TW202415678A - 靶向ｔ細胞受體的免疫球蛋白單可變結構域 - Google Patents
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Abstract
本發明技術提供了結合T細胞上的人T細胞受體（TCR）的恒定結構域和T細胞上的非人靈長類動物TCR的恒定結構域兩者的免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）。本發明技術還涉及包含根據本發明技術的ISVD和至少一種能夠結合靶細胞上的抗原的ISVD的多肽。本發明技術進一步提供了編碼所述ISVD或多肽的核酸，以及載體、宿主和產生這些ISVD或多肽的方法。此外，本發明技術涉及使用本發明技術的ISVD或多肽進行治療的方法。
Description
本發明技術提供了結合T細胞上的人T細胞受體（TCR）的恒定結構域和T細胞上的非人靈長類動物TCR的恒定結構域兩者的免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）。本發明技術還涉及包含根據本發明技術的ISVD和至少一種能夠結合靶細胞上的抗原的ISVD的多特異性多肽。本發明技術進一步提供了編碼所述ISVD或多肽的核酸，以及載體、宿主和產生這些ISVD或多肽的方法。此外，本發明技術涉及使用根據本發明技術的ISVD或多肽進行治療的方法。
癌症在世界各地造成了相當多的人類死亡。現在它是全球性死亡的第二個首要原因，僅位於心臟病和中風之後。癌症是全世界的發病和死亡的首要原因之一，在2020年有大約1930萬新病例和1000萬癌症相關死亡。新病例的數量預計將在未來幾十年進一步上升。人口增長、老齡化和生活方式的變化被描述為是漸增的癌症負擔的促成因素。在2013年，WHO預測，到2030年，癌症將超過缺血性心臟病並且成為全世界最常見的死亡原因（來源：WHO Cancer）。
全世界源於癌症的過早死亡和殘疾的總經濟影響在2008年已約為9000億美元，占當時世界國內生產總值的1.5%。隨著癌症越來越常見，總的經濟影響肯定也會顯著增加。用於實體瘤的可用治療方案典型地包括手術切除、化學療法和放射療法的組合。在40年的臨床經驗中取得了很少的進展，尤其是在癌症的晚期。亟待對抗癌症的新療法。
抗體療法現在是醫生對抗疾病且尤其是癌症的重要部分。已經建立了單株抗體作為一系列疾病的關鍵治療性方法，已有幾年之久。大多數同期批准的抗體療法依賴於單特異性單株抗體（mAb）。直到今天，mAb的大多數標靶都需要激動方法或拮抗方法。雖然靶向細胞表面抗原本身可以藉由誘導細胞凋亡來介導抗腫瘤活性，但針對血液惡性腫瘤的大多數基於mAb的活性依賴於Fc介導的效應子功能，諸如補體依賴性細胞毒性（CDC）和抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）。
最近，免疫療法已成為一種迅速增長的癌症研究領域。免疫療法是將身體的免疫監測系統並且特別是T細胞定向至癌細胞。
細胞毒性T細胞（CTL）是殺傷癌細胞、感染（特別是病毒感染）的細胞或以其他方式受損的細胞的T淋巴細胞。T淋巴細胞（也稱為T細胞）在細胞表面上表現T細胞受體（TCR）和CD3受體。αβTCR-CD3複合物（或「TCR複合物」）由六種不同的I型單跨膜蛋白構成：形成負責配體識別的TCR異二聚體的TCRα和TCRβ鏈，以及帶有胞質序列基序的非共價締合的CD3γ、CD3δ、CD3ε和ζ鏈，所述胞質序列基序在受體活化時發生酪胺酸磷酸化並募集大量信號傳導組分（Call等人 2004, Molecular Immunology 40: 1295-1305）。
異二聚T細胞受體（TCR）的α鏈和β鏈兩者都是由恒定結構域和可變結構域組成。T細胞在由自身MHC分子呈遞的同源肽的TCR識別時被活化，伴隨由酪胺酸磷酸化的CD3複合物活化的信號轉導，從而導致T細胞增殖和分化。
與引發特異性T細胞反應（依賴於癌細胞對MHC分子的表現以及特定肽抗原的存在、產生、運輸和展示）不同，最近的開發嘗試藉由經由基於重組抗體的技術以多株方式接合患者的所有T細胞，而將免疫療法的優勢與抗體療法結合起來。雙特異性抗體已經被工程化，其在一個臂（標靶結合臂）上具有腫瘤識別部分，而分子的另一個臂具有對T細胞抗原的特異性（效應子結合臂），所謂的T細胞接合器（TCE），其通常靶向CD3。這些雙特異性抗體是增強患者對惡性細胞的免疫反應的多重靶向分子。雙特異性抗體與T細胞和腫瘤細胞的共接合導致所述T細胞與所述腫瘤細胞之間溶細胞性突觸的形成，所述溶細胞性突觸誘導T細胞活化並且導致腫瘤細胞殺傷。
儘管大多數活化T細胞的雙特異性抗體靶向T細胞上的CD3複合物，但是一些靶向αβ T細胞受體的恒定結構域的雙特異性結合物已經描述於WO 2016/180969 A1中。然而，這些T細胞活化雙特異性抗體的主要問題之一是觀察到與食蟹猴T細胞受體有很少交叉反應性。
已經提出了多種形式的雙特異性抗體構築體。例如，雙特異性抗體形式可以涉及兩種抗體或其片段的化學綴合（Brennan M.等人 1985, Science 229(4708): 81-83；Glennie M. J.等人 1987, J Immunol 139(7): 2367-2375）。
然而，這樣的雙特異性抗體形式的缺點包括高分子量和在高濃度下的高黏度，使得例如皮下投予具有挑戰性，並且缺點在於每個結合單元需要兩個可變結構域的相互作用以實現特異性和高親和力結合，這對多肽穩定性和生產效率有影響。這樣的雙特異性抗體形式也可能潛在地導致與低生產效率和低效價和/或輕鏈錯配或重鏈錯配相關的CMC問題。
目前，市場上只有一種雙特異性抗體博納吐單抗(Blinatumomab)（一種識別CD19和CD3的BiTE分子）用於臨床治療癌症。儘管這種T細胞接合形式於2014年12月被FDA批准用於二線治療，但必須克服許多障礙。一方面由於神經病學不良事件、細胞介素釋放症候群（CRS）和感染，以及另一方面由於缺乏客觀臨床反應或生物活性的穩健跡象，博納吐單抗的第一次臨床試驗提前停止。CRS是首批T細胞接合療法中報告的最重要的不良事件。
為了將不良事件和全身副作用（諸如細胞介素風暴）的風險最小化，在選擇T細胞抗原臂時必須格外小心。後者必須以單價方式與TCR複合物結合，並且在不存在靶向癌細胞的情況下不可觸發T細胞信號傳導。只有雙特異性抗體的兩個臂與其標靶（腫瘤和T細胞抗原）特異性結合才可觸發溶細胞突觸的形成和隨後對腫瘤細胞的殺傷。
非人靈長類動物，諸如食蟹猴或恒河猴，通常被認為是最適合進行臨床前研究（包括功效和毒性研究）的動物物種。為了使得能夠評估雙特異性T細胞接合抗體在非人靈長類動物中的毒性，抗體對於人TCR和非人靈長類動物TCR的良好物種交叉反應性是可取的。
因此，仍然需要另外的多特異性T細胞接合形式並且特別是靶向不同於CD3的T細胞受體的多特異性T細胞接合形式。
此外，需要以足夠親和力結合靶細胞和T細胞兩者以誘導細胞毒性反應的抗體構築體。同時，這樣的構築體不應誘導對非靶細胞的細胞毒性反應，所述非靶細胞即不表現靶抗原或僅以低水平表現靶抗原的細胞。由此，可以在功效與安全性之間達成平衡。另外可期望，這樣的構築體可以例如在微生物宿主中有效產生。此外，所述構築體（當治療性使用時）應不發揮不期望的副作用或僅發揮極小不期望的副作用，例如由對非靶細胞的細胞毒性活性引起的副作用。
諸位發明人已經發現能夠特異性靶向和結合TCR的新型T細胞接合器（TCE）免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）。這些TCR結合ISVD，也稱為TCE，可以與能夠結合細胞特異性標靶的部分連接。免疫系統可以藉由TCE ISVD與T細胞的結合來靶向在其細胞表面呈遞所述特異性標靶的異常細胞（諸如癌症）引起的病理學。因此，T細胞被引導至表現所述特異性標靶的腫瘤細胞，並且藉由T細胞與TCE的這種結合，誘導T細胞活化。一旦T細胞被活化，就會觸發有效的靶細胞殺傷。
諸位發明人發現，包含根據本發明技術的靶向TCR的ISVD和細胞特異性標靶的構築體同時在體外導致高效的T細胞介導的標靶表現細胞的殺傷。此外，此類構築體僅顯示對不表現標靶或表現低水平標靶的細胞的有限活性。這表明了誘導針對特異性靶細胞的高特異性的T細胞介導的細胞毒性反應，同時展現有利的安全性概況的可能性。
在早期開發的TCR結合ISVD的穩定性研究中，諸位發明人觀察到ISVD中某些位置處的胺基酸殘基中有一些缺乏化學穩定性。具體而言，他們觀察到位置61處的天門冬胺酸（D）發生異構化，並且位置99處發生色胺酸（W）氧化（Kabat編號）。假設，在下游加工過程中，痕量水平的過渡金屬被聚山梨醇酯催化，導致觀察到的色胺酸氧化。諸位發明人在TCR結合ISVD的選定位置進行了幾個胺基酸取代，並且觀察到可以減少或甚至完全防止這些有害影響。
本文提供了TCR結合ISVD，其具有有效力的與不同物種的TCR的結合和改善的化學穩定性。
因此，在第一方面，本發明技術涉及特異性靶向存在於T細胞上的人和/或非人靈長類動物T細胞受體的恒定結構域的ISVD，其中所述ISVD包含三個互補決定區（分別為CDR1至CDR3），並且其中：
a. CDR1的胺基酸序列（根據Kabat）是INFYG（SEQ ID NO: 79）；
b. CDR2的胺基酸序列（根據Kabat）是HISIGDQTDYAX
1SAKG（SEQ ID NO: 80）；並且
c. CDR3的胺基酸序列（根據Kabat）是LSRIX
2PYDY（SEQ ID NO: 81）；
其中
- 胺基酸殘基X
1選自E、D、N、P、K、R、I、T、H、V、A、Y、L、Q、F和S；和/或
- 胺基酸殘基X
2選自Y、A、P、D、Q、E、R、F、S、G、T、H、V、K、L和I。
本發明技術的另一方面涉及特異性結合存在於T細胞上的人和/或非人靈長類動物T細胞受體（TCR）的恒定結構域的ISVD，其中所述ISVD包含3個互補決定區（分別為CDR1至CDR3），其中
a. CDR1的胺基酸序列（根據AbM）是GYVHKINFYG（SEQ ID NO: 82）；
b. CDR2的胺基酸序列（根據AbM）是HISIGDQTD（SEQ ID NO: 83）；並且
c. CDR3的胺基酸序列（根據AbM）是LSRIX
2PYDY（SEQ ID NO: 84）；
並且其中
- 位置61（根據Kabat）處的胺基酸殘基選自E、D、N、P、K、R、I、T、H、V、A、Y、L、Q、F和S；和/或
- 胺基酸殘基X
2選自Y、A、P、D、Q、E、R、F、S、G、T、H、V、K、L和I。
在一個實施例中，X
1選自E、D、N、P、K、R、I、T、H、V、A、Y、L、Q、F和S。在一個實施例中，X
1選自E或D，諸如X
1是E。
在另一個實施例中，位置61（根據Kabat）選自E、D、N、P、K、R、I、T、H、V、A、Y、L、Q、F和S，諸如位置61（根據Kabat）是E或D。
在一個實施例中，位置61（根據Kabat）是E。
在一個實施例中，X
2選自Y、A、P、D、Q、E、R、F、S、G、T、H、V、K、L和I。在一個實施例中，X
2是Y、A、Q、F、S、T或H。在一個實施例中，X
2是Y、Q、S或T。在一個實施例中，X
2是Y。
在一個實施例中，所述ISVD中位置103（Kabat編號）處的胺基酸殘基選自W、R、A、E、Y、L、H、I、Q、V、K、S、G、P、F、T，諸如位置103（Kabat編號）處的胺基酸是W。
在另一個實施例中，本發明技術提供了其中X
1是E，X
2是Y並且位置103（Kabat編號）處的胺基酸殘基是W的ISVD；或者其中位置61（Kabat編號）處的胺基酸殘基是E，X
2是Y並且位置103（Kabat編號）處的胺基酸殘基是W的ISVD。
在一個其他實施例中，所述ISVD是重鏈ISVD。在一個實施例中，所述ISVD選自VHH、人類化VHH、駝類化VH、結構域抗體、單結構域抗體和dAb。在一個實施例中，所述ISVD選自VHH、人類化VHH和駝類化VH。在一個實施例中，所述ISVD與SEQ ID NO: 2-57的序列具有至少85%、較佳至少90%、更較佳至少95%的序列同一性程度，其中出於確定序列同一性程度的目的，形成所述CDR序列的胺基酸殘基被忽略。
本發明技術的其他方面涉及ISVD，其中所述ISVD的序列是
X
0VQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAX
1SAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIX
2PYDYX
3GQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 85），
其中
a. X
0選自E和D；
b. X
1選自E、D、N、P、K、R、I、T、H、V、A、Y、L、Q、F和S組成之群組；
c. X
2選自Y、A、P、D、Q、E、R、F、S、G、T、H、V、K、L和I組成之群組；並且
d. X
3選自W、R、A、E、Y、L、H、I、Q、V、K、S、G、P、F和T組成之群組。
在一個實施例中，X
0是D。在一個實施例中，X
1選自D或E。在一個實施例中，X
1是E。在一個實施例中，X
2選自Y、T、S和Q。在一個實施例中，X
2是Y。在一個實施例中，X
3是W。
在本發明技術的另一方面，根據本發明技術的ISVD是多特異性多肽的一部分，所述多特異性多肽進一步包含能夠結合特異性細胞表面標靶的部分。
在本發明技術的一些實施例中，因此本發明技術提供了一種包含第一ISVD和至少一種另外的ISVD的多肽，其中所述第一ISVD特異性結合存在於T細胞上的人和/或非人靈長類動物TCR的恒定結構域，並且所述至少一種另外的ISVD特異性結合靶細胞上的抗原，其中所述第一ISVD是根據本發明技術的ISVD。
在這些實施例中，所述第一ISVD的胺基酸序列與SEQ ID NO: 2-57的胺基酸序列中的至少一個具有至少80%序列同一性，其中出於確定序列同一性程度的目的，形成所述CDR序列的胺基酸殘基被忽略。在一個實施例中，所述第一ISVD選自由SEQ ID NO: 37、42、46、50和52（諸如SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 42）組成的胺基酸序列的群組。
在另一個實施例中，所述多肽可以進一步包含特異性結合靶細胞上的第二抗原的第三ISVD。
在本發明技術的一些實施例中，所述多肽進一步包含任選地經由一個或多個肽連接子連接的一個或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，其中與沒有所述一個或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一個或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。例如，所述結合單元可以是與（人）血清蛋白諸如人血清白蛋白結合的ISVD。
還提供了一種編碼本發明技術的ISVD或多肽的核酸分子或一種包含所述核酸的載體。
本發明技術還涉及一種用編碼根據本發明技術的ISVD或多肽的核酸或載體轉化或轉染的非人宿主或宿主細胞。
本發明技術還涉及一種組合物，所述組合物包含本發明技術的ISVD或多肽，較佳地所述組合物是醫藥組合物。
進一步提供一種用於產生如本文所公開的ISVD或多肽的方法，所述方法至少包括以下步驟：
a. 在合適的宿主細胞或宿主生物體中或在另一種合適的表現系統中表現編碼所述ISVD或多肽的核酸序列；任選地之後：
b. 分離和/或純化所述ISVD或多肽。
此外，本發明技術涉及用作藥劑的組合物或多肽。
在本發明技術的一個實施例中，所述多肽或組合物用於治療增殖性疾病、炎性疾病、感染性疾病或自體免疫疾病。在本發明技術的一個實施例中，所述增殖性疾病是癌症。
本發明技術還提供了一種治療方法，所述治療方法包括將所述組合物或多肽投予有需要的個體的步驟。
在本發明技術的一個實施例中，所述治療方法用於治療增殖性疾病、炎性疾病、感染性疾病或自體免疫疾病。在一個實施例中，所述增殖性疾病是癌症。
本發明技術另外地提供了用於製備藥劑的組合物或多肽。在本發明技術的一個實施例中，所述藥劑用於治療增殖性疾病、炎性疾病、感染性疾病或自體免疫疾病。
在本發明技術的一個實施例中，所述增殖性疾病是癌症。
諸位發明人發現，在先前的研究中，在ISVD T0170056G05（在WO 2016180969中揭露為SEQ ID NO: 50）的CDR中引入某些胺基酸突變及其組合導致改善的與人TCR和/或非人靈長類動物TCR的恒定結構域的結合。然而，所開發的改善的TCR結合ISVD（命名為T017000700（SEQ ID NO: 1））在與異構化和色胺酸氧化相關的化學穩定性研究中顯示出一些問題。
因此，仍然需要進一步改善的TCR結合ISVD。
諸位發明人現在已經發現，在ISVD序列內的特定位置引入某些胺基酸突變可以消除在T017000700的情況下觀察到的問題，同時保留關於T0170056G05（在WO 2016180969中揭露為SEQ ID NO: 50）的改善的TCR結合。
在本文中將根據如下表B-1中所提及的標準三字母或單字母胺基酸代碼可互換地指示胺基酸殘基。
表
B-1
：常見胺基酸
| 單字母 | 三字母 | |
| 代碼 | 代碼 | 名稱 |
| A | Ala | 丙胺酸 |
| C | Cys | 半胱胺酸 |
| D | Asp | 天門冬胺酸 |
| E | Glu | 麩胺酸 |
| F | Phe | 苯丙胺酸 |
| G | Gly | 甘胺酸 |
| H | His | 組胺酸 |
| I | Ile | 異白胺酸 |
| K | Lys | 離胺酸 |
| L | Leu | 白胺酸 |
| M | Met | 甲硫胺酸 |
| N | Asn | 天門冬醯胺酸 |
| P | Pro | 脯胺酸 |
| Q | Gln | 麩醯胺酸 |
| R | Arg | 精胺酸 |
| S | Ser | 絲胺酸 |
| T | Thr | 蘇胺酸 |
| V | Val | 纈胺酸 |
| W | Trp | 色胺酸 |
| X | Xaa | 未指定 |
| Y | Tyr | 酪胺酸 |
當胺基酸殘基指示為「X」或「Xaa」時，意味著所述胺基酸殘基是未指定的，除非上下文需要更限制的解釋。例如，如果描述提供了CDR的胺基酸序列，其中胺基酸殘基中的一個（或多個）用「X」指示，則描述可以進一步指定哪個（些）胺基酸殘基是（可以）存在於CDR的該特定位置。
5.1
免疫球蛋白單可變結構域
術語「免疫球蛋白單可變結構域」（ISVD）定義了其中抗原結合位點存在於單免疫球蛋白結構域上並且由其形成的免疫球蛋白分子。這使免疫球蛋白單可變結構域與「常規」免疫球蛋白（例如，單株抗體）或其片段（諸如Fab、Fab'、F(ab’)
2、scFv、二scFv）區分開來，其中兩個免疫球蛋白結構域、特別是兩個可變結構域相互作用形成抗原結合位點。典型地，在常規的免疫球蛋白中，重鏈可變結構域（V
H）和輕鏈可變結構域（V
L）相互作用形成抗原結合位點。在這種情況下，V
H和V
L兩者的互補決定區（CDR）將促成抗原結合位點，即總共6個CDR將參與抗原結合位點的形成。
鑒於以上定義，常規4鏈抗體（諸如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；本領域已知的）的抗原結合結構域或者源自這種常規4鏈抗體的Fab片段、F(ab')
2段、Fv片段（諸如二硫鍵連接的Fv或scFv片段）或雙抗體（本領域中全部已知的）將通常不被視為免疫球蛋白單可變結構域，因為在這些情況下，不是一個（單個）免疫球蛋白結構域發生與相應抗原表位的結合，而是一對（締合的）免疫球蛋白結構域（諸如輕鏈和重鏈可變結構域）即免疫球蛋白結構域的V
H-V
L對發生與相應抗原表位的結合，其共同地與相應抗原表位結合。
相比之下，免疫球蛋白單可變結構域能夠在不與另外的免疫球蛋白可變結構域配對的情況下特異性結合至抗原的表位。免疫球蛋白單可變結構域的結合位點是由單V
H、單V
HH或單V
L結構域形成。
因此，所述單可變結構域可以是輕鏈可變結構域序列（例如，V
L序列）或其合適片段；或者重鏈可變結構域序列（例如，V
H序列或V
HH序列）或其合適片段；只要其能夠形成單抗原結合單元（即，功能性抗原結合單元，其基本上由單可變結構域組成，使得單抗原結合結構域不需要與另一可變結構域相互作用以形成功能性抗原結合單元）。
免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）可以是例如重鏈ISVD，諸如V
H、V
HH，包括駝類化V
H或人類化V
HH。較佳地，其是V
HH，包括駝類化V
H或人類化V
HH。重鏈ISVD可以源自常規四鏈抗體或重鏈抗體。
例如，免疫球蛋白單可變結構域可以是（單）結構域抗體（或適合用作單結構域抗體的胺基酸序列）、「dAb」或dAb（或適合用作dAb的胺基酸序列）；其他單可變結構域，或其任一種的任何合適片段。
特別地，免疫球蛋白單可變結構域可以是NANOBODY®免疫球蛋白單可變結構域（諸如V
HH，包括人類化V
HH或駝類化V
H）或其合適片段。NANOBODY®和NANOBODIES®是Ablynx N.V.的註冊商標。
「V
HH結構域」（也稱為V
HH、V
HH抗體片段和V
HH抗體）最初已經被描述為「重鏈抗體」的（即，「沒有輕鏈的抗體」的；Hamers-Casterman等人 1993, Nature 363: 446-448）抗原結合免疫球蛋白可變結構域。已選擇術語「V
HH結構域」以將這些可變結構域與常規4鏈抗體中存在的重鏈可變結構域（其在本文中稱為「V
H結構域」）以及與常規4鏈抗體中存在的輕鏈可變結構域（其在本文中稱為「V
L結構域」）區分開來。關於V
HH的進一步描述，參考Muyldermans 2001的評論文章（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302）。
典型地，免疫球蛋白的產生涉及實驗動物的免疫接種、產生免疫球蛋白的細胞的融合以產生融合瘤以及針對所需特異性的篩選。可替代地，免疫球蛋白可以藉由篩選幼稚或合成文庫，例如藉由噬菌體展示來產生。
免疫球蛋白序列的產生已經在各種出版物中被廣泛描述，其中WO 94/04678、Hamers-Casterman等人 1993和Muyldermans等人 2001可以作為例證。在這些方法中，用靶抗原對駱駝科動物進行免疫接種以誘導針對所述靶抗原的免疫反應。將從所述免疫接種獲得的VHH的庫針對結合所述靶抗原的VHH進行進一步篩選。
在這些情況下，免疫球蛋白的產生需要純化的抗原用於免疫接種和/或篩選。抗原可以從天然來源純化，或者在重組生產的過程中純化。
免疫球蛋白序列的免疫接種和/或篩選可以使用這樣的抗原的肽片段來進行。
本發明技術可以使用不同來源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驢、人和駱駝科動物免疫球蛋白序列。所述技術還包括完全人、人類化或嵌合序列。例如，所述技術包括駱駝科動物免疫球蛋白序列和人類化駱駝科動物免疫球蛋白序列，或者駝類化結構域抗體，例如，如Ward等人所述的駝類化dAb（參見例如WO 94/04678以及Davies和Riechmann 1994和1996）。此外，本技術還使用融合的免疫球蛋白序列，例如從而形成多價和/或多特異性構築體（對於含有一個或多個V
HH結構域的多價和多特異性多肽及其製備，還參見Conrath等人 2001, J. Biol. Chem. 276 (10): 7346-7350，以及參見例如WO 96/34103和WO 99/23221）；以及可從本發明技術的免疫球蛋白序列衍生的包含標籤或其他功能性部分（例如，毒素、標記、放射性化學物質等）的免疫球蛋白序列。
「人類化V
HH」包含與天然存在的V
HH結構域的胺基酸序列對應但是已經被「人類化」的胺基酸序列，即藉由將所述天然存在的V
HH序列（並且特別是架構序列）的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基用來自人類的常規4鏈抗體（例如，上文所示）的V
H結構域中的一個或多個相應位置處存在的一個或多個胺基酸殘基替代而人類化。這能以本身已知的方式進行，這對於本領域技術人員來說是清楚的，例如基於本文的進一步描述和現有技術（例如WO 2008/020079）。此外，應注意，可以以任何本身已知的合適方式獲得此類人類化V
HH，並因此並不嚴格限於已經使用包含天然存在的VHH結構域作為起始材料的多肽獲得的多肽。
「駝類化V
H」包含與天然存在的V
H結構域的胺基酸序列對應但是已經被「駝類化」的胺基酸序列，即藉由將來自常規4鏈抗體的天然存在的V
H結構域的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基用重鏈抗體的V
HH結構域中的一個或多個相應位置處存在的一個或多個胺基酸殘基替代而駝類化。這能以本身已知的方式進行，這對於本領域技術人員來說是清楚的，例如基於本文的進一步描述和現有技術（例如WO 2008/020079）。這樣的「駝類化」取代較佳地插入於形成和/或存在於V
H-V
L介面的胺基酸位置處和/或所謂的駱駝科標誌殘基處，如本文所定義（參見例如WO 94/04678以及Davies和Riechmann 1994和1996，同上）。較佳地，用作用於產生或設計駝類化V
H的起始材料或起點的V
H序列較佳是來自哺乳動物的V
H序列，更佳人的V
H序列，諸如V
H3序列。然而應注意，可以以任何本身已知的合適方式獲得此類駝類化V
H，並且因此並不嚴格限於已經使用包含天然存在的V
H結構域作為起始材料的多肽獲得的多肽。
免疫球蛋白單可變結構域序列的較佳結構可以認為是由四個架構區（「FR」）構成，其在本領域和本文中分別稱為「架構區1」（「FR1」）、「架構區2」（「FR2」）、「架構區3」（「FR3」）和「架構區4」（「FR4」），所述架構區被三個互補決定區（「CDR」）中斷，所述三個互補決定區在本領域和本文中分別稱為「互補決定區1」（「CDR1」）、「互補決定區2」（「CDR2」）和「互補決定區3」（「CDR3」）。
如WO 08/020079的第58頁和第59頁的段落q) 中進一步描述的，免疫球蛋白單可變結構域的胺基酸殘基可以根據由Kabat等人（「Sequence of proteins of immunological interest」, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, 出版號91）給出的用於V
H結構域的通用編號進行編號，如在Riechmann和Muyldermans, 2000（J. Immunol. Methods 240 (1-2): 185-195；參見例如此出版物的圖2）的文章中應用於來自駱駝科動物的V
HH結構域。應注意，如本領域中對於V
H結構域和V
HH結構域所熟知的，每個CDR中胺基酸殘基的總數可以變化，並且可以不對應於由Kabat編號指示的胺基酸殘基的總數（也就是說，根據Kabat編號的一個或多個位置可能不會在實際序列中被佔用，或者實際序列可能含有比Kabat編號所允許的數量更多的胺基酸殘基）。這意味著，通常，根據Kabat的編號可以對應於或可以不對應於實際序列中胺基酸殘基的實際編號。V
H結構域和V
HH結構域中的胺基酸殘基總數通常在110至120，常常在112與115之間的範圍內。然而，應注意，更小和更長的序列也可能適用於本文所述的目的。
在本申請中，除非另有指示，否則根據Kabat（Martin 2010, 在: Kontermann和Dübel (編輯), Antibody Engineering 第2卷, Springer Verlag Heidelberg Berlin, 第3章, 第33-51頁）來確定CDR序列。根據此方法，免疫球蛋白單可變結構域的FR1包含位置1-30處的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的CDR1包含位置31-35處的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的FR2包含位置36-49處的胺基酸，免疫球蛋白單可變結構域的CDR2包含位置50-65處的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的FR3包含位置66-94處的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的CDR3包含位置95-102處的胺基酸殘基，並且免疫球蛋白單可變結構域的FR4包含位置103-113處的胺基酸殘基。
CDR區的確定也可以根據不同方法進行。在本申請中，CDR序列也是根據如Martin 2010（
