KR20230123495A - 글리피칸-3 및 t세포 수용체를 표적으로 하는 면역글로불린단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드 - Google Patents

글리피칸-3 및 t세포 수용체를 표적으로 하는 면역글로불린단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드 Download PDF

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릴리 파오
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페터 쇼테
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아나 파울라 핀템
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Abstract

본 기술은 암을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 신규한 유형의 약물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로, 본 기술은 하나의 ISVD가 TCR에 결합하고 적어도 2개의 ISVD가 GPC3에 결합하는 것을 특징으로 하는 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 기술은 또한 핵산, 벡터, 및 조성물을 제공한다.

Description

글리피칸-3 및 T세포 수용체를 표적으로 하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드
1 기술분야
본 기술은 글리피칸-3(GPC3) 및 T세포 수용체(TCR)를 표적으로 하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 이는 또한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 및 핵산을 포함하는 벡터, 그리고 폴리펩티드, 핵산, 또는 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 기술은 또한 암 세포 또는 감염 세포와 같은 비정상 세포와 관련된 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 생성물에 관한 것이다. 또한, 본 기술은 이러한 생성물의 제조 방법에 관한 것이다.
2 배경기술
세포독성 T세포(CTL)는 암 세포, 감염(특히 바이러스 감염)된 세포, 또는 다른 방식으로 손상된 세포를 사멸시키는 T림프구이다. T림프구(또는 T세포라고도 함)는 세포 표면 상에 T세포 수용체(TCR) 및 CD3 수용체를 발현한다. αβ TCR-CD3 복합체 (또는 "TCR 복합체")는 6종의 상이한 유형 I 단일-스패닝 막관통 단백질로 구성된다: 리간드 인식을 담당하는 TCR 이종이량체를 형성하는 TCRα 및 TCRβ 사슬, 및 수용체 활성화 시에 티로신 인산화되고 대량의 신호전달 성분을 동원시키는 세포질 서열 모티프를 보유하는 비공유적으로 회합된 CD3γ, CD3δ, CD3ε, 및 ζ 사슬(Call et al. 2004, Molecular Immunology 40: 1295-1305).
이종이량체 T세포 수용체(TCR)의 α 및 β 사슬 둘 모두는 불변 도메인 및 가변 도메인으로 이루어진다. T세포는 티로신 인산화된 CD3 복합체에 의해 개시된 신호 전달과 함께 자가 MHC 분자에 의해 제시되는 동족 펩티드의 TCR 인식 시 활성화되어, T세포 증식 및 분화를 유도한다.
이중특이적 항체는 한쪽 아암 상에 종양 인식 부분을 갖는(표적-결합 아암) 한편 분자의 다른 쪽 아암은 T세포 항원, 대개는 CD3에 대한 특이성을 갖도록(이펙터-결합 아암) 조작되었다. T세포 관여자(TCE)라고 불리는 이러한 이중특이적 항체는 악성 세포에 대한 환자의 면역 반응을 증진시키는 다중표적 분자이다. 다중특이적 항체에 의한 T세포와 종양 세포의 공동 결합은 T세포와 종양 세포 사이에 세포용해 시냅스를 형성하여 T세포 활성화를 유도하고 종양 세포 사멸을 가져온다.
대부분의 T세포 활성화 이중특이적 항체는 T세포 상의 CD3 복합체를 표적화하는 반면, αβ T세포 수용체의 불변 도메인을 표적화하는 일부 이중특이적 바인더는 WO 2016/180969 A1에 기술되어 있다.
글리피칸-3(GPC3)은 헤파란 설페이트 GAG 사슬 및 코어 단백질로 이루어진 GPI 고정 세포 표면 당단백질이다. 이는 배아 발생 및 초기 발달, 세포 성장 조절, 및 분화와 관련되어 있다. GPC3의 발현은 발달 중에 높은 반면, 정상 성인 조직에서는 발현이 거의 없으며 신장 근위 세뇨관 및 기관지 세포에서는 중간/낮은 수준의 발현을 보인다. 초기 발달에서의 역할과 일관되게, 태반에서도 높은 수준의 GPC3가 발현된다.
GPC3는 Wnt, Hh, 및 YAP 경로를 비롯한 여러 신호전달 캐스케이드를 통해 초기 발달을 조절할 것으로 보인다. 또한 GPC3는 FGF2와 같은 기본 성장 인자와 상호 작용하여 세포 성장을 조절할 수 있다. 실험 환경에서, GPC3의 과발현은 FGF2-유도 세포 증식을 억제할 수 있다. 대조적으로, GPC3는 또한 억제성 성장 인자인 BMP7을 음성적으로 조절한다. 종합하면, GPC3의 활성은 세포 증식을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 간 및 기타 형태의 암에서 발암을 촉진할 수 있기 때문에 상황에 따라 크게 달라질 수 있다.
GPC3 발현은 충족되지 않은 요구가 상당한 질환인 간세포 암종(HCC)의 종양 조직에서 특히 우세하다. 가용성 GPC3는 HCC 환자의 혈청에서도 검출될 수 있으며 다른 병인을 가진 간 질환과 구별하는 데 사용되어 왔다.
이중특이적 항체 구성체는 여러 형태로 제안되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체 형태는 2개의 항체 또는 이의 단편의 화학적 접합을 포함할 수 있다(Brennan, M, et al., Science, 1985. 229(4708): p. 81-83; Glennie, M. J., et al., J Immunol, 1987. 139(7): p. 2367-2375).
그러나 이러한 이중특이적 항체 형태의 단점은 고농도에서 분자량 및 점도가 높아 예를 들어 피하 투여를 어렵게 하고, 각 결합 단위가 특이적 및 고친화성 결합을 위해 2개의 가변 도메인의 상호작용을 필요로 하며, 이는 폴리펩티드 안정성 및 생산 효율에 영향을 미친다는 점을 포함한다. 이러한 이중특이적 항체 형태는 또한 저조한 생산 효율 및 낮은 역가 및/또는 경쇄의 쌍형성 오류 또는 중쇄의 쌍형성 오류와 관련된 CMC 문제를 잠재적으로 유발할 수 있다.
따라서, 세포독성 반응을 유도하기에 충분한 친화도로 표적 세포 및 T세포 모두에 결합하는 항체 구성체가 필요하다. 동시에, 이러한 구성체는 비표적 세포, 즉, 표적 항원을 발현하지 않거나 이를 낮은 수준으로만 발현하는 세포에 대해 세포독성 반응을 유도하지 않아야 한다. 이에 따라, 효능과 안전성 사이에 균형을 맞출 수 있다. 이러한 구성체가 예를 들어 미생물 숙주에서 효율적으로 생성될 수 있는 것이 더욱 바람직하다. 이러한 구성체는 치료 대상체에서 연속 치료가 편리하게 기간을 두고 이루어질 수 있도록 충분히 긴 반감기를 나타낸다. 또한,치료 대상체의 기존 항체(즉, 항체 구성체를 이용한 첫 번째 치료 전에 대상체에 존재하는 항체)에 대한 이러한 구성체의 반응성을 제한하는 것이 바람직하다. 또한, 폴리펩티드는 바람직하지 않은 부작용, 예를 들어 비표적 세포에 대한 세포 독성 활동으로 인한 유발을 나타내지 않거나 최소화해야 한다.
3 발명의 내용
본 발명자들은 GPC3 및 TCR을 동시에 특이적으로 표적화하는 폴리펩티드가 시험관내에서 GPC3 발현 세포의 효율적인 T세포-매개 사멸을 유도함을 발견하였다. 상기 폴리펩티드는 효율적으로 생성될 수 있다(예를 들어, 미생물 숙주에서). 또한, 이러한 폴리펩티드는 치료 대상체의 기존 항체(즉, 항체 구성체를 사용한 첫 번째 치료 전에 대상체에 존재하는 항체)에 대해 반응성이 제한된 것으로 보일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이러한 폴리펩티드는 치료 대상체에서 연속 치료가 편리하게 기간을 두고 이루어질 수 있도록 충분히 긴 반감기를 나타낸다. 또한, 이러한 폴리펩티드는 GPC3를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 세포에 대해 제한된 활성만을 나타냈다. 이는 이로운 안전성 프로파일을 나타내면서 GPC3 양성 암 표적 세포에 대해 고도로 특이적인 T세포-매개 세포독성 반응을 유도할 가능성을 시사한다.
일 양태에서, 폴리펩티드는 적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 이루어지며, 적어도 2개의 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고 1개의 ISVD는 T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, GPC3에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 ISVD는 인간 GPC3에 특이적으로 결합하고, TCR에 특이적으로 결합하는 ISVD는 인간 TCR에 특이적으로 결합한다. 보다 바람직하게는, GPC3에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 ISVD는 별개의 ISVD이다. 다른 양태에서, 적어도 3개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드는 바람직하게는 임의로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공한다. 예를 들어, 결합 단위는 혈청 단백질, 바람직하게는 인간 혈청 알부민과 같은 인간 혈청 단백질에 결합하는 ISVD일 수 있다.
일 양태에서, 본 기술은 GPC3에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다. 추가 구현예에서, 본 기술의 폴리펩티드는 GPC3에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지며, 2개의 ISVD는 펩티드 링커를 통해 임의로 연결된다. 바람직하게는, GPC3에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD는 별개의 ISVD이다. 또한, 폴리펩티드는 바람직하게는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 임의로 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공한다. 예를 들어, 결합 단위는 혈청 단백질, 바람직하게는 인간 혈청 알부민과 같은 인간 혈청 단백질에 결합하는 ISVD일 수 있다.
다른 양태에서, 본 기술의 폴리펩티드는 T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하는 ISVD 및 GPC3에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지며, 2개의 ISVD는 펩티드 링커를 통해 임의로 연결된다. 이러한 폴리펩티드는 GPC3을 발현하는 세포를 사멸시키기 위한 T세포를 재지정하는데 사용될 수 있다. 이상적으로는, TCR에 결합하는 ISVD는 예를 들어 인간, T세포에 특이적으로 결합하는 상기 폴리펩티드에 포함된 유일한 결합 모이어티이다. 또한, 실시예는 TCR에 특이적으로 결합하는 ISVD가 이러한 폴리펩티드의 N-말단에 위치할 때, 동일한 항-TCR ISVD가 N-말단에 위치하지 않을 때와 비교하여 더 나은 T세포 매개 세포독성이 달성됨을 보여준다. 따라서 TCR에 특이적으로 결합하는 ISVD는 바람직하게는 GPC3에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 ISVD로부터 N-말단에 위치한다. 가장 바람직하게는, TCR에 특이적으로 결합하는 ISVD는 이를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다. 또한, 폴리펩티드는 바람직하게는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 임의로 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공한다. 예를 들어, 결합 단위는 혈청 단백질, 바람직하게는 인간 혈청 알부민과 같은 인간 혈청 단백질에 결합하는 ISVD일 수 있다.
또한, 폴리펩티드를 발현할 수 있는 핵산 분자, 핵산, 또는 핵산을 포함하는 벡터, 및 폴리펩티드, 핵산, 또는 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물은 바람직하게는 약학적 조성물이다.
또한 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 (비-인간) 숙주가 제공된다.
본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드를 생성하는 방법이 추가로 제공되며, 상기 방법은 적어도 다음의 단계를 포함한다:
a. 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 발현시키는 단계; 이어서 임의로,
b. 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계.
또한, 본 기술은 의약으로서 사용하기 위한 폴리펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 또는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 폴리펩티드 또는 조성물은 간암 또는 폐암과 같은 암의 치료에 사용하기 위한 것이다.
또한, 암의 치료 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 개시에 따른 폴리펩티드 또는 조성물의 약학적 활성량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 암은 바람직하게는 간암 또는 폐암으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
암, 바람직하게는 간암 또는 폐암을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조에서 폴리펩티드 또는 조성물의 용도가 추가로 제공된다.
특히, 본 기술은 다음과 같은 구현예를 제공한다:
구현예 1. 적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드로서, 상기 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 적어도 3개의 ISVD는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 임의로 연결되며,
a) 제1 ISVD는
i. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하고,
b) 제2 ISVD는
iv. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하고,
c) 제3 ISVD는
vii. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
viii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
ix. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하고,
ISVD의 순서는 상기 폴리펩티드의 N-말단에서 C-말단까지 고려되는 서로에 대한 이들의 상대적 위치를 나타내고, 제1 ISVD는 임의로 상기 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는, 폴리펩티드.
구현예 2. 구현예 1에 있어서,
a) 상기 제1 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
b) 상기 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
c) 상기 제3 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩티드.
구현예 3. 구현예 1 또는 2에 있어서,
a) 상기 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고;
b) 상기 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고;
c) 상기 제3 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내는, 폴리펩티드.
구현예 4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서,
a) 상기 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지고;
b) 상기 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고;
c) 상기 제3 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는, 폴리펩티드.
구현예 5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 제1 ISVD 및 제2 ISVD는 10개 미만의 아미노산, 바람직하게는 6개 미만의 아미노산으로 이루어진 링커를 통해 서로 연결되고, 링커는 가장 바람직하게는 5GS 링커인, 폴리펩티드.
구현예 6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드는 임의로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공하는, 폴리펩티드.
구현예 7. 구현예 6에 있어서, 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위는 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 소형 단백질 또는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
구현예 8. 구현예 6 또는 구현예 7에 있어서, 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 결합 단위는 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)에 결합할 수 있는 결합 단위로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
구현예 9. 구현예 8에 있어서, 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공하는 상기 결합 단위는 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD인, 폴리펩티드.
구현예 10. 구현예 9에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는
i. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하는, 폴리펩티드.
구현예 11. 구현예 9 또는 구현예 10에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩티드.
구현예 12. 구현예 9 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 5와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내는, 폴리펩티드.
구현예 13. 구현예 9 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는, 폴리펩티드.
구현예 14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 폴리펩티드.
구현예 15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 폴리펩티드.
구현예 16. 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드로서, 상기 ISVD는 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 적어도 하나의 ISVD는
a) 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3, 또는
b) 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하는, 폴리펩티드.
구현예 17. 구현예 16에 있어서, 적어도 하나의 ISVD는
a) 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3; 또는
b) 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하는, 폴리펩티드.
구현예 18. 구현예 16 또는 구현예 17에 있어서, 적어도 하나의 ISVD의 아미노산 서열은
a) 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성, 또는
b) 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성
을 포함하는, 폴리펩티드.
구현예 19. 구현예 16 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 ISVD는
a) 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는
b) 서열번호 4의 아미노산 서열
을 포함하거나 이로 이루어지는, 폴리펩티드.
구현예 20. 적어도 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드로서, 상기 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 적어도 2개의 ISVD는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 임의로 연결되며,
a) 제1 및 제2 ISVD는
i. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하거나,
b) 제1 및 제2 ISVD는
i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하거나,
c) 제1 ISVD는
i. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하고,
제2 ISVD는
iv. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하거나,
d) 제1 ISVD는
i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하고,
제2 ISVD는
iv. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하거나,
e) 제1 ISVD는
i. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하고,
제2 ISVD는
iv. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하거나,
f) 제1 ISVD는
i. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하고,
제2 ISVD는
iv. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하거나,
g) 제1 ISVD는
i. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하고,
제2 ISVD는
iv. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하거나, 또는
h) 제1 ISVD는
i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하고,
제2 ISVD는
iv. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하고,
ISVD의 순서는 상기 폴리펩티드의 N-말단에서 C-말단까지 고려되는 서로에 대한 이들의 상대적 위치를 나타내는, 폴리펩티드.
구현예 21. 구현예 20에 있어서,
a) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
b) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
c) 제1 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
d) 제1 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
e) 제1 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
f) 제1 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
g) 제1 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나, 또는
h) 제1 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩티드.
구현예 22. 구현예 20 또는 21에 있어서,
a) 제1 및 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내거나,
b) 제1 및 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내거나,
c) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 제2 ISVD는 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내거나,
d) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 제2 ISVD는 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내거나,
e) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 제2 ISVD는 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내거나,
f) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 제2 ISVD는 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내거나,
g) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 제2 ISVD는 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내거나, 또는
h) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 제2 ISVD는 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내는, 폴리펩티드.
구현예 23. 구현예 20 내지 22 중 어느 하나에 있어서,
a) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지거나,
b) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지거나,
c) 제1 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지거나,
d) 제1 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지거나,
e) 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지거나,
f) 제1 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지거나,
g) 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는
h) 제1 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는, 폴리펩티드.
구현예 24. 구현예 20 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1, 49 내지 72, 및 78 내지 81로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 폴리펩티드.
구현예 25. 구현예 16 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드는 임의로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공하는, 폴리펩티드.
구현예 26. 구현예 25에 있어서, 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위는 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 소형 단백질 또는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
구현예 27. 구현예 25 또는 구현예 26에 있어서, 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 결합 단위는 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)에 결합할 수 있는 결합 단위로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
구현예 28. 구현예 27에 있어서, 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공하는 상기 결합 단위는 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD인, 폴리펩티드.
구현예 29. 구현예 28에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는
i. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하는, 폴리펩티드.
구현예 30. 구현예 28 또는 구현예 29에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩티드.
구현예 31. 구현예 28 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 5와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내는, 폴리펩티드.
구현예 32. 구현예 28 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는, 폴리펩티드.
구현예 33. 구현예 1 내지 32 중 어느 하나, 바람직하게는 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
구현예 34. 구현예 33에 따른 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포.
구현예 35. 구현예 1 내지 32 중 어느 하나, 바람직하게는 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 적어도
a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 또는 다른 적합한 발현 시스템에서 구현예 33에 따른 핵산을 발현시키는 단계; 이어서 임의로
b) 구현예 1 내지 32 중 어느 하나, 바람직하게는 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 36. 구현예 1 내지 32 중 어느 하나, 바람직하게는 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드, 또는 구현예 33에 따른 핵산을 포함하는 조성물.
구현예 37. 구현예 36에 있어서, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제, 및/또는 보조제를 추가로 포함하고, 하나 이상의 추가의 약학적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 화합물을 임의로 포함하는 약학적 조성물인 조성물.
구현예 38. 의약으로서 사용하기 위한, 구현예 1 내지 32 중 어느 하나, 바람직하게는 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, 또는 구현예 36 또는 구현예 37에 따른 조성물.
구현예 39. 암, 바람직하게는 간암 또는 폐암의 치료에 사용하기 위한, 구현예 1 내지 32 중 어느 하나, 바람직하게는 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, 또는 구현예 36 또는 구현예 37에 따른 조성물.
구현예 40. 구현예 39에 있어서, 간암은 간세포 암종인, 폴리펩티드 또는 조성물.
구현예 41. 구현예 39에 있어서, 폐암은 비소세포 폐암(NSCLC), 바람직하게는 편평 세포 암종(SCC)인, 폴리펩티드 또는 조성물.
구현예 42. 암, 바람직하게는 간암 또는 폐암을 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 32 중 어느 하나, 바람직하게는 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, 또는 구현예 36 또는 구현예 37에 따른 조성물의 약학적 활성량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 43. 구현예 42에 있어서, 간암은 간세포 암종인, 방법.
구현예 44. 구현예 42에 있어서, 폐암은 비소세포 폐암(NSCLC), 바람직하게는 편평 세포 암종(SCC)인, 방법.
구현예 45. 의약의 제조에 있어서, 구현예 1 내지 32 중 어느 하나, 바람직하게는 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, 또는 구현예 36 또는 구현예 37에 따른 조성물의 용도.
구현예 46. 암, 바람직하게는 간암 또는 폐암을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조에 있어서, 구현예 1 내지 32 중 어느 하나, 바람직하게는 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, 또는 구현예 36 또는 구현예 37에 따른 조성물의 용도.
구현예 47. 구현예 46에 있어서, 간암은 간세포 암종인, 폴리펩티드 또는 조성물의 용도.
구현예 48. 구현예 46에 있어서, 폐암은 비소세포 폐암(NSCLC), 바람직하게는 편평 세포 암종(SCC)인, 폴리펩티드 또는 조성물의 용도.
4 도면의 간단한 설명
도 1: 15:1의 이펙터 대 표적 비율을 사용하여 시딩 60시간 후 분석한 Incucyte 기반 인간 TDC(T세포 의존적 세포독성) HepG2-Nuclight 그린(green) 분석에서 삼중특이적 GPC3 T세포 관여자 A022600027(도 1의 A), A022600031(도 1의 B 실선), 및 기준 Ab1(도 1의 B 점선)을 포함한 구성체의 용량 의존적 사멸. 대조군(좌측): (안이 채워진 사각형) 화합물 없음 및 100% 사멸에 대한 (안이 채워진 삼각형) Brefeldin A 1 μM.
도 2: 시딩 72시간 후 분석된, 15:1의 이펙터 대 표적 비율을 사용한 Incucyte 기반 인간 TDC HepG2-Nuclight 그린 분석에서의 삼중특이적 GPC3 ISVD T세포 관여자의 용량 의존적 사멸. 이 도면은 삼중특이적 3가 T세포 관여자 형태가 항-TCR ISVD와 항-GPC3 ISVD간의 링커 길이가 다른, 형태 최적화의 1단계를 나타낸 것이다. 대조군(좌측): 화합물 없음(안이 채워지지 않은 사각형) 및 100% 사멸에 대한 기준(안이 채워지지 않은 원형).
도 3: 시딩 60시간 후 분석된, 15:1의 이펙터 대 표적 비율을 사용한 Incucyte 기반 인간 TDC HepG2-Nuclight 그린 분석에서의 삼중특이적 GPC3 ISVD T세포 관여자의 용량 의존적 사멸. 이 도면은 삼중특이적 4가 T세포 관여자 형태가 이중파라토프 GPC3 결합 ISVD간의 배향 및 링커 길이가 다른, 형태 최적화의 2단계를 나타낸 것이다. 대조군(좌측): 화합물 없음(안이 채워지지 않은 사각형) 및 100% 사멸에 대한 기준(안이 채워지지 않은 원형).
