JP6087054B2 - ポリペプチド多量体を精製するためのポリペプチドの改変方法 - Google Patents
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Description
一方、IgGタイプの抗体の商業的製造においては必ずプロテインAクロマトグラフィーによる精製工程が用いられているが、必ずしもイオン交換クロマトグラフィーは精製工程に用いられない。そのため、二重特異性抗体を高純度に製造するためにイオン交換クロマトグラフィーを用いることは製造コストの増大につながる。また、イオン交換クロマトグラフィーのみを用いた精製法では医薬品の精製法としての頑健性が確保できない可能性があり、複数のクロマトグラフィー工程で不純物を除去することが望ましい。
いずれにしても、イオン交換クロマトグラフィーとは異なる分離モードを有するクロマトグラフィー工程においても二重特異性抗体を高純度化できることが好ましく、その分離モードとしてIgGタイプの抗体の商業的製造においては必ず使用されるプロテインAクロマトグラフィーにより二重特異性抗体を高純度化できることが望まれていた。
さらに、第1の抗原結合活性を有するポリペプチドと第2の抗原結合活性を有するポリペプチドが会合する際に形成される界面を構成するアミノ酸を改変し、ポリペプチド間の会合を制御する方法と組合わせることで、目的のポリペプチド多量体を高純度に且つ効率的に精製又は製造することが可能となった。
また、重鎖定常領域におけるEUナンバリング435位のアミノ酸残基を改変することで、ヒトIgG1と同等以上の血漿中滞留性を維持しつつ、プロテインAに対する結合力を調整することができることを見出した。当該知見により、ヒトIgG1と同等以上の血漿中滞留性を有する二重特異性抗体を高純度にかつ効率的に、精製又は製造することが可能となった。
〔1〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドを含むポリペプチド多量体の製造方法であって、該方法は
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドをコードするDNAを発現させる工程、及び
(b)工程(a)の発現産物を回収する工程、
を含み、
第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドのプロテインAへの結合力に差がつくように、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドの両方又はいずれか一方において1又は複数のアミノ酸残基が改変されている、
方法。
〔2〕工程(b)において、発現産物がプロテインAアフィニティクロマトグラフィーを用いて回収される、〔1〕に記載の方法。
〔3〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをプロテインAから溶出させる溶媒のpH及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドをプロテインAから溶出させる溶媒のpHに差がつくように、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドの両方又はいずれか一方において1又は複数のアミノ酸残基が改変されている、〔1〕または〔2〕に記載の方法。
〔4〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチド又は第2の抗原結合活性を有する若しくは抗原結合活性を有しないポリペプチドのいずれか一方のプロテインAへの結合力が増加又は低下するように、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド又は第2の抗原結合活性を有する若しくは抗原結合活性を有しないポリペプチドにおいて1又は複数のアミノ酸残基が改変されている、〔1〕から〔3〕のいずれかに記載の方法。
〔5〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチド又は第2の抗原結合活性を有する若しくは抗原結合活性を有しないポリペプチドのいずれか一方のポリペプチドのプロテインAへの結合力が増加し、他方のポリペプチドのプロテインAへの結合力が低下するように、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドにおいて1又は複数のアミノ酸残基が改変されている、〔1〕から〔4〕のいずれかに記載の方法。
〔6〕回収されたポリペプチド多量体の純度が95%以上である、〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の方法。
〔7〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドが抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列を含む、〔1〕から〔6〕のいずれかに記載の方法。
〔8〕抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング250〜255位、308〜317位及び430〜436位から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が改変されている、〔7〕に記載の方法。
〔9〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む、〔1〕から〔8〕のいずれかに記載の方法。
〔10〕抗体重鎖可変領域のFR1、CDR2及びFR3のアミノ酸配列において少なくとも1つのアミノ酸残基が改変されている、〔9〕に記載の方法。
〔11〕ポリペプチド多量体が1つ又は2つの第3の抗原結合活性を有するポリペプチドを含み、工程(a)が当該第3の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを発現させることを含む、〔1〕から〔10〕のいずれかに記載の方法。
〔12〕第3の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含む、〔11〕に記載の方法。
〔13〕ポリペプチド多量体が第4の抗原結合活性を有するポリペプチドをさらに含み、工程(a)が当該第4の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを発現させることを含む、〔11〕又は〔12〕に記載の方法。
〔14〕第3および第4の抗原結合活性を有するポリペプチドのうち少なくとも1つのポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含む、〔13〕に記載の方法。
〔15〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖可変領域と抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、第2の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖のアミノ酸配列を含み、第3の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、第4の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含む、〔13〕に記載の方法。
〔16〕ポリペプチド多量体が多重特異性抗体である、〔1〕から〔15〕のいずれかに記載の方法。
〔17〕多重特異性抗体が二重特異性抗体である、〔16〕に記載の方法。
〔18〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチドと第2の抗原結合活性を有しないポリペプチドを有し、第1の抗原結合活性を有するポリペプチドが受容体の抗原結合ドメイン及び抗体Fc領域のアミノ酸配列を含み、第2の抗原結合活性を有しないポリペプチドが抗体Fc領域のアミノ酸配列を含む、〔1〕から〔8〕のいずれかに記載の方法。
〔19〕抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域がヒトIgG由来である、〔7〕から〔18〕のいずれかに記載の方法。
〔20〕〔1〕から〔19〕のいずれかに記載の方法により製造されるポリペプチド多量体。
〔21〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドを含むポリペプチド多量体の精製方法であって、該方法は
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドをコードするDNAを発現させる工程、及び
(b)工程(a)の発現産物をプロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより回収する工程、
を含み、
第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドのプロテインAへの結合力に差がつくように、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドの両方又はいずれか一方において1又は複数のアミノ酸残基が改変されている、
方法。
〔22〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチド又は第2の抗原結合活性を有する若しくは抗原結合活性を有しないポリペプチドのプロテインAへの結合力が増加又は低下するように、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド又は第2の抗原結合活性を有する若しくは抗原結合活性を有しないポリペプチドにおいて1又は複数のアミノ酸残基が改変されている、〔21〕に記載の方法。
〔23〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチド又は第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドのいずれか一方のポリペプチドのプロテインAへの結合力が増加し、他方のポリペプチドのプロテインAへの結合力が低下するように、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドにおいて1又は複数のアミノ酸残基が改変されている、〔20〕または〔21〕に記載の方法。
〔24〕回収されたポリペプチド多量体の純度が95%以上である、〔21〕から〔23〕のいずれかに記載の方法。
〔25〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドが抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列を含む、〔21〕から〔24〕のいずれかに記載の方法。
〔26〕抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング250〜255位、308〜317位及び430〜436位から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が改変されている、〔25〕に記載の方法。
〔27〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む、〔21〕から〔26〕のいずれかに記載の方法。
〔28〕抗体重鎖可変領域のFR1、CDR2及びFR3のアミノ酸配列において少なくとも1つのアミノ酸残基が改変されている、〔27〕に記載の方法。
〔29〕ポリペプチド多量体が1つ又は2つの第3の抗原結合活性を有するポリペプチドを含み、工程(a)が当該第3の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを発現させることを含む、〔21〕から〔28〕のいずれかに記載の方法。
〔30〕第3の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含む、〔29〕に記載の方法。
〔31〕ポリペプチド多量体が第4の抗原結合活性を有するポリペプチドをさらに含み、工程(a)が当該第4の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを発現させることを含む、〔29〕又は〔30〕に記載の方法。
〔32〕第3および第4の抗原結合活性を有するポリペプチドのうち少なくとも1つのポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含む、〔31〕に記載の方法。
〔33〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖可変領域と抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、第2の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖のアミノ酸配列を含み、第3の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、第4の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含む、〔31〕に記載の方法。
〔34〕ポリペプチド多量体が多重特異性抗体である、〔21〕から〔33〕のいずれかに記載の方法。
〔35〕多重特異性抗体が二重特異性抗体である、〔34〕に記載の方法。
〔36〕抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域がヒトIgG由来である、〔25〕から〔35〕のいずれかに記載の方法。
〔37〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドを含むポリペプチド多量体であって、
第1の抗原結合活性を有するポリペプチドと第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドのプロテインAへの結合力が異なる、
ポリペプチド多量体。
〔38〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをプロテインAから溶出させる溶媒のpH及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドをプロテインAから溶出させる溶媒のpHが異なる、〔37〕に記載のポリペプチド多量体。
〔39〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチド又は第2の抗原結合活性を有する若しくは抗原結合活性を有しないポリペプチドが抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、
該抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列においてEUナンバリング250〜255位、308〜317位及び430〜436位から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が改変されている、
〔37〕又は〔38〕に記載のポリペプチド多量体。
〔40〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドが抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、
第1の抗原結合活性を有するポリペプチド又は第2の抗原結合活性を有する若しくは抗原結合活性を有しないポリペプチドのいずれか一方のポリペプチドにおいて、抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング435位のアミノ酸残基がヒスチジン又はアルギニンであり、
他方のポリペプチドにおいて、抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング435位のアミノ酸残基が一方のポリペプチドとは異なるアミノ酸残基である、
〔37〕から〔39〕のいずれかに記載のポリペプチド多量体。
〔41〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドが抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、
第1の抗原結合活性を有するポリペプチド又は第2の抗原結合活性を有する若しくは抗原結合活性を有しないポリペプチドのいずれか一方のポリペプチドにおいて、抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング435位アミノ酸残基がヒスチジンであり、
他方のポリペプチドにおいて、抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリングによる435位のアミノ酸残基がアルギニンである、
〔37〕から〔40〕のいずれかに記載のポリペプチド多量体。
〔42〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列を含み、
該重鎖可変領域のFR1、CDR2及びFR3のアミノ酸配列において少なくとも1つのアミノ酸残基が改変されている、
〔37〕から〔41〕のいずれかに記載のポリペプチド多量体。
〔43〕ポリペプチド多量体が1つ又は2つの第3の抗原結合活性を有するポリペプチドをさらに含む、〔37〕から〔42〕のいずれかに記載のポリペプチド多量体。
〔44〕第3の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含む、〔43〕に記載のポリペプチド多量体。
〔45〕ポリペプチド多量体が第4の抗原結合活性を有するポリペプチドをさらに含む、〔43〕または〔44〕に記載のポリペプチド多量体。
〔46〕第3および第4の抗原結合活性を有するポリペプチドのうち少なくとも1つのポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含む、〔45〕に記載のポリペプチド多量体。