在 :Kontermann和Dübel (編輯) 2010, Antibody Engineering, 第2卷, Springer Verlag Heidelberg Berlin, 第3章, 第33-51頁）中所述的AbM定義確定的。根據此方法，FR1包含位置1-25處的胺基酸殘基，CDR1包含位置26-35處的胺基酸殘基，FR2包含位置36-49處的胺基酸，CDR2包含位置50-58處的胺基酸殘基，FR3包含位置59-94處的胺基酸殘基，CDR3包含位置95-102處的胺基酸殘基，並且FR4包含位置103-113處的胺基酸殘基。
在這種免疫球蛋白序列中，所述架構序列可以是任何合適的架構序列，並且例如基於標準手冊以及本文中提及的另外的揭露內容和現有技術，合適的架構序列的例子對於技術人員將是清楚的。
架構序列較佳地是免疫球蛋白架構序列（的合適組合），或者（例如，藉由人類化或駝類化）源自免疫球蛋白架構序列的架構序列。例如，架構序列可以是源自輕鏈可變結構域（例如，V
L序列）和/或重鏈可變結構域（例如，V
H序列或V
HH序列）的架構序列。在一個特別較佳的方面，架構序列是源自V
HH序列的架構序列（其中所述架構序列可以任選地被部分或完全人類化），或者是已經駝類化的常規V
H序列（如本文所定義）。
特別地，所述技術中使用的ISVD序列中存在的架構序列可以含有一個或多個標誌殘基（如本文所定義），使得所述ISVD序列是V
HH，包括人類化V
HH或駝類化V
H。這樣的架構序列（的合適組合）的一些較佳但非限制性的例子將從本文的其他公開文本變得清楚。
同樣，如本文針對免疫球蛋白序列的大概描述，也可以使用前述任一項的合適片段（或片段的組合），諸如含有一個或多個CDR序列的片段，其適當地被一個或多個架構序列側接和/或經由一個或多個架構序列來連接（例如，以與這些CDR和架構序列可能在衍生所述片段的全尺寸免疫球蛋白序列中出現的相同順序）。
然而，應注意，關於ISVD序列（或用於表現所述ISVD序列的核苷酸序列）的來源，以及關於產生或獲得（或者已經產生或獲得）所述ISVD序列或核苷酸序列的方式，所述技術不受限。因此，ISVD序列可以是天然存在的序列（來自任何合適的物種）或者合成的或半合成的序列。在特定但非限制性的方面，ISVD序列是天然存在的序列（來自任何合適的物種）或者合成的或半合成的序列，包括但不限於「人類化」（如本文所定義）免疫球蛋白序列（如部分或完全人類化的小鼠或兔免疫球蛋白序列，並且特別是部分或完全人類化的V
HH序列）、「駝類化」（如本文所定義）免疫球蛋白序列，以及藉由諸如以下的技術獲得的免疫球蛋白序列：親和力成熟（例如，從合成的、隨機的或天然存在的免疫球蛋白序列開始）、CDR移植、鑲面、組合源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重疊引物的PCR組裝，以及技術人員熟知的工程化免疫球蛋白序列的類似技術；或前述任一項的任何合適組合。
類似地，核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或者合成的或半合成的序列，並且可以是例如藉由PCR從合適的天然存在的範本分離的序列（例如，從細胞分離的DNA或RNA）、已經從文庫（並且特別是，表現文庫）分離的核苷酸序列、已經藉由將突變引入天然存在的核苷酸序列製備的核苷酸序列（使用本身已知的任何合適的技術，諸如錯配PCR）、已經藉由使用重疊引物的PCR製備的核苷酸序列，或者已經使用本身已知的DNA合成技術製備的核苷酸序列。
如上所述，ISVD可以是ISVD或其合適片段。關於ISVD的大概描述，參考下文的進一步描述，以及本文引用的現有技術。然而，在這方面，應注意，此描述和現有技術主要描述了所謂的「V
H3類」的ISVD（即，與V
H3類的人種系序列諸如DP-47、DP-51或DP-29具有高度序列同源性的ISVD）。然而，應注意，所述技術在其最廣泛的意義上通常可以使用任何類型的ISVD並且例如還使用屬於所謂的「V
H4類」的ISVD（即，與V
H4類的人種系序列諸如DP-78具有高度序列同源性的ISVD），例如像WO 2007/118670中所述。
通常，ISVD（特別是V
HH序列，包括（部分）人類化V
HH序列和駝類化V
H序列）的特徵可以是在一個或多個架構序列（同樣如本文進一步所述）中存在一個或多個「標誌殘基」（如本文所述）。因此，通常可以將ISVD定義為具有以下（通用）結構的免疫球蛋白序列
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中標誌殘基中的一個或多個是如本文進一步所定義的。
特別地，ISVD可以是具有以下（通用）結構的免疫球蛋白序列
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中所述架構序列是如本文進一步所定義的。
更特別地，ISVD可以是具有以下（通用）結構的免疫球蛋白序列
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中：
根據Kabat編號，在位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108處的胺基酸殘基中的一個或多個選自下表A-0中提及的標誌殘基。
表
A-0
：
ISVD
中的標誌殘基
| 位置 | 人 V H3 | 標誌殘基 |
| 11 | L、V；主要是L | L、S、V、M、W、F、T、Q、E、A、R、G、K、Y、N、P、I；較佳L |
| 37 | V、I、F；通常是V | F (1)、Y、V、L、A、H、S、I、W、C、N、G、D、T、P；較佳F (1)或Y |
| 44 (8) | G | E (3)、Q (3)、G (2)、D、A、K、R、L、P、S、V、H、T、N、W、M、I； 較佳G (2)、E (3)或Q (3)；最佳G (2)或Q (3)。 |
| 45 (8) | L | L (2)、R (3)、P、H、F、G、Q、S、E、T、Y、C、I、D、V；較佳L (2)或R (3) |
| 47 (8) | W、Y | F (1)、L (1)或W (2)、G、I、S、A、V、M、R、Y、E、P、T、C、H、K、Q、N、D；較佳W (2)、L (1)或F (1) |
| 83 | R或K；通常是R | R、K (5)、T、E (5)、Q、N、S、I、V、G、M、L、A、D、Y、H；較佳K或R；最佳K |
| 84 | A、T、D；主要是A | P (5)、S、H、L、A、V、I、T、F、D、R、Y、N、Q、G、E；較佳P |
| 103 | W | W (4)、R (6)、G、S、K、A、M、Y、L、F、T、N、V、Q、P (6)、E、C；較佳W |
| 104 | G | G、A、S、T、D、P、N、E、C、L；較佳G |
| 108 | L、M或T；主要是L | Q、L (7)、R、P、E、K、S、T、M、A、H；較佳Q或L (7) |
| 注意：(1) 特別地，但非排他地，在位置43-46處與KERE或KQRE組合。 (2) 通常在位置44-47處為GLEW。 (3) 通常在位置43-46處為KERE或KQRE，例如在位置43-47處為KEREL、KEREF、KQREL、KQREF、KEREG、KQREW或KQREG。可替代地，諸如以下的序列也是可能的：TERE（例如，TEREL）、TQRE（例如，TQREL）、KECE（例如，KECEL或KECER）、KQCE（例如，KQCEL）、RERE（例如，REREG）、RQRE（例如，RQREL、RQREF或RQREW）、QERE（例如，QEREG）、QQRE（例如，QQREW、QQREL或QQREF）、KGRE（例如，KGREG）、KDRE（例如，KDREV）。一些其他可能的但不太較佳的序列包括例如DECKL和NVCEL。 (4) 具有位置44-47處的GLEW和位置43-46處的KERE或KQRE兩者。 (5) 常常為天然存在的V HH結構域的位置83-84處的KP或EP。 (6) 特別地，但非排他地，在位置44-47處與GLEW組合。 (7) 前提是當位置44-47為GLEW時，在還含有103處的W的（非人類化）V HH序列中，位置108始終為Q。 (8) GLEW組還在位置44-47處含有GLEW樣序列，例如像GVEW、EPEW、GLER、DQEW、DLEW、GIEW、ELEW、GPEW、EWLP、GPER、GLER和ELEW。 |
所述技術尤其使用可以結合至TCR的恒定結構域的ISVD。在本發明技術的上下文中，與某種靶分子「結合」在本領域中具有與在抗體及其相應抗原的情境中所理解的通常含義。
因此，所述技術中使用的ISVD的靶分子是TCR的恒定結構域。
與TCR的結合可以例如藉由與TCRα亞基和/或TCRβ亞基結合來實現。例子是哺乳動物TCR。儘管人TCR是較佳的，但來自其他物種的形式也適用於本發明技術，例如來自以下物種的TCR：小鼠、大鼠、兔、貓、狗、山羊、綿羊、馬、豬、非人靈長類動物諸如食蟹猴（本文中也稱為「
食蟹猴（
cyno）」）或者駱駝科動物如美洲駝或羊駝。
人和食蟹猴來源的TCR-α/β恒定結構域的序列提供於表A-1中（對於來自人和食蟹猴來源的TCR α的恒定結構域分別為SEQ ID NO: 106和108；對於來自人和食蟹猴來源的TCR β的恒定結構域分別為SEQ ID NO: 107和109）。對於前述序列中的每一個，由UniProt或Genbank檔識別字表示的這些序列中的每一個的來源列出於表A-1中。內部測序證實最初源自恒河猴來源的胺基酸序列與來自食蟹猴來源的胺基酸序列相同。
在一個實施例中，所述ISVD特異性結合人T細胞受體α（TCR-α）的恒定結構域（SEQ ID NO: 106）和/或人T細胞受體β（TCR-β）的恒定結構域（SEQ ID NO: 107），或其多態變體或同種型。
在一個實施例中，ISVD特異性結合非人靈長類動物TCR的恒定結構域。在一個實施例中，所述非人靈長類動物TCR是獼猴或恒河猴TCR。在一個實施例中，所述獼猴或恒河猴TCR包含SEQ ID NO: 108的TCR-α的恒定結構域和/或SEQ ID NO: 109的TCR-β的恒定結構域，或其多態變體或同種型。
同種型是可以從相同基因藉由單個生物學事件或藉由生物學事件的組合產生的替代蛋白質序列，所述生物學事件諸如替代性啟動子使用、選擇性剪接、替代性起始和核糖體移碼，所有這些都是本領域已知的。
表 A-1 與 TCR 相關的胺基酸序列（「
ID」
是指如本文所用的給定 SEQ ID NO ）
| ID | 名稱 | 胺基酸序列 |
| 106 | 人TCRα恒定結構域（源自P01848） | PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS |
| 107 | 人TCRβ恒定結構域（源自P01850） | EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF |
| 108 | 恒河猴TCRα（AEA41863） | MLLLLVLVLEVIFTLGGTRAQSVTQLDSQVSVSEGVPVLLRCNYSSSFSPYLFWYVQYPNQGLQLLLKYTSGTTLVKGINGFEAEFKKSETSFHLTKASAHVSDAAEYFCALARGALVFGKGTRLSVIPNIQNPDPAVYQLRGSKSNDTSVCLFTDFDSVMNVSQSKDSDVHITDKTVLDMRSMDFKSNGAVAWSNKSDFACTSAFKDSVIPADTFFPGTESVCDANLVEKSFETDMNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS |
| 109 | 恒河猴TCRβ（AEA41864） | MGFWTLCCVSFCILVAKHTDAGVIQLPRHEVTEMGKEVTLRCEPISGHSSLFWYRQTMMRGLEFLIYFNNKSPIDDSGMPKDRFSATMPDASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASTPGQGREKLFFGSGTQLSVLEDLKKVFPPKVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALEDSRYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFYGLSEDDEWTEDRDKPITQKISAEVWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALMLMAMVKRKDF |
| 110 | 人TCR拉鍊：α鏈 | MNMRPVTSSVLVLLLMLRRSNGQLLEQSPQFLSIQEGENLTVYCNSSSVFSSLQWYRQEPGEGPVLLVTVVTGGEVKKLKRLTFQFGDARKDSSLHITAAQPGDTGLYLCAGAGSQGNLIFGKGTKLSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKSVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCSSADLVPRGSTTAPSAQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQEQKLISEEDL |
| 111 | 人TCR拉鍊：β鏈 | MSNTVLADSAWGITLLSWVTVFLLGTSSADGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSSRSSYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYSLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCSSADLVPRGSTTAPSAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQTGHHHHHHHHHH |
| 112 | 食蟹猴TCR拉鍊：α鏈（源自AEA41865） | MLLITSVLVLWMQLSQVNGQQIMQIPQYQHVQEGEDFTTYCNSSTTLSNIQWYKQRPGGHPVFLIMLVKSGEVKKQKRLIFQFGEAKKNSSLHITATQTTDVGTYFCATTGVNNLFFGTGTRLTVLPYIQNPDPAVYQLRGSKSNDTSVCLFTDFDSVMNVSQSKDSDVHITDKTVLDMRSMDFKSNGAVAWSNKSDFACTSAFKDSVIPADTFFPSPESSCSSADLVPRGSTTAPSAQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQEQKLISEEDL |
| 113 | 食蟹猴TCR拉鍊：β鏈（源自AEA41866和AEA41868） | MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHDYMYWYRQDPGMGLRLIHYSVGEGSTEKGEVPDGYNVTRSNTEDFPLRLESAAPSQTSVYFCASSYWTGRSYEQYFGPGTRLTVIEDLKKVFPPKVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALEDSRYSLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFYGLSEDDEWTEDRDKPITQKISAEAWGRADCSSADLVPRGSTTAPSAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQTGHHHHHHHHHH |
| 114 | 人TCRα恒定結構域（源自P01848） | PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSC |
| 115 | 人TCRβ恒定結構域（源自P01850） | EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADC |
| 116 | 食蟹猴TCR-α恒定結構域（源自AEA41865） | PYIQNPDPAVYQLRGSKSNDTSVCLFTDFDSVMNVSQSKDSDVHITDKTVLDMRSMDFKSNGAVAWSNKSDFACTSAFKDSVIPADTFFPSPESSC |
| 117 | 食蟹猴TCR-β恒定結構域（源自AEA41868） | EDLKKVFPPKVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALEDSRYSLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFYGLSEDDEWTEDRDKPITQKISAEAWGRADC |
因此，本發明技術的第一方面涉及一種ISVD，所述ISVD特異性結合存在於T細胞上的人和/或非人靈長類動物T細胞受體（TCR）的恒定結構域，其中所述ISVD基本上由4個架構區（分別為FR1至FR4）和3個互補決定區（分別為CDR1至CDR3）組成，其中
a. CDR1的胺基酸序列（根據Kabat）是INFYG（SEQ ID NO: 79）；
b. CDR2的胺基酸序列（根據Kabat）是HISIGDQTDYAX
1SAKG（SEQ ID NO: 80）；並且
c. CDR3的胺基酸序列（根據Kabat）是LSRIX
2PYDY（SEQ ID NO: 81）；
其中
- 胺基酸殘基X
1選自E、D、N、P、K、R、I、T、H、V、A、Y、L、Q、F和S；和/或
- 胺基酸殘基X
2選自Y、A、P、D、Q、E、R、F、S、G、T、H、V、K、L和I。
也可以如下使用針對CDR的AbM定義來表示ISVD序列。一種ISVD，所述ISVD特異性結合存在於T細胞上的人和/或非人靈長類動物T細胞受體（TCR）的恒定結構域，其中所述ISVD基本上由4個架構區（分別為FR1至FR4）和3個互補決定區（分別為CDR1至CDR3）組成，其中
a. CDR1的胺基酸序列（根據AbM）是GYVHKINFYG（SEQ ID NO: 82）；
b. CDR2的胺基酸序列（根據AbM）是HISIGDQTD（SEQ ID NO: 83）；並且
c. CDR3的胺基酸序列（根據AbM）是LSRIX
2PYDY（SEQ ID NO: 84）；
並且其中
- 位置61（根據Kabat）處的胺基酸殘基選自E、N、P、K、R、I、T、H、V、A、Y、L、Q、F和S；和/或
- 胺基酸殘基X
2選自Y、A、P、D、Q、E、R、F、S、G、T、H、V、K、L和I。
諸位發明人發現根據本發明技術的具有CDR的ISVD具有有效力的TCR結合能力，並且分別在相關位置61和99（Kabat編號）處不具有異構化或色胺酸氧化。這意味著所述分子即能有效地與T細胞接合，也是化學穩定的。
在本發明技術的一個實施例中，特異性結合人TCR的ISVD的胺基酸序列可以展現出與SEQ ID NO: 2-57中任一個大於85%，諸如大於90%、大於95%或大於99%的序列同一性，其中所述CDR是如先前本文所定義的。
在一個其他實施例中，特異性結合人TCR的ISVD的胺基酸序列可以展現出大於85%、較佳至少90%、更佳至少95%的序列同一性。較佳地，所述序列包含SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 52，諸如SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 42。
在本發明技術的另一個實施例中，特異性結合人TCR的ISVD的胺基酸序列可以展現出與SEQ ID NO: 2-57中的任一個大於85%，諸如大於90%、大於95%或大於99%的序列同一性，其中出於確定序列同一性程度的目的，形成所述CDR序列的胺基酸殘基被忽略。
在一個其他實施例中，特異性結合人TCR的ISVD的胺基酸序列可以展現出大於85%、較佳至少90%、更佳至少95%的序列同一性，其中出於確定序列同一性程度的目的，形成所述CDR序列的胺基酸殘基被忽略。較佳地，所述序列包含SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 52，諸如SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 42。
當ISVD展現出與SEQ ID NO: 2-57中的任一個大於85%，諸如大於90%、大於95%或大於99%的序列同一性時，所述ISVD與表A-4中所闡述的ISVD之一相比較佳地展現出至少一半的對人TCR的結合親和力，更佳至少相同的結合親和力，其中使用相同方法（諸如表面等離子體共振（SPR））測量結合親和力。
此外，當ISVD展現出與SEQ ID NO: 2-57中的任一個大於85%，諸如大於90%、大於95%或大於99%的序列同一性時，所述ISVD與表A-4中所闡述的ISVD之一相比較佳地展現出在T細胞介導的靶細胞殺傷方面至少一半的效力，更佳在T細胞介導的靶細胞殺傷方面至少相同的效力，其中使用相同方法（諸如基於流式細胞術的T細胞介導的細胞殺傷測定或基於阻抗的T細胞介導的殺傷測定）測量T細胞介導的靶細胞殺傷。
第一胺基酸序列與第二胺基酸序列之間的「
序列同一性」的百分比可以如下進行計算：([
第一胺基酸序列中胺基酸殘基與第二胺基酸序列中相應位置處的胺基酸殘基相同的數量]/[
第一胺基酸序列中胺基酸殘基的總數量])×
100%，其中與第一胺基酸序列相比在第二胺基酸序列中胺基酸殘基的每個缺失、插入、取代或添加被視為單個胺基酸殘基處（即單個位置處）的差異。
通常，為了根據上文概述的計算方法確定兩個胺基酸序列之間的「序列同一性」的百分比，將具有最大胺基酸殘基數量的胺基酸序列作為「第一」胺基酸序列，並且另一個胺基酸序列作為「第二」胺基酸序列。
如本文所用的「胺基酸差異」是指單個胺基酸殘基相對於參考序列的缺失、插入或取代，並且較佳地是取代。
在本發明技術的一個實施例中，胺基酸取代是保守取代。這樣的保守取代較佳地是其中以下 (a) - (e) 組中的一個胺基酸被同一組中的另一個胺基酸殘基取代的取代：(a) 小的脂族、非極性或微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b) 極性、帶負電荷的殘基及其（不帶電荷的）醯胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c) 極性、帶正電荷的殘基：His、Arg和Lys；(d) 大的脂族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；以及 (e) 芳族殘基：Phe、Tyr和Trp。
在本發明技術的另一個實施例中，保守取代如下：Ala取代為Gly或取代為Ser；Arg取代為Lys；Asn取代為Gln或取代為His；Asp取代為Glu；Cys取代為Ser；Gln取代為Asn；Glu取代為Asp；Gly取代為Ala或取代為Pro；His取代為Asn或取代為Gln；Ile取代為Leu或取代為Val；Leu取代為Ile或取代為Val；Lys取代為Arg、取代為Gln或取代為Glu；Met取代為Leu、取代為Tyr或取代為Ile；Phe取代為Met、取代為Leu或取代為Tyr；Ser取代為Thr；Thr取代為Ser；Trp取代為Tyr；Tyr取代為Trp；和/或Phe取代為Val、取代為Ile或取代為Leu。
在本發明技術的一個實施例中，ISVD的整個胺基酸序列由SEQ ID NO: 85表示，其為
X
0VQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAX
1SAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIX
2PYDYX
3GQGTLVTVSS，其中
a. X
0選自E和D；
b. X
1選自E、D、N、P、K、R、I、T、H、V、A、Y、L、Q、F和S組成之群組；
c. X
2選自Y、A、P、D、Q、E、R、F、S、G、T、H、V、K、L和I組成之群組；並且
d. X
3選自W、R、A、E、Y、L、H、I、Q、V、K、S、G、P、F和T組成之群組。
在本發明技術的一個實施例中，X
0是D，和/或X
1是E，和/或X
2是Y、T、S或Q中的任一個，和/或X
3是W。
在本發明技術的另一個實施例中，X
0是E，和/或X
1是E；和/或X
2是Y、T、S或Q中的任一個，和/或X
3是W。
在本發明技術的一個實施例中，X
0是E，和/或X
1是E；和/或X
2是T，和/或X
3是W。
在本發明技術的一個其他實施例中，X
0是D，和/或X
1是E；和/或X
2是T，和/或X
3是W。
在本發明技術的另一個實施例中，X
0是E，和/或X
1是E；和/或X
2是S，和/或X
3是W。
在本發明技術的一個實施例中，X
0是D，和/或X
1是E，和/或X
2是S，和/或X
3是W。
在本發明技術的一個實施例中，X
0是E，和/或X
1是E，和/或X
2是Q，和/或X
3是W。
在本發明技術的另一個實施例中，X
0是D，和/或X
1是E，和/或X
2是Q，和/或X
3是W。
在本發明技術的一個其他實施例中，X
0是E，和/或X
1是E，和/或X
2是Y，和/或X
3是W。
在本發明技術的一個實施例中，X
0是D，和/或X
1是E，和/或X
2是Y，和/或X
3是W。
諸位發明人發現，將所述序列的第一位置（Kabat編號）中的胺基酸從E取代為D可以防止焦麩胺酸鹽形成，同時ISVD的功效不受影響。
在本發明技術的另一個實施例中，根據本發明技術的ISVD具有SEQ ID NO: 37、42、46、50和52中任一個的胺基酸序列。
在本發明技術的一個其他實施例中，所述ISVD具有SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 42的胺基酸序列。
諸位發明人觀察到，與參考ISVD T017000700相比，根據本發明技術的在位置61處具有E並且在位置99處具有Y、A、S或H（Kabat編號）的ISVD具有相似或更高的解鏈溫度（Tm）、更高的聚集開始溫度（Tagg）以及寡聚分數的減少。對於在位置61處具有E並且在位置99具有Q或T（Kabat編號）的ISVD，Tm沒有顯著降低，同時維持或具有更高的Tagg以及類似或降低的寡聚分數（Δ%寡聚）。
因此，在一個實施例中，根據本發明技術的ISVD或展現出與SEQ ID NO: 2-57中任一個大於90%，諸如大於95%或大於99%的序列同一性的ISVD具有至少71ºC、至少72ºC、較佳至少72.5ºC、更佳至少73ºC的解鏈溫度（Tm）。
在另一個實施例中，根據本發明技術的ISVD或展現出與SEQ ID NO: 2-57中任一個大於90%，諸如大於95%或大於99%的序列同一性的ISVD具有至少67ºC、至少68ºC、至少69ºC、至少71ºC、較佳至少72ºC、更佳至少73ºC的聚集開始溫度（Tagg）。
在又進一步的實施例中，根據本發明技術的ISVD或展現出與SEQ ID NO: 2-57中任一個大於90%，諸如大於95%或大於99%的序列同一性的ISVD具有小於0.5%、較佳小於0.4%、更佳小於0.3%、甚至更佳小於0.2%或甚至小於0.1%的寡聚化分數（Δ%寡聚化）。
產生的ISVD的列表可以在表A-4中找到。此外，產生的ISVD的CDR序列的組合可以在表A-5中找到。
在本發明技術的一個實施例中，TCE ISVD具有選自表A-5中呈現的CDR1、CDR2和CDR3序列的CDR1、CDR2和CDR3序列。
在本發明技術的另一個實施例中，TCE ISVD具有選自表A-5的同一行中呈現的CDR序列的組合的CDR1、CRD2和CDR3序列。
5.2
多特異性多肽
諸位發明人發現，在ISVD T0170056G05（在WO 2016180969中揭露為SEQ ID NO: 50）的CDR中引入某些胺基酸突變及其組合導致改善的與人TCR和/或非人靈長類動物TCR的恒定結構域的結合。此外，ISVD序列中特定位置處的另外的胺基酸突變可以藉由最小化或甚至防止異構化和色胺酸氧化來進一步改善ISVD的化學穩定性。
因此，在本發明技術的一個方面中，提供了一種多肽，所述多肽包含能夠特異性結合存在於T細胞上的人和/或非人靈長類動物T細胞受體（TCR）的恒定結構域的第一ISVD和能夠特異性結合靶細胞上的第一抗原的第二ISVD，其中所述第一抗原不同於所述TCR，並且其中所述靶細胞不同於所述T細胞，其中所述第一ISVD和所述第二ISVD基本上由4個架構區（分別為FR1至FR4）和3個互補決定區（分別為CDR1至CDR3）組成，並且其中所述第一ISVD是根據本發明技術的ISVD。
