JPH09506001A - 異種二重特異性抗体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、異種二重特異性抗体の製造法に関する。本発明の課題は、高い純度での異種二重特異性抗体を製造することができるような方法を実施することである。前記課題は、１つのハイブリドーマが、蛋白質Ａの結合ドメインに対する親和性を有する抗体を生産し、別のハイブリドーマは、第一の抗体と比べて、蛋白質Ａの結合ドメインに対して弱い親和性を有するかまたは親和性を有していない抗体を生産するようなハイブリドーマから融合されたクアドロームの製造、該クアドロームの常法による増殖および培養並びに蛋白質Ａの結合ドメインに対してより強い親和性を有する抗体がなお結合しているｐＨを少なくとも０．５単位上回っているｐＨ範囲内でのｂｓＡｋの溶離によって解決される。

Description

【発明の詳細な説明】 異種二重特異性抗体の製造法 本発明は、異種二重特異性抗体の製造法に関する。 下記の概念の定義： 二重特異性抗体ｂｓＡｋ： ｂｓＡｋは、特定の抗原に向けられているモノクローナル抗体に対する相同で ある免疫グロブリン重鎖および軽鎖からなる１つの対であり、他方、別の免疫グ ロブリン重鎖／軽鎖対は、別の抗原を識別するモノクローナル抗体に対する相同 である。このことは、結果として、２つの異なる抗原を同時に結合させるｂｓＡ ｋの能力となる。 異種二重特異性抗体： 前記に関連して、異なる種またはサブクラスの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対を 有するｂｓＡｋは、異種と呼称される。 クアドローム（Quadrom）は、ハイブリッド−ハイブリドーマ（Hybrid-Hybrdo m）である。 クアドロームは、２つの抗体生産ハイブリドーマ細胞を融合することから生じ る。 親抗体： 親抗体は、同様にクアドロームから生産され、かつクアドロームの製造のため に使用された出発クローン のモノクローナル抗体と同一である（図１を見よ）。 二重特異性抗体（ｂｓＡｋ）には、人間の場合に、免疫学的診断［１］から治 療（例えば、腫瘍の免疫学的治療［２］；反発反応および自己免疫反応の抑制、 ［３］）にまで及ぶ多数の使用分野がある。原理的には、ｂｓＡｋは、３つの異 なる方法、化学接合［４］を用いるか、遺伝子工学的方法［５］を用いるかまた は２つのハイブリドーマ細胞系の融合［６］によって製造することができる。２ つのハイブリドーマ細胞系の融合の方法によって製造されるｂｓＡｋには、正確 なグリコシル化を用いて、再現可能な方法で、明確に定義されたクローンから取 得することができる“純粋な”抗体であるという利点がある。しかし、前記方法 の本質的な欠点は、この種のハイブリッド−ハイブリドーマの培養上清が、免疫 グロブリン重鎖および軽鎖の自由な組み合わせによって生じる１０個までの異な る抗体分子を含有していることである。前記の理由から、相対的に費用のかかる 精製法が、正確にペアリングされた二重特異性抗体の単離のために必要とされて いる。 ほとんど全ての普及しているクロマトグラフィー法、例えば陽イオン交換クロ マトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマ トグラフィー、水酸燐灰石および親和クロマトグラフィーを利用するｂｓＡｋの ための一連の精製法がある 。前記の全ての方法に共通する特徴は、最適の純度が少なくとも２つの異なる分 離メカニズム（カラム通路）の使用後にようやく達成できるということである。 このことは、大規模工業的な精製にとっては１つの本質的な欠点である。