도 4: GPC3 T세포 관여자 형태 최적화의 3단계. 항-TCR ISVD T017000624는 3가 및 4가 형태에서, 시퀀싱된 최적화 변이체 TCE01로 치환되었다. 시딩 60시간 후 분석된, 15:1의 이펙터 대 표적 비율을 사용한 Incucyte 기반 인간 TDC HepG2-Nuclight 그린 분석(도 4의 A) 및 xCELLigence 기반 인간 TDC Huh7 분석(도 4의 B)에서의 삼중특이적 GPC3 ISVD T세포 관여자의 용량 의존적 사멸. 대조군(좌측): 화합물 없음(안이 채워지지 않은 사각형) 및 100% 사멸에 대한 기준(안이 채워지지 않은 원형).
도 5: 시딩 60시간 후 분석된, 15:1의 이펙터 대 표적 비율을 사용한 Incucyte 기반 인간 TDC HepG2-Nuclight 그린 분석(도 5의 A) 및 xCELLigence 기반 인간 TDC Huh7 분석(도 5의 B)에서의 삼중특이적 GPC3 ISVD T세포 관여자의 용량 의존적 사멸. GPC3 T세포 관여자 형태 최적화의 4단계는 항-TCR ISVD의 배향이 항-GPC3 ISVD로 변경되었거나 항-GPC3 ISVD의 배향이 항-알부민 ISVD로 변경된 경우를 나타낸 것이다. 대조군(좌측): (안이 채워지지 않은 사각형) 화합물 없음 및 100% 사멸에 대한 (안이 채워지지 않은 원형)
도 6: 시딩 60시간 후 분석된, 15:1의 이펙터 대 표적 비율을 사용한 Incucyte 기반 인간 TDC HepG2-Nuclight 그린 분석(도 6의 A) 및 xCELLigence 기반 인간 TDC Huh7 분석(도 6의 B)에서의 삼중특이적 GPC3 ISVD T세포 관여자의 용량 의존적 사멸. GPC3 T세포 관여자 형태 최적화의 5단계는 링커 길이가 다양한 경우를 나타낸 것이다. 대조군(좌측): (안이 채워지지 않은 사각형) 화합물 없음 및 100% 사멸에 대한 (안이 채워지지 않은 원형)
도 7: 시딩 60시간 후 분석된, 15:1의 이펙터 대 표적 비율을 사용한 xCELLigence 기반 인간 TDC Huh7 분석(도 7의 A)에서의 삼중특이적 GPC3 ISVD T세포 관여자의 세포 독성 및 표적 세포(Huh7)의 존재(도 7의 B) 및 부재(도 7의 C) 하에서의 삼중특이적 GPC3 ISVD T세포 관여자에 의한 T세포 활성화에 대한 가용성 GPC3(sGPC3)의 영향 평가. 대조군(좌측): 화합물 없음(안이 채워지지 않은 원형, 도 7의 A) 및 이소형 대조군(안이 채워지지 않은 원형, 도 7의 B 및 7의 C).
도 8: 0.5시간, 3시간, 24시간, 및 48시간 시점에서 37℃에서 측정된 T세포 관여자 내재화(도 8의 A) 및 GPC3 발현(도 8의 B)의 시간 경과. 대조군(좌측)은 4℃에서 각 화합물에 대해 0.5시간에 측정한 값이다.
도 9: 15:1의 이펙터 대 표적 비율을 사용하여 GPC3의 감소하는 발현 수준을 발현하는 상이한 종양 세포주에 대한 xCELLigence 기반 인간 TDC 분석에서의 삼중특이적 GPC3 T세포 관여자의 용량 의존적 사멸: 60시간에서 분석된 HepG2(도 9의 A), 75시간에서 분석된 NCI-H661(도 9의 B), 60시간에서 분석된 Huh-7(도 9의 C), 65시간에서 분석된 MKN-45(도 9의 D), 65시간에서 분석된 BxPC-3(도 9의 E), 60시간에서 분석된 NCI-H292(도 9의 F). 대조군(좌측): (안이 채워지지 않은 사각형) 화합물 없음(이펙터 및 T세포만).
도 10: 15:1의 이펙터 대 표적 비율을 사용하고 60시간에서 분석된 2개의 종양 세포주, NCI-H661(도 10의 A), 및 BxPC-3(도 10의 B)에 대한 xCELLigence 기반 인간 TDC 분석에서의 5개의 선택된 삼중특이적 GPC3 ISVD 기반 T세포 관여자의 용량 의존적 사멸 대조군(좌측): 화합물 없음(안이 채워지지 않은 사각형, 이펙터 및 T세포만) 및 30 nM에서의 T017000698(안이 채워지지 않은 마름모형).
도 11: 4가(도 11의 A) 및 3가(도 11의 B) 선택된 ISVD 기반 GPC3 T세포 관여자 형태에 대한 96개의 정상 인간 혈청 샘플로부터의 기존 항체 반응성의 중간 및 사분위수 범위.
도 12: 효능 모델에 대한 연구 설계. Huh-7 종양 세포를 NOG 마우스에 피하 주사하였다. 종양을 약 150 mm3의 평균 종양 부피에 도달할 때까지 성장시켰다. 이 시점에서, 시험관내 확장된 T세포를 각 마우스에 복강내(D0) 주사하였다. A022600424를 정맥 주사한 치료는 T세포 주입 3시간 후인 D0에 시작하여 D3, D6, D9, 및 D12에 계속되었다(q3d). 4가지 용량 수준의 A022600424를 테스트하였다(0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.7 mg/kg, 및 2 mg/kg). D0, D3, D6, D9, 및 D12(q3d)에 대조군 T017000698을 대조군에 2 mg/kg으로 주사하였다. 테스트 화합물을 투여하기 전 D6 및 D12에 생존 혈액 샘플링을 수행하였다. 모든 마우스를 D15에 희생시키고, 혈액 및 종양 샘플을 수집하였다.
도 13: 효능 모델의 결과. 4가지 용량 수준의 A022600424를 테스트하였다(0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.7 mg/kg, 및 2 mg/kg). 대조군 T017000698을 대조군에 2 mg/kg으로 주사하였다.
5 발명의 상세한 설명
본 기술은 간암 또는 폐암과 같은 암의 치료를 위한 신규한 유형의 약물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 GPC3 및 TCR을 동시에 특이적으로 표적화하는 폴리펩티드가 시험관내에서 GPC3 발현 세포의 효율적인 T세포-매개 사멸을 유도함을 발견하였다. 상기 폴리펩티드는 효율적으로 생성될 수 있다(예를 들어, 미생물 숙주에서). 또한, 이러한 폴리펩티드는 치료 대상체의 기존 항체(즉, 항체 구성체를 사용한 첫 번째 치료 전에 대상체에 존재하는 항체)에 대해 반응성이 제한된 것으로 보일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이러한 폴리펩티드는 치료 대상체에서 연속 치료가 편리하게 기간을 두고 이루어질 수 있도록 충분히 긴 반감기를 나타낸다. 또한, 이러한 폴리펩티드는 GPC3를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 세포에 대해 제한된 활성만을 나타냈다. 이는 GPC3 양성 표적 세포에 대해 고도로 특이적인 T세포-매개 세포독성 반응을 유도할 가능성을 시사한다.
상기와 별개로, 본원에 개시된 GPC3-결합 ISVD는 인간 및 시노 GPC3에 대한 높은 친화도-결합을 제공하고, 따라서 GPC3에 대한 결합이 요구되는 다른 적용을 위해 1가 또는 다가 형태로 용이하게 사용될 수 있다.
5.1 폴리펩티드
단일특이적-1가 폴리펩티드
일 양태에서, 폴리펩티드는 단일특이적이고 1가이다.
용어 "단일특이적"은 표적 분자(들)의 하나의 (특이적) 유형에 대한 결합을 지칭한다. 따라서, 단일특이적 폴리펩티드는 GPC3에 특이적으로 결합한다.
용어 "1가"는 ISVD와 같은 분자를 (특이적으로) 표적으로 하는 단 하나의 결합 단위/빌딩 블록의 존재를 나타낸다.
따라서, 일 양태에서, 본 기술은 GPC3, 바람직하게는 인간 GPC3에 특이적으로 결합하는 하나의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 단일특이적-1가 폴리펩티드를 제공하며, 이는 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)을 포함한다. ISVD는
a) 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3; 또는
b) 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하는 ISVD로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, GPC3에 특이적으로 결합하는 ISVD는
a) 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3; 또는
b) 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하는 ISVD로부터 선택된다.
본 기술의 이러한 양태의 추가 구현예에서, GPC3에 특이적으로 결합하는 ISVD는
a) 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(바람직하게는 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어짐); 또는
b) 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(바람직하게는 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어짐)
을 포함하는 ISVD로부터 선택된다.
따라서, 다른 양태에서, 본 기술은 T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하는 하나의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 단일특이적-1가 폴리펩티드를 제공하며, 이는 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)을 포함한다. ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10고 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는 ISVD일 수 있다.
바람직하게는, TCR에 특이적으로 결합하는 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는 ISVD이다.
본 기술의 이러한 양태의 추가 구현예에서, TCR에 특이적으로 결합하는 ISVD는 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 ISVD이고, 바람직하게는 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
이러한 1가 화합물은 또한 다가 및/또는 다중특이적 폴리펩티드에 대한 빌딩 블록으로서 작용할 수 있다.
이를 포함하는 (1가 또는 다가) 폴리펩티드의 N-말단에 위치한 ISVD는 바람직하게는 N-말단 단부에서 글루탐산(E)을 나타내지 않는다. 따라서 위치 1의 글루탐산(E)은 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 위치한 ISVD에서 아스파트산(D)으로 치환된다. 따라서, 예를 들어 서열번호 3, 4, 또는 5가 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다면, 이들 서열은 일반적으로 E1D 치환을 나타낼 것이다. 역으로, 서열번호 2가 N-말단에 위치하지 않는 경우, 이 서열은 일반적으로 D1E 돌연변이를 나타낼 것이다. 따라서 일반적으로 서열번호 2 내지 5의 첫 번째 위치는 이들 서열이 N-말단에 위치하는지의 여부에 따라 E 또는 D일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 기술의 폴리펩티드에 포함된 제1 ISVD의 제1 아미노산은 아스파트산(D)이다.
단일특이적-다가 폴리펩티드
다른 양태에서, 폴리펩티드는 단일특이적이고, 적어도 2가이지만, 또한 예를 들어, 3가, 4가, 5가, 6가 등일 수 있다.
용어들 "2가", "3가", "4가", "5가", 또는 "6가"는 모두 용어 "다가"에 해당하며, ISVD와 같이 각각 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 결합 단위/빌딩 블록의 존재를 나타낸다.
따라서, 일 양태에서, 본 기술은 GPC3, 바람직하게는 인간 GPC3에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 단일특이적-2가 폴리펩티드를 제공하며, 2개의 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 2개의 ISVD는 바람직하게는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결되며,
a) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나;
b) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나;
c) 제1 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,
제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나;
d) 제1 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,
제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.
바람직하게는, 단일특이적-2가 폴리펩티드는 GPC3에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지고,
a) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나;
b) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나;
c) 제1 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나; 또는
d) 제1 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.
본 기술의 이러한 양태의 추가 구현예에서, 단일특이적-2가 폴리펩티드는 GPC3에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지고,
a) 제1 및 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 제1 및 제2 ISVD는 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지거나;
b) 제1 및 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 제1 및 제2 ISVD는 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지거나;
c) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 제2 ISVD는 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 바람직하게는 제1 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고 제2 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지거나; 또는
d) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 제2 ISVD는 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 바람직하게는 제1 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진다.
이와 관련하여, 용어들 "제1 ISVD" 및 "제2 ISVD"는 서로에 대해 GPC3에 결합하는 특이적으로 인용된 ISVD의 상대적 위치만을 나타내며, 여기서 넘버링은 폴리펩티드의 N-말단으로부터 시작된다. 따라서, "제1 ISVD"는 "제2 ISVD"보다 N-말단에 더 가깝다. 따라서, "제2 ISVD"는 "제1 ISVD"보다 C-말단에 더 가깝다. 넘버링은 절대적이지 않으며, 두 ISVD의 상대적인 위치만을 나타내기 때문에 GPC3, TCR, 또는 혈청 알부민에 각각 결합하는 ISVD와 같은 추가 결합 단위/빌딩 블록이 폴리펩티드에 존재할 수 있는 가능성을 배제하지 않는다. 또한, ISVD와 같은 다른 결합 단위/빌딩 블록이 그 사이에 위치할 수 있는 가능성을 배제하지 않는다. 예를 들어, 하기에 추가로 기재된 바와 같이(특히, "다중특이적-다가 폴리펩티드" 및 5.4 "(생체내) 반감기 연장" 섹션 참조), 폴리펩티드는 "제1 ISVD"와 "제2 ISVD" 사이에서도 위치할 수 있는 인간 혈청 알부민에 결합하는 또 다른 ISVD를 추가로 포함할 수 있다(이러한 구성체는 후속 섹션에 기재된 바와 같이 다중특이적으로 지칭됨).
바람직한 구현예에서, 단일특이적-다가 폴리펩티드, 특히 상기 기재된 단일특이적-2가 폴리펩티드의 (적어도 2개의) ISVD는 펩티드 링커를 통해 연결된다. 둘 이상의 (폴리)펩티드를 연결하기 위한 펩티드 링커의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 단일특이적-다가 폴리펩티드, 특히 상기 기재된 단일특이적-2가 폴리펩티드와 함께 사용될 수 있는 예시적인 펩티드 링커는 표 A-5에 제시되어 있다. 펩티드 링커의 자주 사용되는 부류 중 하나는 "Gly-Ser" 또는 "GS" 링커로 알려져 있다. 이들은 본질적으로 글리신(G) 및 세린(S) 잔기로 이루어지고, 일반적으로 GGGGS(서열번호 100) 모티프와 같은 펩티드 모티프의 하나 이상의 반복부를 포함하는 링커이다(예를 들어, 식 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(식 중, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 그 이상일 수 있음)을 나타냄). 이러한 GS 링커의 일부 자주 사용되는 예는 9GS 링커(GGGGSGGGS, 서열번호 103), 15GS 링커(n=3), 및 35GS 링커(n=7)이다. 예를 들어 문헌[Chen et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2013 Oct 15; 65(10): 1357-1369; 및 Klein et al., Protein Eng. Des. Sel. (2014) 27 (10): 325-330] 참조. 일 구현예에서, 단일특이적-다가 폴리펩티드, 특히 단일특이적-2가 폴리펩티드의 ISVD는 표 A-5에 제시된 링커를 통해 연결된다. 일 구현예에서, (적어도) 2개의 ISVD는 35GS 또는 9GS 링커(들)을 통해 연결된다. 바람직한 구현예에서, (적어도) 2개의 ISVD는 9GS 링커(들)을 통해 연결된다.
다중특이적-다가 폴리펩티드
추가 양태에서, 폴리펩티드는 적어도 이중특이적이지만, 예를 들어 삼중특이적, 사중특이적, 오중특이적 등일 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 적어도 2가이지만, 예를 들어 3가, 4가, 5가, 6가 등일 수도 있다.
용어들 "이중특이적", "삼중특이적", "사중특이적", "오중특이적", 등은 모두 용어 "다중특이적"에 해당하며, 각각 2, 3, 4, 5개 등의 다른 표적 분자들에 대한 결합을 나타낸다.
용어들 "2가", "3가", "4가", "5가", "6가" 등은 모두 용어 "다가"에 해당하며, ISVD와 같이 각각 2, 3, 4, 5, 6개 등의 결합 단위/빌딩 블록의 존재를 나타낸다.
예를 들어, 폴리펩티드는 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드와 같이 이중특이적-2가일 수 있고, 1개의 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고 1개의 ISVD는 T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하고, GPC3 및 TCR은 바람직하게는 인간 GPC3 및 인간 TCR이다. 폴리펩티드는 또한 3개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드와 같이 이중특이적-3가일 수 있고, 2개의 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고 1개의 ISVD는 T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하고, GPC3 및 TCR은 바람직하게는 인간 GPC3 및 인간 TCR이다. 다른 예에서, 폴리펩티드는 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드와 같은 삼중특이적-4가일 수 있고, 2개의 ISVD는 인간 GPC3에 특이적으로 결합하고, 1개의 ISVD는 T세포 상의 인간 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하고 1개의 ISVD는 인간 혈청 알부민에 결합한다. 이러한 폴리펩티드는 예를 들어 2개의 ISVD가 인간 GPC3 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 경우 동시에 이중파라토프성(biparatopic)일 수 있다. 용어 "이중파라토프성"은 동일한 표적 분자의 2개의 상이한 부분(예를 들어 에피토프)에 대한 결합을 지칭한다. 바람직한 삼중특이적-4가 폴리펩티드는, 예를 들어, 인간 GPC3에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD, T세포 상의 인간 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하는 1개의 ISVD, 인간 혈청 알부민에 결합하는 1개의 ISVD를 포함하고, GPC3에 결합하기 위해 이중파라토프인 ISVD 구성체 A022600424이다.
일 구현예에서, 본 기술은 적어도 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지는 이중특이적-2가 폴리펩티드를 제공하고, 상기 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 적어도 2개의 ISVD는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 임의로 연결되고,
a) 제1 ISVD는
i. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하고,
제2 ISVD는
iv. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하거나,
b) 제1 ISVD는
i. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하고,
제2 ISVD는
iv. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하거나,
c) 제1 ISVD는
i. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하고,
제2 ISVD는
iv. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하거나, 또는
d) 제1 ISVD는
i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함하고,
제2 ISVD는
iv. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 이러한 폴리펩티드는 적어도 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지고, 상기 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 적어도 2개의 ISVD는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 임의로 연결되고,
a) 제1 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
b) 제1 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
c) 제1 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나, 또는
d) 제1 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.
따라서, 이러한 폴리펩티드는
a) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 제3 ISVD는 서열번호 2과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내거나,
b) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 제2 ISVD는 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내거나,
c) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 제2 ISVD는 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내거나,
d) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 제2 ISVD는 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내는 폴리펩티드일 수 있다.
바람직하게는, 이러한 폴리펩티드에서,
a) 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지거나,
b) 제1 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지거나,
c) 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는
d) 제1 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진다.
다른 양태에서, 본 기술은 전술한 이중특이적-2가 폴리펩티드 및 아래에 상세히 기재된 바와 같은(섹션 5.4; "(생체내) 반감기 연장") 인간 혈청 알부민에 결합하는 제3 ISVD를 포함하는 삼중특이적-3가 폴리펩티드를 제공한다.
일 구현예에서, 본 기술은 적어도 3개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지는 이중특이적-3가 폴리펩티드를 제공하고, 상기 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 적어도 3개의 ISVD는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 임의로 연결되고,
a) 제1 ISVD는 T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하고, 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
b) 제2 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고, 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
c) 제3 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고, 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,
상기 폴리펩티드에 의해 결합된 TCR 및 GPC3은 바람직하게는 각각 인간 TCR 및 인간 GPC3이다.
다중특이적-다가 폴리펩티드의 바람직한 구현예에서,
a) 상기 제1 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
b) 상기 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
c) 상기 제3 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.
다중특이적-다가 폴리펩티드의 추가 양태에서,
a) 상기 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 바람직하게는 상기 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지고;
b) 상기 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 바람직하게는 상기 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고;
c) 상기 제3 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, 바람직하게는 상기 제3 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진다.
이와 관련하여, 용어들 "제1 ISVD", "제2 ISVD", "제3 ISVD” 등은 서로에 대해 ISVD의 상대적 위치만을 나타내며, 넘버링은 폴리펩티드의 N-말단으로부터 시작된다. 따라서, "제1 ISVD"는 "제2 ISVD"보다 N-말단에 더 가까운 반면, "제2 ISVD"는 "제3 ISVD"보다 N-말단에 더 가깝다. 따라서, ISVD 배열은 C-말단에서 고려할 때 반대이다. 넘버링은 절대적이지 않고 적어도 4개의 ISVD의 상대적 위치만을 나타내기 때문에, GPC3에 결합하는 추가 ISVD 또는 또 다른 표적에 결합하는 ISVD와 같은 다른 결합 단위/빌딩 블록이 폴리펩티드에 존재할 수 있음을 배제하지 않는다. 또한, ISVD와 같은 다른 결합 단위/빌딩 블록이 그 사이에 위치할 수 있는 가능성을 배제하지 않는다. 예를 들어, 하기에 추가로 기술된 바와 같이(특히, 하기 섹션 5.4 "(생체내) 반감기 연장" 참조), 폴리펩티드는 예를 들어 "제3 ISVD" 및 "제4 ISVD” 사이에도 위치될 수 있는 인간 혈청 알부민에 결합하는 또 다른 ISVD를 추가로 포함할 수 있다.
추가 양태에서, 따라서 본 기술은 전술한 이중특이적-3가 폴리펩티드 및 아래에 상세히 기재된 바와 같은(섹션 5.4; "(생체내) 반감기 연장") 인간 혈청 알부민에 결합하는 제4 ISVD를 포함하는 삼중특이적-4가 폴리펩티드를 제공한다.
바람직한 구현예에서, TCR에 결합하는 제1 ISVD는 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다.