〔47〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖可変領域と抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、第2の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖のアミノ酸配列を含み、第3の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、第4の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含む、〔45〕に記載のポリペプチド多量体。
〔48〕多重特異性抗体である、〔37〕から〔47〕のいずれかに記載のポリペプチド多量体。
〔49〕多重特異性抗体が二重特異性抗体である、〔48〕に記載のポリペプチド多量体。
〔50〕第1の抗原結合活性を有するポリペプチドと第2の抗原結合活性を有しないポリペプチドを有し、第1の抗原結合活性を有するポリペプチドが受容体の抗原結合ドメイン及び抗体Fc領域のアミノ酸配列を含み、第2の抗原結合活性を有しないポリペプチドが抗体Fc領域のアミノ酸配列を含む、〔37〕から〔41〕のいずれかに記載のポリペプチド多量体。
〔51〕抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域がヒトIgG由来である、〔39〕から〔50〕のいずれかに記載のポリペプチド多量体。
〔52〕〔20〕、〔37〕から〔51〕のいずれかに記載のポリペプチド多量体を構成するポリペプチドをコードする核酸。
〔53〕〔52〕に記載の核酸が挿入されたベクター。
〔54〕〔52〕に記載の核酸又は〔53〕に記載のベクターを含む細胞。
〔55〕〔20〕、〔37〕から〔51〕のいずれかに記載のポリペプチド多量体を有効成分として含有する医薬組成物。
本発明の多重特異性抗体の精製及び製造方法は、抗体重鎖定常領域および/または抗体重鎖可変領域のアミノ酸残基を改変することを特徴とする。これらの領域に本発明のアミノ酸残基の改変を導入することによってプロテインAに対する結合力が改変される。さらに、他の目的のアミノ酸改変の効果、例えば、ヒトIgG1と同等以上の血漿中滞留性を得ることも出来る。本発明の方法により、このようなアミノ酸改変の効果を有する多重特異性抗体を高純度に且つ効率的に取得することが出来る。
一般に、IgGタイプの多重特異性抗体を高純度で製造するためには、イオン交換クロマトグラフィーによる精製工程を行う必要がある。しかしこの精製工程の追加は製造の複雑さと製造コストの増大につながる。一方で、単一のイオン交換クロマトグラフィーによるのみに依存した精製は、医薬品の精製方法として頑健性に欠ける可能性がある。そのため、IgGタイプの二重特異性抗体をプロテインA精製工程のみにより製造する方法、あるいは、プロテインA精製工程とイオン交換クロマトグラフィー工程の2工程を用いた頑健性の高い製造方法の開発が課題となっていた。本発明はこのような課題を解決するものである。
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドをコードするDNAを発現させる工程、及び
(b)工程(a)の発現産物を回収する工程、
を含み、
第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドのプロテインAへの結合力に差がつくように、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドの両方又はいずれか一方において1又は複数のアミノ酸残基が改変されていることを特徴とする方法である。
本発明のポリペプチド多量体の製造方法は、プロテインAへの結合力が改変されたポリペプチド多量体の製造方法と表現することも出来る。
また本発明において「第1の抗原結合活性を有するポリペプチド」は「抗原結合活性を有する第1のポリペプチド」と表現することが出来る。「第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチド」は、「抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しない第2のポリペプチド」と表現することが出来る。後述する「第3の抗原結合活性を有するポリペプチド」、「第4の抗原結合活性を有するポリペプチド」も同様に表現することが出来る。
本発明において「含む」は、「含む」、「からなる」のいずれも意味する。
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドをコードするDNAを発現させる工程、及び
(b)工程(a)の発現産物をプロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより回収する工程、
を含み、
第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドのプロテインAへの結合力に差がつくように、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドの両方又はいずれか一方において1又は複数のアミノ酸残基が改変されていることを特徴とする方法である。
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドをコードするDNAを提供する工程、
(b)第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドのプロテインAへの結合力に差がつくように、工程の(a)の第1のポリペプチドをコードするDNA及び第2のポリペプチドをコードするDNAの両方又はいずれか一方において、1又は複数の塩基を改変する工程、
(c)工程(b)のDNAを宿主細胞に導入し、DNAが発現するように宿主細胞を培養する工程、及び
(d)工程(c)の発現産物を宿主細胞培養物から回収する工程。
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドをコードするDNAを提供する工程、
(b)第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドのプロテインAへの結合力に差がつくように、工程の(a)の第1のポリペプチドをコードするDNA及び第2のポリペプチドをコードするDNAの両方又はいずれか一方において、1又は複数の塩基を改変する工程、
(c)工程(b)のDNAを宿主細胞に導入し、DNAが発現するように宿主細胞を培養する工程、及び
(d)工程(c)の発現産物を宿主細胞培養物からプロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより回収する工程。
多量体としては2量体、3量体、4量体等が挙げられるがこれらに限定されない。
従って本発明は、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド、第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチド、及び1つ又は2つの第3の抗原結合活性を有するポリペプチドを含むポリペプチド多量体の製造方法であって、
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、第2の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、及び2つの第3の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを発現させる工程、及び
(b)工程(a)の発現産物を回収する工程、
あるいは、
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、第2の抗原結合活性を有しないポリペプチドをコードするDNA、及び1つの第3の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを発現させる工程、及び
(b)工程(a)の発現産物を回収する工程、
を含み、
第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドのプロテインAへの結合力に差がつくように、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドの両方又はいずれか一方において1又は複数のアミノ酸残基が改変されている方法を提供する。
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、第2の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、及び2つの第3の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを提供する工程、
(b)第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有するポリペプチドのプロテインAへの結合力に差がつくように、工程の(a)の第1及び第2のポリペプチドをコードするDNAの両方又はいずれか一方において、1又は複数の塩基を改変する工程、
(c)第1、第2、及び2つの第3のポリペプチドをコードするDNAを宿主細胞に導入し、DNAが発現するように宿主細胞を培養する工程、及び
(d)工程(c)の発現産物を宿主細胞培養物から回収する工程。
あるいは、
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、第2の抗原結合活性を有しないポリペプチドをコードするDNA、及び1つの第3の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを提供する工程、
(b)第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有しないポリペプチドのプロテインAへの結合力に差がつくように、工程の(a)の第1及び第2のポリペプチドをコードするDNAの両方又はいずれか一方において、1又は複数の塩基を改変する工程、
(c)第1、第2、及び第3のポリペプチドをコードするDNAを宿主細胞に導入し、DNAが発現するように宿主細胞を培養する工程、及び
(d)工程(c)の発現産物を宿主細胞培養物から回収する工程。
また本発明の第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドは、第3のポリペプチド及び第4のポリペプチドと多量体を形成することが出来る。
従って本発明は、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド、第2の抗原結合活性を有するポリペプチド、第3の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第4の抗原結合活性を有するポリペプチドを含むポリペプチド多量体の製造方法であって、
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、第2の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、第3の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第4の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを発現させる工程、及び
(b)工程(a)の発現産物を回収する工程、
を含み、
第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有するポリペプチドのプロテインAへの結合力に差がつくように、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有するポリペプチドの両方又はいずれか一方において1又は複数のアミノ酸残基が改変されている方法を提供する。
上記方法は以下(a)から(d)の工程を含む方法と表現することも出来る。
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、第2の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、第3の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第4の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを提供する工程、
(b)第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有するポリペプチドのプロテインAへの結合力に差がつくように、工程の(a)の第1及び第2のポリペプチドをコードするDNAの両方又はいずれか一方において、1又は複数の塩基を改変する工程、
(c)第1、第2、第3のポリペプチドおよび第4のポリペプチドをコードするDNAを宿主細胞に導入し、DNAが発現するように宿主細胞を培養する工程、及び
(d)工程(c)の発現産物を宿主細胞培養物から回収する工程。
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、第2の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、及び2つの第3の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを発現させる工程、及び
(b)工程(a)の発現産物を回収する工程、
あるいは、
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、第2の抗原結合活性を有しないポリペプチドをコードするDNA、及び1つの第3の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを発現させる工程、及び
(b)工程(a)の発現産物を回収する工程、
を含み、
第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドのプロテインAへの結合力に差がつくように、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドの両方又はいずれか一方において1又は複数のアミノ酸残基が改変されている方法を提供する。
上記方法は以下(a)から(d)の工程を含む方法と表現することも出来る。
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドをコードするDNA、及び2つの第3の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを提供する工程、
(b)第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有するポリペプチドのプロテインAへの結合力に差がつくように、工程の(a)の第1及び第2のポリペプチドをコードするDNAの両方又はいずれか一方において、1又は複数の塩基を改変する工程、
(c)第1、第2、及び2つの第3のポリペプチドをコードするDNAを宿主細胞に導入し、DNAが発現するように宿主細胞を培養する工程、及び
(d)工程(c)の発現産物を宿主細胞培養物から回収する工程。
あるいは、
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、第2の抗原結合活性を有しないポリペプチドをコードするDNA、及び1つの第3の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを提供する工程、
(b)第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有しないポリペプチドのプロテインAへの結合力に差がつくように、工程の(a)の第1及び第2のポリペプチドをコードするDNAの両方又はいずれか一方において、1又は複数の塩基を改変する工程、
(c)第1、第2、及び第3のポリペプチドをコードするDNAを宿主細胞に導入し、DNAが発現するように宿主細胞を培養する工程、及び
(d)工程(c)の発現産物を宿主細胞培養物から回収する工程。
また本発明は、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド、第2の抗原結合活性を有するポリペプチド、第3の抗原結合活性を有するポリペプチド、及び第4の抗原結合活性を有するポリペプチドを含むポリペプチド多量体の精製方法であって、
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、第2の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、第3の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、及び第4の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを発現させる工程、及び
(b)工程(a)の発現産物をプロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより回収する工程、
を含み、
第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有するポリペプチドのプロテインAへの結合力に差がつくように、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有するポリペプチドの両方又はいずれか一方において1又は複数のアミノ酸残基が改変されている方法を提供する。
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、第2の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、第3の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA、及び第4の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを提供する工程、
(b)第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有するポリペプチドのプロテインAへの結合力に差がつくように、工程の(a)の第1のポリペプチドをコードするDNA及び第2のポリペプチドをコードするDNAの両方又はいずれか一方において、1又は複数の塩基を改変する工程、