在此多特異性多肽中，所述CDR區是如本文所定義的（參見項目5.1）。諸位發明人發現，包含根據本發明技術的具有CDR的第一ISVD的多肽具有有效力的TCR結合能力，並且分別在相關位置61和99（Kabat編號）處不具有異構化或色胺酸氧化。
在一個實施例中，所述第一ISVD的胺基酸序列與SEQ ID NO: 2-57中任一個的胺基酸序列中的至少一個具有至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少95%的序列同一性，其中所述CDR區的序列是如本文所定義的，較佳地其中所述第一ISVD的序列包含SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 52。
在一個實施例中，所述第一ISVD的胺基酸序列與SEQ ID NO: 2-57中任一個的胺基酸序列中的至少一個具有至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少95%的序列同一性，其中出於確定序列同一性程度的目的，形成所述CDR序列的胺基酸殘基被忽略，較佳地其中所述第一ISVD的序列包含SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 52。
在另一個實施例中，所述第一ISVD與SEQ ID NO: 32、33和/或35-57中任一個的胺基酸序列具有至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少95%的序列同一性，其中所述CDR區的序列是如本文所定義的，並且其中較佳地所述序列包含SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 52。
在另一個實施例中，所述第一ISVD與SEQ ID NO: 32、33和/或35-57中任一個的胺基酸序列具有至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少95%的序列同一性，其中出於確定序列同一性程度的目的，形成所述CDR序列的胺基酸殘基被忽略，並且其中較佳地所述序列包含SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 52。
在一個其他實施例中，所述第一ISVD包含SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 42，或者由其組成。
在又另一個實施例中，所述第一ISVD包含SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 52，或者由其組成。
如本文進一步提供的實例所示，T017000700（SEQ ID NO: 1）中位置61和99處的特定胺基酸殘基的取代不影響ISVD對人和/或非人靈長類動物TCR的恒定結構域的親和力，而與先前開發的T017000700（SEQ ID NO: 1）相比，所得變體具有更好的化學穩定性。發現T017000978（SEQ ID NO: 37）和T017000991（SEQ ID NO: 42）是特別有效和穩定的。此外，T017000995（SEQ ID NO: 46）、T017000999（SEQ ID NO: 50）和T017001001（SEQ ID NO: 52）顯示出對TCR較低的親和力，但是維持細胞殺傷的高效力，這表明它們可能具有更好的生物分佈，並且因此有潛力具有更大的靶向特異性作用。
在本發明技術的一個實施例中，所述多肽是至少雙特異性的，但是也可以是例如三特異性、四特異性、五特異性等。此外，所述多肽是至少二價的，但是也可以是例如三價、四價、五價、六價等。
術語「
雙特異性」、「
三特異性」、「
四特異性」、「
五特異性」等都落在術語「
多特異性」的範圍內，並且分別是指結合至兩個、三個、四個、五個等不同的靶分子。
術語「
二價」、「
三價」、「
四價」、「
五價」、「
六價」等都落在術語「
多價」的範圍內，並且分別指示兩個、三個、四個、五個、六個等結合單元/構建單元諸如ISVD的存在。
例如，所述多肽可以是雙特異性二價的，諸如包含至少ISVD或由兩個ISVD組成的多肽，其中一個ISVD特異性結合存在於T細胞上的人和/或非人靈長類動物TCR的恒定結構域，並且一個ISVD特異性結合細胞表面特異性靶抗原，其中所述TCR和靶抗原較佳地是人的。
所述多肽也可以是雙特異性三價的，諸如包含三個ISVD或由三個ISVD組成的多肽，其中兩個ISVD特異性結合同一細胞表面特異性靶抗原，並且一個ISVD特異性結合T細胞上的人和/或非人靈長類動物TCR的恒定結構域。
在另一個例子中，所述多肽可以是三特異性三價的，諸如包含三個ISVD或由三個ISVD組成的多肽，其中一個ISVD特異性結合T細胞上的人和/或非人靈長類動物TCR的恒定結構域，一個ISVD特異性結合靶細胞上的第一抗原，並且一個ISVD特異性結合相同靶細胞上的第二抗原。
在又另一個例子中，所述三特異性三價多肽包含與T細胞上特異性結合人和/或非人靈長類動物TCR的恒定結構域的一個ISVD和特異性結合靶細胞上的第一抗原的一個ISVD相鄰的特異性結合人血清白蛋白的一個ISVD。
基於本文的公開內容，技術人員將清楚多特異性多價多肽的其他例子。
這種多肽可以同時是雙互補位的，例如在兩個ISVD結合靶抗原的兩個不同表位的情況下。
術語「雙互補位」是指與同一靶分子的兩個不同部分（例如，表位）結合。
本文所述的所述多特異性-多價多肽的組分（較佳ISVD）可以藉由一個或多個合適的連接子諸如肽連接子彼此連接。
使用連接子來連接兩個或更多個（多）肽是本領域中熟知的。
一類常用肽連接子被稱為「Gly-Ser」或「GS」連接子。這些是基本上由甘胺酸（G）和絲胺酸（S）殘基組成的連接子，並且通常包含肽基序諸如GGGGS（SEQ ID NO: 86）基序的一個或多個重複（例如，展現式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)
n，其中n可以是1、2、3、4、5、6、7或更大）。這樣的GS連接子的一些常用例子是9GS連接子（GGGGSGGGS，SEQ ID NO: 87）、15GS連接子（n = 3）和35GS連接子（n = 7）。參見例如，Chen等人 2013 (Adv. Drug Deliv. Rev. 65(10): 1357-1369) 和Klein等人 2014 (Protein Eng. Des. Sel. 27 (10): 325-330)。在本文公開的一種或多種多肽中，使用5GS和9GS連接子將所述多肽的組分彼此連接是較佳的。較佳地，少於10個胺基酸的連接子用於將能夠特異性結合TCR的第一ISVD與能夠特異性結合細胞表面特異性靶抗原的第二ISVD連接。
合適的連接子的例子在下面的表A-2中給出。
表 A-2 ：連接子序列（「
ID」
是指如本文所用的 SEQ ID NO ）
| 名稱 | ID | 胺基酸序列 |
| 3A連接子 | 136 | AAA |
| 5GS連接子 | 86 | GGGGS |
| 7GS連接子 | 137 | SGGSGGS |
| 8GS連接子 | 138 | GGGGSGGS |
| 9GS連接子 | 87 | GGGGSGGGS |
| 10GS連接子 | 139 | GGGGSGGGGS |
| 15GS連接子 | 140 | GGGGSGGGGSGGGGS |
| 18GS連接子 | 141 | GGGGSGGGGSGGGGSGGS |
| 20GS連接子 | 142 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 25GS連接子 | 143 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 30GS連接子 | 144 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 35GS連接子 | 145 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 40GS連接子 | 146 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| G1鉸鏈 | 147 | EPKSCDKTHTCPPCP |
| 9GS-G1鉸鏈 | 148 | GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP |
| 美洲駝上部長鉸鏈區 | 149 | EPKTPKPQPAAA |
| G3鉸鏈 | 150 | ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP |
因此，在一個實施例中，所述多肽包含根據本發明技術的能夠特異性結合人和/或非人靈長類動物TCR的恒定結構域的第一ISVD和能夠特異性地結合細胞表面特異性靶抗原的第二ISVD，它們藉由5GS和/或9GS連接子連接。
在本發明技術的另一個實施例中，所述多肽包含根據本發明技術的能夠特異性結合人和/或非人靈長類動物TCR的恒定結構域的第一ISVD和能夠特異性結合細胞表面特異性靶抗原的第二ISVD，它們藉由9GS連接子連接。
諸位發明人令人驚訝地發現，這樣的組態可以增加所述多肽在引發T細胞介導的細胞毒性反應中的效率。
應理解（如實例部分中也展示的）結合TCR的ISVD和結合靶細胞上的第一抗原的ISVD可以以任何順序位於本發明技術的多特異性多價多肽中。
因此，在本發明技術的實施例中，所述多肽以從多肽N末端開始的順序包含以下或由以下組成：特異性結合TCR的第一ISVD、特異性結合細胞表面特異性靶抗原的第二ISVD、以及為所述多肽提供如本文所定義的增加的半衰期的任選結合單元。在一個實施例中，所述ISVD藉由9GS連接子連接。為所述多肽提供增加的半衰期的結合單元較佳地是較佳地結合至血清白蛋白的ISVD。
所述多肽的這樣的組態可以提供關於治療癌症的強效力。
再者，不排除多肽中可存在其他結合單元/構建單元，諸如與靶細胞上的其他抗原結合或與另一標靶結合的其他ISVD。此外，不排除在其間放置其他結合單元/構建單元（諸如ISVD）的可能性。例如，如下文進一步描述的（具體參見，下文第5.4節「（體內）半衰期延長」），所述多肽可以進一步包含甚至可被定位在例如「第一ISVD」與「第二ISVD」之間的另一個與人血清白蛋白特異性結合的ISVD。
本發明技術的多肽的第二ISVD特異性結合靶細胞（較佳癌細胞）上的抗原。如本文所提及的「靶細胞」是在其表面上呈遞特定抗原的細胞。在一個實施例中，「靶細胞」是癌細胞。
膜（也稱為質膜或磷脂雙層）圍繞細胞的胞質，是細胞的外邊界，即膜是細胞的表面。該膜用於將細胞與其周圍環境分離並保護細胞免受周圍環境的影響，並且主要由磷脂雙層構成。嵌入該膜內的是各種蛋白質分子，諸如通道、泵和細胞受體。由於膜是流體，蛋白質分子可以在膜內移動。如本文所用，術語「靶細胞上的抗原」表示在細胞表面上展示的分子。在大多數情況下，該分子將位於細胞的質膜中或細胞的質膜上，使得該分子的至少一部分保持以三級形式可從細胞外可及。位於質膜中的細胞表面分子的非限制性例子是跨膜蛋白，所述跨膜蛋白在其三級構形中包含親水性和疏水性區域。在這裡，至少一個疏水性區域允許細胞表面分子嵌入或插入細胞的疏水性質膜中，而親水性區域在質膜的任一側分別延伸到胞質和胞外間隙中。
所述抗原可以是細胞上的任何標靶，例如腫瘤抗原。在一個實施例中，所述抗原是所述靶細胞（例如，癌細胞）特有的，諸如所述癌細胞上的腫瘤抗原或腫瘤相關抗原（TAA）。
如本文所用的術語「腫瘤抗原」可以理解為呈遞在腫瘤細胞上的那些抗原。這些抗原可以以胞外部分呈遞在細胞表面，所述胞外部分與通常與該分子的跨膜和胞質部分組合。這些抗原有時只可由腫瘤細胞呈遞，而不可由正常或健康細胞呈遞。腫瘤抗原可以僅在腫瘤細胞上表現，或者可能代表與正常細胞相比的腫瘤特異性突變。在這種情況下，它們被稱為腫瘤特異性抗原。然而，通常情況並非如此。更常見的是由腫瘤細胞和正常細胞呈遞的抗原，並且它們被稱為「腫瘤相關抗原（TAA）」。與正常細胞相比，這些腫瘤相關抗原可以在腫瘤細胞上過表現，或者與正常組織相比，腫瘤組織的結構不太緊湊，因此更容易在腫瘤細胞中與抗體結合。TAA較佳是在特定腫瘤細胞上表現但較佳不在正常細胞中表現的抗原。通常，TAA是僅在生物發育的特定點（諸如在胎兒發育期間）在細胞中正常表現並且在當前發育點在生物體中不適當表現的抗原，或者是在現在表現抗原的器官的正常組織或細胞中不表現的抗原。
在一個實施例中，靶細胞上的所述第一抗原是腫瘤相關抗原（TAA）。
在一個實施例中，靶細胞上的所述第一抗原在癌細胞上比在正常細胞上更豐富地存在。靶細胞上的抗原較佳是腫瘤相關抗原（TAA）。
在一個實施例中，靶細胞上的所述第一抗原是腫瘤抗原或腫瘤特異性抗原（TSA）。
在一個實施例中，本發明技術的多特異性多價多肽包含特異性結合CD123或磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3的第二ISVD。
在另一個實施例中，根據本發明技術的多肽進一步包含特異性結合靶細胞上的第二抗原的第三ISVD。
本發明技術的多肽結合的靶細胞特別涉及哺乳動物細胞，較佳靈長類動物細胞，並且甚至更較佳人細胞。靶細胞較佳是過度增殖性細胞，例如像癌細胞。
在本發明技術的另一個實施例中，所述多特異性多價多肽展現與人血清中預先存在的抗體的降低的結合。為此，在本發明技術的一個實施例中，所述多肽在至少一個ISVD中（並且較佳地在所述多肽C末端的ISVD），但較佳地在每個ISVD中展現在胺基酸位置11處的纈胺酸（V）和在胺基酸位置89處的白胺酸（L）（根據Kabat編號）。
在本發明技術的另一個實施例中，所述多肽在C末端ISVD的C末端處展現1至5個（較佳地天然存在的）胺基酸的延長，諸如單一丙胺酸（A）延長。ISVD的C末端通常是VTVSS（SEQ ID NO: 88）。
在本發明技術的另一個實施例中，所述多肽在至少一個ISVD中展現在位置110（根據Kabat編號）處的離胺酸（K）或麩醯胺酸（Q）。
在本發明技術的另一個實施例中，在至少一個ISVD中，所述ISVD展現在位置112（根據Kabat編號）處的離胺酸（K）或麩醯胺酸（Q）。在這些實施例中，所述ISVD的C末端是VKVSS（SEQ ID NO: 89）、VQVSS（SEQ ID NO: 90）、VTVKS（SEQ ID NO: 91）、VTVQS（SEQ ID NO: 92）、VKVKS（SEQ ID NO: 93）、VKVQS（SEQ ID NO: 94）、VQVKS（SEQ ID NO: 95）或VQVQS（SEQ ID NO: 96），使得在添加單一丙胺酸後，所述多肽的C末端例如展現序列VTVSSA（SEQ ID NO: 97）、VKVSSA（SEQ ID NO: 98）、VQVSSA（SEQ ID NO: 99）、VTVKSA（SEQ ID NO: 100）、VTVQSA（SEQ ID NO: 101）、VKVKSA（SEQ ID NO: 102）、VKVQSA（SEQ ID NO: 103）、VQVKSA（SEQ ID NO: 104）或VQVQSA（SEQ ID NO: 105），較佳VTVSSA。
在本發明技術的另一個實施例中，所述多肽在至少C末端ISVD中展現在胺基酸位置11處的纈胺酸（V）和在胺基酸位置89處的白胺酸（L）（根據Kabat編號），任選地在至少一個ISVD中在位置110處的離胺酸（K）或麩醯胺酸（Q）（根據Kabat編號），並且在C末端ISVD的C末端處展現1至5個（較佳地天然存在的）胺基酸的延長，諸如單一丙胺酸（A）延長（使得所述多肽的C末端例如由序列VTVSSA、VKVSSA或VQVSSA組成，較佳地由VTVSSA組成）。關於這方面的其他資訊，參見例如WO 2012/175741和WO 2015/173325。
從以上和本文的進一步描述中將清楚，本發明技術的ISVD可以作為「構建單元」用以形成本發明技術的多肽，例如，藉由將所述ISVD與其他基團、殘基、部分或結合單元適當地組合，以形成如本文所述的化合物或構築體（諸如但不限於本文所述的本發明技術的二價/三價/四價/多價和雙特異性/三特異性/四特異性/多特異性多肽），其將一種或多種所需特性或生物學功能組合在一個分子內。具有多種ISVD的多肽在本文中也稱為「構築體」或「ISVD形式」。
5.3
特異性
術語「
特異性」、「
特異性地結合」或「
特異性結合」是指特定結合單元（諸如ISVD）可以以足夠高的親和力（參見下文）結合的來自同一生物體的不同靶分子（諸如抗原）的數量。「
特異性」、「
特異性地結合」或「
特異性結合」在本文中與「
選擇性」、「
選擇性地結合」或「
選擇性結合」可互換使用。結合單元諸如ISVD較佳地特異性結合至其指定標靶。
結合單元的特異性/選擇性可以基於親和力來確定。親和力表示分子相互作用的強度或穩定性。親和力通常藉由K
D或解離常數給出，以mol/升（或M）為單位來表示。親和力也可以表示為締合常數K
A，其等於1/K
D並且以（mol/升）
-1（或M
-1）為單位來表示。
親和力是部分與靶分子上的結合位點之間的結合強度的量度：K
D值越低，靶分子與靶向部分之間的結合強度越強。
典型地，本發明技術中使用的結合單元（諸如ISVD）將以10
-5至10
-12莫耳/升或更低、並且較佳10
-7至10
-12莫耳/升或更低、並且更較佳10
-8至10
-12莫耳/升的解離常數（K
D）（即，以10
5至10
12升/莫耳或更高、並且較佳10
7至10
12升/莫耳或更高、並且更較佳10
8至10
12升/莫耳的締合常數（K
A））與其標靶結合。
通常認為任何大於10
-4mol/升的K
D值（或任何小於10
4升/mol的K
A值）指示非特異性結合。
被認為具有特異性的生物學相互作用（諸如免疫球蛋白序列與抗原的結合）的K
D典型地在10
-5莫耳/升（10000 nM或10 µM）至10
-12莫耳/升（0.001 nM或1 pM）或更低的範圍內。
因此，特異性/選擇性結合可能意味著，使用相同的測量方法例如SPR，結合單元（或包含其的多肽）以10
-5至10
-12莫耳/升或更低的K
D值與TCR結合，並且以大於10
-4莫耳/升的K
D值與相關標靶結合。
因此，所述ISVD與由SEQ ID NO: 1的胺基酸組成的ISVD相比較佳地展現出至少一半的對人TCR的結合親和力，更較佳至少相同的結合親和力，其中所述結合親和力是使用相同方法（諸如SPR）測量的。
與來自某個物種的某種標靶的特異性結合並不排除結合單元也可以與來自不同物種的類似標靶特異性地結合。例如，與人TCR特異性結合不排除結合單元（或包含所述結合單元的多肽）也可以與來自食蟹猴的TCR特異性結合。
在稱ISVD展現與另一個ISVD相比「改善的關於結合人TCR和非人靈長類動物TCR的交叉反應性」時，其意味著對於所述ISVD，對人TCR和對非人靈長類動物TCR的結合活性（諸如表示為K
D或k
off）的比率低於在相同測定中針對其他ISVD計算的該相同比率。
關於結合人TCR和非人靈長類動物TCR的良好交叉反應性允許在非人靈長類動物中進行的臨床前研究中評估多特異性T細胞接合多肽的毒性。
結合單元與其指定標靶的特異性結合可以以本身已知的任何合適方式來確定，所述方式包括例如Scatchard分析和/或競爭性結合測定，諸如放射免疫測定（RIA）、酶免疫測定（EIA）和夾層法競爭測定，以及它們在本領域中本身已知的不同變體；以及本文提及的其他技術。
如技術人員將清楚的，解離常數可以是實際的或表觀的解離常數。用於確定解離常數的方法對技術人員將是清楚的，並且例如包括以下提及的技術。在這一方面，還將清楚的是，可能無法測量大於10
-4mol/L或10
-3mol/L（例如為10
-2mol/L）的解離常數。任選地，如技術人員還將清楚的，可以基於（實際或表觀）締合常數（K
A），借助關係式 [K
D= 1/K
A] 來計算（實際或表觀）解離常數。
可以經由本身已知的不同技術（諸如熟知的表面等離子體共振（SPR）生物感測器技術）來測量兩個分子之間的分子相互作用的親和力（參見例如Ober等人 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559）。如本文所用，術語「表面等離子體共振」是指一種光學現象，其允許藉由檢測生物感測器矩陣內蛋白質濃度的改變來分析即時生物特異性相互作用，其中一個分子固定在生物感測器晶片上，並且另一個分子在流動條件下經過固定的分子，從而得到k
on、k
off測量值，並且因此得到K
D（或K
A）值。例如，這可以使用熟知的BIAcore®系統（BIAcore International AB，一家GE Healthcare公司，烏普薩拉，瑞典和皮斯卡塔韋，新澤西州）進行。有關進一步描述，參見Jonsson等人 (1993, Ann. Biol. Clin. 51: 19-26)，Jonsson等人 (1991, Biotechniques 11: 620-627)，Johnsson等人 (1995, J. Mol. Recognit. 8: 125-131)，和Johnnson等人 (1991, Anal. Biochem. 198: 268-277)。
另一種熟知的確定生物分子相互作用的親和力的生物感測器技術是生物層干涉法（BLI）（參見例如Abdiche等人 2008, Anal. Biochem. 377: 209-217）。如本文所用，術語「生物層干涉法」或「BLI」是指無標記光學技術，其分析從兩個表面反射的光的干涉圖案：內部參考層（參考光束）和生物感測器尖端上的固定蛋白質的層（信號光束）。結合到生物感測器尖端的分子數量的變化會導致干涉圖案的偏移，報告為波長偏移（nm），其幅度是結合到生物感測器尖端表面的分子數量的直接量度。由於可以即時測量相互作用，因此可以確定締合和解離速率和親和力。例如，BLI可以使用熟知的Octet®系統（ForteBio，Pall Life Sciences的分公司，門洛派克，美國）來進行。
可替代地，可以在動力學排斥測定（KinExA）（參見例如Drake等人 2004, Anal. Biochem., 328: 35-43）中使用KinExA®平臺（Sapidyne Instruments Inc，博伊西，美國）測量親和力。如本文所用，術語「KinExA」是指測量未修飾分子的真實平衡結合親和力和動力學的基於溶液的方法。使抗體/抗原複合物的平衡溶液藉由具有用抗原（或抗體）預包被的珠的柱，從而允許游離的抗體（或抗原）與被包被的分子結合。用結合抗體（或抗原）的螢光標記的蛋白完成了對如此捕獲的抗體（或抗原）的檢測。
GYROLAB®免疫測定系統為自動化生物分析和快速樣品周轉提供了平臺（Fraley等人 2013, Bioanalysis 5: 1765-74）。
在一個實施例中，本發明技術的ISVD結合人TCR的結合速率常數（k
on）選自至少約10
3M
-1s
-1、至少約10
4M
-1s
-1、和至少約10
5M
-1s
-1，較佳如藉由SPR測量的，較佳在ProteOn XPR36儀器上較佳在25ºC進行。
在一個實施例中，本發明技術的ISVD結合非人靈長類動物TCR的k
on選自至少約10
3M
-1s
-1、至少約10
4M
-1s
-1、和至少約10
5M
-1s
-1，較佳如藉由SPR測量的，較佳在ProteOn XPR36儀器上較佳在25ºC進行。
在一個實施例中，本發明技術的ISVD結合人TCR的k
off選自至多約10
-1s
-1、至多約10
-2s
-1、至多約10
-3s
-1、和至多約10
-4s
-1，較佳如藉由SPR測量的，較佳在ProteOn XPR36儀器上較佳在25ºC進行。
在一個實施例中，本發明技術的ISVD結合非人靈長類動物TCR的k
off選自至多約10
-1s
-1、至多約10
-2s
-1、至多約10
-3s
-1、和至多約10
-4s
-1，較佳如藉由SPR測量的，較佳在ProteOn XPR36儀器上較佳在25ºC進行。
與在位置99處具有不同胺基酸的ISVD相比，在位置99處具有Y、F、H、K、L或R的ISVD顯示出特別有利的K
off。因此，在一個實施例中，ISVD在位置99處具有Y、F、H、K、L或R。在一個實施例中，ISVD在位置99處具有Y、F、H或R。
與在位置103處具有另一個胺基酸的ISVD相比，在位置103（Kabat編號）處具有W、A、E、F、H、I、K、L、Q、R、S、T、V或Y的ISVD顯示出特別有利的koff。因此，在一個實施例中，ISVD在位置103處具有W、A、E、F、H、I、K、L、Q、R、S、T、V或Y。在一個實施例中，ISVD在位置103處具有W、A、E、F、H、I、K、L、Q、S、T或V。
在位置61（Kabat編號）處具有A、E、F、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V或Y的ISVD顯示出與在位置61處具有D的參考TCE ISVD一樣良好的k
off。由於在所述參考ISVD中的D61處觀察到異構化，因此需要獲得在位置61處具有不同胺基酸的具有至少相似解離速率的ISVD。因此，在一個實施例中，ISVD在位置61處具有A、E、F、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V或Y，較佳地，ISVD在位置61處具有E。
在一個實施例中，本發明技術的ISVD結合人TCR的親和力（K
D）選自至多約10
-6M、至多約10
-7M、至多約10
-8M、和至多約10
-9M，較佳如藉由SPR測量的，較佳在ProteOn XPR36儀器上較佳在25ºC進行。
在一個實施例中，本發明技術的ISVD結合非人靈長類動物TCR的K
D選自至多約10
-5M、至多約10
-6M、至多約10
-7M、和至多約10
-8M，較佳如藉由SPR測量的，較佳在ProteOn XPR36儀器上較佳在25ºC進行。
在一些實施例中，本發明技術的TCR結合ISVD以與SEQ ID NO: 1相比相同或更低的解離速率常數（k
off）結合人TCR。在一些實施例中，本發明技術的ISVD以與SEQ ID NO: 1的ISVD相比相同或更低的k
off結合非人靈長類動物TCR。在一些實施例中，本發明技術的TCR結合ISVD以與ISVD T0170056G05（在WO 2016180969中揭露為SEQ ID NO: 50）相比相同或更低的解離速率常數（k
off）結合人TCR。
在一些實施例中，本發明技術的ISVD以與ISVD T0170056G05（在WO 2016180969中揭露為SEQ ID NO: 50）相比相同或更低的k
off結合非人靈長類動物TCR。解離速率（k
off）可以藉由本領域技術人員已知的任何方法來測量。在一個實施例中，解離速率（k
off）是藉由表面等離子體共振（SPR）測量的，較佳在ProteOn XPR36儀器上較佳在25ºC進行。
諸位發明人發現，當在細胞殺傷測定中測試時，根據本發明技術的具有與參考ISVD T017000700（SEQ ID NO: 1）相同或更高的親和力（K
D）的ISVD也具有與所述參考ISVD相似或更高效力。
令人驚訝地是，諸位發明人發現了本發明技術的ISVD子集，其結合人TCR的親和力（K
D）比參考ISVD T017000700（SEQ ID NO: 1）的親和力低超過40倍，但是在細胞殺傷測定中維持高效力。這些在位置61處具有E並且在位置99處具有Q、S或T（Kabat編號）的特定ISVD在產生具有更好生物分佈的生物治療劑方面提供了感興趣的機會。
在一個實施例中，與ISVD T0170056G05（在WO 2016180969中揭露為SEQ ID NO: 50）相比，本發明技術的ISVD的結合人和非人靈長類動物TCR具有改善的交叉反應性。因此，在一個特定實施例中，本發明技術的ISVD的結合人TCR的k
off在結合非人靈長類動物TCR的k
off的5倍範圍內。
在另一個實施例中，本發明技術的ISVD以與SEQ ID NO: 1相比相同或更低的K
D結合人TCR，較佳如藉由表面等離子體共振（SPR）測量的，較佳在ProteOn XPR36儀器上較佳在25ºC進行。在另一個實施例中，本發明技術的ISVD以與SEQ ID NO: 1相比相同或更低的K
D結合非人靈長類動物TCR，較佳如藉由表面等離子體共振（SPR）測量的，較佳在ProteOn XPR36儀器上較佳在25ºC進行。在另一個實施例中，本發明技術的ISVD以與ISVD T0170056G05（在WO 2016180969中揭露為SEQ ID NO: 50）相比相同或更低的K