다른 양태에서, 본 기술은 상기 단일특이적-1가 폴리펩티드(섹션 5.1; "단일특이적-1가 폴리펩티드")에 대해 상세히 기재된 바와 같이 GPC3에 특이적으로 결합하는 ISVD 및 아래에 상세히 기재된 바와 같이(섹션 5.4; "(생체내) 반감기 연장") 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD를 포함하는 이중특이적-2가 폴리펩티드를 제공한다.
다른 양태에서, 본 기술은 상기 단일특이적-2가 폴리펩티드(섹션 5.1; "단일특이적-2가 폴리펩티드") 및 아래에 상세히 기재된 바와 같이(섹션 5.4; "(생체내) 반감기 연장") 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD를 포함하는 이중특이적-3가 폴리펩티드를 제공한다.
본원에 기술된 상기 다중특이적-다가 폴리펩티드의 성분, 바람직하게는 ISVD는 펩티드 링커와 같은 하나 이상의 적합한 링커에 의해 서로 연결될 수 있다.
2개 이상의 (폴리)펩티드를 연결하기 위한 링커의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 예시적인 펩티드 링커는 표 A-5에 제시되어 있다. 펩티드 링커의 자주 사용되는 부류 중 하나는 "Gly-Ser" 또는 "GS" 링커로 알려져 있다. 이들은 본질적으로 글리신(G) 및 세린(S) 잔기로 이루어지고, 일반적으로 GGGGS(서열번호 100) 모티프와 같은 펩티드 모티프의 하나 이상의 반복부를 포함하는 링커이다(예를 들어, 식 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(식 중, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 그 이상일 수 있음)을 나타냄). 이러한 GS 링커의 일부 자주 사용되는 예는 9GS 링커(GGGGSGGGS, 서열번호 103), 15GS 링커(n=3), 및 35GS 링커(n=7)이다. 예를 들어 문헌[Chen et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2013 Oct 15; 65(10): 1357-1369; 및 Klein et al., Protein Eng. Des. Sel. (2014) 27 (10): 325-330] 참조. 본원에 개시된 폴리펩티드에서, 폴리펩티드의 성분을 서로 연결하기 위해 5GS 및 9GS 링커를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 10개 미만의 아미노산, 예컨대 6개 미만의 아미노산의 링커, 특히 5GS 링커는 TCR에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD를 GPC3에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD에 연결하는 데 사용된다.
다중특이적-다가 폴리펩티드의 일 양태에서, 적어도 3개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드는 GPC3에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 ISVD 및 TCR에 특이적으로 결합하는 적어도 1개의 ISVD를 포함한다. 본 기술의 이러한 양태에서, TCR에 결합하는 ISVD는 5GS 링커를 통해 GPC3에 결합하는 적어도 2개의 ISVD 중 하나에 연결되는 반면, GPC3에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 ISVD는 9GS 링커를 통해 서로 연결된다. 추가 양태에서, 다중특이적-다가 폴리펩티드는 알부민에 결합하는 ISVD를 추가로 포함하며, 이는, 9GS 링커를 통해, TCR에 결합하는 ISVD에 연결되지 않은 GPC3에 결합하는 ISVD에 추가로 연결된다(섹션 5.4 "(생체내) 반감기 연장"에 기재된 바와 같음). 본 발명자들은 이러한 구성이 T세포-매개 세포독성 반응을 유발하는 폴리펩티드의 효율을 증가시킬 수 있다는 놀라운 발견을 하였다.
따라서, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 N 말단에서 시작하는 순서로 다음을 포함하거나 이로 이루어지는 것이 바람직하다: TCR에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD, GPC3에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD, GPC3에 특이적으로 결합하는 제3 ISVD, 및 본원에 정의된 바와 같은 반감기가 증가된 폴리펩티드에 제공하는 임의의 결합 단위. 반감기가 증가된 폴리펩티드에 제공하는 결합 단위는 바람직하게는 ISVD로, 바람직하게는 혈청 알부민에 결합한다.
폴리펩티드는 폴리펩티드의 N 말단에서 시작하는 순서로, TCR에 특이적으로 결합하는 ISVD, 링커, GPC3에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD, 링커, GPC3에 특이적으로 결합하는 제3 ISVD, 링커, 및 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD을 포함하거나 이로 이루어지는 것이 보다 더 바람직하며, 제1 및 제2 ISVD 사이의 링커는 바람직하게는 5GS 링커인 반면, 다른 링커는 바람직하게는 9GS 링커이다.
폴리펩티드의 이러한 구성은 기존 항체에 대한 낮은 결합뿐만 아니라 암 치료와 관련하여 강력한 효능을 제공할 수 있다.
바람직하게는, 다중특이적-다가 폴리펩티드는 인간 혈청의 기존의 항체에 의해 감소된 결합을 나타낸다. 이를 위해, 일 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 하나의 ISVD(및 바람직하게는 폴리펩티드의 C-말단 단부에 있는 ISVD), 그러나 바람직하게는 각각의 ISVD에서 아미노산 위치 11에 발린(V) 및 아미노산 위치 89(Kabat 넘버링에 따름)에 류신(L)을 포함한다. 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 C 말단 ISVD의 C 말단에서 단일 알라닌(A) 연장과 같은 1 내지 5개의 (바람직하게는 자연 발생) 아미노산의 연장을 나타낸다. ISVD의 C 말단은 일반적으로 VTVSS(서열번호 116)이다. 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 하나의 ISVD에서 위치 110(Kabat 넘버링에 따름)에서 리신(K) 또는 글루타민(Q)을 나타낸다. 다른 구현예에서, ISVD는 적어도 하나의 ISVD에서의 위치 112(Kabat 넘버링에 따름)에서 리신(K) 또는 글루타민(Q)을 나타낸다. 이러한 구현예에서, ISVD의 C 말단은 VKVSS(서열번호 117), VQVSS(서열번호 118), VTVKS(서열번호119), VTVQS(서열번호120), VKVKS(서열번호121), VKVQS(서열번호122), VQVKS(서열번호123), 또는 VQVQS(서열번호124)이고, 이에 따라, 단일 알라닌 첨가 후, 폴리펩티드의 C-말단은 예를 들어 서열 VTVSSA(서열번호 125), VKVSSA(서열번호 126), VQVSSA(서열번호 127), VTVKSA(서열번호128), VTVQSA(서열번호129), VKVKSA(서열번호130), VKVQSA(서열번호131), VQVKSA(서열번호132), 또는 VQVQSA(서열번호133), 바람직하게는 VTVSSA를 나타낸다(표 A-7 참조). 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 ISVD에서 아미노산 위치 11의 발린(V) 및 아미노산 위치 89(Kabat 넘버링에 따름)의 류신(L), 임의로 적어도 하나의 ISVD에서 위치 110(Kabat 넘버링에 따름)의 리신(K) 또는 글루타민(Q)을 포함하고, C 말단 ISVD의 C 말단에 단일 알라닌(A) 연장과 같은 1 내지 5개의 (바람직하게는 자연 발생) 아미노산의 연장을 포함한다(따라서, 폴리펩티드의 C 말단은 예를 들어, 서열 VTVSSA, VKVSSA, 또는 VQVSSA, 바람직하게는 VTVSSA로 이루어짐). 이와 관련하여 추가 정보는 예를 들어, WO2012/175741 및 WO2015/173325 참조.
바람직한 구현예에서, 다중특이적-다가 폴리펩티드는 서열번호 1과 90% 초과, 예컨대 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 보다 바람직하게는 4개의 ISVD의 CDR은 각각 아래에 섹션 "5.2 면역글로불린 단일 가변 도메인" 및 "5.4 (생체내) 반감기 연장"에 제시된 Abm 정의 사용하는 항목 A 내지 D(또는 Kabat 정의를 사용하는 경우, A' 내지 D')에 정의된 바와 같으며, 특히,
· T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
· GPC3에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
· GPC3에 특이적으로 결합하는 제3 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
· 인간 혈청 알부민에 결합하는 제4 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하거나,
또는 대안적으로 Kabat 정의를 사용하는 경우,
· TCR에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 31의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 35의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
· GPC3에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 32의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 36의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
· GPC3에 특이적으로 결합하는 제3 ISVD는 서열번호 33의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 37의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
· 인간 혈청 알부민에 결합하는 제4 ISVD는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 1, 49 내지 72, 및 78 내지 81로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직하게는, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(표 A-3 참조). 가장 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진다.
폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드와 비교하여 인간 TCR 및 인간 GPC3에 대해 바람직하게는 적어도 절반의 결합 친화도, 보다 바람직하게는 적어도 동일한 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 표면 플라스몬 공명(SPR)과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.
5.2 면역글로불린 단일 가변 도메인
"단일 가변 도메인"과 상호 교환적으로 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"(ISVD)은 항원 결합 부위가 단일 면역글로불린 도메인에 존재하거나 이에 의해 형성되는 면역글로불린 분자를 정의한다. 이는 "통상적인" 면역글로불린(예를 들어, 단일클론 항체) 또는 이들의 단편(예컨대, Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv, 디-scFv) 외에도 면역글로불린 단일 가변 도메인을 지정하며, 2개의 면역글로불린 도메인, 특히 2개의 가변 도메인은 상호 작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 일반적으로, 통상적인 면역글로불린에서, 중쇄 가변 도메인(VH)과 경쇄 가변 도메인(VL)은 상호 작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 이 경우, VH와 VL 모두의 상보성 결정 영역(CDR)은 항원 결합 부위에 기여할 것이며, 즉, 총 6개의 CDR이 항원 결합 부위 형성에 관여할 것이다.
상기 정의를 고려하면, 통상적인 4쇄 항체(예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자; 당업계에 알려짐) 또는 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 예컨대, 이황화 결합 Fv 또는 scFv 단편, 또는 이러한 통상적인 4쇄 항체로부터 유래된 디아바디(모두 당업계에 알려짐)의 항원 결합 도메인은, 이러한 경우에 항원의 각 에피토프에 대한 결합이 일반적으로 하나의 (단일) 면역글로불린 도메인이 아니라 경쇄 및 중쇄 가변 도메인과 같은 한 쌍의 (연관) 면역글로불린 도메인, 즉 각 항원의 에피토프에 공동으로 결합하는 면역글로불린 도메인의 VH-VL 쌍에 의해 일어나므로, 일반적으로 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 간주되지 않는다.
대조적으로, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 추가의 면역글로불린 가변 도메인과 짝을 이루지 않고 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 결합 부위는 단일 VH, 단일 VHH, 또는 단일 VL 도메인에 의해 형성된다.
따라서, 단일 가변 도메인은 이것이 단일 항원 결합 단위를 형성할 수 있는 한(즉, 단일 가변 도메인으로 본질적으로 구성된 기능적 항원 결합 단위로서, 따라서 단일 항원 결합 도메인이 기능적 항원 결합 단위를 형성하기 위해 또 다른 가변 도메인과 상호 작용할 필요가 없음) 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, VL-서열) 또는 이의 적합한 단편; 또는 중쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, VH-서열 또는 VHH 서열) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다.
면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)은 예를 들어 낙타화 VH 또는 인간화 VHH를 포함하는 VH, VHH와 같은 중쇄 ISVD일 수 있다. 바람직하게는, 낙타화 VH 또는 인간화 VHH를 포함하는 VHH이다. 중쇄 ISVD는 통상적인 4쇄 항체 또는 중쇄 항체로부터 유래될 수 있다.
예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 단일 도메인 항체(또는 단일 도메인 항체로 사용하기에 적합한 아미노산 서열), "dAb" 또는 dAb(또는 dAb로 사용하기에 적합한 아미노산 서열); 기타 단일 가변 도메인, 또는 이의 임의의 것의 임의의 적합한 단편일 수 있다.
특히, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 면역글로불린 단일 가변 도메인(예컨대, 인간화 VHH 또는 낙타화 VH를 포함하는 VHH) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다. 나노바디(Nanobody®, Nanobodies®) 및 나노클론(Nanoclone®)은 Ablynx N.V.의 등록상표이다.
VHH, VHH 항체 단편, 및 VHH 항체로도 알려져 있는 "VHH 도메인"은 본래 "중쇄 항체"(즉, "경쇄가 결여된 항체")의 항원 결합 면역글로불린 (가변) 도메인으로 기술되었다(Hamers-Casterman et al. Nature 363: 446-448, 1993). 용어 "VHH 도메인"은, 통상적인 4쇄 항체에 존재하는 중쇄 가변 도메인(본원에서 "VH 도메인"으로 언급됨) 및 통상적인 4쇄 항체에 존재하는 경쇄 가변 도메인(본원에서 "VL 도메인"으로 언급됨)으로부터 이들 가변 도메인을 구분하기 위해 선택된 것이다. VHH에 대한 추가 설명은 Muyldermans의 리뷰 논문을 참조한다(Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001).
일반적으로, 면역글로불린의 생성은 실험 동물의 면역화, 하이브리도마를 생성하기 위한 면역글로불린 생성 세포의 융합 및 목적하는 특이성에 대한 스크리닝을 포함한다. 대안적으로, 면역글로불린은 나이브 또는 합성 라이브러리의 스크리닝에 의해, 예를 들어, 파지 디스플레이에 의해 생성될 수 있다.
면역글로불린 서열의 생성은 다양한 공보에서 광범위하게 기술되었고, 그 중에서, WO 94/04678, 문헌[Hamers-Casterman et al. 1993] 및 문헌[Muyldermans et al. 2001]이 예시될 수 있다. 이러한 방법에서, 낙타과는 표적 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 표적 항원으로 면역화된다. 상기 면역화로부터 수득된 VHH의 레퍼토리는 표적 항원에 결합하는 VHH에 대해 추가로 스크리닝된다.
이러한 경우에, 항체의 생성은 면역화 및/또는 스크리닝을 위해 정제된 항원을 필요로 한다. 항원은 천연 공급원에서 또는 재조합 생산 과정에서 정제될 수 있다.
면역글로불린 서열에 대한 면역화 및/또는 스크리닝은 이러한 항원의 펩티드 단편을 사용하여 수행될 수 있다.
본 기술은 마우스, 래트, 토끼, 당나귀, 인간, 및 낙타과의 면역글로불린 서열을 포함하는 상이한 기원의 면역글로불린 서열을 사용할 수 있다. 본 기술은 또한 완전한 인간, 인간화, 또는 키메라 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 기술은 낙타과 면역글로불린 서열 및 인간화 낙타과 면역글로불린 서열, 또는 낙타화 도메인 항체, 예를 들어, Ward 등에 기재된 낙타화 dAb를 포함한다(예를 들어 WO 94/04678 및 문헌[Davies and Riechmann (1994 and 1996)] 참조). 또한, 본 기술은 또한 융합된 면역글로불린 서열, 예를 들어, 다가 및/또는 다중특이적 구성체 형성(하나 이상의 VHH 도메인을 함유하는 다가 및 다중특이적 폴리펩티드 및 이의 제조에 대해서는 문헌[Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001] 및 예를 들어, WO 96/34103 및 WO 99/23221을 참조) 및 태그 또는 기타 기능적 모이어티를 포함하는 면역글로불린 서열, 예를 들어, 본 기술의 면역글로불린 서열에서 유래할 수 있는 독소, 표지, 방사성 화학물질 등을 사용한다.
"인간화 VHH"는 자연 발생 VHH 도메인의 아미노산 서열에 상응하지만 "인간화"된, 즉 (위에 나타난 바와 같이) 상기 자연 발생 VHH의 아미노산 서열(특히 프레임워크 서열)에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 인간으로부터의 통상적인 4쇄 항체로부터의 VH 도메인의 상응하는 위치(들)에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나 이상에 의해 대체함으로써 인간화된 아미노산 서열을 포함한다. 이는 그 자체로 알려진 방식으로 수행될 수 있으며, 이는 예를 들어 본원의 추가 설명 및 선행 기술(예를 들어, WO 2008/020079)에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다. 즉, 이러한 인간화 VHH는 그 자체로 알려진 임의의 적합한 방식으로 수득될 수 있고, 따라서 출발 물질로서 자연 발생 VHH 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 수득된 폴리펩티드에 엄격하게 제한되지 않는다는 점에 유의해야 한다.
"낙타화 VH"는 자연 발생 VH 도메인의 아미노산 서열에 상응하지만 "낙타화"된, 즉 통상적인 4쇄 항체로부터의 자연 발생 VH 도메인의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기를 중쇄 항체의 VHH 도메인의 상응하는 위치(들)에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나 이상에 의해 대체함으로써 낙타화된 아미노산 서열을 포함한다. 이는 그 자체로 알려진 방식으로 수행될 수 있으며, 이는 예를 들어 본원의 추가 설명 및 선행 기술(예를 들어, WO 2008/020079)에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 "낙타화" 치환은 바람직하게는 VH-VL 경계면에 존재하고/하거나 이를 형성하는 아미노산 위치, 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 소위 낙타과 홀마크 잔기에 삽입된다(예를 들어, WO 94/04678 및 위의 문헌[Davies and Riechmann (1994 및 1996)] 참조). 바람직하게는, 낙타화 VH를 생성 또는 설계하기 위한 출발 물질 또는 출발점으로 사용되는 VH 서열은 바람직하게는 포유동물로부터의 VH 서열, 보다 바람직하게는 VH3 서열과 같은 인간의 VH 서열이다. 그러나 이러한 낙타화 VH는 그 자체로 알려진 임의의 적합한 방식으로 수득될 수 있고, 따라서 출발 물질로서 자연 발생 VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 수득된 폴리펩티드에 엄격하게 제한되지 않는다는 점에 유의해야 한다.
면역글로불린 단일 가변 도메인 서열의 바람직한 구조는 당업계 및 본원에서 각각 "프레임워크 영역 1"("FR1"); "프레임워크 영역 2"("FR2"); "프레임워크 영역 3"("FR3"); 및 "프레임워크 영역 4"("FR4")로 지칭되는 4개의 프레임워크 영역("FR")을 포함하는 것으로 간주될 수 있고, 프레임워크 영역은 당업계 및 본원에서 각각 "상보성 결정 영역 1"("CDR1"); "상보성 결정 영역 2"("CDR2"); 및 "상보성 결정 영역 3"("CDR3")으로 지칭되는 3개의 상보성 결정 영역("CDR")에 의해 중단된다.
WO 08/020079의 58페이지 및 59페이지의 단락 q)에 추가로 기재된 바와 같이 면역글로불린 단일 가변 도메인의 아미노산 잔기는 Riechmann과 Muyldermans의 논문(2000 (J. Immunol. Methods 240 (1-2): 185-195; 예를 들어, 이 공보의 도 2 참조)의 낙타과로부터의 VHH 도메인에 적용되는 바와 같이 Kabat 등(“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)이 제공한 VH 도메인에 대한 일반적인 넘버링에 따라 넘버링될 수 있다. VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해 당업계에 잘 알려진 바와 같이 각각의 CDR의 아미노산 잔기의 총 수는 다양할 수 있으며 Kabat 넘버링에 의해 표시되는 아미노산 잔기의 총 수에 상응하지 않을 수 있음(즉, Kabat 넘버링에 따른 하나 이상의 위치가 실제 서열에서 점유되지 않을 수 있거나, 또는 실제 서열이 Kabat 넘버링에 의해 허용되는 수보다 더 많은 아미노산 잔기를 포함할 수 있음)을 유의해야 한다. 이는 일반적으로 Kabat에 따른 넘버링이 실제 서열에서 아미노산 잔기의 실제 넘버링과 상응하거나 상응하지 않을 수 있음을 의미한다. VH 도메인 및 VHH 도메인에서 아미노산 잔기의 총 수는 일반적으로 110 내지 120, 종종 112 내지 115의 범위일 것이다. 그러나 더 작고 더 긴 서열도 본원에 기술된 목적에 적합할 수 있음에 유의해야 한다.
본 출원에서, 달리 명시되지 않는 한, CDR 서열은 Kontermann 및 Duebel에 기재된 AbM 정의에 따라 결정되었다(문헌[Eds. 2010, Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp. 33-51]). 이 방법에 따르면, FR1은 위치 1~25의 아미노산 잔기를 포함하고, CDR1은 위치 26~35의 아미노산 잔기를 포함하고, FR2는 위치 36~49의 아미노산을 포함하고, CDR2는 위치 50~58의 아미노산 잔기를 포함하고, FR3은 위치 59~94의 아미노산 잔기를 포함하고, CDR3은 위치 95~102의 아미노산 잔기를 포함하고, FR4는 위치 103~113의 아미노산 잔기를 포함한다.
CDR 영역의 결정은 또한 상이한 방법에 따라 수행될 수 있다. Kabat에 따른 CDR 결정에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 FR1은 위치 1~30의 아미노산 잔기를 포함하고, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 CDR1은 위치 31~35의 아미노산 잔기를 포함하고, FR2는 면역글로불린 단일 가변 도메인은 위치 36~49의 아미노산을 포함하고, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 CDR2는 위치 50~65의 아미노산 잔기를 포함하고, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 FR3은 위치 66~94의 아미노산 잔기를 포함하고, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 CDR3은 위치 95~102의 아미노산 잔기를 포함하고, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 FR4는 위치 103~113의 아미노산 잔기를 포함한다.
이러한 면역글로불린 서열에서, 프레임워크 서열은 임의의 적합한 프레임워크 서열일 수 있고, 적합한 프레임워크 서열의 예는 예를 들어 표준 핸드북 및 추가 개시내용 및 본원에 언급된 선행 기술에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다.