最近使 用されることがますます多くなっておりかつ前記の欠点を回避しようと試みられ ている方法を、本明細書中で詳細に論じなければならない。この場合、陽イオン 交換クロマトグラフィー（ＫＡ）のことである。前記の分離技術は、適当な酸性 のｐＨ（多くの場合、ｐＨ４．５〜５．８）での種々の免疫グロブリンの多種多 様の電荷に基づくものであり、かつ一定の前提条件下で、精製工程でのｂｓＡｋ 画分を単離できるようにしている。 一工程精製の利点は、就中、ｂｓＡｋの大規模工業的精製の際に重要である一 連の欠点と相対している： ａ）ＫＡカラムには、免疫グロブリンだけでなく、［８］から知られているよう に、全ての他の適当なｐＨでプラスに帯電している蛋白質（例えば、ウシ血清ア ルブミンあるいはまたウシ免疫グロブリン）が結合しており； ｂ）前記により、ｂｓＡｋのためのカラムの容量が同時に低下し、 ｃ）前記により、重鎖および軽鎖の間でのペアリングの可能性は、マウス／マウ スもしくはラット／ラット−クアドローム中で、一般には制限されておらず［７ ］、１０個までの抗体変異体が存在する。ＫＡカラムは、この種の変異体を、電 荷の違いに基づき、一定の度合いまで分離することができる［８］。しかし、原 理的には、このことは、モノクローナルの親抗体が、分離のために使用される適 当な緩衝液系の場合に、十分にそのＩｇ軽鎖およびＩｇ重鎖の電荷で異なってい るようなｂｓＡｋの場合にのみ可能である。即ち、不十分な抗体組合せ物を有す る特定のｂｓＡｋは、ＫＡクロマトグラフィーを用いる精製が不可能である。 ｄ）高価な分離材料 ｅ）先行する濃縮工程、例えば塩沈殿によって、ｂｓＡｋの部分的な変性が可能 である。 更に、マウスのサブクラスが、多種多様のｐＨ値で蛋白質Ａから溶離可能であ ることは、Ey 他［９］から公知である。また、蛋白質Ａの前記の性質を、マウ ス／マウス−クアドロームのｂｓＡｋ画分の精製のために使用しようとする試み も既に行われた。上記の方法の最も本質的な欠点は、次のことである： １．これまでに記載された精製法［１０、１１］の場合、先ず全ての分泌された 抗体変異体が蛋白質Ａに結合される。従って、本明細書中に記載された方法の場 合よりも３分の１少ない容量が、蛋白質ＡカラムへのｂｓＡｋの結合のために提 供されている。 ２．蛋白質Ａへのマウス／マウス−クアドロームから分泌された全ての抗体変異 体の前記の結合の結果とし て、連続的ｐＨ溶離を用いる、精製すべきｂｓＡｋ画分からの望ましくない親抗 体の分離は、あまり厳密ではない。 ３．ｂｓＡｋの製造および精製の際の本質的な要因は、Ｉｇ重鎖およびＩｇ軽鎖 の欠陥ペアリング（Fehlpaarung）の制御である。前記の点は、マウス／マウス もしくはラット／ラットｂｓＡｋ組合せ物の場合に、解決不可能な課題となりう る。 本発明の課題は、例えば高い純度での異種二重特異性抗体を製造することが可 能であるような種類の方法を提供することである。 前記課題は、請求項１の特徴部によって解決される。従属請求項には、この方 法の有利な実施態様もしくはこの方法で製造可能な有利な抗体が記載されている 。 請求項１に記載の方法には、上記の方法と異なり以下の利点がある： 出願人らによって提案された異種ｂｓＡｋ組合せ物の場合、就中、サブクラス の差異などが存在しないような双方の軽鎖の証拠は、ｂｓＡｋの品質管理を決定 的に容易にすることである。 出願人によって、マウス／ラット−クアドローム中で、より高いｂｓＡｋ収率 は、有利な正確なＩｇ重鎖／Ｉｇ軽鎖の対によって可能であることが見出された 。 出願人らの方法の場合、ｂｓＡｋに関わる親抗体の１つは、原則的に蛋白質Ａ には結合しないので、ｂｓＡｋ画分および蛋白質Ａに結合している第二の親抗体 画分の識別は、本質的により良好である。