體例子包括HEK293細胞、CHO細胞、大腸桿菌或巴斯德畢赤酵母。最佳的宿主是巴斯德畢赤酵母。
如所述的多肽、核酸分子或載體或者包含所述多肽、核酸分子或載體的組成物，較佳地所述多肽或包含所述多肽的組成物，可用作藥物。
因此，所述技術提供用作藥物的如所述的多肽、核酸分子或載體或者包含所述多肽、核酸分子或載體的組成物。
還提供用於癌症的治療的如所述的多肽、核酸分子或載體或者包含所述多肽、核酸分子或載體的組成物。
進一步提供一種治療癌症的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者投予醫藥活性量的如所述的多肽、核酸分子或載體或者包含所述多肽、核酸分子或載體的組成物。
進一步提供如所述的多肽、核酸分子或載體或者包含所述多肽、核酸分子或載體的組成物在藥物製備中的用途。
進一步提供如所述的多肽、核酸分子或載體或者包含所述多肽、核酸分子或載體的組成物在較佳地用於治療癌症的醫藥組成物的製備中的用途。
所述癌症可以是任何類型的表現GPC3的癌症。所述癌症較佳地是肝癌或肺癌，較佳地是肝癌。肝癌較佳地是肝細胞癌。肺癌較佳地是非小細胞肺癌（NSCLC），最佳地是鱗狀細胞癌（SCC）。
較佳地，如與Huh7細胞（平均）相比，表現GPC3的癌細胞表現（平均）至少一半的量的GPC3蛋白，較佳地至少等量的GPC3蛋白。Huh7細胞可從例如國家生物醫學創新、健康和營養研究所（National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition）、JCRB細胞銀行以登錄號JCRB0403公開獲得。
所表現的GPC3較佳地是指細胞表面暴露的GPC3。（細胞表面暴露的）GPC3在細胞上的表現（及其量）可以通過業內一般已知的常規方法如流式細胞術、免疫組織化學或如實例中所述容易地確定。
如在所述技術的上下文中所提及的」「受試者」可以是任何動物，較佳地哺乳動物。在哺乳動物之間，可以區分人與非人哺乳動物。非人動物可以是例如伴侶動物（例如狗、貓）、家畜（例如牛、馬、綿羊、山羊或豬動物）或通常用於研究目的和/或用於產生抗體的動物（例如小鼠、大鼠、兔、貓、狗、山羊、綿羊、馬、豬、非人靈長類動物（如食蟹猴）或駱駝科動物（如美洲駝或羊駝））。
在預防和/或治療目的的情況下，受試者可以是任何動物，並且更具體地是任何哺乳動物，但較佳地是人受試者。
物質（包括多肽、核酸分子和載體）或組成物可以通過任何合適的投予途徑投予受試者（例如通過腸內（如口服或直腸）或腸胃外（如表皮、舌下、頰、鼻、關節內、皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、經皮或經粘膜）投予。腸胃外投予，如肌內、皮下或真皮內投予是較佳的。最佳的是皮下投予。
可以將有效量的如所述的多肽、核酸分子或載體或者包含所述多肽、核酸分子或載體的組成物投予受試者，以便提供預期的治療結果。
可以投予一或多個劑量。如果投予多於一個劑量，則可以以合適的間隔投予所述劑量，以便最大化所述多肽、組成物、核酸分子或載體的作用。
表 A-1 ：在五價多肽 A022600424 內鑒定的不同單價 ISVD 構建塊的胺基酸序列（」「 ID 」是指如本文所用的 SEQ ID NO ）
* A02260018C08的序列優化變異體（SEQ ID NO: 48）
° A02260015A08的序列優化變異體（SEQ ID NO: 47）
| 名稱 | ID | 胺基酸序列 |
| TCE01 | 2 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| A022600351* | 3 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNKGVTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSS |
| A022600314° | 4 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIFRSVFSSSTMEWYRQAPGKKRELVARIAPGEGTYYGALYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCASGVAWGQGTLVTVSS |
| ALB23002 | 5 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
表 A-2 ： CDR 和架構的序列（ 」「 ID 」 是指給定的 SEQ ID NO ）
* A02260018C08的序列優化變異體（SEQ ID NO: 48）
° A02260015A08的序列優化變異體（SEQ ID NO: 47）
| ID | ISVD | ID | FR1 | ID | CDR1 | ID | FR2 | ID | CDR2 | ID | FR3 | ID | CDR3 | ID | FR4 |
| 2 | TCE01 | 18 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVAS | 6 | GYVHKINFYG | 20 | WYRQAPGKEREKVA | 10 | HISIGDQTD | 24 | YADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRA | 14 | LSRIWPYDY | 28 | WGQGTLVTVSS |
| 3 | A022600351* | 19 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS | 7 | GFTFSSFAMT | 21 | WVRRPPGKGLEWVA | 11 | TITNKGVTS | 25 | YADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYICAN | 15 | ARRTGPRAPTDIGSY | 29 | RGQGTLVTVSS |
| 4 | A022600314° | 19 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS | 8 | GSIFRSVFSSSTME | 22 | WYRQAPGKKRELVA | 12 | RIAPGEGTYYGAL | 26 | YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAS | 16 | GVA | 28 | WGQGTLVTVSS |
| 5 | ALB23002 | 19 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS | 9 | GFTFRSFGMS | 23 | WVRQAPGKGPEWVS | 13 | SISGSGSDTL | 27 | YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI | 17 | GGSLSR | 30 | SSQGTLVTVSS |
表 A-2-1 ： CDR 和架構的序列（」「 ID 」是指給定的 SEQ ID NO ）
* A02260018C08的序列優化變異體（SEQ ID NO: 48）
° A02260015A08的序列優化變異體（SEQ ID NO: 47）
| ID | ISVD | ID | FR1 | ID | CDR1 | ID | FR2 | ID | CDR2 | ID | FR3 | ID | CDR3 | ID | FR4 |
| 2 | TCE01 | 39 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHK | 31 | INFYG | 20 | WYRQAPGKEREKVA | 35 | HISIGDQTDYADSAKG | 43 | RFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRA | 14 | LSRIWPYDY | 28 | WGQGTLVTVSS |
| 3 | A022600351* | 40 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFS | 32 | SFAMT | 21 | WVRRPPGKGLEWVA | 36 | TITNKGVTSYADSVKG | 44 | RFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYICAN | 15 | ARRTGPRAPTDIGSY | 29 | RGQGTLVTVSS |
| 4 | A022600314° | 41 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIFR | 33 | SVFSSSTME | 22 | WYRQAPGKKRELVA | 37 | RIAPGEGTYYGALYADSVKG | 45 | RFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAS | 16 | GVA | 28 | WGQGTLVTVSS |
| 5 | ALB23002 | 42 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFR | 34 | SFGMS | 23 | WVRQAPGKGPEWVS | 38 | SISGSGSDTLYADSVKG | 46 | RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI | 17 | GGSLSR | 30 | SSQGTLVTVSS |
表
A-3
：所選多價
ISVD
的胺基酸序列
| 名稱 | ID | 胺基酸序列 |
| A022600424 | 1 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNKGVTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIFRSVFSSSTMEWYRQAPGKKRELVARIAPGEGTYYGALYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
表
A-4
：血清白蛋白結合
ISVD
序列（」「
ID
」是指如本文所用的
SEQ ID NO
）
| 名稱 | ID | 胺基酸序列 |
| Alb8 | 82 | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb8-A | 83 | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb23 | 84 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb23-A | 85 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb83 | 86 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb83-A | 87 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb132 | 88 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb132-A | 89 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb73 | 90 | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSS |
| Alb73-A | 91 | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSSA |
| Alb82 | 92 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb82-A | 93 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb199 | 94 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSS |
| Alb199-A | 95 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSSA |
| Alb23002 | 5 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb223 | 96 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb216 | 97 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSS |
| Alb216-A | 98 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSSA |
表
A-5
：連接子序列（
」「
ID
」
是指如本文所用的
SEQ ID NO
）
| 名稱 | ID | 胺基酸序列 |
| 3A連接子 | 99 | AAA |
| 5GS連接子 | 100 | GGGGS |
| 7GS連接子 | 101 | SGGSGGS |
| 8GS連接子 | 102 | GGGGSGGS |
| 9GS連接子 | 103 | GGGGSGGGS |
| 10GS連接子 | 104 | GGGGSGGGGS |
| 15GS連接子 | 105 | GGGGSGGGGSGGGGS |
| 18GS連接子 | 106 | GGGGSGGGGSGGGGSGGS |
| 20GS連接子 | 107 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 25GS連接子 | 108 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 30GS連接子 | 109 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 35GS連接子 | 110 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 40GS連接子 | 111 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| G1鉸鏈 | 112 | EPKSCDKTHTCPPCP |
| 9GS-G1鉸鏈 | 113 | GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP |
| 美洲駝上部長鉸鏈區 | 114 | EPKTPKPQPAAA |
| G3鉸鏈 | 115 | ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP |
表
A-6
：所選多價多肽的胺基酸序列（」「
ID
」是指給定的
SEQ ID NO
）
| SEQ | ID | 序列 |
| 49 | A022600027 | DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGDVHKINFLGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNMVYLQMNSLKPEDTAVYFCRAFSRIYPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGLTFSSYAMGWFRQAPGKERERVVSISRGGGYTYYADSVKGRFTISRDNSENTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAARYWATGSEYEFDYWGQGTLVTVSS |
| 50 | A022600031 | DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGDVHKINFLGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNMVYLQMNSLKPEDTAVYFCRAFSRIYPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGSIFRSVFSSSTMEWYRQPPGKKRELVARIAPGDGTNYGALYADSVKGRFTISRDDAKKTVDLQMNSLKPEDTGVYFCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGLTFSSYAMGWFRQAPGKERERVVSISRGGGYTYYADSVKGRFTISRDNSENTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAARYWATGSEYEFDYWGQGTLVTVSS |