D結合人TCR，較佳如藉由表面等離子體共振（SPR）測量的，較佳在ProteOn XPR36儀器上較佳在25ºC進行。在另一個實施例中，本發明技術的ISVD以與ISVD T0170056G05（在WO 2016180969中揭露為SEQ ID NO: 50）相比相同或更低的K
D結合非人靈長類動物TCR，較佳如藉由表面等離子體共振（SPR）測量的，較佳在ProteOn XPR36儀器上較佳在25ºC進行。
在一個實施例中，本發明技術的ISVD (i) 結合人TCR的親和力（K
D）選自至多約10
-6M、至多約10
-7M、至多約10
-8M、至多約10
-8M、和至多約10
-9M，
並且(ii) 結合非人靈長類動物TCR的K
D選自至多約10
-5M、至多約10
-6M、至多約10
-7M、和至多約10
-8M，較佳如藉由SPR測量的，較佳在ProteOn XPR36儀器上較佳在25ºC進行。
在一個實施例中，本發明技術的ISVD顯示出改善的交叉反應性，即結合人和非人靈長類動物TCR的結合活性的比率（諸如表示為K
D或k
off）與對於ISVD T0170056G05（在WO 2016180969中揭露為SEQ ID NO: 50）的同樣比率相比更低，較佳藉由SPR測定所述K
D或K
off，較佳在ProteOn XPR36儀器上較佳在25ºC進行。
例如，與ISVD T0170056G05（在WO 2016180969中揭露為SEQ ID NO: 50）在人食蟹猴交叉反應性方面的差異相比，基於K
D，本發明技術的ISVD在人食蟹猴交叉反應性方面顯示出更低的差異。較佳地，藉由SPR確定K
D，較佳在ProteOn XPR36儀器上較佳在25ºC進行。
5.4
（體內）半衰期延長
如上文所公開的，根據本發明技術的多肽可以進一步包含任選地經由一個或多個肽連接子連接的一個或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，其中與沒有所述一個或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一個或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供了增加的（體內）半衰期。體內半衰期延長意指，例如，所述多肽在投予後在哺乳動物諸如人個體中展現增加的半衰期。半衰期可以表示為例如t1/2β。
基團、殘基、部分或結合單元的類型通常不受限，並且可以例如選自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可以結合至血清蛋白的結合單元、Fc部分以及可以結合至血清蛋白的小蛋白或肽。
更特定地，為所述多肽提供增加的半衰期的所述一個或多個其他基團、殘基、部分或結合單元可以選自可以結合至血清白蛋白（諸如人血清白蛋白）或者血清免疫球蛋白（諸如IgG）的結合單元，並且較佳地是可以結合至人血清白蛋白的結合單元。所述結合單元較佳地是ISVD。
例如，WO 04/041865描述了與血清白蛋白（並且特別是人血清白蛋白）結合的ISVD，其可以與其他蛋白質（諸如與所需標靶結合的一種或多種其他ISVD）連接，以增加所述蛋白質的半衰期。
國際申請WO 06/122787描述了針對（人）血清白蛋白的多種ISVD。這些ISVD包括稱為Alb-1的ISVD（WO 06/122787中的SEQ ID NO: 52）及其人類化變體，諸如Alb-8（WO 06/122787中的SEQ ID NO: 62）。同樣，這些可以用於延長治療性蛋白質和多肽以及其他治療性實體或部分的半衰期。
此外，WO 2012/175400描述Alb-1的另一種改進形式，稱為Alb-23。
在本發明技術的一個實施例中，所述多肽包含選自以下的血清白蛋白結合部分：Alb-1、Alb-3、Alb-4、Alb-5、Alb-6、Alb-7、Alb-8、Alb-9、Alb-10和Alb-23，較佳地Alb-8或Alb-23或其變體，如WO 2012/175400的第7-9頁中所示，以及WO 2012/175741、WO 2015/173325、WO 2017/080850、WO 2017/085172、WO 2018/104444、WO 2018/134235、WO 2018/134234中所述的白蛋白結合物。
在另一個實施例中，所述多肽包含選自表A-3的血清白蛋白結合部分。
表 A-3 ：血清白蛋白結合 ISVD 序列（「
ID」
是指如本文所用的 SEQ ID NO ）
| 名稱 | ID | 胺基酸序列 |
| Alb8 | 118 | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb8-A | 119 | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb23 | 120 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb23-A | 121 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb83 | 122 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb83-A | 123 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb132 | 124 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb132-A | 125 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb73 | 126 | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSS |
| Alb73-A | 127 | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSSA |
| Alb82 | 128 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb82-A | 129 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb199 | 130 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSS |
| Alb199-A | 131 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSSA |
| Alb23002 | 132 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb223 | 133 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb216 | 134 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSS |
| Alb216-A | 135 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSSA |
當這種結合人血清白蛋白的ISVD位於C末端位置時，其展現出C末端丙胺酸（A）或甘胺酸（G）延伸（較佳A）。在本發明技術的一些實施例中，所述結合人血清白蛋白的ISVD位於不同於C末端位置的另一個位置（即，不是所述多肽的C末端ISVD）。
5.5
核酸分子
還提供了一種編碼如本文所公開的ISVD或多肽的核酸分子。
「核酸分子」（可與「核酸」互換使用）是經由磷酸酯主鏈彼此連接以形成核苷酸序列的核苷酸單體的鏈。核酸可以用於轉化/轉染宿主細胞或宿主生物體，例如用於多肽的表現和/或生產。用於生產目的的合適的宿主或宿主細胞對技術人員將是清楚的，並且可以例如是任何合適的真菌、原核或真核細胞或細胞株或任何合適的真菌、原核或真核生物體。包含編碼所述多肽的核酸的（非人）宿主或宿主細胞也被所述技術涵蓋。
核酸可以是例如DNA、RNA或其雜合體，並且還可以包含（例如，以化學方式）修飾的核苷酸，諸如PNA。其可以是單鏈或雙鏈的，並且較佳地呈雙鏈DNA的形式。例如，核苷酸序列可以是基因組DNA或cDNA。
核酸可以以本身已知的方式來製備或獲得，和/或可以從合適的天然來源分離。編碼天然存在的（多）肽的核苷酸序列可以例如進行定點誘變，以便提供編碼具有序列變異的多肽的核酸分子。同樣，如技術人員將清楚的，為了製備核酸，也可以以合適的方式將數個核苷酸序列諸如至少一個編碼靶向部分的核苷酸序列和例如編碼一個或多個連接子的核酸連接在一起。
用於產生核酸的技術對技術人員將是清楚的，並且可以例如包括但不限於自動化DNA合成；定點誘變；組合兩個或更多個天然存在的和/或合成的序列（或其兩個或更多個部分），引入導致截短的表現產物表現的突變；引入一個或多個限制性位點（例如，以產生可能易於使用合適的限制性酶消化和/或連接的盒和/或區域），和/或借助使用一個或多個「錯配」引物的PCR反應引入突變。
5.6
載體
還提供了一種包含編碼如本文所公開的ISVD或多肽的核酸分子的載體。
如本文所用的「載體」是適用於將遺傳物質攜帶到細胞中的載具。載體包括裸核酸，諸如質粒或mRNA，或嵌入到更大結構諸如脂質體或病毒載體中的核酸。
載體通常包含任選地與一種或多種調節元件（例如像一種或多種合適的啟動子、增強子、終止子等）連接的至少一種核酸。載體較佳地是表現載體，即適用於在合適的條件下（例如，當所述載體被引入（例如，人）細胞中時）表現編碼的多肽或構築體的載體。對於基於DNA的載體，這通常包括用於轉錄（例如，啟動子和聚A信號）和轉譯（例如，Kozak序列）的元件的存在。
較佳地，在載體中，所述至少一種核酸和所述調節元件彼此「可操作地連接」，這通常意指它們彼此之間具有功能關係。例如，如果啟動子能夠啟動或以其他方式控制/調節編碼序列的轉錄和/或表現，則所述啟動子被認為與編碼序列「可操作地連接」（其中，所述編碼序列應理解為「在所述啟動子的控制下」）。通常，當兩個核苷酸序列可操作地連接時，它們處於相同定向，並且通常也處於同一閱讀框中。它們通常也是基本上連續的，但這也可能不是必需的。
較佳地，載體的任何調節元件使得它們能夠在預期的宿主細胞或宿主生物體中提供其預期的生物學功能。
例如，啟動子、增強子或終止子在預期的宿主細胞或宿主生物體中應是「可操作的」，這意味著例如所述啟動子應能夠啟動或以其他方式控制/調節與其可操作地連接的核苷酸序列（例如，編碼序列）的轉錄和/或表現。
5.7
組合物
所述技術還提供了一種組合物，所述組合物包含至少一種如本文所公開的ISVD或多肽、編碼如本文所公開的ISVD或多肽的至少一種核酸分子或包含這樣的核酸分子的至少一種載體。所述組合物可以是醫藥組合物。所述組合物可以進一步包含至少一種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，並且任選地包含一種或多種其他醫藥活性多肽和/或化合物。
5.8
宿主生物體
所述技術還涉及宿主細胞或宿主生物體，所述宿主細胞或宿主生物體包含如本文所公開的ISVD或多肽、編碼如本文所公開的ISVD或多肽的核酸和/或包含編碼如本文所公開的ISVD或多肽的核酸分子的載體。
合適的宿主細胞或宿主生物體對技術人員是清楚的，並且是例如任何合適的真菌、原核或真核細胞或細胞株或任何合適的真菌、原核或真核生物體。具體例子包括HEK293細胞、CHO細胞、大腸桿菌（
Escherichia coli）或巴斯德畢赤酵母（
Pichia pastoris）。最較佳的宿主是巴斯德畢赤酵母。
5.9 ISVD
和多肽的方法和用途
所述技術還提供了一種用於產生如本文所揭示的ISVD或多肽的方法。所述方法可以包括用編碼所述ISVD或多肽的核酸轉化/轉染宿主細胞或宿主生物體，在所述宿主中表現所述ISVD或多肽，任選地隨後進行一個或多個分離和/或純化步驟。具體地，所述方法可以包括：
a) 在合適的宿主細胞或（非人）宿主生物體中或在另一合適的表現系統中表現編碼根據本發明技術的ISVD或多肽的核酸序列，任選地隨後：
b) 分離和/或純化所述多肽。
用於生產目的的合適的宿主細胞或宿主生物體對技術人員將是清楚的，並且可以例如是任何合適的真菌、原核或真核細胞或細胞株或任何合適的真菌、原核或真核生物體。具體例子包括HEK293細胞、CHO細胞、大腸桿菌或巴斯德畢赤酵母。最較佳的宿主是巴斯德畢赤酵母。
典型地，本發明技術的多特異性多價多肽將靶細胞上的高親和力抗原識別與T細胞活化相結合，導致不依賴於T細胞天然特異性的活化。本發明技術的多肽的第一ISVD對/與效應細胞（較佳所述效應細胞的TCR，並且甚至更較佳所述TCR的恒定結構域）具有高親和力/特異性結合。
效應細胞是包含TCR複合物的細胞，較佳免疫細胞，諸如T細胞，較佳CD4+ T輔助細胞（也稱為CD4細胞、T輔助細胞或T4細胞），更較佳細胞毒性T細胞（也稱為TC細胞、CTL或CD8+ T細胞）或自然殺傷T細胞（NKT細胞）。在一些實施例中，細胞在體內存在。在一些實施例中，細胞在體外存在。本發明技術的效應細胞特別涉及哺乳動物細胞，較佳靈長類動物細胞，並且甚至更較佳人細胞。
如本文所用，「T細胞活化」是指T細胞（例如，細胞毒性T細胞）的一種或多種細胞反應，所述細胞反應諸如選自：增殖、分化、細胞介素分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒性活性、活化標記物的表現、和重定向的靶細胞裂解。本發明技術的多特異性多價多肽能夠誘導T細胞活化。測量T細胞活化的合適測定在本文所述的領域中是已知的，例如如WO 99/54440或Schlereth等人 2005 (Cancer Immunol. Immunother. 20: 1-12) 所述或如在實例或下文中例示的。
在一個實施例中，本發明技術涉及如本文所述的多特異性多價多肽，其中所述多肽誘導T細胞活化。較佳地，僅當所述第二個和/或另外的ISVD與靶細胞上的抗原結合時，本發明技術的多肽才誘導T細胞活化。
在一個實施例中，本發明技術涉及如本文所述的多特異性多價多肽，其中所述T細胞活化依賴於將與靶細胞上的所述第一抗原結合的所述多肽呈遞給T細胞。
本發明技術的多肽對T細胞的活化可以藉由以下來監測：CD69、CD25和各種細胞黏附分子的上調，細胞介素（例如，IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-2、IL-4和IL-10）的從頭表現和/或釋放，顆粒酶和穿孔素表現的上調，和/或細胞增殖，膜起泡，半胱天門冬酶原3和/或7的活化，核DNA的片段化和/或半胱天門冬酶底物聚(ADP核糖)聚合酶的切割。較佳地，多特異性多價多肽對靶細胞的重定向裂解不依賴於T細胞受體特異性、MHC I類和/或β2微球蛋白的存在、和/或任何共刺激性刺激。
在一個實施例中，本發明技術涉及如本文所述的多特異性多價多肽，其中所述T細胞活化不依賴於MHC識別。
本發明技術的多特異性多價多肽在體外顯示用先前未刺激的外周多株CD8
+和CD4
+陽性T細胞的重定向裂解。藉由本發明技術的多肽募集T細胞對靶細胞的重定向裂解涉及溶細胞突觸形成以及穿孔素和顆粒酶的遞送。已經描述了T細胞造成的細胞裂解，例如Atkinson和Bleackley 1995 (Crit. Rev. Immunol 15(3-4):359-384) 所述。較佳地，接合的T細胞能夠進行連續靶細胞裂解，並且不受干擾肽抗原加工和呈遞或選殖T細胞分化的免疫逃逸機制的影響（參見例如WO 2007/042261）。在體外，在低皮莫耳濃度下觀察到重定向裂解，這表明非常少數量的本發明技術的多肽需要與靶細胞結合以觸發T細胞。因此，本發明技術涉及強效多肽。較佳地，本發明技術的多特異性多價多肽介導靶細胞（例如，癌細胞）的殺傷，諸如刺激T細胞形成孔並遞送細胞毒性T細胞顆粒的促凋亡組分。
在一個實施例中，本發明技術涉及如本文所述的多特異性多價多肽，其中所述T細胞活化引起所述T細胞的一種或多種細胞反應，其中所述細胞反應選自增殖、分化、細胞介素分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒性活性、活化標記物的表現和重定向的靶細胞裂解。
如本文所用，術語「效力」是藥劑諸如多肽或ISVD的生物活性的量度。藥劑的效力可以藉由本領域已知的任何合適的方法來確定，例如像如在實驗部分中描述的。基於細胞培養的效力測定通常是確定生物活性的較佳形式，因為它們測量由藥劑引發的生理反應並且可以在相對較短的時間段內產生結果。可以使用基於產品作用機制的各種類型的基於細胞的測定，包括但不限於增殖測定、細胞毒性測定、細胞殺傷測定、報告基因測定、細胞表面受體結合測定、和測量功能必需蛋白質或其他信號分子（諸如磷酸化蛋白質、酶、細胞介素、cAMP等）的誘導/抑制的測定、Ramos B細胞耗盡模型、T細胞介導的腫瘤細胞殺傷測定（例如，如實例部分所述），在本領域中都是熟知的。
在一個實施例中，與其中第一ISVD被T0170056G05（在WO 2016180969中揭露為SEQ ID NO: 50）替代的相同形式相比，本發明技術的多特異性多價多肽在人和食蟹猴T細胞介導的殺傷測定中顯示出改善的效力和功效。
（本發明技術的多肽的）「功效」測量在飽和多肽濃度下作用本身的最大強度。功效指示本發明技術的多肽可實現的最大反應。它是指多肽產生所需（治療性）作用的能力。
因此，在一個實施例中，本發明技術涉及如本文所述的多特異性多價多肽，其中所述T細胞活化引起所述靶細胞活性的抑制，例如從而延遲或最小化靶細胞的擴散、抑制或延遲靶細胞的生長和/或增殖、和/或殺傷靶細胞（例如，引起障礙和/或症狀消退）大於約10%，諸如20%、30%、或40%，或甚至大於50%，諸如大於60%，諸如70%、80%或者甚至大於90%，諸如100%。在一個特定實施例中，所述T細胞活化引起所述靶細胞裂解大於約10%，諸如20%、30%或40%，或甚至大於50%，諸如大於60%。
在一個實施例中，如本文所述的多特異性多價多肽引起人T細胞以選自至多約10
-9M、至多約10
-10M、和至多約10
-11M的EC50值裂解靶細胞，所述EC50值如在T細胞介導的殺傷測定中確定的。例如，EC50是在實例8或實例9所述的基於流式細胞術的測定中確定的，或者在實例10所述的基於阻抗的細胞毒性測定中確定的。
在一個實施例中，如本文所述的多特異性多價多肽引起非人靈長類動物T細胞以選自至多約10
-9M、和至多約10
-10M、和至多約10
-11M的EC50值裂解靶細胞，所述EC50值如在T細胞介導的殺傷測定中確定的。例如，EC50是在實例8或實例9所述的基於流式細胞術的測定中確定的，或者在實例10所述的基於阻抗的細胞毒性測定中確定的。
在基於流式細胞術的T細胞介導的殺傷測定中，具有根據本發明技術的在位置61處具有E並且在位置99處具有Y或S的TCR結合ISVD的多特異性多價多肽顯示出特別高的效力。因此，在一個實施例中，所述多特異性多價多肽包含在位置61處具有E並且在位置99處具有Y或S的TCR結合ISVD。在一個實施例中，所述多特異性多價多肽引起人T細胞以至多約5.10
-10M、至多約10
-10M，諸如至多約5.10
-11M的EC50值裂解所述靶細胞，所述EC50值如在基於流式細胞術的T細胞介導的殺傷測定或基於阻抗的T細胞介導的殺傷測定中確定的。在一個實施例中，所述多特異性多價多肽包含在位置61處具有E並且在位置99處具有Y、Q、T或S的TCR結合ISVD，並且引起人T細胞以至多約5.10
-10M、至多約10
-10M，諸如至多5.10
-11M的EC50值裂解所述靶細胞，所述EC50值如在基於流式細胞術的T細胞介導的殺傷測定或基於阻抗的T細胞仲介的殺傷測定中確定的。
在一個實施例中，如本文所述的多特異性多價多肽能夠活化人和/或非人靈長類動物T細胞，從而與其中所述第一ISVD被ISVD T0170056G05（在WO 2016180969中揭露為SEQ ID NO: 50）替換的相同多肽相比以改善的（更低的）EC50值裂解所述靶細胞。
在一個實施例中，本發明技術的多特異性多價多肽引起人T細胞與其中所述第一ISVD被ISVD T0170056G05（在WO 2016180969中揭露為SEQ ID NO: 50）替代的相同多肽相比以改善的（更低的）EC50值裂解所述靶細胞，所述EC50值是如在T細胞介導的殺傷測定中確定的。例如，EC50是如實例部分所述來確定的。
在一個實施例中，本發明技術的多特異性多價多肽引起非人靈長類動物T細胞與其中所述第一ISVD被ISVD T0170056G05（在WO 2016180969中揭露為SEQ ID NO: 50）替代的相同多肽相比以改善的（更低的）EC50值裂解所述靶細胞，所述EC50值是如在T細胞介導的殺傷測定中確定的。例如，EC50是如實例部分所述來確定的。
在一個實施例中，如本文所述的包含本發明技術的第一ISVD的多特異性多價多肽與其中所述第一ISVD被ISVD T0170056G05（在WO 2016180969中揭露為SEQ ID NO: 50）替代的相同多肽（即，包含作為第一ISVD和具有T0170056G05的CDR序列的ISVD的多肽）相比顯示出改善的與人和/或非人靈長類動物TCR的恒定結構域的結合。
本發明技術的ISVD的結合特徵在下文更詳細地討論（第5.3節；「特異性」）。
在一些實施例中，本發明技術的多特異性多價多肽結合人TCR的結合速率常數（k
on）選自至少約10
3M
-1s
-1、至少約10
4M
-1s
-1、和至少約10
5M
-1s
-1。
在一些實施例中，如本文所述的多特異性多價多肽結合非人靈長類動物TCR的k
on選自至少約10
3M
-1s
-1、至少約10
4M
-1s
-1、至少約10
5M
-1s
-1和至少約10
6M
-1s
-1。
在一些實施例中，本發明技術的多特異性多價多肽結合人TCR的解離速率常數（k
off）選自至多約10
-1s
-1、至多約10
-2s
-1、至多約10
-3s
-1、和至多約10
-4s
-1。
在一些實施例中，如本文所述的多特異性多價多肽結合非人靈長類動物TCR的k
off選自至多約10
-1s
-1、至多約10
-2s
-1、至多約10
-3s
-1和至多約10
-4s
-1。
在一些實施例中，本發明技術的多特異性多價多肽結合人TCR的親和力（K
D）選自至多約10
-5M、至多約10
-6M、至多約10
-7M、至多約10
-8M和至多約10
-9M。
在一些實施例中，本發明技術的多特異性多價多肽結合非人靈長類動物TCR的K
D選自至多約10
-5M、至多約10
-6M、至多約10
-7M和至多約10
-8M。
在一個實施例中，k
on、k
off或K
D是藉由表面等離子體共振（SPR）來測量的。例如，k
on、k
off或K
D是如實例部分所闡述來確定的。
在另一個實施例中，k
on、k
off或K
D是藉由生物層干涉法（BLI）來測量的。
在一個實施例中，本發明技術的多特異性多價多肽與其中第一ISVD被ISVD T0170056G05（在WO 2016180969中揭露為SEQ ID NO: 50）替代的相同多肽相比以改善的（更低的）K
D結合人TCR。
在一個實施例中，本發明技術的多特異性多價多肽與其中第一ISVD被ISVD T0170056G05（在WO 2016180969中揭露為SEQ ID NO: 50）替代的相同多肽相比以改善的（更低的）K
D結合非人靈長類動物TCR。
如所述的多肽、核酸分子或載體或者包含所述ISVD或多肽、核酸分子或載體的組合物，較佳地所述多肽或包含所述多肽的組合物，可用作藥劑。
因此，所述技術提供用作藥劑的如所述的多肽、核酸分子或載體或者包含所述ISVD或多肽、核酸分子或載體的組合物。
還提供了用於預防、治療或改善選自增殖性疾病、炎性疾病、感染性疾病和自體免疫疾病的疾病的如本文所述的多肽、核酸分子或載體，或者包含所述ISVD或多肽、核酸分子或載體的組合物。
此外，提供用於治療癌症的如本文所述的多肽、核酸分子或載體或者包含所述ISVD或多肽、核酸分子或載體的組合物。
還提供了一種用於預防、治療或改善疾病的方法，其中所述方法包括向有需要的個體投予醫藥活性量的如本文所述的多肽、核酸分子或載體或者包含所述ISVD或多肽、核酸分子或載體的組合物。
此外，提供了一種用於預防、治療或改善選自增殖性疾病、炎性疾病、感染性疾病和自體免疫疾病的疾病的方法，其中所述方法包括向有需要的個體投予醫藥活性量的如本文所述的多肽、核酸分子或載體或者包含所述ISVD或多肽、核酸分子或載體的組合物。
此外，提供了一種治療癌症的方法，其中所述方法包括向有需要的個體投予醫藥活性量的如本文所述的多肽、核酸分子或載體或者包含所述ISVD或多肽、核酸分子或載體的組合物。
進一步提供了如本文所述的多肽、核酸分子或載體或者包含所述多肽、核酸分子或載體的組合物在藥劑製備中的用途。
還提供了如本文所述的多肽、核酸分子或載體，或者包含所述多肽、核酸分子或載體的組合物在製備用於預防、治療或改善選自增殖性疾病、炎性疾病、感染性疾病和自體免疫疾病的疾病的藥劑中的用途。
進一步提供了如本文所述的多肽、核酸分子或載體或者包含所述多肽、核酸分子或載體的組合物在較佳地用於治療癌症的醫藥組合物的製備中的用途。
如在所述技術的上下文中所提及的「個體」可以是任何動物，較佳哺乳動物。在哺乳動物中，可以區分人與非人哺乳動物。非人動物可以是例如伴侶動物（例如，狗、貓）、家畜（例如，牛、馬、綿羊、山羊或豬動物）或通常用於研究目的和/或用於產生抗體的動物（例如，小鼠、大鼠、兔、貓、狗、山羊、綿羊、馬、豬、非人靈長類動物（諸如食蟹猴）或駱駝科動物（諸如美洲駝或羊駝））。
在預防和/或治療性目的的情況下，個體可以是任何動物，並且更具體地是任何哺乳動物，但較佳是人個體。
如本文所用，在向個體投予一種或多種療法的上下文中，術語「治療（treat）」、「治療（treatment）」和「治療（treating）」是指減少或改善與過度增殖性細胞障礙相關的障礙（例如，癌症）的進展、嚴重性和/或持續時間，和/或改善所述障礙的由投予一種或多種療法（包括但不限於投予一種或多種預防劑或治療劑）導致的一種或多種症狀。在具體實施例中，在向個體投予一種或多種療法的上下文中，術語「治療（treat）」、「治療（treatment）」和「治療（treating）」是指減少或改善過度增殖性細胞障礙（例如，癌症）的進展、嚴重性和/或持續時間，是指相對於對照（例如，陰性對照，諸如磷酸鹽緩衝鹽水）將癌細胞減少至少5%，較佳至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%。在其他實施例中，在向個體投予一種或多種療法的上下文中，術語「治療（treat）」、「治療（treatment）」和「治療（treating）」是指減少或改善過度增殖性細胞障礙（例如，癌症）的進展、嚴重性和/或持續時間，是指癌症個體的癌細胞數量沒有變化、住院治療時間減少、死亡率降低或存活時間增加。
物質（包括多肽、核酸分子和載體）或組合物可以藉由任何合適的投予途徑投予個體（例如，藉由腸內（諸如口服或直腸）或腸胃外（諸如表皮、舌下、頰、鼻、關節內、皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、經皮或經黏膜）投予。腸胃外投予，諸如肌內、皮下或真皮內投予是較佳的。最較佳的是皮下投予。
可以將有效量的如所述的多肽、核酸分子或載體或者包含所述ISVD或多肽、核酸分子或載體的組合物投予個體，以便提供預期的治療結果。
可以投予一個或多個劑量。如果投予多於一個劑量，則可以以合適的間隔投予所述劑量，以便最大化所述多肽、組合物、核酸分子或載體的作用。
表
A-4
：
ISVD
的序列
| 名稱 | SEQ ID NO | 61 | 99 | 103 | 序列 |
