CN104039808B - 用bis-tris缓冲液的蛋白纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于小规模和大规模蛋白质纯化特别是单克隆抗体的两步色谱法，其仅使用由一种母液制得的四种缓冲溶液。

Description

用BIS-TRIS缓冲液的蛋白纯化
技术领域
本发明涉及使用四种缓冲溶液的用于小规模和大规模蛋白质纯化，尤其是单克隆抗体的两步色谱过程。
发明背景
抗体纯化可能是生物生产最为昂贵的方面之一。单克隆抗体（mAbs）通常采用在各步骤使用特定缓冲体系的三步骤三树脂色谱方法来纯化。这种常规纯化方法包括捕获步骤，接着是离子交换步骤，并且结束于抛光步骤，并通常花费3至5个工作日（包括储存和开放阶段（open phase））。随着提高的细胞培养物效价和更大的细胞培养物体积用于生产，下游加工被视为行业瓶颈。这特别与单克隆抗体生产相关，在单克隆抗体生产中，关注点由批量体积转向下游加工能力。此外，早期的临床前期和临床阶段研究要求可以更快速制造的更大量抗体。因此，在行业中有需求减少用于抗体纯化的步骤数，并减少获得批量产品所花费的时间。
发明概述
发明人已经发现了用于纯化抗体的新方法，所述方法包括有限数量的步骤，同时仍能够以优异的纯度获得纯化抗体的高产率。纯化的蛋白质由此适于医疗应用。因此，该方法可用于纯化用于临床试验的蛋白质和/或用于包含该蛋白质的药物组合物的营销。
简而言之，这种方法仅包括两个色谱步骤：一个亲和色谱，和一个多峰树脂色谱（multimodal resin chromatography）。此外，已经发现，在这两个色谱步骤过程中使用的缓冲液可以由相同的母液起始制备。在其它方面，所有缓冲液可以由相同的化学物质组成，尽管各缓冲液中所述化学物质的浓度可以彼此不等。这些缓冲液有利地包含Bis Tris，例如与NaCl、乙酸和水组合。由于不需要任何缓冲液交换，该方法容易进行，并且高度适于自动化和/或用于以连续模式运行。此外，所有缓冲液可以由相同化学物质组成的事实能够极大减少制备色谱柱的时间，并减少了对人工干预的需要。本发明的方法进一步允许减少或取消开放阶段（即其中纯化系统开放以进行手工操作的步骤，如准备用于新缓冲液的色谱柱、稀释样品或调节其pH），由此减少污染的风险。因此，本发明的方法能够快速生产批量产品并减少纯化系统的占用时间。由此适于放大试验和以工业规模纯化重组蛋白质。
已经建立了两种特定方案并对三种不同的抗体实施。在第一种方案中，在第一色谱步骤结束时使用Bis Tris溶液（参见实施例3、4和5）调节获得的粗蛋白质洗脱液的pH值。已经表明，该方案是通用的，只要其提供优异和可再现的结果，不考虑被纯化的特定抗体（参见实施例6）。在第二种方案中，在第一色谱步骤结束时获得的粗蛋白质洗脱液直接通过第二色谱柱，即没有经受任何处理如pH调节、缓冲液交换或稀释（参见实施例7）。在该方案中，两个色谱步骤后可接着流过膜吸附器。第二种方案具有极为快速（对100升原材料为大约7或8小时）的优点。此外，其可以完全自动化，以连续方式运行，并且不包含任何开放阶段。
本发明由此提供一种从溶液中纯化蛋白质的方法，该方法包括第一色谱步骤和第二色谱步骤，所述第一色谱步骤包括使平衡缓冲液流经第一色谱柱，使溶液流经第一色谱柱，使平衡缓冲液流经第一色谱柱，使清洗和卫生缓冲液流经第一色谱柱，使平衡缓冲液流经第一色谱柱，使用第一洗脱缓冲液从第一色谱柱中洗脱粗蛋白质洗脱液，和任选使用BisTris溶液调节该粗蛋白质洗脱液的pH值；所述第二色谱步骤包括使平衡缓冲液流经第二色谱柱，使粗蛋白质洗脱液流经第二色谱柱，使平衡缓冲液流经第二色谱柱，和使用第二洗脱缓冲液从第二色谱柱中回收纯化的蛋白质。
本发明还提供一种从溶液中纯化蛋白质的方法，该方法包括第一色谱步骤和第二色谱步骤，所述第一色谱步骤包括使平衡缓冲液流经第一色谱柱，使溶液流经第一色谱柱，使平衡缓冲液流经第一色谱柱，使用第一洗脱缓冲液从第一色谱柱中洗脱粗蛋白质洗脱液，和任选使用Bis Tris溶液调节该粗蛋白质洗脱液的pH值；所述第二色谱步骤包括使平衡缓冲液流经第二色谱柱，使该粗蛋白质洗脱液流经第二色谱柱，使平衡缓冲液流经第二色谱柱，使清洗和卫生缓冲液流经第二色谱柱，使平衡缓冲液流经第二色谱柱，和使用第二洗脱缓冲液从第二色谱柱中回收纯化蛋白质。
在本发明的一个实施方案中，该Bis Tris溶液是1M的Bis Tris溶液。在其它实施方案中，各缓冲液包含Bis Tris和/或各缓冲液包含不同浓度的相同化学物质。在另一个实施方案中，各缓冲液包含Bis Tris、乙酸、NaCl和水。
在本发明的一个实施方案中，该第一色谱柱是蛋白质A柱，该第二色谱柱是多峰树脂色谱柱。在本发明的另一实施方案中，该第一色谱柱是多峰树脂色谱柱，该第二色谱柱是蛋白质A柱。在本发明的其它实施方案中，用于从溶液中纯化蛋白质的方法不包括任何包括使该溶液流经阴离子交换色谱（AEX）柱的色谱步骤。
在本发明的一个实施方案中，被纯化的蛋白质是抗体。在另一个实施方案中，该抗体是单克隆抗体。
在本发明的一个实施方案中，该方法进一步包括在步骤（b）之后使该粗蛋白质洗脱液流经膜吸附器。在其它实施方案中，该方法进一步包括在步骤（b）之后的纳滤步骤和/或在该纳滤步骤后的超滤和渗滤步骤。
在本发明的某些实施方案中，该第一洗脱缓冲液包含20mM Bis Tris和20mMNaCl，用乙酸调节至pH 3.5；该第二洗脱缓冲液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl，用乙酸调节至pH 4.5；该平衡缓冲液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl, 用乙酸调节至pH 7.4；并且该清洗和卫生缓冲液包含20mM Bis Tris和1M NaCl，用乙酸调节至pH 7.4。在本发明的其它实施方案中，该第一洗脱缓冲液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl，用乙酸调节至pH 4.5；该第二洗脱缓冲液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl，用乙酸调节至pH 3.5；该平衡缓冲液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl，用乙酸调节至pH 7.4；并且该清洗和卫生缓冲液包含20mM Bis Tris和1M NaCl，用乙酸调节至pH 7.4。