(c)第1、第2、第3及び第4のポリペプチドをコードするDNAを宿主細胞に導入し、DNAが発現するように宿主細胞を培養する工程、及び
(d)工程(c)の発現産物を宿主細胞培養物からプロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより回収する工程。
本発明のポリペプチド多量体において、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドは異なる抗原に対して結合活性を有することが好ましい。一方第3のポリペプチドは、第1のポリペプチドや第2のポリペプチドのいずれか又は両方と同じ抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。あるいは、第1のポリペプチドや第2のポリペプチドとは異なる抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。
あるいは本発明のポリペプチド多量体は、第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、第3のポリペプチド、及び第4のポリペプチドを含むポリペプチド多量体とすることも出来る。このようなポリペプチド多量体において、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドはそれぞれ、第3のポリペプチド及び第4のポリペプチドと多量体(2量体)を形成することが出来る。例えば、第1のポリペプチドと第3のポリペプチド、第2のポリペプチドと第4のポリペプチドの間でジスルフィド結合を形成することにより、2量体を形成することができる。
本発明ポリペプチド多量体においては、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドは異なる抗原に対して結合活性を有することが好ましい。一方第3のポリペプチドは、第1のポリペプチドや第2のポリペプチドのいずれか又は両方と同じ抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。あるいは、第1のポリペプチドや第2のポリペプチドとは異なる抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。また第4のポリペプチドは、第1のポリペプチドや第2のポリペプチドのいずれかと同じ抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。あるいは、第1のポリペプチドや第2のポリペプチドとは異なる抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。
具体的には、例えば、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドがそれぞれ抗原Aに対する抗体重鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド、抗原Bに対する抗体重鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチドである場合、第3のポリペプチドを抗原Aに対する抗体軽鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド、第4のポリペプチドを抗原Bに対する抗体軽鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチドとすることができる。本発明のポリペプチド多量体がそれぞれ異なる2種類の抗体軽鎖のアミノ酸配を含む第3のポリペプチド及び第4のポリペプチドを有する場合、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドのプロテインAへの結合力の差に加えて、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドのpI値を後述に記載の方法に従って異なる値とする、あるいは、protein Lへの結合力に差をつけることによって、目的のポリペプチド多量体をより高純度に且つ効率的に精製あるいは製造することが可能である。
また、例えば、第1のポリペプチドを抗原Aに対する抗体重鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド、第2のポリペプチドを抗原Bに対する抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列と抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドとし、第3のポリペプチドを抗原Aに対する抗体軽鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド、第4のポリペプチドを抗原Bに対する抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列と抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドとする場合も、本発明を利用することによって、目的の第1〜第4のポリペプチドを有するポリペプチド多量体をより高純度に且つ効率的に精製又は製造することができる。この場合、後述の実施例12に記載のように、ポリペプチドのpI値を改変するアミノ酸変異、目的のポリペプチドの会合を促進するアミノ酸変異(WO2006/106905)を、本発明のプロテインAへの結合力に差のついたポリペプチドに導入することによって、目的の第1〜第4のポリペプチドを有するポリペプチド多量体をより高純度に且つ効率的に精製あるいは製造することが可能である。ポリペプチドの会合を促進するために導入されるアミノ酸変異としては、Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617-21.、Protein Eng Des Sel. 2010 Apr;23(4):195-202.、J Biol Chem. 2010 Jun 18;285(25):19637-46.、WO2009080254等に記載された重鎖定常領域のCH3ドメインの改変により2種類に重鎖定常領域を含むポリペプチドをヘテロ会合化する方法、および、WO2009080251、WO2009080252、WO2009080253等に記載された重鎖と軽鎖の特定の組み合わせの会合化を促進する方法等を用いることも可能である。
scaffoldとしては、少なくとも1つの抗原に結合することができる立体構造的に安定なポリペプチドであれば、どのようなポリペプチドであっても用いることができる。そのようなポリペプチドとしては、例えば、抗体可変領域断片、フィブロネクチン、Protein Aドメイン、LDL受容体Aドメイン、リポカリン等のほか、Nygrenら(Current Opinion in Structural Biology, 7:463-469(1997)、Journal of Immunol Methods, 290:3-28(2004))、Binzら(Nature Biotech 23:1257-1266(2005))、Hosseら(Protein Science 15:14-27(2006))に記載の分子が挙げられるがこれらに限定されない。
抗体の可変領域、レセプター、レセプターとFc領域の融合ペプチド、Scaffold及びこれらの断片の取得方法は当業者に周知である。
抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗原結合タンパク質ドメインを有するポリペプチドと表現することも出来る。
本発明において「抗原結合活性を有しないポリペプチド」とは、抗原結合活性を有していない抗体の断片、Fc領域、Scaffold及びこれらの断片など5アミノ酸以上の長さを有するペプチド及びタンパク質を指す。すなわち抗原結合活性を有しないポリペプチドは、抗体定常領域、Fc領域、Scaffold、又はこれらの断片のアミノ酸配列を含むことが出来るがこれらに限定されない。抗原結合活性を有しないポリペプチドと抗原結合活性を有するポリペプチドを組み合わせることで、抗原に対して1価で結合するポリペプチド多量体を製造することも可能である。
また本発明の第3の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第4の抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含むことが出来る。抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列としては、ヒトkappa、ヒトlambdaタイプの定常領域のアミノ酸配列が挙げることが出来るがこれに限定されない。あるいはこれらの改変体であってもよい。
また本発明の抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体可変領域のアミノ酸配列(例えばCDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3、FR4のアミノ酸配列)を含むことが出来る。
また、目的のポリペプチド多量体が、第1のポリペプチドと第3のポリペプチドで2量体を形成し、第2のポリペプチドと第4のポリペプチドで2量体を形成し、さらにこれら2量体同士が多量体を形成するような4量体である場合には、本発明のポリペプチド多量体として、例えば、第1と第2の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド、第3と第4の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチドを用いることもできるし、第1の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド、第2の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列と抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列を含むポリペプチド、第3の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド、第4の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列と抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドを用いることも出来る。
本発明において「多重特異性抗体」とは、少なくとも2種類の異なる抗原に対して特異的に結合することが可能な抗体を意味する。
本発明において「異なる抗原」には、抗原分子自体が異なることに加え、抗原分子が同一であって抗原決定基が異なることも含まれる。従って、例えば、単一分子内の異なる抗原決定基は本発明の「異なる抗原」に含まれる。また、このような単一分子内の異なる抗原決定基を各々認識する抗体は、本発明において「異なる抗原対して特異的に結合することが可能な抗体」として扱われる。
抗原結合活性を有するポリペプチドのプロテインAへの結合力の強さは、溶出に用いる溶媒のpHと相関し、ポリペプチドのプロテインAへの結合力が強くなるほど、溶出のための溶媒のpHが低くなる。従って「抗原結合活性を有するポリペプチドのプロテインAへの結合力に差がつく」とは、「抗原結合活性を有する2種以上のポリペプチドをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いて溶出する際に、それぞれのポリペプチドの間で溶出溶媒のpHが異なる」と表現することも出来る。溶出溶媒のpHの差としては、0.1以上、好ましくは0.5以上、さらに好ましくは1.0以上が挙げられるがこれらに限定されない。
また本発明においては、当該抗原結合活性を有するポリペプチドの他の活性(例えば血漿中滞留性)を低下させずにプロテインAへの結合力を改変することが好ましい。
・ 2本の第1の抗体重鎖及び2本の共通L鎖からなるホモ抗体、
・ 第1の抗体重鎖、第2の抗体重鎖、及び2本の共通L鎖からなる二重特異性抗体、
・ 2本の第2の抗体重鎖及び2本の共通L鎖からなるホモ抗体
これにより、目的のポリペプチド多量体(二重特異性抗体)を製造又は精製することが可能となる。
(1)第1の抗原結合活性を有するポリペプチド又は第2の抗原結合活性を有する若しくは抗原結合活性を有しないポリペプチドのいずれか一方のポリペプチドのプロテインAへの結合力が増加するように、当該いずれか一方のポリペプチドのアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸残基を改変すること、
(2)第1の抗原結合活性を有するポリペプチド又は第2の抗原結合活性を有する若しくは抗原結合活性を有しないポリペプチドのいずれか一方のポリペプチドのプロテインAへの結合力が低下するように、当該いずれか一方のポリペプチドのアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸残基を改変すること、
(3)第1の抗原結合活性を有するポリペプチド又は第2の抗原結合活性を有する若しくは抗原結合活性を有しないポリペプチドのいずれか一方のポリペプチドのプロテインAへの結合力が増加し、他方のポリペプチドのプロテインAへの結合力が低下するように、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドにおいて1又は複数のアミノ酸残基を改変すること、
が挙げられるがこれらに限定されない。
従って本発明においては、例えば、抗体のFc領域又は重鎖定常領域におけるEUナンバリング250-255位のTLMISR、308-317位のVLHQDWLNGK、430-436位のEALHNHY、
好ましくは250-254位のTLMIS、309-312位のLHQD、314-315位のLN、430位のE、432-436LHNHY、
さらに好ましくは251-254位のLMIS、309-311位のLHQ、314位のL、432-435位のLHNH、
特に252-254位のMIS、309位のL、311位のQ、434-436位のNHYのアミノ酸残基を改変することが好ましい。
抗体の重鎖可変領域のアミノ酸の改変に関しては、FR1、CDR2、FR3が好ましい改変位置として挙げられる。より好ましい改変位置としては、例えば、EUナンバリング H15-H23, H56-H59, H63-H72, H79-H83を挙げることができる。
これらのアミノ酸の改変として、FcRnへの結合を低下させない改変、ヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける血漿中滞留性を悪化させない改変がより好ましい。
またポリペプチドのプロテインAへの結合力が低下するような改変として、抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング435位のアミノ酸残基のアルギニンへの改変が挙げられるがこれらに限定されない。
また、抗体の重鎖可変領域においては、VH3サブクラスの重鎖可変領域はプロテインAへの結合性を有することから、プロテインAへの結合力を高くするためには、上述の改変位置のアミノ酸配列がVH3サブクラスの重鎖可変領域配列と同一であることが好ましく、プロテインAへの結合力を低くするためには、その他のサブクラスの重鎖可変領域配列と同一であることが好ましい。
アミノ酸残基の改変は、後述のようにポリペプチドをコードするDNAにおいて1又は複数の塩基を改変し、当該DNAを宿主細胞で発現させることによって行うことが出来る。当業者であれば、改変後のアミノ酸残基の種類に応じて、改変すべき塩基の数や位置、種類を容易に決定することが出来る。
本発明において改変とは、置換、欠損、付加、挿入のいずれか、又はそれらの組み合わせを意味する。
・二重特異性抗体の2種類のH鎖のヘテロ会合率を高めるためのアミノ酸の改変
・第1の抗原結合活性を有するポリペプチドと第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチド間のジスルフィド結合を安定化させるためのアミノ酸改変
・抗体の血漿中滞留性を改善するためのアミノ酸改変
・酸性条件下における安定性向上のための改変
・ヘテロジェニティー低減のための改変
・脱アミド化反応抑制のための改変
・2種類のポリペプチド間に等電点の差異を導入するための改変
・Fcγレセプターへの結合性を変化させるための改変
以下にこれらのアミノ酸の改変に関して述べる。
本発明のアミノ酸の改変とWO2006106905に記載のアミノ酸の改変を組合わせることが可能である。改変箇所としては、2つの抗原結合活性を有するポリペプチド内の界面を形成するアミノ酸であれば限定されない。具体的には、例えば重鎖定常領域を改変する場合、第1の抗原結合活性を有するポリペプチドの重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング356位と439位、357位と370位、及び、399位と409位の組み合わせのうち、少なくとも1つの組み合わせを同一の電荷を有するアミノ酸に改変すること、第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドの重鎖定常領域のEUナンバリング356位と439位、357位と370位、及び、399位と409位の組合わせのうち、少なくとも1つの組合せを第1の抗原結合活性を有するポリペプチドとは反対の電荷を有するアミノ酸に改変することが挙げられる。より具体的には、例えば、第1の抗原結合活性を有するポリペプチドと第2の抗原結合活性を有するポリペプチドの重鎖定常領域のアミノ酸配列において、いずれか一方のポリペプチドにEUナンバリング356番目のGluをLysに置換する変異を導入し、他方のポリペプチドにEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する変異を導入することが挙げられる。このような改変を本発明の改変と組み合わせることによって、目的のポリペプチドを、プロテインAを用いた精製のみによって、更に高純度で得ることが可能である。