| T017000700 | 1 | D | W | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000937 | 2 | N | W | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYANSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000938 | 3 | P | W | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAPSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000939 | 4 | K | W | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAKSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000940 | 5 | R | W | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYARSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000941 | 6 | I | W | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAISAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000942 | 7 | T | W | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYATSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000943 | 8 | H | W | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAHSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000944 | 9 | V | W | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAVSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000945 | 10 | E | W | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000946 | 11 | A | W | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAASAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000947 | 12 | Y | W | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAYSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000948 | 13 | L | W | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYALSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000949 | 14 | Q | W | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAQSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000950 | 15 | F | W | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAFSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000951 | 16 | S | W | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYASSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000952 | 17 | D | W | R | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYRGQGTLVTVSS |
| T017000953 | 18 | D | W | A | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYAGQGTLVTVSS |
| T017000954 | 19 | D | W | E | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYEGQGTLVTVSS |
| T017000955 | 20 | D | W | Y | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYYGQGTLVTVSS |
| T017000956 | 21 | D | W | L | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYLGQGTLVTVSS |
| T017000957 | 22 | D | W | H | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYHGQGTLVTVSS |
| T017000958 | 23 | D | W | I | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYIGQGTLVTVSS |
| T017000959 | 24 | D | W | Q | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYQGQGTLVTVSS |
| T017000960 | 25 | D | W | V | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYVGQGTLVTVSS |
| T017000961 | 26 | D | W | K | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYKGQGTLVTVSS |
| T017000962 | 27 | D | W | S | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYSGQGTLVTVSS |
| T017000963 | 28 | D | W | G | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYGGQGTLVTVSS |
| T017000964 | 29 | D | W | P | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYPGQGTLVTVSS |
| T017000965 | 30 | D | W | F | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYFGQGTLVTVSS |
| T017000966 | 31 | D | W | T | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYTGQGTLVTVSS |
| T017000967 | 32 | D | Y | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000974 | 33 | E | Y | W | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000975 | 34 | D | W | W | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000976 | 35 | R | Y | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYARSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000977 | 36 | V | Y | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAVSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000978 | 37 | E | Y | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000979 | 38 | A | Y | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAASAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000980 | 39 | Q | Y | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAQSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000981 | 40 | S | Y | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYASSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000982 | 41 | E | Y | Y | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYYGQGTLVTVSS |
| T017000991 | 42 | E | Y | W | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000992 | 43 | E | A | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIAPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000993 | 44 | E | P | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIPPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000994 | 45 | E | D | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIDPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000995 | 46 | E | Q | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIQPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000996 | 47 | E | E | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIEPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000997 | 48 | E | R | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIRPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000998 | 49 | E | F | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIFPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000999 | 50 | E | S | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRISPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017001000 | 51 | E | G | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIGPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017001001 | 52 | E | T | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRITPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017001002 | 53 | E | H | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIHPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017001003 | 54 | E | V | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIVPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017001004 | 55 | E | K | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIKPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017001005 | 56 | E | L | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRILPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017001006 | 57 | E | I | W | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIIPYDYWGQGTLVTVSS |
表
A-5
：
ISVD
變體的
CDR
區的序列（根據
Kabat
定義）
| TCE ISVD | CDR1 | CDR2 | CDR3 | |||
| SEQ ID NO | SEQ ID NO | 序列 | SEQ ID NO | 序列 | SEQ ID NO | 序列 |
| 1 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 2 | 79 | INFYG | 152 | HISIGDQTDYANSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 3 | 79 | INFYG | 153 | HISIGDQTDYAPSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 4 | 79 | INFYG | 154 | HISIGDQTDYAKSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 5 | 79 | INFYG | 155 | HISIGDQTDYARSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 6 | 79 | INFYG | 156 | HISIGDQTDYAISAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 7 | 79 | INFYG | 157 | HISIGDQTDYATSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 8 | 79 | INFYG | 158 | HISIGDQTDYAHSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 9 | 79 | INFYG | 159 | HISIGDQTDYAVSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 10 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 11 | 79 | INFYG | 161 | HISIGDQTDYAASAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 12 | 79 | INFYG | 162 | HISIGDQTDYAYSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 13 | 79 | INFYG | 163 | HISIGDQTDYALSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 14 | 79 | INFYG | 164 | HISIGDQTDYAQSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 15 | 79 | INFYG | 165 | HISIGDQTDYAFSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 16 | 79 | INFYG | 166 | HISIGDQTDYASSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 17 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 18 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 19 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 20 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 21 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 22 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 23 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 24 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 25 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 26 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 27 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 28 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 29 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 30 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 31 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 32 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 168 | LSRIYPYDY |
| 33 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 168 | LSRIYPYDY |
| 34 | 79 | INFYG | 151 | HISIGDQTDYADSAKG | 167 | LSRIWPYDY |
| 35 | 79 | INFYG | 155 | HISIGDQTDYARSAKG | 168 | LSRIYPYDY |
| 36 | 79 | INFYG | 159 | HISIGDQTDYAVSAKG | 168 | LSRIYPYDY |
| 37 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 168 | LSRIYPYDY |
| 38 | 79 | INFYG | 161 | HISIGDQTDYAASAKG | 168 | LSRIYPYDY |
| 39 | 79 | INFYG | 164 | HISIGDQTDYAQSAKG | 168 | LSRIYPYDY |
| 40 | 79 | INFYG | 166 | HISIGDQTDYASSAKG | 168 | LSRIYPYDY |
| 41 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 168 | LSRIYPYDY |
| 42 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 168 | LSRIYPYDY |
| 43 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 169 | LSRIAPYDY |
| 44 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 170 | LSRIPPYDY |
| 45 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 171 | LSRIDPYDY |
| 46 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 172 | LSRIQPYDY |
| 47 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 173 | LSRIEPYDY |
| 48 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 174 | LSRIRPYDY |
| 49 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 175 | LSRIFPYDY |
| 50 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 176 | LSRISPYDY |
| 51 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 177 | LSRIGPYDY |
| 52 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 178 | LSRITPYDY |
| 53 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 177 | LSRIHPYDY |
| 54 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 178 | LSRIVPYDY |
| 55 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 179 | LSRIKPYDY |
| 56 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 180 | LSRILPYDY |
| 57 | 79 | INFYG | 160 | HISIGDQTDYAESAKG | 181 | LSRIIPYDY |
除非另有說明或定義，否則使用的所有術語都具有其在本領域中對技術人員來說清楚的通常含義。例如，參見標準手冊，諸如Sambrook等人 (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版) 第1-3卷, Cold Spring Harbor Laboratory Press)；F. Ausubel等人 (1987, Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York)；Lewin (1985, Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)；Old等人 (1981, Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (第2版) University of California Press, Berkeley, CA)；Roitt等人 (2001, Immunology (第6版) Mosby/Elsevier, Edinburgh)；Roitt等人 (2001, Roitt’s Essential Immunology (第10版) Blackwell Publishing, UK)；和Janeway等人 (2005, Immunobiology (第6版) Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York)，以及本文引用的通用背景技術。
除非另外指明，否則沒有詳細地具體描述的所有方法、步驟、技術和操作可以並且已經按照本身已知的方式進行，這對技術人員來說將是清楚的。例如，再次參見標準手冊和本文提及的通用背景技術以及其中引用的其他參考文獻；以及例如以下綜述；Presta (2006, Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640-56)；Levin和Weiss (2006, Mol. Biosyst. 2(1): 49-57)；Irving等人 (2001, J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45)；Schmitz等人 (2000, Placenta 21 增刊A: S106-12)；Gonzales等人 (2005, Tumor Biol. 26(1): 31-43)，其描述了蛋白質工程化的技術，諸如親和力成熟和用於改善特異性以及蛋白質的其他所需特性諸如免疫球蛋白的其他技術。
如本文所用的術語「序列」（例如，在「免疫球蛋白序列」、「抗體序列」、「可變結構域序列」、「VHH序列」或「蛋白質序列」等術語中）通常應理解為包括相關的胺基酸序列以及編碼所述胺基酸序列的核酸或核苷酸序列，除非上下文需要更限制的解釋。
「胺基酸序列」應解釋為是指單個胺基酸或兩個或更多個胺基酸的無分支序列，這取決於上下文。核苷酸序列應解釋為意指3個或更多個核苷酸的無分支序列。
胺基酸是天然存在的蛋白質中常見的那些L-胺基酸，並且列於表B-1中。那些含有D-胺基酸的胺基酸序列不旨在包含在該定義中。任何含有轉譯後修飾的胺基酸的胺基酸序列都可以描述為最初使用表B-1中所示符號轉譯的具有修飾位置（例如，羥基化或糖基化）的胺基酸序列；但是這些修飾不在胺基酸序列中明確示出。該定義包括任何可以表現為序列修飾的連接、交聯和端帽、非肽基鍵等的肽或蛋白質。
術語「蛋白質」、「肽」、「蛋白質/肽」和「多肽」在整個公開文本中可互換使用，並且各自具有用於本公開文本目的的相同含義。每個術語是指由兩個或更多個胺基酸的直鏈構成的有機化合物。所述化合物可以具有十個或更多個胺基酸；二十五個或更多個胺基酸；五十個或更多個胺基酸；一百個或更多個胺基酸，兩百個或更多個胺基酸，以及甚至三百個或更多個胺基酸。熟練技術人員將理解，儘管不存在本領域公認的區分多肽與蛋白質的胺基酸數量的分界點，但多肽通常比蛋白質包含更少的胺基酸；可以藉由化學合成或重組方法製備多肽；並且通常藉由本領域已知的重組方法在體外或體內製備蛋白質。
除非上下文另有明確要求，否則在整個說明書和申請專利範圍中，詞語「包括」、「包含」等應被解釋為包括性的意義，而不是排他性或窮舉性的意義；也就是說，是「包括但不限於」的意義。