本发明提供包含一种试剂盒，其包含多峰树脂色谱柱和/或蛋白质A柱；和至少一种包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成的缓冲液。在某些实施方案中，该试剂盒用于使用本发明的方法从溶液中纯化蛋白质。
本发明还提供一种试剂盒，其包含多峰树脂色谱柱和/或蛋白质A柱；以及用于制备至少一种包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成的缓冲液的说明书。在某些实施方案中，该试剂盒用于使用本发明的方法从溶液中纯化蛋白质。
本发明进一步提供了包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成的缓冲液用于通过至少一个色谱步骤从溶液中纯化蛋白质的用途。在某些实施方案中，该色谱步骤是多峰树脂色谱步骤和/或蛋白质A色谱步骤。还提供了包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成的缓冲液用于通过本发明的方法从溶液中纯化蛋白质的用途。
本发明进一步提供了用于制备平衡缓冲液的方法，包括生成具有20mM Bis Tris和20mM NaCl的最终浓度的100升溶液；用乙酸将该溶液的pH调节至7.4；和收集50升该溶液。本发明还提供了用于制备清洗和卫生缓冲液的方法，包括用乙酸将来自制备平衡缓冲液剩余的50升溶液的pH调节至4.5；和收集25升该溶液。本发明进一步提供了用于制备洗脱缓冲液的方法，包括用乙酸将来自清洗和卫生缓冲液制备的剩余25升溶液的pH调节至3.5。本发明进一步提供了用于制备洗脱缓冲液的方法，包括向来自洗脱缓冲液制备的剩余25升溶液中添加当量1M的NaCl。通过本文中公开的方法制备的缓冲液可用于使用本发明的方法从溶液中纯化蛋白质。
将由下列详述及所附权利要求更充分地理解公开的纯化方法的这些和其它特征与优点。要注意的是，权利要求的范围由其中的叙述限定，而并非由该描述中所提出的特征与优点的具体讨论来限定。
附图概述
当与下列附图结合阅读时能够最好地理解公开的纯化法的实施方案的下列详述。
图1显示了用于配制实施例3至6中公开的纯化法的缓冲液的方案的示意图。
图2显示了两步纯化法的示意图。
图3显示了两步纯化法用于大规模纯化柱的示意图。
图4显示了“一天一批”大规模纯化的示意图。
图5显示了“一天一批”大规模纯化的结果。
图6显示了用于配制实施例7中公开的纯化法的缓冲液的方案的示意图。
各方面与实施方案的详细描述
基于混合模式树脂（亦称多峰树脂）的可用性，本发明人已经开发了一种仅使用两个色谱步骤的新的纯化方法。换句话说，该方法仅包含两个涉及流经色谱柱的步骤。
本发明涉及用于从溶液中纯化蛋白质的方法，包括或由以下步骤组成：
（a）第一色谱步骤，包括：
- 使所述溶液流经第一色谱柱；
- 使用第一洗脱缓冲液从第一色谱柱中洗脱粗蛋白质洗脱液；和
（b）第二色谱步骤，包括：
- 使在步骤（a）结束时获得的粗蛋白质洗脱液流经第二色谱柱；
- 使用第二洗脱缓冲液从第二色谱柱中回收纯化的蛋白质，
其中各缓冲液包含Bis Tris。
更具体而言，两个上述色谱步骤各自可以包含或由以下步骤组成：
- 使平衡缓冲液流经该色谱柱；
- 使溶液或粗蛋白质洗脱液流经色谱柱（如上所述）；
- 使平衡缓冲液流经该色谱柱；
- 任选地使清洗和卫生缓冲液流经该色谱柱；
- 任选使平衡缓冲液流经该色谱柱；
- 使用洗脱缓冲液从该色谱柱中洗脱该粗蛋白质洗脱液或回收纯化的蛋白质（如上所述），
其中各缓冲液包含Bis Tris。
如上所述，上述本发明的方法仅包含两个色谱步骤。更具体而言，该方法可以避免使该溶液流经阴离子交换色谱（AEX）柱的色谱步骤和/或用于抛光的色谱步骤。即使本发明的方法仅包含两个色谱步骤，该方法也能够获得适于药物用途并特别适于施用于人类的纯化蛋白质。
除了将纯化法中的步骤数量由三个减少到两个（并因此缩短了完成该纯化过程所需的总时间），公开的方法将用于纯化的缓冲液数量由七种减少到四种。此外，该缓冲液包含相同的组分（即Bis Tris、NaCl、乙酸和水），这极大地便利了缓冲液的制备。除了允许纯化多种mAb外，公开的纯化方法还简化了mAb纯化，提高了总产率，并减少了原材料、商品成本和加工时间。
与常规蛋白质纯化方法不同，如上所述，本文中公开的方法使用四种缓冲液：平衡缓冲液、清洗缓冲液和两种洗脱缓冲液。公开的方法中使用的缓冲液用相同的化合物基质由母液制得，这极大地便利了缓冲液的制备。
本文中所用的“本发明的缓冲液”指的是包含Bis Tris的缓冲液。Bis Tris是本领域技术人员公知的化合物，其IUPAC名称是2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇，其CAS编号为6976-37-0。本发明的此类缓冲液可以对应于平衡缓冲液、对应于清洗和卫生缓冲液和/或对应于洗脱缓冲液。
更具体而言，本发明的此类缓冲液可以包含或由不同浓度的相同化学物质组成（其中之一是Bis Tris）。在一个具体实施方案中，该缓冲液包含或由Bis Tris、乙酸和水组成。在一个更具体的实施方案中，该缓冲液包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成。换句话说，此类缓冲液包含或由不同浓度的Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成。
