KR102048598B1 - Bis-tris 버퍼를 사용한 단백질 정제 - Google Patents

Bis-tris 버퍼를 사용한 단백질 정제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한 모액으로부터 제조된 네 가지의 버퍼 용액만을 사용한, 단백질, 특히 단일클론 항체의 소규모 및 대규모 정제용 2단계 크로마토그래피 공정을 제공한다.

Description

BIS-TRIS 버퍼를 사용한 단백질 정제{PROTEIN PURIFICATION USING BIS-TRIS BUFFER}
본 발명은 네 가지의 버퍼 용액을 사용한, 단백질, 특히 단일클론 항체의 소규모 및 대규모 정제용 2단계 크로마토그래피 공정에 관한 것이다.
항체 정제는 바이오생산에서 가장 비용이 많이 드는 측면 중 하나일 수 있다. 단일클론 항체(mAb)는 대개 3단계의 세 수지 크로마토그래피 공정을 이용하여 정제되며, 각 단계에서는 특정한 버퍼 시스템이 사용된다. 이러한 종래 정제 방법은 캡쳐 단계, 이어서 이온교환 단계, 그리고 마지막으로 폴리싱 단계를 포함하며, 보통 (저장 및 개방 과정(phase)을 포함한) 작업 일수는 3 내지 5일이다. 생산에 사용되는 세포 배양 역가가 증가하고 세포 배양 부피가 더 커짐에 따라, 다운스트림 처리는 산업적 애로사항으로 여겨지고 있다. 이는 특히 배치(batch) 부피에서 다운스트림 처리 능력 쪽으로 주안점이 옮겨진 단일클론 항체 생산과 관련이 있다. 또한, 초기 임상 전(잠복기) 과정 및 임상 과정을 연구하는 경우, 더 빠르게 생성될 수 있는 더 많은 양의 항체가 필요하다. 따라서, 산업 차원에서, 항체 정제에 이용되는 단계들의 수를 감소하고, 배치를 얻는데 소요되는 시간을 단축시킬 필요가 있다.
본 발명가들은 제한된 수의 단계를 포함하면서도, 여전히 순도가 월등히 높은 정제된 항체를 고수율로 수득할 수 있도록 하는 새로운 항체 정제 방법을 발견하였다. 이와 같은 정제된 단백질은 의료 적용분야에 적합하다. 이에 따라, 본 방법은 임상 실험 및/또는 단백질을 포함한 약학적 조성물의 마케팅을 위한 단백질을 정제하는데 이용될 수 있다.
간단히 말해, 본 방법은 친화성 크로마토그래피 및 다중성분(multi-modal) 수지 크로마토그래피 등 두 크로마토그래피 단계만 포함한다. 또한, 이들 두 크로마토그래피 단계 동안 사용되는 모든 버퍼는 동일한 모액을 출발물질로 하여 제조가능하다는 것이 밝혀졌다. 다시 말해서, 모든 버퍼는 동일한 화학물질들로 구성될 수 있으며, 단지 상기 화학물질들의 농도는 버퍼마다 다를 수 있다. 이들 버퍼는 유리하게, 예를 들면 NaCl, 아세트산 및 물과 조합된 Bis Tris를 포함한다. 버퍼를 교환할 필요가 전혀 없기 때문에, 본 방법은 수행하기 용이하고, 자동화 및/또는 연속식 모드로 시행하기에 매우 적합하다. 또한, 모든 버퍼가 동일한 화학물질로 구성될 수 있다는 사실로 인해 크로마토그래피 컬럼을 준비하는 시간이 상당히 단축될 수 있고, 또한 수동적 개입의 필요성이 줄어든다. 더 나아가 본 발명의 방법 덕분에 개방 과정들(즉, 새 버퍼를 위한 크로마토그래피 컬럼 준비, 시료 희석 또는 시료의 pH 조절과 같은 수동 조작을 수행하기 위해 정제 시스템이 개방되는 단계들)을 줄이거나 없애는 것이 가능해져, 오염 위험이 낮아진다. 그러므로, 본 발명의 방법은 신속한 배치 제조 및 정제 시스템의 점유 시간 단축을 모두 가능하게 한다. 따라서, 규모 확대 및 산업적 규모의 재조합 단백질 정제에 적합하다.
3종의 상이한 항체를 위해 두 가지의 특정한 프로토콜을 설정하여 시행하였다. 제1 프로토콜에서는 첫째 크로마토그래피 단계의 말미에 수득된 조 단백질 용출액의 pH를 Bis Tris 용액을 사용하여 조절한다(실시예 3, 4 및 5 참조). 제1 프로토콜은 정제 대상인 특정 항체와 상관없이 탁월하며 재생가능한 결과를 제공한다는 점에서 보편적이라는 것으로 나타났다(실시예 6 참조). 제2 프로토콜에서는 둘째 크로마토그래피 단계의 말미에 수득된 조 단백질 용출액이 제2 크로마토그래피 컬럼에 바로, 즉 pH 조절, 버퍼 교환 또는 희석과 같은 어떠한 처리도 거치지 않고 통과된다(실시예 7 참조). 제2 프로토콜에서는, 이들 두 크로마토그래피 단계들에 이어, 막흡착기에 통과시키는 조작이 시행될 수 있다. 이러한 제2 프로토콜의 장점은 대단히 신속하다는 것이다(출발물질 100 L의 경우 약 7시간 내지 8시간 걸림). 또한, 제2 프로토콜은 완전히 자동화되어, 연속식 모드로 시행될 수 있으며, 어떠한 개방 과정도 포함하지 않는다.