| 51 | A022600096 | DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 52 | A022600102 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSAAAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 53 | A022600103 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 54 | A022600104 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 55 | A022600105 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 56 | A022600122 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSIFRSVFSSSTMEWYRQPPGKKRELVARIAPGDGTNYGALYADSVKGRFTISRDDAKKTVDLQMNSLKPEDTGVYFCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 57 | A022600131 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSIFRSVFSSSTMEWYRQPPGKKRELVARIAPGDGTNYGALYADSVKGRFTISRDDAKKTVDLQMNSLKPEDTGVYFCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 58 | A022600132 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSIFRSVFSSSTMEWYRQPPGKKRELVARIAPGDGTNYGALYADSVKGRFTISRDDAKKTVDLQMNSLKPEDTGVYFCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 59 | A022600133 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSIFRSVFSSSTMEWYRQPPGKKRELVARIAPGDGTNYGALYADSVKGRFTISRDDAKKTVDLQMNSLKPEDTGVYFCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 60 | A022600134 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSIFRSVFSSSTMEWYRQPPGKKRELVARIAPGDGTNYGALYADSVKGRFTISRDDAKKTVDLQMNSLKPEDTGVYFCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 61 | A022600135 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSIFRSVFSSSTMEWYRQPPGKKRELVARIAPGDGTNYGALYADSVKGRFTISRDDAKKTVDLQMNSLKPEDTGVYFCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 62 | A022600167 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 63 | A022600168 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSIFRSVFSSSTMEWYRQPPGKKRELVARIAPGDGTNYGALYADSVKGRFTISRDDAKKTVDLQMNSLKPEDTGVYFCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 64 | A022600169 | DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSIFRSVFSSSTMEWYRQPPGKKRELVARIAPGDGTNYGALYADSVKGRFTISRDDAKKTVDLQMNSLKPEDTGVYFCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 65 | A022600170 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSIFRSVFSSSTMEWYRQPPGKKRELVARIAPGDGTNYGALYADSVKGRFTISRDDAKKTVDLQMNSLKPEDTGVYFCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 66 | A022600172 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSIFRSVFSSSTMEWYRQPPGKKRELVARIAPGDGTNYGALYADSVKGRFTISRDDAKKTVDLQMNSLKPEDTGVYFCASGVAWGQGTLVTVSSA |
| 67 | A022600174 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSIFRSVFSSSTMEWYRQPPGKKRELVARIAPGDGTNYGALYADSVKGRFTISRDDAKKTVDLQMNSLKPEDTGVYFCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 68 | A022600175 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSIFRSVFSSSTMEWYRQPPGKKRELVARIAPGDGTNYGALYADSVKGRFTISRDDAKKTVDLQMNSLKPEDTGVYFCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 69 | A022600178 | DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 70 | A022600179 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 71 | A022600370 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLRPEDTALYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGC |
| 72 | A022600372 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLRPEDTALYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGSIFRSVFSSSTMEWYRQPPGKKRELVARIAPGDGTNYGALYADSVKGRFTISRDDAKKTVDLQMNSLRPEDTGLYFCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGC |
| 73 | A022600373 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGC |
| 74 | T017000698 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 78 | A022600412 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNAGVTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 1 | A022600424 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNKGVTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIFRSVFSSSTMEWYRQAPGKKRELVARIAPGEGTYYGALYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 79 | A022600425 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIFRSVFSSSTMEWYRQAPGKKRELVARIAPGEGTYYGALYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNAGVTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 80 | A022600426 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIFRSVFSSSTMEWYRQAPGKKRELVARIAPGEGTYYGALYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNKGVTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| 81 | A022600427 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNAGVTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIFRSVFSSSTMEWYRQAPGKKRELVARIAPGEGTYYGALYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
表
A-7
：具有或不具有
C
末端延長的
C
末端（」「
ID
」是指如本文所用的給定
SEQ ID NO
）
| ID | 胺基酸序列 |
| 116 | VTVSS |
| 117 | VKVSS |
| 118 | VQVSS |
| 119 | VTVKS |
| 120 | VTVQS |
| 121 | VKVKS |
| 122 | VKVQS |
| 123 | VQVKS |
| 124 | VQVQS |
| 125 | VTVSSA |
| 126 | VKVSSA |
| 127 | VQVSSA |
| 128 | VTVKSA |
| 129 | VTVQSA |
| 130 | VKVKSA |
| 131 | VKVQSA |
| 132 | VQVKSA |
| 133 | VQVQSA |
表
A-8
：與
GPC3
和
TCR
有關的胺基酸序列
6
實例
6.1
實例
1
：特異性結合至
GPC3
的
ISVD
的發現
| ID | 描述 | 胺基酸序列 |
| 134 | 人GPC3（P51654） | MAGTVRTACLVVAMLLSLDFPGQAQPPPPPPDATCHQVRSFFQRLQPGLKWVPETPVPGSDLQVCLPKGPTCCSRKMEEKYQLTARLNMEQLLQSASMELKFLIIQNAAVFQEAFEIVVRHAKNYTNAMFKNNYPSLTPQAFEFVGEFFTDVSLYILGSDINVDDMVNELFDSLFPVIYTQLMNPGLPDSALDINECLRGARRDLKVFGNFPKLIMTQVSKSLQVTRIFLQALNLGIEVINTTDHLKFSKDCGRMLTRMWYCSYCQGLMMVKPCGGYCNVVMQGCMAGVVEIDKYWREYILSLEELVNGMYRIYDMENVLLGLFSTIHDSIQYVQKNAGKLTTTIGKLCAHSQQRQYRSAYYPEDLFIDKKVLKVAHVEHEETLSSRRRELIQKLKSFISFYSALPGYICSHSPVAENDTLCWNGQELVERYSQKAARNGMKNQFNLHELKMKGPEPVVSQIIDKLKHINQLLRTMSMPKGRVLDKNLDEEGFESGDCGDDEDECIGGSGDGMIKVKNQLRFLAELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEISTFHNLGNVHSPLKLLTSMAISVVCFFFLVH |
| 135 | 人TCRα恆定結構域（源自P01848） | PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSC |
| 136 | 人TCRβ恆定結構域（源自P01850） | EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADC |
用含有編碼人磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3亞型2前體[NP_004475；580個AA；智人（Homo sapiens）]的序列的DNA雙基因載體對2只美洲駝和1只羊駝進行免疫接種。之後，用重組人磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3（R&D Systems，目錄號2119-GP）對所述動物進行加強。
在最終免疫原注射後，收集血樣並根據製造商的說明書（Amersham Biosciences，皮斯卡塔韋，新澤西州，美國）使用Ficoll-Hypaque製備外周血單個核細胞（PBMC），並且提取並儲存總RNA。
使用總RNA作為RT-PCR的起始材料以擴增編碼ISVD的基因片段。將這些片段選殖至噬菌粒載體pAX212中。根據標準方案（Antibody Phage Display: Methods and Protocols（第一版, 2002, O'Brian和Aitken編輯, Humana Press, 托托瓦, 新澤西州））製備噬菌體，並在4ºC下過濾滅菌後儲存直至進一步使用。從每只免疫接種的動物構建噬菌體文庫，得到3 x 10
8、6 x 10
8和8 x 10
8cfu的文庫大小。
使用重組蛋白探測噬菌體展示文庫。簡言之，將噬菌體顆粒以50 nM（在補充有2% Marvel和0.05% Tween 20的PBS中）添加至生物素化抗原（人GPC3 R&D Systems，目錄號2119-GP；食蟹猴GPC3 DGPI DHS-HIS，內部生產（登錄號P51654；Q3-R358；S359-H559、S495A、S509A）；都使用標準方案生物素化）。在鏈黴親和素或抗生物素包被的磁珠（Invitrogen）上捕獲生物素化抗原。洗除（用補充有0.05% Tween 20的PBS）未結合的噬菌體；通過添加胰蛋白酶（1 mg/mL，於PBS中）來洗脫結合的噬菌體。允許洗脫的噬菌體感染指數型生長的大腸桿菌TG-1細胞以用於後續選擇輪次（在用輔助噬菌體拯救後），和/或用於在瓊脂板上鋪板後篩選單獨殖株。為此，將單獨菌落挑取至含有0.5 mL培養基的96深孔盤中並生長過夜。將每個殖株的80 µL過夜培養物與40 µL的2xTY中的60%甘油混合並儲存於-80ºC。
對於ISVD的小規模生產，用所述過夜培養物接種96深孔盤（1 mL體積）。通過添加IPTG至1 mM的終濃度來誘導ISVD表現。通過冷凍細胞沈澱並將其溶解於100 µL PBS中來製備周質提取物(periplasmic extract)。通過離心去除細胞碎片。
在ELISA中針對與人和食蟹猴GPC3的結合來篩選周質提取物。將384孔高結合SpectraPlate（PerkinElmer，6007509）在4 ºC用1 μg/mL的蛋白質（於PBS中）塗布過夜。然後將板在RT封閉至少一小時（PBS，1%酪蛋白）。添加周質提取物的1 : 10稀釋液（於PBS中，0.1%酪蛋白、0.05% Tween 20），在RT持續一小時。洗除（補充有0.05 % Tween 20的PBS）未結合的周質提取物並使用小鼠抗FLAG-HRP（Sigma-Aldrich，目錄號A8592）和後續酶反應在底物esTMB（3,3',5,5'-四甲基聯苯胺；SDT）的存在下檢測結合的ISVD。