また、第1の抗原結合活性を有するポリペプチドの重鎖可変領域のKabatナンバリング39番目および/または重鎖定常領域のEUナンバリング213番目と、第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドの重鎖可変領域のKabatナンバリング39番目および/または重鎖定常領域のEUナンバリング213番目とを、それぞれ反対の電荷を有するアミノ酸に改変し、第3の抗原結合活性を有するポリペプチドの軽鎖可変領域のKabatナンバリング38番目および/またはEUナンバリング123番目と、第4の抗原結合活性を有するポリペプチドの軽鎖可変領域のKabatナンバリング38番目および/またはEUナンバリング123番目とを、それぞれ反対の電荷を有するアミノ酸に改変することで、第1〜第4の抗原結合活性を有するポリペプチドを含む目的のポリペプチド多量体をより高純度に且つ効率的に精製又は製造することも可能である。
公知の文献(Mol. Immunol. 1993, 30, 105-108及びMol. Immunol. 2001, 38, 1-8)に記載の通り、IgG4重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング228番目のSerをProに置換することでIgG4のヘテロジェニティーが解消され安定な構造の維持が可能である。
血漿中滞留性を制御するために、本発明のアミノ酸の改変と抗体のpI値を改変させるためのアミノ酸の改変を組み合わせることが可能である。定常領域の改変については、例えば、公知の文献(J. Immunol. 2006, 176(1):346-356やNat. Biotechnol. 1997 15(7):637-640等)に記載のEUナンバリング250位や428位等のアミノ酸の改変が挙げられる。また、可変領域の改変としてWO2007/114319やWO2009/041643に記載のアミノ酸の改変が挙げられる。改変されるアミノ酸は、抗原結合活性を有するポリペプチドの表面に露出しているアミノ酸が好ましい。例えば、重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング196位のアミノ酸の置換が挙げられる。重鎖定常領域がIgG4の場合、例えば196番目のリジンをグルタミンに置換することでpI値を低くし、血漿中滞留性を高めることが可能である。
また、血漿中滞留性はFcRnに対する結合力を改変することによっても制御可能である。FcRnに対する結合力改変のためのアミノ酸改変としては、例えば、公知の文献(The Journal of Biological Chemistry vol.276, No.9 6591-6604, 2001やMolecular Cell, Vol.7, 867-877, 2001やCurr Opin Biotechnol. 2009, 20(6):685-91.)に記載の抗体重鎖定常領域のアミノ酸の置換が挙げられる。例えば、EUナンバリング233位、238位、253位、254位、255位、256位、258位、265位、272位、276位、280位、285位、288位、290位、292位、293位、295位、296位、297位、298位、301位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、315位、317位、329位、331位、338位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、415位、424位、433位、434位、435位、436位等の位置のアミノ酸の置換が挙げられる。
重鎖定常領域としてIgG4を利用した場合は、酸性条件下におけるIgG4のhalf-molecule化を抑え安定な4鎖構造(H2L2構造)を維持させることが好ましい。そのため、4鎖構造の維持に重要な役割を果たしているEUナンバリング409位のアミノ酸であるアルギニン(Immunology 2002, 105, 9-19)を、酸性条件下においても安定な4鎖構造を維持するIgG1タイプのリジンに置換することが好ましい。また、IgG2の酸安定性を向上させるためにEUナンバリング397位のアミノ酸であるメチオニンをバリンに置換することも可能である。このような改変を本発明のアミノ酸の改変と組合わせて用いることができる。
本発明のアミノ酸の改変とWO2009041613に記載の方法を組合わせることが可能である。具体的には、例えばIgG1重鎖定常領域のC末端の2アミノ酸、すなわちEUナンバリング446番目のグリシン及び447番目のリジンを欠損させる改変を本発明の実施例に基づくアミノ酸の改変と組み合わせることが可能である。
本発明のアミノ酸の改変と脱アミド化反応の抑制のためのアミノ酸の改変を組合わせることが可能である。脱アミド化反応は、特にアスパラギン(N)とグリシン(G)が隣接した部位(・・・NG・・・)において起こりやすいことが報告されている(Geigerら J. Bio. Chem. 1987; 262:785-794)。本発明のポリペプチド多量体(多重特異性抗体)にアスパラギンとグリシンが隣接した部位が存在する場合には、当該アミノ酸配列を改変することにより脱アミド化反応を抑制することができる。具体的には例えば、アスパラギンとグリシンどちらか一方若しくは両方のアミノ酸を他のアミノ酸に置換する。より具体的には例えば、アスパラギンをアスパラギン酸に置換することが挙げられる。
本発明のアミノ酸の改変と等電点の差異を導入するためのアミノ酸の改変を組合わせることが可能である。具体的な方法は、例えばWO2007/114325に記載されている。本発明の改変に加えて、第1の抗原結合活性を有するポリペプチドと第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドのアミノ酸配列を改変し、これらポリペプチドの等電点の値に差をつけることにより、目的のポリペプチドをより高純度にかつ効率的に精製又は製造することが可能である。また、第3の抗原結合活性を有するポリペプチドと第4の抗原結合活性を有するポリペプチドの等電点に差をつけることで、第1〜第4のポリペプチドを含む目的のポリペプチド多量体をより高純度にかつ効率的に精製又は製造することも可能である。具体的な改変位置としては、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドが抗体重鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチドの場合、例えば、Kabatナンバリングにおける1, 3, 5, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 19, 23, 25, 26, 39, 42, 43, 44, 46, 68, 71, 72, 73, 75, 76, 81, 82b, 83, 85, 86, 105, 108, 110, 112位が挙げられる。第3のポリペプチド及び第4のポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチドの場合、例えば、Kabatナンバリングにおける1, 3, 7, 8, 9, 11, 12, 16, 17, 18, 20, 22, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 49, 57, 60, 63, 65, 66, 68, 69, 70, 74, 76, 77, 79, 80, 81, 85, 100, 103, 105, 106, 107, 108位が挙げられる。一方のポリペプチド中の上記の位置の少なくとも1つのアミノ酸残基を電荷を有するアミノ酸とし、他方のポリペプチド中の上記の位置の少なくとも1つのアミノ酸残基を当該電荷と反対の電荷を有するアミノ酸残基若しくは電荷を有しないアミノ酸残基とすることにより等電点に差をつけることが可能である。
本発明のアミノ酸改変とFcγレセプターへの結合性を変化させる(増加させる、あるいは、低減させる)ためのアミノ酸の改変を組合わせることが可能である。Fcγレセプターへの結合性を変化せる改変としてはCurr Opin Biotechnol. 2009, 20(6):685-91.に記された改変が挙げられるが、これに限定されない。具体的な方法は、例えば、本発明の改変と、IgG1重鎖定常領域のEUナンバリング234番目および235番目のロイシン、および、272番目のアスパラギンを他のアミノ酸に置換する改変とを組合わせることによって、Fcγレセプターへの結合性を変化させることが可能である。置換後のアミノ酸としてはアラニンが挙げられるがこれに限定されない。
本発明において、抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA又は抗原結合活性を有しないポリペプチドをコードするDNAは、既知の配列(天然に存在する配列、存在しない配列)の全長もしくは一部、又はそれらの組み合わせを用いることが可能である。このようなDNAは当業者に公知の方法で取得することができる。例えば、抗体ライブラリーから取得することが可能であるし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子をクローニングして取得することも可能である。
抗体重鎖及び軽鎖をコードする抗体遺伝子を得るための感作抗原は、免疫原性を有する完全抗原と、免疫原性を示さないハプテン等を含む不完全抗原の両方を含む。例えば、目的タンパク質の全長タンパク質、又は部分ペプチドなどを用いることができる。その他、多糖類、核酸、脂質等から構成される物質が抗原となり得ることが知られており、本発明において抗原は特に限定されるものではない。抗原の調製は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、バキュロウィルスを用いた方法(例えば、WO98/46777など)などに準じて行うことができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法(G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46)等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。また、必要に応じ抗原を他の分子と結合させることにより可溶性抗原とすることもできる。受容体のような膜貫通分子を抗原として用いる場合、受容体の細胞外領域部分を断片として用いたり、膜貫通分子を細胞表面上に発現する細胞を免疫原として使用することも可能である。
なお本発明の低分子化抗体及び抗体断片は、さらに抗体重鎖定常領域及び/又は軽鎖定常領域のアミノ酸配列を有することが好ましい。
本発明において「塩基の改変」とは、DNAによってコードされるポリペプチドが目的のアミノ酸残基を有するように、DNAに対して少なくとも1塩基を挿入、欠失又は置換するような遺伝子操作もしくは変異処理を行うことを意味する。即ち、元のアミノ酸残基をコードするコドンを、目的のアミノ酸残基をコードするコドンに変換することを意味する。このような塩基の改変は、部位特異的突然変異(例えば、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488参照)、PCR変異導入法、カセット変異等の方法により行うことができる。一般に、生物学的特性の改善された抗体変異体は70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上(例えば、95%以上、97%、98%、99%等)のアミノ酸配列の相同性及び/又は類似性を元となった抗体の可変領域のアミノ酸配列に対して有する。本明細書において、配列の相同性及び/又は類似性は、配列の相同性が最大の値を取るように必要に応じ配列を整列化、及びギャップ導入した後、元となったアミノ酸残基と相同(同じ残基)又は類似(一般的なアミノ酸の側鎖の特性に基づき同じグループに分類されるアミノ酸残基)するアミノ酸残基の割合として定義される。通常、天然のアミノ酸残基は、その側鎖の性質に基づいて(1)疎水性:アラニン、イソロイシン、バリン、メチオニン及びロイシン;(2)中性親水性:アスパラギン、グルタミン、システイン、スレオニン及びセリン;(3)酸性:アスパラギン酸及びグルタミン酸;(4)塩基性:アルギニン、ヒスチジン及びリジン;(5)鎖の配向に影響する残基:グリシン及びプロリン;ならびに(6)芳香族性:チロシン、トリプトファン及びフェニルアラニンのグループに分類される。アミノ酸の改変数は、例えば10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸とすることが出来るがこれらに限定されない。
本発明の方法によって、上述のように、例えば、所望の、実際に活性を保持する、ポリペプチド多量体を効率的に取得することができる。
このように改変されたポリペプチドをコードするDNAは、適当なベクターへクローニング(挿入)され、宿主細胞へ導入される。ベクターとしては、挿入した核酸を安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターが挙げられる。クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製)などが好ましいが、市販の種々のベクターを利用することができる。本発明のポリペプチド多量体もしくはポリペプチドを生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されない。例えば、試験管内発現であればpBESTベクター(プロメガ社製)、大腸菌内発現であればpETベクター(Invitrogen社製)、培養細胞内発現であればpME18S-FL3ベクター(GenBank Accession No. AB009864)、生物個体内での発現であればpME18Sベクター(Mol Cell Biol. 8:466-472(1988))などが好ましい。ベクターへのDNAの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons.Section 11.4-11.11)。
なお第1から第4のポリペプチドの発現ベクターの構築においては、第1から第4のポリペプチドをコードするDNAを別個のベクターに導入し、発現ベクターとすることが出来る。あるいは、第1から第4のポリペプチドをコードするDNAのうち複数のDNA(例えば第1のポリペプチドをコードするDNAと第2のポリペプチドをコードするDNA)を1個のベクターに導入し、発現ベクターとすることが出来る。1個のベクターに複数のDNAを導入して発現ベクターとする場合、導入されるポリペプチドをコードするDNAの組み合わせは限定されない。
発現産物の回収は、ポリペプチドが培地に分泌される場合は、培地を回収する。ポリペプチドが細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する。
組換え細胞培養物からポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。
本発明においてはプロテインAアフィニティクロマトグラフィーが好ましい。
プロテインAを用いたカラムとしては、Hyper D(PALL製), POROS(Applied Biosystems製), Sepharose F. F. (GE製)、ProSep(Millipore製)等が挙げられるがこれらに限定されない。また、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーには、プロテイン AのIgG結合能をmimicするようなリガンドを結合させた樹脂を用いることもできる。プロテイン A mimicを用いた場合も、本発明のアミノ酸改変により、その結合力に差が生じ、目的のポリペプチド多量体を分離・精製することが可能である。プロテイン A mimicとしては、例えば、mabSelect SuRE(GE Healthcare製)が挙げられるがこれに限定されない。
さらに本発明は、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドを含むポリペプチド多量体であって、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドのプロテインAへの結合力が異なるポリペプチド多量体を提供する。
このようなポリペプチド多量体は、本明細書に記載の方法によって取得することが出来る。またこのようなポリペプチド多量体の具体的な構造や性質は上述の通りである。以下にその概要を示す。
従って本発明は、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド、第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチド、及び1つ又は2つの第3の抗原結合活性を有するポリペプチドを含むポリペプチド多量体であって、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドのプロテインAへの結合力が異なるポリペプチド多量体に関する。このようなポリペプチド多量体もまた、本明細書に記載の方法によって取得することが出来る。
さらに上記のポリペプチド多量体には、第4のポリペプチドが含まれていてもよい。第1のポリペプチド又は第2のポリペプチドのどちらか一方が第3のポリペプチドと多量体を形成し、他方が第4のポリペプチドと多量体を形成することが出来る。
従って本発明は、第1の抗原結合活性を有するポリペプチド、第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチド、第3の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第4の抗原結合活性を有するポリペプチドを含むポリペプチド多量体であって、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドのプロテインAへの結合力が異なるポリペプチド多量体に関する。このようなポリペプチド多量体もまた、本明細書に記載の方法によって取得することが出来る。
また上記第3の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第4の抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含むことが出来る。
また抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体可変領域(例えばCDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3、FR4のアミノ酸配列)のアミノ酸配列を含むことが出来る。