例如，當稱一個核苷酸序列、胺基酸序列或多肽分別「包含」另一個核苷酸序列、胺基酸序列或多肽，或「基本上由」另一個核苷酸序列、胺基酸序列或多肽「組成」時，這可以意味著後一種核苷酸序列、胺基酸序列或多肽已分別併入第一個提及的核苷酸序列、胺基酸序列或多肽中，但更通常這一般意味著第一個提及的核苷酸序列、胺基酸序列或多肽在其序列內分別包含一段分別與後一個序列具有相同核苷酸序列或胺基酸序列的核苷酸或胺基酸殘基，而不論第一個提及的序列是如何實際產生或獲得的（例如，可能是藉由本文所述的任何合適的方法）。藉由非限制性示例方式，當本發明技術的多肽被稱為包含免疫球蛋白單可變結構域時，這可意味著所述免疫球蛋白單可變結構域序列已併入本發明技術的多肽的序列中，但更通常這一般意味著本發明技術的多肽在其序列內含有免疫球蛋白單可變結構域的序列，而不論本發明技術的所述多肽是如何產生或獲得的。此外，當一個核酸或核苷酸序列被稱為包含另一個核苷酸序列時，第一個提及的核酸或核苷酸序列較佳地使得當其表現為表現產物（例如，多肽）時，由後一個核苷酸序列編碼的胺基酸序列形成所述表現產物的一部分（換言之，後一個核苷酸序列與第一個提及的較大核酸或核苷酸序列在相同閱讀框中）。
當胺基酸序列或多肽被稱為「基本上由免疫球蛋白單可變結構域組成」時，意味著所述胺基酸序列或多肽與免疫球蛋白單可變結構域完全相同或對應於如下多肽或胺基酸序列，所述多肽或胺基酸序列在免疫球蛋白單可變結構域的胺基末端、羧基末端、或胺基末端和羧基末端兩者處具有有限數量的胺基酸殘基，如1-20個胺基酸殘基，例如1-10個胺基酸殘基並且較佳1-6個胺基酸殘基，諸如1、2、3、4、5或6個胺基酸殘基。當使用「由……組成」時，意味著胺基酸序列或多肽與免疫球蛋白單可變結構域完全相同。
必須注意的是，如本文所用，單數形式「一個/一種（a）」、「一個/一種（an）」和「所述（the）」包括複數指示物，除非上下文另外清楚地規定。因此，例如，提及「一種試劑」包括一種或多種這樣的不同試劑，並且提及「所述方法」包括提及本領域普通技術人員已知的等同步驟和方法，其可以修改或替代本文所述的方法。
除非另外指示，否則在一系列要素之前的術語「至少」應被理解為是指所述系列中的每個要素。本領域的技術人員僅使用常規實驗就將認識到或能夠確定本文所述的本發明技術的具體實施例的許多等同方案。此類等同方案旨在被本發明技術涵蓋。
術語「和/或」無論在本文哪裡使用時均包括「和」、「或」和「由所述術語連接的要素的所有或任何其他組合」的含義。
如本文所用，術語「約」或「大約」意指給定值或範圍的20%以內，較佳15%以內，更較佳10%以內，並且最較佳5%以內。
6
實例
6.1
實例
1
：
T
細胞接合（
TCE
）
ISVD
的產生和解離速率確定
變體的產生
將ISVD T017000700（SEQ ID NO: 1）中位置61、99和103（Kabat編號）處的胺基酸取代以產生不同變體，所述變體維持功能和整體可開發性，但是在位置61處具有減少的異構化或沒有異構化，並且在位置99和/或103處具有減少的氧化或沒有氧化（Kabat編號）。
ISVD T017000700以及產生的變體ISVD示出於上表A-4中。將所有ISVD用FLAG-HIS標籤（FLAG3-HIS6，SEQ ID NO: 77）標記，使得它們可以在進一步的實驗中進行分析。
與人TCRαβ-拉鍊蛋白的解離速率確定
在ProteOn XPR36儀器（BioRad Laboratories, Inc.）或SPR-32儀器（Bruker Daltonics SPR）上借助基於SPR的測定，藉由確定與重組人TCRαβ-拉鍊蛋白的解離速率常數（kd）來評估TCE ISVD變體與TCRαβ的結合。
ProteOn XPR36
上的設置
藉由表面等離子體共振（SPR）（Bio-rad Laboratories, Inc.，ProteOn XPR36）探測粗提取物單價TCE-FLAG3-HIS6 ISVD構築體與人TCRαβ-拉鍊蛋白（huTCR(2XN9)-拉鍊，內部生產）的結合。使用標準胺偶聯化學將標靶固定在GLC感測器晶片（短矩陣，正常容量）上。以1 : 10的稀釋度注射ISVD構築體的粗提取物（一式兩份）以評估結合參數。將每種ISVD注射120 s，並且在600 s期間評估解離。
藉由減去參考分析物泳道和空白緩衝液注射物來對資料進行雙重參比。使用ProteOn Manager 3.1.0（Bio-rad Laboratories, Inc.，3.1.0.6版），應用Langmuir 1 : 1相互作用模型計算每種相互作用的解離速率常數（kd）。
SPR-32
上的設置
藉由表面等離子體共振（SPR）（Bruker Daltonics SPR，SPR-32）探測粗提取物單價TCE-FLAG3-HIS6 ISVD構築體與人TCRαβ-拉鍊蛋白（huTCR(2XN9)-拉鍊，內部生產）的結合。使用標準胺偶聯化學將標靶固定在高容量胺（HCA）感測器晶片上。以1 : 10的稀釋度注射ISVD構築體的粗提取物以評估結合參數。將每種ISVD注射120 s，並且在600 s期間評估解離。
藉由減去參考點和空白緩衝液注射物來對資料進行雙重參比。使用SPR-32分析儀軟體（Bruker Daltonics SPR，3.2.0.19版），應用Langmuir 1 : 1相互作用模型計算每種相互作用的解離速率常數（kd）。
測量結果可以見於表1-3。
表
1
位置
61
（
Kabat
編號）處的
TCE ISVD
變體和參考
TCE ISVD
構築體對於人
TCRαβ-
拉鍊蛋白的基於
SPR
的解離速率確定
| 人TCRαβ-拉鍊 | |||||
| ISVD ID | 殘基61 | 殘基99 | 殘基103 | kd (1/s) | 相比於參考的kd比率 |
| T017000946 | A | W | W | 3.8E-04 | 1.0 |
| T017000945 | E | W | W | 3.6E-04 | 1.0 |
| T017000950 | F | W | W | 3.5E-04 | 0.9 |
| T017000943 | H | W | W | 3.3E-04 | 0.9 |
| T017000941 | I | W | W | 3.4E-04 | 0.9 |
| T017000939 | K | W | W | 3.5E-04 | 1.0 |
| T017000948 | L | W | W | 3.3E-04 | 0.9 |
| T017000937 | N | W | W | 3.3E-04 | 0.9 |
| T017000938 | P | W | W | 3.6E-04 | 1.0 |
| T017000949 | Q | W | W | 3.8E-04 | 1.0 |
| T017000940 | R | W | W | 3.8E-04 | 1.0 |
| T017000951 | S | W | W | 3.9E-04 | 1.0 |
| T017000942 | T | W | W | 3.4E-04 | 0.9 |
| T017000944 | V | W | W | 3.8E-04 | 1.0 |
| T017000947 | Y | W | W | 3.5E-04 | 0.9 |
| T017000700 (參考) | D | W | W | 3.7E-04 | 1.0 |
如從表1可以看出，對於所有測試的構築體，即在位置61處具有胺基酸殘基A、E、F、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、Y的構築體，如藉由基於SPR的解離速率確定評估的在位置61（Kabat編號）處具有取代的TCE ISVD變體與人TCRαβ-拉鍊蛋白的結合維持在與參考（T017000700）非常相似的水平。
表
2
：位置
99
和位置
61
（
Kabat
編號）（固定為
E
）處的
TCE ISVD
變體和參考
TCE ISVD
構築體對於人
TCRαβ-
拉鍊蛋白的基於
SPR
的解離速率確定
| 人TCRαβ-拉鍊 | |||||
| ISVD ID | 殘基 61 | 殘基 99 | 殘基 103 | kd (1/s) | 相比於參考的 kd 比率 |
| T01700978 | E | Y | W | 4.3E-04 | 1.4 |
| T017000992 | E | A | W | 7.0E-03 | 23 |
| T017000994 | E | D | W | 7.6E-03 | 24 |
| T017000996 | E | E | W | 1.1E-02 | 37 |
| T017000998 | E | F | W | 6.8E-04 | 2 |
| T017001000 | E | G | W | 3.1E-03 | 10 |
| T017001002 | E | H | W | 1.0E-03 | 3 |
| T017001006 | E | I | W | 1.5E-02 | 49 |
| T017001004 | E | K | W | 2.5E-03 | 8 |
| T017001005 | E | L | W | 2.3E-03 | 8 |
| T017000993 | E | P | W | 3.4E-02 | 109 |
| T017000995 | E | Q | W | 1.9E-02 | 61 |
| T017000997 | E | R | W | 1.9E-03 | 6 |
| T017000999 | E | S | W | 3.8E-03 | 12 |
| T017001001 | E | T | W | 4.2E-03 | 14 |
| T017001003 | E | V | W | 6.3E-03 | 20 |
| T017000700 (參考) | D | W | W | 3.1E-04 | 1.0 |
如從表2可以看出，在殘基61固定為麩胺酸（E）的構築體中，測試了在位置99（Kabat編號）處具有取代的TCE ISVD變體與人TCRαβ-拉鍊蛋白的結合。在基於SPR的解離速率確定中，所有測試的變體（即，在位置99處具有殘基Y、A、D、E、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、T、V）維持了可檢測的與人TCRαβ-拉鍊蛋白的結合水平，然而，解離速率的範圍為比與參考T017000700快高達大約100倍。
表
3
：位置
103
（
Kabat
編號）處的
TCE ISVD
變體和參考
TCE ISVD
構築體對人
TCRαβ-
拉鍊蛋白的基於
SPR
的解離速率確定
| 人TCRαβ-拉鍊 | |||||
| ISVD ID | 殘基 61 | 殘基 99 | 殘基 103 | kd (1/s) | 相比於參考的 kd 比率 |
| T017000953 | D | W | A | 2.0E-04 | 0.5 |
| T017000954 | D | W | E | 3.7E-04 | 1.0 |
| T017000965 | D | W | F | 3.8E-04 | 1.0 |
| T017000963 | D | W | G | 無結合 | 無結合 |
| T017000957 | D | W | H | 2.7E-04 | 0.7 |
| T017000958 | D | W | I | 2.5E-04 | 0.7 |
| T017000961 | D | W | K | 3.4E-04 | 0.9 |
| T017000956 | D | W | L | 2.4E-04 | 0.6 |
| T017000964 | D | W | P | 無結合 | 無結合 |
| T017000959 | D | W | Q | 2.6E-04 | 0.7 |
| T017000952 | D | W | R | 4.7E-04 | 1.3 |
| T017000962 | D | W | S | 3.6E-04 | 1.0 |
| T017000966 | D | W | T | 3.1E-04 | 0.8 |
| T017000960 | D | W | V | 2.5E-04 | 0.7 |
| T017000955 | D | W | Y | 4.4E-04 | 1.2 |
| T017000700 (參考) | D | W | W | 3.8E-04 | 1.0 |
如表3可以看出，對於在位置103處具有胺基酸殘基A、E、F、H、I、K、L、Q、R、S、T、V、Y的構築體，如藉由基於SPR的解離速率確定評估的在Kabat位置103處具有取代的TCE ISVD變體與人TCRαβ-拉鍊蛋白的結合維持在與參考T017000700非常相似的水平，而對於在位置103處具有胺基酸殘基G或P的構築體未觀察到結合。
基於SPR分析的結果，可以得出以下結論：當取代參考T017000700序列中位置61、99和103（Kabat編號）中的一個或多個處的胺基酸時，可以獲得與TCR結合的功能性ISVD。
選擇了許多產生的ISVD，並且在下面將討論的另外的實驗中進行進一步分析。
6.2
實例
2
：
TCE ISVD
變體的生物物理特性（
Tm
、
Tagg
和寡聚化）的確定
熱位移測定（TSA）中解鏈溫度的確定
熱位移測定（TSA）在LightCycler 480II機器（Roche）上的96孔板中進行。每行中，在以下pH下分析一種ISVD：4、5、6、7、8和9。每孔中，將5 μL ISVD樣品（在PBS中為0.8 mg/mL）添加到5 μL Sypro Orange（在MilliQ水中為40x；Invitrogen目錄號S6551）和10 μL緩衝液（100 mM磷酸鹽、100 mM硼酸鹽、100 mM檸檬酸鹽和115 mM NaCl，pH範圍為3.5至9）。施加的溫度梯度（37ºC至99ºC，速率為0.03ºC/s）誘導ISVD展開，從而疏水性小塊（patch）變成暴露的。Sypro Orange與那些疏水性小塊結合，導致螢光強度增加（Ex/Em = 465/580 nm）。在pH 7時螢光強度曲線的一階導數的拐點用作解鏈溫度的量度。
聚集開始溫度測定（Tagg測定）
使用DynaPro讀板儀（Wyatt）藉由動態光散射（DLS）確定ISVD蛋白開始聚集的溫度（= 聚集開始溫度 = Tagg）。為此，使用在大腸桿菌（
E. coli）中產生、經由IMAC然後製備型SEC純化、過濾（0.22 µm）、濃度為1 mg/mL（D-PBS）的具有3xFLAG-HIS6標籤的ISVD（SEQ ID NO: 77）。解凍後，將樣品在0.1 µm膜上過濾，並且以14000 rpm離心5 min。將30 µL（4個重複）的樣品以0.25ºC/分鐘的恒定速率從40ºC加熱至80ºC，並且連續記錄光散射強度。將由測量強度得出的流體動力學半徑針對溫度進行繪圖，以確定半徑開始增加時的溫度（= Tagg，ºC）。
寡聚化測定
藉由分析型尺寸排阻層析（SE-HPLC）研究單價ISVD在應激條件下（45ºC下1週）的寡聚化傾向。為此，使用在大腸桿菌中產生、經由IMAC然後製備型SEC純化、過濾（0.22 µm）、濃度為1 mg/mL（DPBS）的具有3xFLAG-HIS6標籤的ISVD。比較兩份100 µL等分試樣的SE-HPLC譜：將一份樣品在-20ºC下培育1週，並且將另一份樣品在45ºC下培育1週。藉由在20000 RCF下離心5分鐘使樣品澄清，並且隨後將其在Acquity UPLC BEH200 SEC（移動相750 mM L-精胺酸，HCl + 10 mM磷酸鹽pH 7.0，流速0.4 mL/分鐘）上進行分析。計算應激樣品（+45ºC）和非應激樣品（-20ºC）的相對峰前面積的差異並且將其報告為Δ%寡聚（= %寡聚1W 45ºC - %寡聚T0）。
結果
根據解鏈溫度（Tm）、聚集開始（Tagg）和在45ºC下1週後的寡聚化表徵在位置61、99和103（Kabat編號）處具有選定胺基酸取代的TCE ISVD的純化變體（參見表A-4），如表4和表5所說明。
在TCE ISVD的位置61處，選擇胺基酸殘基變體A、E、P、Q、R、S、V，因為這些是人VH基因中此位置最常見的殘基。
在TCE ISVD的位置99處，選擇胺基酸殘基變體A、H、Q、S、T和Y。選擇Y，因為它是對相應ISVD變體與TCRαβ結合的解離速率影響最小的殘基（表2）。選擇殘基A、H、Q、S、T，因為相應的TCE ISVD代表一系列不同的與TCRαβ結合的解離速率。
在大約95%的人VH基因和天然存在的ISVD [序列的內部分析] 中，在kabat位置103處發現色胺酸（W）。可以在
天然存在的 ISVD的位置103處發現的其他殘基是Y、R和S。因此，選擇Y、R、S用於位置103處的胺基酸殘基變體。
表
4
：位置
61
和位置
99
處的
TCE ISVD
變體和參考
TC017000700
的生物物理特性（
Tm
、
Tagg
和寡聚化）
| ISVD ID | Tm | 相比於參考的 ΔTm ( ºC ) | Tagg | 相比於參考的 Δtagg ( ºC ) | Δ% 寡聚 | 相比於參考的 Δ% 寡聚 |
| T017000700 | 72.0 | - | 68 | - | 0.2 | - |
| T017000938 | 72.0 | 0.0 | 66 | -2 | 1.0 | 0.8 |
| T017000940 | 68.6 | -3.4 | 60 | -8 | 0.9 | 0.7 |
| T017000944 | 72.0 | 0.0 | 61 | -7 | 0.9 | 0.7 |
| T017000945 | 72.5 | 0.5 | 68 | 0 | 0.6 | 0.4 |
| T017000946 | 70.0 | -2.0 | 64 | -4 | 0.7 | 0.5 |
| T017000949 | 69.6 | -2.4 | 64 | -4 | 1.1 | 0.9 |
| T017000951 | 70.0 | -2.0 | 63 | -5 | 1.0 | 0.8 |
| T017000967 | 72.0 | 0.0 | 73 | 5 | 0.4 | 0.2 |
| T017000975 | 73.4 | 1.4 | 71 | 3 | 1.5 | 1.3 |
| T017000976 | 69.6 | -0.4 | 64 | -4 | 0.9 | 0.7 |
| T017000977 | 70.5 | -1.5 | 65 | -3 | 1.6 | 1.4 |
| T017000978 | 73.0 | 1.0 | 71 | 3 | 0.0 | -0.2 |
| T017000979 | 71.5 | -0.5 | 68 | 0 | 1.7 | 1.5 |
| T017000980 | 70.5 | -1.5 | 67 | -1 | 0.1 | -0.1 |
| T017000981 | 70.5 | -1.5 | 68 | 0 | 1.3 | 1.1 |
| T017000992 | 73.0 | 1.0 | 73 | 5 | 0.2 | 0.0 |
| T017000995 | 71.0 | -1.0 | 73 | 5 | 0.1 | -0.1 |
| T017000999 | 72.0 | 0.0 | 72 | 4 | 0.1 | -0.1 |
| T017001001 | 71.0 | -1.0 | 68 | 0 | 0.3 | 0.1 |
| T017001002 | 72.0 | 0.0 | 69 | 1 | 0.2 | 0.0 |
表
5
：位置
103
處的
TCE ISVD
變體和參考
TC017000700
的生物物理特性（
Tm
、
Tagg
和寡聚化）
| ISVD ID | Tm ( ºC ) | 相比於參考的 ΔTm ( ºC ) | Tagg ( ºC ) | 相比於參考的 ΔTagg ( ºC ) | Δ% 寡聚 |
| T017000982 | 64.7 | -7.3 | 61 | 7 | 0.1 |
| T017000955 | 63.2 | -8.8 | 57 | 11 | 0.3 |
| T017000952 | 56.9 | -15.1 | 48 | 20 | 0.2 |
| T017000962 | 59.3 | -12.7 | 53 | 15 | 0.3 |
如從表4可以看出，與參考T017000700相比，T017000978、T017000992、T017000999和T017001002具有維持或改善的所有三種特性。對於Tm，觀察到從0ºC增加至1ºC，對於Tagg，觀察到從1ºC增加至5ºC，並且觀察到寡聚分數從參考的0.2%減少到根據本發明技術的ISVD的0.0%或0.1%。
令人驚訝地，如從表5可以看出，儘管位置103處的ISVD變體的TCR結合沒有受到影響，但是與參考ISVD相比，此位置處的取代導致解鏈溫度降低7.3ºC至15.1ºC並且聚集開始溫度降低7ºC至20ºC。這表明W103可能對TCE ISVD的生物物理穩定性很重要。
因此，進一步向前，決定保持位置103處的色胺酸，同時改變位置61和99處的胺基酸殘基。
6.3
實例
3
：
TCE ISVD
變體對人和食蟹猴
TCRαβ
蛋白的親和力確定
藉由表面等離子體共振（SPR）（Bio-rad Laboratories, Inc.，ProteOn XPR36）探測純化的單價TCE-FLAG3-HIS6和TCE-HIS6 ISVD構築體與人TCRαβ-拉鍊蛋白（huTCR(2XN9)-拉鍊，內部生產）和食蟹猴TCRαβ-拉鍊蛋白（cyTCR(AEA41865)-拉鍊，內部生產）的結合。使用標準胺偶聯化學將兩種標靶均固定在GLC感測器晶片（短矩陣，正常容量）上。在多循環動力學（MCK）實驗中將ISVD構築體以6種不同濃度注射。將每種濃度的ISVD注射120 s，並且在600 s期間評估解離。
藉由減去參考分析物泳道和空白緩衝液注射物來對資料進行雙重參比。使用ProteOn Manager 3.1.0（Bio-rad Laboratories, Inc.，3.1.0.6版），應用Langmuir 1 : 1相互作用模型計算親和力常數（ka、kd和K
D）。
TCE ISVD胺基酸變體對人和食蟹猴TCRαβ-拉鍊蛋白的親和力測量的結果總結於下表6和表7中。使用T017000700作為參考。
表
6
：
TCE ISVD
變體和參考
T017000700
結合人
TCRαβ-
拉鍊融合蛋白的基於
SPR
的動力學確定
| 人TCRαβ-拉鍊 | ||||
| ISVD ID | ka (1/Ms) | kd (1/s) | K D (M) | 相比於參考的 K D 比率 |
| T017000700 | 1.3E+05 | 3.7E-04 | 2.5E-09 | 1.0 |
| T017000938 | 1.7E+05 | 3.6E-04 | 2.1E-09 | 0.9 |
| T017000940 | 2.0E+05 | 3.8E-04 | 1.9E-09 | 0.8 |
| T017000944 | 1.6E+05 | 3.8E-04 | 2.3E-09 | 0.9 |
| T017000945 | 1.6E+05 | 3.6E-04 | 2.3E-09 | 0.9 |
| T017000946 | 1.7E+05 | 3.8E-04 | 2.3E-09 | 0.9 |
| T017000949 | 1.8E+05 | 3.8E-04 | 2.1E-09 | 0.9 |
| T017000951 | 1.6E+05 | 3.9E-04 | 2.5E-09 | 1.0 |
| T017000967 | 1.1E+05 | 4.8E-04 | 4.4E-09 | 1.8 |
| T017000975 | 1.4E+05 | 5.5E-04 | 3.8E-09 | 1.5 |
| T017000976 | 1.5E+05 | 5.7E-04 | 3.9E-09 | 1.6 |
| T017000977 | 1.1E+05 | 5.2E-04 | 4.5E-09 | 1.8 |
| T017000978 | 1.1E+05 | 5.2E-04 | 5.0E-09 | 2.0 |
| T017000979 | 1.1E+05 | 5.6E-04 | 4.9E-09 | 2.0 |
| T017000980 | 1.3E+05 | 5.5E-04 | 4.1E-09 | 1.7 |
| T017000981 | 1.2E+05 | 5.3E-04 | 4.4E-09 | 1.8 |
| T017000995 | 3.3E+04 | 3.3E-02 | 1.0E-06 | 404 |
| T017000999 | 3.8E+04 | 5.3E-03 | 1.4E-07 | 56 |
| T017001001 | 2.5E+04 | 8.6E-03 | 3.5E-07 | 141 |
表
7
：
TCE ISVD
變體和參考
T017000700
結合食蟹猴
TCRαβ-
拉鍊融合蛋白的基於
SPR
的動力學確定
| 食蟹猴TCRαβ-拉鍊 | |||||
| ISVD ID | ka (1/Ms) | kd (1/s) | K D(M) | 相比於參考的 K D 比率 | K D 比率 cy/huTCR |
| T017000700 | 2.2E+05 | 1.8E-03 | 8.0E-09 | 1.0 | 3.3 |
| T017000938 | 2.8E+05 | 1.9E-03 | 6.7E-09 | 0.8 | 3.2 |
| T017000940 | 3.2E+05 | 1.9E-03 | 6.1E-09 | 0.8 | 3.2 |
| T017000944 | 2.8E+05 | 1.9E-03 | 7.0E-09 | 0.9 | 3.0 |
| T017000945 | 2.6E+05 | 1.8E-03 | 7.1E-09 | 0.9 | 3.1 |
| T017000946 | 2.7E+05 | 1.9E-03 | 7.0E-09 | 0.9 | 3.1 |
| T017000949 | 2.8E+05 | 1.9E-03 | 6.8E-09 | 0.8 | 3.2 |
| T017000951 | 2.6E+05 | 2.0E-03 | 7.4E-09 | 0.9 | 3.0 |
| T017000967 | 2.0E+05 | 2.8E-03 | 1.4E-08 | 1.7 | 3.1 |
| T017000975 | 2.3E+05 | 3.4E-03 | 1.5E-08 | 1.8 | 3.9 |
| T017000976 | 2.3E+05 | 3.5E-03 | 1.5E-08 | 1.9 | 3.9 |
| T017000977 | 1.8E+05 | 3.5E-03 | 1.9E-08 | 2.4 | 4.3 |
| T017000978 | 1.7E+05 | 3.3E-03 | 2.0E-08 | 2.5 | 4.0 |
| T017000979 | 1.8E+05 | 3.5E-03 | 1.9E-08 | 2.3 | 3.8 |
| T017000980 | 2.1E+05 | 3.4E-03 | 1.7E-08 | 2.1 | 4.0 |
| T017000981 | 2.1E+05 | 3.5E-03 | 1.7E-08 | 2.1 | 3.8 |
| T017000995 | 4.7E+04 | 9.3E-02 | 2.0E-06 | 246 | 2.0 |
| T017000999 | 5.1E+04 | 1.8E-02 | 3.5E-07 | 43 | 2.5 |
| T017001001 | 3.2E+04 | 3.4E-02 | 1.1E-06 | 133 | 3.1 |
如從表6和表7可以看出，對於所有測試構築體，除T017000995、T017000999和T017001001外，TCE ISVD變體的親和力與參考TCE ISVD保持相當（K
D值在2.5倍以內）。
每種ISVD對食蟹猴TCRαβ蛋白的K
D是對人TCRαβ蛋白的K
D的2-4倍。這表明根據本發明技術的ISVD具有開發和用於人治療性應用的潛力。
6.4
實例
4
：單價
TCE ISVD
與純化的原代人
T
細胞的結合
在流式細胞術中測試根目錄據本發明技術的TCE ISVD與人T細胞的結合。測試以下ISVD：T017000700（參考）、T017000978、T017000995、T017000999和T017001001。還添加陰性對照。包括未染色細胞（US）、僅用GaM-PE染色的細胞以及僅用ANTI-FLAG® M2抗體和GaM-PE（a-FLAG + GaM-PE）染色的細胞作為陰性對照。
簡而言之，將細胞收穫並且轉移到V型底96孔板（在50 µL中的5x1E4個細胞/孔），並且在FACS緩衝液（D-PBS（Gibco，14190），具有2% FBS（Sigma，F7524）和0.05%迭氮化鈉（Acros organics，19038））中與TCE ISVD的系列稀釋液一起在4ºC下培育3.5小時。