프레임워크 서열은 바람직하게는 (예를 들어, 인간화 또는 낙타화에 의해) 면역글로불린 프레임워크 서열로부터 유래된 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 프레임워크 서열(의 적합한 조합)이다. 예를 들어, 프레임워크 서열은 경쇄 가변 도메인(예를 들어, VL-서열) 및/또는 중쇄 가변 도메인(예를 들어, VH-서열 또는 VHH 서열)으로부터 유래된 프레임워크 서열일 수 있다. 특히 바람직한 일 양태에서, 프레임워크 서열은 VHH-서열로부터 유래된 프레임워크 서열(여기서 상기 프레임워크 서열은 임의로 부분적으로 또는 완전히 인간화될 수 있음)이거나 낙타화된 통상적인 VH 서열(본원에 정의된 바와 같음)이다.
특히, 본 기술에 사용된 ISVD 서열에 존재하는 프레임워크 서열은 (본원에 정의된 바와 같은) 홀마크 잔기 중 하나 이상을 함유할 수 있으며, 따라서, ISVD 서열은 인간화 VHH 또는 낙타화 VH를 비롯한 VHH이다. 이러한 프레임워크 서열(의 적합한 조합)의 일부 바람직하지만 비제한적인 예는 본원의 추가 개시내용으로부터 명백해질 것이다.
다시, 면역글로불린 서열에 대해 본원에 일반적으로 기재된 바와 같이, 하나 이상의 프레임워크 서열(예를 들어, 이들 CDR 및 프레임워크 서열과 동일한 순서로 단편이 유래된 전체 크기 면역글로불린 서열에서 발생할 수 있음)에 의해 적합하게 플랭킹되고/되거나 이를 통해 연결된 하나 이상의 CDR 서열을 함유하는 단편과 같은, 임의의 전술한 것의 적합한 단편(또는 단편의 조합)을 사용하는 것도 가능하다.
그러나 본 기술은 ISVD 서열(또는 이를 발현하는 데 사용된 뉴클레오티드 서열)의 기원이나 ISVD 서열 또는 뉴클레오티드 서열이 생성되거나 수득되는(또는 생성되었거나 수득된) 방식에 한정되지 않음을 유의해야 한다. 따라서, ISVD 서열은 (임의의 적합한 종으로부터) 자연 발생 서열 또는 합성 또는 반합성 서열일 수 있다. 특정, 그러나 비제한적인 양태에서, ISVD 서열은 (임의의 적합한 종으로부터의) 자연 발생 서열 또는 합성 또는 반합성 서열이고, 이는 (본원에 정의된 바와 같은) "인간화" 면역글로불린 서열(예를 들어, 부분 또는 완전 인간화된 마우스 또는 토끼 면역글로불린 서열, 특히 부분 또는 완전 인간화 VHH 서열), (본원에 정의된 바와 같은) "낙타화" 면역글로불린 서열뿐만 아니라, 친화도 성숙(예를 들어, 합성, 무작위 또는 자연 발생 면역글로불린 서열로부터 시작), CDR 그래프팅(grafting), 베니어링(veneering), 상이한 면역글로불린 서열로부터 유래된 단편 조합, 중첩 프라이머를 사용한 PCR 어셈블리 및 당업자에게 잘 알려진 면역글로불린 서열을 조작하기 위한 유사한 기술; 또는 임의의 전술한 것의 임의의 적합한 조합과 같은 기술에 의해 수득한 면역글로불린 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
마찬가지로, 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 뉴클레오티드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열일 수 있고, 예를 들어 적합한 자연 발생 주형(예를 들어, 세포로부터 단리된 DNA 또는 RNA)으로부터 PCR에 의해 단리된 서열, 라이브러리(특히, 발현 라이브러리)로부터 단리된 뉴클레오티드 서열, (미스매치 PCR과 같이 그 자체로 알려진 임의의 적합한 기술을 사용하여) 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입함으로써 제조된 뉴클레오티드 서열, 중첩 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제조된 뉴클레오티드 서열, 또는 그 자체로 알려진 DNA 합성 기술을 사용하여 제조된 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
전술한 바와 같이, ISVD는 나노바디 또는 이의 적합한 단편일 수 있다. 나노바디에 대한 일반적인 설명은 아래의 추가 설명 및 본원에서 인용된 선행 기술을 참조한다. 그러나 이와 관련하여, 본 명세서와 선행 기술은 소위 "VH3 부류"의 나노바디(즉, VH3 부류의 인간 생식선 서열과 높은 정도의 서열 상동성을 갖는 나노바디, 예컨대, DP-47, DP-51 또는 DP-29)를 주로 설명하였음에 유의해야 한다. 그러나 가장 넓은 의미에서, 본 기술은 일반적으로 임의의 유형의 나노바디를 사용할 수 있으며, 예를 들어 WO 2007/118670에 기재된 바와 같은, 예를 들어 소위 "VH4 부류"에 속하는 나노바디(즉, VH4 부류의 인간 생식선 서열과 높은 정도의 서열 상동성을 갖는 나노바디, 예컨대, DP-78)도 사용함에 유의해야 한다.
일반적으로, 나노바디(특히, (부분) 인간화 VHH 서열 및 낙타화 VH 서열을 포함하는 VHH 서열)는 (다시 본원에서 추가로 설명되는 바와 같이) 하나 이상의 프레임워크 서열의 하나 이상의 (본원에 기재된 바와 같은) "홀마크 잔기"의 존재를 특징으로 할 수 있다. 따라서, 일반적으로 나노바디는 다음의 (일반) 구조를 갖는 면역글로불린 서열로 정의할 수 있다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
여기서 FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 나타내고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 나타내고, 여기서 홀마크 잔기 중 하나 이상은 본원에 추가로 정의된 바와 같다.
특히, 나노바디는 다음의 (일반) 구조를 갖는 면역글로불린 서열일 수 있다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
여기서 FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 나타내고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 나타내고, 여기서 프레임워크 서열은 본원에 추가로 정의된 바와 같다.
보다 구체적으로, 나노바디는 다음의 (일반) 구조를 갖는 면역글로불린 서열일 수 있다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
여기서 FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 나타내고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 나타내며,
Kabat 넘버링에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상은 하기 표 A-0에 언급된 홀마크 잔기로부터 선택된다.
[표 A-0]
본 기술은 특히 TCR 또는 GPC3의 불변 도메인에 결합할 수 있는 ISVD를 사용한다. 본 기술의 맥락에서, 특정 표적 분자에 "결합"하는 것은 항체 및 이들의 각각의 항원의 맥락에서 이해되는 바와 같이 당업계에서 통상적인 의미를 갖는다.
다중특이적-다가 폴리펩티드는 GPC3에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 ISVD를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 GPC3에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD 및 TCR에 특이적으로 결합하는 ISVD를 포함할 수 있다.
본 기술에 사용된 ISVD는 폴리펩티드의 일부를 형성하며, 이는 적어도 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어져 폴리펩티드가 GPC3 및 TCR에 특이적으로 결합할 수 있다.
따라서 본 기술에 사용되는 ISVD의 표적 분자는 각각 GPC3와 TCR의 불변 도메인이다. TCR에 대한 결합은 예를 들어 TCR 알파 서브유닛 및/또는 TCR 베타 서브유닛에 결합함으로써 달성될 수 있다. 예는 포유류 GPC3 및 TCR이다. 인간 GPC3(Uniprot 수탁 P51654, 표 A-8 참조) 및 인간 TCR(표 A-8 참조)이 바람직하지만, 다른 종으로부터의 버전, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 염소, 양, 말, 돼지, 시노몰구스 원숭이(본원에서 "시노"로도 지칭됨)와 같은 비인간 영장류, 또는 라마 또는 알파카와 같은 낙타과로부터의 GPC3 및 TCR이 본 기술에 적합하다.
본 기술에 사용될 수 있는 T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하는 ISVD의 구체적인 예는 하기 항목 A에 기재된 바와 같다:
A. 인간 TCR에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:
i. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
(바람직하게는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3).
바람직한 구현예에서, ISVD는 서열번호 135의 인간 TCR-α 및/또는 서열번호 136의 TCR-β, 또는 이의 다형성 변이체 또는 이소형의 불변 도메인에 결합한다.
인간 TCR에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 바람직한 예는 (선행하는 항목 A에 정의된 CDR 외에도) 표 A-2의 ISVD TCE01에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 (및 바람직하게는 모든) 프레임워크 영역을 포함하고, 가장 바람직하게는 ISVD TCE01의 전체 아미노산 서열로 이루어진 ISVD이다(서열번호 2, 표 A-1 및 A-2 참조).
또한 바람직한 구현예에서, 인간 TCR에 특이적으로 결합하는 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과, 예컨대 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 나타낼 수 있고, CDR은 선행하는 항목 A에 정의된 바와 같다. 특히, TCR에 특이적으로 결합하는 ISVD는 가장 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열이다.
TCR에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD가 상응하는 참조 CDR 서열(위의 항목 A)에 비해 적어도 하나의 CDR에서 2 또는 1개의 아미노산 차이를 나타내는 경우, ISVD는 서열번호 2에 제시된 구성체 TCE01와 인간 TCR에 대해 바람직하게는 적어도 절반의 결합 친화도, 보다 바람직하게는 적어도 동일한 결합 친화도를 나타내며, 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.
본 기술에서 사용할 수 있는 GPC3에 특이적으로 결합하는 ISVD의 구체적인 예는 다음 항목 B 및 C에 기재된 바와 같다:
B. 인간 GPC3에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:
i. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
(바람직하게는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3).
C. 인간 GPC3에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:
i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
(바람직하게는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3).
바람직한 구현예에서, ISVD는 서열번호 134의 인간 GPC3에 결합한다.
인간 GPC3에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 바람직한 예는 (선행하는 항목 B 및 C에 각각 정의된 CDR 외에도) 표 A-2의 ISVD A022600351 및 A022600314 각각에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 (및 바람직하게는 모든) 프레임워크 영역을 포함하고, 가장 바람직하게는 ISVD A022600351 또는 A022600314의 전체 아미노산 서열로 이루어진 ISVD이다(서열번호 3 또는 4, 표 A-1 및 A-2 참조).
또한, 바람직한 구현예에서, 인간 GPC3에 특이적으로 결합하는 ISVD의 아미노산 서열은 각각 서열번호 3 또는 4와 90% 초과, 예컨대 95% 초과, 또는 99% 초과의 서열 동일성을 나타낼 수 있고, CDR은 각각 선행하는 항목 B 및 C에 정의된 바와 같다. 특히, 일 구현예에서, 인간 GPC3에 결합하는 ISVD는 가장 바람직하게는 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열이다.
인간 GPC3에 결합하는 이러한 ISVD가 상응하는 참조 CDR 서열(상기 항목 B 또는 D)에 비해 적어도 하나의 CDR에서 2 또는 1개의 아미노산 차이를 나타내는 경우, ISVD는 각각 서열번호 3 및 4에 제시된 구성체 A022600351 또는 A022600314와 인간 GPC3에 대해 바람직하게는 적어도 절반의 결합 친화도, 또는 보다 바람직하게는 적어도 동일한 결합 친화도를 나타내며, 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.
바람직하게는, 상기 항목 A 내지 C에 정의된 바와 같은 각각의 ISVD는 폴리펩티드에 포함된다.
상기 항목 A 내지 C에 정의된 바와 같은 각각의 ISVD를 포함하는 이러한 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드와 인간 TCR 및 인간 GPC3에 대해 바람직하게는 적어도 절반의 결합 친화도, 보다 바람직하게는 적어도 동일한 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.
상기 항목 A 내지 C 및 아래 항목 D(섹션 5.4 "(생체내) 반감기 연장" 참조)에서 언급된 서열번호는 AbM 정의(표 A-2 참조)에 따른 CDR 정의를 기반으로 한다. Kabat 정의(표 A-2-1 참조)에 따라 동일한 CDR을 정의하는 서열번호는 마찬가지로 상기 항목 A 내지 C 및 아래 항목 D(섹션 5.4 "(생체내) 반감기 연장" 참조)에서 사용될 수 있음에 주목한다.
따라서, 본 기술에서 사용할 수 있는 T세포 상의 TCR의 불변 도메인 또는 GPC3에 특이적으로 결합하는 ISVD의 구체적인 예는 AbM 정의를 사용하여 위에서 설명한 바와 같으며, 또한 아래 항목 A' 내지 C'에 제시된 바와 같이 Kabat 정의를 사용하여 설명할 수 있다:
A'. 인간 TCR에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:
i. 서열번호 31의 아미노산 서열 또는 서열번호 31과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 35의 아미노산 서열 또는 서열번호 35과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
(바람직하게는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3).
인간 TCR에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 바람직한 예는 (선행하는 항목 A'에 정의된 CDR 외에도) 표 A-2-1의 ISVD TCE01에 대해 각각 표시된 바와 같은 하나 이상의 (및 바람직하게는 모든) 프레임워크 영역을 포함하고, 가장 바람직하게는 ISVD TCE01의 전체 아미노산 서열로 이루어진 ISVD이다(서열번호 2, 표 A-1 및 A-2-1 참조).
B'. 인간 GPC3에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:
i. 서열번호 32의 아미노산 서열 또는 서열번호 32과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 36의 아미노산 서열 또는 서열번호 36과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
(바람직하게는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3).
C'. 인간 GPC3에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:
i. 서열번호 33의 아미노산 서열 또는 서열번호 33과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 37의 아미노산 서열 또는 서열번호 37과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
(바람직하게는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3).
인간 GPC3에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 바람직한 예는 (선행하는 항목 B' 및 C'에 각각 정의된 CDR 외에도) 표 A-2-1의 ISVD A022600351 및 A022600314 각각에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 (및 바람직하게는 모든) 프레임워크 영역을 포함하고, 가장 바람직하게는 ISVD A022600351 또는 A022600314의 전체 아미노산 서열로 이루어진 ISVD이다(서열번호 3 또는 4, 표 A-1 및 A-2-1 참조).
제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"의 백분율은 [제2 아미노산 서열의 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기와　동일한 제1 아미노산 서열의 아미노산 잔기의 수]를 [제1 아미노산 서열의 아미노산 잔기의 총 수]로 나누고 [100%]를 곱하여 계산할 수 있으며, - 제1 아미노산 서열과 비교하여 - 제2 아미노산 서열의 아미노산 잔기의 각 결실, 삽입, 치환 또는 부가는 단일 아미노산 잔기(즉, 단일 위치)에서의 차이로 간주된다.
통상적으로, 본원의 위에서 개략적으로 설명된 계산 방법에 따라 2개의 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"의 백분율을 결정하기 위하여, 가장 많은 수의 아미노산 잔기를 가진 아미노산 서열을 "제1" 아미노산 서열로 취할 것이고, 다른 아미노산 서열을 "제2" 아미노산 서열로 취할 것이다.
본원에서 사용되는 "아미노산 차이"는 참조 서열과 비교하여 단일 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 지칭하고, 바람직하게는 치환이다.
아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 이러한 보존적 치환은 바람직하게는 다음의 군 (a) 내지 (e) 내의 하나의 아미노산이 동일한 군의 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다: (a) 작은 지방족의, 비극성 또는 약한 극성의 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro, 및 Gly; (b) 극성의, 음으로 하전된 잔기 및 이들의 (하전되지 않은) 아미드: Asp, Asn, Glu, 및 Gln; (c) 극성의, 양으로 하전된 잔기: His, Arg, 및 Lys; (d) 큰 지방족의, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val, 및 Cys; 및 (e) 방향족 잔기: Phe, Tyr, 및 Trp.
특히 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala에서 Gly 또는 Ser으로; Arg에서 Lys으로; Asn에서 Gln 또는 His으로; Asp에서 Glu으로; Cys에서 Ser으로; Gln에서 Asn으로; Glu에서 Asp으로; Gly에서 Ala 또는 Pro으로; His에서 Asn 또는 Gln로; Ile에서 Leu 또는 Val으로; Leu에서 Ile 또는 Val로; Lys에서 Arg, Gln 또는 Glu으로; Met에서 Leu, Tyr 또는 Ile으로; Phe에서 Met, Leu 또는 Tyr으로; Ser에서 Thr으로; Thr에서 Ser으로; Trp에서 Tyr으로; Tyr에서 Trp으로; 및/또는 Phe에서 Val, Ile 또는 Leu으로.
5.3 특이성
"특이성", "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적 결합"이라는 용어는 ISVD와 같은 특정 결합 단위가 충분히 높은 친화도로 결합할 수 있는 동일한 유기체로부터 항원과 같은 상이한 표적 분자의 수를 지칭한다(아래 참조). "특이성", "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적 결합"은 본원에서 "선택성", "선택적으로 결합하는" 또는 "선택적 결합"과 상호 교환적으로 사용된다. ISVD와 같은 결합 단위는 바람직하게는 지정된 표적에 특이적으로 결합한다.
결합 단위의 특이성/선택성은 친화도에 따라 결정될 수 있다. 친화도는 분자의 상호 작용의 강도 또는 안정성을 나타낸다. 친화도는 통상적으로 몰/L(또는 M) 단위로 표현되는 KD 또는 해리 상수로 제공된다. 또한, 친화도는, 1/KD와 같으며 (몰/L)-1(또는 M-1) 단위로 표현되는 결합 상수 KA로 나타낼 수 있다.
친화도는 모이어티와 표적 분자의 결합 부위 사이의 결합 강도에 대한 척도이다: KD 값이 낮을수록 표적 분자와 표적 모이어티 사이의 결합 강도가 더 강해짐.
일반적으로, 본 기술에서 사용되는 결합 단위(예를 들어, ISVD)는 10-5 내지 10-12 몰/L 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/L 이하, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/L 이하의 해리 상수(KD)(즉, 105 내지 1012 리터/몰 이상, 바람직하게는 107 내지 1012 리터/몰 이상, 보다 바람직하게는 108 내지 1012 리터/몰 이상의 결합 상수(KA))로 이들의 표적과 결합할 것이다.
10-4 몰/L보다 큰 임의의 KD 값(또는 104 L/몰보다 낮은 임의의 KA 값)은 일반적으로 비 특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다.
특이적인 것으로 간주되는 항원에 대한 면역글로불린 서열의 결합과 같은 생물학적 상호 작용에 대한 KD는 일반적으로 10-5 몰/L(10000 nM 또는 10 μM) 내지 10-12 몰/L(0.001 nM 또는 1 pm) 이하의 범위이다.
따라서, 특이적/선택적 결합은 - 동일한 측정 방법, 예를 들어, SPR을 사용하여 - 결합 단위(또는 이를 포함하는 폴리펩티드)가 10-5 내지 10-12 몰/L 이하의 KD 값으로 TCR 및/또는 GPC3에 결합하고 10-4 몰/L 초과의 KD 값으로 관련 표적에 결합함을 의미할 수 있다. GPC3에 대한 관련 표적의 예는 GPC1, GPC2, GPC4, GPC5, 또는 GPC6이다. 따라서, 본 기술의 구현예에서, GPC3에 결합하는 폴리펩티드에 포함된 ISVD는 KD 값이 10-5 내지 10-12 몰/리터 이하인 GPC3에 결합하고, KD 값이 10-4 몰/리터를 초과하는 동일한 종의 GPC1, GPC2, GPC4, GPC5, 및 GPC6에 결합한다.
따라서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드와 비교하여 인간 TCR 및 인간 GPC3에 대해 바람직하게는 적어도 절반의 결합 친화도, 보다 바람직하게는 적어도 동일한 결합 친화도를 나타내며, 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.
특정 종으로부터의 특정 표적에 대한 특이적 결합은, 결합 단위가 상이한 종으로부터의 유사한 표적에도 특이적으로 결합할 수 있음을 배제하지 않는다. 예를 들어, 인간 TCR에 대한 특이적 결합은 결합 단위(또는 이를 포함하는 폴리펩티드)가 시노몰구스 원숭이로부터의 TCR에도 특이적으로 결합할 수 있음을 배제하지 않는다. 마찬가지로, 예를 들어, 인간 GPC3에 대한 특이적 결합은 결합 단위(또는 이를 포함하는 폴리펩티드)가 시노몰구스 원숭이("시노")로부터의 GPC3에도 특이적으로 결합할 수 있음을 배제하지 않는다.
인간 TCR에 결합하고 본 기술의 폴리펩티드에 포함되는 서열번호 2를 갖는 ISVD는 WO 2016/180969 A1에 기술된 ISVD T0170056G05와 비교하여 개선된 결합 특성을 나타낸다. 보다 구체적으로, 서열번호 2를 갖는 ISVD는 T017056G05로부터 유래되고 CDR1 및 CDR3에 특정 돌연변이를 포함하며, 이는 ISVD T0170056G05와 비교하여 인간 및 비인간 영장류(예컨대 시노몰구스 원숭이) TCR에 대한 결합에 있어서의 교차 반응성을 개선시킨다.
ISVD가 다른 ISVD와 비교하여 "인간 및 비인간 영장류 TCR에 대한 결합에 있어서 향상된 교차 반응성"을 보인다고 언급되는 경우, 이는 상기 ISVD에 대해 인간 TCR 및 비인간 영장류 TCR에 대한 결합 활성의 비율(예컨대 KD 또는 koff로 나타냄)이 동일한 분석에서 다른 ISVD에 대해 계산된 동일한 비율보다 낮다는 것을 의미한다.
인간 및 비인간 영장류 TCR에 대한 결합에 있어서의 우수한 교차 반응성은 비인간 영장류에 대해 수행된 전임상 연구에서 다중특이적 T세포 관여 폴리펩티드의 독성 평가를 가능케 한다.
지정된 표적에 대한 결합 단위의 특이적 결합은 예를 들어, 스캐차드 분석 및/또는 경쟁 결합 분석, 예를 들어 방사선 면역측정법(RIA), 효소 면역분석법(EIA) 및 샌드위치 경쟁 분석법, 및 당업계에서 그 자체로 알려진 이들의 다양한 변이형; 및 본원에서 언급된 기타 기술을 비롯한, 그 자체로 알려진 임의의 적합한 방법에서 결정될 수 있다.