该洗脱缓冲液可以例如包含或由15至25 mM（例如20 mM）Bis Tris和15至25 mM（例如20 mM）NaCl组成，用乙酸调节至包括3至4（例如3.5）的pH。此类洗脱缓冲液尤其适用于亲和色谱柱如蛋白质A柱。
该洗脱缓冲液还可以包含或由15至25 mM（例如20 mM）Bis Tris和15至25 mM（例如20 mM）NaCl组成，用乙酸调节至包括4至5（例如4.5）的pH。此类洗脱缓冲液尤其适用于多峰树脂色谱柱如Capto Adhere。
该洗脱缓冲液还可以包含或由15至25 mM（例如20 mM）Bis Tris和150至250 mM（例如200 mM）NaCl组成，用乙酸调节至包括8至9 的pH。此类洗脱缓冲液尤其适于与多峰树脂色谱柱如Capto MMC一起使用。
该平衡缓冲液可以包含或由15至25 mM（例如20 mM）Bis Tris和15至25 mM（例如20 mM）NaCl组成，用乙酸调节至包括7至8（例如7.4）的pH。
该清洗和卫生缓冲液可以包含或由15至25 mM（例如20 mM）Bis Tris和0.9 to1.1 mM（例如1 M）NaCl组成，用乙酸调节至包括7至8（例如7.4）的pH。
更具体地，用于公开的方法的一种平衡缓冲液含有20 mM Bis Tris和20 mMNaCl，用2 mM乙酸调节至pH 7.4。用于公开的方法的一种清洗缓冲液含有20 mM Bis Tris和1 M NaCl，用2 mM乙酸调节至pH 7.4。用于公开的方法的第一洗脱缓冲液含有20 mM BisTris和20 mM NaCl，用275 mM乙酸调节至pH 3.5。用于公开的方法的第二洗脱缓冲液含有20 mM Bis Tris和20 mM NaCl，用35 mM乙酸调节至pH 4.5。
上述缓冲液制剂的优点包括相对于传统纯化方法能够以更大的相容性使mAb产物通过公开的方法中使用的两个色谱柱，同时最小化不需要的相互作用，限制pH和电导率降低，并有助于提高产率。除了使用减少数量的缓冲液之外，公开的方法的另一方面是使用Bis-Tris缓冲液。
本文中所用的术语“多肽”或“蛋白质”指的是具有天然蛋白质（即由天然存在和具体地非重组细胞产生的，或基因工程改造或重组细胞所产生的蛋白质）的序列的分子，并包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或缺失、添加和/或取代天然序列的一个或多个氨基酸的分子。在某些方面，待纯化蛋白质是抗体。
本文中所用的术语“抗体”指的是完整抗体，或其与完整抗体竞争特定结合的结合片段。结合片段包括但不限于F(ab)、F(ab')、F(ab')2、Fv和单链抗体。术语“重链”包括具有足够的可变区序列以赋予对抗原的特异性的任何免疫球蛋白多肽。
本文中所用的术语“重链”涵盖全长重链及其片段。全长重链包括可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。该VH结构域位于多肽的氨基末端，CH3结构域位于羧基末端。
本文中所用的术语“轻链”涵盖全长轻链及其片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。类似重链，轻链的可变区结构域在多肽的氨基末端。本文中所用的术语“轻链”包括具有足够的可变区序列以赋予对抗原的特异性的任何免疫球蛋白多肽。
天然存在的抗体结构单元通常包含四聚体。此类四聚体各自通常由两个相同的多肽链对组成，各对具有一个全长轻链（通常具有大约25 kDa的分子量）和一个全长重链（通常具有大约50-70 kDa的分子量）。各轻链和重链的氨基末端部分通常包括大约100至110个或更多氨基酸的可变区，该可变区通常负责抗原识别。各链的羧基末端部分通常限定了负责效应子功能的恒定区。人轻链通常分类为κ和λ轻链。重链通常分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型限定为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个子分类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有包括但不限于IgM1和IgM2的子分类。IgA类似地细分为包括但不限于IgA1和IgA2的子分类。在全长轻链和重链中，可变区和恒定区通常通过大约12或更多个氨基酸的“J”区接合，重链还包括大约10个或更多个氨基酸的“D”区。
各个轻/重链对的可变区通常构成抗原结合位点。可变区通常表现出通过三个高变区（也称为互补决定区或CDR）连接的相对保守的框架区（FR）的相同的一般结构。来自各个对的两个链的CDR通常通过可能使得能够结合至特定表位的框架区对准。由N端至C端，轻链和重链可变区二者通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。通常根据Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, U.S.Department of Health and Human Services, NIH出版号91-3242的定义将氨基酸分配到各结构域。双特异性或双功能抗体通常是具有两种不同的重链/轻链对和两种不同的结合位点的人工杂交抗体。
F(ab)片段包含一个重链的CH1与可变区和一个轻链。F(ab)分子的重链不能与另一重链分子构成双硫键。F(ab')片段含有一个轻链和在CH1与CH2结构域之间含有更多恒定区的一个重链，以使得能够在两个重链之间形成链间双硫键以形成F(ab')2分子。Fv区包含来自重链和轻链的可变区，但是缺少恒定区。单链抗体是其中重链和轻链可变区已经通过柔性联结子连接以形成单一多肽链（其构成抗原结合区）的Fv分子。在某些实施方案中，除了“多特异性”或“多功能”抗体之外的二价抗体应理解为包含具有相同抗原特异性的结合位点。