また上記第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドは、抗体重鎖のアミノ酸配列又は抗体軽鎖可変領域と抗体重鎖定常領域からなるアミノ酸配列を含むことが出来る。上記第3の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第4の抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体軽鎖のアミノ酸配列又は抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖定常領域からなるアミノ酸配列を含むことが出来る。
他方のポリペプチドにおいて、抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング435位のアミノ酸残基が一方のポリペプチドとは異なるアミノ酸残基であるポリペプチド多量体を挙げることが出来るがこれに限定されない。
他方のポリペプチドにおいて、抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリングによる435位のアミノ酸残基がアルギニンであるポリペプチド多量体を挙げることが出来るがこれに限定されない。
(1)ヒトIgG由来の抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング435位及び436位のアミノ酸残基がそれぞれヒスチジン(His)及びチロシン(Tyr)に改変されたアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド又は第2のポリペプチドを含むポリペプチド多量体。
このようなポリペプチド多量体として、例えば、配列番号:9、11、13又は15に記載のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド又は第2のポリペプチドを含むポリペプチド多量体が挙げられるがこれらに限定されない。
(2)ヒトIgG由来の抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング435位及び436位のアミノ酸残基がそれぞれアルギニン(Arg)及びフェニルアラニン(Phe)に改変されたアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド又は第2のポリペプチドを含むポリペプチド多量体。
このようなポリペプチド多量体として、例えば、配列番号:10又は12に記載のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド又は第2のポリペプチドを含むポリペプチド多量体が挙げられるがこれらに限定されない。
(3)ヒトIgG由来の抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング435位及び436位のアミノ酸残基がそれぞれアルギニン(Arg)及びチロシン(Tyr)に改変されたアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド又は第2のポリペプチドを含むポリペプチド多量体。
このようなポリペプチド多量体として、例えば、配列番号:14に記載のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド又は第2のポリペプチドを含むポリペプチド多量体が挙げられるがこれらに限定されない。
(4)第1のポリペプチド又は第2のポリペプチドのいずれか一方のポリペプチドにおいて、ヒトIgG由来の抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング435位及び436位のアミノ酸残基がそれぞれヒスチジン(His)及びチロシン(Tyr)に改変されたアミノ酸配列を含むポリペプチド及び、他方のポリペプチドにおいて抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング435位及び436位のアミノ酸残基がそれぞれアルギニン(Arg)及びフェニルアラニン(Phe)に改変されたアミノ酸配列を含む第ポリペプチドを含むポリペプチド多量体。
このようなポリペプチド多量体として、例えば、配列番号:9、11、13又は15に記載のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド及び、配列番号:10又は12に記載のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチドを含むポリペプチド多量体が挙げられるがこれらに限定されない。
(5)第1のポリペプチド又は第2のポリペプチドのいずれか一方のポリペプチドにおいて、ヒトIgG由来の抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング435位及び436位のアミノ酸残基がそれぞれヒスチジン(His)及びチロシン(Tyr)に改変されたアミノ酸配列を含むポリペプチド及び、他方のポリペプチドにおいて抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング435位及び436位のアミノ酸残基がそれぞれアルギニン(Arg)及びチロシン(Tyr)に改変されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むポリペプチド多量体。
このようなポリペプチド多量体として、例えば、配列番号:9、11、13又は15に記載のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド及び、配列番号:14に記載のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチドを含むポリペプチド多量体が挙げられるがこれらに限定されない。
(6)第1のポリペプチド又は第2のポリペプチドのいずれか一方のポリペプチドにおいて、ヒトIgG由来の抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング435位及び436位のアミノ酸残基がそれぞれアルギニン(Arg)及びフェニルアラニン(Phe)に改変されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び他方のポリペプチドにおいて抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング435位及び436位のアミノ酸残基がそれぞれアルギニン(Arg)及びチロシン(Tyr)に改変されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むポリペプチド多量体。
このようなポリペプチド多量体として、例えば、配列番号:10又は12に記載のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド及び、配列番号:14に記載のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチドを含むポリペプチド多量体が挙げられるがこれらに限定されない。
上記第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドは、更に抗体重鎖可変領域を含むことが出来る。また上記(1)から(6)のポリペプチド多量体は、第3のポリペプチド及び/又は第4のポリペプチドを有していてもよい。
また本発明は、EUナンバリング435位及び436位のアミノ酸残基のいずれか一方に変異を有するポリペプチドを含むポリペプチド変異体を提供する。このようなポリペプチド変異体として、実施例に挙げられているポリペプチドを含むポリペプチド変異体が挙げられるがこれらに限定されない。
投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。ポリペプチド多量体もしくはポリペプチド、又はそれらをコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量は、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲に設定することが可能である。又は、例えば、患者あたり0.001〜100000mgの投与量とすることもできるが、本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量及び投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量及び投与方法を設定することが可能である。
また、必要に応じ本発明の多重特異性抗体を、その他の医薬成分と組み合わせて製剤化することもできる。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
〔実施例1〕抗体遺伝子発現ベクターの作製と各抗体の発現
抗体H鎖可変領域として、次のものが使用された。Q153(抗ヒトF.IX抗体のH鎖可変領域、配列番号:1)、Q407(抗ヒトF.IX抗体のH鎖可変領域、配列番号:2)、J142(抗ヒトF.X抗体のH鎖可変領域、配列番号:3)、J300(抗ヒトF.X抗体のH鎖可変領域、配列番号:4)、MRA-VH(抗ヒトインターロイキン-6受容体抗体のH鎖可変領域、配列番号:5)。
抗体L鎖として、次のものが使用された。L180-k(抗ヒトF.IX抗体/抗ヒトF.X抗体共通L鎖、配列番号:6)、L210-k(抗ヒトF.IX抗体/抗ヒトF.X抗体共通L鎖、配列番号:7)、MRA-k(抗ヒトインターロイキン-6受容体抗体のL鎖、配列番号:8)。
抗体H鎖定常領域として、次のものが使用された。IgG4にEUナンバリング228番目のSerをProに置換する変異を導入してC末端のGly及びLysを除去したG4d(配列番号:9)、G4dにEUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異、EUナンバリング436番目のTyrをPheに置換する変異及びEUナンバリング445番目のLeuをProに置換する変異を導入したz72(配列番号:10)、G4dにEUナンバリング356番目のGluをLysに置換する変異を導入したz7(配列番号:11)、z72にEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する変異を導入したz73(配列番号:12)、z7にEUナンバリング196番目のLysをGlnに置換する変異、EUナンバリング296番目のPheをTyrに置換する変異及びEUナンバリング409番目のArgをLysに置換する変異を導入したz106(配列番号:13)、z73にEUナンバリング196番目のLysをGlnに置換する変異、EUナンバリング296番目のPheをTyrに置換する変異、EUナンバリング409番目のArgをLysに置換する変異およびEUナンバリング436番目のPheをTyrに置換する変異を導入したz107(配列番号:14)、IgG1のC末端のGly及びLysを除去したG1d(配列番号:15)。EUナンバリング356番目のGluをLysに置換する変異及びEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する変異は、ヘテロ抗体を産生する際に、各H鎖のヘテロ分子を効率的に形成させるためである((WO 2006/106905) PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY)。
各抗体遺伝子(Q153-G4d、Q153-z7、Q407-z106、J142-G4d、J142-z72、J142-z73、J300-z106、MRA-G1d、MRA-z106、MRA-z107、L180-k、L210-k、MRA-k)は、動物細胞発現ベクターに組み込まれた。
作製した発現ベクターを用いて、以下の抗体をFreeStyle293細胞(invitrogen)へのトランスフェクションにより、一過性に発現させた。以下の通り、トランスフェクションする複数の抗体遺伝子を並べたものを抗体名として表記した。
MRA-G1d/MRA-k
MRA-z106/MRA-z107/MRA-k
Q153-G4d/J142-G4d/L180-k
Q153-G4d/J142-z72/L180-k
Q153-z7/J142-z73/L180-k
Q407-z106/J300-z107/L210-k
Q153-G4d/J142-G4d/L180-k及びQ153-G4d/J142-z72/L180-kを一過性に発現させ得られたFreeStyle293細胞培養液(以下CMと略す)を試料として、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーの溶出条件を検討した。D-PBSで平衡化したrProtein A Sepharose Fast Flowカラム(GE Healthcare)に、φ0.22μmフィルターで濾過したCMを負荷し、表1に示す洗浄1、2、溶出1〜5を段階的に実施した。カラムに負荷する抗体量が20 mg/mL resineになるようにCMの負荷量を調節した。各条件の溶出画分を分取し、陽イオン交換クロマトグラフィー分析により、各溶出画分に含まれている成分を同定した。コントロールには各CMをrProtein G Sepharose Fast Flow樹脂 (GE Healthcare)に負荷し、バッチで溶出することにより精製した試料を用いた。プロテインGは抗体のFab部分に結合するため、プロテインGを用いることで、プロテインAへの親和性とは無関係に、CM中に存在する全ての抗体(目的の2種類のH鎖がヘテロ会合化した二重特異性抗体(ヘテロ抗体)、及び、不純物の1種類のH鎖がホモ会合化した単特異性のホモ抗体)を精製することが可能である。
一方Q153-G4d/J142-z72/L180-kでは、溶出1画分から溶出5画分になるにつれて、各画分に含まれる抗体成分が、ヘテロ抗体Q153-G4d/J142-z72/L180-k次いでホモ抗体Q153-G4d/L180-kの順に変化していることが判明した。ホモ抗体J142-z72/L180-k(FXに対するホモ抗体)は各溶出画分においてほとんど検出されなかったため、プロテインAに対する結合が欠失していることが示唆された。J142-z72に導入されているEUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異により、プロテインAに結合しなくなると考えられる。ホモ抗体J142-z72/L180-k(FXに対するホモ抗体)はプロテインAへの結合部位がなく、ヘテロ抗体Q153-G4d/J142-z72/L180-kは2ヶ所、ホモ抗体Q153-G4d/L180-k(FIXに対するホモ抗体)は4ヶ所となる。ホモ抗体J142-z72/L180-k(FXに対するホモ抗体)はプロテインAに結合せず素通りするため、各溶出画分で検出されなかった。また、Q153-G4d/J142-G4d/L180-k及びQ153-G4d/J142-z72/L180-kともに、pH3.6とそれ以下のpHでヘテロ抗体とホモ抗体Q153-G4d /L180-k(FIXに対するホモ抗体)を分離できる可能性が示唆された。
下記に示す抗体のCMを試料として用いた。
・Q153-G4d/J142-G4d/L180-k
・Q153-G4d/J142-z72/L180-k
・Q153-z7/J142-z73/L180-k
・Q407-z106/J300-z107/L210-k
D-PBSで平衡化したrProtein A Sepharose Fast Flowカラム (GE Healthcare)にφ0.22μmフィルターで濾過したCMを負荷し、表2に示す洗浄1、2、溶出1、2を実施した(Q407-z106/J300-z107/L210-k は溶出1のみの実施)。溶出条件は実施例2の結果を参考にした。負荷する抗体量が20 mg/mL resineになるようにCMの負荷量を調節した。各条件の溶出画分を分取し、陽イオン交換クロマトグラフィー分析により、各溶出画分に含まれている成分を同定した。コントロールには実施例2と同様に、各CMをrProtein G Sepharose Fast Flow樹脂 (GE Healthcare)に負荷し、バッチで溶出することにより精製した試料を用いた。
以上より、ホモ抗体とヘテロ抗体のプロテインA結合部位の数の差を利用し、プロテインAクロマトグラフィー工程のみを用いることで、ヘテロ抗体を高純度にかつ効率的に分離精製することが可能であることを見出した。
実施例3の検討により、二重特異性抗体の各H鎖定常領域にz106(配列番号:13)及びz107(配列番号:14)を用いることで、目的の二重特異性抗体であるヘテロ抗体をプロテインA工程のみにより98%以上の純度で精製可能であることが見出された。一方、プロテインAとヒトFcRnはIgG抗体の同一箇所を認識するため(J Immunol. 2000 164(10):5313-8.)、プロテインAへの結合性を失わせることによって、ヒトFcRnへの結合性も失われる可能性が高い。実際、プロテインAを用いて95%の純度まで二重特異性抗体を精製する方法として報告されているラットIgG2bのH鎖(プロテインAに結合しない)を用いる方法が報告されているが、この方法を用いて精製された二重特異性抗体であるCatumaxomabは、ヒトにおける半減期が約2.1日であり、通常のヒトIgG1の半減期は2〜3週間と比較して極めて短い(非特許文献2)。そこで、実施例3に用いたz106(配列番号:13)とz107(配列番号:14)を定常領域として有する抗体の薬物動態の評価を行った。
ヒトにおける半減期を予測する薬物動態試験として、ヒト FcRnトランスジェニックマウス(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276 +/+ マウス、Jackson Laboratories)を用いた薬物動態の評価は以下の通り行った。IgG1を定常領域として有するMRA-G1d/MRA-k(以下MRA-IgG1)及びz106/z107を定常領域として有するMRA-z106/MRA-z107/MRA-k(以下MRA-z106/z107)をそれぞれマウスに1 mg/kgの投与量で静脈内に単回投与し適時採血を行った。採取した血液は直ちに4℃、15,000 rpmで15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫に保存した。血漿中濃度はELISA法を用いて測定した。