따라서, 본 발명은 용액으로부터 단백질의 정제 방법을 제공하며, 상기 방법은 평형 버퍼를 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작, 상기 용액을 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작, 평형 버퍼를 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작, 세척 및 위생용 버퍼를 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작, 평형 버퍼를 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작, 제1 용출 버퍼를 사용하여 제1 크로마토그래피 컬럼으로부터 조 단백질 용출액을 용출하는 조작, 및 선택적으로는 Bis Tris 용액을 사용하여 조 단백질 용출액의 pH를 조절하는 조작을 포함한 첫째 크로마토그래피 단계; 및 평형 버퍼를 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작, 상기 조 단백질 용출액을 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작, 평형 버퍼를 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작, 및 제2 용출 버퍼를 사용하여 제2 크로마토그래피 컬럼으로부터 정제된 단백질을 회수하는 조작을 포함한 둘째 크로마토그래피 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 용액으로부터 단백질의 정제 방법을 제공하며, 상기 방법은 평형 버퍼를 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작, 상기 용액을 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작, 평형 버퍼를 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작, 제1 용출 버퍼를 사용하여 제1 크로마토그래피 컬럼으로부터 조 단백질 용출액을 용출하는 조작, 및 선택적으로는 Bis Tris 용액을 사용하여 조 단백질 용출액의 pH를 조절하는 조작을 포함한 첫째 크로마토그래피 단계; 및 평형 버퍼를 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작, 상기 조 단백질 용출액을 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작, 평형 버퍼를 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작, 세척 및 위생용 버퍼를 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작, 평형 버퍼를 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작, 및 제2 용출 버퍼를 사용하여 제2 크로마토그래피 컬럼으로부터 정제된 단백질을 회수하는 조작을 포함한 둘째 크로마토그래피 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, Bis Tris 용액은 1M Bis Tris 용액이다. 다른 구현예에서, 각 버퍼는 Bis Tris를 포함하고/하거나, 각 버퍼는 동일한 화학물질들을 다양한 농도로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 각 버퍼는 Bris Tris, 아세트산, NaCl, 및 물을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 Protein A 컬럼이고, 제2 크로마토그래피 컬럼은 다중성분 수지 크로마토그래피 컬럼이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 다중성분 수지 크로마토그래피 컬럼이고, 제2 크로마토그래피 컬럼은 Protein A 컬럼이다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 용액으로부터 단백질의 정제 방법의 어느 크로마토그래피 단계도 상기 용액을 음이온-교환 크로마토그래피(AEX) 컬럼에 통과시키는 조작을 포함하지 않는다.
본 발명의 일 구현예서, 정제되는 단백질은 항체이다. 다른 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 방법은 조 생성물 용출액을 (b) 단계 후에 막흡착시키는 단계를 더 포함한다. 다른 구현예에서, 본 방법은 (b) 단계 후에 나노여과 단계를 포함하고/하거나 나노여과 단계 후에 한외여과 및 정용여과(diafiltration) 단계를 더 포함한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 제1 용출 버퍼는 20 mM Bis Tris 및 20 mM NaCl를 포함하고, 아세트산을 사용하여 pH가 3.5로 조절되며; 제2 용출 버퍼는 20 mM Bis Tris 및 20 mM NaCl를 포함하고, 아세트산을 사용하여 pH가 4.5로 조절되며; 평형 버퍼는 20 mM Bis Tris 및 20 mM NaCl를 포함하고, 아세트산을 사용하여 pH가 7.4로 조절되며; 세척 및 위생용 버퍼는 20 mM Bis Tris 및 1M NaCl를 포함하고, 아세트산을 사용하여 pH가 7.4로 조절된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 제1 용출 버퍼는 20 mM Bis Tris 및 20 mM NaCl를 포함하고, 아세트산을 사용하여 pH가 4.5로 조절되며; 제2 용출 버퍼는 20 mM Bis Tris 및 20 mM NaCl를 포함하고, 아세트산을 사용하여 pH가 3.5로 조절되며; 평형 버퍼는 20 mM Bis Tris 및 20 mM NaCl를 포함하고, 아세트산을 사용하여 pH가 7.4로 조절되며; 세척 및 위생용 버퍼는 20 mM Bis Tris 및 1M NaCl를 포함하고, 아세트산을 사용하여 pH가 7.4로 조절된다.
본 발명은 다중성분 수지 크로마토그래피 컬럼 및/또는 Protein A 컬럼; 및 Bis Tris, 아세트산, NaCl 및 물을 포함하거나 이들로 구성된 한 가지 이상의 버퍼를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에 의하면, 키트는 본 발명의 방법을 이용하여 용액으로부터 단백질을 정제하는 데에 사용된다
본 발명은 또한 다중성분 수지 크로마토그래피 컬럼 및/또는 Protein A 컬럼; 및 Bis Tris, 아세트산, NaCl 및 물을 포함하거나 이들로 구성된 한 가지 이상의 버퍼를 조제하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에 의하면, 키트는 본 발명의 방법을 이용하여 용액으로부터 단백질을 정제시키는데 사용된다.
본 발명은 또한 적어도 한 크로마토그래피 단계를 통해 용액으로부터 단백질을 정제하는데 있어서의, Bis Tris, 아세트산, NaCl 및 물을 포함하거나 이들로 구성된 버퍼의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 단계는 다중성분 수지 크로마토그래피 단계 및/또는 Protein A 크로마토그래피 단계이다. 또한, 본 발명의 방법을 이용하여 용액으로부터 단백질을 정제시키는데 있어서의, Bis Tris, 아세트산, NaCl 및 물을 포함하거나 이들로 구성된 버퍼의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 최종 농도 20 mM Bis Tris 및 20 mM NaCl를 함유한 100L 용액을 생성하는 단계; 용액의 pH를 아세트산을 사용하여 7.4로 조절하는 단계; 및 50 L의 용액을 수거하는 단계를 포함하는 평형 버퍼의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 평형 버퍼의 제조 방법에서 남은 50 L의 용액의 pH를 아세트산을 사용하여 4.5로 조절하는 단계; 및 25 L의 용액을 수거하는 단계를 포함하는 세척 및 위생용 버퍼의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 세척 및 위생용 버퍼의 제조 방법에서 남은 25 L의 용액의 pH를 아세트산을 사용하여 3.5로 조절하는 단계를 포함하는 용출 버퍼의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 용출 버퍼의 제조 방법에서 남은 25 L의 용액에 당량 1M NaCl를 첨가하는 단계를 포함하는 용출 버퍼의 제조 방법을 제공한다. 본원에 개시된 방법들에 의해 제조된 버퍼는 본 발명의 방법을 이용하여 용액으로부터 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다.