可以通过公开方法纯化的单克隆抗体（mAbs）可以通过多种技术制得，包括常规单克隆抗体方法，例如，本领域公知的标准体细胞杂交技术。尽管原则上体细胞杂交程序是优选的，可以使用制造单克隆抗体的其它技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。该单克隆抗体例如可以对应于鼠类、嵌合、人源化或全人抗体。
在一个具体实施方案中，通过本发明的方法纯化的抗体是选自以下的单克隆抗体：特异性结合到人β-淀粉样蛋白质的初原纤维形式上的抗体（例如人源化抗体）、特异性结合到细菌表面多糖聚-N-乙酰基葡糖胺（PNAG）上的抗体（例如全人抗体）、和特异性结合到CD38跨膜糖蛋白上的抗体（例如人源化抗体）。
本文中所用的术语“回收蛋白质”指的是在使用公开的纯化方法后收集蛋白质。公开的纯化方法可以使用多种标准蛋白质色谱技术实现，所述色谱技术例如但不限于亲和色谱、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、凝胶过滤色谱和多峰树脂色谱。
在公开方法的某些实施方案中，第一或第二色谱柱是蛋白质A柱。该蛋白质A柱经由树脂配体与蛋白质之间的亲和力起作用，实现杂质的高效去除。在公开的方法中使用蛋白质A柱的另一优点在于mAbs对蛋白质A具有通用的亲和力。在公开的方法的一个实施方案中，该蛋白质A柱是MabSelect Sure树脂（GE Healthcare）。
在公开方法的其它实施方案中，第一或第二色谱柱是多峰（混合模式）树脂色谱柱。该多峰树脂与所述目标蛋白质经由几种机制相互作用，所述机制具有mAb:离子相互作用、疏水性相互作用和氢键相互作用。更具体地，在多峰树脂色谱柱中，该mAb:离子相互作用是mAb:阳离子相互作用，与发生在传统阴离子交换色谱（AEX）柱中的mAb:阴离子相互作用相反。
在公开的方法的一个特定实施方案中，该多峰树脂是Capto Adhere树脂（GEHealthcare）。Capto adhere是具有基于高度交联的琼脂糖的基质的多峰阴离子交换剂。下面总结了Capto adhere的特性（参见GE Healthcare Life Sciences, 数据文件28-9078-88 AC）。
基质 高度交联的琼脂糖
官能团 多峰强阴离子交换剂
总离子容量 0.09至0.12 mmol Cl-/mL介质
粒度 75 μm (d<sub>50v</sub>)
流速 在< 3巴（0.3 MPa）下使用粘度与水相同的过程缓冲液(process buffer)，在20℃下在床高为20厘米的1米直径柱中为至少600 cm/h。
pH稳定性
短期 2至14
长期 3至12
工作温度 +4℃至+30℃
在公开方法的另一具体实施方案中，该多峰树脂是Capto MMC树脂（GEHealthcare）。Capto MMC是具有基于高度交联的琼脂糖的基质的多峰阳离子交换剂。下面总结了Capto MMC的特性（参见GE Healthcare Life Sciences, 数据文件11-0035-45AA）。
基质 高度交联的琼脂糖
官能团 多峰弱阳离子交换剂
总离子容量 0.07-0.09 mmol H+/ml介质
粒度 75 μm (d<sub>50v</sub>)
流速 在< 3巴（0.3 MPa）下使用粘度与水相同的过程缓冲液，在20℃下在床高为20厘米的1米直径柱中为至少600 cm/h。
动态结合 在30 mS/cm下，> 45 mg BSA/ml介质
pH稳定性
短期 2至14
长期 2至12
工作温度 +4℃至+30℃
本发明的方法在第一色谱步骤结束时可以包括或不包括使用Bis Tris溶液调节粗蛋白质洗脱液的pH值。
在第一实施方案中，在第一色谱步骤结束时使用Bis Tris溶液将粗蛋白质洗脱液的pH值例如调节至6至7的pH值（例如6.5）。此类Bis Tris溶液可以是1M的Bis Tris溶液。在此类方法中，该多峰树脂色谱柱可以例如对应于Capto Adhere柱。该方法的特定实例公开在实施例3至6中。
在第二实施方案中，在第一色谱步骤结束时获得的粗蛋白质洗脱液直接流经第二色谱柱。更具体地，在两个步骤之间随即不进行处理（如pH调节、缓冲液交换或稀释）。在此类方法中，该多峰树脂色谱柱可以例如对应于Capto MMC柱。附加地，如下文中进一步描述的那样，该粗蛋白质洗脱液可以在第二色谱步骤后流经膜吸附器。这种方法的一个具体实例公开在实施例7中。在此类方法中，完全不存在需要人工干预和开放纯化系统的步骤间处理（例如在灭活容器中稀释，后无活性过滤和在蛋白质A池容器中的pH调节）。
本文中公开的方法可用于回收纯化蛋白质。如本文中所用，“纯化的”指的是允许在体外、离体或在体内有效使用该蛋白质的纯度。对于在体外、离体或体内应用中有用的蛋白质，其应当基本不含能干扰该蛋白质在此类应用中的使用或至少对包含在所述蛋白质中而言不合意的污染物、其它蛋白质和/或化学物质。此类应用包括制备治疗性组合物、以治疗组合物形式施用该蛋白质和本文中公开的其它方法。优选地，本文中所述的“纯化的”蛋白质是这样的蛋白质——其可以通过任何方法制得（即通过由天然来源直接纯化、以重组方式或以合成方式）并已经从其它蛋白质组分纯化以使得该蛋白质占所给组合物中总蛋白质的至少大约80重量%，并且更优选占所给组合物中总蛋白质的至少大约85%、更优选至少大约90%、更优选至少大约91%、更优选至少大约92%、更优选至少大约93%、更优选至少大约94%、更优选至少大约95%、更优选至少大约96%、更优选至少大约97%、更优选至少大约98%和更优选至少大约99%。
如本文中所用，“粗蛋白质”指的是可以通过任何方法制得（通过由天然来源直接纯化、以重组方式或以合成方式）并已经由其它蛋白质组分纯化以使得该蛋白质占给定组合物中总蛋白质重量的小于大约80重量%的蛋白质。