MRA-IgG1及びMRA-z106/z107kのヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける血漿中滞留性の評価を行った結果、図1に示すとおり、MRA-z106/z107はMRA-IgG1と比較して同等以上の血漿中滞留性を示した。これにより、ヘテロ抗体をプロテインA精製工程のみにより高純度にかつ効率的に精製又は製造できる定常領域であるz106/z107は、ヒトIgG1と同等以上の血漿中滞留性を有することが見出された。
抗体H鎖可変領域として、次のものが使用された。
・Q499(抗ヒトF.IX抗体のH鎖可変領域、配列番号:16)
・J339(抗ヒトF.X抗体のH鎖可変領域、配列番号:17)。
抗体L鎖として、次のものが使用された。
・L377-k(抗ヒトF.IX抗体/抗ヒトF.X抗体共通L鎖、配列番号:18)。
抗体H鎖定常領域として、次のものが使用された。
・実施例1に記載のz106にEUナンバリング405番目のLeuをPheに置換する変異を導入したz118(配列番号:19)
・z118にEUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異を導入したz121(配列番号:20)
・z118にEUナンバリング356番目のLysをGluに置換する変異及びEUナンバリング439番目のGluをLysに置換する変異を導入したz119(配列番号:21)
Q499の下流にz118あるいはz121を連結することで、抗ヒトF.IX抗体H鎖遺伝子Q499-z118あるいはQ499-z121が作製された。J339の下流にz119を連結することで、抗ヒトF. X抗体H鎖遺伝子J339-z119が作製された。
各抗体遺伝子(Q499-z118、Q499-z121、J339-z119、L377-k)は、動物細胞発現ベクターに組み込まれた。
作製した発現ベクターを用いて、以下の抗体をFreeStyle293細胞(invitrogen)へのトランスフェクションにより、一過性に発現させた。以下の通り、トランスフェクションする複数の抗体遺伝子を並べたものを抗体名として表記した。
Q499-z118/J339-z119/L377-k
Q499-z121/J339-z119/L377-k
上記2つの抗体は、抗ヒトF.IX抗体H鎖のEUナンバリング435番目のアミノ酸が違うだけである。z118は435番目がHisであり、プロテインAに対する結合能を有しているが、z121は435番目がArgであり、実施例2よりプロテインAに対する結合はなくなると考えられる。Q499はその配列からプロテインAには結合することが予想されるため、Q499-z118/J339-z119/L377-kのホモ体J339-z119/L377-k(FXに対するホモ抗体)はプロテインAへの結合部位が2ヶ所、ヘテロ抗体Q499-z118/J339-z119/L377-kは3ヶ所、ホモ抗体Q499-z118 /L377-k(FIXに対するホモ抗体)は4ヶ所となっている。一方、プロテインA非結合改変が導入されたQ499-z121/J339-z119/L377-kのホモ体J339-z119/L377-kはプロテインAへの結合部位が2ヶ所、ヘテロ抗体Q499-z121/J339-z119/L377-kは2ヶ所、ホモ抗体Q499-z121 /L377-kは2ヶ所となっている。つまり、プロテインA非結合改変(例えばEUナンバリング435番目のアミノ酸をArgに置換する改変)は、可変領域でプロテインAに結合するH鎖にのみ導入しても、プロテインA精製工程のみでヘテロ抗体を高純度かつ効率的に分離精製する効果は得られない。しかし、Q499に結合しない改変プロテインAであるMabSelct SuRe (GE Healthcare)を用いることで、プロテインA非結合改変の効果を出すことができる。MabSelect SuReは工業的要求を満たすために開発された抗体精製用のクロマトグラフィー担体で、リガンドは遺伝子工学的にアルカリ耐性を保持させた組換えプロテインAである。高いpH安定性をもつため、低価格かつ効率的なNaOH による洗浄が可能である。また、Q499などのVH3サブクラスの重鎖可変領域に結合しないという特徴を持っている。Q499-z118/J339-z119/L377-kのホモ体J339-z119/L377-kはMabSelect SuReへの結合部位が2ヶ所、ヘテロ抗体Q499-z118/J339-z119/L377-kは2ヶ所、ホモ抗体Q499-z118 /L377-kは2ヶ所となっている。一方、Q499-z121/J339-z119/L377-kのホモ体J339-z119/L377-kはMabSelect SuReへの結合部位が2ヶ所、ヘテロ抗体Q499-z121/J339-z119/L377-kは1ヶ所、ホモ抗体Q499-z121 /L377-kは0ヶ所となっている。すなわち、MabSelect SuReなど、抗体可変領域に結合しない改変プロテインAと、プロテインA非結合改変を組み合わせることで、重鎖可変領域のプロテインA結合能に関係なく、プロテインA精製工程のみでヘテロ抗体を高純度かつ効率的に分離精製することができると考えられる。
Q499-z118/J339-z119/L377-kおよびQ499-z121/J339-z119/L377-kを発現させたCMの改変プロテインAアフィニティクロマトグラフィーを行った。D-PBSで平衡化したMab Select SuRe カラム(GE Healthcare)にφ0.22 μmフィルターで濾過したCMを負荷し、表7に示す洗浄1、2、溶出を実施した。Mab Select SuReは、組換えプロテインAのIgG結合能を持つ5つのドメイン(A〜E)の内、Bドメインに対して遺伝子工学が施され、その改変Bドメインをテトラマー化した構造から成る。Mab Select SuReは、抗体の可変領域への結合能が欠失しており、それにより通常の組換えプロテインAよりも温和な条件で抗体を溶出することができる、という特徴を持っている。さらに、アルカリ耐性が増強しており、0.1〜0.5 M NaOHでの定置洗浄が可能であるため、生産により適した樹脂である。本実施例では、実施例3のようなpH3.6及びpH2.7の段階的溶出ではなく、表7に示すとおり50 mM Acetic acid(pH未調整、実測pH3.0付近)を採用した。溶出画分を分取し、陽イオン交換クロマトグラフィー分析により各溶出画分に含まれている成分を同定した。コントロールには実施例2と同様に、各CMをrProtein G Sepharose Fast Flow樹脂 (GE Healthcare)に負荷し、バッチで溶出することにより精製した試料を用いた。
一方、Q499-z121/J339-z119/L377-kは、表9に示すとおり、溶出画分に含まれるQ499-z121/L377-k(F.IXに対するホモ抗体)の比率が、コントロールと比較して著しく減少した。これに対し、J339-z119/L377-k(F.Xに対するホモ抗体)及びQ499-z121/J339-z119/L377-k(ヘテロ抗体)の溶出画分の比率は、Q499-z121/L377-kが減少したことに伴い、コントロールと比較し相対的に増加する結果となった。これは、改変プロテインAに対する結合部位が、J339-z119/L377-k(F.Xに対するホモ抗体)が2ヶ所、Q499-z121/J339-z119/L377-k(ヘテロ抗体)が1ヶ所、Q499-z121/L377-k(F.IXに対するホモ抗体)が0ヶ所であり、ほとんどのQ499-z121/L377-kが改変プロテインAに結合せずパスしたためと考えられた。
以上より、プロテインA結合能を有する可変領域を持つ抗体においても、プロテインA非結合改変と改変プロテインAを組み合わせることで、プロテインA精製工程のみで一方のホモ抗体を著しく減少させ、ヘテロ抗体の純度を高めることができることを見出した。
実施例6で調製されたQ499-z118/J339-z119/L377-kとQ499-z121/J339-z119/L377-kの薬物動態評価を行った。
図2のように、プロテインAとヒトFcRnはIgG抗体の同一箇所を認識するため(J Immunol. 2000 164(10):5313-8.)、ヒトFcRnへの結合を保持したままプロテインAへの結合活性を調整することは困難であると予想される。ヒトFcRnへの結合力の保持は、IgGタイプの抗体の特徴であるヒトにおける長い血漿中滞留性(長い半減期)に極めて重要である。そこで、実施例6で調製されたQ499-z118/J339-z119/L377-kとQ499-z121/J339-z119/L377-kの薬物動態を比較した。
ヒトにおける半減期を予測する薬物動態試験として、ヒト FcRnトランスジェニックマウス(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276 +/+ マウス、Jackson Laboratories)を用いた薬物動態の評価は以下の通り行った。Q499-z118/J339-z119/L377-k及びQ499-z121/J339-z119/L377-kをそれぞれマウスに5 mg/kgの投与量で静脈内に単回投与し適時採血を行った。採取した血液は直ちに4℃、15,000 rpmで15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫に保存した。血漿中濃度はELISA法を用いて測定した。
プロテインAによるGC33-IgG1-CD3-scFv分子の精製のための変異導入
抗GPC3 IgG抗体の2つのH鎖のうち、片側のH鎖のみに抗CD3 scFv抗体を付与した分子(図4)の作製を検討した。本分子は、癌特異的抗原であるglypican-3(GPC3)に2価で結合し、T細胞抗原であるCD3に1価で結合することで、癌細胞にT細胞をリクルートし癌細胞を殺傷することが可能であると考えられた。CD3に1価で結合するためには、2つのH鎖のうち、片側のH鎖のみに抗CD3 scFv抗体が付加されている必要があるため、これら2種類のH鎖のヘテロ会合化した分子の精製が必要である。
そこで、実施例3と同様の手法を用いて、一方のH鎖にEUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異を導入し、さらに、2種類のH鎖のヘテロ会合化を促進する改変として WO 2006/106905 (PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY)に記載された変異(一方のH鎖のEUナンバリング356番目のAspをLysに置換し、もう一方のH鎖のEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する)を組み合わせることで、プロテインAクロマトグラフィーのみにより、目的とする分子を精製することが可能かどうかを検証した。
抗体H鎖可変領域として、GPC3(抗ヒトGlypican-3抗体 H鎖可変領域、配列番号:22)をコードする遺伝子を当業者に公知の方法により作製した。抗体L鎖として、GC33-k0(抗ヒトGlypican-3抗体L鎖、配列番号:23)をコードする遺伝子を当業者に公知の方法により作製した。抗体H鎖定常領域として、以下に示す遺伝子を当業者に公知の方法により作製した。
・IgG1にEUナンバリング234番目および235番目のLeuをAlaに置換し、297番目のAsnをAlaに置換する変異を導入して、C末端のGly及びLysを除去したLALA-G1d(配列番号:24)
・LALA -G1dにCD3のscFv(抗ヒトCD3抗体H鎖可変領域及び抗ヒトCD3抗体L鎖可変領域をポリペプチドリンカーで結合したもの)をC末端に結合したLALA-G1d-CD3(配列番号:25)
・LALA-G1dにEUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異及びEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する変異を導入したLALA-G3S3E-G1d(配列番号:26)、LALA-G1d-CD3にEUナンバリング356番目のAspをLysに置換する変異を導入したLALA-S3K-G1d-CD3(配列番号:27)。
抗ヒトGlypican-3抗体のH鎖可変領域GPC3の下流に、H鎖定常領域に抗CD3 scFv抗体を付与したLALA-G1d-CD3あるいはH鎖定常領域であるLALA-G1dを連結することで、抗ヒトGPC3抗体H鎖遺伝子NTA1LあるいはNTA1Rが作製された。さらに、GPC3の下流にH鎖定常領域に抗CD3 scFv抗体を付与し、且つ、EUナンバリング356番目のAspをLysに置換する変異を導入したLALA-S3K-G1d-CD3あるいはEUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異及びEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する変異を導入したLALA-G3S3E-G1dを連結することで、抗ヒトGPC3抗体H鎖遺伝子NTA2LあるいはNTA2Rが作製された。作製した遺伝子は以下の通りである。
H鎖
・NTA1L:GPC3-LALA-G1d-CD3
・NTA1R:GPC3-LALA-G1d
・NTA2L:GPC3-LALA-S3K-G1d-CD3
・NTA2R:GPC3-LALA-G3S3E-G1d
L鎖
・GC33-k0
各抗体遺伝子(H鎖;NTA1L, NTA1R, NTA2L, NTA2R, L鎖;GC33-k0)は、動物細胞発現ベクターに組み込まれた。作製した発現ベクターを用いて、以下の抗体を当業者に公知の方法でFreeStyle293細胞(invitrogen)へトランスフェクションし、一過性に発現させた。以下の通り、トランスフェクションする複数の抗体遺伝子を並べたものを抗体名として表記した(第一のH鎖/第二のH鎖/L鎖)。
・NTA1L/NTA1R/GC33-k0
・NTA2L/NTA2R/GC33-k0
下記に示す抗体のFreeStyle293細胞の培養上清(CM)を試料として用いた。
・NTA1L/NTA1R/GC33-k0
・NTA2L/NTA2R/GC33-k0
D-PBSで平衡化したrProtein A Sepharose Fast Flowカラム (GE Healthcare)にφ0.22μmフィルターで濾過したCMを負荷し、表10に示す洗浄1、2、溶出1を実施した。負荷する抗体量が20 mg/mL resineになるようにCMの負荷量を調節した。溶出画分を分取し、サイズ排除クロマトグラフィー分析により、溶出画分に含まれている成分を同定した。
プロテインAによるmonovalent type抗体分子の精製のための変異導入
通常の抗GPC3 IgG抗体は2つのH鎖により癌特異的抗原であるglypican-3(GPC3)に2価で結合する。本実施例では、1価でglypican-3に結合する抗GPC3 IgG抗体分子(図6)の作製を検討した。本分子は、癌特異的抗原であるglypican-3(GPC3)に1価で結合することで、通常の2価の抗体と比較してavidityではなくaffinityで結合し、さらに抗原をクロスリンクすることなく結合することが可能であると考えられた。Glypican-3(GPC3)に1価で結合するためには、2つのH鎖のうち、片側のH鎖は通常のH鎖であり、もう片方のH鎖は可変領域とCH1ドメインを欠損させたヒンジFcドメインのH鎖である必要があるため、これら2種類のH鎖のヘテロ会合化した分子の精製が必要である。
そこで、実施例3と同様の手法を用いて、一方のH鎖にEUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異を導入し、さらに、2種類のH鎖のヘテロ会合化を促進する改変として WO 2006/106905 (PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY)に記載された変異(一方のH鎖のEUナンバリング356番目のAspをLysに置換し、もう一方のH鎖のEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する)を組み合わせることで、プロテインAクロマトグラフィーのみにより、目的とする分子を精製することが可能かどうかを検証した。
抗体H鎖可変領域として、次のものが使用された。GPC3(抗ヒトGlypican-3抗体 H鎖可変領域、配列番号:22)。
抗体L鎖として、次のものが使用された。GC33-k0(抗ヒトGlypican-3抗体のL鎖、配列番号:23)。
抗体H鎖定常領域として、次のものが使用された。
・IgG1にEUナンバリング234番目および235番目のLeuをAlaに置換し、297番目のAsnをAlaに置換する変異を導入して、C末端のGly及びLysを除去したLALA-G1d(配列番号:24)
・LALA-G1dにEUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異を導入したLALA-G3-G1d(配列番号:28)
・LALA-G3-G1dにEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する変異を導入したLALA-G3S3E-G1d(配列番号:26)
・LALA-G1dのEUナンバリング1番目から215番目までを欠損させたLALA-G1Fc(配列番号:29)、G1FcにEUナンバリング356番目のAspをLysに置換する変異を導入したLALA-G1Fc-S3K(配列番号:30)。
抗ヒトGlypican-3抗体のH鎖可変領域GPC3の下流にH鎖定常領域であるLALA-G1d、EUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異を導入したLALA-G3-G1dあるいはEUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異とEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する変異を導入したLALA-G3S3E-G1dを連結することで、抗ヒトGPC3抗体H鎖遺伝子NTA4L-cont、NTL4L-G3あるいはNTA4Lが作製された。さらに抗ヒトヒンジFcドメインであるLALA-G1FcあるいはEUナンバリング356番目のAspをLysに置換する変異を導入したヒンジFcドメインであるLALA-G1Fc-S3Kとして、Fc遺伝子NTA4R-contあるいはNTA4Rが作製された。作製した遺伝子は以下の通りである。