接下來，將細胞用FACS緩衝液洗滌3次，並且與1 µg/ml /mL單株ANTI-FLAG® M2抗體（Sigma F1804）一起在4ºC下培育30 min，再次洗滌，並且與1/100稀釋的R-藻紅蛋白綴合的AffiniPure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG（Fc y片段特異性）（Jackson Immunoresearch，115-116-071；稱為GaM-PE）一起在4ºC下培育30 min。
隨後，將細胞重懸於補充有5 nM TO-PRO®-3碘化物（642⁄661）（Life Technologies - Molecular Probes，T3605）的FACS緩衝液中，以區分活細胞與死細胞。染色後，使用MACSQuant®流式細胞儀（Miltenyi）使用FlowLogic軟體分析細胞。首先，基於FSC-SSC分佈選擇占總細胞群體大於80%的P1群體。從此群體（P1）中排除TO-PRO®-3碘化物陽性（死）細胞，並且計算平均螢光強度PE值。
測量結果可以見於圖1。如所預期，在沒有TCE ISVD的對照條件下沒有觀察到人T細胞的染色。此外，如可以從此圖中看出，基於測量的平均螢光強度，T017000978具有與參考T017000700相當的染色。變體T017000995、T017000999和T017001001具有低得多的染色，這對應於如表6所示的在拉鍊蛋白上確定的結合親和力。
6.5
實例
5
：
TCE-CD123-ALB
構築體的產生
將TCE ISVD變體形式變化為多特異性ISVD構築體，其具有藉由9GS連接子連接的針對CD123的腫瘤錨定ISVD構建單元和針對人血清白蛋白的ISVD構建單元。將TCE變體構建單元放置在N末端位置（位置1）或第二位置（位置2）；然後將抗CD123構建單元分別放置在位置2或位置1。在所有構築體中，將抗人血清白蛋白構建單元放置在C末端位置3。除了TCE構建單元中位置61和位置99（Kabat編號）處的取代之外，當將TCE構建單元放置在多特異性構築體中的位置1處時，將所述TCE構建單元的第一殘基維持為E或改變為D。通常引入E1D突變以避免焦麩胺酸鹽形成。產生的構築體列於下表8中。參考構築體T017001017包括參考TCR結合ISVD T017000700。
表
8
：
TCE-CD123-ALB
和
CD123-TCE-ALB
構築體的列表
| CD123-TCE-ALB/TCE-CD123-ALB | 構築體中的抗TCR ISVD | 構築體中TCE的Kabat位置變體 | |||||
| 樣品 ID | SEQ ID NO | 名稱 | 構築體中的 TCE 位置 | 殘基 1 | 殘基 61 | 殘基 99 | 殘基 103 |
| T017001017 | 58 | T017000700 | 1 | E | D | W | W |
| T017001018 | 59 | T017000978 | 1 | E | E | Y | W |
| T017001019 | 60 | T017001001 | 1 | E | E | T | W |
| T017001020 | 61 | T017000999 | 1 | E | E | S | W |
| T017001021 | 62 | T017000995 | 1 | E | E | Q | W |
| T017001022 | 63 | T017000975 | 1 | D | D | W | W |
| T017001023 | 64 | T017000991 | 1 | D | E | Y | W |
| T017001024 | 65 | T017001001 (E1D) | 1 | D | E | T | W |
| T017001025 | 66 | T017000999 (E1D) | 1 | D | E | S | W |
| T017001026 | 67 | T017000995 (E1D) | 1 | D | E | Q | W |
| T017001027 | 68 | T017000700 | 2 | E | D | W | W |
| T017001028 | 69 | T017000978 | 2 | E | E | Y | W |
| T017001029 | 70 | T017001001 | 2 | E | E | T | W |
| T017001030 | 71 | T017000999 | 2 | E | E | S | W |
| T017001031 | 72 | T017000995 | 2 | E | E | Q | W |
在以上所列構築體中使用以下TCE ISVD構建快：
對於T017001017和T017001027，使用參考TCE ISVD T017000700（SEQ ID NO: 1）。
對於T017001018和T017001028，使用T017000978（SEQ ID NO: 37）。
對於T017001019、T017001024和T017001029，使用T017001001（SEQ ID NO: 52）。T017001024進一步含有在TCE ISVD中的E1D突變。
對於T017001020、T017001025和T017001030，使用T017000999（SEQ ID NO: 50）。T017001025進一步含有在TCE ISVD中的E1D突變。
對於T017001021、T017001026和T017001031，使用T017000995（SEQ ID NO 46）。T017001026進一步含有在TCE ISVD中的E1D突變。
對於T017001022，使用T017000975（SEQ ID NO: 34）。這是具有E1D突變的T017000700。
對於T017001023，使用T017000991（SEQ ID NO: 42）。這是具有E1D突變的T017000978。
6.6
實例
6
：
TCE-CD123-ALB
構築體對人和食蟹猴
TCRαβ-
拉鍊蛋白的親和力確定
藉由表面等離子體共振（SPR）（Cytiva，Biacore 8K+）探測純化的TCE-CD123-ALB和CD123-TCE-ALB ISVD構築體與人TCRαβ-拉鍊蛋白（huTCR(2XN9)-拉鍊，內部生產）和食蟹猴TCRαβ-拉鍊蛋白（cyTCR(AEA41865)-拉鍊，內部生產）的結合。使用標準胺偶聯化學將兩種標靶均固定在CM5感測器晶片上。在多循環動力學實驗中，將總共15種ISVD構築體（表8）以12種不同濃度（從20 µM到0.84 nM的連續稀釋液）注射。將每種濃度的ISVD注射180 s，並且在600 s期間評估解離。
藉由減去參考流通池（FC）和空白緩衝液注射物來對資料進行雙重參比。使用Biacore Insight評價軟體（Cytiva，3.0.12.15655版），應用Langmuir 1 : 1相互作用模型計算親和力常數（ka，kd和K
D）。15種多價ISVD構築體（表8）對人TCRαβ蛋白的親和力測量的結果總結於表9中並且對食蟹猴TCRαβ蛋白的親和力測量的結果總結於表10中。
表
9
：
TCE-CD123-ALB
構築體對人
TCRαβ-
拉鍊蛋白的親和力確定
| 對人TCR-拉鍊蛋白的動力學 | ||||
| 樣品 ID | ka (1/Ms) | kd (1/s) | K D (M) | 相對於 T017001017 的倍數變化 K D |
| T017001017 | 7.7E+04 | 3.3E-04 | 4.3E-09 | 1 |
| T017001018 | 6.1E+04 | 4.6E-04 | 7.6E-09 | 2 |
| T017001019 | 1.4E+04 | 6.9E-03 | 5.0E-07 | 116 |
| T017001020 | 2.3E+04 | 4.6E-03 | 2.0E-07 | 47 |
| T017001021 | 1.8E+04 | 2.7E-02 | 1.5E-06 | 360 |
| T017001022 | 8.5E+04 | 4.4E-04 | 5.2E-09 | 1 |
| T017001023 | 7.2E+04 | 6.6E-04 | 9.1E-09 | 2 |
| T017001024 | 1.8E+04 | 1.5E-02 | 8.7E-07 | 205 |
| T017001025 | 2.5E+04 | 7.0E-03 | 2.8E-07 | 65 |
| T017001026 | 2.5E+04 | 4.3E-02 | 1.8E-06 | 412 |
| T017001027 | 1.3E+04 | 5.9E-04 | 4.5E-08 | 11 |
| T017001028 | 1.1E+04 | 6.9E-04 | 6.3E-08 | 15 |
| T017001029 | 3.6E+03 | 1.4E-02 | 3.8E-06 | 897 |
| T017001030 | 6.0E+03 | 5.6E-03 | 9.2E-07 | 216 |
| T017001031 | 5.5E+03 | 3.9E-02 | 7.0E-06 | 1654 |
表
10
：
TCE-CD123-ALB
構築體對食蟹猴
TCRαβ-
拉鍊蛋白的親和力確定
| 對食蟹猴TCR-拉鍊蛋白的動力學 | |||||
| 樣品 ID | ka (1/Ms) | kd (1/s) | K D (M) | 相對於 T017001017 的倍數變化 K D | K D 比率 cy/huTCR |
| T017001017 | 1.2 E+05 | 1.5 E-03 | 1.3 E-08 | 1 | 2.9 |
| T017001018 | 1.2 E+05 | 3.9 E-03 | 3.2 E-08 | 3 | 4.2 |
| T017001019 | 1.7 E+04 | 2.8 E-02 | 1.6 E-06 | 129 | 3.3 |
| T017001020 | 2.8 E+04 | 1.6 E-02 | 5.5 E-07 | 44 | 2.8 |
| T017001021 | 2.4 E+04 | 8.2 E-02 | 3.4 E-06 | 274 | 2.2 |
| T017001022 | 1.5 E+05 | 2.3 E-03 | 1.5 E-08 | 1 | 2.9 |
| T017001023 | 1.9 E+05 | 7.0 E-03 | 3.7 E-08 | 3 | 4.1 |
| T017001024 | 2.2 E+04 | 5.1 E-02 | 2.4 E-06 | 189 | 2.7 |
| T017001025 | 3.0 E+04 | 2.3 E-02 | 7.8 E-07 | 63 | 2.8 |
| T017001026 | 2.9 E+04 | 1.1 E-01 | 3.9 E-06 | 313 | 2.2 |
| T017001027 | 3.0 E+04 | 5.8 E-03 | 1.9 E-07 | 15 | 4.3 |
| T017001028 | 1.6 E+04 | 6.5 E-03 | 4.0 E-07 | 32 | 6.4 |
| T017001029 | 5.3 E+03 | 4.8 E-02 | 9.1 E-06 | 728 | 2.4 |
| T017001030 | 7.5 E+03 | 2.7 E-02 | 3.6 E-06 | 286 | 3.9 |
| T017001031 | 8.7E+03 | 1.5E-01 | 1.8E-05 | 1402 | 2.5 |
表9和表10顯示，當在構築體中使用時，根據本發明技術的TCE ISVD變體保持其與TCR結合的能力。這表明根據本發明技術的TCE ISVD變體可以與靶向ISVD組合使用。因此，它們適於開發和用於靶特異性治療性應用。
6.7
實例
7
：
TCE-CD123-ALB ISVD
構築體與純化的原代人
T
細胞的結合的確定
使用流式細胞術確定根據本發明技術的TCE-CD123-ALB ISVD構築體對原代人T細胞的劑量依賴性結合。使用以下構築體：T017001017（參考）、T017001018、T017001019、T017001020和T017001021。包括未染色細胞（US）、僅用GaM-PE染色的細胞以及僅用ABH0074和GaM-PE（ABH0074 + GaM-PE）染色的細胞作為陰性對照。
簡而言之，將細胞收穫並且轉移到V型底96孔板（在50 µL中的5x1E4個細胞/孔），並且在FACS緩衝液（D-PBS（Gibco，14190），具有2% FBS（Sigma，F7524）和0.05%迭氮化鈉（Acros organics，19038））中與TCE-CD123-ALB ISVD構築體的系列稀釋液一起在4ºC下培育2.5小時。
接下來，將細胞用FACS緩衝液洗滌3次並且與10 µg/mL 抗VHH mAb（內部製備）一起在4ºC下培育30 min，再次洗滌，並且與1/100稀釋的R-藻紅蛋白綴合的AffiniPure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG（Fc y片段特異性）（Jackson Immunoresearch，115-116-071）一起在4ºC下培育30 min。隨後，將細胞重懸於補充有5 nM TO-PRO®-3碘化物（642⁄661）（Life Techn. - Molecular Probes，T3605）的FACS緩衝液中，以區分活細胞與死細胞。染色後，使用MACSQuant®流式細胞儀（Miltenyi）使用FlowLogic軟體分析細胞。首先，基於FSC-SSC分佈選擇占總細胞群體大於80%的P1群體。從此群體（P1）中排除TO-PRO®-3碘化物陽性（死）細胞，並且計算平均螢光強度PE值。
測量的結果示出於圖2中。如所預期，在沒有TCE ISVD的對照條件下沒有觀察到人T細胞的染色。此外，如從此圖可以看出，T017001018（包含TCE ISVD T017000978）和參考T017001017（包含TCE ISVD T017000700）以相似的EC50與人T細胞結合。在另一方面，T017001019（包含TCE ISVD T017000995）、T017001020（包含TCE ISVD T017000999）和T017001021（包含TCE ISVD T017001001）對人T細胞具有較低的結合親和力。這對應於如表9所示的在對拉鍊蛋白上觀察到的結合。
6.8
實例
8
：多特異性
TCE-CD123-ALB
構築體誘導人
T
細胞介導的靶細胞殺傷
基於流式細胞術的細胞毒性測定
在基於流式細胞術的細胞毒性測定中，使用人原代T細胞作為效應細胞以及非貼壁靶細胞，針對重定向T細胞介導的殺傷來進一步表徵根據本發明技術的ISVD構築體。根據製造商的說明，使用PKH26紅色螢光細胞連接子套組（Sigma，PKH26GL-1KT）用4 μM PKH26膜染料標記靶細胞。將效應細胞（2.5 x 105個細胞/孔）和PKH26標記的靶細胞（2.5 x 104個細胞/孔）在96孔V型底板（Greiner Bio-one，# 651 180）中在靶細胞株的測定培養基（具有1%青黴素/鏈黴素（Life Technologies，15140）和30 μM Alburex HSA（CSL Behring，2160-679）的標靶生長培養基）中共同培育（效應子與標靶比率為10 : 1）。為了分析濃度依賴性細胞裂解，將標靶測定培養基中ISVD構築體的系列稀釋液添加到細胞中，並且在37ºC下在5% CO2氣氛中培育18 h。培育後，藉由離心使細胞沈澱並且用FACS緩衝液（D-PBS（Gibco，14190），具有10% FBS（Sigma，F7524）和0.05%迭氮化鈉（Acros organics，19038））洗滌。隨後，將細胞重懸於補充有5 nM TO-PRO®-3碘化物（642⁄661）（ThermoFisher Scientific，T3605）的100 μL FACS緩衝液中，以區分活細胞與死細胞。使用MACSQuant X流式細胞儀（Miltenyi Biotec）分析細胞。每個樣品採集的總樣品體積為70 μL。對PKH26陽性細胞設置門控，並且在該群體中確定TO-PRO®-3陽性細胞。特異性裂解百分比 = ((% TO-PRO-3+無構築體 - % TO-PRO-3+有構築體)/ % TO-PRO-3+無構築體)) x100。在存在過量HSA的情況下進行測定，以使ISVD如上所述被HSA完全飽和。
結果
為了評估TCE ISVD變體作為T細胞接合器的功能，如上所述，在基於流式細胞術的T細胞介導的MOLM-13細胞殺傷測定中，使用人原代T細胞（兩名供體）與表現CD123的人MOLM-13靶細胞株組合，在存在30 μM HSA的情況下，評價表8中所列的TCE-CD123-ALB形式。這些結果的說明示出於圖3A-圖3F中。計算的靶細胞殺傷的EC50值示出於表11中。
表
11
：在基於流式細胞術的人
T
細胞介導的
MOLM-13
細胞殺傷測定中，使用
10
比
1
的效應子與標靶比率，在存在
30 μM HSA
的情況下，
TCE-CD123-ALB
構築體的
EC50
(M)
| MOLM-13耗盡 | |||
| 樣品 ID | 構築體中的 TCE 位置 | 供體 #1 EC50 (M) | 供體 #2 EC50 (M) |
| T017001017 | 1 | 4.5E-11 | 9.2E-11 |
| T017001018 | 1 | 3.3E-11 | 1.0E-10 |
| T017001019 | 1 | 1.5E-10 | 5.2E-10 |
| T017001020 | 1 | 4.7E-11 | 2.3E-10 |
| T017001021 | 1 | 2.3E-10 | 2.1E-09 |
| T017001022 | 1 | 1.5E-11 | 1.4E-10 |
| T017001023 | 1 | 2.4E-11 | 1.1E-10 |
| T017001024 | 1 | 1.8E-10 | 9.8E-10 |
| T017001025 | 1 | 6.6E-11 | 3.4E-10 |
| T017001026 | 1 | 3.4E-10 | 4.4E-09 |
| T017001027 | 2 | 5.7E-10 | 2.8E-09 |
| T017001028 | 2 | 6.7E-10 | 3.2E-09 |
| T017001029 | 2 | 負 | 負 |
| T017001030 | 2 | 5.8E-09 | 負 |
| T017001031 | 2 | 負 | 負 |
如從表11和圖3可以看出，其中TCE構建單元位於N末端位置（位置1）的所有構築體都介導了靶細胞的有效力的細胞殺傷。此外，TCE ISVD的第一位置從麩胺酸到天門冬胺酸的突變對構築體的殺傷效力沒有顯著影響。此外，當與將相同的TCE ISVD放置在構築體的第二位置相比時，在構築體的N末端位置具有TCE ISVD似乎會導致效力增加。
令人驚訝地，與其他構築體相比，對TCR拉鍊蛋白和人T細胞具有較低親和力的ISVD構築體T017001019、T017001020和T017001021（分別含有TCE ISVD T017001001、T01700999和T017000995）具有高的靶細胞殺傷效力。事實上，即使在人TCR拉鍊蛋白以及人T細胞上觀察到的親和力比參考低40多倍（參見表6和表9以及圖1和圖2），靶細胞殺傷的效力也沒有顯著差異。
據報導，與對腫瘤相關標靶的親和力相比，對T細胞受體的低親和力對於分佈到腫瘤組織（相比於富含T細胞的次級淋巴組織）是重要的。期望優先靶向腫瘤組織以減少T細胞介導的標靶清除。
因此，這些對TCR具有低親和力和對靶細胞殺傷具有高效力的特定ISVD構築體可以為產生T細胞接合生物治療劑提供獨特的可能性，所述T細胞接合生物治療劑維持高效力，但是由於較高的腫瘤組織暴露，可以以較低的水平用劑，這進而可以降低毒性風險。
總之，根據本發明技術的TCE ISVD變體非常適合用於人的標靶特異性治療性應用的構築體中。
6.9
實例
9
：多特異性
TCE-CD123-ALB
構築體誘導的人和食蟹猴
T
細胞介導的
KG-1a
細胞的靶細胞殺傷
為了評估TCE-CD123-ALB ISVD構築體是否能夠殺傷腫瘤細胞，用分離的人或食蟹猴T細胞作為效應細胞，進行細胞毒性測定。測試ISVD構築體T017001017、T017001018、T017001019、T017001020和T017001021。包括T017000968（SEQ ID NO: 75）作為陰性對照。T017000968包含抗TCR ISVD T017000975和白蛋白結合ISVD，但是不包含抗CD123 ISVD。
在基於流式細胞術的測定中藉由TCE-CD123-ALB構築體進行的重定向T細胞介導的CD123靶細胞殺傷
使用RosetteSep（StemCell Technologies，15061）從健康志願者（Blood bank Gent）的血沈棕黃層血液收集人T細胞，隨後根據製造商的說明在Ficoll-PaqueTM PLUS（GE Healthcare，17-1440-03）上富集。在流式細胞術測定中，將經純化人T細胞的品質和純度用抗CD3（eBioscience，12-0037-73）、抗CD8（BDBiosciences，555367）、抗CD4（BD Biosciences，345771）、抗CD45RO（BD Biosciences，555493）、抗CD45RA（BDBiosciences，550855）、抗CD19（BDBiosciences，555413）、抗CD25（BDBiosciences，557138）和抗CD69（BDBiosciences，557050）螢光標記抗體檢查。將細胞在液氮中冷凍。
根據製造商的說明，使用泛T細胞分離套組（Miltenyi，130-091-993），在內部（Sanofi，蒙彼利埃，法國）從PBMC（經由Ficoll密度離心分離）中分離來自食蟹猴（Macaca schicularis）的T細胞。將細胞在液氮中冷凍。
根據製造商的說明，使用PKH26紅色螢光細胞連接子套組（Sigma，PKH26GL-1KT）用4 µM PKH-26膜染料標記表現人CD123的KG1a細胞，並且將其用作靶細胞。將2.5x1E5效應細胞（即，人或食蟹猴原代T細胞）與2.5x1E4靶細胞（即，PKH標記KG1a細胞）在96孔V型底板中共同培育（效應子與標靶的比率為10 : 1）。為了測量濃度依賴性細胞裂解，將TCE-CD123-ALB構築體在具有30 µM HSA（CSL Behring，Alburex 20人血清白蛋白）的測定培養基中的系列稀釋液添加到細胞中，並且在37ºC下在5% CO2氣氛中培育18小時。
培育後，將細胞藉由離心裂解並且重懸於補充有5 nM TO-PRO®-3碘化物（642⁄661）（Life Techn. - Molecular Probes，T3605）的FACS緩衝液中，以區分活細胞與死細胞。使用MACSQuant®流式細胞儀（Miltenyi）分析細胞。對PKH26陽性靶細胞設置門控，並且在此群體中確定TO-PRO®-3碘化物陽性細胞的百分比。
結果
結果可以在下表12和圖4中看到。
表
12
：基於流式細胞術的
T
細胞介導的
KG-1a
細胞殺傷測定中的
TCE-CD123-ALB
構築體
| 樣品 ID | 效力 (M)- 人 T 細胞 | 效力 (M) - 食蟹猴 T 細胞 |
| T017001017 | 2.1E-10 | 3.9E-11 |
| T017001018 | 2.7E-10 | 4.0E-11 |
| T017001019 | 2.3E-09 | 7.4E-10 |
| T017001020 | 7.6E-10 | 2.3E-10 |
| T017001021 | 5.7E-09 | 9.4E-10 |
| T017000689 | - | - |
如從表12和圖4可以看出，所有TCE ISVD構築體在用人T細胞和食蟹猴T細胞兩者殺傷KG-1a細胞方面都是有效力的。如所預期，陰性對照構築體T017000689沒有顯示出細胞殺傷。
低親和力TCE ISVD T017001019、T017001020和T017001021在KG1-a細胞殺傷測定中也具有高效力。這進一步支持了這些具有低親和力抗TCR構建單元的TCE構築體具有作為T細胞接合生物治療劑的顯著潛力，如實例8中所提及的。
此外，對於所有測試的TCE-CD123-ALB形式，關於使用人T細胞作為效應細胞的每種形式觀察到的所介導的細胞毒性活性與藉由食蟹猴T細胞介導的活性非常相似。
因此，此細胞殺傷測定進一步支援了根據本發明技術的TCE ISVD變體非常適合用於人的標靶特異性治療性應用的構築體中。
6.10
實例
10
：
TCE-GPC3-GPC3-ALB
融合體的功能
TCE-GPC3-GPC3-ALB融合體的產生
將TCE ISVD變體形式變化為多特異性ISVD構築體，其具有藉由5GS連接子和9GS連接子連接的兩個針對磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）的腫瘤錨定ISVD構建單元和針對人血清白蛋白的ISVD構建單元。TCE構建單元的第一殘基改變為D。產生的構築體列於下表13中。參考構築體（A022600427）包含參考TCR結合ISVD T017000975（具有E1D突變的T017000700；SEQ ID NO: 34）、兩個針對磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）的腫瘤錨定ISVD構建單元和人血清白蛋白結合ISVD。陰性對照（T017000698）不包含抗GPC3 ISVD構建快。
基於阻抗的細胞毒性測定
在基於阻抗的細胞毒性測定（例如，如WO 2018091606A1中所述）中，使用人或食蟹猴原代效應T細胞和貼壁靶細胞，針對重定向T細胞介導的殺傷表徵ISVD構築體。使用xCELLigence儀器（Roche）測量由靶細胞黏附到電極表面引發的阻抗變化。T細胞是非貼壁的，並且因此不會影響阻抗測量。xCELLigence® RTCA MP儀器量化電阻抗的變化，將其顯示為稱為細胞指數的無量綱參數，該參數與細胞覆蓋的組織培養孔的總面積成正比。向96 E板（ACEA Biosciences；05 232 368 001）的每個孔中添加50 μL的在測定培養基（靶細胞生長培養基 + 1%青黴素/鏈黴素（Life technologies目錄號15140））中的120 μM Alburex HSA（CSL Behring，2160-679），以具有30 μM的最終濃度。不使用外孔，並且填充200 μL培養基或D-PBS。將96 E-板放置在xCELLigence®站中（在37ºC、5% CO2培養箱中），並且在不存在細胞的情況下進行單次測量以測量測定培養基的背景阻抗。隨後，將測定培養基中的50 μL靶細胞（2 x 1E4個細胞/孔）接種到96 E-板上，並且添加50 μL在測定培養基中的系列稀釋ISVD構築體溶液（4X濃度）。（最終體積 = 200 μL）。在室溫下30 min後，每孔添加在測定培養基中的50 μL原代T 5細胞（3 x 1E5個細胞/孔），以實現15 : 1的效應子與標靶比率。將板放置在xCELLigence®站中，並且每15 min測量阻抗，持續4天。以固定時間點（60小時）分析資料。
產生的構築體示出於下表13中。
表
13
：
TCE-GPC3-GPC3-ALB
和對照構築體的列表
| 構築體 ID | TCE ISVD ID | SEQ ID |
| A022600427 | T017000975 | 73 |
| A022600462 | T017000991 | 74 |
| T017000698 | T017000975 | 75 |
結果
在融合構築體中比較TCE ISVD變體T017000991（SEQ ID NO: 42）與參考T017000975（SEQ ID NO: 34），所述融合構築體具有藉由GS連接子連接的兩個針對腫瘤錨定GPC3（磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3）的ISVD構建單元和針對白蛋白的ISVD構建單元。作為陰性對照，產生不具有GPC3結合ISVD的構築體（T017000698，表13）。作為陽性對照，產生GPC3結合雙特異性抗體。此抗體的一個臂結合GPC3，並且另一個臂結合CD3。結果的圖示說明示出於圖5A-圖5D中。計算的靶細胞殺傷的IC50值示出於表14中。
表
14.