對ELISA中的陽性命中進行DNA測序，並且針對與人和食蟹猴GPC3的解離率以及與表現人和食蟹猴GPC3的細胞的結合來進一步分析非冗餘殖株。
ISVD的解離率是在ProteOn XPR36儀器（Bio-Rad Laboratories, Inc.）上確定的。將ProteOn GLC感測器晶片用食蟹猴磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3 ΔGPI-HIS（內部生產；登錄號P51654；Q3-R358；S359-H559）和人GPC3（R&D Systems，目錄號2119-GP）塗布。將周質提取物在ProteOn PBS Tween緩衝液（PBS，pH 7.4，0.005% Tween 20（167-2720，BioRad））中1 : 10稀釋。在25 ºC進行實驗。通過參考泳道減除以及空白緩衝液注射的減除對所獲得的資料進行雙重參考。將加工的曲線用於基於朗繆爾解離（解離率分析）模型的解離率分析。
在流式細胞術中分別使用表現人GPC3（登錄號P51654；Q25-R358、S359-H580）或食蟹猴GPC3（登錄號P51654；Q3-R358；S359-H559）的CHO Flp-In細胞（Invitrogen目錄號K6010）針對人和食蟹猴GPC3結合篩選周質提取物。簡言之，將1 × 10
5個細胞在1:5稀釋的周質提取物中在4ºC培育30 min，然後洗滌3次。作為對照，包括親本CHO Flp-In細胞株（Invitrogen目錄號K6010）。接下來，將細胞與1 µg/mL單株抗FLAG® M2抗體（Sigma-Aldrich，目錄號F1804）在4ºC一起培育30 min，再次洗滌，並且與山羊抗小鼠PE標記的抗體（1:100；Jackson Immunoresearch，目錄號115-115-164）在4ºC一起培育30 min。將樣品洗滌並重懸於補充有5 nM TOPRO3（Molecular Probes，目錄號T3605）的FACS緩衝液（具有10% FBS（Sigma）和0.05%迭氮化鈉（Merck）的D-PBS（Gibco））中。然後在FACS Array上分析細胞懸浮液。使用前向/側向散射和TOPRO3通道螢光參數，針對活的完整細胞設置門控。高於針對包括非結合ISVD的對照條件所獲得的那些的平均PE通道螢光值指示命中。
基於解離率分析以及與表現人和食蟹猴GPC3的CHO細胞的結合（表2），選擇兩個ISVD（表1）。
表
1
：抗
GPC3 ISVD
的胺基酸序列
| ISVD ID | 序列 |
| A0226015A08 (SEQ ID NO: 47) | EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGSIFRSVFSSSTMEWYRQPPGKKRELVARIAPGDGTNYGALYADSVKGRFTISRDDAKKTVDLQMNSLKPEDTGVYFCASGVAWGQGTLVTVSS |
| A0226018C08 (SEQ ID NO: 48) | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNGGVTSYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLNPEDTAVYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSS |
表
2
：抗
GPC3 ISVD A0226015A08
和
A0226018C08
的篩選結果的匯總
6.2
實例
2
：基於三特異性
GPC3 ISVD
的
T
細胞接合器的生成
| ISVD ID | k offhGPC3（1/s） | k offcyGPC3（1/s） | 比率MFI hGPC3 CHO / CHO | 比率MFI cyGPC3 CHO / CHO |
| A0226015A08 | 3.3E-04 | 4.0E-04 | 58.2 | 13.7 |
| A0226018C08 | 9.7E-04 | 1.1E-03 | 158.9 | 19.9 |
將所選抗GPC3 ISVD（表1中的序列）在三特異性構建體中格式化，所述三特異性構建體具有在N末端處的結合至TCR的恆定結構域的固定T細胞接合器ISVD（T0170056G05，抗TCR）以及在C末端處的固定白蛋白結合ISVD（ALBX00001）。所述構建體中的構建塊通過柔性35GS（GlySer連接子）來遺傳連接，從而得到形式抗TCR-35GS-抗GPC3-35GS-ALBX00001（表3）。胺基酸序列顯示於表A-6中。
多價ISVD在巴斯德畢赤酵母中表現。使含有目的ISVD構建體的巴斯德畢赤酵母NRRL Y-11430細胞在BGCM培養基中生長。隨後，將培養基轉換為BMCM並且使構建體進一步生長且通過逐步添加甲醇進行誘導。使細胞旋轉沈降並收集上清液（含有分泌的ISVD）。
在蛋白A樹脂上純化多價ISVD，之後進行脫鹽步驟以及（如果需要）在D-PBS中的製備型SEC。
表
3
：三特異性
ISVD
構建體的樣品
ID
和描述
6.3
實例
3
：三特異性
GPC3 ISVD T
細胞接合器的
T
細胞依賴性細胞毒性
| 樣品 ID | SEQ ID NO | 描述 |
| A022600027 | 49 | T0170056G05-35GS-A0226018C08-35GS-ALBX00001 |
| A022600031 | 50 | T0170056G05-35GS-A0226015A08-35GS-ALBX00001 |
在T細胞依賴性細胞毒性測定（TDC）中表徵含有抗GPC3 ISVD的三特異性T細胞接合器（表3）。將具有高GPC3表現的肝癌細胞株HepG2（ATCC，殖株HB8065）用Nuclight Green（Essen Bioscience，目錄號4624）標記，並且在包含A0226015A08或A0226018C08的三特異性T細胞接合器構建體（即分別為構建體A022600031或A022600027）的存在下或者在呈形式抗TCR-35GS-抗GPC3-35GS-HLE（HLE = 半衰期延長因子）的具有參考GPC3結合單一結構域抗體（Ab1）的構建體的存在下用作T細胞殺傷的目標。為此，將板（96孔F底，Greiner，目錄號655180）用200 µL/孔的測定培養基預封閉（2 h，37ºC）。每種測定組分的同時添加以200 µL/孔的總體積來進行：(1) 50 µL稀釋的/滴定的化合物（Nbs；佈雷菲德菌素A（Sigma-Aldrich，目錄號B7651）；(2) 25 µL稀釋的HSA（Sigma-Aldrich，目錄號A8763-10G）（終濃度：30 µM）；(3) 25 µL稀釋的Cytotox Red（Essen Bioscience，目錄號4632）（終濃度：250 nM）；(4) 50 µL人T細胞（T細胞是從膚色血球層（Red Cross）使用RosetteSep T細胞富集混合物（StemCell，目錄號15061）分離），以及50 µL的HepG2 Nuclight green（新鮮的，於DNEM（高葡萄糖，GlutaMAX，丙酮酸鹽）中，Life Technologies-Gibco，目錄號31966），呈15 : 1比率。將板置於IncuCyte ZOOM中用於在所有三個通道中讀出（相襯，綠色和紅色），間隔4或6小時，總計72h。
所測試的三特異性GPC3 T細胞接合器以劑量依賴性方式誘導人T細胞介導的對HepG2 Nuclight green的殺傷，如圖1中所示。IC50值和最大殺傷百分比顯示於表4中。
表
4
：在基於
Incucyte
的人
TDC HepG2-Nuclight green
測定中，使用
15:1
的效應子與目標比率，在接種後
60h
進行分析，三特異性
GPC3 ISVD T
細胞接合器的
IC50
（
M
）和最大殺傷百分比（
%
）
6.4
實例
4
：
GPC3
結合物的表位分區（
Epitope binning
）
| 樣品 ID | IC50 （ M ） | 最大殺傷 % |
| A022600027 | 8.6E-09 | 80 |
| A022600031 | 1.5E-08 | 75 |
| Ab1 | 1.3E-08 | 40 |
抗GPC3 ISVD的表位分區是通過允許單價ISVD A0226015A08或A0226018C08的周質提取物與呈純化三特異性形式的ISVD競爭的流式細胞術來進行。為此，將4 × 10
4個人GPC3 CHO Flp-In細胞（參考，參見實例1）與周質提取物的1/15和1/150稀釋物、150 nM競爭劑（三特異性ISVD形式；過飽和濃度）以及0.2 µg/mL的單株抗FLAG® M2抗體（Sigma-Aldrich，目錄號F1804）和大鼠抗小鼠APC（BD-Pharmingen，目錄號550874）在RT和300 rpm下一起培育5 h。在iQue篩選器中讀取樣品。在A0226015A08與A0226018C08之間未觀察到競爭，表明它們結合至不同的不重疊的表位。
6.5 實例 5 ： GPC3 ISVD T 細胞接合器的格式最佳化
在T細胞依賴性細胞毒性（TDC）HepG2 Nuclight green測定中，呈表3中所述形式的GPC3 ISVD T細胞接合器未達到完全功效，如通過最大殺傷百分比所指示（實例3）。為了增加效力和功效，生成其中抗GPC3 ISVD與以下組合的三特異性構建體：在N末端處的抗TCR ISVD T0170056G05的序列優化變異體，即T017000624；在C末端處的白蛋白結合ISVD，即ALB23002-A（具有C末端單一丙胺酸延長的SEQ ID NO: 5）；以及在所述構建體中心位置的一或多個GPC3結合ISVD（表5和表6）。所述優化包括兩個步驟：步驟1 - 抗TCR ISVD與抗GPC3 ISVD之間的連接子長度的優化（三特異性三價形式）；步驟2 - 雙互補位GPC3 ISVD T細胞接合器的生成（三特異性四價形式）以及兩個GPC3結合ISVD之間的連接子長度的優化。胺基酸序列顯示於表A-6中。
在TDC HepG2 Nuclight green測定中測試所生成的形式，如實例3中所述。用於步驟1和步驟2形式的分析分別是在接種後72h或60h進行。
表5和表6分別顯示在TDC HepG2 Nuclight green測定中，在格式最佳化的步驟1和步驟2中，不同形式的IC50值和最大殺傷%。
在步驟1中，隨著抗TCR ISVD與抗GPC3 ISVD之間的連接子長度減小，三特異性GPC3 ISVD T細胞接合器顯示具有增加的功效的細胞腫瘤殺傷（增加的最大殺傷），從72%（35GS連接子）至94%（AAA連接子）（圖2）。在步驟2中，測試GPC3雙互補位T細胞接合器，對於其將A0226018C08和A0226015A08在同一構建體中組合並置於不同定向且在兩個構建塊之間具有不同連接子長度。此處，觀察到所測試的變數對功效沒有影響（圖3）。
表
5
：在基於
Incucyte
的人
TDC HepG2-Nuclight green
測定中，使用
15 : 1
的效應子與目標比率，在接種後
72h
進行分析，三特異性
GPC3 ISVD T
細胞接合器的
IC50
（
M
）和最大殺傷百分比（
%
）
| 步驟 | 樣品 ID | SEQ ID NO | 描述 | IC50 （ M ） | 最大殺傷 % |
| 1 | A022600096 | 51 | T017000624-35GS-A0226018C08-35GS-ALB23002-A | 1.4E-09 | 72 |
| A022600105 | 55 | T017000624-20GS-A0226018C08-35GS-ALB23002-A | 2.14E-09 | 85 | |
| A022600104 | 54 | T017000624-9GS-A0226018C08-35GS-ALB23002-A | 2.13E-09 | 90 | |
| A022600103 | 53 | T017000624-5GS-A0226018C08-35GS-ALB23002-A | 2.04E-09 | 92 | |
| A022600102 | 52 | T017000624-AAA-A0226018C08-35GS-ALB23002-A | 1.72E-09 | 94 |
表
6
：在基於
Incucyte
的人
TDC HepG2-Nuclight green
測定中，使用
15 : 1
的效應子與目標比率，在接種後
72h
進行分析，三特異性
GPC3 ISVD T
細胞接合器的
IC50
（
M
）和最大殺傷百分比（
%
）
| 步驟 | 樣品 ID | SEQ ID NO | 描述 | IC50 （ M ） | 最大殺傷 % |
| 2 | A022600103 | 53 | T017000624-5GS-A0226018C08-35GS-ALB23002-A | 5.43E-10 | 90 |
| A022600122 | 56 | T017000624-5GS-A0226018C08-35GS-A0226015A08-35GS-ALB23002-A | 4.45E-10 | 92 | |
| A022600131 | 57 | T017000624-5GS-A0226018C08-20GS-A0226015A08-35GS-ALB23002-A | 4.44E-10 | 94 | |
| A022600132 | 58 | T017000624-5GS-A0226018C08-9GS-A0226015A08-35GS-ALB23002-A | 7.02E-10 | 91 | |
| A022600133 | 59 | T017000624-5GS-A0226015A08-35GS-A0226018C08-35GS-ALB23002-A | 4.08E-10 | 92 | |
| A022600134 | 60 | T017000624-5GS-A0226015A08-20GS-A0226018C08-35GS-ALB23002-A | 5.28E-10 | 92 | |
| A022600135 | 61 | T017000624-5GS-A0226015A08-9GS-A0226018C08-35GS-ALB23002-A | 6.11E-10 | 91 |
為了評價與HepG2的高水準相比，殺傷表現中等GPC3水準的肝癌細胞株的能力，進行TDC Huh7測定。為此，使用xCELLigence®（Acea）系統。首先，將含有50 µL測定培養基的96孔E板（Acea，目錄號5232368001）置於xCELLigence®內部用於背景測量，所述測定培養基具有4x濃度（120 µM）的Alburex 20人血清白蛋白（CSL Behring，目錄號2160-979）（最終測定濃度30 µM）。在背景測量後，進行每種測定組分的同時添加至200 µL/孔的總體積：(1) 50 µL稀釋的/滴定的化合物；(2) 50 µL的Huh7（HSRRB，殖株JCRB0403）的單細胞懸浮液；(3) 50 µL效應細胞（人T細胞，如實例3中所述來獲得）的單一懸浮液以匹配15 : 1的效應子:目標比率。將板置於xCELLigence®中，以15分鐘間隔進行400次掃描。在適當的時間點（大約60h），分析細胞指數（CI），其中CI為0表示100%殺傷。
在GPC3 T細胞接合器格式最佳化的第3步驟中，抗TCR ISVD T017000624被呈三價和四價形式的已測序的優化的變異體T017000680（TCE01，SEQ ID NO: 2）取代。在HepG2和Huh7 TDC測定中評估效力和功效，如上所述。所述形式、其描述和功能性匯總於表7中。數據描繪於圖4中。格式最佳化的第三步驟導致構建體之間更小的功效增加。根據此實踐，採用GPC3 T細胞接合器形式A022600167和A022600168。
GPC3 T細胞接合器格式最佳化的步驟4在於改變抗TCR ISVD相對於抗GPC3 ISVD的定向，但是這對效力和功效有影響（表8，圖5）。對於三價形式，殺傷功效喪失。對於四價形式，仍然可以觀察到功能性，其效力和功效有所降低；對HepG2 Nuclight green的殺傷功效降低20%，並且對Huh7的殺傷功效降低40%。此外，改變抗GPC3 ISVD相對於抗白蛋白ISVD的定向也對殺傷功效有影響。根據此實踐，不對GPC3 T細胞接合器形式A022600167和A022600168做出改變。
GPC3 T細胞接合器格式最佳化的步驟5在於改變連接子長度（表9，圖6）。在呈三價形式的抗白蛋白ISVD之前減小連接子長度導致降低的功效。這在四價形式中未被觀察到，因此在這種情形中，可以在9GS與35GS連接子長度之間做出選擇。