해리 상수는 당업자에게 명백하듯이 실제 또는 겉보기 해리 상수일 수 있다. 해리 상수를 결정하는 방법은 당업자에게 명확할 것이며, 예를 들어 아래에서 언급되는 기술을 포함한다. 이와 관련하여, 10-4 몰/L 또는 10-3 몰/L 초과(예를 들어, 10-2 몰/L)의 해리 상수를 측정하는 것은 가능하지 않을 수 있음은 명백할 것이다. 임의로, 또한 당업자에게 명확하듯이, (실제 또는 겉보기) 해리 상수는 관계식 [KD = 1/KA]에 의해 (실제 또는 겉보기) 결합 상수(KA)를 기초로 하여 계산될 수 있다.
두 분자 사이의 분자 상호 작용의 친화도는 그 자체로 알려진 상이한 기술, 예를 들어 잘 알려진 표면 플라스몬 공명(SPR) 바이오센서 기술(예를 들어 Ober et al. 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559)을 통해 측정할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "표면 플라스몬 공명"은 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변화를 검출함으로써 실시간 생물특이적 상호 작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상을 의미하며, 여기서 하나의 분자는 바이오센서 칩에 고정되어 있고 다른 분자는 kon, koff 측정값 및 따라서 KD(또는 KA) 값을 산출하는 흐름 조건에서 고정된 분자 위로 통과된다. 이것은 예를 들어 잘 알려진 BIAcore® 시스템(BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)을 사용하여 수행될 수 있다. 추가 설명에 대해서는, 문헌[Jonsson et al. (1993, Ann. Biol. Clin. 51: 19-26)], 문헌[Jonsson et al. (1991 Biotechniques 11: 620-627)], 문헌[Johnsson et al. (1995, J. Mol. Recognit. 8: 125-131)], 및 문헌[Johnnson et al. (1991, Anal. Biochem. 198: 268-277]을 참조.
생체분자 상호작용의 친화도를 결정하기 위한 또 다른 잘 알려진 바이오센서 기술은 생물층 간섭계(BLI)이다(예를 들어 문헌[Abdiche et al. 2008, Anal. Biochem. 377: 209-217] 참조). 본원에서 사용되는 용어 "생물층 간섭계" 또는 "BLI"는 두 표면: 내부 참조층(참조 빔) 및 바이오센서 팁 상의 고정된 단백질 층(신호 빔)으로부터 반사된 빛의 간섭 패턴을 분석하는 무표지 광학 기술을 지칭한다. 바이오센서의 팁에 결합된 분자 수의 변화는 간섭 패턴의 이동을 유발하며, 이는 파장 이동(nm)으로 보고되며, 그 규모는 바이오센서 팁 표면에 결합된 분자 수의 직접적인 척도이다. 상호 작용을 실시간으로 측정할 수 있으므로 결합 및 해리 속도와 친화도를 결정할 수 있다. BLI는 예를 들어 잘 알려진 Octet® 시스템(ForteBio, a division of Pall Life Sciences, Menlo Park, USA)을 사용하여 수행될 수 있다.
대안적으로, 친화도는 KinExA® 플랫폼(Sapidyne Instruments Inc, 미국 보이시 소재)을 사용하여 Kinetic Exclusion Assay(KinExA)에서 측정할 수 있다(예를 들어, 문헌[Drake et al. 2004, Anal. Biochem., 328: 35-43] 참조). 본원에서 사용되는 "KinExA"라는 용어는 변형되지 않은 분자의 진정한 평형 결합 친화도 및 동역학을 측정하기 위한 용액 기반 방법을 지칭한다. 항체/항원 복합체의 평형 용액을 항원(또는 항체)으로 미리 코팅된 비드가 있는 컬럼 위로 통과시켜 유리 항체(또는 항원)가 코팅된 분자에 결합하도록 한다. 이렇게 포획된 항체(또는 항원)의 검출은 항체(또는 항원)에 결합하는 형광 표지된 단백질로 달성된다.
GYROLAB® 면역분석 시스템은 자동화된 생물분석 및 신속한 샘플 처리를 위한 플랫폼을 제공한다(Fraley et al. 2013, Bioanalysis 5: 1765-74).
5.4 (생체내) 반감기 연장
폴리펩티드는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 임의로 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위를 추가로 포함할 수 있고, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 (생체내) 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공한다. 생체 내 반감기 연장은 예를 들어, 폴리펩티드가 투여 후 인간 대상체와 같은 포유동물에서 반감기가 증가됨을 나타낸다. 반감기는 예를 들어 t1/2베타로 표현할 수 있다.
기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위의 유형은 일반적으로 제한되지 않으며, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 소형 단백질 또는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
보다 구체적으로, 폴리펩티드에 증가된 반감기를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위는 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민 또는 IgG와 같은 혈청 면역글로불린에 결합할 수 있는 결합 단위로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 결합 단위이다. 결합 단위는 바람직하게는 ISVD이다.
예를 들어, WO 04/041865는 상기 단백질의 반감기를 증가시키기 위해 다른 단백질(예를 들어, 목적하는 표적에 결합하는 하나 이상의 다른 나노바디)에 연결될 수 있는 혈청 알부민에 결합하는 (특히 인간 혈청 알부민에 대한) Nanobodies®를 기재하고 있다.
국제출원 WO 06/122787은 (인간) 혈청 알부민에 대한 다수의 Nanobodies®를 기재하고 있다. 이러한 Nanobodies®에는 Alb-1(WO 06/122787의 서열번호 52)로 불리는 Nanobody® 및 Alb-8(WO 06/122787의 서열번호 62)과 같은 이의 인간화 변이체가 포함된다. 즉, 이들은 치료 단백질 및 폴리펩티드 및 기타 치료 엔티티 또는 모이어티의 반감기를 연장하는 데 사용될 수 있다.
또한, WO2012/175400은 Alb-23이라 불리는 Alb-1의 추가 개선된 버전을 기재하고 있다.
바람직한 구현예에서, 폴리펩티드는 Alb-1, Alb-3, Alb-4, Alb-5, Alb-6, Alb-7, Alb-8, Alb-9, Alb-10 및 Alb-23, 바람직하게는 Alb-8 또는 Alb-23 또는 WO2012/175400의 페이지 7~9에 제시된 바와 같은 이의 변이체 및 WO2012/175741, WO2015/173325, WO2017/080850, WO2017/085172, WO2018/104444, WO2018/134235, WO2018/134234에 기재된 알부민 결합제로부터 선택된 혈청 알부민 결합 모이어티를 포함한다. 일부 바람직한 혈청 알부민 결합제는 또한 표 A-4에 제시되어 있다. 폴리펩티드의 특히 바람직한 추가 성분은 항목 D에 기재된 바와 같다:
D. 인간 혈청 알부민에 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:
i. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
(바람직하게는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3).
인간 혈청 알부민에 결합하는 이러한 ISVD의 바람직한 예는 (선행하는 항목 D에 정의된 CDR 외에도) 표 A-2의 ISVD ALB23002에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 (및 바람직하게는 모든) 프레임워크 영역을 포함하고, 가장 바람직하게는 ISVD ALB23002의 전체 아미노산 서열로 이루어진 ISVD이다(서열번호 5, 표 A-1 및 A-2 참조).
항목 D는 또한 Kabat 정의를 사용하여 다음과 같이 기술될 수 있다:
D'. 인간 혈청 알부민에 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:
i. 서열번호 34의 아미노산 서열 또는 서열번호 34과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 38의 아미노산 서열 또는 서열번호 38과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
(바람직하게는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3).
인간 혈청 알부민에 결합하는 이러한 ISVD의 바람직한 예는 (선행하는 항목 D'에 정의된 CDR 외에도) 표 A-2-1의 ISVD ALB23002에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 (및 바람직하게는 모든) 프레임워크 영역을 포함하고, 가장 바람직하게는 ISVD ALB23002의 전체 아미노산 서열로 이루어진 ISVD이다(서열번호 5, 표 A-1 및 A-2-1 참조).
또한, 바람직한 구현예에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 5와 90% 초과, 예컨대 95% 초과, 또는 99% 초과의 서열 동일성을 나타낼 수 있고, CDR은 선행하는 항목 D 또는 D'에 정의된 바와 같다. 특히, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열이다.
인간 혈청 알부민에 결합하는 이러한 ISVD가 상응하는 참조 CDR 서열(위의 항목 D 또는 D')에 비해 적어도 하나의 CDR에서 2 또는 1개의 아미노산 차이를 나타내는 경우, ISVD는 서열번호 5에 제시된 구성체 ALB23002와 인간 혈청 알부민에 대해 적어도 절반의 결합 친화도, 바람직하게는 적어도 동일한 결합 친화도를 나타내며, 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.
인간 혈청 알부민에 결합하는 이러한 ISVD가 C 말단 위치를 포함하는 경우, 이는 C 말단 알라닌(A) 또는 글리신(G) 연장(바람직하게는 A)을 나타내고, 바람직하게는 서열번호 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 96, 및 98, 가장 바람직하게는 서열번호 96(단일 알라닌 연장을 갖는 서열번호 5를 나타냄)로부터 선택된다(아래 표 A-4 참조). 일부 구현예에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 C 말단 위치 이외의 다른 위치에 있고(즉, 폴리펩티드의 C 말단 ISVD가 아님), 서열번호 5, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 및 97로부터 선택된다(아래 표 A-4 참조).
5.5 핵산 분자
또한, 본원에 기재된 바와 같이 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 제공된다.
"핵산 분자"("핵산"과 상호교환적으로 사용됨)는 뉴클레오티드 서열을 형성하기 위해 포스페이트 백본을 통해 서로 연결된 뉴클레오티드 단량체의 사슬이다. 핵산은 예를 들어, 폴리펩티드의 발현 및/또는 생성을 위해, 숙주 세포 또는 숙주 유기체를 형질전환/형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 생성 목적에 적합한 숙주 또는 숙주 세포는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 세포 또는 세포주 또는 임의의 적합한 진균, 원핵, 또는 진핵 유기체일 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포도 본 기술에 포함된다.
핵산은 예를 들어 DNA, RNA, 또는 이들의 하이브리드일 수 있고, 또한 PNA와 같은 (예를 들어, 화학적으로) 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이는 단일 또는 이중 가닥일 수 있으며, 바람직하게는 이중 가닥 DNA의 형태이다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA 또는 cDNA일 수 있다.
핵산은 그 자체로 알려진 방식으로 제조 또는 수득될 수 있고/있거나 적합한 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 자연 발생 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열 변이를 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 제공하기 위해 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발을 수행할 수 있다. 또한, 당업자에게 명백한 바와 같이, 핵산을 제조하기 위해 표적화 모이어티를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열 및 예를 들어 하나 이상의 링커를 암호화하는 핵산과 같은 여러 뉴클레오티드 서열이 적합한 방식으로 함께 연결될 수 있다.
핵산을 생성하는 기술은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 자동화된 DNA 합성; 부위-지정 돌연변이유발; 2개 이상의 자연 발생 및/또는 합성 서열(또는 이의 2개 이상의 부분)의 결합, 절단된 발현 생성물의 발현을 유도하는 돌연변이의 도입; 하나 이상의 제한 부위의 도입(예를 들어, 적합한 제한 효소를 사용하여 쉽게 소화 및/또는 결찰될 수 있는 카세트 및/또는 영역을 생성하기 위해) 및/또는 하나 이상의 "미스매치된" 프라이머를 사용하는 PCR 반응에 의한 돌연변이의 도입을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
5.6 벡터
또한, 본원에 기재된 바와 같이 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공된다. 본원에서 사용되는 벡터는 유전 물질을 세포 내로 운반하기에 적합한 비히클이다. 벡터는 플라스미드 또는 mRNA와 같은 네이키드(naked) 핵산, 또는 리포솜 또는 바이러스 벡터와 같은 더 큰 구조에 내장된 핵산을 포함한다.
벡터는 일반적으로 하나 이상의 적절한 프로모터(들), 인핸서(들), 터미네이터(들) 등과 같은 하나 이상의 조절 요소에 임의로 연결된 적어도 하나의 핵산을 포함한다. 벡터는 바람직하게는 발현 벡터, 즉 적합한 조건 하에서, 예를 들어, 벡터가 (예를 들어, 인간) 세포에 도입되는 경우, 암호화된 폴리펩티드 또는 구성체를 발현하기에 적합한 벡터이다. DNA 기반 벡터의 경우, 이는 일반적으로 전사(예를 들어, 프로모터 및 폴리A 신호) 및 번역(예를 들어, Kozak 서열)을 위한 요소의 존재를 포함한다.
바람직하게는, 벡터에서, 상기 적어도 하나의 핵산 및 상기 조절 요소는 서로 "작동 가능하게 연결"되어 있으며, 이는 일반적으로 이들이 서로 기능적 관계에 있음을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 암호화 서열의 전사 및/또는 발현을 개시 또는 다르게는 제어/조절할 수 있는 경우 상기 프로모터는 암호화 서열에 "작동 가능하게 연결"된 것으로 간주된다(상기 암호화 서열은 상기 프로모터의 "제어 하"에 있다고 이해되어야 한다). 일반적으로, 2개의 뉴클레오티드 서열이 작동 가능하게 연결되어 있을 때, 이들은 동일한 방향으로 있을 것이고 일반적으로 동일한 해독 프레임에도 있을 것이다. 이들은 또한 일반적으로 본질적으로 연속적일 것이지만, 이는 필요하지 않을 수도 있다.
바람직하게는, 벡터의 임의의 조절 요소는 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 의도된 생물학적 기능을 제공할 수 있도록 하는 것이다.
예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 터미네이터는 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 "작동 가능"해야 하며, 이는 예를 들어 상기 프로모터가 작동 가능하게 연결되는 뉴클레오티드 서열 - 예를 들어, 암호화 서열 -의 전사 및/또는 발현을 개시 또는 다르게는 제어/조절할 수 있어야 함을 의미한다.
5.7 조성물
본 기술은 또한 본원에 기재된 바와 같이 적어도 하나의 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같이 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자 또는 이러한 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 또는 부형제 및/또는 보조제를 추가로 포함할 수 있고, 임의로 하나 이상의 추가의 약학적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함할 수 있다.
5.8 숙주 유기체
본 기술은 또한 본원에 기재된 바와 같이 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같이 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 및/또는 본원에 기재된 바와 같이 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에 관한 것이다.
적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 당업자에게 명백하고, 예를 들어 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 세포 또는 세포주 또는 임의의 적합한 진균, 원핵, 또는 진핵 유기체이다. 특정 예에는 HEK293 세포, CHO 세포, 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)가 포함된다. 가장 바람직한 숙주는 피치아 파스토리스이다.
5.9 방법 및 폴리펩티드의 용도
본 기술은 또한 본원에 기재된 바와 같이 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공한다. 방법은 숙주 세포 또는 숙주 유기체를 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로 형질전환/형질감염시키는 단계, 숙주에서 폴리펩티드를 발현시키는 단계(이어서 임의로 하나 이상의 단리 및/또는 정제 단계)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 방법은 다음을 포함할 수 있다:
a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 발현시키는 단계; 이어서 임의로,
b) 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계.
생성 목적에 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 세포 또는 세포주 또는 임의의 적합한 진균, 원핵, 또는 진핵 유기체일 수 있다. 특정 예에는 HEK293 세포, CHO 세포, 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)가 포함된다. 가장 바람직한 숙주는 피치아 파스토리스이다.
기재된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 벡터, 또는 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 벡터를 포함하는 조성물 - 바람직하게는 폴리펩티드 또는 이를 포함하는 조성물 -은 의약으로서 유용하다.
따라서, 본 기술은 의약으로서 사용하기 위한, 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 벡터, 또는 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 암의 치료에 사용하기 위한, 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 벡터, 또는 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다.
암을 치료하는 방법이 추가로 제공되며, 상기 방법은 기재된 바와 같은 약학적 활성량의 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 벡터, 또는 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 벡터를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
의약의 제조에 있어서의, 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 벡터, 또는 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 벡터를 포함하는 조성물의 용도가 추가로 제공된다.
바람직하게는 암을 치료하기 위한, 약학적 조성물의 제조에서 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 벡터, 또는 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 벡터를 포함하는 조성물의 용도가 제공된다.
암은 임의의 유형의 GPC3 발현 암일 수 있다. 암은 바람직하게는 간암 또는 폐암, 바람직하게는 간암이다. 간암은 바람직하게는 간세포 암종이다. 폐암은 바람직하게는 비소세포 폐암(NSCLC), 가장 바람직하게는 편평 세포 암종(SCC)이다.
바람직하게는, GPC3 발현 암 세포는 GPC3 단백질 양의 (평균적으로) 적어도 절반, 바람직하게는 Huh7 세포와 (평균적으로) 적어도 동일한 양의 GPC3 단백질을 발현한다. Huh7 세포는 예를 들어 수탁 번호 JCRB0403로 JCRB Cell Bank, Health and Nutrition, National Institutes of Biomedical Innovation을 통해 공개적으로 이용가능하다.
발현된 GPC3는 바람직하게는 세포 표면에 노출된 GPC3을 의미한다. 세포 상의 (세포 표면에 노출된) GPC3의 발현(및 이의 양)은 유세포 분석, 면역조직화학, 또는 실시예에 기재된 바와 같은 당업계에 일반적으로 알려진 통상의 방법을 통해 용이하게 확인할 수 있다.
본 기술의 맥락에서 언급되는 "대상체"는 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물일 수 있다. 포유동물 중에서 인간과 비인간 포유동물 사이에 구별이 이루어질 수 있다. 비인간 동물은 예를 들어 반려 동물(예를 들어, 개, 고양이), 가축(예를 들어, 소, 말, 양, 염소, 또는 돼지), 또는 연구 목적 및/또는 항체 생성을 위해 일반적으로 사용되는 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 염소, 양, 말, 돼지, 시노몰구스 원숭이와 같은 비인간 영장류 또는 라마 또는 알파카와 같은 낙타과)일 수 있다.
예방 및/또는 치료 목적의 맥락에서, 대상체는 임의의 동물, 더욱 구체적으로 임의의 포유동물일 수 있지만, 바람직하게는 인간 대상체이다.
물질(폴리펩티드, 핵산 분자, 및 벡터 포함) 또는 조성물은 임의의 적합한 투여 경로, 예를 들어 소화관 내(예를 들어, 경구 또는 직장) 또는 비경구(예를 들어, 피부, 설하, 협측, 비강, 관절 내, 피내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 경피, 또는 경점막) 투여에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 근육 내, 피하, 또는 피내와 같은 비경구 투여가 바람직하다. 가장 바람직한 것은 피하 투여이다.
유효량의 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 벡터, 또는 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 벡터를 포함하는 조성물은 의도된 치료 결과를 제공하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다.
1회 이상의 용량이 투여될 수 있다. 1회 초과의 용량이 투여되는 경우, 용량은 폴리펩티드, 조성물, 핵산 분자, 또는 벡터의 효과를 최대화하기 위해 적절한 간격으로 투여될 수 있다.
[표 A-1]
[표 A-2]
[표 A-2-1]
[표 A-3]
[표 A-4]
[표 A-5]
[표 A-6]
[표 A-7]
[표 A-8]
6 실시예
6.1 실시예 1: GPC3에 특이적으로 결합하는 ISVD의 발견
2마리의 라마와 1마리의 알파카를 인간 글리피칸-3 이소형 2 전구체 [NP_004475; 580AA; 호모 사피엔스]을 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 이중 유전자 벡터로 면역시켰다. 후에, 동물을 재조합 인간 글리피칸-3(R&D Systems, cat nr. 2119-GP)로 부스팅하였다.
최종 면역원 주입 후, 혈액 샘플을 수집하고 제조사의 지침(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, US)에 따라 Ficoll-Hypaque를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 준비하고 총 RNA를 추출하여 보관하였다.
총 RNA를 ISVD 암호화 유전자 단편을 증폭하기 위한 RT-PCR의 출발 물질로서 사용하였다. 이들 단편을 파지미드 벡터 pAX212에 클로닝하였다. 파지는 표준 프로토콜(Antibody Phage Display: Methods and Protocols(First Edition, 2002, O'Brian and Aitken eds., Humana Press, Totowa, NJ)에 따라 준비하고, 추가 사용 시까지 4℃에서 필터 멸균 후 보관하였다. 각각의 면역화된 동물로부터 파지 라이브러리를 구성하여, 라이브러리를 3x108, 6x108, 및 8x108 cfu의 크기로 산출하였다.
재조합 단백질을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 프로빙하였다. 간략하게, 파지 입자를 50 nM에서(2% Marvel 및 0.05% Tween 20이 보충된 PBS에서) 비오티닐화된 항원(인간 GPC3 R&D Systems, cat nr. 2119-GP; 시노 GPC3 DGPI DHS-HIS, 자체 생산(수탁 번호 P51654; Q3-R358; S359-H559, S495A, S509A); 모두 표준 프로토콜을 사용하여 비오티닐화됨)에 50 nM(2% Marvel 및 0.05% Tween 20이 보충된 PBS에서))에 첨가하였다. 비오티닐화된 항원을 스트렙타비딘 또는 항비오틴 코팅된 자기 비드(Invitrogen) 상에 포획하였다. 결합되지 않은 파지를 세척하여 제거하였다(0.05% Tween 20이 보충된 PBS 사용); 결합된 파지는 트립신(PBS 중 1 mg/mL)을 첨가하여 용출시켰다. 용출된 파지는 기하급수적으로 성장하는 E. coli TG-1 세포를 감염시켜 후속 선택 라운드(도우미 파지로 구조한 후) 및/또는 한천 플레이트에 플레이팅한 후 개별 클론의 스크리닝을 위해 사용토록 하였다. 이를 위해 개별 콜로니를 0.5 mL 배지를 함유하는 96 딥 웰 플레이트에 집어넣고 밤새 성장시켰다. 각 클론의 하룻밤 배양액 80 μL를 2xTY에서 40 μL의 60% 글리세롤과 혼합하고 -80℃에서 보관하였다.