前記の発見によって、異種ｂｓＡｋの 精製法のより良好な利用は、蛋白質Ａを介するマウス／マウスまたはラット／ラ ットｂｓＡｋと比べて更なる規模になる。Ｉｇ重鎖およびＩｇ軽鎖の欠陥ペアリ ングの本質的により少ない量（それぞれクローン組合せ物に応じて、７０％から １０〜３０％への減少、図１を見よ）によって、エネルギーおよび費用（恒温器 用の電流、増殖培地等）の莫大な金額および蛋白質Ａカラムの容量が節約される 。 本発明の原理は、蛋白質Ａと比べて、同種−（ＣＨ2−ＣＨ3）２免疫グロブリ ン領域および異種−（ＣＨ2ＣＨ3）（ＣＨ2′−ＣＨ3′）免疫グロブリン領域の 多種多様の親和定数に基づいている。この場合、異種（ＣＨ2−ＣＨ3）立体配置 の際に、ＣＨ2−ＣＨ3−領域だけが蛋白質Ａへの結合に有用である。第二のＣＨ 2′−ＣＨ3′−領域は、事情によっては、蛋白質ＡへのｂｓＡｋの既に実施され た結合後に、更に保護することができる。蛋白質Ａと比べて、同種立体配置およ び異種立体配置を有する免疫グロブリンの多種多様な親和定数は、二重特異性成 分の精製に利用される。 ｂｓＡｋのための前記の新規精製原理の本質的な点 は、同様にクアドローム細胞から分泌される親抗体の１つが蛋白質Ａには結合し ないことである。即ち、第二のハイブリドーマ細胞系と融合してクアドロームに されるハイブリドーマ細胞系の１つは、蛋白質Ａには結合していない抗体を生産 するのである。前記の条件から、前記の双方の抗体変異体のできるだけ清浄な分 離のために重要である蛋白質Ａと比べて、ｂｓＡｋの親和定数と第二の親抗体（ 十分に蛋白質Ａに結合していなければならない）との間の相対的に多くの差異も 生じている。前記の重要な前提条件は、マウス抗体を生産する細胞系とラット抗 体を生産する細胞系との融合によって最も効率よく達成される。ラット抗体サブ クラスＩｇＧ２ｃは、唯一のラット抗体のとしての該ラット抗体サブクラスには 、蛋白質Ａに対する十分に高い親和性があるので、前記の規則から除外される。 前記の前提条件を充足するもう１つのペアリング法は、ヒトのサブクラスＩｇ Ｇ３（蛋白質Ａに結合していない）と、ヒトのサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ およびＩｇＧ２ｂの１つとの組合せ物である。 ｂｓＡｋのできるだけ簡単な精製のために本質的に重要であるもう１つの点は 、クアドローム細胞中の種の中での免疫グロブリン重鎖および軽鎖の明らかに主 要な対である。即ち、ラット−ハイブリドーマとマウス−ハイブリドーマとの融 合から生じるクアドローム中で、マウスのＩｇ軽鎖が大部分はマウスのＩｇ重鎖 と対をなし、同様にラットのＩｇ重鎖がラットのＩｇ重鎖と対をなしている。こ れとは異なり、重鎖の対は、明らかに制限されていない。マウス／マウス−クア ドローム中の重鎖および軽鎖の自由な組合せ可能性を研究している一連の研究は 、一般に、それぞれ２個のＩｇ重鎖およびＩｇ軽鎖の間の自由な組合せ可能性に 関する制限が存在しないという結果になっている［７］。即ち、マウス／マウス −クアドロームから分泌された全ての抗体変異体の総和を１００％とした場合に は、正確にペアリングされた二重特異性成分のパーセントでの割合は７．５％〜 １０％の間で変動している［７、８］。 これとは異なり、出願人らによって研究された異種マウス／ラット−クアドロ ームの場合、正確にペアリングされたｂｓＡｋの割合は、ほぼ３倍に増大して２ ０〜３０％になっている。この場合、より高い割合は、明らかに更に存続する重 鎖の自由な組合せのために互いに不可能である。 