H鎖
・NTA4L-cont:GPC3-LALA-G1d
・NTA4L-G3:GPC3-LALA-G3-G1d
・NTA4L:GPC3-LALA-G3S3E-G1d
・NTA4R-cont: LALA-G1Fc
・NTA4R: LALA-G1Fc-S3K
L鎖
・GC33-k0
各抗体遺伝子(NTA4L、NTA4L-cont、NTA4L-G3、NTA4R、NTA4R-cont、GC33-k0)は、動物細胞発現ベクターに組み込まれた。
作製した発現ベクターを用いて、以下の抗体をFreeStyle293細胞(invitrogen)へのトランスフェクションにより、一過性に発現させた。以下の通り、トランスフェクションする複数の抗体遺伝子を並べたものを抗体名として表記した。
・NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0
・NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0
・NTA4L/NTA4R/GC33-k0
下記に示す抗体のCMを試料として用いた。
・NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0
・NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0
・NTA4L/NTA4R/GC33-k0
D-PBSで平衡化したrProtein A Sepharose Fast Flowカラム (GE Healthcare)にφ0.22μmフィルターで濾過したCMを負荷し、表12に示す洗浄1、2、溶出1を実施した。負荷する抗体量が20 mg/mL resineになるようにCMの負荷量を調節した。溶出画分を分取し、サイズ排除クロマトグラフィー分析により、溶出画分に含まれている成分を同定した。
NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0はGPC3に対して2価で結合するホモ抗体(NTA4L-contホモ抗体)及びGPC3結合部位を有さないホモ分子(NTA4R-contホモ抗体)が溶出され、目的とするNTA4L-cont/NTA4R-contヘテロ抗体はわずか46.5%であった。
NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0においては、GPC3に対して2価で結合するホモ抗体(NTA4L-G3ホモ抗体)がほとんど検出されなかったが、GPC3結合部位を有さないホモ分子(NTA4R-contホモ抗体)は多く含まれており、目的とするNTA4L-G3/NTA4R-contヘテロ抗体は66.7%であった。NTA4L/NTA4R/GC33-k0においては、GPC3に対して2価で結合するホモ抗体(NTA4Lホモ抗体)がほとんど検出されず、さらにGPC3結合部位を有さないホモ分子(NTA4R)の割合が大幅に低減し、目的とするNTA4L/NTA4Rヘテロ抗体の割合は93.0%まで大幅に向上した。すなわち、EUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異に加えて、各H鎖のヘテロ分子を効率的に形成させるためのEUナンバリング356番目のAspをLysに置換する変異およびEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する変異を導入することで、プロテインA精製工程のみにより、目的とする分子形のヘテロ抗体を93%以上の純度で効率的に精製可能であることが明らかになった。
実施例9に記したように片腕のみ可変領域を有する抗体は、EUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異、WO 2006/106905 (PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY)に記載された変異(一方のH鎖もしくはFcのEUナンバリング356番目のAspをLysに置換し、もう一方のH鎖のEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する)を組み合わせることで、プロテインA精製工程のみで効率よくヘテロ抗体を精製できることが見出された。しかし、溶出液1(2 mM HCl, pH2.7)で溶出するだけでは、ヘテロ抗体の純度は十分に高いとは言えず、更なる精製工程を必要とする。
そこで本実施例では、プロテインAに対する結合部位数が多いほどプロテインAに強く結合し、溶出させるために必要なpHが低くなることを利用したpHグラジェント溶出によるプロテインAカラムクロマトグラフィー精製により、より高純度にヘテロ抗体を分離精製可能かどうかを検証した。pHグラジェント溶出により、ヘテロ抗体の純度を100%近くまで高めることができれば、精製工程のコストダウンと効率化を達成することができる。
下記に示す抗体のCMを試料として用いた。
・NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0
・NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0
・NTA4L/NTA4R/GC33-k0
D-PBSで平衡化したHiTrap protein A HPカラム(GE Healthcare)に、φ0.22μmフィルターで濾過したCMを負荷し、表14に示す洗浄1、2、溶出A・Bを用いたpHグラジェント溶出を順に実施した。pHグラジェント溶出は、溶出A:溶出B(100:0)→(30:70)35分の直線勾配として実施した。溶出画分を分取し、サイズ排除クロマトグラフィー分析により、各溶出画分に含まれている成分を同定した。
各溶出ピークのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果を表15に示した。NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0は、溶出する順番に、GPC3に対して2価で結合するホモ抗体(NTA4L-contホモ抗体)、GPC3に対して1価で結合するヘテロ抗体(NTA4L-cont/NTA4R-concヘテロ抗体)、GPC3結合部位を有さないホモ分子(NTA4R-contホモ抗体)の3成分が検出された。各成分のプロテインAに対する結合部位数が同じ(2つ)であるため、pHグラジェント溶出で3成分を分離することができなかったと考えられる。NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0の溶出1は、GPC3に対して2価で結合するホモ抗体(NTA4L-G3ホモ抗体)及びGPC3結合部位を有さないホモ分子(NTA4R-contホモ抗体)が検出限界以下であり、GPC3に対して1価で結合するヘテロ抗体(NTA4L-G3/NTA4R-concヘテロ抗体)が99.6%であることが判明した。溶出2では、98.8%がGPC3結合部位を有さないホモ分子(NTA4R-contホモ抗体)であることが判明した。NTA4L-G3ホモ抗体はEUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異により、プロテインAに結合できないため、プロテインAカラムを素通りする。また、プロテインAに対する結合部位数はNTA4L-G3/NTA4R-concヘテロ抗体が1つ、NTA4R-contホモ抗体は2つであり、結合部位数が多いほどプロテインAに強く結合し溶出させるために必要なpHが低くなるため、NTA4R-contホモ抗体がNTA4L-G3/NTA4R-concヘテロ抗体よりも低pHで溶出したと考えられる。NTA4L/NTA4R/GC33-k0に関しても概ね同様の結果となった。サイズ排除クロマトグラフィー分析結果は、NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0とほぼ同じ成分比だったが、プロテインAのクロマトグラムには差異があり、NTA4L/NTA4R/GC33-k0の方が溶出1に対する溶出2のピーク面積が小さかった。これはNTA4L-G3/NTA4R-concヘテロ抗体を効率的に形成されるための変異が導入されているため、溶出2のメイン成分であるNTA4R-contホモ抗体の発現比率が低下したためである。上記アミノ酸変異により、pHグラジェント溶出によるプロテインAカラムクロマトグラフィー精製のヘテロ抗体の精製の収率および堅牢性が向上することができた。
以上より、pHグラジェント溶出によるプロテインAカラムクロマトグラフィー精製工程のみによって、ヘテロ抗体を高純度かつ効率的に分離精製することが可能であることを見出した。
CH3ドメインへの変異導入によりプロテインA精製工程によるMonovalent FcalphaレセプターFc融合タンパク質の調製
EternerceptやAbataceptをはじめとする通常のFcレセプターFc融合タンパク質はホモダイマーであり、リガンドに対して2価で結合することができる。本実施例では、リガンドであるIgAに対して1価で結合するFcalphaレセプターFc融合(図9)の作製を検討した。FcalphaレセプターがIgAに1価で結合するためには、2つのFcレセプターFc融合H鎖のうち、片側のH鎖は全長であり、ヒンジFcドメインのH鎖である必要があるため、これら2種類のH鎖のヘテロ会合化した分子の精製が必要である。
そこで、実施例6と同様の手法を用いて、一方のH鎖にEUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異を導入し、さらに、2種類のH鎖のヘテロ会合化を促進する改変として WO 2006/106905 (PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY)に記載された変異(一方のH鎖のEUナンバリング356番目のAspをLysに置換し、もう一方のH鎖のEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する)を組み合わせることで、プロテインAクロマトグラフィーのみにより、目的とする分子を精製することが可能かどうかを検証した。
FcレセプターとしてFcalphaR(ヒトIgA1レセプター、配列番号:31)を使用した。
融合H鎖定常領域として次のものが使用された。
・IgG1のEUナンバリング1番目から223番目までとC末端のGlyおよびLysを欠損させたヒトヒンジFcドメインであるG1Fc(配列番号:32)
・G1FcにEUナンバリング356番目のAspをLysに置換する変異を導入し、さらに435番目のHisをArgに置換する変異を導入したG1Fc-G3S3K(配列番号:33)
・G1FcにEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する変異を導入したG1Fc-S3E(配列番号:34)
FcalphaRの下流にポリペプチドリンカー(配列番号35)を介して、H鎖定常領域であるG1Fc、およびEUナンバリング356番目のAspをLysに、435番目のHisをArgに置換する変異を導入したG1Fc-G3S3Kを連結することで、FcalphaR-Fc融合タンパク質IAL-contおよびIALが作製された。
さらにヒトヒンジFcドメインであるG1FcあるいはEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する変異を導入したヒンジFcドメインであるG1Fc-S3Eとして、Fc遺伝子IAR-contあるいはIARが作製された。作製した遺伝子は以下の通りである。
H鎖
・IAL-cont:FcalphaR-G1Fc
・IAL:FcalphaR-G1Fc-G3S3K
・IAR-cont: G1Fc
・IAR:G1Fc-S3E
各抗体遺伝子(IAL-cont, IAL, IAR-cont, IAR)は、動物細胞発現ベクターに組み込まれた。
作製した発現ベクターを用いて、以下の抗体をFreeStyle293細胞(invitrogen)へのトランスフェクションにより、一過性に発現させた。以下の通り、トランスフェクションする複数の抗体遺伝子を並べたものを抗体名として表記した。
・IAL-cont/IAR-cont
・IAL/IAR
下記に示す抗体のCMを試料として用いた。
・IAL-cont/IAR-cont
・IAL/IAR
D-PBSで平衡化したrProtein A Sepharose Fast Flowカラム (GE Healthcare)にφ0.22μmフィルターで濾過したCMを負荷し、表16に示す洗浄1、2、溶出1を実施した。負荷する抗体量が20 mg/mL resineになるようにCMの負荷量を調節した。溶出画分を分取し、サイズ排除クロマトグラフィー分析により、溶出画分に含まれている成分を同定した。
抗体遺伝子発現ベクターの作製と各抗体の発現
実施例1で調製したヒトF.IXとヒトF.Xに対する二重特異性抗体は、それぞれの抗原を認識する2種類のH鎖と共通のL鎖から構成される。このような共通L鎖を有する二重特異性抗体は取得することが容易ではない。それは2種類の抗原を共通の配列を有するL鎖で認識することが困難であるためである。このように共通L鎖の取得が極めて困難であることから、2種類の抗原を認識する2種類のH鎖と2種類のL鎖から構成される二重特異性抗体のほうが好ましいと考えられるが、2種類のH鎖と2種類のL鎖を発現させると、これらがランダムに組み合わさることで10種類のH2L2型のIgG分子が発現されてしまう。これらの10種類のうち目的とする二重特異性抗体を精製することは極めて困難である。
本実施例では、ヒトIL-6レセプターとヒトglypican-3(GPC3)に対する2種類のH鎖と2種類のL鎖から構成される二重特異性抗体の調製を検討した。2種類のH鎖と2種類のL鎖からなる二重特異性抗体を効率的に調製するためには、同じ抗原に対するH鎖とL鎖の会合を促進し、且つ、2種類のH鎖のヘテロ会合化を促進する必要がある。さらに得られた発現産物から正しい組み合わせを有する二重特異性抗体が精製できる必要がある。
同じ抗原に対するH鎖とL鎖の会合を促進するために、抗GPC3抗体であるGC33のH鎖(GC33-VH-CH1-hinge-CH2-CH3)の可変領域(VH)とL鎖(GC33-VL-CL)の可変領域(VL)をそれぞれ交換したH鎖(GC33-VL-CH1-hinge-CH2-CH3)とL鎖(GC33-VH-CL)を作製した(VHドメインとVLドメインを交換)。GC33-VL-CH1-hinge-CH2-CH3は、GC33-VH-CLとは会合するが、抗IL-6レセプター抗体のL鎖(MRA-VL-CL)との会合はVL/VLの相互作用が不安定なため阻害される。同様にして、抗IL-6レセプター抗体のH鎖(MRA-VH-CH1-hinge-CH2-CH3)は、MRA-VL-CLとは会合するが、抗GPC3抗体のL鎖(GC33-VH-CL)はVH/VHの相互作用が不安定なため阻害される。このようにして、同じ抗原に対するH鎖とL鎖の会合を促進することが可能であるが、VH/VLの相互作用よりは不安定であるがVH/VHおよびVL/VLの相互作用も起こることから(VH/VHの報告:FEBS Lett. 2003 Nov 20;554(3):323-9.、J Mol Biol. 2003 Oct 17;333(2):355-65.、VL/VLの報告:J Struct Biol. 2002 Jun;138(3):171-86.、Proc Natl Acad Sci U S A. 1985 Jul;82(14):4592-6.)、望ましくないH鎖同士およびL鎖同士の会合も少なからず起こってしまう。そのため、VHドメインとVLドメインを交換するだけでは、目的とする二重特異性抗体の割合は向上するものの、やはり10種類程度の組み合わせの産物が発現されてしまう。
抗GPC3抗体のH鎖とL鎖のVHとVLを交換することで、目的とするH鎖とL鎖の組み合わせは向上したが、H54-VH/Hu22-VHおよびL28-VL/GC33-VLの相互作用が完全に抑えられないことから、望ましくないH鎖とL鎖の会合も少なからず起こってしまう。VH/VHの相互作用する際、通常の抗体配列は39番目がグルタミンであり、VH/VH界面においてグルタミン同士が水素結合すると考えられている。そこで、H54-VH/Hu22-VHの相互作用をさらに減弱させるために、Kabatナンバリング39番目のグルタミンをリジンに置換した。これによりVH/VH界面においてリジン同士が静電反発することでVH/VHの相互作用が大幅に減弱すると考えられた。そこで、H54-VHおよびHu22-VHの配列中のKabatナンバリング39番目のグルタミンをリジンに置換したH54-VH-Q39KおよびHu22-VH-Q39Kを作製した。同様にして、VL/VLの相互作用においても、通常の抗体配列は38番目がグルタミンであるため、VL/VL界面においてグルタミン同士が水素結合すると考えられている。そこで、L28-VL/GC33-VLの相互作用をさらに減弱させるために、Kabatナンバリング38番目のグルタミンをグルタミン酸に置換した。これによりVL/VL界面においてグルタミン酸同士が静電反発することでVL/VLの相互作用が大幅に減弱すると考えられた。そこで、L28-VLおよびGC33-VLの配列中のKabatナンバリング39番目のグルタミンをグルタミン酸に置換したL28-VL-Q38EおよびGC33-VL-Q38Eを作製した。
すなわち、抗体H鎖可変領域として、次のものが使用された。
・MRA-VH(抗ヒトインターロイキン-6受容体抗体のH鎖可変領域、配列番号:36)
・GC33-VH(抗GPC3抗体のH鎖可変領域、配列番号:37)
・MRA-VHの等電点を低下させたH54-VH(抗ヒトインターロイキン-6受容体抗体のH鎖可変領域、配列番号:38)
・GC33-VHの等電点を上昇させたHu22-VH(抗GPC3抗体のH鎖可変領域、配列番号:39)
・H54-VHの配列中のKabatナンバリング39番目のGlnがLysに置換されたH54-VH-Q39K(配列番号:40)
・Hu22-VHの配列中のKabatナンバリング39番目のGlnがLysに置換されたHu22-VH-Q39K(配列番号:41)
また、抗体H鎖定常領域として、次のものが使用された。