개시된 정제 방법의 상기 및 기타 특징들 및 장점들은 첨부된 청구범위와 함께 하기의 상세 설명으로부터 더 충분히 이해될 수 있다. 청구범위의 범주는 본 명세서에 제시된 특징들 및 장점들에 대한 구체적인 설명에 의해 규정되는 것이 아니라, 청구범위에 인용된 내용들에 의해 규정된다는 것을 주목한다.
개시된 정제 방법의 구현예들에 대한 하기의 상세 설명은 이에 따른 도면들을 참조로 읽을 때 가장 잘 이해될 수 있다.
도 1은 실시예 3 내지 6에 개시된 정제 방법의 버퍼를 조제하는데 이용되는 프로토콜의 개략도를 나타낸다.
도 2는 2단계 정제 방법의 개략도를 나타낸다.
도 3은 대규모 정제 컬럼을 위해 2단계 정제 방법이 사용되는 것의 개략도를 나타낸다.
도 4는 "1일 1배치" 대규모 정제의 개략도를 나타낸다.
도 5는 "1일 1배치" 대규모 정제의 결과를 나타낸다.
도 6은 실시예 7에 개시된 정제 방법의 버퍼를 조제하는데 이용되는 프로토콜의 개략도를 나타낸다.
혼합 성분(mixed mode) 수지(다중성분 수지로도 불림)의 가용성에 근거하여, 본 발명가들은 2개의 크로마토그래피 단계만 이용하는 새로운 정제 방법을 개발하였다. 다시 말해서, 본 방법은 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 두 단계만 포함한다.
본 발명은 용액으로부터 단백질의 정제 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
- 상기 용액을 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
- 제1 용출 버퍼를 사용하여 제1 크로마토그래피 컬럼으로부터 조 단백질 용출액을 용출시키는 조작
을 포함한 (a) 첫째 크로마토그래피 단계; 및
- (a) 단계의 말미에 수득된 조 단백질 용출액을 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
- 제2 용출 버퍼를 사용하여 제2 크로마토그래피 컬럼으로부터 정제된 단백질을 회수하는 조작
을 포함한 (b) 둘째 크로마토그래피 단계
를 포함하거나 이들 단계로 구성되며, 이때 각 버퍼는 Bis Tris를 포함한다.
더 구체적으로, 위의 두 크로마토그래피 단계들에서 각 단계는
- 평형 버퍼를 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
- (위에 언급한 바와 같이) 용액 또는 조 단백질 용출액을 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
- 평형 버퍼를 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
- 선택적으로는, 세척 및 위생용 버퍼를 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
- 선택적으로는, 평형 버퍼를 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작; 및
- (위에 언급한 바와 같이) 용출 버퍼를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 조 단백질 용출액을 용출하거나 또는 정제된 단백질을 회수하는 조작
을 포함하거나 이들 조작으로 구성될 수 있으며, 이때 각 버퍼는 Bis Tris를 포함한다.
위에 지적한 바와 같이, 본 발명의 상기 방법은 2개의 크로마토그래피 단계만 포함한다. 더 구체적으로, 본 방법은 용액을 음이온-교환 크로마토그래피(AEX) 컬럼에 통과시키는 조작을 포함하는 크로마토그래피 단계, 및/또는 폴리싱을 위한 크로마토그래피 단계를 생략할 수 있다. 비록 본 발명에 따른 방법이 2개의 크로마토그래피 단계만 포함하지만, 약학적 목적, 특히 인간에 투여하기에 적합한 정제된 단백질을 수득할 수 있게 한다.
본 정제 방법 덕분에 단계 수가 3개에서 2개로 줄어드는 것(그리고, 결과적으로 정제 방법을 완료하는데 필요한 전체 시간이 단축되는 것) 외에도, 본 개시된 방법 덕분에 정제에 사용되는 버퍼의 수가 7개에서 4개로 감소된다. 또한, 버퍼는 동일한 구성성분들(즉, Bis Tris, NaCl, 아세트산 및 물)을 포함하며, 이로 인해 버퍼 제조가 상당히 용이해진다. 본 개시된 정제 방법은 또한, 다양한 mAb를 정제시킬 수 있다는 점 외에도, mAb 정제를 단순화시키고, 전체 수율을 향상시키며, 원료들, 제품 단가 및 공정 시간을 줄인다.
종래의 단백질 정제 방법들과는 달리, 위에 명시한 바와 같이, 본원에 개시되는 방법은 평형 버퍼, 세척용 버퍼 및 두 가지의 용출 버퍼 등 네 가지의 버퍼를 사용한다. 본 개시된 방법에 사용되는 버퍼들은, 모액으로부터, 동일한 매트릭스의 화합물들로 만들어지며, 이로써 버퍼 제조가 크게 용이해진다.
본원에 사용된 바와 같이, "본 발명에 따른 버퍼"는 Bis Tris를 포함한 버퍼를 가리킨다. Bis Tris는 당업자에게 잘 알려진 화합물로서, IUPAC 명칭은 2-[비스(2-하이드록시에틸)아미노]-2-(하이드록시메틸)프로판-1,3-디올이고, CAS 번호는 6976-37-0이다. 이러한 본 발명에 따른 버퍼는 평형 버퍼, 세척 및 위생용 버퍼, 및/또는 용출 버퍼에 해당할 수 있다.
더 구체적으로 이러한 본 발명에 따른 버퍼는 다양한 농도의, 동일한 화학물질들(그 중 하나는 Bis Tris임)을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 구체적인 일 구현예에 의하면, 버퍼는 Bis Tris, 아세트산 및 물을 포함하거나 이들로 구성된다. 더 구체적인 일 구현예에 의하면, 버퍼는 Bis Tris, 아세트산, NaCl 및 물을 포함하거나 이들로 구성된다. 다시 말해, 이와 같은 버퍼는 다양한 농도의, Bis Tris, 아세트산, NaCl 및 물을 포함하거나 이들로 구성된다.