要約すれば、異種ｂｓＡｋの製造および引き続く蛋白質Ａによる精製には、次 の利点がある： ａ）通常のマウス／マウス−クアドロームまたはラット／ラット−クアドローム と比べて、正確にペアリングされたｂｓＡｋのほぼ３倍までに増大された割合、 ｂ）親の出発抗体の１つがヒトのサブクラスＩｇＧ３（またはそのＣＨ2−ＣＨ3 領域）を有する場合には、 ヒト化された抗体のｂｓＡｋ自体が単離できる。この場合、例２中に詳細に記載 されているように、ラット−Ｆａｂドメインおよびマウス−Ｆａｂドメインの正 確なペアリングを、更に利用することができ、 ｃ）極めて類似した等電点を有する親の出発抗体を基礎とし、ひいては陽イオン 交換クロマトグラフィーにより識別不可能であるｂｓＡｋが単離可能になり、 ｄ）ｂｓＡｋの極めて僅かな変性から変性なしで生じる特に穏和な条件下での蛋 白質ＡによるｂｓＡｋ成分の簡単な一工程精製、このことによって、こうして取 得されたｂｓＡｋは新たな品質を有し、 ｅ）ウシ免疫グロブリンは、７を上回るｐＨで、高度な塩条件下で（１Ｍを上回 るＮａＣｌ）ではじめて蛋白質Ａに結合するので、ウシ免疫グロブリンによる汚 染がなく、 ｆ）血清中に含有されている別の蛋白質は、原理的には蛋白質Ａに対して親和性 を有していないので、血清中に含有されている別の蛋白質による汚染がなく、 ｇ）蛋白質Ａは、スペーサーを有する別のクロマトグラフィーの分離媒体と比べ て、最も安価な分離媒体であり、 ｈ）蛋白質Ａは、既により低い圧力で傑出した分離性質を有し、その結果、高価 なＨＰＬＣ技術は必要でなく、就中、大規模工業的な使用のために本質的により 有用なＦＰＬＣ技術を使用することができ、 ｉ）ラット／マウス−クアドロームの場合のＩｇ重鎖およびＩｇ軽鎖の欠陥ペア リングの度合いが、（選択的に軽鎖および重鎖を認識する）種特異性抗血清を用 いて測定することができる。 前記の改善点の全ての総和は、僅かなｂｓＡｋ収率のクアドローム技術の冒頭 で記載された欠点を相殺し、かつ前記方法の誰もが認める利点がある。本明細書 中で紹介されている方法は、本質的に、臨床におけるｂｓＡｋ治療の中断に必要 とされるｂｓＡｋの膨大な量を安価に提供するのに有用でありうる。 蛋白質Ａは、黄色ブドウ球状菌（Staphylococcus aureus）の細胞壁成分であ り、かつ互いに親和性を有する一連の種およびサブクラスの免疫グロブリンのＦ ｃ領域に結合している。これは、４２Ｋｄａの大きさのポリペプチド鎖であり、 かつ５個のドメインを含有している。４個の極めて相同なドメインは、そのそれ ぞれ１つ１つは、一価のＦｃ結合ドメインに相応し、順次配列されている。トリ プシン消化を用いて、前記の相同ドメインに相応し、かつ７ＫＤａの大きさを有 する活性フラグメントを単離することができる。フラグメントは、２：１の化学 量論比を有する免疫グロブリンのＦｃ部分に結合している。結晶学的データから 、この種の蛋白質ＡフラグメントがＣＨ2領域とＣＨ3領域との間の位置で、ＣＨ 2領域のＣ−基部の突出部の若干のアミノ酸基が共に作用しながら結合している ダイ ゼンホーフア（Deisenhofer）［９］を導き出すことができた。 要するに、明らかに２個の免疫グロブリンは、蛋白質Ａ分子に結合している、 この場合、蛋白質Ａ分子の４個の相同ドメインが関与していると言うことができ る。従って、カラム材料として、少なくとも２つの関連するフラグメントＢ（結 合ドメイン）を含有する蛋白質Ａのフラグメントを使用することが可能である。 本発明は、以下に図面に基づき、実施例により詳細に説明される。 この場合、図１は、ハイブリッド−ハイブリドーマ細胞から分泌された抗体異 性体の全てを示している。図２は、蛋白質ＡによるｂｓＡｋ精製の経過を示して いる。図３および図４は、図２の双方のピークの構成を示している。 