・IgG1のH鎖定常領域の配列において、EUナンバリング234番目および235番目のLeuがAlaに置換され、297番目のAsnがAlaに置換され、C末端のGly及びLysが除去されたIgG1-LALA-N297A-CH(配列番号:42)
・IgG1-LALA-N297A-CHの配列のN末端にSerが2つ付加されたIgG1-LALA-N297A-CHr(配列番号:43)
・IgG1-LALA-N297A-CHの配列中のEUナンバリング439番目のLysがGluへ置換されたIgG1-LALA-N297A-s3-CH(配列番号:44)
・IgG1-LALA-N297A-CHrの配列中のEUナンバリング356番目のAspがLysへ置換され、435番目のHisがArgへ置換されたIgG1-LALA-N297A-G3s3-CHr(配列番号:45)
また、抗体L鎖可変領域として、次のものが使用された。
・MRA-VL(抗ヒトインターロイキン-6受容体抗体のL鎖可変領域、配列番号:46)
・GC33-VL(抗GPC3抗体のL鎖可変領域、、配列番号:47)
・MRA-VLの等電点を低下させたL28-VL(抗ヒトインターロイキン-6受容体抗体のL鎖可変領域、配列番号:48)
・L28-VLの配列中のKabatナンバリング38番目のGlnがGluに置換されたL28-VL-Q38E(配列番号:49)
・GC33-VLの配列中のKabatナンバリング38番目のGlnがGluに置換されたGC33-VL-Q38E(配列番号:50)
また、抗体L鎖定常領域として、次のものが使用された。
・IgG1-CL(IgG1のL鎖定常領域、配列番号:51)
・IgG1-CLの配列のC末端のAla及びSerが、Arg及びThrに置換されたIgG1-CLr(配列番号:52)
GC33-VLの下流にIgG1-LALA-N297A-CHrを連結することで、遺伝子no2-Gh-Hが作製された。GC33-VHの下流にIgG1-CLrを連結することで、遺伝子no2-Gh-Lが作製された。
H54-VHの下流にIgG1-LALA-N297A-CHを連結することで、遺伝子no3-Ml-Hが作製された。L28-VLの下流にIgG1-CLを連結することで、遺伝子no3-Ml-Lが作製された。Hu22-VHの下流にIgG1-CLrを連結することで、遺伝子no3-Ghh-Lが作製された。
H54-VHの下流にIgG1-LALA-N297A-s3-CHを連結することで、遺伝子no5-Ml-Hが作製された。GC33-VLの下流にIgG1-LALA-N297A-G3s3-CHrを連結することで、遺伝子no5-Gh-Hが作製された。
H54-VH-Q39Kの下流にIgG1-LALA-N297A-s3-CHを連結することで、遺伝子no6-Ml-Hが作製された。L28-VL-Q38Eの下流にIgG1-CLを連結することで、遺伝子no6-Ml-Lが作製された。GC33-VL-Q38Eの下流にIgG1-LALA-N297A-G3s3-CHrを連結することで、遺伝子no6-Gh-Hが作製された。Hu22-VH-Q39Kの下流にIgG1-CLrを連結することで、遺伝子no6-Ghh-Lが作製された。
各遺伝子(no1-Mh-H、no1-Mh-L、no1-Gh-H、no1-Gh-L、no2-Gh-H、no2-Gh-L、no3-Ml-H、no3-Ml-L、no3-Ghh-L、no5-Ml-H、no5-Gh-H、no6-Ml-H、no6-Ml-L、no6-Gh-H、no6-Ghh-L)は、動物細胞発現ベクターに組み込まれた。
以下に示す組み合わせの発現ベクターがFreeStyle293-F細胞に導入され、各目的分子を一過性に発現させた。
説明:天然型抗IL-6レセプター・抗GPC3二重特異性抗体
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド:no1-Mh-H(配列番号:53)、no1-Mh-L(配列番号:54)、no1-Gh-H(配列番号:55)、no1-Gh-L(配列番号:56)
B.目的分子:no2(図12)
説明:no1に対して、抗GPC3抗体のVHドメインとVLドメインを交換
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド:no1-Mh-H、no1-Mh-L、no2-Gh-H(配列番号:57)、no2-Gh-L(配列番号:58)
C.目的分子:no3(図13)
説明:no2に対して、各鎖の等電点を改変する改変を導入
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド:no3-Ml-H(配列番号:59)、no3-Ml-L(配列番号:60)、no2-Gh-H、no3-Ghh-L(配列番号:61)
D.目的分子:no5(図14)
説明:no3に対して、H鎖ヘテロ会合化を促進する改変とプロテインAによりヘテロ会合化した抗体を精製するための改変を導入
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド:no5-Ml-H(配列番号:62)、no3-Ml-L、no5-Gh-H(配列番号:63)、no3-Ghh-L
E.目的分子:no6(図15)
説明:no5に対して、目的のH鎖と目的のL鎖の会合を促進する改変を導入
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド:no6-Ml-H(配列番号:64)、no6-Ml-L(配列番号:65)、no6-Gh-H(配列番号:66)、no6-Ghh-L(配列番号:67)
φ0.22μmフィルターで濾過して得られた培養上清に、培地で平衡化したrProtein A Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare)が添加され、バッチで溶出することにより精製した。プロテインGは抗体のFab部分に結合するため、プロテインGを用いることで、プロテインAへの親和性とは無関係に、CM中に存在する全ての抗体を精製することが可能である。
作製した抗体(no1、no2、no3、no5、no6)の発現パターンを、陽イオン交換クロマトグラフィー (IEC) により評価した。陽イオン交換クロマトグラフィーは、分析用カラムであるProPac WCX-10カラム(Dionex)を用い、移動相Aに20 mM MES-NaOH, pH6.1、移動相Bに20 mM MES-NaOH, 250 mM NaCl, pH6.1を使用し、0.5 mL/minの流速で適切なグラジエントで実施した。各抗体のIECによる評価結果を図16に示した。天然型抗IL-6レセプター・抗GPC3二重特異性抗体のno1では複数のピークが近接しており、いずれのピークが目的とする二重特異性抗体であるのかを判別することは不可能であった。no1に対して、抗GPC3抗体のVHドメインとVLドメインを交換したno2においても同様であった。no2に対して、各鎖の等電点を改変する改変を導入したno3においてはじめて目的とする二重特異性抗体のピークを分離することが可能となった。no3に対して、H鎖ヘテロ会合化を促進する改変とプロテインAによりヘテロ会合化した抗体を精製するための改変を導入したno5において、大幅に目的とする二重特異性抗体のピークの割合が向上した。no5に対して、目的のH鎖と目的のL鎖の会合を促進する改変を導入したno6において、さらに目的とする二重特異性抗体のピークの割合が向上した。
そこで、no6のCMを用いて精製用カラムで目的とする二重特異性抗体を高純度で精製することが可能かどうかを検討した。D-PBSで平衡化したHiTrap protein A HPカラム(GE Healthcare)に、φ0.22μmフィルターで濾過したCMを負荷し、表18に示す洗浄1、2、溶出A・Bを用いたpHグラジェント溶出を順に実施した。pHグラジェント溶出は、溶出A:溶出B(100:0)→(35:65)40分の直線勾配として実施した。
1番目の溶出画分について、20 mM 酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.5で平衡化したHiTrap SP Sepharose HPカラム(GE Healthcare)に添加し、同液で洗浄後に0 mMから500 mMまでNaCl濃度グラジェント溶出を実施した。得られたメインピーク画分について同様の方法で陽イオン交換クロマトグラフィー分析を行った。その結果を図18に示した。目的とする二重特異性抗体を極めて高い純度で精製できていることが示された。
Claims (23)
- 第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドを含むポリペプチド多量体の製造方法であって、該方法は
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドをコードするDNAを発現させる工程、及び
(b)工程(a)の発現産物をプロテインAアフィニティクロマトグラフィーを用いて回収する工程、
を含み、
第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドが抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、
抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域はヒトIgG由来であり、
抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列が以下の(1)及び(2)の改変方法により改変されている、
方法;
(1)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドのEUナンバリング435位のアミノ酸残基と第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドのEUナンバリング435位のアミノ酸残基がそれぞれヒスチジン(H)とアルギニン(R)又は、それぞれアルギニン(R)とヒスチジン(H)になるように改変する改変方法、
(2)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドのEUナンバリング356位と439位のアミノ酸残基をリジン(K)、第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドのEUナンバリング356位と439位のアミノ酸残基をグルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)にそれぞれ改変するか、または第1の抗原結合活性を有するポリペプチドのEUナンバリング356位と439位のアミノ酸残基をグルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)、第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドのEUナンバリング356位と439位のアミノ酸残基をリジン(K)にそれぞれ改変する改変方法。 - 回収されたポリペプチド多量体の純度が95%以上である、請求項1に記載の方法。
- 第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 抗体重鎖可変領域のFR1、CDR2及びFR3のアミノ酸配列において少なくとも1つのアミノ酸残基が改変されている、請求項3に記載の方法。
- ポリペプチド多量体が1つ又は2つの第3の抗原結合活性を有するポリペプチドを含み、工程(a)が当該第3の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを発現させることを含む、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 第3の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の方法。
- ポリペプチド多量体が第4の抗原結合活性を有するポリペプチドをさらに含み、工程(a)が当該第4の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを発現させることを含む、請求項5又は6に記載の方法。
- 第3および第4の抗原結合活性を有するポリペプチドのうち少なくとも1つのポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の方法。
- 第1の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖可変領域と抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、第2の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖のアミノ酸配列を含み、第3の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、第4の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の方法。
- ポリペプチド多量体が多重特異性抗体である、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- 多重特異性抗体が二重特異性抗体である、請求項10に記載の方法。
- 第1の抗原結合活性を有するポリペプチドと第2の抗原結合活性を有しないポリペプチドを有し、第1の抗原結合活性を有するポリペプチドが受容体の抗原結合ドメイン及び抗体Fc領域のアミノ酸配列を含み、第2の抗原結合活性を有しないポリペプチドが抗体Fc領域のアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドを含むポリペプチド多量体の精製方法であって、該方法は
(a)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドをコードするDNAを発現させる工程、及び
(b)工程(a)の発現産物をプロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより回収する工程、
を含み、
第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドが抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、
抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域はヒトIgG由来であり、
抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列が以下の(1)及び(2)の改変方法により改変されている、
方法;
(1)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドのEUナンバリング435位のアミノ酸残基と第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドのEUナンバリング435位のアミノ酸残基がそれぞれヒスチジン(H)とアルギニン(R)又は、それぞれアルギニン(R)とヒスチジン(H)になるように改変する改変方法、
(2)第1の抗原結合活性を有するポリペプチドのEUナンバリング356位と439位のアミノ酸残基をリジン(K)、第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドのEUナンバリング356位と439位のアミノ酸残基をグルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)にそれぞれ改変するか、または第1の抗原結合活性を有するポリペプチドのEUナンバリング356位と439位のアミノ酸残基をグルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)、第2の抗原結合活性を有する又は抗原結合活性を有しないポリペプチドのEUナンバリング356位と439位のアミノ酸残基をリジン(K)にそれぞれ改変する改変方法。 - 回収されたポリペプチド多量体の純度が95%以上である、請求項13に記載の方法。
- 第1の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第2の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む、請求項13または14に記載の方法。
- 抗体重鎖可変領域のFR1、CDR2及びFR3のアミノ酸配列において少なくとも1つのアミノ酸残基が改変されている、請求項15に記載の方法。
- ポリペプチド多量体が1つ又は2つの第3の抗原結合活性を有するポリペプチドを含み、工程(a)が当該第3の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを発現させることを含む、請求項13から16のいずれかに記載の方法。
- 第3の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含む、請求項17に記載の方法。
- ポリペプチド多量体が第4の抗原結合活性を有するポリペプチドをさらに含み、工程(a)が当該第4の抗原結合活性を有するポリペプチドをコードするDNAを発現させることを含む、請求項17又は18に記載の方法。
- 第3および第4の抗原結合活性を有するポリペプチドのうち少なくとも1つのポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の方法。
- 第1の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖可変領域と抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、第2の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖のアミノ酸配列を含み、第3の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、第4の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の方法。
- ポリペプチド多量体が多重特異性抗体である、請求項13から21のいずれかに記載の方法。
- 多重特異性抗体が二重特異性抗体である、請求項22に記載の方法。
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