용출 버퍼는 예를 들면 15 내지 25 mM(예컨대, 20mM)의 Bis Tris 및 15 내지 25 mM(예컨대, 20mM)의 NaCl를 포함하거나 이들로 구성될 수 있으며, 상기 버퍼의 pH는 아세트산을 사용하여 3 내지 4에 속한 pH(예컨대, 3.5)로 조절된다. 이러한 용출 버퍼는 Protein A 컬럼과 같은 친화성 크로마토그래피 컬럼과 사용하기에 특히 적합하다.
용출 버퍼는 또한 15 내지 25 mM(예컨대, 20 mM) Bis Tris 및 15 내지 25 mM(예컨대, 20 mM) NaCl를 포함하거나 이들로 구성될 수 있으며, 상기 버퍼의 pH는 아세트산을 사용하여 4 내지 5에 속한 pH(예컨대, 4.5)로 조절된다. 이러한 용출 버퍼는 가령 Capto Adhere와 같은 다중성분 수지 크로마토그래피 컬럼과 사용하기에 특히 적합하다.
용출 버퍼는 또한 15 내지 25 mM(예컨대, 20 mM) Bis Tris 및 150 내지 250 mM(예컨대, 200 mM) NaCl를 포함하거나 이들로 구성될 수 있으며, 상기 버퍼의 pH는 아세트산을 사용하여 8 내지 9에 속한 pH로 조절된다. 이러한 용출 버퍼는 가령 Capto MMC와 같은 다중성분 수지 크로마토그래피 컬럼과 사용하기에 특히 적합하다.
평형 버퍼는 15 내지 25 mM(예컨대, 20 mM) Bis Tris 및 15 내지 25 mM(예컨대, 20 mM) NaCl를 포함하거나 이들로 구성될 수 있으며, 상기 버퍼의 pH는 아세트산을 사용하여 7 내지 8에 속한 pH(예컨대, 7.4)로 조절된다.
세척 및 위생용 버퍼는 15 내지 25 mM(예컨대, 20 mM) Bis Tris 및 0.9 내지 1.1 mM(예컨대, 1 M) NaCl를 포함하거나 이들로 구성될 수 있으며, 상기 버퍼의 pH는 아세트산을 사용하여 7 내지 8에 속한 pH(예컨대, 7.4)로 조절한다.
더 구체적으로, 본 개시된 방법에 사용되는 한 평형 버퍼는 20 mM의 Bis Tris 및 20 mM의 NaCl를 함유하며, 2 mM 아세트산을 사용하여 pH 7.4로 조절된다. 본 개시된 방법에 사용되는 한 세척용 버퍼는 20 mM의 Bis Tris 및 1M의 NaCl를 함유하며, 2 mM 아세트산을 사용하여 pH 7.4로 조절된다. 본 개시된 방법에 사용되는 제1 용출 버퍼는 20 mM의 Bis Tris 및 20 mM의 NaCl를 함유하며, 275 mM 아세트산을 사용하여 pH 3.5로 조절된다. 본 개시된 방법에 사용되는 제2 용출 버퍼는 20 mM의 Bis Tris 및 20 mM의 NaCl를 함유하며, 35 mM 아세트산을 사용하여 pH 4.5로 조절된다
상기 버퍼 조제법들의 장점은, 원하지 않는 상호반응들을 최소화하고, pH 저하 및 전도성 저하를 제한하며, 종래의 정제 방법들과 비교하여 수율 증가를 촉진시키는 동시에, 본 개시된 방법에 이용되는 호환성이 더 좋은 2개의 크로마토그래피 컬럼에 mAb 생성물을 통과시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다. 더 적은 개수의 버퍼를 사용한다는 것에 더하여, 본 개시된 방법의 또 다른 양태는 Bis-Tris 버퍼를 사용한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"이란 용어는 천연 단백질, 즉 자연-발생 특이적 비-재조합 세포, 또는 유전자 조작 또는 재조합 세포에 의해 생성되는 단백질의 서열을 갖는 분자를 가리키며, 천연 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자, 또는 천연 서열에서 1개 이상의 아미노산이 결실(deletion), 첨가, 및/또는 치환된 분자를 포함한다. 일부 양태에 의하면, 정제되는 단백질은 항체이다.
본원에 사용되는 바와 같이 "항체"란 용어는 원형(변형되지 않은) 항체, 또는 특이적 결합을 위해 상기 원형 항체와 경쟁하는 그의 결합 조각을 가리킨다. 결합 조각에는 F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, 및 단사슬 항체가 있되, 이에 제한되지 않는다. "중쇄"란 용어는 항원 특이성을 부여하는데 충분한 가변 부위 서열을 갖는 임의의 면역글로불린 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이 "중쇄"란 용어는 전장(full-length) 중쇄 및 그의 조각들을 포괄한다. 전장 중쇄는 1개의 가변 부위 영역인 VH, 및 3개의 불변 부위 영역들인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. VH 영역은 폴리펩타이드의 아미노 말단에 있고, CH3 영역은 카복실 말단에 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 "경쇄"란 용어는 전장 경쇄 및 그의 조각들을 포괄한다. 전장 경쇄는 1개의 가변 부위 영역인 VL, 및 1개의 불변 부위 영역인 CL을 포함한다. 중쇄와 마찬가지로, 경쇄의 가변 부위 영역은 폴리펩타이드의 아미노 말단에 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 "경쇄"란 용어는 항원 특이성을 부여하는데 충분한 가변 부위 서열을 갖는 임의의 면역글로불린 폴리펩타이드를 포함한다. 자연발생 항체의 구조적 단위는 통상 사량체(tetramer)를 포함한다. 각각의 이러한 사량체는 통상 동일한 두 쌍의 폴리펩타이드 사슬로 구성되며, 각 쌍은 하나의 전장 경쇄(전형적으로, 분자량이 약 25 kDa임)와 하나의 전장 중쇄(전형적으로, 분자량이 약 50 내지 70 kDa임)를 가진다. 각각의 경쇄 및 중쇄의 아미노 말단 부분은 통상적으로 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산으로 된 가변 부위를 포함하며, 전형적으로 이러한 가변 부위를 통해 항원을 인식하게 된다. 각 사슬의 카복시 말단 부분은 작용기 기능(effector function)의 요인이 되는 불변 부위를 정의한다. 인간의 경쇄는 통상 카파 경쇄와 람다 경쇄로 구분된다. 중쇄는 통상 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 구분되며, 항체의 동형을 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 각각 정의한다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 등의 여러 세부 종류(subclass)를 가지되, 이에 한정되지 않는다. IgM은 IgM1 및 IgM2 등의 세부 종류를 가지되, 이에 한정되지 않는다. 마찬가지로 IgA는 IgA1 및 IgA2 등의 세부 종류로 구분되되, 이에 한정되지 않는다. 전장 경쇄 및 중쇄 내에서, 통상, 가변 부위 및 불변 부위는 약 12개 이상의 아미노산으로 된 "J" 부위에 의해 접합되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산으로 된 "D" 영역을 포함한다.