例 １ 第１のｂｓＡｋを、異なる種の２つのハイブリドーマ細胞の融合によって製造 された１つのクアドロームから生産する。 出発クローンは、１）サブクラスＩｇＧ２ｂアンチ−マウス−ＣＤ３ラット抗 体並びにサブクラスＩｇＧ２ａのアンチ−マウス−Ｔｈｙ−１．２マウス抗体を 生産する。 ｂｓＡｋの１リットルの培養上清を、ｐＨ７に調節し、かつ０．２ｍｍのフィ ルターで除菌濾過した。こ うして得られた培養上清を、一晩、５ｍｌの蛋白質Ａ−カラムを介して導き、引 き続き、１０カラム容量のＰＢＳと結合していない血清成分並びに蛋白質Ａに結 合しない親のラット抗体およびホモＦｃ変異体を除去した。それから更に、ｐＨ ５．９に調節された０．１ＭのＮａクエン酸塩緩衝液を用いてｂｓＡｋを溶離し た。この場合、蛋白質Ａが結合している担体材料の粒度が５０μｍ未満である場 合に有利である。こうして、１００μｍの粒度を有する担体材料と比べて、本質 的に先鋭な溶離のピークを達成することができた。相対的に高いｐＨは、前記の 場合専ら、ヘテロ−Ｆｃ（ＣＨ₂−ＣＨ₃／ＣＨ₂′−ＣＨ₃′）−立体配置を有す る抗体変異体が溶離液中に存在することが保証される。マウスに由来するＣＨ2 −ＣＨ3領域への蛋白質Ａ分子の結合ドメインだけがｂｓＡｋ中に存在するので 、７から５．８５へのｐＨの低下は、ｂｓＡｋの切断には既に十分である。蛋白 質Ａ′の最終的な再生のために、ｐＨ３．５に調節された０．１ＭのＮａクエン 酸塩緩衝液が、カラムを介して導かれ、これによって、マウスに由来する結合さ れたホモ−Ｆｃ（ＣＨ2−ＣＨ3）２変異体も切断される。この場合、親のマウス 抗体およびホモ−マウスＦｃ変異体のより高い結合親和性は、付加的な２つの相 互作用する蛋白質Ａ結合ドメインに基づいている。蛋白質Ａ上のｂｓＡｋ精製の 過程は、図２中に示されている。 ｂｓＡｋ （ｐＨ５．８５）および親のマウス抗体（ｐＨ３．５）画分の精製 を、モノＳ陽イオン交換体カラム（図３および図４）を用い並びにＥＬＩＳＡ中 で試験した。 抗体の多種多様の糖化によって、相応する蛋白質Ａ溶離画分に相応するピーク は、ＫＡ−クロマトグラフィーの場合に複数のピークに分かれている（例１によ る純粋なｂｓＡｋが複数のピーク分かれている図３を見よ）。 図４は、親のマウス抗体の組成を示している。欠陥ペアリングは、ピーク３中 に含まれている。ｂｓＡｋは、ピーク４中に痕跡成分として含まれている。前記 のダイアグラムから、欠陥ペアリングが、マウス／マウス−クアドロームと異な り、本質的に制限されて存在していることが判明する。従って、多種多様のハイ ブリドーマが融合されているような前記の変性されたクアドローム法は、特にｂ ｓＡｋの製造の適している。 ｐＨ範囲の定義 １．ｐＨ５未満で、親マウスＩｇＧ２ａ抗体の溶解が開始する。ｐＨ６．８未満 で、ｂｓＡｋの溶解が開始する。 ２．ｐＨ５．２を上回ると、親ＩｇＧ２ａマウス抗体の溶解はない（２％未満） 。 ｐＨ６でのｂｓＡｋの量的溶離、より少ないｂｓＡ ｋ濃度を有する溶離緩衝液のより長い滞留時間後。 ３．短い溶離時間および最大ｂｓＡｋ濃度を伴う最適範囲（ｐＨ５．８±０．２ ）。１００μｍを上回る直径を有する粗粒状の支持体上の蛋白質Ａは、５０μｍ 未満の支持体上の蛋白質Ａよりも分離に適していないことを示している。 陽イオン交換クロマトグラフィーのための注：モノＳ経過曲線の経過条件は、 同一である。５０〜８００ｍＭのＮａＣｌ勾配を使用し、この場合、ｐＨは、５ ０ｍＭのＭＥＳを用いてｐＨ５．５で一定に保持した。 異種ハイブリッド−ハイブリドーマ（Ｇ２）の培養上清中での個々の抗体変異 体の量比の評価。 個々の抗体変異体のパーセントでの量比の評価のために、１．モノＳ経過曲線 の個々の明白に定義されたピークの下での面積を採用し、かつ２．