在一个实施方案中，公开的方法还包含第三步骤，称为“步骤（c）”，其中在步骤（b）后使粗蛋白质洗脱液流经膜吸附器。特别地，当在第一色谱步骤结束时获得的粗蛋白质洗脱液直接流经第二色谱柱时可以进行步骤（c）。膜吸附器为使用具有大孔隙而非微孔粒子的膜的色谱基质或过滤器形式。这些孔隙覆盖了整个过滤器面积并促进了样品的极快流速，以及目标分子在该膜内部结构中的最佳结合。该膜可以并入离心柱中，这使得能够容易和选择性地从复杂溶液中分离目标蛋白质。使用膜吸附器的益处在于它们与用于结合污染物的常规色谱法同样有效；它们允许高处理流速，不需要装填、确认或清洁，并且是一次性的但也可以再使用。耐盐性膜甚至允许更多类型的纯化。在某些实施方案中，该膜吸附器是耐盐性相互作用色谱法膜吸附器（例如Satorius STIC膜吸附器）或Q膜吸附器。
当纯化用于药物目的的重组蛋白质时，该色谱步骤通常后接过滤步骤。因此，本发明在步骤（b）或（c）之后可以进一步包括纳滤步骤。在该纳滤步骤之后可以进一步进行超滤和渗滤步骤。如本文中所用，“超滤”或“UF”指的是使用半透膜以便根据粒度和UF膜中的孔隙尺寸物理地和选择性地从溶液中除去粒子和/或离子的过滤技术。如本文中所用，“纳滤”指的是经纳米过滤器过滤溶液，所述纳米过滤器用于除去例如病毒粒子。如本文中所用，“渗滤”指的是使用超滤膜以便从溶液中完全去除、替代或是降低盐浓度或溶剂的一种技术。
最后，该纯化蛋白质可以配制成适于储存的组合物和/或配制成适于施用于动物和/或人类的药物组合物。
公开的方法的大量优点之一在于其能够获得高纯蛋白质的良好产率。采用本发明的方法回收的纯化蛋白质可以例如表现出至少95%、96%、97%、98%或99%的纯度。此外，本发明的方法可以允许以至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的产率回收纯化的蛋白质。
本发明的另一方面涉及制备适用于本发明的方法的缓冲液的方法。事实上，所有这些缓冲液可以由单一母液非常容易和快速地制备。
制备缓冲液的此类方法可以包括以下步骤或由以下步骤组成：
i）制得具有15至25 mM（例如20 mM）Bis Tris和15至25 mM（例如20 mM）NaCl的最终浓度的溶液（例如100升的溶液）；
ii）用乙酸将该溶液的pH调节至包括7至8（例如7.4）的值；
iii）收集该溶液的一半，由此获得平衡缓冲液；
iv）用乙酸将来自步骤（iii）的溶液的剩余一半的pH调节至包括4至5（例如4.5）的值；
v）收集步骤（iv）获得的溶液的一半，由此获得洗脱缓冲液；
vi）用乙酸将来自步骤（v）的溶液的剩余一半的pH调节至包括3至4（例如3.5）的值，由此获得进一步的洗脱缓冲液；
vii）收集步骤（iii）获得的平衡缓冲液溶液的一半并加入NaCl以获得0.9至1.1mM（例如1 M）的最终NaCl浓度，由此获得清洗和卫生缓冲液。
此类方法示意性地描述在图1中。
可选地，用于制备缓冲液的方法可以包含以下步骤或由以下步骤组成：
i）制得具有15至25 mM（例如20 mM）Bis Tris和15至25 mM（例如20 mM）NaCl的最终浓度的溶液（例如100升的溶液）；
ii）用乙酸将该溶液的pH调节至包括8至9（例如8.2）的值；
iii）收集该溶液的四分之一（例如25升），由此获得洗脱缓冲液；
iv）用乙酸将来自步骤（iii）的剩余溶液的pH调节至包括7至8（例如7.4）的值；
v）收集步骤（iv）获得的溶液的三分之二，由此获得平衡缓冲液；
vi）用乙酸将来自步骤（v）的剩余溶液的pH调节至包括3至4（例如3.5）的值，由此获得进一步的洗脱缓冲液；
vii）收集步骤（v）获得的平衡缓冲液的一半并加入NaCl以获得0.9至1.1 mM（例如1 M）的最终NaCl浓度，由此获得清洗和卫生缓冲液。
此类方法示意性地描述在图6中。
制备缓冲液的上述方法之一还可以对应于在进行两个色谱步骤之前本发明的方法的第一步骤。
本发明进一步涉及试剂盒，其包含以下或由以下组成：
（a）多峰树脂色谱柱和/或亲和色谱柱如蛋白质A柱；和
（b）至少一种本发明的缓冲液（例如包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成）和/或用于制备至少一种本发明的缓冲液（例如包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成）的说明书。
本发明进一步涵盖本发明的缓冲液（例如包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成）用于通过至少一个色谱步骤从溶液中纯化蛋白质的用途。更具体地，该至少一个色谱步骤可以是多峰树脂色谱步骤和/或亲和色谱步骤如蛋白质A柱。
实施例
以下实施例描述了公开的方法的特定实施例以及其各种用途。列举它们仅为说明性目的，不应视为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：纯化缓冲液的优化
1.1. 在蛋白质A柱情况下，Bis Tris缓冲液可用作洗脱缓冲液
当使用蛋白质A柱进行色谱步骤时，该洗脱缓冲液通常由柠檬酸盐或甘氨酸缓冲液组成。使用以下经典条件进行使用蛋白质A柱的此类色谱步骤：
- 柱：80毫升的MabSelect Sure
- 平衡缓冲液：pH 7.2的PBS缓冲液
- 洗脱缓冲液：pH 3.0的100 mM柠檬酸钠
- 负载：包含1.48 g/L的抗-CD38 mAb的1升溶液。
在该色谱步骤后获得175毫升包含7.92 g/L的mAb的粗蛋白质洗脱液（1.386 g的mAb）。
发明人研究了是否可以用Bis Tris缓冲液替代柠檬酸缓冲液。使用以下条件：
- 柱：80毫升的MabSelect Sure
- 平衡缓冲液：pH 7.2的PBS缓冲液
- 洗脱缓冲液：pH 3.5的100 mM Bis Tris（用乙酸调节pH）
- 负载：包含1.48 g/L的抗-CD38 mAb的1升溶液。
发明人获得了200毫升包含的6.8 g/L的mAb的粗蛋白质洗脱液（1.369 g的mAb）。
这表明，当使用蛋白质A柱进行色谱步骤时，使用Bis Tris缓冲液作为洗脱缓冲液能够获得与经典柠檬酸钠缓冲液一样好的结果。
1.2. 在多峰树脂色谱柱的情况下，Bis Tris缓冲液可以有利地用作缓冲液