각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 부위들은 통상 항원-결합 부위를 형성한다. 가변 부위들은, 통상 상보적 결정 부위 또는 CDR로도 불리는 3개의 초가변 부위들에 의해 접합된 상대적으로 보존된 골격부위(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 두 사슬로부터의 CDR은 전형적으로 골격부위와 정렬되며, 이는 특이적 에피토프로의 결합을 가능하게 할 수 있다. N-말단에서 C-말단까지, 경쇄 가변 부위 및 중쇄 가변 부위는 통상 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 영역들을 포함한다. 각 영역에서의 아미노산 배정은 통상 Kabat et al ., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., 미국 보건복지부, NIH Publication No. 91-3242의 규정에 따른다. 전형적으로 이중특이 항체 또는 이중기능 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍과 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 혼성 항체이다. F(ab) 조각은 하나의 경쇄, 및 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 부위들로 구성된다. F(ab) 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 디설파이드 결합을 형성할 수 없다. F(ab') 조각은 하나의 경쇄, 및 CH1과 CH2 영역 사이에 더 많은 불변 영역들을 함유한 하나의 중쇄를 포함하므로, 2개의 중쇄 사이에 사슬간 디설파이드 결합이 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있다. Fv 부위에는 중쇄 및 경쇄 각각으로부터의 가변 부위들이 포함되어 있지만, 불변 부위들은 부족하다. 단일 사슬 항체는 Fv 분자이며, 이때 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위는 가요성 링커에 의해 연결되어, 단일 폴리펩타이드 사슬을 형성하며, 이로써 항원-결합 부위가 형성된다. 특정 구현예에 의하면, "다중특이적" 또는 "다중기능적" 항체가 아닌 이가 항체는 동일한 항원 특이성을 갖는 결합 부위들을 포함하는 것으로 알려져 있다.
본 개시된 방법에 의해 정제가능한 단일클론 항체(mAb)는 통상의 단일클론 항체 생성 방법, 예컨대, 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 표준 체세포 혼성화 기법을 비롯한 다양한 기법으로 제조될 수 있다. 비록 체세포 혼성화 과정이 바람직하지만, 기본적으로는, 여타 단일클론 항체 생성 기법들, 예컨대, B-림프구의 바이러스성 또는 종양성 변이를 이용할 수 있다. 단일클론 항체는 예를 들어 쥐의 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체에 해당될 수 있다.
구체적인 일 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 정제되는 항체는 인간의 β-아밀로이드 단백질의 원섬유(protofibrillar) 형태에 특이적으로 결합하는 항체(예컨대, 인간화 항체), 박테리아 표면 다당류 폴리-N-아세틸 글루코사민(PNAG)에 특이적으로 결합하는 항체(예컨대, 인간 항체), 및 CD38 막관통 글리코단백질에 특이적으로 결합하는 항체(예컨대, 인간화 항체)로 이루어진 군에서 선택되는 단일클론 항체이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "단백질을 회수하는 조작"이란 어구는 본 개시된 정제 방법을 이용한 후에 단백질을 수거하는 조작을 가리킨다. 본 개시된 정제 방법은 다양한 표준 단백질 크로마토그래피 기법을 이용하여 성취될 수 있으며, 이러한 기법으로는 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 상호반응 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 및 다중성분 수지 크로마토그래피가 있되, 이에 한정되지는 않는다. 본 개시된 방법의 특정 구현예에 의하면, 제1 또는 제2 크로마토그래피 컬럼은 Protein A 컬럼이다. Protein A 컬럼은 수지 리간드와 단백질 사이의 친화성을 통해 기능하여, 불순물을 높은 효율로 제거한다. 본 개시된 방법에 Protein A 컬럼을 사용하는 것의 또 다른 장점은 mAb가 Protein A에 대해 전반적인 친화성을 갖는다는 것이다. 본 개시된 방법의 일 구현예에서, Protein A 컬럼은 MabSelect Sure 수지(GE Healthcare)이다.
본 개시된 방법의 추가 구현예에 의하면, 제1 또는 제2 크로마토그래피 컬럼은 다중성분(혼합성분) 수지 크로마토그래피 컬럼이다. 다중성분 수지는 mAb: 이온성, 소수성 및 수소 결합 상호반응 등 여러 기전을 통해 해당 단백질과 상호반응한다: 더 구체적으로, 다중성분 수지 크로마토그래피 컬럼에서, mAb:이온성 상호반응은 전통적 음이온 교환 크로마토그래피 (AEX) 컬럼에서 발생하는 mAb:음이온성 상호반응과 달리 mAb:양이온성 상호반응이다.