從GPC3 T細胞接合器形式A022600167和A022600168的組代表在TDC測定中具有最高效力和功效的三特異性三價和四價形式。儘管功效是可比較的，但三價形式A022600167與四價形式A022600168的效力不同。在HepG2 TDC測定中，A022600167的效力比A022600168低5倍，而在Huh7 TDC測定中，所述差異增加至50倍。
表
7
：
GPC3 ISVD T
細胞接合器格式最佳化的步驟
3
。在基於
Incucyte
的人
TDC HepG2-Nuclight green
測定中以及在基於
xCELLigence
的人
TDC Huh7
測定中，使用
15 : 1
的效應子與目標比率，在接種後
60h
進行分析，三特異性
GPC3 ISVD T
細胞接合器的
IC50
（
M
）和最大殺傷百分比（
%
）
| 樣品 ID | SEQ ID NO | 描述 | Incucyte 上的 HepG2 IC50 （ M ） | Incucyte 上的 HepG2 最大殺傷 % | xCELLigence 上的 Huh7 IC50 （ M ） | xCELLigence 上的 Huh7 最大殺傷 % |
| A022600103 | 53 | T017000624-5GS-A0226018C08-35GS-ALB23002-A | 1.23E-09 | 96 | 7.11E-09 | 71 |
| A022600167 | 62 | TCE01-5GS-A0226018C08-35GS-ALB23002-A | 1.92E-09 | 98 | 8.61E-09 | 91 |
| A022600122 | 56 | T017000624-5GS-A0226018C08-35GS-A0226015A08-35GS-ALB23002-A | 5.3E-10 | 93 | 2.61E-10 | 101 |
| A022600168 | 63 | TCE01-5GS-A0226018C08-35GS-A0226015A08-35GS-ALB23002-A | 3.67E-10 | 103 | 1.98E-10 | 107 |
| A022600132 | 58 | T017000624-5GS-A0226018C08-9GS-A0226015A08-35GS-ALB23002-A | 6.83E-10 | 83 | 2.9E-10 | 95 |
| A022600175 | 68 | TCE01-5GS-A0226018C08-9GS-A0226015A08-35GS-ALB23002-A | 5.27E-10 | 96 | 5.86E-11 | 99 |
表
8
：
GPC3 ISVD T
細胞接合器格式最佳化的步驟
4
。在基於
Incucyte
的人
TDC HepG2-Nuclight green
測定中以及在基於
xCELLigence
的人
TDC Huh7
測定中，使用
15 : 1
的效應子與目標比率，在接種後
60h
進行分析，三特異性
GPC3 ISVD T
細胞接合器的
IC50
（
M
）和最大殺傷百分比（
%
）
| 樣品 ID | SEQ ID NO | 描述 | Incucyte 上的 HepG2 IC50 （ M ） | Incucyte 上的 HepG2 最大殺傷 % | xCELLigence 上的 Huh7 IC50 （ M ） | xCELLigence 上的 Huh7 最大殺傷 % |
| A022600167 | 62 | TCE01-5GS-A0226018C08-35GS-ALB23002-A | 1.92E-09 | 98 | 8.61E-09 | 91 |
| A022600178 | 69 | A0226018C08-5GS-TCE01-35GS-ALB23002-A | 無作用 | 無作用 | ||
| A022600168 | 63 | TCE01-5GS-A0226018C08-35GS-A0226015A08-35GS-ALB23002-A | 3.67E-10 | 103 | 1.98E-10 | 107 |
| A022600169 | 64 | A0226018C08- 5GS-TCE01-5GS- A0226015A08-35GS-ALB23002-A | 6.41E-10 | 81 | 1.02E-09 | 61 |
| A022600174 | 67 | TCE01-5GS-A0226018C08-9GS-A0226015A08-9GS-ALB23002-A | 6.73E-10 | 96 | 6.26E-11 | 99 |
| A022600172 | 66 | TCE01-5GS-A0226018C08-9GS-ALB23002-9GS-A0226015A08-A | 6.01E-10 | 81 | 6.70E-11 | 90 |
表
9
：
GPC3 T
細胞接合器格式最佳化的步驟
5
。在基於
Incucyte
的人
TDC HepG2-Nuclight green
測定中以及在基於
xCELLigence
的人
TDC Huh7
測定中，使用
15 : 1
的效應子與目標比率，在接種後
60h
進行分析，三特異性
GPC3 ISVD T
細胞接合器的
IC50
（
M
）和最大殺傷百分比（
%
）
6.6
實例
6
：在可溶
GPC3
的存在下對
T
細胞活化誘導的評估
| 樣品 ID | SEQ ID NO | 描述 | Incucyte 上的 HepG2 IC50 （ M ） | Incucyte 上的 HepG2 最大殺傷 % | xCELLigence 上的 Huh7 IC50 （ M ） | xCELLigence 上的 Huh7 最大殺傷 % |
| A022600167 | 62 | TCE01-5GS-A0226018C08-35GS-ALB23002-A | 1.92E-09 | 98 | 8.61E-09 | 91 |
| A022600179 | 70 | TCE01-5GS-A0226018C08-9GS-ALB23002-A | 2.92E-09 | 76 | 6.13E-09 | 66 |
| A022600168 | 63 | TCE01-5GS-A0226018C08-35GS-A0226015A08-35GS-ALB23002-A | 3.67E-10 | 103 | 1.98E-10 | 107 |
| A022600170 | 65 | TCE01-5GS-A0226018C08-35GS-A0226015A08-9GS-ALB23002-A | 3.19E-10 | 97 | 1.86E-10 | 103 |
| A022600175 | 68 | TCE01-5GS-A0226018C08-9GS-A0226015A08-35GS-ALB23002-A | 5.27E-10 | 96 | 5.86E-11 | 99 |
| A022600174 | 67 | TCE01-5GS-A0226018C08-9GS-A0226015A08-9GS-ALB23002-A | 6.73E-10 | 96 | 6.26E-11 | 99 |
GPC3可以以可溶形式被釋放至循環中，且其水準在高達50%的HCC患者中有所增加。循環中的可溶GPC3抗體聚集體可以導致免疫複合物沈積和相關毒性。因此，重要的是評估在GPC3 T細胞接合器的存在下可溶GPC3對T細胞活化的影響。
所報告的血清GPC3水準可以在10至300 ng/mL之間變化，其對應於0.1至10 nM。所述評估是使用1、10和100 nM可溶GPC3在三特異性GPC3 ISVD T細胞接合器A022600167和A022600168的存在下以三種方式進行：(1) 在目標細胞（Huh-7）和可溶GPC3存在下的細胞毒性（圖7A）：與不存在可溶GPC3的情況相比，未觀察到另外的殺傷；(2) 在目標細胞和可溶GPC3存在下的CD69上調（圖7B）：與不存在可溶GPC3的情況相比，未觀察到另外的T細胞活化；(3) 在不存在目標細胞且存在可溶GPC3的情況下的CD69上調（圖7C）：未觀察到T細胞活化。因此認為由於可溶GPC3的血清水準增加所致的毒性影響的風險低。
如實例5中所述進行對Huh-7的細胞毒性測定。通過流式細胞術使用抗CD69抗體（BD Pharmigen，目錄號557050）和抗小鼠IgG1抗體（BD Pharmigen，目錄號556650）來確定T細胞上的CD69表現。
6.7 實例 7 ： GPC3 介導的 T 細胞接合器內化
已知GPC3會內化，並且其內化速率可能對化合物的功效有影響。在Huh-7細胞中在48h的時程中評估在等效於A022600167和A022600168的三特異性GPC3 ISVD T細胞接合器以及參考CD3-GPC3雙特異性T細胞接合器抗體（Ab2）的存在下的內化速率和GPC3受體密度（表10）。
內化是通過用pHAb（Promega，目錄號G9841）標記A022600167和A022600168以及Ab2來確定，所述pHAb是一種pH敏感染料，其在pH ＞ 7具有低螢光並且其螢光在溶液pH變為酸性時顯著增加。對於此標記，生成在C末端具有額外-GGC的形式以實現所述標記的單一位點摻入（表10）：A022600167-GGC對應於A022600370，A022600168-GGC對應於A022600372，並且作為對照，生成不含GPC3 ISVD的形式A022600373。在BD FACSArray上用黃色鐳射讀取測定（pHAb：激發最大值在532 nm處，發射最大值在560 nm處）。內化速率是通過與4ºC在0.5 h相比，在37ºC在不同時間點（0.5 h、3 h、24 h和48 h）對內化進行定量來確定（表10，圖8A）。
受體表現是使用固定濃度的3xFLAG-His6標記的ISVD（20 nM）與用於檢測的APC標記的抗FLAG組合在BD FACSArray上用紅色鐳射來確定，所述ISVD結合至與A02260018C08和A02260015A08不同的GPC3表位（表10，圖8B）。
將內化速率計算為具有任意單位的動力學曲線的斜率。三特異性GPC3 ISVD T細胞接合器顯示比參考雙特異性T細胞接合器Ab2更慢的內化速率。GPC3 ISVD T細胞接合器的內化是GPC3介導的，因為不具有GPC3結合ISVD的對照形式（A022600373）不顯示內化。在48 h內未觀察到GPC3細胞表面表現的降低（表10，圖8）。
表
10
：
pHAb
標記的三特異性
GPC3 T
細胞接合器的內化速率
6.8
實例
8
：癌細胞株的
GPC3
表現剖析以及與
GPC3 T
細胞接合器的功能性的關聯
| 樣品 ID | SEQ ID NO | 描述 | 標記的 pHAb 程度 | 內化速率（歸一化斜率 n=2 ） |
| A022600370 | 71 | TCE01-5GS-A0226018C08-35GS-ALB23002-GGC | 1 | 194 |
| A022600372 | 72 | TCE01-5GS-A0226018C08-35GS-A0226015A08-35GS-ALB23002-GGC | 1 | 297 |
| A022600373 | 73 | TCE01-20GS-ALB23002-GGC | 1 | 2 |
| Ab2 | - | - | 1.4 | 597 |
通過免疫細胞化學（ICC）並使用QIFIKIT®（Dako，目錄號K0078）根據製造商的說明書來確定一組癌細胞株的GPC3蛋白表現水準（表11）。另外，對肝細胞癌和正常腎樣品進行免疫組織化學（IHC）。
ICC和IHC是使用Ventana discovery XT機器人（Ventana medical system，Roche）來進行。首先將細胞株和組織樣品固定在4%福馬林中，然後用石蠟包埋。脫蠟後，將細胞用緩衝液CC1標準品（Ventana，目錄號950-124）在95ºC的溫度下調理48分鐘，之後用封閉劑A和B（Ventana，目錄號760-104）中的每一種進行4分鐘的封閉步驟。在室溫下施加小鼠單株IgG2a抗GPC3抗體（Ventana，目錄號790-4564）並持續60分鐘，之後用5M NaCl中的0.05%戊二醛（Prolabo，目錄號20879-238）進行4分鐘的固定。在室溫下施加以1/200稀釋度於抗體稀釋劑（Ventana；目錄號760-108）中的生物素化的山羊抗小鼠IgG2a抗體（Southern Biotech，目錄號1080-080）並持續32分鐘。用DABMap試劑盒（Ventana；目錄號760-124）進行檢測。將切片用蘇木精II（Ventana，目錄號790-2208）複染4分鐘並用染藍劑（Ventana，目錄號760-2037）後複染4分鐘，之後脫水並用Cytoseal XYL（Richard-Allan Scientific，目錄號8312-4）封固。通過對細胞染色強度（分級為0：無染色，1（或+）：弱，2（或++）：中等；3（或+++）：強）和每個強度類別中陽性細胞的百分比二者的半定量評估來評價免疫組織化學染色。根據下式計算組織得分（H得分）：
H得分 = 3 x (3級細胞%) + 2 x (2級細胞%) + 1 x (1級細胞%)。
可能的得分範圍是0至300，如文獻中所述（Detre等人, J Clin Pathol 1995; 48:876-878以及Lui等人, Journal of Latex Class filed, 2015年8月, 第14卷, 第8期）。HCC中H得分的確定是基於對GPC3的膜表現的評價。
在所測試的細胞株組內，如用QIFIKIT®所確定，Hep-G2（ATCC，殖株HB-8065；5.2E5個受體/細胞）顯示最高的GPC3表現水準，其次是NCI-H661（ATCC，殖株HTB-183；3.4E5個受體/細胞）和Huh-7（HSRRB，殖株JCRB0403；6.8E4個受體/細胞），後者被認為是中等表現細胞株。這些細胞株源自肝癌和肺癌，所述癌症是相關GPC3表現實體瘤。在ICC中未顯示任何染色的低或極低GPC3表現細胞株是MKN-45（DSMZ，殖株ACC409；1.5E4個受體/細胞）、NCI-H23（ATCC，殖株CRL-5800；2.6E3個受體/細胞）、BxPC-3（ATCC，殖株CRL-1687；1.5E3個受體/細胞）和NCI-H292（ATCC，殖株CRL-1848；6E2個受體/細胞）。
對於癌細胞株與患者腫瘤樣品之間的比較，確定二者的H得分。ICC中的GPC3陽性癌細胞株即Huh-7、NCI-H661和HepG2顯示優於80的H得分（表11），這對應於在IHC中針對GPC3陽性肝細胞癌（HCC）樣品確定的80,75的平均H得分（表12）。正常腎GPC3陽性樣品顯示0,75的平均H得分（表12），而癌細胞株MKN-45、NCI-H23、BxPC-3和NCI-H292對於GPC3染色呈陰性（表11）。採用這些細胞株作為GPC3正常樣表現水準細胞的代表。
為了使用同組癌細胞株評估三特異性GPC3 T細胞接合器的功能性，使用xCELLigence系統進行TDC測定，如實例5中所述；結果顯示於表13和圖9中。對於GPC3高表現細胞株Hep-G2和NCI-H661，與雙特異性T細胞接合器Ab2相比，三特異性GPC3 ISVD T細胞接合器A022600167和A022600168顯示類似效力（NCI-H661）和低10倍的效力（Hep-G2）。對於中等表現細胞株Huh-7，具有與GPC3的雙互補位結合的四價形式A022600168顯示與Ab2相同的效力，而三價形式A022600167的效力低10倍。對於GPC3低表現細胞株MKN-45和BxPC-3，Ab2顯示nM範圍內的效力，而三特異性GPC3 ISVD T細胞接合器顯示無殺傷作用。對於極低GPC3表現細胞株NCI-H292，沒有化合物顯示出作用。缺少GPC3結合ISVD的T細胞接合器T017000698不顯示對任何細胞株的任何殺傷作用，從而確認了三特異性GPC3 T細胞接合器的GPC3特異性作用。
總之，Ab2是能夠殺傷GPC3表現水準低至一千個受體/細胞且H得分為0的癌細胞株的有效T細胞接合器。相比之下，三特異性T細胞接合器形式有效殺傷H得分類似於HCC和大細胞肺癌樣品的高和中等GPC3表現癌細胞株，而不殺傷所表現GPC3水準低於一萬個受體/細胞且H得分低於正常腎樣品的平均值的細胞株。
表
11
：不同癌細胞株的
GPC3
表現水準。
| 細胞株 | 癌症組織 | 表現 RNA FPKM | 表現蛋白 #GPC3 / 細胞 | 表現蛋白 ICC （ H 得分） |
| Hep-G2 | 肝 | 2253 | 619006 | 70%+++, 25%++ (260) |
| NCI-H661 | 肺 | 237 | 346756 | 40%++ (80) |
| Huh-7 | 肝 | 549 | 78027 | 20%++, 40%+ (80) |
| MKN-45 | 胃 | 20.9 | 7453 | 0 |
| NCI-H23 | 肺 | 3.17 | 2255 | 0 |
| BxPC3 | 胰腺 | 5.3 | 1332 | 0 |