在基於阻抗的人和食蟹猴
T
細胞介導的
HuH-7
細胞殺傷測定中，使用
15
比
1
的效應子與標靶比率，在存在
30 μM HSA
的情況下，
TCE-GPC3-GPC3-ALB
構築體的
IC50
(M)
| TCE-GPC3-GPC3-ALB介導的HuH-7耗盡 | ||||
| 樣品 ID | 人供體 #1 IC50 (M) | 人供體 #2 IC50 (M) | 食蟹猴供體 #1 IC50 (M) | 食蟹猴供體 #2 IC50 (M) |
| A022600427 | 3.0E-10 | 1.1E-10 | 2.3E-08 | 2.5E-10 |
| A022600462 | 2.8E-10 | 1.0E-10 | 3.9E-09 | 2.2E-10 |
| T017000698 | 負 | 曲線擬合差 | 負 | 負 |
| 陽性對照 | 1.0E-10 | 1.5E-10 | 6.0E-11 | 2.5E-11 |
當使用人或食蟹猴T細胞時，具有與GPC3結合ISVD融合的TCE構建單元的兩種構築體的IC50值是可比較的。如所預期，沒有GPC3結合ISVD的構築體（即，只有與人血清白蛋白結合ISVD融合的TCRαβ結合ISVD）沒有介導任何水平的細胞殺傷或僅介導低水平的細胞殺傷。
6.11
實例
11
：
TCE ISVD
的化學穩定性評估
為了評價根據本發明技術的TCE ISVD的化學穩定性，用T017000991（SEQ ID NO: 42）進行了強制降解研究，並且與參考T017000975（SEQ ID NO: 34）進行比較，兩者均附接了HIS6標籤（SEQ ID NO: 78）。
所述研究由以下組成：用10 mM H
2O
2進行強制氧化，並且在25ºC和40ºC（分別類比加速條件和應激條件）兩者下進行四週的培育時間段。應激測試後，藉由使用胰蛋白酶消化的肽圖、藉由反相層析的肽分離和質譜MS/MS檢測分析T017000991的穩定性。針對以下分子修飾進行篩選：脫醯胺、異構化/外消旋以及甲硫胺酸或色胺酸氧化。為了評價T017000991的序列優化的價值，將具有化學修飾的ISVD的化學穩定性與參考T017000975進行比較。
結果
對於不同溫度條件的肽圖分析的結果呈現於下表15中。
表
15
：溫度應激後
T017000991
和
T017000975
（對照）的胰蛋白酶肽圖分析的比較。
| T017000975 上的肽 % | T017000991 上的肽 % | ||||||||
| 片段標記 | 肽 | Seq ID NO | 修飾 (Kabat 編號 ) | T0 | Δ 4w 25ºC | Δ 4w 40ºC | T0 | Δ 4w 25ºC | Δ 4w 40ºC |
| T7 | VAHISIGDQTDYADSAK | 182 | 異構化D61 | 1.0 | +0.3 | +2.1 | N.D. | N.D. | N.D. |
| T11 | NTVYLQMNSLRPEDTAAYYCR | 183 | 脫醯胺N82a | 1.1 | 0.0 | +0.4 | 1.1 | +0.1 | +0.2 |
| T11 | NTVYLQMNSLRPEDTAAYYCR | 183 | 脫醯胺N82a | 0.5 | +0.2 | +1.0 | 0.7 | +0.1 | +0.7 |
| T11 | NTVYLQMNSLRPEDTAAYYCR | 183 | 氧化M82 | 1.6 | +1.2 | +0.5 | 1.4 | -0.1 | +2.8 |
| T13 | IWPYDYWGQGTLVTVSSAAAHHHHHHH | 184 | 氧化W99 | 0.6 | +0.2 | +0.3 | N.D. | N.D. | N.D. |
在強制氧化條件下未觀察到顯著變化。兩種分子的序列覆蓋率為約85%。結合AspN消化，兩種分子都獲得100%的序列覆蓋率。未檢測到另外的修飾。
在T017000975中鑑定了兩種化學不穩定性（chemical liability）：D61易於異構化，並且W99易於氧化（Kabat編號）。如前所提到的，在T017000991中這兩種敏感胺基酸被取代（D61E，W99Y），導致在評價的條件下完全去除根據本發明技術的TCE ISVD中的這兩種不穩定性。
因此，相對於參考TCE ISVD，根據本發明技術的TCE ISVD的化學穩定性已經得到改善。
6.12
實例
12
：作為形式變化的
ISVD
構築體的一部分的
TCE ISVD
的化學穩定性
為了進一步證明根據本發明技術的TCE ISVD的穩定性的提高，分析作為形式變化的ISVD構築體的一部分的T017000991的化學穩定性。
進行短期儲存研究。將T017000991以及T017000975（作為對照）用兩種抗GPC3 ISVD和與人血清白蛋白結合的ISVD進行形式變化。構築體呈現於下表16中。
表
16
| ISVD 構築體 ID | SEQ ID NO | 形式 |
| A022600424 | 76 | T017000975-GPC3-GPC3-ALB |
| A022600462 | 74 | T017000991-GPC3-GPC3-ALB |
當將形式變化的分子以液體用合適的配製緩衝液儲存時，在儲存期間觀察到色胺酸氧化和天門冬胺酸異構化。
同時發現色胺酸氧化速率取決於pH、溫度、ISVD濃度、過渡金屬和聚山梨醇酯20。因此，為了加速任何潛在的氧化事件，進行應激研究。應激條件由以下組成：在40ºC/75%相對濕度（RH）± 5% RH下加上添加100 ppm Fe(II)作為氧化劑，在塑膠管中培育3個月。
對於此研究，將兩種ISVD構築體在25 mM組胺酸-HCl、8%（w/v）蔗糖、0.01%（w/v）pH 6.5緩衝液中配製為1 mg/mL，並且還在3個月的時間段內監測25ºC/60% RH ± 5% RH下的穩定性。
藉由反相層析追蹤作為色胺酸氧化指示的相對保留時間（RRT）＜ 1.0的峰(圖MS ID)以及藉由肽圖追蹤胰蛋白酶消化和反相LC-MS/MS來監測穩定性特徵。
結果
結果的圖示說明見於圖6中，其示出了藉由反相層析追蹤RRT ＜ 1.0的峰，在25ºC下的穩定性特徵。與A022600424相比，觀察到A022600462的氧化速率降低，色胺酸氧化降低5倍。
在應激條件下的穩定性特徵評價過程中，可以觀察到類似的趨勢（圖7）。在存在聚山梨醇酯20和組胺酸的情況下，將Fe(II)添加到配製溶液中催化了ISVD構築體的氧化速率。在40ºC下培育一天后，與對照A022600424相比，A022600462的氧化速率降低了約四倍。在14天的強制降解條件下仍然可以看到較低的氧化速率。
使用肽圖來精確確定胺基酸序列中不同氧化事件發生的位置。出於此目的，分析和比較了樣品的溫度應激穩定性。胰蛋白酶消化後，序列的幾乎85%可以被所產生的肽覆蓋。使用質譜儀（MS）上的Biopharma Finder軟體（BPF；3.2版），可以鑑定不同的肽，並且闡明所述肽上的化學修飾。結果表明，在所選的形式上存在不同的色胺酸氧化位點，即TCE ISVD上位於肽編號13的位點，更精確地是W99（A022600424）和W103（A022600424和A022600462）上的位點。結果示出於圖8中。
來自儲存穩定性研究的樣品的肽圖分析顯示，當與A0022600424相比時，A022600462的總氧化速率要低得多，因為從前一序列中去除了色胺酸W99。第二色胺酸上的氧化速率似乎保持穩定，而所述形式中存在的其他構建單元上的色胺酸氧化似乎不受引入的胺基酸取代的影響。如所預期，D61殘基的去除導致了最終形式中異構化傾向的去除。
總之，藉由取代相關位置的胺基酸，已經克服了ISVD中與色胺酸氧化和異構化相關的問題，同時維持了ISVD的功能。
7
工業實用性
本文所述的ISVD、多肽、編碼所述多肽的核酸分子、包含所述核酸的載體和組合物可以用於例如患有癌症的個體的治療中。
表
A-6
：序列表
| 名稱 | SEQ ID NO | 序列 |
| T017000700 | 1 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000937 | 2 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYANSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000938 | 3 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAPSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000939 | 4 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAKSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000940 | 5 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYARSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000941 | 6 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAISAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000942 | 7 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYATSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000943 | 8 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAHSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000944 | 9 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAVSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000945 | 10 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000946 | 11 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAASAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000947 | 12 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAYSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000948 | 13 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYALSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000949 | 14 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAQSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000950 | 15 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAFSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000951 | 16 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYASSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000952 | 17 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYRGQGTLVTVSS |
| T017000953 | 18 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYAGQGTLVTVSS |
| T017000954 | 19 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYEGQGTLVTVSS |
| T017000955 | 20 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYYGQGTLVTVSS |
| T017000956 | 21 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYLGQGTLVTVSS |
| T017000957 | 22 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYHGQGTLVTVSS |
| T017000958 | 23 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYIGQGTLVTVSS |
| T017000959 | 24 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYQGQGTLVTVSS |
| T017000960 | 25 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYVGQGTLVTVSS |
| T017000961 | 26 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYKGQGTLVTVSS |
| T017000962 | 27 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYSGQGTLVTVSS |
| T017000963 | 28 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYGGQGTLVTVSS |
| T017000964 | 29 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYPGQGTLVTVSS |
| T017000965 | 30 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYFGQGTLVTVSS |
| T017000966 | 31 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYTGQGTLVTVSS |
| T017000967 | 32 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000974 | 33 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000975 | 34 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAPSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000976 | 35 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYARSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000977 | 36 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAVSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000978 | 37 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000979 | 38 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAASAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000980 | 39 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAQSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000981 | 40 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYASSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000982 | 41 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYYGQGTLVTVSS |
| T017000991 | 42 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSS |
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| T017000994 | 45 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIDPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000995 | 46 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIQPYDYWGQGTLVTVSS |
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| T017000997 | 48 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIRPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000998 | 49 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIFPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017000999 | 50 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRISPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017001000 | 51 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIGPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017001001 | 52 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRITPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017001002 | 53 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIHPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017001003 | 54 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIVPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017001004 | 55 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYASAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIKPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017001005 | 56 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRILPYDYWGQGTLVTVSS |
| T017001006 | 57 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIIPYDYWGQGTLVTVSS |
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| T017001018 | 59 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGTTLDYYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCATDPYYSSCHPFFADYEYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| T017001019 | 60 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRITPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGTTLDYYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCATDPYYSSCHPFFADYEYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| T017001020 | 61 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRISPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGTTLDYYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCATDPYYSSCHPFFADYEYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| T017001021 | 62 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIQPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGTTLDYYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCATDPYYSSCHPFFADYEYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| T017001022 | 63 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGTTLDYYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCATDPYYSSCHPFFADYEYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| T017001023 | 64 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGTTLDYYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCATDPYYSSCHPFFADYEYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| T017001024 | 65 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRITPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGTTLDYYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCATDPYYSSCHPFFADYEYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| T017001025 | 66 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRISPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGTTLDYYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCATDPYYSSCHPFFADYEYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| T017001026 | 67 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIQPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGTTLDYYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCATDPYYSSCHPFFADYEYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| T017001027 | 68 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGTTLDYYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCATDPYYSSCHPFFADYEYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| T017001028 | 69 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGTTLDYYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCATDPYYSSCHPFFADYEYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| T017001029 | 70 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGTTLDYYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCATDPYYSSCHPFFADYEYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRITPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| T017001030 | 71 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGTTLDYYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCATDPYYSSCHPFFADYEYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRISPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| T017001031 | 72 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGTTLDYYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCATDPYYSSCHPFFADYEYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIQPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| A022600427 | 73 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNAGVTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIFRSVFSSSTMEWYRQAPGKKRELVARIAPGEGTYYGALYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| A022600462 | 74 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAESAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIYPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNKGVTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIFRSVFSSSTMEWYRQAPGKKRELVARIAPGEGTYYGALYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| T017000698 | 75 | DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| A022600424 | 76 | VQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMTWVRRPPGKGLEWVATITNKGVTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYICANARRTGPRAPTDIGSYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIFRSVFSSSTMEWYRQAPGKKRELVARIAPGEGTYYGALYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| FLAG3-HIS6標籤 | 77 | AAADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGAAHHHHHH |
| HIS6標籤 | 78 | HHHHHH |
| TCE ISVD的CDR1 (Kabat) | 79 | INFYG |
| TCE ISVD的CDR2 (Kabat) | 80 | HISIGDQTDYAX 1SAKG |
| TCE ISVD的CD3 (Kabat) | 81 | LSRIX 2PYDY |
| TCE ISVD的CDR1 (Abm) | 82 | GYVHKINFYG |
| TCE ISVD的CDR2 (Abm) | 83 | HISIGDQTD |
| TCE ISVD的CDR3 (Abm) | 84 | LSRIX 2PYDY |
| TCE ISVD | 85 | X 0VQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYAX 1SAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIX 2PYDYX 3GQGTLVTVSS |
| 5GS連接子 | 86 | GGGGS |
| 9GS連接子 | 87 | GGGGSGGGS |
| C末端ISVD | 88 | VTVSS |
| C末端ISVD | 89 | VKVSS |
| C末端ISVD | 90 | VQVSS |
| C末端ISVD | 91 | VTVKS |
| C末端ISVD | 92 | VTVQS |
| C末端ISVD | 93 | VKVKS |
| C末端ISVD | 94 | VKVQS |
| C末端ISVD | 95 | VQVKS |
| C末端ISVD | 96 | VQVQS |
| C末端ISVD | 97 | VTVSSA |
| C末端ISVD | 98 | VKVSSA |
| C末端ISVD | 99 | VQVSSA |
| C末端ISVD | 100 | VTVKSA |
| C末端ISVD | 101 | VTVQSA |
| C末端ISVD | 102 | VKVKSA |
| C末端ISVD | 103 | VKVQSA |
| C末端ISVD | 104 | VQVKSA |
| C末端ISVD | 105 | VQVQSA |
| 人TCRα恒定結構域(源自P01848) | 106 | PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS |
| 人TCRβ恒定結構域(源自P01850) | 107 | EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF |
| 恒河猴TCRα (AEA41863) | 108 | MLLLLVLVLEVIFTLGGTRAQSVTQLDSQVSVSEGVPVLLRCNYSSSFSPYLFWYVQYPNQGLQLLLKYTSGTTLVKGINGFEAEFKKSETSFHLTKASAHVSDAAEYFCALARGALVFGKGTRLSVIPNIQNPDPAVYQLRGSKSNDTSVCLFTDFDSVMNVSQSKDSDVHITDKTVLDMRSMDFKSNGAVAWSNKSDFACTSAFKDSVIPADTFFPGTESVCDANLVEKSFETDMNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS |
| 恒河猴TCRβ (AEA41864) | 109 | MGFWTLCCVSFCILVAKHTDAGVIQLPRHEVTEMGKEVTLRCEPISGHSSLFWYRQTMMRGLEFLIYFNNKSPIDDSGMPKDRFSATMPDASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASTPGQGREKLFFGSGTQLSVLEDLKKVFPPKVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALEDSRYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFYGLSEDDEWTEDRDKPITQKISAEVWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALMLMAMVKRKDF |
| 人TCR拉鍊：α鏈 | 110 | MNMRPVTSSVLVLLLMLRRSNGQLLEQSPQFLSIQEGENLTVYCNSSSVFSSLQWYRQEPGEGPVLLVTVVTGGEVKKLKRLTFQFGDARKDSSLHITAAQPGDTGLYLCAGAGSQGNLIFGKGTKLSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKSVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCSSADLVPRGSTTAPSAQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQEQKLISEEDL |
| 人TCR拉鍊：β鏈 | 111 | MSNTVLADSAWGITLLSWVTVFLLGTSSADGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSSRSSYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYSLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCSSADLVPRGSTTAPSAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQTGHHHHHHHHHH |
| 食蟹猴TCR拉鍊：α鏈(源自AEA41865) | 112 | MLLITSVLVLWMQLSQVNGQQIMQIPQYQHVQEGEDFTTYCNSSTTLSNIQWYKQRPGGHPVFLIMLVKSGEVKKQKRLIFQFGEAKKNSSLHITATQTTDVGTYFCATTGVNNLFFGTGTRLTVLPYIQNPDPAVYQLRGSKSNDTSVCLFTDFDSVMNVSQSKDSDVHITDKTVLDMRSMDFKSNGAVAWSNKSDFACTSAFKDSVIPADTFFPSPESSCSSADLVPRGSTTAPSAQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQEQKLISEEDL |
| 食蟹猴TCR拉鍊：β鏈(源自AEA41866和AEA41868) | 113 | MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHDYMYWYRQDPGMGLRLIHYSVGEGSTEKGEVPDGYNVTRSNTEDFPLRLESAAPSQTSVYFCASSYWTGRSYEQYFGPGTRLTVIEDLKKVFPPKVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALEDSRYSLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFYGLSEDDEWTEDRDKPITQKISAEAWGRADCSSADLVPRGSTTAPSAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQTGHHHHHHHHHH |
| 人TCRα恒定結構域(源自P01848) | 114 | PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSC |
| 人TCRβ恒定結構域(源自P01850) | 115 | EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADC |
| 食蟹猴TCR-α恒定結構域(源自AEA41865) | 116 | PYIQNPDPAVYQLRGSKSNDTSVCLFTDFDSVMNVSQSKDSDVHITDKTVLDMRSMDFKSNGAVAWSNKSDFACTSAFKDSVIPADTFFPSPESSC |
| 食蟹猴TCR-β恒定結構域(源自AEA41868) | 117 | EDLKKVFPPKVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALEDSRYSLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFYGLSEDDEWTEDRDKPITQKISAEAWGRADC |
| Alb8 | 118 | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb8-A | 119 | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb23 | 120 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb23-A | 121 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb83 | 122 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb83-A | 123 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb132 | 124 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb132-A | 125 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb73 | 126 | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSS |
| Alb73-A | 127 | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSSA |
| Alb82 | 128 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb82-A | 129 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb199 | 130 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSS |
| Alb199-A | 131 | EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSSA |
| Alb23002 | 132 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS |
| Alb223 | 133 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA |
| Alb216 | 134 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSS |
| Alb216-A | 135 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSSA |
| 3A連接子 | 136 | AAA |
| 7GS連接子 | 137 | SGGSGGS |
| 8GS連接子 | 138 | GGGGSGGS |
| 10GS連接子 | 139 | GGGGSGGGGS |
| 15GS連接子 | 140 | GGGGSGGGGSGGGGS |
| 18GS連接子 | 141 | GGGGSGGGGSGGGGSGGS |
| 20GS連接子 | 142 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 25GS連接子 | 143 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 30GS連接子 | 144 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 35GS連接子 | 145 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 40GS連接子 | 146 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| G1鉸鏈 | 147 | EPKSCDKTHTCPPCP |
| 9GS-G1鉸鏈 | 148 | GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP |
| 美洲駝上部長鉸鏈區 | 149 | EPKTPKPQPAAA |
| G3鉸鏈 | 150 | ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP |
| TCE ISVD的CDR2 (Kabat) | 151 | HISIGDQTDYADSAKG |
| TCE ISVD的CDR2 (Kabat) | 152 | HISIGDQTDYANSAKG |
| TCE ISVD的CDR2 (Kabat) | 153 | HISIGDQTDYAPSAKG |
| TCE ISVD的CDR2 (Kabat) | 154 | HISIGDQTDYAKSAKG |
| TCE ISVD的CDR2 (Kabat) | 155 | HISIGDQTDYARSAKG |
| TCE ISVD的CDR2 (Kabat) | 156 | HISIGDQTDYAISAKG |
| TCE ISVD的CDR2 (Kabat) | 157 | HISIGDQTDYATSAKG |
| TCE ISVD的CDR2 (Kabat) | 158 | HISIGDQTDYAHSAKG |
| TCE ISVD的CDR2 (Kabat) | 159 | HISIGDQTDYAVSAKG |
| TCE ISVD的CDR2 (Kabat) | 160 | HISIGDQTDYAESAKG |
| TCE ISVD的CDR2 (Kabat) | 161 | HISIGDQTDYAASAKG |
| TCE ISVD的CDR2 (Kabat) | 162 | HISIGDQTDYAYSAKG |
| TCE ISVD的CDR2 (Kabat) | 163 | HISIGDQTDYALSAKG |
| TCE ISVD的CDR2 (Kabat) | 164 | HISIGDQTDYAQSAKG |
| TCE ISVD的CDR2 (Kabat) | 165 | HISIGDQTDYAFSAKG |
| TCE ISVD的CDR2 (Kabat) | 166 | HISIGDQTDYASSAKG |
| TCE ISVD的CDR3 (Kabat) | 167 | LSRIWPYDY |
| TCE ISVD的CDR3 (Kabat) | 168 | LSRIYPYDY |
| TCE ISVD的CDR3 (Kabat) | 169 | LSRIAPYDY |
| TCE ISVD的CDR3 (Kabat) | 170 | LSRIPPYDY |
| TCE ISVD的CDR3 (Kabat) | 171 | LSRIDPYDY |
| TCE ISVD的CDR3 (Kabat) | 172 | LSRIQPYDY |
| TCE ISVD的CDR3 (Kabat) | 173 | LSRIEPYDY |
| TCE ISVD的CDR3 (Kabat) | 174 | LSRIRPYDY |
| TCE ISVD的CDR3 (Kabat) | 175 | LSRIFPYDY |
| TCE ISVD的CDR3 (Kabat) | 176 | LSRISPYDY |
| TCE ISVD的CDR3 (Kabat) | 177 | LSRIGPYDY |
| TCE ISVD的CDR3 (Kabat) | 178 | LSRITPYDY |
| TCE ISVD的CDR3 (Kabat) | 179 | LSRIHPYDY |
| TCE ISVD的CDR3 (Kabat) | 180 | LSRIVPYDY |
| TCE ISVD的CDR3 (Kabat) | 181 | LSRIKPYDY |
| 肽片段T7 | 182 | VAHISIGDQTDYADSAK |
| 肽片段T11 | 183 | NTVYLQMNSLRPEDTAAYYCR |
| 肽片段T13 | 184 | IWPYDYWGQGTLVTVSSAAAHHHHHHH |
| 肽片段T14 | 185 | LSCAASGFTFSSFAMTWVR |
| 肽片段T16 | 186 | GLEWVATITNK |
| 肽片段T27 | 187 | SVFSSSTMEWYR |
| 肽片段T36 | 188 | NTVYLQMNSLRPEDTALYYCASGVAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGWQPGGS |
| 肽片段T40 | 189 | GPEWVSSISGSGSDTLYLADSVK |
無
圖 1示出了如流式細胞術（FACS）中確定的根據本發明技術的TCE ISVD與原代人T細胞的結合。
圖 2示出了如流式細胞術（FACS）中確定的根據本發明技術的TCE-CD123-ALB ISVD構築體與原代人T細胞的結合。
圖 3示出了在基於流式細胞術的人T細胞介導的MOLM-13細胞殺傷測定中，使用10比1的效應子與標靶比率，在存在30 μM HSA的情況下，TCE-CD123-ALB構築體的劑量-反應曲線。從2名人供體獲得細胞。供體1的結果示出於
圖 3A、
圖 3C和
圖 3E，而供體2的結果示出於
圖 3B、
圖 3D和
圖 3F。
圖 4示出了在基於流式細胞術的人（
圖 4A）和食蟹猴（
圖 4B）T細胞介導的KG-1a細胞殺傷測定中，使用10比1的效應子與標靶比率，在存在30 μM HSA的情況下，TCE-CD123-ALB構築體的劑量-反應曲線。
圖 5示出了在基於阻抗的人（
圖 5A 、圖 5B）和食蟹猴（
圖 5C、
圖 5D）T細胞介導的HuH-7細胞殺傷測定中，使用15比1的效應子與標靶比率，在存在30 μM HSA的情況下，TCE-GPC3-GPC3-ALB構築體的劑量反應曲線。
圖 6示出了對於ISVD構築體A022600424和A022600462兩者，在25ºC下相對色胺酸氧化的演變，量化為反相層析中RRT ＜ 1.0的峰的總和。
圖 7示出了對於ISVD構築體A022600424和A022600462兩者，在1天后和2週後在強制降解條件下色胺酸氧化的演變，量化為反相層析中RRT ＜ 1.0的峰的總和。
圖 8示出了ISVD構築體A022600424和A022600462的肽圖的結果。
無
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Claims (44)
- 一種免疫球蛋白單可變結構域（ISVD），其特異性結合存在於T細胞上的人和/或非人靈長類動物T細胞受體（TCR）的恒定結構域，其中所述ISVD基本上由4個架構區（分別為FR1至FR4）和3個互補決定區（分別為CDR1至CDR3）組成，其中 a. CDR1的胺基酸序列（根據Kabat）是INFYG（SEQ ID NO: 79）； b. CDR2的胺基酸序列（根據Kabat）是HISIGDQTDYAX 1SAKG（SEQ ID NO: 80）；並且 c. CDR3的胺基酸序列（根據Kabat）是LSRIX 2PYDY（SEQ ID NO: 81）； 其中 - 胺基酸殘基X 1選自E、D、N、P、K、R、I、T、H、V、A、Y、L、Q、F和S；和/或 - 胺基酸殘基X 2選自Y、A、P、D、Q、E、R、F、S、G、T、H、V、K、L和I。
- 一種免疫球蛋白單可變結構域（ISVD），其特異性結合存在於T細胞上的人和/或非人靈長類動物T細胞受體（TCR）的恒定結構域，其中所述ISVD基本上由4個架構區（分別為FR1至FR4）和3個互補決定區（分別為CDR1至CDR3）組成，其中 a. CDR1的胺基酸序列（根據AbM）是GYVHKINFYG（SEQ ID NO: 82）； b. CDR2的胺基酸序列（根據AbM）是HISIGDQTD（SEQ ID NO: 83）；並且 c. CDR3的胺基酸序列（根據AbM）是LSRIX 2PYDY（SEQ ID NO: 84）； 並且其中 - 位置61（根據Kabat）處的胺基酸殘基選自E、D、N、P、K、R、I、T、H、V、A、Y、L、Q、F和S；和/或 - 胺基酸殘基X 2選自Y、A、P、D、Q、E、R、F、S、G、T、H、V、K、L和I。
- 如請求項1所述的ISVD，其中X 1是E或D。
- 如請求項1所述的ISVD，其中X 1是E。
- 如請求項2所述的ISVD，其中位置61（根據Kabat）處的胺基酸殘基是E或D。
- 如請求項2所述的ISVD，其中位置61（根據Kabat）處的胺基酸殘基是E。
- 如請求項1-6中任一項所述的ISVD，其中X 2是Y、A、Q、F、S、T或H。
- 如請求項1-6中任一項所述的ISVD，其中X 2是Y、Q、S或T。
- 如請求項1-6中任一項所述的ISVD，其中X 2是Y。
- 如請求項1-9中任一項所述的ISVD，其中所述ISVD中位置103（Kabat編號）處的胺基酸殘基選自W、R、A、E、Y、L、H、I、Q、V、K、S、G、P、F、T。
- 如請求項1-9中任一項所述的ISVD，其中所述ISVD中位置103（Kabat編號）處的胺基酸殘基是W。
- 如請求項1所述的ISVD，其中X 1是E，X 2是Y並且位置103（Kabat編號）處的胺基酸殘基是W。
- 如請求項2所述的ISVD，其中位置61（Kabat編號）處的胺基酸殘基是E，X 2是Y並且位置103（Kabat編號）處的胺基酸殘基是W。
- 如請求項1-13中任一項所述的ISVD，其中位置1（Kabat編號）處的胺基酸殘基選自E和D。
- 如請求項1-14中任一項所述的ISVD，其中所述ISVD是重鏈ISVD。
- 如請求項15所述的ISVD，其中所述重鏈ISVD選自V HH、人類化V HH、駝類化V H、結構域抗體、單結構域抗體和dAb。
- 如前述請求項中任一項所述的ISVD，所述ISVD與SEQ ID NO: 2-57中任一個的序列具有至少85%、較佳至少90%、更佳至少95%的序列同一性程度，其中出於確定序列同一性程度的目的，形成所述CDR序列的胺基酸殘基被忽略，並且其中較佳地所述序列為SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 52。
- 如前述請求項中任一項所述的ISVD，所述ISVD與SEQ ID NO: 32、33和/或35-57的序列具有至少85%、較佳至少90%、更佳至少95%的序列同一性程度，其中出於確定序列同一性程度的目的，形成所述CDR序列的胺基酸殘基被忽略，並且其中較佳地所述序列包含SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 52。
- 如請求項17或18所述的ISVD，其中所述ISVD包含SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 42，或者由其組成。
- 如請求項17或18所述的ISVD，其中所述ISVD包含SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 52，或者由其組成。
- 一種免疫球蛋白單可變結構域（ISVD），其包含以下序列或由以下序列組成： X 0VQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVASGYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAHISIGDQTDYA X 1SAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYCRALSRIX 2PYDYX 3GQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 85）， 其中 a. X 0選自E和D； b. X 1選自E、D、N、P、K、R、I、T、H、V、A、Y、L、Q、F和S； c. X 2選自Y、A、P、D、Q、E、R、F、S、G、T、H、V、K、L和I；並且 d. X 3選自W、R、A、E、Y、L、H、I、Q、V、K、S、G、P、F和T。
- 如請求項21所述的ISVD，其中X 0是D。
- 如請求項21或22所述的ISVD，其中X 1選自D或E組成之群組。
- 如請求項21或22所述的ISVD，其中X 1是E。
- 如請求項21-24中任一項所述的ISVD，其中X 2選自Y、T、S和Q組成之群組。
- 如請求項21-24中任一項所述的ISVD，其中X 2是Y。
- 如請求項21-26中任一項所述的ISVD，其中X 3是W。
- 一種多肽，其包含能夠特異性結合存在於T細胞上的人和/或非人靈長類動物T細胞受體（TCR）的恒定結構域的第一ISVD和能夠特異性結合靶細胞上的第一抗原的第二ISVD，其中所述第一抗原不同於所述TCR，並且其中所述靶細胞不同於所述T細胞， 其中所述第一ISVD和所述第二ISVD基本上由4個架構區（分別為FR1至FR4）和3個互補決定區（分別為CDR1至CDR3）組成，並且其中所述第一ISVD是如請求項1-27中任一項所述的ISVD。
- 如請求項28所述的多肽，其中所述第一ISVD的胺基酸序列與SEQ ID NO: 2-57中任一個的胺基酸序列中的至少一個具有至少80%、較佳至少85%、更較佳至少90%、更佳至少95%的序列同一性，其中出於確定序列同一性程度的目的，形成所述CDR序列的胺基酸殘基被忽略，較佳地其中所述第一ISVD的序列包含SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 52。
- 如請求項28或29所述的多肽，其中所述第一ISVD與SEQ ID NO: 32、33和/或35-57中任一個的胺基酸序列具有至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少95%的序列同一性，其中出於確定序列同一性程度的目的，形成所述CDR序列的胺基酸殘基被忽略，並且其中較佳地所述序列包含SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 52。
- 如請求項28或29所述的多肽，其中所述第一ISVD包含SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 42，或者由其組成。
- 如請求項28或29所述的多肽，其中所述第一ISVD包含SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 52，或者由其組成。
- 如請求項28-32中任一項所述的多肽，所述多肽進一步包含特異性結合靶細胞上的第二抗原的第三ISVD。
- 如請求項28-33中任一項所述的多肽，其中所述多肽進一步包含任選地經由一個或多個肽連接子連接的一個或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，其中與沒有所述一個或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一個或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。
- 如請求項34所述的多肽，其中所述一個或多個其他基團、殘基、部分或結合單元是能夠與人血清白蛋白結合的ISVD。
- 一種產生如請求項1-27中任一項所述的ISVD或如請求項28-35中任一項所述的多肽的方法，其中所述方法包括： a. 在合適的宿主細胞或宿主生物體中或在另一種合適的表現系統中表現編碼所述ISVD或多肽的核酸序列；任選地之後： b. 分離和/或純化所述ISVD或多肽。
- 一種核酸，其編碼如請求項1-27中任一項所述的ISVD或如請求項28-35中任一項所述的多肽。
- 一種載體，其包含如請求項37所述的核酸。
- 一種用如請求項37所述的核酸或如請求項38所述的載體轉化或轉染的非人宿主或宿主細胞。
- 一種組合物，其包含如請求項1-27中任一項所述的ISVD或如請求項28-35中任一項所述的多肽。
- 如請求項40所述的組合物，其中所述組合物是醫藥組合物。
- 如請求項28-35中任一項所述的多肽或如請求項40或41所述的組合物，其用作藥劑。
- 如請求項28-35中任一項所述的多肽或如請求項40或41所述的組合物，其用於預防、治療或改善選自增殖性疾病、炎性疾病、感染性疾病和自體免疫疾病的疾病。
- 如請求項43所述的用於所述用途的多肽或組合物，其中所述疾病是癌症。
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