본 개시된 방법의 구체적인 일 구현예에서, 다중성분 수지는 Capto Adhere 수지(GE Healthcare)이다. Capto adhere는 고도로 가교된 아가로오스 기반 매트릭스를 갖는 다중성분 음이온 교환체이다. Capto adhere의 특성을 아래에 정리하였다(GE Healthcare Life Sciences, 데이터 파일 28-9078-88 AC 참조).
Figure 112014056840338-pct00001
본 개시된 방법의 또 다른 특정 구현예에 의하면, 다중성분 수지는 Capto MMC 수지(GE Healthcare)이다. Capto MMC는 고도로 가교된 아가로오스 기반 매트릭스를 갖는 다중성분 양이온 교환체이다. Capto MMC의 특성을 아래에 정리하였다(GE Healthcare Life Sciences, 데이터 파일 11-0035-45 AA 참조).
Figure 112014056840338-pct00002
본 발명에 따른 방법은 첫째 크로마토그래피 단계의 말미에 Bis Tris 용액을 사용하는 조 단백질 용출액의 pH를 조절하는 단계를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
제1 구현예에서는, 첫째 크로마토그래피 단계의 말미에 Bis Tris 용액을 사용하는 조 단백질 용출액의 pH를 예를 들면 6 내지 7에 속하는 pH(예컨대 6.5)로 조절한다. 상기 Bis Tris 용액은 1M Bis Tris 용액일 수 있다. 이와 같은 방법에서, 다중성분 수지 크로마토그래피 컬럼은 예를 들어 Capto Adhere 컬럼에 해당될 수 있다. 본 방법의 구체적인 예를 실시예 3 내지 6에 개시하였다.
제2 구현예에서는, 첫째 크로마토그래피 단계의 말미에 수득된 조 단백질 용출액을 제2 크로마토그래피 컬럼에 직접 통과시킨다. 더 구체적으로 말하자면, 이들 두 단계 사이에 수행되는 처리(이를테면, pH 조절, 버퍼 교환 또는 희석)가 전혀 없다. 이와 같은 방법에서, 다중성분 수지 크로마토그래피 컬럼은 예를 들면 Capto MMC 컬럼에 해당될 수 있다. 또한, 아래에 더 설명하겠지만, 둘째 크로마토그래피 단계 후에 조 단백질 용출액을 막흡착기에 통과시킬 수 있다. 이러한 방법의 구체적인 일 예를 실시예 7에 개시하였다. 이와 같은 방법에서는, 수동적 개입 및 정제 시스템의 개방이 요구되는 내부(inter)-단계 처리들(예컨대, 비활성화 용기에서의 희석, 후공정 비활성 여과 및 Protein A 풀(pool) 용기에서 pH 조절)이 완전히 생략된다.
본원에 개시된 방법은 정제된 단백질을 회수하는데 이용될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "정제된"이란 단백질을 in vitro, ex vivo, 또는 in vivo에 효과적으로 사용가능한 순도를 가리킨다. 단백질이 in vitro, ex vivo, 또는 in vivo 적용분야에 유용하게 되려면, 이러한 적용분야에서의 단백질 사용을 방해하거나 또는 최소한 해당 단백질을 봉입시키는데 바람직하지 않을 수 있는 불순물, 다른 단백질, 및/또는 화학물질을 실질적으로 함유하지 않아야 한다. 이러한 적용분야로는 치료용 조성물의 제조, 치료용 조성물의 투여, 및 본원에 개시되는 여타 방법들이 포함된다. 바람직하게, 본원에서 언급하는 바와 같이, "정제된" 단백질은 임의의 방법(즉, 천연 공급원으로부터 직접, 재결합 또는 합성 방식을 통해 정제시킴)에 의해 제조될 수 있고; 다른 단백질 구성성분들로부터 정제되었으므로 주어진 조성에서 총 단백질의 중량을 기준으로 약 80 중량% 이상, 더 바람직하게는 약 85 중량% 이상, 더 바람직하게는 약 90 중량% 이상, 더 바람직하게는 약 91 중량% 이상, 더 바람직하게는 약 92 중량% 이상, 더 바람직하게는 약 93 중량% 이상, 더 바람직하게는 약 94 중량% 이상, 더 바람직하게는 약 95 중량% 이상, 더 바람직하게는 약 96 중량% 이상, 더 바람직하게는 약 97 중량% 이상, 더 바람직하게는 약 98 중량% 이상, 더 바람직하게는 약 99 중량% 이상을 구성하는 단백질이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "조 단백질"은 임의의 방법(즉, 천연 공급원으로부터 직접, 재결합 또는 합성 방식을 통해 정제시킴)에 의해 제조될 수 있고; 다른 단백질 구성성분들로부터 정제되었으므로 주어진 조성에서 총 단백질의 중량을 기준으로 약 80 중량% 미만을 구성하는 단백질을 가리킨다.
일 구현예에서, 본 개시된 방법은 "(c) 단계"로 불리는 제3 단계를 추가로 포함하며, 이 단계에서는 (b) 단계 후에 조 단백질 용출액을 막 흡착기에 통과시킨다. 특히 (c) 단계는 첫째 크로마토그래피 단계의 말미에 수득된 조 단백질 용출액이 제2 크로마토그래피 컬럼에 직접 통과될 때 수행될 수 있다. 막 흡착기는 미세다공성 입자가 아닌 큰 기공들을 가진 막을 사용하는 크로마토그래피 매트릭스 또는 필터 형태이다. 이들 기공은 전체 필터 면적을 덮고, 시료의 매우 빠른 흐름 속도뿐만 아니라, 막의 내부 구조체 내 타겟 분자들이 최적 결합을 용이하게 한다. 막은 스핀 컬럼 내에 통합될 수 있으며, 이는 복합 용액으로부터 타겟 단백질을 쉽게 선택적으로 분리할 수 있게 한다. 막 흡착기를 사용하는 것의 이점은 불순물들을 결합시키는 통상의 크로마토그래피 공정만큼 효율적이고; 빠른 처리 흐름 속도가 가능하며; 충진, 확인 또는 세정 조작이 불필요하고, 일회용이기는 해도 재사용가능하다는 것이다. 내염성 막은 훨씬 더 많은 유형의 정제를 가능하게 한다. 특정 구현예에 의하면, 막 흡착기는 내염성 상호반응 크로마토그래피 막 흡착기(예컨대, Satorius STIC 막 흡착기) 또는 Q 막 흡착기이다.