流经蛋白质A色谱柱后获得的粗蛋白质洗脱液随后流经Capto adhere多峰树脂色谱柱。为此，发明人首先测试了以下条件：
- 柱：1毫升的Capto adhere
- 平衡缓冲液：pH 8.6的100 mM的柠檬酸钠（80%）和pH 2.2的100 mM柠檬酸（20%），最终pH接近5.3。
- 洗脱缓冲液：改变上述两种缓冲液的浓度以确定发生最佳洗脱的情形。
- 洗涤缓冲液：与平衡缓冲液相同。
- 负载：包含35 mg的anti-CD38 mAb的20毫升粗蛋白质洗脱液，pH为5.3。
发现抗体在清洗步骤中被洗脱，明显是由于pH降低。实际上，在升高至pH5.3之前pH值由5.3瞬间降低至4.0。pH值降至4.0的事实足以令抗体在清洗步骤过程中被洗脱。
发明人随后研究了使用Bis Tris缓冲液是否能够在清洗步骤过程中避免不想要的洗脱。他们测试了以下条件：
- 柱：1毫升的Capto adhere
- 平衡缓冲液：pH 7.0的20 mM Bis Tris（用乙酸调节pH）
- 洗脱缓冲液：pH 6.0的20 mM Bis Tris（用乙酸调节pH）
- 清洗/再生缓冲液：pH 4.0的20 mM Bis Tris（用乙酸调节pH）
- 卫生处理缓冲液：NaOH 0.5 N
- 负载：18毫升包含大约30毫克的抗-CD38 mAb的粗蛋白质洗脱液。该洗脱液来自上面段落1.1中描述的第二色谱法。在负载到该Capto adhere柱上之前用1 M Bis Tris溶液调节该洗脱液的pH至7.2的pH值。
发明人发现，这些条件能够获得抗体的正确洗脱。实际上，用具有6.0的pH值的BisTris洗脱缓冲液洗脱抗体。在pH 4.0处再生的过程中和在用NaOH卫生处理的过程中观察到两个较小和可忽略的峰。
进一步测试了用HCl取代乙酸调节Bis Tris缓冲液的pH值是否有益。使用以下条件：
- 柱：1毫升的Capto adhere
- 平衡缓冲液：pH 7.0的20 mM Bis Tris（用1 N HCl调节pH）。
- 洗脱缓冲液：含有Bis Tris缓冲液的梯度（20 mM，pH为4，用1 N HCl调节pH）。
- 负载：包含大约15 mg的抗-CD38 mAb的10毫升粗蛋白质洗脱液。该洗脱液来自上面段落1.1中描述的第二色谱法。在负载到该Capto adhere柱上之前用1 M Bis Tris溶液调节该洗脱液的pH至7.2的pH值。
使用这些条件，在清洗步骤过程中并未洗脱抗体。该试验因此证明使用Bis Tris缓冲液能够在清洗步骤过程中防止不想要的抗体洗脱。但是，当用HCl而非乙酸调节pH值时，在洗脱步骤过程中pH值并未那么快地降低。因此，当用HCl而非乙酸调节pH值时抗体的洗脱效率较低。
总之，本发明人令人惊讶地发现，在多峰树脂色谱步骤过程中，使用包含Bis Tris的平衡与洗脱缓冲液能够在清洗和卫生处理步骤过程中避免不想要的抗体洗脱。他们进一步发现，有利的是用乙酸调节该Bis Tris缓冲液的pH值。由于该Bis Tris缓冲液已被发现适于进行蛋白质A色谱步骤，发明人已经发现了其中缓冲液可以均由相同化合物基质制成的纯化方法，这极大地便利了缓冲液的制备。
进行进一步的试验以确定对平衡缓冲液、洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液的最佳pH值，这些缓冲液均包含Bis Tris以及用于pH调节目的的乙酸。发明人进一步未预料到地发现可以有利地将NaCl加入到该缓冲液中。这些附加试验导致实施例2至7中描述的纯化缓冲液与方案。
实施例2：配制纯化缓冲液
本文中描述的两步纯化法使用四种缓冲液：平衡缓冲液、清洗和卫生缓冲液以及两种洗脱缓冲液，均由相同的母液制备。图1中显示了方案的示意图并且该方案如下：将当量20 mM Bis Tris和当量20mM的NaCl引入100升注射用水（WFI）中作为母液，随后用乙酸将溶液的pH值调节至7.4。随后收集并储存50升所得溶液作为平衡缓冲液。随后取出25升的该平衡缓冲液并加入当量1M的NaCl，由此将pH值降低至3.5。所得25升溶液是清洗和卫生缓冲液。剩余50升母液的pH值随后用乙酸调节至4.5。随后收集25升这种溶液作为洗脱缓冲液之一。随后用乙酸将剩余25升母液的pH值调节至3.5，得到另一洗脱缓冲液。
实施例3：两步单克隆抗体纯化方法
该两步单克隆抗体（mAb）纯化法起始于使用MabSelect Sure树脂的第一色谱步骤。令2柱体积（CV）的平衡缓冲液流经该柱。随后将该mAb溶液负载在该柱上。接着令2 CV的清洗缓冲液流经该柱，接着是2 CV的平衡缓冲液。随后用1 CV的第一洗脱缓冲液洗脱该粗mAb溶液。在两个色谱步骤之间是低pH处理。这可以是使用1M 乙酸将pH调低至pH 3.5 ±0.1或使用1M Bis Tri调节pH至pH 5 ± 0.1。使用Capto Adhere色谱柱进行第二色谱法。使2 CV的平衡缓冲液流经该柱。随后将粗mAb溶液负载在该柱上，接着4 CV的平衡缓冲液通过。部分纯化的mAb溶液随后用1 CV的第二洗脱缓冲液洗脱。在色谱法后，该mAb可以用纳滤和超滤/渗滤进行过滤。纳滤开始于使用X0HC和VPD预过滤器（Millipore）的预过滤步骤，并结束于使用Viresolve Pro过滤器（Millipore）的纳滤。随后进行超滤，目标浓度为50 g/L，接着使用7体积的组胺缓冲液进行渗滤（该方法的示意图参见图2）。
实施例4：人源化13C3 mAb的小批量纯化
实施例2中描述的方案用于53克人源化13C3 mAb的小批量纯化。该13C3 mAb结合到人β-淀粉样蛋白质的初原纤维形式上，如国际公开号WO 2009/065054中描述的那样。