ISVD의 소규모 생성을 위해 96 딥 웰 플레이트(1 mL 부피)에 밤새 배양액을 접종하였다. IPTG를 1 mM의 최종 농도로 첨가하여 ISVD 발현을 유도하였다. 세포 펠렛을 동결하고 100 μl PBS에 용해시켜 주변세포질 추출물을 준비하였다. 원심분리에 의해 세포 파편을 제거하였다.
인간 및 시노 GPC3에 대한 결합에 대해 ELISA에서 주변세포질 추출물을 스크리닝하였다. 384 웰 고 결합 SpectraPlates(PerkinElmer, 6007509)를 1 μg/mL의 단백질(PBS 중)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 이어서 플레이트를 RT에서 적어도 1시간 동안 차단하였다(PBS, 1% 카제인). 주변세포질 추출물의 1:10 희석액(PBS 중, 0.1% 카제인, 0.05% Tween 20)을 RT에서 1시간 동안 첨가하였다. 결합되지 않은 주변세포질 추출물을 세척하여 제거하고(0.05% Tween 20이 보충된 PBS) 결합된 ISVD를 마우스 항-FLAG-HRP(Sigma-Aldrich, cat nr A8592) 및 기질 esTMB (3,3',5,5'-테트라멘틸벤지딘; SDT)의 존재 하에 후속 효소 반응을 사용하여 검출하였다.
ELISA에서 양성 히트는 DNA 시퀀싱이었고, 인간 및 시노 GPC3에 대한 해리율뿐만 아니라 인간 및 시노 GPC3를 발현하는 세포에 대한 결합에 대해 비중복 클론을 추가로 분석하였다.
ISVD의 해리율은 ProteOn XPR36 기기(Bio-Rad Laboratories, Inc.)로 확인하였다. ProteOn GLC 센서 칩을 시노 글리피칸-3 ΔGPI-HIS(자체 생산, 수탁 번호 P51654, Q3-R358, S359-H559) 및 인간 GPC3(R&D Systems, cat nr. 2119-GP)로 코팅하였다. 주변세포질 추출물을 ProteOn PBS Tween 완충제(PBS, pH 7.4, 0.005% Tween 20(167-2720, BioRad))에서 1:10으로 희석하였다. 25℃에서 실험을 수행하였다. 수득한 데이터를 참조 레인 감산 및 블랭크 완충제 주입 감산으로 이중 참조하였다. 처리된 곡선을 Langmuir 해리(해리율 분석) 모델을 기반으로 하는 해리율 분석에 사용하였다.
인간 GPC3(수탁 번호 P51654; Q25-R358, S359-H580) 또는 시노 GPC3(수탁 번호 P51654, Q3-R358, S359-H559)을 각각 발현하는 CHO Flp-In 세포(Invitrogen cat nr. K6010)를 사용하여 유세포분석에서 인간 및 시노 GPC3 결합에 대해 주변세포질 추출물을 스크리닝하였다. 요컨대, 1 × 105 세포를 1:5 희석된 주변세포질 추출물에서 30분 동안 4℃에서 인큐베이션한 후 3회 세척하였다. 대조군으로, 모 CHO Flp-In 세포주(Invitrogen cat nr. K6010)를 포함시켰다. 이어서, 세포를 1 μg/mL 단일클론 항-FLAG® M2 항체(Sigma-Aldrich, cat nr F1804)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 다시 세척하고, 염소 항-마우스 PE 표지된 항체(1:100; Jackson Immunoresearch, cat nr. 115-115-164)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 세척하고 5 nM TOPRO3(Molecular Probes, cat nr T3605)이 보충된 FACS 완충제(10% FBS(Sigma) 및 0.05% 아지드화나트륨(Merck)을 포함하는 D-PBS(Gibco))에 재현탁시켰다. 이어서, 세포 현탁액을 FACS Array에서 분석하였다. 정방향/측면 산란 및 TOPRO3 채널 형광 파라미터를 사용하여 살아있는 온전한 세포에 게이팅을 설정하였다. 비결합 ISVD를 포함하는 대조 조건에 대해 얻은 값보다 높은 평균 PE 채널 형광 값은 히트를 나타낸다.
해리율 분석 및 인간 및 시노 GPC3-발현 CHO 세포에 대한 결합(표 2)에 근거하여 2개의 ISVD를 선택하였다(표 1).
[표 1]
[표 2]
6.2 실시예 2: 삼중특이적 GPC3 ISVD 기반 T세포 관여자의 생성
선택된 항-GPC3 ISVD(표 1의 서열)을 N-말단에서 TCR(T0170056G05, 항-TCR)의 불변 도메인에 결합하는 고정된 T세포 관여자 ISVD 및 C-말단에 고정된 알부민 결합 ISVD(ALBX00001)가 포함된 삼중특이적 구성체로 포맷하였다. 구성체의 빌딩 블록은 유연한 35GS(GlySer 링커)에 의해 유전적으로 연결되어 항-TCR-35GS-항-GPC3-35GS-ALBX00001 형태가 생성된다(표 3). 아미노산 서열은 표 A-6에 제시되어 있다.
다가 ISVD는 피치아 파스토리스로 발현되었다. 관심 ISVD 구성체를 함유하는 P. 파스토리스 NRRL Y-11430 세포를 BGCM 배지에서 성장시켰다. 이어서, 배지를 BMCM으로 전환하고 구성체를 추가로 성장시키고 메탄올을 단계적으로 첨가하여 유도하였다. 세포를 회전 침강시키고 상청액(분비된 ISVD 함유)을 수집하였다.
다가 ISVD를 단백질 A 수지에서 정제한 후 탈염 단계 및 필요한 경우 D-PBS에서 분취 SEC를 수행하였다.
[표 3]
6.3 실시예 3: 삼중특이적 GPC3 ISVD T세포 관여자의 T세포 의존적 세포독성
항-GPC3 ISVD(표 3)를 포함하는 삼중특이적 T세포 관여자는 T세포 의존적 세포독성 분석(TDC)에서 특성화되었다. GPC3 발현이 높은 간암 세포주인 HepG2(ATCC, 클론 HB8065)를 Nuclight Green(Essen Bioscience, cat no. 4624)으로 표지하여, A0226015A08 또는 A0226018C08(즉, 각각 A022600031 또는 A022600027 구성체)을 포함하는 삼중특이적 T세포 관여자 구성체의 존재 하에 또는 항-TCR-35GS-항-GPC3-35GS-HLE(HLE = 반감기 연장제) 형태의 기준 GPC3 결합 단일 도메인 항체(Ab1)가 포함된 구성체의 존재 하에 T세포 사멸의 표적으로 사용하였다. 이를 위해 플레이트(96 웰 F-bottom, Greiner, cat no 655180)를 200 μL/웰 분석 배지(2시간, 37℃)로 미리 차단하였다. 각 분석 구성요소를 총 부피 200 μL/웰로 동시에 첨가하였다: (1) 50 μL의 희석/적정 화합물(Nbs; Brefeldin A(Sigma-Aldrich, cat no B7651); (2) 25 μL의 희석 HSA(Sigma-Aldrich, cat no A8763-10G)(최종 농도: 30 μM); (3) 25 μL의 희석 Cytotox Red(Essen Bioscience, cat no 4632)(최종 농도: 250 nM); (4) 15:1 비율의, RosetteSep T세포 강화 칵테일(StemCell, cat no. 15061)을 사용한 50 μL의 인간 T세포(T세포는 버피 코트(적십자)에서 단리됨) 및 50 μL의 HepG2 Nuclight green(신선한 DNEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate, Life Technologies-Gibco, cat no 31966). 총 72시간 동안 4시간 또는 6시간 간격으로 3개 채널(위상차, 녹색 및 적색) 모두에서 판독을 위해 플레이트를 IncuCyte ZOOM에 배치하였다.
시험된 삼중특이적 GPC3 T세포 관여자는 도 1에 나타낸 바와 같이 용량 의존적 방식으로 HepG2 Nuclight green의 인간 T세포 매개 사멸을 유도하였다. IC50 값 및 최대 사멸 백분율이 표 4에 제공되어 있다.
[표 4]
6.4 실시예 4: GPC3 바인더의 에피토프 비닝
항-GPC3 ISVD의 에피토프 비닝을, 1가 ISVD A0226015A08 또는 A0226018C08의 주변세포질 추출물이 정제된 삼중특이적 형태의 ISVD와 경쟁할 수 있도록, 유세포분석을 통해 수행하였다. 이를 위해, 4 × 104 인간 GPC3 CHO Flp-In 세포(기준, 실시예 1 참조)를 주변세포질 추출물의 1/15 및 1/150 희석액, 150 nM 경쟁자(삼중특이적 ISVD 형태; 과포화 농도) 및 0.2 μg/mL의 단일클론 항-FLAG® M2 항체(Sigma-Aldrich, cat nr F1804) 및 래트 항-마우스 APC(BD-Pharmingen, cat no 550874)와 함께 RT 및 300 rpm에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. iQue Screener에서 샘플을 판독하였다. A0226015A08과 A0226018C08 사이에는 경쟁이 관찰되지 않았으며, 이는 서로 다른 비중복 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다.
6.5 실시예 5: GPC3 ISVD T세포 관여자에 대한 형태 최적화
표 3에 기술된 형태의 GPC3 ISVD T세포 관여자는 T세포 의존적 세포독성(TDC) HepG2 Nuclight green 분석에서 최대 사멸 백분율이 가리키는 바와 같이 완전한 효능에 도달하지 않는다(실시예 3). 효력 및 효능을 증진시키기 위해, 항-GPC3 ISVD가 N-말단의 항-TCR ISVD T0170056G05의 서열 최적화 변이체, 즉 T017000624, C-말단의 알부민 결합 ISVD, ALB23002-A(C-말단 단일 알라닌 연장을 갖는 서열번호 5), 및 구성체의 중앙 위치에 있는 GPC3 결합 ISVD(들)과 결합된 삼중특이적 구성체를 생성하였다(표 5 및 6). 최적화에는 다음의 두 단계가 포함된다: 1단계 - 항-TCR ISVD와 항-GPC3 ISVD간의 링커 길이 최적화(삼중특이적 3가 형태); 2단계 - 이중파라토프 GPC3 ISVD T세포 관여자(삼중특이적 4가 형태) 생성 및 2개의 GPC3 결합 ISVD간의 링커 길이 최적화. 아미노산 서열은 표 A-6에 제공되어 있다.
생성된 형태는 실시예 3에 기술된 바와 같이 TDC HepG2 Nuclight green 분석에서 테스트하였다. 단계 1 및 단계 2 형태에 대한 분석은 각각 시딩 72시간 후 또는 시딩 60시간 후에 수행하였다.
표 5 및 6은 각각 TDC HepG2 Nuclight green 분석에서 형태 최적화의 1단계 및 2단계에서 서로 다른 형태에 대한 IC50 값 및 최대 사멸 %을 보여준다.
1단계에서 삼중특이적 GPC3 ISVD T세포 관여자는 항-TCR ISVD와 항-GPC3 ISVD간의 링커 길이가 72%(35GS 링커) 내지 94%(AAA 링커) 감소함과 함께 효능이 증가된 세포 종양 사멸(최대 사멸 증가)을 나타냈다(도 2). 2단계에서, A0226018C08 및 A0226015A08이 동일한 구성체에 결합되고 두 빌딩 블록 사이에 서로 다른 링커 길이를 갖고 서로 다른 배향으로 위치한, GPC3 이중파라토프 T세포 관여자를 테스트하였다. 이 경우, 효능에 대한 테스트 변수의 영향은 관찰되지 않았다(도 3).
[표 5]
[표 6]
높은 수준의 HepG2와 비교하여 중간 수준의 GPC3을 발현하는 간암 세포주를 사멸시키는 능력을 평가하기 위해 TDC Huh7 분석을 수행하였다. 이를 위해 xCELLigence®(Acea) 시스템을 사용하였다. 먼저, 4x 농도(120 μM)의 Alburex 20 인간 혈청 알부민(CSL Behring, Cat no 2160-979)(최종 분석 농도 30 μM)이 포함된 50 μL의 분석 배지를 함유하는 96 웰 E-플레이트(Acea, Cat no 5232368001)를 백그라운드 측정을 위해 xCELLigence® 내부에 배치하였다. 백그라운드 측정 후 각 분석 구성요소를 총 부피 200μL/웰로 동시에 첨가하였다. (1) 50 μL의 희석/적정 화합물; (2) Huh7(HSRRB, 클론 JCRB0403)의 단일 세포 현탁액 50 μL; (3) 이펙터:표적 비율이 15:1이 되도록 이펙터 세포(인간 T세포, 실시예 3에 기술된 바와 같이 수득함)의 단일 현탁액 50 μL. 플레이트를 15분 간격으로 400회 스윕하여 xCELLigence®에 넣었다. 적절한 시점(약 60 h)에서 세포 지수(CI)를 분석하였으며, CI 0은 100% 사멸을 나타낸다.
GPC3 T세포 관여자 형태 최적화의 3단계에서, 항-TCR ISVD T017000624는, 3가 및 4가 형태에서, 시퀀싱된 최적화 변이체 T017000680(TCE01, 서열번호 2)으로 치환되었다. 상기 기재된 바와 같이 HepG2 및 Huh7 TDC 분석에서 효력 및 효능을 평가하였다. 형태, 종류, 및 기능성은 표 7에 요약되어 있다. 데이터는 도 4에 나와 있다. 형태 최적화의 3단계는 구성체 전체에서 효능이 약간 더 증가하는 결과를 가져왔다. 이 단계로부터 GPC3 T세포 관여자 형태 A022600167 및 A022600168이 발생되었다.
GPC3 T세포 관여자 형태 최적화의 4단계는 항-TCR ISVD의 배향을 항-GPC3 ISVD로 변경하는 것으로 구성되었으나 이는 효능에 대한 효력에 영향을 미쳤다(표 8, 도 5). 3가 형태의 경우 사멸 효능이 상실되었다. 4가 형태의 경우 효력 및 효능 감소와 함께 기능성이 여전히 관찰되었다; 사멸 효능은 HepG2 Nuclight green에서 20%, Huh7에서 40% 감소하였다. 또한, 항-GPC3 ISVD의 항-알부민 ISVD로의 배향 변경도 사멸 효능에 영향을 미쳤다. 이 단계에서 GPC3 T세포 관여자 형태 A022600167 및 A022600168에 대한 변경이 없었다.
GPC3 T세포 관여자 형태 최적화의 5단계는 링커 길이를 변경하는 것으로 구성되었다(표 9, 도 6). 3가 형태의 항알부민 ISVD 전에 링커 길이를 줄이면 효능이 감소하였다. 이는 4가 형태에서는 볼 수 없으므로, 이 경우 9GS와 35GS 링커 길이 중에서 선택할 수 있다.
GPC3 T세포 관여자 형태 A022600167 및 A022600168 세트는 TDC 분석에서 가장 높은 효력 및 효능을 갖는 삼중특이적 3가 및 4가 형태를 나타낸다. 효능은 유사하나 3가 형태 A022600167과 4가 형태 A022600168은 효력이 다르다. HepG2 TDC 분석에서 A022600167은 A022600168보다 5배 효력이 떨어지지만 Huh7 TDC 분석에서는 그 차이가 50배로 증가한다.
[표 7]
[표 8]
[표 9]
6.6 실시예 6: 가용성 GPC3 존재 하의 T세포 활성화 유도 평가
GPC3는 가용성 형태로 순환계로 방출될 수 있으며 HCC 환자의 최대 50%에서 수준이 증가한다. 순환계의 가용성 GPC3 항체 응집체는 면역 복합체 침착 및 관련 독성을 유발할 수 있다. 따라서, GPC3 T세포 관여자의 존재 하에 가용성 GPC3의 T세포 활성화에 대한 효과를 평가하는 것이 중요하다.
GPC3의 보고된 혈청 수준은 10 내지 300 ng/mL 사이에서 다양할 수 있으며, 이는 0.1 내지 10 nM에 해당한다. 삼중특이적 GPC3 ISVD T세포 관여자 A022600167 및 168의 존재 하에 1, 10, 및 100 nM의 가용성 GPC3를 사용하여 다음과 같은 세 가지 방식으로 평가를 수행하였다: (1) 표적 세포(Huh-7) 및 가용성 GPC3 존재 하의 세포독성(도 7의 A): 가용성 GPC3가 부재한 경우와 비교하여 추가적인 사멸이 관찰되지 않았음; (2) 표적 세포 및 가용성 GPC3의 존재 하에 CD69 상향조절(도 7의 B): 가용성 GPC3가 부재한 경우와 비교하여 추가적인 T세포 활성화가 관찰되지 않았음; (3) 표적 세포의 부재 및 가용성 GPC3의 존재 하의 CD69 상향조절(도 7의 C): T세포 활성화가 관찰되지 않았음. 따라서 가용성 GPC3의 혈청 수준 증가로 인한 독성 영향의 위험은 낮은 것으로 간주된다.
Huh-7에 대한 세포독성 분석은 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행하였다. T세포 상의 CD69 발현은 항-CD69 항체(BD Pharmigen, cat no. 557050) 및 항-마우스 IgG1 항체(BD Pharmigen, cat no. 556650)를 사용하여 유세포분석으로 확인하였다.
6.7 실시예 7: GPC3 매개 T세포 관여자 내재화
GPC3는 내재화하는 것으로 알려져 있으며 내재화율은 화합물의 효능에 영향을 미칠 수 있다. A022600167 및 A022600168에 상응하는 삼중특이적 GPC3 ISVD T세포 관여자 및 기준 CD3-GPC3 이중특이적 T세포 관여자 항체(Ab2)(표 10)의 존재 하에 내재화율 및 GPC3 수용체 밀도를 48시간 동안 Huh-7 세포에서 평가하였다.
내재화는 A022600167 및 A022600168 및 Ab2를 pH 7 초과에서 낮은 형광성을 갖는 pH 센서 염료인 pHAb(Promega, cat no. G9841)로 표지하고 용액의 pH가 산성이 될 때 형광성이 강하게 증가하는 것으로 확인하였다. 이 표지화의 경우, 표지의 단일 부위 통합을 위해 C-말단에 추가 -GGC가 있는 형태를 생성하였다(표 10):. A022600167-GGC는 A022600370에 해당하고, A022600168-GGC는 A022600372에 해당하며, 대조군으로서 GPC3 ISVD가 없는 형태인 A022600373을 생성하였다. 분석은 황색 레이저(pHAb: 532 nm에서 최대 여기, 560 nm에서 최대 방출)로 BD FACSArray에서 판독하였다. 내재화율은 0.5시간에서 4℃와 비교하여 서로 다른 시점(0.5시간, 3시간, 24시간, 및 48시간)에서 37℃에서의 내재화를 정량화하여 확인하였다(표 10, 도 8의 A).
수용체 발현은 적색 레이저로 BD FACSArray에서 검출을 위해 APC 표지된 항-FLAG와 조합하여 A02260018C08 및 A02260015A08과 다른 GPC3 에피토프에 결합하는 3xFLAG-His6-태그 ISVD(20 nM)의 고정 농도를 사용하여 확인하였다(표 10, 도 8의 B).
내재화율은 임의의 단위로 동역학 곡선의 기울기로 계산하였다. 삼중특이적 GPC3 ISVD T세포 관여자는 기준 이중특이적 T세포 관여자 Ab2보다 느린 내재화율 나타낸다. GPC3 ISVD T세포 관여자의 내재화는 GPC3 결합 ISVD(A022600373)가 내재화를 나타내지 않는 대조군 형태로서 GPC3 매개이다. 48시간 이내에 GPC3 세포 표면 발현의 감소는 관찰되지 않았다(표 10, 도 8).
[표 10]
6.8 실시예 8: 암 세포주의 GPC3 발현 프로파일링 및 GPC3 T세포 관여자의 기능성과의 상관관계
암 세포주의 패널에 대한 GPC3 단백질 발현 수준은 제조사의 지침에 따라 면역세포화학(ICC) 및 QIFIKIT®(Dako, Cat no K0078)을 사용하여 확인하였다(표 11). 또한, 간세포 암종 및 정상 신장 샘플에 대해 면역조직화학(IHC)을 수행하였다.
ICC 및 IHC는 Ventana discovery XT 로봇(Ventana medical system, Roche)을 사용하여 수행하였다. 세포주 및 조직 샘플을 먼저 4% 포르말린에 고정한 후 파라핀으로 포매하였다. 탈파라핀화 후, 세포를 48분 동안 95℃에서 완충제 CC1 표준(Ventana, Cat no 950-124)으로 컨디셔닝한 후, 각각의 Blocker A 및 B(Ventana, Cat no 760-104)로 4분의 차단 단계를 수행하였다. 마우스 단일클론성 IgG2a 항-GPC3 항체(Ventana, Cat no 790-4564)를 실온에서 60분 동안 적용한 후, 5 M NaCl(Prolabo, Cat no 20879-238) 중 0.05% 글루타르알데히드로 4분 동안 고정시켰다. 항체 희석제(Ventana; Cat no 760-108)에 1/200 희석된 비오티닐화된 염소 항-마우스 IgG2a 항체(Southern Biotech, Cat no 1080-080)를 실온에서 32분 동안 적용하였다. 검출은 DABMap Kit(Ventana; Cat no 760-124)로 수행하였다. 절편을 헤마톡실린 II(Ventana, Cat no 790-2208)로 4분 동안 대조염색하고 블루잉제(Ventana, Cat no 760-2037)로 4분 동안 사후 대조염색한 후 탈수하고 Cytoseal XYL(Richard-Allan Scientific, Cat no 8312-4)로 마운팅하였다. 면역조직화학적 염색은 세포의 염색 강도(0: 염색 없음, 1(또는 +): 약함, 2(또는 ++): 보통; 3(또는 +++ ): 강함) 및 모든 강도 범주에서 양성 세포의 백분율 모두의 반정량적 평가로 평가하였다. Histoscore(H-점수)는 다음의 공식에 따라 계산하였다:
H-점수 = 3 x (3등급의 세포 %) + 2 x (2등급의 세포 %) + 1 x (1등급의 세포 %).