약학적 용도를 위해 재조합 단백질을 정제시킬 때, 크로마토그래피 단계들 다음에는 통상적으로 여과 단계들이 수행된다. 따라서, 본 발명의 방법은 (b) 또는 (c) 단계 후에 나노여과 단계를 더 포함할 수 있다. 한외여과 및 정용여과 단계는 나노여과 단계 후에 추가로 수행될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "한외여과" 또는 "UF"는 용액으로부터 입자 및/또는 이온을 물리적, 선택적으로 제거하기 위해 입자 크기 및 UF 막에 있는 기공의 크기에 근거한 반투과성 막을 사용하는 여과 기법을 가리킨다. 본원에 사용되는 바와 같이, "나노여과"는 예컨대 바이러스성 입자를 제거하는데 사용되는 나노필터를 통해 용액을 여과시키는 것을 가리킨다. 본원에 사용되는 바와 같이, "정용여과"는 용액으로부터 염 또는 용매를 완전히 제거하거나, 대체시키거나, 또는 염 또는 용매의 농도를 더 낮추기 위해 한외여과 막을 사용하는 기법을 가리킨다.
마지막으로, 상기 정제된 단백질을 보관에 적합한 조성물로 조제할 수 있고/있거나, 동물 및/또는 인간에 투여하기에 적합한 약학적 조성물로 조제할 수 있다.
본 개시된 방법의 수많은 장점 중 하나는 고순도 단백질을 양호한 수율로 수득할 수 있다는 것이다. 본 발명의 방법으로 회수되는 정제된 단백질은 가령 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 순도를 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 정제된 단백질을 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 수율로 회수할 수 있도록 한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 버퍼의 제조 방법에 관한 것이다. 사실, 이들 모든 버퍼는 단일 모액을 출발물질로 하여 매우 쉽고 빠르게 제조될 수 있다.
이와 같은 버퍼의 제조 방법은
i) 최종 농도 15 내지 25 mM(예컨대, 20 mM) Bis Tris 및 15 내지 25 mM(예컨대, 20 mM) NaCl를 함유한 용액(예컨대, 100 L의 용액)을 생성하는 단계;
ii) 용액의 pH를 아세트산을 사용하여 7 내지 8에 속한 값(예컨대, 7.4)으로 조절하는 단계;
iii) 용액의 절반을 수거함으로써, 평형 버퍼를 수득하는 단계;
iv) (iii) 단계로부터의 나머지 용액의 pH를 아세트산을 사용하여 4 내지 5에 속한 값(예컨대, 4.5)으로 조절하는 단계;
v) (iv) 단계에서 수득된 용액의 절반을 수거함으로써, 평형 버퍼를 수득하는 단계;
vi) (v) 단계로부터의 나머지 용액의 pH를 아세트산을 사용하여 3 내지 4에 속한 값(예컨대, 3.5)으로 조절함으로써, 추가 용출 버퍼를 수득하는 단계; 및
vii) (iii) 단계에서 수득된 평형 버퍼의 절반을 수거하고, NaCl를 첨가하되 최종 NaCl 농도가 0.9 내지 1.1 mM에 속한 농도(예컨대, 1M)가 되도록 첨가함으로써, 세척 및 위생용 버퍼를 수득하는 단계
를 포함할 수 있거나, 상기 단계들로 구성될 수 있다.
상기 방법은 도 1에 개략적으로 도시되어 있다.
대안으로, 버퍼의 제조 방법은
i) 최종 농도 15 내지 25 mM(예컨대, 20 mM) Bis Tris 및 15 내지 25 mM(예컨대, 20 mM) NaCl를 함유한 용액(예컨대, 100 L의 용액)을 생성하는 단계;
ii) 용액의 pH를 아세트산을 사용하여 8 내지 9에 속한 값(예컨대, 8.2)으로 조절하는 단계;
iii) 용액의 1/4(예컨대, 25 L)을 수거함으로써, 평형 버퍼를 수득하는 단계;
iv) (iii) 단계로부터의 용액의 나머지 절반의 pH를 아세트산을 사용하여 7 내지 8에 속한 값(예컨대, 7.4)으로 조절하는 단계;
v) (iv) 단계에서 수득된 용액의 2/3을 수거함으로써, 용출 버퍼를 수득하는 단계;
vi) (v) 단계로부터의 용액의 나머지 절반의 pH를 아세트산을 사용하여 3 내지 4에 속한 값(예컨대, 3.5)으로 조절함으로써, 추가 용출 버퍼를 수득하는 단계; 및
vii) (v) 단계에서 수득된 평형 버퍼의 절반을 수거하고, NaCl를 첨가하되 최종 NaCl 농도가 0.9 내지 1.1 mM에 속한 농도(예컨대, 1M)가 되도록 첨가함으로써, 세척 및 위생용 버퍼를 수득하는 단계
를 포함할 수 있거나, 상기 단계들로 구성될 수 있다.
상기 방법은 도 6에 개략적으로 도시되어 있다.
전술된 버퍼의 제조 방법들 중 하나는 또한 본 발명에 따른 방법의 제일 첫 번째 단계, 즉 2개의 크로마토그래피 단계를 수행하기 전의 단계에 해당될 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) 다중성분 수지 크로마토그래피 컬럼, 및/또는 Protein A 컬럼과 같은 친화성 크로마토그래피 컬럼; 및
(b) 본 발명에 따른 1개 이상의 버퍼(예컨대, Bis Tris, 아세트산, NaCl 및 물을 포함하거나 이들로 구성됨), 및/또는 본 발명에 따른 1개 이상의 버퍼(예컨대, Bis Tris, 아세트산, NaCl 및 물을 포함하거나 이들로 구성됨)를 제조하기 위한 설명서
를 포함하거나 상기로 구성된 키트에 관한 것이다.