個々のピーク のＥＬＩＳＡ−データを考慮した。クアドロームＧ２については、前記の方法を 用いて、常用のマウス／マウスクアドロームと比べて２．５倍のｂｓＡｋ収率の 増大に相応する２０〜２５％の正確にペアリングされたｂｓＡｋの値を定めるこ とができた。クアドローム細胞中のマウスおよびラットのＩｇ重鎖の任意のペア リングに基づき、ｂｓＡｋ画分について３３％の値を上回ることができないので 、既にほぼ最適の収率の２０〜２５％の収率で存在している。 例 ２ａ この実施例は、１つ、の種の中でさえも、蛋白質ＡによるｂｓＡｋ成分の一工 程精製が可能であることを示している。前記の場合、関係した出発抗体の１個は 、蛋白質Ａには結合していない１個のサブクラスを有していなければならない。 出願人らの具体例では、ｂｓＡｋは、２個のヒト化された抗体から構成されてい る。この場合、クローンＡ中では、ＣＨ2−ＣＨ3ドメインの本来マウスの配列が 、サブクラスＩｇＧ１のヒトの配列によって代替されていた。これとは異なり、 クローンＢ中では、ＣＨ2−ＣＨ3ドメインの本来ラットの配列が、サブクラスＩ ｇＧ３のヒトの配列によって代替えされていた。この場合、ヒトのサブクラスＩ ｇＧ３は、蛋白質Ａに結合していないｂｓＡｋの割合である。 原理的には、この実施例中でのヒトのサブクラスＩｇＧ１は、それぞれ別の蛋 白質Ａに結合しているヒトのサブクラスによって代替することができる。 この種のクアドロームの培養上清からのｂｓＡｋの精製は、原則的に、例１中 に示された実験記録により行うことができる。 例 ２ｂ 例２ａのこの変法の場合、２個の完全にヒト化された抗体のｂｓＡｋが重要で あり、この内の１個の成分は、ヒトのサブクラスＩｇＧ３のＣＨ2−ＣＨ3領域を 有している。もう１個のｂｓＡｋに関係したヒトのサブクラスが蛋白質Ａに結合 していることを考慮する場合には、この場合に記載された精製原理を、この種の ヒト抗体に同様に適用することができる。 例 ３ 例３では、適当な出発クローンの融合によって、本明細書中で記載された精製 法の利点を、ｂｓＡｋの望ましい一価の結合と組み合わせることができることを 示している。この具体的な場合では、重要な特異性を有するラット抗体を、それ ぞれ試験管内もしくは生体内系中で重要でない特異性のマウス抗体と融合させた 。一方で、親の二価のラット抗体を、該抗体が蛋白質Ａに結合していないので、 既に、蛋白質Ａカラムの負荷の際に分離させた。できるだけ高い収率が、この実 施例の場合、同様に、ラットの重鎖と軽鎖との有利なペアリングにより保証され ている。この場合に記載された変法のもう１つの利点は、関係したラット抗体が 、サブクラスＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ１に属していなければならない場合に、マ ウスサブクラスＩｇＧ２ａによって取得されたｂｓＡｋの効果器機能である。 例 ４ 例４中には、ヒト抗原に対して向けられたモノクローナル抗体と、マウスの抗 原に対して向けられた抗体との組合せ物を取り扱う。この種のｂｓＡｋは、 １．関与するモノクローナル抗体の種もしくはサブク ラスの適当な選択によって、マウス／ラット−クアドロームの場合に、ｂｓＡｋ 並びに向上された正確な免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の精製のためのこの場合に 記載された本発明の利点を利用することができ、 ２．冒頭に記載された特異性に基づき、ヒトもしくはマウスの場合に、それぞれ 、１つの結合手（一価の）だけにより結合していることができ、この場合、例え ば特定のリンパ球集団の不足のような特定の治療形のために１つの性質が重要で あり、 ３．