经深度过滤系统澄清mAb批量收集物并使用0.22 μm过滤器过滤，随后在纯化前在50升一次性袋中在2-8℃下储存96小时。以240 cm/h的流速将43升批量收集物负载在3.1升MabSelect Sure柱上。如上所述进行该第一色谱步骤，收集6升mAb溶液。接着用4升Milli-Q水稀释该洗出液以产生浓度为大约5克/升的溶液。随后用1升的1 M Bis Tris将pH值再次调节至6.5。随后经C0HC级深度过滤器和0.22 μm Millipak过滤器过滤11.03升的总体积。随手收集11.58升并在2-8℃下储存。对于第二色谱步骤而言，将MabSelect Sure洗出液以240 cm/h流速负载在4升Capto adhere柱上。在负载步骤后，如上所述进行色谱法并收集在10升袋中，最终体积为5.58升。最终产物经0.22 μm Millipak过滤器过滤并在2-8℃下储存。
与经典mAb纯化相比，本文中公开的两步法得到了类似的结果：>90%的总产率和>98%的纯度，在这种情况下，具体为99.4%的纯度和9.49克/升的最终浓度。
实施例5：单克隆抗体的大批量纯化
该两步纯化法还可应用于单克隆抗体的大规模纯化。对于第一色谱步骤，将人源化13C3 mAb的批量收集物（216升）分为四个等分试样并以240 cm/h的流速以每次大约54升的4次运作负载在3.1升的MabSelect Sure柱上。如上所述进行色谱法，并在Mobuis 100升袋中收集mAb洗出液。此外，在每个负载步骤后，用平衡缓冲液平衡该柱。该19.7升溶液的pH值测量为3.9。该洗出液随后用60升MilliQ水稀释至5克/升的浓度。该pH随后用4.0升1 M的乙酸调节至3.5，持续大约1小时。在pH稳固后，用7升1M Bis Tris溶液将洗出液的pH调节至用于Capto Adhere步骤的pH 6.5。该步骤的最终体积为91升，产物在4℃下储存。对于第二色谱步骤，将该MabSelect Sure洗出液均分并以240 cm/h的流速以4次运作负载在3.5升的Capto Adhere柱上。在每个负载步骤后，用平衡缓冲液平衡该柱。所有洗脱液经0.22 μm过滤器贮存在同一50升Flexboy袋中，并在各步骤后，使用清洗缓冲液进行卫生处理。最终体积为22.1升并储存在2-8℃下。随后用X0HC过滤器（Millipore）进行深度过滤步骤。由于X0HC过滤器与用于以下步骤的VPF预过滤器之间的相容性问题 ，将VPF预过滤器加到X0HC过滤器上以便在相同固持器中进行过滤。为了尽量减小产率损失，在两个深度过滤器后串联安装Modus 1.3纳滤器。该溶液经0.22m2的X0HC级（2×0.11 m2）、0.22m2的VPF过滤器（2×0.11 m2）和Modus 1.3（0.21 m2）过滤。在过滤冲洗后，回收的总体积为25.9升。未出现压力问题，压力开始于1.8巴，并在460 ml/min下结束于大约1.3巴。最终步骤是溶液的超滤与渗滤。这两个步骤在具有将容量提高至1.71 m2的固持器的Millipore Cogent M中进行。将批料以9.3升恒定体积负载在Cogent M上以便将该溶液浓缩至50克/升。在12 L/M/H泵交叉流下在50分钟后达到第一浓度。该渗滤随后用7体积的10mM组胺（pH 6.5）在14L/M/H泵交叉流下在165分钟内实施。产物随后在8 L/M/H泵交叉流下经30分钟缓慢浓缩。调整流量以保持在ΔP < 0.6巴下，开始于1670毫升分钟，结束于520毫升/分钟。收集的溶液的最终体积为2.6升，含有457克的mAb，最终浓度为175.7克/升（UV）。最后，产品用0.22 μm Sartopore 2-150过滤器过滤并在4℃下储存。
实施例6：不同单克隆抗体的纯化
除了人源化13C3抗体之外，上述两步纯化法用于纯化附加的抗体，即特异性结合到细菌表面多糖聚-N-乙酰基葡糖胺（PNAG）上的全人抗体，和特异性结合到CD38跨膜糖蛋白上的人源化单克隆抗体。
下表显示了在纯化这三种抗体时获得的总产率与纯度。
抗体 总产率(%)<sup>1</sup> 纯度(%)
人源化13C3 mAb > 90 > 98
抗-PNAG mAb > 95 > 97
抗-CD38 mAb > 85 > 98
1总产率对应于纳滤、超滤和渗滤步骤前的产率。
纯化的人源化13C3 mAb与纯化的抗-PNAG mAb随后在临床试验框架内施用于人。
总之，已经证实了对三种不同的抗体，两步纯化法能够获得具有优异的纯度的纯化抗体的良好产率，纯化抗体具有适于施用于人类的品质。
实施例7：“一天一批”纯化法
大规模纯化也可以采用使用连接到多峰柱上的蛋白质A柱，通过使在第一色谱步骤结束时获得的粗蛋白质洗脱液直接流经第二色谱柱（参见图3）。使用该方法于大规模纯化的某些益处在于不需要进一步稀释、pH调节或储存。此外，该方法允许快速负载粗抗体制剂。该大规模抗体纯化法用于经7小时30分钟纯化340克批量的mAb（参见图4）。该纯化法获得98%的产率（332/340 g）和96.9%的纯度（参见图5）。此外，采用该方法的污染物去除达到了类似于常规纯化法所观察到的水平。
上述大规模纯化法可用于满足用于例如临床前和临床试验的更大和更有效的抗体制备的目标。
更具体地，将称为“一天一批”的该方法应用于人源化13C3 mAb的大规模纯化。目的在于在仅仅一天中经由2个色谱步骤纯化全部200升批料，而没有储存、开放阶段、稀释/调节步骤。
如图6中所示制备缓冲液。
对第一色谱步骤，将批量收集物（179升）分为4个等分试样，并以4次运作负载在3.1升MabSelect Sure柱上。所有运作用缓冲液B（20mM NaCl, 20mM Bis Tris pH7.4）平衡，用缓冲液D（1M NaCl, 20mM Bis Tris pH7.4）清洗，并用缓冲液C（20mM NaCl, 20mMBis Tris pH3.5）洗脱。各洗脱剂直接负载到3.1升Capto MMC柱上。在各负载运作前，该柱用缓冲液C（20mM NaCl, 20mM Bis Tris pH3.5）平衡，随后，在负载后，该柱用缓冲液B（20mM NaCl, 20mM Bis Tris pH7.4）平衡，产物用缓冲液A（200mM NaCl, 20mM Bis TrispH8.2）洗脱。在一个工作日内由上午7点至下午3点纯化全部批量。