| NCI-H292 | 肺 | 0.04 | 452 | 0 |
表
12
：通過免疫組織化學對肝細胞癌和正常腎樣品確定的
GPC3 H
得分（基於對
GPC3
的膜表現的評價）。
| 總病例 | H 得分 | 總 GPC3+ 病例 | H 得分 | |
| HCC | 288 | 52,22 | 187 | 80,75 |
| 正常腎 | 35 | 0,17 | 8 | 0,75 |
表 13 ：在基於 xCELLigence 的人 TDC 測定中，對表現降低的 GPC3 表現水準的不同腫瘤細胞株，使用 15:1 的效應子與目標比率， GPC3 T 細胞接合器的 IC50 （ M ）：在 60h 分析的 HepG2 、在 75h 分析的 NCI-H661 、在 60h 分析的 Huh-7 、在 65h 分析的 MKN-45 、在 65h 分析的 BxPC-3 、在 60h 分析的 NCI-H292 。n.a. = 不可用
6.9 實例 9 ： A0226015A08 和 A0226018C08 的序列優化
| 樣品 ID | SEQ ID NO | 描述 | Hep-G2 | NCI-H661 | Huh-7 | MKN-45 | BxPC-3 | NCI-H292 |
| A022600167 | 62 | TCE01-5GS-A0226018C08-35GS-ALB23002-A | 9.2E-11 | 1.8E-10 | 4.7E-10 | n.a. | n.a. | n.a. |
| A022600168 | 63 | TCE01-5GS-A0226018C08-35GS-A0226015A08-35GS-ALB23002-A | 7.3E-11 | 1.4E-10 | 2.4E-11 | n.a. | n.a. | n.a. |
| T017000698 | 74 | TCE01-9GS- ALB23002-A | n.a. | n.a. | n.a. | n.a. | n.a. | n.a. |
| Ab2 | - | 雙特異性CD3-GPC3 | 1.1E-11 | 2.8E-11 | 3.0E-11 | 2.0E-09 | 3.6E-09 | n.a. |
對ISVD A0226015A08和A0226018C08進行進一步序列優化。
序列優化涉及替代所述序列中的一或多個特定胺基酸殘基，以改進所述ISVD的一種或多種（所需）特性。
這樣的序列優化的一些例子在本文的其他描述中有所提及，並且例如包括但不限於：
1) 親本野生型ISVD序列中的取代，以得到與人VH3-JH種系共有序列更相同的ISVD序列，此過程被稱為人類化。為此，除了所謂的標誌殘基以外，將FR中在ISVD與人VH3-JH種系共有序列之間不同的特定胺基酸以使蛋白質結構、活性和穩定性保持完整的方式改變為人對應物。
2) 朝向美洲駝種系的取代以增加ISVD的穩定性，這被定義為駝類化。為此，將親本野生型ISVD胺基酸序列與ISVD的美洲駝IGHV種系胺基酸序列進行比對（根據ISVD與美洲駝IGHV種系的BlastP分析鑒定為最高命中）。
3) 改進在儲存下的長期穩定性或特性的取代、增加在所需宿主細胞或宿主生物體中的表現水準的取代和/或去除或減少（不需要的）一或多個翻譯後修飾（如糖基化或磷酸化）的取代，仍根據所需宿主細胞或宿主生物體而定。
4) 在位置11朝向Val和在位置89朝向Leu的突變（根據Kabat），以使任何天然存在的預先存在的抗體的結合降至最低。
A0226015A08的序列優化得到最終序列優化變異體A022600314，其與親本ISVD殖株A0226015A08相比包含13個胺基酸取代（即L11V、A14P、V23A、P40A、D52cE、N54Y、D73N、K76N、D79Y、K83R、G88A、V89L、F91Y）（表14）。
A0226018C08的序列優化得到兩種序列優化變異體，即A022600345，其與親本ISVD殖株A0226018C08相比包含8個胺基酸取代（即L11V、V23A、G54A、R60A、E81Q、T82aN、N83R、V89L），以及A022600351，其包含8個胺基酸取代（即L11V、V23A、G54K、R60A、E81Q、T82aN、N83R、V89L）（表14）。
表
14
：
A0226015A08
和
A0226018C08
的序列優化形式的胺基酸序列。
| 樣品 ID | SEQ ID NO | 描述 | 序列 |
| A022600314 | 75（與4相同） | A0226015A08（L11V, A14P、V23A、P40A、D52cE、N54Y、D73N、K76N、D79Y、K83R、G88A、V89L、F91Y） | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIFRSVFSSSTMEWYRQAPGKKRELVARIAPGEGTYYGALYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCASGVAWGQGTLVTVSS |
| A022600345 | 76 | A0226018C08（L11V、V23A、G54A、R60A、E81Q、T82aN、N83R、V89L） | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNAGVTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSS |
| A022600351 | 77（與3相同） | A0226018C08（L11V、V23A、G54K、R60A、E81Q、T82aN、N83R、V89L） | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNKGVTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSS |
如下評估序列優化變異體與親本ISVD相比的特性：
通過流式細胞術針對與HepG2、Huh-7和CHO Flip-In食蟹猴GPC3細胞的結合來評價變異體，如實例1中所述。
在熱位移測定（TSA）中使用Lightcycler（Roche）來測試變異體的熱穩定性。在此測定中，在不同pH下在SYPRO
TM橙的存在下培育親本ISVD及其變異體，並應用溫度梯度。在ISVD開始變性時，SYPRO
TM橙結合導致螢光增加，從而允許確定對於給定pH的解鏈溫度（Tm）。
結果匯總於表15和表16中
表
15
：親本
ISVD A0226015A08
的序列優化變異體
A0226000314
的分析結果。
| 樣品 ID | 突變 | EC50 （ M ） HepG2 | EC50 （ M ） Huh-7 | EC50 （ M ） CHO-cGPC3 | Tm （ ºC ）在 pH 7 下 TSA |
| A0226015A08 | WT | 7.5E-09 | 6.6E-09 | 7.8E-09 | 70 |
| A022600314 | L11V、A14P、V23A、P40A、D52cE、N54Y、D73N、K76N、D79Y、K83R、G88A、V89L、F91Y | 1.6E-08 | 9.3E-09 | 1.2E-08 | 65 |
表
16
：親本
ISVD A0226018C08
的序列優化變異體
A022600345
和
A0226000351
的分析結果。
| 樣品 ID | 突變 | EC50 （ M ） HepG2 | EC50 （ M ） Huh-7 | EC50 （ M ） CHO-cGPC3 | Tm （ ºC ）在 pH 7 下 TSA |
| A0226018C08 | WT | 9.15E-10 | 6.96E-10 | 4.9E-10 | 67 |
| A022600345 | L11V、V23A、G54A、R60A、E81Q、T82aN、N83R、V89L | 3.91E-10 | 2.76E-10 | 1.5E-10 | 75 |
| A022600351 | L11V、V23A、G54K、R60A、E81Q、T82aN、N83R、V89L | 4.31E-10 | 4.77E-10 | 2.1E-10 | 74 |
與親本ISVD A0226015A08相比，A022600314展現對於表現人GPC3或食蟹猴GPC3的不同細胞株，小於2倍的結合效力的降低。Tm略微下降5ºC並且在可接受的值內。對於A022600314，與參考hIGHV3-23SO/IGHJ4相比，架構區中的架構同一性%基於AbM定義是88.8%（參見Antibody Engineering, 第2卷，由Kontermann和Dübel (編輯), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010），並且基於Kabat定義是是85.1%。
與親本ISVD A0226018C08相比，變異體A022600345和A022600351對表現人GPC3或食蟹猴GPC3的不同細胞株的結合效力增加2倍。變異體A022600345和A022600351的Tm分別增加至75ºC和74ºC。對於A022600345和A022600351二者，與參考hIGHV3-23SO/IGHJ4相比，架構區中的架構同一性%基於AbM定義是89.9%，並且基於Kabat定義是89.7%。
6.10 實例 10 ：三特異性序列優化 GPC3 ISVD T 細胞接合器的生成
序列優化GPC3 ISVD A022600314（A0226015A08的優化變異體）、A022600345和A022600351（A0226018C08的優化變異體）用於生成五種三特異性GPC3 T細胞接合器形式，用於評估構建塊與連接子長度的最佳組合，如表17中所述。
表
17
：所評價的不同三特異性
GPC3 ISVD T
細胞接合器形式的選擇
| 樣品 ID | SEQ ID NO | 描述 |
| A022600427 | 81 | TCE01-5GS-A022600345-9GS-A022600314-9GS-ALB23002-A |
| A022600424 | 1 | TCE01-5GS-A022600351-9GS-A022600314-9GS-ALB23002-A |
| A022600425 | 79 | TCE01-5GS-A022600314-20GS-A022600345-9GS-ALB23002-A |
| A022600426 | 80 | TCE01-5GS-A022600314-20GS-A022600351-9GS-ALB23002-A |
| A022600412 | 78 | TCE01-5GS-A022600345-20GS-ALB23002-A |
在基於xCELLingence的TDC測定中使用不同癌細胞株測試五種所選形式的功能性，如實例8中所述。結果描繪於表18中。對於高和中等GPC3表現細胞株HepG2、NCI-H661和Huh-7，與三價形式相比，對於四價形式獲得更高效力。對於高GPC3表現細胞株NCI-H661，四價形式A022600424和A022600427比A022600425和A022600426更有效。對於GPC3低表現細胞株NCI-H23和BxPC-3，對於所有三特異性GPC3 ISVD T細胞接合器形式，確認缺少殺傷作用。
圖10顯示對於五種選擇的ISVD形式，使用三種不同的T細胞供體，基於xCELLingence的TDC測定的劑量依賴性殺傷曲線，通過細胞株NCI-H661和BxPC-3來例證。
表 18 ：在基於 xCELLigence 的人 TDC 測定中，對不同腫瘤細胞株，使用 15:1 的效應子與目標比率且在 60h 分析， GPC3 T 細胞接合器的 IC50 （ M ）。na = 不可用；無擬合 =
未獲得曲線擬合， IC50 被估計為 ＞1E-7M
| 樣品 ID | IC50 （ M ） HepG2 | IC50 （ M ） NCI-H661 | IC50 （ M ） Huh-7 | IC50 （ M ） NCI-H23 | IC50 （ M ） BxPC-3 |
| A022600427 | 1.03E-10 | 1.00E-10 | 1.37E-10 | 無擬合 | 無擬合 |
| A022600424 | 1.15E-10 | 1.14E-10 | 1.16E-10 | 無擬合 | 無擬合 |
| A022600425 | 1.11E-10 | 2.59E-10 | 1.58E-10 | 無擬合 | 無擬合 |
| A022600426 | 1.25E-10 | 2.64E-10 | 1.09E-10 | 無擬合 | 無擬合 |
| A022600412 | 3.82E-10 | 6.18E-10 | 1.53E-09 | na | 無擬合 |
| Ab2 | 1.49E-11 | 4.60E-11 | 8.41E-11 | 1.28E-09 | 1.09E-09 |
使用基於SPR的設置來評估預先存在的抗體與5種所選形式的結合（實例14）。圖11顯示，對於所有形式，僅觀察到低水準的預先存在的抗體結合，與可開發性要求相容。
評估所述5種形式在巴斯德畢赤酵母中的表現，集中於在5 L發酵罐規模下在上游加工（USP）期間的產物效價和純度，以及在下游加工（DSP）後的產率（表19）。將A022600424和A022600426鑒定為較佳的ISVD開發候選者，其將高分子量（HMW）種類的低百分比、RPC上變異體的低百分比與高效價和最佳總體DSP產率組合。
表
19
：
5
種選擇的基於
ISVD
的
GPC3 T
細胞接合器形式在畢赤酵母中的表現。
| 樣品 ID | 效價（ g/L ） | 分析型 SEC （ HMW% ） | RPC （峰後 % ） | DSP 產率 （總 % ） |
| A022600412 | 3.9 | 5.4 | 3.3 | 26 |
| A022600424 | 4.9 | 1.8 | 1.7 | 45 |
| A022600425 | 5.6 | 6.3 | 2.7 | 24 |
| A022600426 | 5.4 | 2.4 | 3.3 | 32 |
| A022600427 | 4.7 | 5.1 | 1.4 | 32 |
基於GPC3驅動的殺傷效力、與預先存在的抗體的降低組合和在畢赤酵母中的表現的最佳組合，選擇A022600424作為開發候選者。
6.11 實例 11 ： A022600424 對 GPC3 、 TCRab 和血清白蛋白的結合和親和力
通過表面電漿共振（SPR）使用ProteOn XPR36對A022600424針對以下的親和力（表示為平衡解離常數（K
D））進行定量：人和食蟹猴GPC3（分別為R&D Systems，目錄號2119-GP和內部生產（登錄號P51654、Q3-R358、S359-H559））；人和食蟹猴TCRab（兩者都是內部生產的，其中α和β鏈細胞外結構域與拉鍊肽融合用於二聚化；登錄號：人α鏈P01848、人β鏈P01850；食蟹猴α鏈的預測序列與人相同，食蟹猴β鏈的預測序列相差4個aa：A125V、E136V、V167M、S177F）；以及人、食蟹猴和小鼠血清白蛋白（分別為Sigma目錄號A8763、從動物組織內部生產、DivBioScience目錄號IMSA）。
在使用EDC和NHS化學品（運行緩衝液：HBS-EP+，pH7.4）經由胺偶聯固定有THE抗His抗體（Genscript，目錄號ABIN387699）的GLC感測器晶片（Biorad）上，捕獲重組GPC3蛋白。以不同濃度（在0.3 nM與1000 nM之間）注射純化ISVD持續2分鐘（流速45 µL/min），並跟蹤解離900s。通過注射10mM甘胺酸-HCl（pH 1.5）持續1分鐘（流速45 µL/min）來進行再生。通過減除參考配體泳道和空白緩衝液注射對資料進行雙重參考。基於1 : 1相互作用模型（朗繆爾結合模型）使用ProteOn Manager 3.1.0（3.1.0.6版）軟體分析加工的傳感圖。
使用EDC和NHS化學品（運行緩衝液：HBS-EP+，pH 7.4），經由胺偶聯將重組TCR蛋白固定在GLC感測器晶片（Biorad）上。以不同濃度（在0.2 nM與200 nM之間）注射純化ISVD持續2分鐘（流速45 µL/min），並跟蹤解離900 s。通過注射3 M MgCl
2持續3分鐘（流速90 µL/min）來進行再生。通過減除參考配體泳道和空白緩衝液注射對資料進行雙重參考。基於1 : 1相互作用模型（朗繆爾結合模型）使用ProteOn Manager 3.1.0（3.1.0.6版）軟體分析加工的傳感圖。
使用EDC和NHS化學品（運行緩衝液：HBS-EP+，pH 7.4），經由胺偶聯將血清白蛋白固定在GLC感測器晶片（Biorad）上。以不同濃度（在0.24 nM與500 nM之間）注射純化ISVD持續2分鐘（流速45 µL/min），並跟蹤解離900s。通過注射10mM甘胺酸-HCl（pH 1.5）持續47秒（流速100 µL/min）來進行再生。通過減除參考配體泳道和空白緩衝液注射對資料進行雙重參考。基於1 : 1相互作用模型（朗繆爾結合模型）使用ProteOn Manager 3.1.0（3.1.0.6版）軟體分析加工的傳感圖。