関係した抗体の適当なサブクラス選択によって特定の効果器機能を有するこ とができ、 ４．マウスの場合でのその生物学的適合性について臨床前に試験することができ 、ひいてはヒトの場合でのその性質についての結論を導き出すことができた。 例 ５ Rousseaux 1981［13］により、ラットサブクラスＩｇＧ２ｃが、ラットサブク ラスの唯一のものとして蛋白質Ａに結合していることが明らかであり、融合成分 の１つがラットサブクラスＩｇＧ２ｃを生産するようなラット／ラットクアドロ ームのｂｓＡｋは、同様に例１中に記載された実験記録により精製することがで きる。これは、同時に、蛋白質Ａを用いる、ラットのｂｓＡｋのための第一の精 製法であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．異種二重特異性抗体を製造するための方法において、 ａ） １つのハイブリドーマが、蛋白質Ａの結合ドメインに対する親和性を有す る抗体（１）を生産し、この場合、抗体（１）は、マウス抗体、サブクラスＩｇ Ｇ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４のヒト抗体もしくはヒト化された抗体またはサブクラ スＩｇＧ２ｃのラット抗体であり、かつ別のハイブリドーマが、抗体（１）と比 べて蛋白質Ａの結合ドメインに対して弱い親和性を有するかまたは親和性を有し ていない抗体（２）を生産し、この場合、抗体（２）は、サブクラスＩｇＧ１、 ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３のラット抗体またはサブクラスＩｇＧ３のヒ ト抗体もしくはヒト化された抗体であるようなハイブリドーマから融合されたク アドロームの製造、 ｂ）常法でのクアドロームの増殖および培養、 ｃ）蛋白質Ａの結合ドメインを官能基として含有する材料で被覆されたカラム上 へのクアドローム培養上清の装填、 ｄ）相応するｐＨ範囲内での結合していない蛋白質の洗浄除去および ｅ）蛋白質Ａの結合ドメインに対してより強力な親和性を有する抗体がなお結合 しているｐＨを少なくとも ０．５単位上回っているｐＨ範囲内でのｂｓＡｋの溶離 からなることを特徴とする、異種二重特異性抗体の製造法。 ２．マウス抗体がサブクラスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ３の抗体で ある、請求項１に記載の方法。 ３．異種ｂｓＡｋが、サブクラスＩｇＧ２ｂのラット抗体と融合したサブクラ スＩｇＧ２ａのマウス抗体からなる、請求項１または２に記載の方法。 ４．異種ｂｓＡｋが、サブクラスＩｇＧ３のヒト抗体またはヒト化された抗体 と融合したサブクラスＩｇＧ１のヒト抗体またはヒト化された抗体からなる、請 求項１または２に記載の方法。 ５．異種ｂｓＡｋが、サブクラスＩｇＧ２ｂのラット抗体と融合したサブクラ スＩｇＧ２ｃのラット抗体からなる、請求項１または２に記載の方法。 ６．異種ｂｓＡｋが、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂまたはＩ ｇＧ３のラット抗体と融合したサブクラスＩｇＧ１のヒト抗体またはヒト化した 抗体からなる、請求項１または２に記載の方法。 ７．異種ｂｓＡｋが、サブクラスＩｇＧ３のヒト抗体またはヒト化した抗体と 融合したサブクラスＩｇＧ２ｃラット抗体からなる、請求項１または２に記載の 方法。 ８．異種ｂｓＡｋが、サブクラスｃＩｇＧ３のヒト抗体またはヒト化した抗体 と融合したサブクラスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３のマウス抗体からなる 、請求項１または２に記載の方法。