在这两个色谱步骤后，令所有洗脱级分流经STIC膜，随后收集在50升袋中。
负载在第一柱上的总体积为179升，mAb浓度为1.61 g/L。纯化的总体积为35.7升，mAb效价为7.26 g/L。总产率为90%。
已经参照其特定实施方案详细描述了本发明，显而易见的是可以在不背离所附权利要求限定的本发明的范围的情况下进行修改和改变。更具体地，尽管本发明的某些方面在本文中被认为特别有利，但应理解本发明不必限于这些具体方面。
本文中描述和/或引用的各参考文献经此引用全文并入本文中。

Claims (18)

1.用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其包括：
(a)第一色谱步骤，包括：
-使所述溶液流经第一色谱柱；
-使用第一洗脱缓冲液从所述第一色谱柱中洗脱粗蛋白质洗脱液；和
(b)第二色谱步骤，包括：
-使在步骤(a)结束时获得的所述粗蛋白质洗脱液直接流经第二色谱柱；
-使用第二洗脱缓冲液从所述第二色谱柱中回收纯化的蛋白质，
其中所述蛋白质是单克隆抗体或其结合片段，
其中各缓冲液由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成，
其中所述第一色谱柱是蛋白质A亲和色谱柱，所述第二色谱柱是多峰树脂色谱柱，
并且其中所述纯化的蛋白质以至少85％的产率回收并且表现出至少95％的纯度。
2.权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体是选自特异性结合到人β-淀粉样蛋白质的初原纤维形式上的抗体、特异性结合到细菌表面多糖聚-N-乙酰基葡糖胺(PNAG)上的抗体和特异性结合到CD38跨膜糖蛋白上的抗体的单克隆抗体。
3.权利要求1或2所述的方法，其中两个色谱步骤的各个包括：
-使平衡缓冲液流经所述色谱柱；
-使所述溶液或所述粗蛋白质洗脱液流经所述色谱柱；
-使平衡缓冲液流经所述色谱柱；
-任选地使清洗和卫生缓冲液流经所述色谱柱；
-任选地使平衡缓冲液流经所述色谱柱；
-使用洗脱缓冲液从所述色谱柱中洗脱所述粗蛋白质洗脱液或回收纯化的蛋白质，
其中各缓冲液由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中各所述缓冲液由不同浓度的相同化学品组成。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中用于从溶液中纯化蛋白质的所述方法仅包括两个色谱步骤。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤(a)进一步包括使用Bis Tris溶液调节所述粗蛋白质洗脱液的pH。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤(a)进一步包括使用Bis Tris溶液调节所述粗蛋白质洗脱液的pH至包括6至7的值。
8.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中使在步骤(a)结束时获得的所述粗蛋白质洗脱液直接流经第二色谱柱，而不经受选自下组的任何处理：pH调节、缓冲液交换和稀释。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)第一色谱步骤，包括：
(i)使平衡缓冲液流经第一色谱柱；
(ii)使所述溶液流经所述第一色谱柱；
(iii)使平衡缓冲液流经所述第一色谱柱；
(iv)使清洗和卫生缓冲液流经所述第一色谱柱；
(v)使平衡缓冲液流经所述第一色谱柱；
(vi)使用第一洗脱缓冲液从所述第一色谱柱中洗脱粗蛋白质洗脱液；和
(vii)任选地使用Bis Tris溶液调节所述粗蛋白质洗脱液的pH值；
和
(b)第二色谱步骤，包括：
(i)使平衡缓冲液流经第二色谱柱；
(ii)使来自步骤(a)的所述粗蛋白质洗脱液流经所述第二色谱柱；
(iii)使平衡缓冲液流经所述第二色谱柱；和
(iv)使用第二洗脱缓冲液从所述第二色谱柱中回收纯化的蛋白质，
其中各缓冲液由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其在步骤(b)之后进一步包括使所述粗蛋白质洗脱液流经膜吸附器的步骤(c)。
11.权利要求10所述的方法，其中所述膜吸附器是耐盐性相互作用色谱法膜吸附器。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其在步骤(b)或(c)之后进一步包括纳滤步骤。
13.权利要求12所述的方法，在所述纳滤步骤后进一步包括超滤和渗滤步骤。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述第一洗脱缓冲液包含15至25mM BisTris和15至25mM NaCl，用乙酸调节至包括3至4的pH。
15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述第二洗脱缓冲液：
-包含15至25mM Bis Tris和15至25mM NaCl，用乙酸调节至包括4至5的pH，或
-包含15至25mM Bis Tris和150至250mM NaCl，用乙酸调节至包括8至9的pH。
16.权利要求3至15中任一项所述的方法，其中平衡缓冲液包含15至25mM Bis Tris和15至25mM NaCl，用乙酸调节至包括7至8的pH。
17.权利要求3至16中任一项所述的方法，其中所述清洗和卫生缓冲液包含15至25mMBis Tris和0.9至1.1mM NaCl，用乙酸调节至包括7至8的pH。
18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其进一步包括将所述回收的纯化的蛋白质配制成药物组合物的步骤。
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