가능한 점수의 범위는 문헌[Detre et al., J Clin Pathol 1995; 48:876-878 및 Lui et al., Journal of Latex Class filed, 2015 8월, vol 14, No.8]에 기재된 바와 같이 0 내지 300이었다. HCC에서 H-점수의 측정은 GPC3의 막 발현 평가를 기반으로 하였다.
QIFIKIT®로 측정한 바와 같은, 테스트된 세포주 패널 내에서 Hep-G2(ATCC, 클론 HB-8065; 5.2E5 수용체/세포)가 가장 높은 수준의 GPC3 발현을 나타냈고 NCI-H661(ATCC, 클론 HTB-183; 3.4E5 수용체/세포) 및 Huh-7(HSRRB, 클론 JCRB0403; 6.8E4 수용체/세포)가 그 뒤를 이었고, 후자는 배지 발현 세포주로 간주된다. 이들 세포주는 관련 GPC3 발현 고형 종양인 간암 및 폐암에서 기원하였다. ICC에서 어떠한 염색도 나타내지 않은 낮거나 매우 낮은 GPC3 발현 세포주는 MKN-45(DSMZ, 클론 ACC409; 1.5E4 수용체/세포), NCI-H23(ATCC, 클론 CRL-5800; 2.6E3 수용체 /세포), BxPC-3(ATCC, 클론 CRL-1687; 1.5E3 수용체/세포), 및 NCI-H292(ATCC, 클론 CRL-1848; 6E2 수용체/세포)였다.
암 세포주와 환자 종양 샘플 간의 비교를 위해 H-점수를 두 가지 모두에 대해 측정하였다. ICC에서 GPC3 양성 암 세포주, 즉 Huh-7, NCI-H661, 및 HepG2는 80,75(표 12)의 IHC에서 GPC3 양성 간세포 암종(HCC) 샘플에 대해 측정된 평균 H-점수에 상응하는 80(표 11)보다 우수한 H-점수를 나타냈다. 정상 신장 GPC3 양성 샘플은 0,75(표 12)의 평균 H-점수를 나타내는 반면 암 세포주 MKN-45, NCI-H23, BxPC-3, 및 NCI-H292는 GPC3 염색에 대해 음성이었다(표 11). 이러한 세포주는 GPC3 정상 유사 발현 수준 세포의 대표자로 간주되었다.
삼중특이적 GPC3 T세포 관여자의 기능성을 동일한 암 세포주 패널로 평가하기 위해, 실시예 5에 기재된 바와 같이 xCELLigence 시스템을 사용하여 TDC 분석을 수행하였다; 결과는 표 13 및 도 9에 나와 있다. GPC3 고발현 세포주인 Hep-G2 및 NCI-H661의 경우, 삼중특이적 GPC3 ISVD T세포 관여자 A022600167 및 A022600168은 이중특이적 T세포 관여자 Ab2와 비교하여 비슷한 효력(NCI-H661) 및 10배 낮은 효력(Hep-G2)을 나타낸다. 배지 발현 세포주, Huh-7, A022600168의 경우, GPC3에 대한 이중파라토프 결합을 갖는 4가 형태는 Ab2와 동일한 효력을 나타내는 반면, 3가 형태 A022600167의 효력은 10배 낮다. GPC3 저발현 세포주인 MKN-45 및 BxPC-3의 경우, Ab2는 nM 범위의 효력을 나타내는 반면, 삼중특이적 GPC3 ISVD T세포 관여자는 사멸 효과를 나타내지 않는다. 매우 낮은 GPC3 발현 세포주인 NCI-H292의 경우, 어떤 화합물도 효과를 나타내지 않는다. GPC3 결합 ISVD(T017000698)가 결여된 T세포 관여자는 임의의 세포주에 대해 어떠한 사멸 효과도 나타내지 않아 삼중특이적 GPC3 T세포 관여자의 GPC3 특이적 효과를 확인시켜 준다.
결론적으로 Ab2는 GPC3 발현 수준이 세포당 1000개 정도로 낮고 H-점수가 0인 암 세포주를 사멸시킬 수 있는 강력한 T세포 관여자이다. 이에 비해 삼중특이적 T세포 관여자 형태는 H-점수가 HCC 및 대세포 폐암 샘플과 유사한 높은 및 중간 수준의 GPC3 발현 암 세포주를 강력하게 사멸시키는 한편 세포당 10,000개 미만의 수용체 GPC3 수준을 발현하고 정상 신장 샘플의 평균보다 낮은 H-점수를 갖는 세포주를 유지한다.
[표 11]
[표 12]
[표 13]
6.9 실시예 9: A0226015A08 및 A0226018C08의 서열 최적화
ISVD A0226015A08 및 A0226018C08은 추가로 서열 최적화되었다.
서열 최적화는 ISVD의 하나 이상의 (목적하는) 특성을 개선하기 위해 서열에서 하나 이상의 특정 아미노산 잔기를 대체하는 것을 포함한다.
이러한 서열 최적화의 일부 예는 본원의 추가 설명에 언급되어 있으며, 예를 들어 제한 없이 다음을 포함한다:
1) 인간 VH3-JH 생식계열 컨센서스 서열과 더 동일한 ISVD 서열을 생성하기 위한 부모 야생형 ISVD 서열의 치환, 인간화라고 하는 과정. 이를 위해, ISVD와 인간 VH3-JH 생식계열 컨센서스 간에 상이한 FR에서 소위 홀마크 잔기를 제외하고는 특정 아미노산이 단백질 구조, 활성, 및 안정성이 그대로 유지되는 방식으로 인간 대응물로 변경된다.
2) 낙타화로 정의되는, ISVD의 안정성을 높이기 위한 라마 생식계열로의 치환. 이를 위해, 부모 야생형 ISVD 아미노산 서열은 ISVD의 라마 IGHV 생식계열 아미노산 서열에 정렬된다(라마 IGHV 생식계열에 대한 ISVD의 BlastP 분석에서 최고 히트로 확인됨).
3) 장기 안정성 또는 저장 시 특성을 개선하는 치환, 목적하는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 발현 수준을 증가시키는 치환, 및/또는 다시 목적하는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에 따라 다른, (목적하지 않는) 번역 후 변형(들)(예컨대 글리코실화 또는 인산화)을 제거하거나 감소시키는 치환.
4) 위치 11에서 Val에 대한 돌연변이 및 위치 89에서 Leu에 대한 돌연변이(Kabat에 따름)를 통해 임의의 자연 발생 기존 항체의 결합을 최소화한다.
A0226015A08의 서열 최적화로 최종 서열 최적화 변이체 A022600314를 생성하였고, 이는 모 ISVD 클론 A0226015A08과 비교하여 13개의 아미노산 치환(즉, L11V, A14P, V23A, P40A, D52cE, N54Y, D73N, K76N, D79Y, K83R, G88A, V89L, F91Y)(표 14)을 포함한다.
A0226018C08의 서열 최적화로 2개의 서열 최적화 변이체 A022600345를 생성하였고, 이는 모 ISVD 클론 A0226018C08과 비교하여 8개의 아미노산 치환(L11V, V23A, G54A, R60A, E81Q, T82aN, N83R, V89L), 및 8개의 아미노산 치환(L11V, V23A, G54K, R60A, E81Q, T82aN, N83R, V89L)(표 14)을 포함하는 A022600351을 포함한다.
[표 14]
모 ISVD와 비교하여 서열 최적화 변이체의 특성을 다음과 같이 평가하였다:
변이체는 실시예 1에 기술된 바와 같이 유세포분석에 의해 HepG2, Huh-7, 및 CHO Flip-In 시노-GPC3 세포에 대한 결합에 대해 평가하였다.
변이체의 열 안정성은 Lightcycler(Roche)를 사용하는 열 이동 분석(TSA)에서 테스트하였다. 이 분석에서, 모 ISVD 및 이의 변이체는 SYPROTM 오렌지의 존재 하에 다양한 pH에서 인큐베이션되고 온도 구배가 적용된다. ISVD가 변성되기 시작하면 SYPROTM 오렌지가 결합하여 형광이 증가하여 특정 pH에 대한 용융 온도(Tm)를 측정할 수 있다.
결과는 표 15 및 표 16에 요약되어 있다.
[표 15]
[표 16]
모 ISVD A0226015A08과 비교하여, A022600314는 인간 GPC3 또는 시노 GPC3를 발현하는 상이한 세포주에 대해 2배 미만의 결합 효력 감소를 나타냈다. Tm은 허용가능한 값 내에서 5℃까지 약간 감소하였다. A022600314에 대한, 기준 hIGHV3-23SO/IGHJ4와 비교한 프레임워크 영역의 프레임워크 동일성 %은 AbM 정의에 근거하면 88.8%이고(문헌[Antibody Engineering, Vol2 by Kontermann & Duebel (Eds), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010] 참조), Kabat 정의에 근거하면 85.1%이다.
모 ISVD A0226018C08과 비교하여, 인간 GPC3 또는 시노 GPC3을 발현하는 상이한 세포주에 대한 변이체 A022600345 및 A022600351의 결합 효력은 2배 증가하였다. 변이체 A022600345 및 A022600351의 Tm은 각각 75℃ 및 74℃로 증가하였다. A022600345 및 A022600351 둘 모두에 대한, 기준 hIGHV3-23SO/IGHJ4와 비교한 프레임워크 영역의 프레임워크 동일성 %은 AbM 정의에 근거하면 89.9%이고 Kabat 정의에 근거하면 89.7%이다.
6.10 실시예 10: 삼중특이적 서열 최적화 GPC3 ISVD T세포 관여자의 생성
서열 최적화 GPC3 ISVD A022600314(A0226015A08의 최적화 변이체), A022600345 ,및 A022600351(A0226018C08의 최적화 변이체)은 표 17에 기술된 바와 같이 빌딩 블록 및 링커 길이의 최적 조합을 평가하기 위한 5개의 삼중특이적 GPC3 T세포 관여자 형태의 생성에 사용된다.
[표 17]
5개의 선택된 형태를 실시예 8에 기술된 바와 같이 기능성에 대해 상이한 암 세포주를 사용하여 xCELLingence 기반 TDC 분석에서 테스트하였다. 결과는 표 18에 나와 있다. 높은 및 중간 GPC3 발현 세포주 HepG2, NCI-H661, 및 Huh-7의 경우, 3가 형태와 비교하여 4가 형태에서 더 높은 효력을 얻었다. 높은 GPC3 발현 세포주 NCI-H661의 경우, 4가 형태 A022600424 및 A022600427이 A022600425 및 A022600426보다 더 효력이 높다. GPC3 저발현 세포주인 NCI-H23 및 BxPC-3의 경우, 모든 삼중특이적 GPC3 ISVD T세포 관여자 형태에 대해 사멸 효과의 결여가 확인되었다.
도 10은 5개의 선택된 ISVD 형태에 대해 3개의 다른 T세포 공여체를 사용하여 세포주 NCI-H661 및 BxPC-3로 예시된, xCELLingence 기반 TDC 분석에 대한 용량 의존적 사멸 곡선을 나타낸 것이다.
[표 18]
5개의 선택된 형태에 대한 기존 항체의 결합을 SPR 기반 설정을 사용하여 평가하였다(실시예 14). 도 11은 모든 형태에 대해 낮은 수준의 기존 항체 결합만 관찰되었으며, 개발가능성 요건과 양립할 수 있음을 보여준다.
피치아 파스토리스의 성능은 5 L 발효기 규모에서 업스트림 처리(USP) 동안 제품 역가 및 순도뿐만 아니라 다운스트림 처리(DSP) 후 수율에 초점을 맞춰 5가지 형태에 대해 평가하였다(표 19). A022600424 및 A022600426은 낮은 비율의 고분자량(HMW) 종, 역가가 높고 전체 DSP 수율이 가장 좋은 RPC에 대한 낮은 비율의 변이체를 결합한 바람직한 ISVD 개발 후보로 확인되었다.
[표 19]
GPC3 기반 사멸 효력, 기존 항체에 대한 감소된 결합, 및 피치아에서의 성능의 최상의 조합을 기반으로 A022600424가 개발 후보로 선택되었다.
6.11 실시예 11: GPC3, TCRab, 및 혈청 알부민에 대한 A022600424의 결합 및 친화도
인간 및 시노 GPC3(R&D Systems, cat no 2119-GP 및 자체 생산(각각 수탁 번호 P51654, Q3-R358, S359-H559)), 인간 및 시노 TCRab(둘 다 자체 생산, 알파 및 베타 사슬 세포외 도메인은 이량체화를 위해 지퍼 펩티에 융합됨; 수탁 번호: 인간 알파 사슬 P01848, 인간 베타 사슬 P01850; 시노 알파 사슬의 예상 서열은 인간과 동일함, 시노 베타 사슬의 예상 서열은 4aa: A125V, E136V, V167M, S177F에서 상이함), 시노 및 마우스 혈청 알부민(각각 Sigma cat no A8763, 동물 조직에서 자체 생산, DivBioScience cat no IMSA)에 대한 A022600424의 평형 해리 상수(KD)로 표시되는 친화도는 ProteOn XPR36을 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 정량화하였다.
재조합 GPC3 단백질을 EDC 및 NHS 화학(실행 완충제: HBS-EP+, pH 7.4)을 사용하여 아민 커플링을 통해 THE 항-His 항체(Genscript, cat no ABIN387699)로 고정된 GLC 센서 칩(Biorad)에 포획하였다. 정제된 ISVD를 다양한 농도(0.3 nM ~ 1000 nM)로 2분 동안(유량 45 μL/분) 주입하고 900초 동안 해리하였다. 1분 동안 10 mM 글리신-HCl(pH 1.5)을 주입하여 재생을 수행하였다(유량 45 μL/분). 기준 리간드 레인 및 블랭크 완충제 주입을 제하여 데이터를 이중 참조하였다. 처리된 센서그램은 ProteOn Manager 3.1.0(Version 3.1.0.6) 소프트웨어를 사용하여 1:1 상호작용 모델(Langmuir binding model)로 분석하였다.
재조합 TCR 단백질을 EDC 및 NHS 화학(실행 완충제: HBS-EP+, pH 7.4)을 사용하여 아민 커플링을 통해 GLC 센서 칩(Biorad)에 고정화하였다. 정제된 ISVD를 다양한 농도(0.2 nM~200 nM)로 2분 동안(유량 45 μL/분) 주입하고 900초 동안 해리하였다. 3분 동안 3 M MgCl2를 주입하여 재생을 수행하였다(유량 90 μL/분). 기준 리간드 레인 및 블랭크 완충제 주입을 제하여 데이터를 이중 참조하였다. 처리된 센서그램은 ProteOn Manager 3.1.0(Version 3.1.0.6) 소프트웨어를 사용하여 1:1 상호작용 모델(Langmuir binding model)로 분석하였다.
혈청 알부민 단백질을 EDC 및 NHS 화학(실행 완충제: HBS-EP+, pH 7.4)을 사용하여 아민 커플링을 통해 GLC 센서 칩(Biorad)에 고정화하였다. 정제된 ISVD를 다양한 농도(0.24 nM ~ 500 nM)로 2분 동안(유량 45 μL/분) 주입하고 900초 동안 해리하였다. 47초 동안 10 mM 글리신-HCl(pH 1.5)을 주입하여 재생을 수행하였다(유량 100 μL/분). 기준 리간드 레인 및 블랭크 완충제 주입을 제하여 데이터를 이중 참조하였다. 처리된 센서그램은 ProteOn Manager 3.1.0(Version 3.1.0.6) 소프트웨어를 사용하여 1:1 상호작용 모델(Langmuir binding model)로 분석하였다.
결과(표 20)는 A022600424가 높은 친화도로 인간 및 시노 GPC3에 결합함을 입증한다.
[표 20]
세포 발현된 인간 및 시노 GPC3에 대한 A022600424의 결합은 인간 및 시노 GPC3을 과발현하는 CHO-Flp-In 세포 뿐만 아니라 Huh-7 세포에 대해 유세포분석으로 평가하였고, 1~2 nM의 EC50 값을 산출하였다(표 21).
A022600424를 EC30 농도에서 각각 TCRab 결합 1가 ISVD T017000624 및 T017000623(T0170056G05 변이체)과 경쟁하는 인간 및 시노 T세포에 대한 결합에 대해 평가하였다. T세포(실시예 3에 기술된 바와 같이 수득한 인간 T세포 및 독일 LPT 연구실에서 구입한 시노 T세포)를 분석 당일에 해동하고 계수하고 1E+06 세포/mL의 농도로 희석한 후 V-bottom 96 웰 플레이트(Greiner, cat no 651180)의 웰에 75 μL를 첨가하였다. 세포를 차가운 FACS 완충제로 1회 세척한 후 25 μL Nb 및 25 μL 경쟁자를 웰에 첨가하였다. T017000624는 4E-08 M(웰 중 2E-08 M)의 2배 농도로 희석하였고, T017000623은 1E-07 M(웰 중 5E-08 M)의 2배 농도로 희석하였고, A022600424는 8 μM~7.8 nM 범위의 웰에서 최종 농도로 희석하였다. 세포를 재현탁시키고 플레이트를 4℃에서 90분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 차가운 FACS 완충제에서 2회 세척하였다. 세포를 FACS 완충제 중 50 μL 1/1000 희석된 Monoclonal ANTI-FLAG® M2(Sigma Aldrich, cat no F1804)에서 재현탁하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 차가운 FACS 완충제로 두 번 세척하였다. 세포를 FACS 완충제 중 50 μL 1/100 희석된 알로피코시아닌 접합 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(서브클래스 1+2a+2b+3), Fc Fragment Specific(Jackson Immunoresearch, cat no 115-135-164)에서 재현탁하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 차가운 FACS 완충제로 두 번 세척하였다. 세포를 FACS 완충제 중 55 μL 1/1000 희석된 Propidium Iodide(Sigma-Aldrich, cat no P4170)에서 재현탁한 후 MACSQuant X(Miltenyi biotec)에서 데이터를 수집하였다.
결과는 표 21에 나타나 있다. A022600424는 인간 및 시노 T세포 모두에 약 200 nM 친화도로 결합한다.
[표 21]
시노 T세포로 A022600424 기능성을 평가하기 위해, 실시예 8에 기술된 바와 같이 Huh-7에 대한 xCELLigence 기반 TDC 분석을 시노 T세포(LPT 연구실, 독일)를 사용하여 수행하였다. 시노 및 인간 T세포에 대한 IC50 값은 유사한 것으로 밝혀졌다(표 22).
[표 22]
6.12 실시예 12: GPC3에 대한 결합에 대한 A022600424의 선택성
GPC3의 패밀리 구성원, 즉 GPC1, GPC2, GPC5, 및 GPC6에 결합하는 A022600424의 부재를 ELISA로 평가하고 GPC4에 대한 결합을 SPR(Proteon XPR36)로 평가하였다.
인간 GPC1(R&D 시스템, cat no 4519-GP), 인간 GPC2(R&D 시스템, cat no 2304-GP), 인간 GPC3(R&D 시스템, cat no 2119-GP), 인간 클리피칸-5(R&D 시스템, cat no 2607 -G5), 및 인간 글리피칸-6(R&D 시스템, cat no 2845-GP)를 384 웰 HB SpectraPlate(PerkinElmer) 상에서 4℃(2 μg/mL, 1xPBS 완충제)에서 밤새 직접 코팅하였다. 다음날 플레이트를 6회 세척하고(AquaMax 마이크로플레이트 세척기, 분자 장치) 실온에서 2시간 동안 1xPBS + 1% 카제인으로 차단하였다. 추가의 6회 세척 단계 후 A022600424(1xPBS, 0.1% 카제인, 0.05% TWEEN 20)를 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 제거한 후 6회 세척 단계를 거쳐 항-ISVD mAb ABH0077을 실온에서 1시간 동안 17 nM 최종 농도(1xPBS, 0.1% 카제인, 0.05% TWEEN 20)로 첨가하였다. 플레이트를 다시 6회 세척하고 HRP(Abcam, cat no ab97040)(1/1250 희석; 1xPBS, 0.1% 카제인, 0.05% TWEEN 20)에 접합된 염소 항-마우스 IgG 다클론 항체를 실온에서 1시간 동안 플레이트에 적용하였다. 6회의 최종 세척 단계 후에 es(HS)TMB 기질(SDT)을 첨가하고 10분 후에 1 M HCl을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 플레이트의 흡광도를 Clariostar 장비(BMG LABTECH)로 파장 450 및 620 nm에서 측정하였고 데이터 분석을 위해 OD450-OD620을 계산하고 플롯팅하였다.