結果（表20）表明，A022600424以高親和力結合人和食蟹猴GPC3。
表 20 ：與人和食蟹猴 GPC3 、人和食蟹猴 TCRab 以及人、食蟹猴和小鼠血清白蛋白的結合親和力. n.a. = 不可用
| 抗原 | 樣品 ID | KD （ M ） 人 | KD （ M ） 食蟹猴 | KD 小鼠 |
| GPC3 | A022600424 | ＜ 5.6E-12 | ＜ 5.9E-12 | n.a. |
| Ab2 | 1.8E-09 | 1.7E-09 | n.a. | |
| TCRab | A022600424 | 6.3E-09 | 5.4E-09 | n.a. |
| T017000698 | 8.5E-09 | 1.1E-08 | n.a. | |
| 血清白蛋白 | A022600424 | 8.3E-10 | 3.3E-10 | 6.9E-09 |
| ALB223 | 8.8E-10 | 5.7E-10 | 5.3E-09 |
對於過表現人和食蟹猴GPC3的CHO-Flp-In細胞以及Huh-7細胞，通過流式細胞術來評估A022600424與細胞表現的人和食蟹猴GPC3的結合，得到在1 nM與2 nM之間的EC50值（表21）。
在EC30濃度，針對分別與TCRab結合單價ISVD T017000624和T017000623（T0170056G05變異體）競爭結合至人和食蟹猴T細胞來評價A022600424。在測定當天將T細胞（如實例3中所述獲得的人T細胞和購自德國LPT實驗室的食蟹猴T細胞）解凍並計數，並且稀釋至1E+06個細胞/mL的濃度，之後添加75 µL至V形底96孔盤（Greiner，目錄號651180）的孔中。用冷FACS緩衝液將細胞洗滌一次，之後添加25 µL Nb和25 µL競爭劑至孔。將T017000624稀釋至4E-08 M的2x濃度（2E-08 M於孔中），將T017000623稀釋至1E-07 M的2x濃度（5E-08 M於孔中），並且將A022600424在空中稀釋至範圍為8 µM與7.8 nM之間的終濃度。重懸細胞並將板在4ºC培育90分鐘，此後將板在冷FACS緩衝液中洗滌兩次。將細胞重懸於50 µL FACS緩衝液中的1/1000稀釋的單株抗FLAG® M2（Sigma Aldrich，目錄號F1804）中，並且在4ºC培育30分鐘。將板在冷FACS緩衝液中洗滌兩次。將細胞重懸於50 µL FACS緩衝液中的1/100稀釋的別藻藍蛋白綴合的Fc片段特異性AffiniPure山羊抗小鼠IgG（亞類1+2a+2b+3）（Jackson Immunoresearch，目錄號115-135-164）中，並且在4ºC培育30分鐘。將板在冷FACS緩衝液中洗滌兩次。將細胞重懸於55 µL FACS緩衝液中的1/1000稀釋的碘化丙啶（Sigma-Aldrich，目錄號P4170）中，之後在MACSQuant X（Miltenyi biotec）上採集資料。
結果顯示於表21中。A022600424以大約200nM親和力結合至人和食蟹猴T細胞二者。
表
21
：
A022600424
與細胞表現的人和食蟹猴
GPC3
以及人和食蟹猴
TCRab
的結合評估。
| 抗原 | 樣品 ID | CHO huGPC3 EC50 （ M ） | CHO cyGPC3 EC50 （ M ） | Huh-7 EC50 （ M ） |
| GPC3 （結合 FACS ） | A022600424 | 1.82E-09 | 1.11E-09 | 1.25E-09 |
| Ab2 | 1.69E-08 | 5.4E-09 | 5.2E-09 | |
| 原代 hu T 細胞 IC50 （ M ） | 原代 cy T 細胞 IC50 （ M ） | |||
| TCRab （競爭 FACS ） | A022600424 | 1.7E-07 | 2.5E-07 | |
| T017000698 | 1.9E-07 | 2.5E-07 |
為了使用食蟹猴T細胞評估A022600424功能性，使用食蟹猴T細胞（LPT實驗室，德國）對Huh-7進行基於xCELLigence的TDC測定，如實例8中所述。發現對食蟹猴和人T細胞的IC50值是可比較的（表22）。
表
22
：在基於
xCELLigence
的
TDC
測定中，對
Huh-7
，以
15:1
的效應子與目標比率且在
60h
分析，使用食蟹猴
T
細胞，
A022600424
的功能性。
6.12
實例
12
：
A022600424
對於結合至
GPC3
的選擇性
| 樣品 ID | 原代 hu T 細胞 IC50 （ M ） | 原代 cy T 細胞 IC50 （ M ） |
| A022600424 | 7.59E-11 | 2.29E-10 |
| Ab2 | 7.88E-11 | 3.57E-11 |
通過ELISA評估與GPC3家族成員（即GPC1、GPC2、GPC5和GPC6）的A022600424結合的不存在，並且通過SPR（Proteon XPR36）評估與GPC4的A022600424結合的不存在。
在384孔HB SpectraPlate（PerkinElmer）上將人GPC1（R&D systems，目錄號4519-GP）、人GPC2（R&D systems，目錄號2304-GP）、人GPC3（R&D systems，目錄號2119-GP）、人磷脂醯肌醇蛋白聚糖-5（R&D systems，目錄號2607-G5）和人磷脂醯肌醇蛋白聚糖-6（R&D systems，目錄號2845-GP）在4ºC直接塗布過夜（2 µg/mL，1xPBS緩衝液）。次日將板洗滌6次（AquaMax微量板洗滌器，Molecular devices）並在室溫下用1xPBS + 1%酪蛋白封閉2小時。在另外的6次洗滌步驟後，將A022600424（1xPBS、0.1%酪蛋白、0.05% TWEEN 20）添加至板並在室溫下培育1小時。接下來，去除樣品，之後進行6次洗滌步驟並在1小時期間在室溫下以17 nM終濃度添加抗ISVD mAb ABH0077（1xPBS、0.1%酪蛋白、0.05% TWEEN 20）。將板再次洗滌6次，並將與HRP綴合的山羊抗小鼠IgG多株抗體（Abcam，目錄號ab97040）（1/1250稀釋度；1xPBS、0.1%酪蛋白、0.05% TWEEN 20）在室溫下施加至板持續1小時。在6次最終洗滌步驟後，添加es(HS)TMB底物（SDT），並在10分鐘後通過添加1 M HCl來終止反應。在Clariostar儀器（BMG LABTECH）上在波長450 nm和620 nm測量板的吸光度，並計算OD
450-OD
620且繪圖以供資料分析。
在使用EDC和NHS化學品（所用運行緩衝液：HBS-EP+，pH7.4）經由胺偶聯固定有小鼠抗人IgG1（GE Healthcare，目錄號BR-1008-39）的GLC感測器晶片（Biorad）上，捕獲重組人GPC4/hFc（R&D Systems，目錄號9195-GP）。以不同濃度（在4 nM與1000 nM之間）注射純化ISVD持續2分鐘（流速45 µL/min），並跟蹤解離持續900s。通過注射10mM甘胺酸-HCl（pH1.5）持續1分鐘（流速45 µL/min）來進行再生。通過減除參考配體泳道和空白緩衝液注射對資料進行雙重參考。基於1 : 1相互作用模型（朗繆爾結合模型）使用ProteOn Manager 3.1.0（3.1.0.6版）軟體分析加工的傳感圖。
未檢測到A022600424與任何所測試的GPC3家族成員的結合。
6.13 實例 13 ：人預先存在的抗體對 A022600424 的反應性
對於正常人血清（n=96），使用ProteOn XPR36（Bio-Rad Laboratories, Inc.）評估預先存在的抗體與A022600424的結合。使用PBS/Tween（磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.4，0.005% Tween20）作為運行緩衝液，並且在25ºC進行實驗。
在感測器晶片上經由ALB23002構建塊與固定在所述晶片上的HSA的結合來捕獲A022600424。為了固定HSA，用EDC/NHS（流速30 μL/min）活化ProteOn GLC感測器晶片的配體泳道，並且以ProteOn乙酸鹽緩衝液（pH4.5）中的100 µL/mL注射HSA以實現大約2900 RU的固定水準。在固定後，用乙醇胺HCI（流速30μL/min）使表面失活。
隨後，以45 μΙ/min在HSA表面上注射A022600424持續2 min，以實現大約800 RU的ISVD捕獲水準。將含有預先存在的抗體的樣品以14,000 rpm離心2分鐘並將上清液以1:10稀釋於PBS-Tween20（0.005%）中，之後將其以45 μΙ/min注射持續2分鐘，之後進行後續400秒的解離步驟。在每個循環後（即在新的ISVD捕獲和血樣注射步驟之前），經由HCI（100 mM）以45 μL/min的2分鐘注射使HSA表面再生。在通過減除1) ISVD-HSA解離和2) 與參考配體泳道的非特異性結合來進行雙重參考後，獲得顯示預先存在的抗體結合的傳感圖。通過將報告點設在125秒（締合結束後5秒）來確定預先存在的抗體的結合水準。相對於參考ISVD在125秒的結合水準，計算預先存在的抗體結合的降低百分比。
與對照未優化四價ISVD形式F027301099相比，通過引入抗TCR構建塊的突變L11V和V89A、每個GPC3和血清白蛋白結合構建塊中的突變L11V和V89L以及C末端丙胺酸來針對減少的預先存在的抗體結合優化的四價ISVD形式A022600424顯示顯著更少的與預先存在的抗體的結合（圖11A）。
6.14 實例 14 ：在可溶 GPC3 的存在下 A022600424 的 T 細胞活化誘導的評估
如實例6中所述來評估在可溶GPC3的存在下A022600424的T細胞活化誘導。A022600424顯示與其野生型變異體A022600168相同的行為（圖7）。
6.15 實例 15 ：在移入體外擴增的 T 細胞的帶有 Huh-7 腫瘤的 NOG 小鼠中對 A022600424 的體內概念驗證
在帶有腫瘤的NOG小鼠中的體內功效研究中，皮下注射肝細胞癌Huh-7腫瘤細胞，並允許腫瘤生長直至達到約150 mm
3的平均腫瘤體積。在此點，將體外擴增的T細胞腹膜內注射至所述小鼠中。通過測量腫瘤體積並分析腫瘤生長動力學來評價通過ISVD介導的T細胞募集進行的腫瘤細胞殺傷。評價A022600424關於腫瘤細胞殺傷的體內功效並與缺少GPC3特異性的對照T細胞接合器T017000698（SEQ ID NO: 74，表A-6）進行比較。
詳細地，在NOG小鼠中皮下注射重懸於100 µL HBSS中的2 x 10
6個Huh-7腫瘤細胞。腫瘤生長直至達到大約150 mm
3的平均腫瘤體積。在此點，將重懸於200 µL PBS中的10
7個體外擴增的T細胞腹膜內注射至每只小鼠中（D0）。此T細胞注射是在將小鼠隨機化至不同組中之後24小時進行。使用靜脈內注射的A022600424的治療始於D0，T細胞注射後3 h，並且在D3、D6、D9和D12繼續（q3d；圖12）。測試TCR/GPC3結合多肽的四個劑量水準（0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.7 mg/kg和2 mg/kg）。在D0、D3、D6、D9和D12（q3d）在對照組中以2 mg/kg注射T017000698。在D6和D12在含有肝素的管中進行存活採血，以測量抗體暴露。在D15處死小鼠，並收集血液和腫瘤組織。血液用於抗體暴露測量，並且腫瘤組織用於目標表現（GPC3）的分析和T細胞浸潤分析。
腫瘤生長動力學的結果顯示於圖13中。使用以T017000698治療的小鼠作為對照組用於在D24的分析，此時所有對照小鼠都是存活的，因為它們沒有達到終點標準（2000mm
3腫瘤體積）。對於誘導腫瘤停滯，在A022600424與對照T017000698的腫瘤生長概況中觀察到劑量反應模式。A022600424的0.7 mg/kg（**，p = 0.0016）和2 mg/kg（*，p = 0.0415）劑量水準與對照T017000698顯著不同。0.1 mg/kg、0.2 mg/kg劑量對控制腫瘤生長具有更低的作用，並且與對照組沒有顯著不同。已經通過單因素ANOVA使用用於分析的Dunnett多重比較檢驗來進行統計學分析。
總之，結果表明，A022600424可以在此模型中以劑量依賴性方式誘導統計學上顯著的腫瘤停滯。這確認了通過將T細胞與Huh-7腫瘤細胞上的GPC3交聯經由GPC3 ISVD T細胞接合器實現的多肽誘導的T細胞介導的殺傷的概念。
7 工業實用性
本文所述的多肽、編碼所述多肽的核酸分子、包含所述核酸的載體和組成物可以用於例如患有癌症的受試者的治療中。
無
圖 1 ：在基於Incucyte的人TDC（T細胞依賴性細胞毒性）HepG2-Nuclight green測定中，使用15:1的效應子與目標比率，在接種後60h進行分析，三特異性GPC3 T細胞接合器A022600027（圖1A）、A022600031（圖1B實線）和具有參考Ab1的構建體（圖1B虛線）的劑量依賴性殺傷。對照（左側）是：（實心正方形）無化合物和（實心三角形）用於100%殺傷的1 µM佈雷菲德菌素A。
圖 2 ：在基於Incucyte的人TDC HepG2-Nuclight green測定中，使用15 : 1的效應子與目標比率，在接種後72h進行分析，三特異性GPC3 ISVD T細胞接合器的劑量依賴性殺傷。所述圖表現格式最佳化的步驟1，其中三特異性三價T細胞接合器形式的連接子長度在抗TCR ISVD與抗GPC3 ISVD之間不同。對照（左側）是：無化合物（空心正方形）和用於100%殺傷的參考（空心圓形）。
圖 3 ：在基於Incucyte的人TDC HepG2-Nuclight green測定中，使用15 : 1的效應子與目標比率，在接種後60h進行分析，三特異性GPC3 ISVD T細胞接合器的劑量依賴性殺傷。所述圖表現格式最佳化的步驟2，其中三特異性四價T細胞接合器形式的定向和連接子長度在雙互補位GPC3結合ISVD之間不同。對照（左側）是：無化合物（空心正方形）和用於100%殺傷的參考（空心圓形）。
圖 4 ：GPC3 T細胞接合器格式最佳化的步驟3：抗TCR ISVD T017000624被呈三價和四價形式的已測序的優化的變異體TCE01取代。在基於Incucyte的人TDC HepG2-Nuclight green測定（圖4A）中和在基於xCELLigence的人TDC Huh7測定（圖4B）中，使用15 : 1的效應子與目標比率，在接種後60h進行分析，三特異性GPC3 ISVD T細胞接合器的劑量依賴性殺傷。對照（左側）是：無化合物（空心正方形）和用於100%殺傷的參考（空心圓形）。
圖 5 ：在基於Incucyte的人TDC HepG2-Nuclight green測定（圖5A）中和在基於xCELLigence的人TDC Huh7測定（圖5B）中，使用15 : 1的效應子與目標比率，在接種後60h進行分析，三特異性GPC3 ISVD T細胞接合器的劑量依賴性殺傷。表現GPC3 T細胞接合器格式最佳化的步驟4，其中用抗GPC3 ISVD改變抗TCR ISVD的定向或者用抗白蛋白ISVD改變抗GPC3 ISVD的定向。對照（左側）是：（空心正方形）無化合物和（空心圓形）用於100%殺傷的參考。
圖 6 ：在基於Incucyte的人TDC HepG2-Nuclight green測定（圖6A）中和在基於xCELLigence的人TDC Huh7測定（圖6B）中，使用15 : 1的效應子與目標比率，在接種後60h進行分析，三特異性GPC3 ISVD T細胞接合器的劑量依賴性殺傷。表現GPC3 T細胞接合器格式最佳化的步驟5，其中連接子長度是多變的。對照（左側）是：（空心正方形）無化合物和（空心圓形）用於100%殺傷的參考。
圖 7 ：可溶GPC3（sGPC3）對在基於xCELLigence的人TDC Huh7測定中使用15 : 1的效應子與目標比率在接種後60h分析的三特異性GPC3 ISVD T細胞接合器的細胞毒性的影響（圖7A）以及對在存在（圖7B）和不存在（圖7C）目標細胞（Huh7）的情況下三特異性GPC3 ISVD T細胞接合器的T細胞活化的影響的評估。對照（左側）是：無化合物（空心圓形，圖7A）和同種型對照（空心圓形，圖7B和圖7C）。
圖 8 ：在37ºC在時間點0.5h、3h、24h和48h測量的T細胞接合器內化（圖8A）和GPC3表現（圖8B）的時程。對照（左側）是在4ºC對於每種化合物在0.5h的測量
。
圖 9 ：在基於xCELLigence的人TDC測定中，對表現降低的GPC3表現水準的不同腫瘤細胞株，使用15 : 1的效應子與目標比率，三特異性GPC3 T細胞接合器的劑量依賴性殺傷：在60h分析的HepG2（圖9A）、在75h分析的NCI-H661（圖9B）、在60h分析的Huh-7（圖9C）、在65h分析的MKN-45（圖9D）、在65h分析的BxPC-3（圖9E）、在60h分析的NCI-H292（圖9F）。對照（左側）是：（空心正方形）無化合物（僅效應子和T細胞）。