재조합 인간 GPC4/hFc(R&D Systems, cat no 9195-GP)를 EDC 및 NHS 화학(사용된 실행 완충제: HBS-EP+, pH7.4)를 사용하여, 아민 커플링을 통해 마우스 항-인간 IgG1(GE Healthcare, cat no BR-1008-39)로 고정된 GLC 센서 칩(Biorad)에 포획하였다. 정제된 ISVD를 다양한 농도(4 nM ~ 1000 nM)로 2분 동안(유량 45 μL/분) 주입하고 900초 동안 해리하였다. 1분 동안 10 mM 글리신-HCl(pH 1.5)을 주입하여 재생을 수행하였다(유량 45 μL/분). 기준 리간드 레인 및 블랭크 완충제 주입을 제하여 데이터를 이중 참조하였다. 처리된 센서그램은 ProteOn Manager 3.1.0(Version 3.1.0.6) 소프트웨어를 사용하여 1:1 상호작용 모델(Langmuir binding model)로 분석하였다.
테스트한 GPC3 패밀리 구성원에 대한 A022600424의 결합이 검출되지 않았다.
6.13 실시예 13: A022600424에 대한 인간 기존 항체의 반응성
A022600424의 기존 항체의 결합은 ProteOn XPR36(Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 사용하여 정상 인간 혈청(n=96)에서 평가하였다. PBS/Tween(인산염 완충 식염수, pH 7.4, 0.005% Tween20)을 실행 완충제로 사용하고, 실험을 25℃에서 수행하였다.
A022600424는 칩에 고정된 HSA에 ALB23002 빌딩 블록을 결합하여 센서 칩에 포획하였다. HSA를 고정화하기 위해, ProteOn GLC 센서 칩의 리간드 레인을 EDC/NHS(유량 30 μl/분)로 활성화하고 HSA를 ProteOn 아세테이트 완충제 pH 4.5에 100 μl/ml로 주입하여 대략 2900 RU의 고정화 수준을 제공하였다. 고정화 후, 표면을 에탄올아민 HCl(유량 30 μΙ/분)로 비활성화시켰다.
이어서, A022600424를 HSA 표면에 45 μl/분으로 2분 동안 주입하여 ISVD 포획 수준이 대략 800 RU가 되도록 하였다. 기존 항체를 함유하는 샘플을 14,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고 상청액을 PBS-Tween20(0.005%)에서 1:10으로 희석한 후, 45 μΙ/분으로 2분 동안 주입하고, 이어서 후속 400초의 해리 단계를 수행하였다. 각 주기 후(즉, 새로운 ISVD 포획 및 혈액 샘플 주입 단계 전), HSA 표면은 45 μl/분에서 HCI(100 mM)의 2분 주입으로 재생되었다. 기존 항체 결합을 나타내는 센서그램은 1) ISVD-HSA 해리 및 2) 기준 리간드 레인에 대한 비특이적 결합을 제하여 이중 참조 후 얻었다. 기존 항체의 결합 수준을, 보고 지점을 125초(회합 종료 후 5초)로 설정하여 측정하였다. 기존 항체 결합의 감소율을 기준 ISVD의 125초에서의 결합 수준에 대해 계산하였다.
항-TCR 빌딩 블록에 대한 돌연변이 L11V 및 V89A, 각 GPC3 및 혈청 알부민 결합 빌딩 블록 및 C-말단 알라닌에서의 돌연변이 L11V 및 V89L의 도입으로, 감소된 기존 항체 결합에 대해 최적화된 4가 ISVD 형태 A022600424는 대조군 비최적화 4가 ISVD 형태 F027301099와 비교하여 기존 항체에 대해 실질적으로 더 적은 결합을 나타낸다(도 11의 A).
6.14 실시예 14: 가용성 GPC3의 존재 하에 A022600424에 의한 T세포 활성화 유도의 평가
가용성 GPC3의 존재 하에 A022600424에 의한 T세포 활성화 유도를 실시예 6에 기재된 바와 같이 평가하였다. A022600424는 야생형 변이체 A022600168과 동일한 거동을 나타냈다(도 7).
6.15 실시예 15: 시험관내 증식된 T세포가 이식된 Huh-7 종양이 있는 NOG 마우스에서의 A022600424에 대한 생체내 개념 증명
종양이 있는 NOG 마우스에서의 생체내 효능 연구에서, 간세포 암종 Huh-7 종양 세포를 피하 주사하고 종양의 평균 종양 부피가 약 150 mm3에 도달할 때까지 성장하도록 하였다. 이 시점에서, 시험관내 확장된 T세포를 마우스에 복강내 주사하였다. T세포의 ISVD-매개 모집에 의한 종양 세포 사멸은 종양 부피를 측정하고 종양 성장 동역학을 분석하여 평가하였다. 종양 세포 사멸에 대한 A022600424의 생체내 효능을 평가하고 GPC3 특이성이 결여된 대조군 T세포 관여자 T017000698(서열번호 74, 표 A-6)과 비교하였다.
구체적으로, 100 μL의 HBSS에 재현탁된 2x106 Huh-7 종양 세포를 NOG 마우스에 피하 주사하였다. 종양을 약 150 mm3의 평균 종양 부피에 도달할 때까지 성장시켰다. 이 시점에서, 200 μL의 PBS에 재현탁된 107개의 시험관내 확장된 T세포를 각 마우스에 복강내(D0) 주사하였다. 이러한 T세포 주입은 마우스를 다른 군으로 무작위배정하고 24시간 후에 수행하였다. A022600424를 정맥 주사한 치료는 T세포 주입 3시간 후인 D0에 시작하여 D3, D6, D9, 및 D12에 계속되었다(q3d; 도 12). 4가지 용량 수준의 TCR/GPC3 결합 폴리펩티드를 테스트하였다(0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.7 mg/kg, 및 2 mg/kg). D0, D3, D6, D9, 및 D12(q3d)에 T017000698을 대조군에 2 mg/kg으로 주사하였다. 항체 노출을 측정하기 위해 헤파린 함유 튜브에서 생존 혈액 샘플링을 D6 및 D12에 수행하였다. 마우스를 D15에 희생시키고, 혈액 및 종양 조직을 수집하였다. 혈액을 항체 노출 측정에 사용하고 종양 조직을 표적 발현(GPC3) 분석 및 T세포 침윤 분석에 사용하였다.
종양 성장 동역학에 대한 결과는 도 13에 나와 있다. T017000698로 처리된 마우스는 모든 대조군 마우스가 평가변수 기준(2000 mm3 종양 부피)에 도달하지 않아 살아 있는, D24의 분석을 위한 대조군으로 사용하였다. A022600424 대 대조군 T017000698에 대한 종양 성장 프로파일에서 종양 정체 유도를 위한 용량 반응 패턴이 관찰되었다. A022600424에 대한 0.7 mg/kg(**, p = 0.0016) 및 2 mg/kg(*, p = 0.0415) 용량 수준은 대조군 T017000698과 유의하게 상이하였다. 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg 용량은 종양 성장 제어에 더 낮은 효과를 보였고 대조군과 크게 다르지 않았다. 분석을 위해 Dunnett의 다중 비교 테스트를 사용하여 일원 분산분석으로 통계 분석을 수행하였다.
결론적으로, 결과는 A022600424가 이 모델에서 용량 의존적으로, 통계적으로 유의한 종양 정체를 유도할 수 있음을 입증한다. 이는 T세포를 Huh-7 종양 세포 상의 GPC3에 가교 결합함으로써 GPC3 ISVD T세포 관여자를 통한 폴리펩티드-유도 T세포-매개 사멸의 개념을 확인시켜준다.
폴리펩티드, 이를 암호화하는 핵산 분자, 핵산을 포함하는 벡터 및 본원에 기재된 조성물은 예를 들어 암을 앓고 있는 대상체의 치료에 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Ablynx NV Sanofi <120> POLYPEPTIDES COMPRISING IMMUNOGLOBULIN SINGLE VARIABLE DOMAINS TARGETING GLYPICAN-3 AND T CELL RECEPTOR <130> 242233 <150> EP20306633.7 <151> 2020-12-21 <150> US63/127,224 <151> 2020-12-18 <160> 185 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 498 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A022600424 <400> 1 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Val His Lys Ile Asn 20 25 30 Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val 35 40 45 Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys Arg 85 90 95 Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala Met Thr Trp Val Arg 145 150 155 160 Arg Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Thr Asn Lys 165 170 175 Gly Val Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 180 185 190 Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 195 200 205 Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Ile Cys Ala Asn Ala Arg Arg Thr Gly 210 215 220 Pro Arg Ala Pro Thr Asp Ile Gly Ser Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val 245 250 255 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 260 265 270 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Arg Ser Val Phe Ser 275 280 285 Ser Ser Thr Met Glu Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Arg Glu 290 295 300 Leu Val Ala Arg Ile Ala Pro Gly Glu Gly Thr Tyr Tyr Gly Ala Leu 305 310 315 320 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 325 330 335 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu 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35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 111 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 111 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 112 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 112 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 113 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 113 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 1 5 10 15 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 20 <210> 114 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 114 Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 115 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 115 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 20 25 30 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 35 40 45 Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 50 55 60 <210> 116 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 116 Val Thr Val Ser Ser 1 5 <210> 117 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 117 Val Lys Val Ser Ser 1 5 <210> 118 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 118 Val Gln Val Ser Ser 1 5 <210> 119 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 119 Val Thr Val Lys Ser 1 5 <210> 120 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 120 Val Thr Val Gln Ser 1 5 <210> 121 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 121 Val Lys Val Lys Ser 1 5 <210> 122 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 122 Val Lys Val Gln Ser 1 5 <210> 123 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 123 Val Gln Val Lys Ser 1 5 <210> 124 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 124 Val Gln Val Gln Ser 1 5 <210> 125 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 125 Val Thr Val Ser Ser Ala 1 5 <210> 126 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 126 Val Lys Val Ser Ser Ala 1 5 <210> 127 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 127 Val Gln Val Ser Ser Ala 1 5 <210> 128 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 128 Val Thr Val Lys Ser Ala 1 5 <210> 129 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 129 Val Thr Val Gln Ser Ala 1 5 <210> 130 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 130 Val Lys Val Lys Ser Ala 1 5 <210> 131 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 131 Val Lys Val Gln Ser Ala 1 5 <210> 132 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 132 Val Gln Val Lys Ser Ala 1 5 <210> 133 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 133 Val Gln Val Gln Ser Ala 1 5 <210> 134 <211> 580 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human GPC3 (P51654) <400> 134 Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp 20 25 30 Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly 35 40 45 Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val 50 55 60 Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys 65 70 75 80 Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala 85 90 95 Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln 100 105 110 Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala 115 120 125 Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe 130 135 140 Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp 145 150 155 160 Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro 165 170 175 Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu 180 185 190 Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe 195 200 205 Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln 210 215 220 Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile 225 230 235 240 Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu 245 250 255 Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys 260 265 270 Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly 275 280 285 Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu 290 295 300 Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu 305 310 315 320 Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys 325 330 335 Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser 340 345 350 Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile 355 360 365 Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu 370 375 380 Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser 385 390 395 400 Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala 405 410 415 Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr 420 425 430 Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His 435 440 445 Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp 450 455 460 Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys 465 470 475 480 Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly 485 490 495 Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly 500 505 510 Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr 515 520 525 Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro 530 535 540 Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser 545 550 555 560 Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe 565 570 575 Phe Leu Val His 580 <210> 135 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human TCR alpha constant domain (derived from P01848) <400> 135 Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 1 5 10 15 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 20 25 30 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 35 40 45 Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 50 55 60 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 65 70 75 80 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys 85 90 95 <210> 136 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human TCR beta constant domain (derived from P01850) <400> 136 Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 1 5 10 15 Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 20 25 30 Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 35 40 45 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys 50 55 60 Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu 65 70 75 80 Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 85 90 95 Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp 100 105 110 Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 115 120 125 Ala Asp Cys 130 <210> 137 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 137 Lys Glu Arg Glu 1 <210> 138 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 138 Lys Gln Arg Glu 1 <210> 139 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 139 Gly Leu Glu Trp 1 <210> 140 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 140 Lys Glu Arg Glu Leu 1 5 <210> 141 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 141 Lys Glu Arg Glu Phe 1 5 <210> 142 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 142 Lys Gln Arg Glu Leu 1 5 <210> 143 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 143 Lys Gln Arg Glu Phe 1 5 <210> 144 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 144 Lys Glu Arg Glu Gly 1 5 <210> 145 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 145 Lys Gln Arg Glu Trp 1 5 <210> 146 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 146 Lys Gln Arg Glu Gly 1 5 <210> 147 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 147 Thr Glu Arg Glu 1 <210> 148 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 148 Thr Glu Arg Glu Leu 1 5 <210> 149 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 149 Thr Gln Arg Glu 1 <210> 150 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 150 Thr Gln Arg Glu Leu 1 5 <210> 151 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 151 Lys Glu Cys Glu 1 <210> 152 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 152 Lys Glu Cys Glu Leu 1 5 <210> 153 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 153 Lys Glu Cys Glu Arg 1 5 <210> 154 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 154 Lys Gln Cys Glu 1 <210> 155 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 155 Lys Gln Cys Glu Leu 1 5 <210> 156 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 156 Arg Glu Arg Glu 1 <210> 157 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 157 Arg Glu Arg Glu Gly 1 5 <210> 158 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 158 Arg Gln Arg Glu 1 <210> 159 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 159 Arg Gln Arg Glu Leu 1 5 <210> 160 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 160 Arg Gln Arg Glu Phe 1 5 <210> 161 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 161 Arg Gln Arg Glu Trp 1 5 <210> 162 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 162 Gln Glu Arg Glu 1 <210> 163 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 163 Gln Glu Arg Glu Gly 1 5 <210> 164 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 164 Gln Gln Arg Glu 1 <210> 165 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 165 Gln Gln Arg Glu Trp 1 5 <210> 166 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 166 Gln Gln Arg Glu Leu 1 5 <210> 167 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 167 Gln Gln Arg Glu Phe 1 5 <210> 168 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 168 Lys Gly Arg Glu 1 <210> 169 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 169 Lys Gly Arg Glu Gly 1 5 <210> 170 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 170 Lys Asp Arg Glu 1 <210> 171 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 171 Lys Asp Arg Glu Val 1 5 <210> 172 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 172 Asp Glu Cys Lys Leu 1 5 <210> 173 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 173 Asn Val Cys Glu Leu 1 5 <210> 174 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 174 Gly Val Glu Trp 1 <210> 175 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 175 Glu Pro Glu Trp 1 <210> 176 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 176 Gly Leu Glu Arg 1 <210> 177 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 177 Asp Gln Glu Trp 1 <210> 178 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 178 Asp Leu Glu Trp 1 <210> 179 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 179 Gly Ile Glu Trp 1 <210> 180 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 180 Glu Leu Glu Trp 1 <210> 181 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 181 Gly Pro Glu Trp 1 <210> 182 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 182 Glu Trp Leu Pro 1 <210> 183 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 183 Gly Pro Glu Arg 1 <210> 184 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 184 Gly Leu Glu Arg 1 <210> 185 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif from Table A-0 <400> 185 Glu Leu Glu Trp 1

Claims (45)

  1. 적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드로서, 상기 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 적어도 3개의 ISVD는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 임의로 연결되며,
    a) 제1 ISVD는 T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하고,
    i. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    ii. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    iii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하고,
    b) 제2 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고,
    iv. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    v. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    vi. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하고,
    c) 제3 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고,
    vii. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    viii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    ix. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하고,
    ISVD의 순서는 상기 폴리펩티드의 N-말단에서 C-말단까지 고려되는 서로에 대한 이들의 상대적 위치를 나타내고, 제1 ISVD는 임의로 상기 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는, 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    a) 상기 제1 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
    b) 상기 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
    c) 상기 제3 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a) 상기 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고;
    b) 상기 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고;
    c) 상기 제3 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내는, 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 상기 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지고;
    b) 상기 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고;
    c) 상기 제3 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는, 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 ISVD 및 제2 ISVD는 10개 미만의 아미노산, 바람직하게는 6개 미만의 아미노산으로 이루어진 링커를 통해 서로 연결되고, 링커는 가장 바람직하게는 5GS 링커인, 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 임의로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공하는, 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서, 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위는 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 소형 단백질 또는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 결합 단위는 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)에 결합할 수 있는 결합 단위로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공하는 상기 결합 단위는 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD인, 폴리펩티드.
  10. 제9항에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는
    i. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    ii. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    iii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하는, 폴리펩티드.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩티드.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 5와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내는, 폴리펩티드.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는, 폴리펩티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 폴리펩티드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 폴리펩티드.
  16. GPC3에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드로서, 상기 ISVD는 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 적어도 하나의 ISVD는
    a) 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3, 또는
    b) 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하는, 폴리펩티드.
  17. 제16항에 있어서, 적어도 하나의 ISVD는
    a) 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3; 또는
    b) 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하는, 폴리펩티드.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 적어도 하나의 ISVD의 아미노산 서열은
    a) 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    b) 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하거나 이로 이루어지는, 폴리펩티드.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 ISVD는
    a) 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는
    b) 서열번호 4의 아미노산 서열
    을 포함하거나 이로 이루어지는, 폴리펩티드.
  20. 적어도 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드로서, 상기 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 적어도 2개의 ISVD는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 임의로 연결되며,
    a) 제1 및 제2 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고,
    i. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    ii. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    iii. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하거나,
    b) 제1 및 제2 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고,
    i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    iii. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하거나,
    c) 제1 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고,
    i. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    ii. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    iii. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하고,
    제2 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고,
    iv. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    v. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    vi. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하거나,
    d) 제1 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고,
    i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    iii. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하고,
    제2 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고,
    iv. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    v. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    vi. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하거나,
    e) 제1 ISVD는 T세포 상의 T세포 수용체(TCR)의 불변 도메인에 특이적으로 결합하고,
    i. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    ii. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    iii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하고,
    제2 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고,
    iv. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    v. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    vi. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하거나,
    f) 제1 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고,
    i. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    ii. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    iii. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하고,
    제2 ISVD는 T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하고,
    iv. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    v. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    vi. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하거나,
    g) 제1 ISVD는 T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하고,
    i. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    ii. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    iii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하고,
    제2 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고,
    iv. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    v. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    vi. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하거나, 또는
    h) 제1 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고,
    i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    iii. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하고,
    제2 ISVD는 T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하고,
    iv. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    v. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    vi. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하고,
    ISVD의 순서는 상기 폴리펩티드의 N-말단에서 C-말단까지 고려되는 서로에 대한 이들의 상대적 위치를 나타내는, 폴리펩티드.
  21. 제20항에 있어서,
    a) 제1 및 제2 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고, 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
    b) 제1 및 제2 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고, 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
    c) 제1 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고, 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고, 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
    d) 제1 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고, 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고, 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
    e) 제1 ISVD는 T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하고, 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고, 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
    f) 제1 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고, 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하고, 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
    g) 제1 ISVD는 T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하고, 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고, 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나, 또는
    h) 제1 ISVD는 GPC3에 특이적으로 결합하고, 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하고, 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩티드.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    a) GPC3에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내거나,
    b) GPC3에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내거나,
    c) GPC3에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, GPC3에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내거나,
    d) GPC3에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, GPC3에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내거나,
    e) T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, GPC3에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내거나,
    f) GPC3에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내거나,
    g) T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, GPC3에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내거나, 또는
    h) GPC3에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내고, T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내는, 폴리펩티드.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) GPC3에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지거나,
    b) GPC3에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지거나,
    c) GPC3에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, GPC3에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지거나,
    d) GPC3에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, GPC3에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지거나,
    e) T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지고, GPC3에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지거나,
    f) GPC3에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지거나,
    g) T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지고, GPC3에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는
    h) GPC3에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, T세포 상의 TCR의 불변 도메인에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는, 폴리펩티드.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1, 49 내지 72, 및 78 내지 81로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 폴리펩티드.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 임의로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공하는, 폴리펩티드.
  26. 제25항에 있어서, 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티, 또는 결합 단위는 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 소형 단백질 또는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 결합 단위는 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)에 결합할 수 있는 결합 단위로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
  28. 제27항에 있어서, 반감기가 증가된 폴리펩티드를 제공하는 상기 결합 단위는 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD인, 폴리펩티드.
  29. 제28항에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는
    i. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
    ii. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
    iii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3
    을 포함하는, 폴리펩티드.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩티드.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 5와 90% 초과의 서열 동일성을 나타내는, 폴리펩티드.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는, 폴리펩티드.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  34. 제33항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포.
  35. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 적어도
    a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 또는 다른 적합한 발현 시스템에서 제33항에 따른 핵산을 발현시키는 단계; 이어서 임의로
    b) 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함하는 방법.
  36. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드, 또는 제33항에 따른 핵산을 포함하는 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제, 및/또는 보조제를 추가로 포함하고, 하나 이상의 추가의 약학적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 화합물을 임의로 포함하는 약학적 조성물인 조성물.
  38. 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 제36항 또는 제37항에 따른 조성물.
  39. 암, 바람직하게는 간암 또는 폐암의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 제36항 또는 제37항에 따른 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 간암은 간세포 암종인, 폴리펩티드 또는 조성물.
  41. 암, 바람직하게는 간암 또는 폐암을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 제36항 또는 제37항에 따른 조성물의 약학적 활성량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 간암은 간세포 암종인, 방법.
  43. 의약의 제조에 있어서, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 제36항 또는 제37항에 따른 조성물의 용도.
  44. 암, 바람직하게는 간암 또는 폐암을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조에 있어서, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제1항 내지 제15항에 따른 폴리펩티드, 또는 제36항 또는 제37항에 따른 조성물의 용도.
  45. 제44항에 있어서, 간암은 간세포 암종인, 폴리펩티드 또는 조성물의 용도.
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