圖 10 ：在基於xCELLigence的人TDC測定中，使用15 : 1的效應子與目標比率並在60h分析，五種選擇的基於三特異性GPC3 ISVD的T細胞接合器對兩種腫瘤細胞株NCI-H661（圖10A）和BxPC-3（圖10B）的劑量依賴性殺傷。對照（左側）是：無化合物（空心正方形，僅效應子和T細胞）和30 nM的T017000698（空心菱形）。
圖 11 ：針對四價（圖11A）和三價（圖11B）選擇的基於ISVD的GPC3 T細胞接合器形式，來自96個正常人血清樣品的預先存在的抗體反應性的中值和四分位距。
圖 12 ：用於功效模型的研究設計。在NOG小鼠中皮下注射Huh-7腫瘤細胞。腫瘤生長直至達到大約150 mm
3的平均腫瘤體積。在此點，將體外擴增的T細胞腹膜內注射至每只小鼠中（D0）。使用靜脈內注射的A022600424的治療始於D0，T細胞注射後3 h，並且在D3、D6、D9和D12（q3d）繼續。測試A022600424的四個劑量水準（0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.7 mg/kg和2 mg/kg）。在D0、D3、D6、D9和D12（q3d）在對照組中以2 mg/kg注射對照T017000698。在使用測試化合物之前在D6和D12進行存活採血。在D15處死所有小鼠，收集血液和腫瘤樣品。
圖 13 ：功效模型的結果。測試A022600424的四個劑量水準（0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.7 mg/kg和2 mg/kg）。在對照組中以2 mg/kg注射對照T017000698。
無。
無。
Claims (45)
- 一種包含至少三個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成的多肽，其中所述ISVD中的每一個包含三個互補決定區（分別是CDR1至CDR3），其中所述至少三個ISVD任選地經由一或多個肽連接子來連接，並且其中： a) 第一ISVD特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域並且包含 i. 作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 6的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； ii. 作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 10的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 iii. 作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3； b) 第二ISVD特異性結合至GPC3並且包含 iv. 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； v. 作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 vi. 作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3；並且 c) 第三ISVD特異性結合至GPC3並且包含 vii. 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； viii. 作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 ix. 作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3， 其中所述ISVD的順序指示從所述多肽的N末端至C末端來看，所述ISVD與彼此的相對位置，其中所述第一ISVD任選地位於所述多肽的N末端處。
- 如請求項1所述的多肽，其中： a) 所述第一ISVD包含作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3； b) 所述第二ISVD包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3；並且 c) 所述第三ISVD包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3。
- 如請求項1或2中任一項所述的多肽，其中： a) 所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 2超過90%的序列同一性； b) 所述第二ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 3超過90%的序列同一性；並且 c) 所述第三ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 4超過90%同一性的序列同一性。
- 如請求項1至3中任一項所述的多肽，其中： a) 所述第一ISVD由SEQ ID NO: 2的胺基酸序列組成； b) 所述第二ISVD由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成；並且 c) 所述第三ISVD由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成。
- 如請求項1至4中任一項所述的多肽，其中所述第一ISVD和所述第二ISVD經由由少於10個胺基酸、較佳地少於6個胺基酸組成的連接子彼此連接，其中所述連接子最佳地是5GS連接子。
- 如請求項1至5中任一項所述的多肽，其中所述多肽還包含一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元任選地經由一或多個肽連接子來連接，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。
- 如請求項6所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元選自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可以結合至血清蛋白的結合單元、Fc部分以及可以結合至血清蛋白的小蛋白或肽。
- 如請求項6或7中任一項所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他結合單元選自可以結合至血清白蛋白（如人血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（如IgG）的結合單元。
- 如請求項8所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述結合單元是結合至人血清白蛋白的ISVD。
- 如請求項9所述的多肽，其中結合至人血清白蛋白的所述ISVD包含 i. 作為SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 9的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； ii. 作為SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 13的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 iii. 作為SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 17的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3。
- 如請求項9或10中任一項所述的多肽，其中結合至人血清白蛋白的所述ISVD包含作為SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3。
- 如請求項9至11中任一項所述的多肽，其中結合至人血清白蛋白的所述ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 5超過90%的序列同一性。
- 如請求項9至12中任一項所述的多肽，其中結合至人血清白蛋白的所述ISVD由SEQ ID NO: 5的胺基酸序列組成。
- 如請求項1至13中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含展現與SEQ ID NO: 1超過90%的序列同一性的胺基酸序列或由其組成。
- 如請求項1至14中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列或由其組成。
- 一種包含特異性結合GPC3的至少一個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成的多肽，其中所述ISVD包含三個互補決定區（分別是CDR1至CDR3），並且其中所述至少一個ISVD包含： a) 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； 作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，或者 b) 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； 作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3。
- 如請求項16所述的多肽，其中所述至少一個ISVD包含： a) 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3，或者 b) 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3。
- 如請求項16或17中任一項所述的多肽，其中所述至少一個ISVD的胺基酸序列包含以下或由以下組成： a) 具有與SEQ ID NO: 3超過90%的序列同一性的胺基酸序列，或 b) 具有與SEQ ID NO: 4超過90%同一性的序列同一性的胺基酸序列。
- 如請求項16至18中任一項所述的多肽，其中所述至少一個ISVD包含以下或由以下組成： a) SEQ ID NO: 3的胺基酸序列，或 b) SEQ ID NO: 4的胺基酸序列。
- 一種包含至少兩個ISVD或由其組成的多肽，其中所述ISVD中的每一個包含三個互補決定區（分別是CDR1至CDR3），其中所述至少兩個ISVD任選地經由一或多個肽連接子來連接，並且其中： a) 第一ISVD和第二ISVD特異性結合至GPC3並且包含 i. 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； ii. 作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 iii. 作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3， b) 第一ISVD和第二ISVD特異性結合至GPC3並且包含 i. 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； ii. 作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 iii. 作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3， c) 第一ISVD特異性結合至GPC3並且包含 i. 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； ii. 作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 iii. 作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且 第二ISVD特異性結合至GPC3並且包含 iv. 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； v. 作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 vi. 作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3， d) 第一ISVD特異性結合至GPC3並且包含 i. 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； ii. 作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 iii. 作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且 第二ISVD特異性結合至GPC3並且包含 iv. 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； v. 作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 vi. 作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3， e) 第一ISVD特異性結合至T細胞上的T細胞受體（TCR）的恆定結構域並且包含 i. 作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 6的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； ii. 作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 10的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 iii. 作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且 第二ISVD特異性結合至GPC3並且包含 iv. 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； v. 作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 vi. 作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3， f) 第一ISVD特異性結合至GPC3並且包含 i. 作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 7的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； ii. 作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 11的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 iii. 作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 15的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且 第二ISVD特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域並且包含 iv. 作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 6的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； v. 作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 10的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 vi. 作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3， g) 第一ISVD特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域並且包含 i. 作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 6的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； ii. 作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 10的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 iii. 作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且 第二ISVD特異性結合至GPC3並且包含 iv. 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； v. 作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 vi. 作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，或者 h) 第一ISVD特異性結合至GPC3並且包含 i. 作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 8的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； ii. 作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 12的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 iii. 作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 16的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3，並且 第二ISVD特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域並且包含 iv. 作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 6的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； v. 作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 10的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 vi. 作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 14的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3， 其中所述ISVD的順序指示從所述多肽的N末端至C末端來看，所述ISVD與彼此的相對位置。
- 如請求項20所述的多肽，其中： a) 所述第一ISVD和所述第二ISVD特異性結合至GPC3並且包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3， b) 所述第一ISVD和所述第二ISVD特異性結合至GPC3並且包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3， c) 所述第一ISVD特異性結合至GPC3並且包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD特異性結合至GPC3並且包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3， d) 所述第一ISVD特異性結合至GPC3並且包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD特異性結合至GPC3並且包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3， e) 所述第一ISVD特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域並且包含作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD特異性結合至GPC3並且包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3， f) 所述第一ISVD特異性結合至GPC3並且包含作為SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域並且包含作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3， g) 所述第一ISVD特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域並且包含作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD特異性結合至GPC3並且包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3，或者 h) 所述第一ISVD特異性結合至GPC3並且包含作為SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3，並且所述第二ISVD特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域並且包含作為SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3。
- 如請求項20或21中任一項所述的多肽，其中： a) 特異性結合至GPC3的所述第一ISVD和所述第二ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 3超過90%的序列同一性， b) 特異性結合至GPC3的所述第一ISVD和所述第二ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 4超過90%的序列同一性， c) 特異性結合至GPC3的所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 3超過90%的序列同一性，並且特異性結合至GPC3的所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 4超過90%同一性的序列同一性， d) 特異性結合至GPC3的所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 4超過90%的序列同一性，並且特異性結合至GPC3的所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 3超過90%同一性的序列同一性， e) 特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域的所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 2超過90%的序列同一性，並且特異性結合至GPC3的所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 3超過90%同一性的序列同一性， f) 特異性結合至GPC3的所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 3超過90%的序列同一性，並且特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域的所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 2超過90%同一性的序列同一性， g) 特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域的所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 2超過90%的序列同一性，並且特異性結合至GPC3的所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 4超過90%同一性的序列同一性，或者 h) 特異性結合至GPC3的所述第一ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 4超過90%的序列同一性，並且特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域的所述第二ISVD展現與SEQ ID NO: 2超過90%同一性的序列同一性。
- 如請求項20至22中任一項所述的多肽，其中： a) 特異性結合至GPC3的所述第一ISVD和所述第二ISVD由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成， b) 特異性結合至GPC3的所述第一ISVD和所述第二ISVD由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成， c) 特異性結合至GPC3的所述第一ISVD由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成，並且特異性結合至GPC3的所述第二ISVD由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成， d) 特異性結合至GPC3的所述第一ISVD由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成，並且特異性結合至GPC3的所述第二ISVD由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成， e) 特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域的所述第一ISVD由SEQ ID NO: 2的胺基酸序列組成，並且特異性結合至GPC3的所述第二ISVD由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成， f) 特異性結合至GPC3的所述第一ISVD由SEQ ID NO: 3的胺基酸序列組成，並且特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域的所述第二ISVD由SEQ ID NO: 2的胺基酸序列組成， g) 特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域的所述第一ISVD由SEQ ID NO: 2的胺基酸序列組成，並且特異性結合至GPC3的所述第二ISVD由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成，或者 h) 特異性結合至GPC3的所述第一ISVD由SEQ ID NO: 4的胺基酸序列組成，並且特異性結合至T細胞上的TCR的恆定結構域的所述第二ISVD由SEQ ID NO: 2的胺基酸序列組成。
- 如請求項20至23中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含選自SEQ ID NO: 1、49-72和78-81的胺基酸序列或由其組成。
- 如請求項16至24中任一項所述的多肽，其中所述多肽還包含一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元任選地經由一或多個肽連接子來連接，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。
- 如請求項25所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元選自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可以結合至血清蛋白的結合單元、Fc部分以及可以結合至血清蛋白的小蛋白或肽。
- 如請求項25至26中任一項所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他結合單元選自可以結合至血清白蛋白（如人血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（如IgG）的結合單元。
- 如請求項27所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述結合單元是結合至人血清白蛋白的ISVD。
- 如請求項28所述的多肽，其中結合至人血清白蛋白的所述ISVD包含 i. 作為SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 9的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR1； ii. 作為SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 13的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR2；以及 iii. 作為SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 17的2個或1個胺基酸差異的胺基酸序列的CDR3。
- 如請求項28至29中任一項所述的多肽，其中結合至人血清白蛋白的所述ISVD包含作為SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR1、作為SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR2以及作為SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3。
- 如請求項28至30中任一項所述的多肽，其中結合至人血清白蛋白的所述ISVD的胺基酸序列展現與SEQ ID NO: 5超過90%的序列同一性。
- 如請求項28至31中任一項所述的多肽，其中結合至人血清白蛋白的所述ISVD由SEQ ID NO: 5的胺基酸序列組成。
- 一種包含編碼如請求項1至32中任一項、較佳地如請求項1至15中任一項所述的多肽的核苷酸序列的核酸。
- 一種包含如請求項33所述的核酸的宿主或宿主細胞。
- 一種用於產生如請求項1至32中任一項、較佳地如請求項1至15中任一項所述的多肽的方法，所述方法至少包括以下步驟： a) 在合適的宿主細胞或宿主生物體中或在另一種合適的表現系統中表現如請求項33所述的核酸；任選地之後進行： b) 分離和/或純化如請求項1至32中任一項、較佳地如請求項1至15中任一項所述的多肽。
- 一種包含至少一種如請求項1至32中任一項、較佳地如請求項1至15中任一項所述的多肽或者如請求項33所述的核酸的組成物。
- 如請求項36所述的組成物，其是如下醫藥組成物，所述醫藥組成物還包含至少一種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，並且任選地包含一種或多種其他醫藥活性多肽和/或化合物。
- 如請求項1至32中任一項、較佳地如請求項1至15中任一項所述的多肽或者如請求項36或37所述的組成物，其用作藥物。
- 如請求項1至32中任一項、較佳地如請求項1至15中任一項所述的多肽或者如請求項36或37所述的組成物，其用於癌症、較佳地肝癌或肺癌的治療中。
- 如請求項39所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述肝癌是肝細胞癌。
- 一種治療癌症、較佳地肝癌或肺癌的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者投予醫藥活性量的如請求項1至32中任一項、較佳地如請求項1至15中任一項所述的多肽或者如請求項36或37所述的組成物。
- 如請求項41所述的方法，其中所述肝癌是肝細胞癌。
- 如請求項1至32中任一項、較佳地如請求項1至15中任一項所述的多肽或者如請求項36或37所述的組成物在藥物製備中的用途。
- 如請求項1至32中任一項、較佳地如請求項1至15中任一項所述的多肽或者如請求項36或37所述的組成物用於製備治療癌症、較佳地肝癌或肺癌的醫藥組成物的用途。
- 如請求項44所述的多肽或組成物的用途，其中所述肝癌是肝細胞癌。
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