또한 본 발명은 1개 이상의 크로마토그래피 단계를 통해 용액으로부터 단백질을 정제하는데 있어서의 본 발명에 따른 버퍼(예컨대, Bis Tris, 아세트산, NaCl 및 물을 포함하거나 이들로 구성됨)의 용도에 관한 것이다. 더 구체적으로, 상기 1개 이상의 크로마토그래피 단계는 다중성분 수지 크로마토그래피 단계, 및/또는 Protein A 컬럼과 같은 친화성 크로마토그래피 단계일 수 있다.
실시예
하기의 실시예는 본 개시된 방법의 특정 구현예들과 그의 다양한 용도를 예시한다. 이들 실시예는 설명 목적으로만 제시되는 것일 뿐, 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 이해해서는 안 된다.
실시예 1: 정제 버퍼의 최적화
1.1. Protein A 컬럼과 함께, 용출 버퍼로서 Bis Tris 버퍼를 사용할 수 있음
Protein A 컬럼을 이용하여 크로마토그래피 단계를 수행하는 경우, 용출 버퍼는 통상 구연산염 또는 글리신 버퍼로 구성된다. Protein A 컬럼을 이용한 상기 크로마토그래피 단계를 다음과 같은 종래 조건들을 이용하여 수행하였다:
- 컬럼: 80 mL의 MabSelect Sure
- 평형 버퍼: pH 7.2의 PBS 버퍼
- 용출 버퍼: pH 3.0의 100 mM 구연산나트륨
- 로딩: 1.48 g/L의 항(anti)-CD38 mAb를 포함한 1 L의 용액.
상기 크로마토그래피 단계 후, 7.92 g/L의 mAb를 포함한 175 mL의 조 단백질 용출액(1.386 g of mAb)을 수득하였다.
본 발명가들은 구연산염 버퍼를 Bis Tris 버퍼로 대체할 수 있는지의 여부를 연구하였다. 다음과 같은 조건들을 이용하였다:
- 컬럼: 80 mL의 MabSelect Sure
- 평형 버퍼: pH 7.2의 PBS 버퍼
- 용출 버퍼: pH 3.5(아세트산을 사용하여 조절된 pH)의 100 mM Bis Tris
- 로딩: 1.48 g/L의 항-CD38 mAb를 포함한 1 L의 용액.
본 발명가들은 6.8 g/L의 mAb(1.369 g의 mAb)를 포함한 200 mL의 조 단백질 용출액을 수득하였다.
이는, Protein A 컬럼을 이용하여 크로마토그래피 단계를 수행하는 경우, 용출 버퍼로서 Bis Tris 버퍼를 사용하면 종래의 구연산나트륨 버퍼와 같이 양호한 결과를 얻을 수 있다는 것을 보여 준다.
1.2. 다중모드식 다중성분-수지 크로마토그래피 컬럼과 함께, 버퍼로서 Bis Tris 버퍼를 유리하게 사용할 수 있음
Protein A 크로마토그래피 컬럼에 통과시킨 후에 수득된 조 단백질 용출액을 Capto adhere 다중모드식 다중성분-수지 크로마토그래피 컬럼에 통과시켰다. 이를 위해, 본 발명가들은 우선 다음과 같은 조건들을 시험하였다:
- 컬럼: 1 mL의 Capto adhere
- 평형 버퍼: pH 8.6의 100 mM 구연산나트륨(80%) 및 pH 2.2의 100 mM 시트르산(20%), 최종 pH는 5.3에 가까움
- 용출 버퍼: 어느 경우에 최적 용출이 이루어지고 있는지의 여부를 확인하기 위해 상기 2개의 버퍼의 농도를 변화시킴
- 세척용 버퍼: 평형 버퍼와 동일함
- 로딩: pH 5.3의, 35 mg의 항-CD38 mAb를 포함한 20 mL의 조 단백질 용출액
항체는 세척 단계 동안에 용출되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 당연히 pH가 감소되었기 때문이다. 실제, pH는 5.3으로 다시 증가하기 전에 일시적으로 5.3에서 4.0으로 감소되었다. pH가 4.0으로 떨어졌다는 사실은 항체가 세척 단계 동안에 용출되기에 충분하였다.
이어서, 본 발명가들은 Bis Tris 버퍼를 사용하면 세척 단계 동안에 원치 않은 용출을 피할 수 있는 가능성의 여부에 대해 연구하였다. 본 발명가들은 다음과 같은 조건들을 시험하였다:
- 컬럼: 1 mL의 Capto adhere
- 평형 버퍼: pH 7.0(아세트산을 사용하여 조절된 pH)의 20 mM Bis Tris
- 용출 버퍼: pH 6.0(아세트산을 사용하여 조절된 pH)의 20 mM Bis Tris
- 세척/재생용 버퍼: pH 4.0(아세트산을 사용하여 조절된 pH)의 20 mM Bis Tris
- 위생용 버퍼: NaOH 0.5N
- 로딩: 약 30 mg의 항-CD38 mAb를 포함한 18 mL의 조 단백질 용출액. 이 용출액은 위의 단락 1.1에서 설명한 제2 크로마토그래피로부터 생성되었다. Capto adhere 컬럼에 로딩하기 전에, 1M Bis Tris 용액을 사용하여 상기 용출액의 pH를 pH 7.2로 조절하였다.
본 발명가들은 상기 조건들 하에서 항체를 제대로 용출할 수 있다는 것을 발견하였다. 실제, pH 6.0의 Bis Tris 용출 버퍼로 항체가 용출되었다. pH 4.0에서의 재생 단계 및 NaOH를 사용한 위생 단계 동안에 2개의 작은, 무시해도 될 정도의 피크가 관찰되었다.
아세트산 대신에 HCl를 사용하여 Bis Tris 버퍼의 pH를 조절하는 것이 이로울 수 있는지의 여부에 대해 추가로 시험하였다. 다음과 같은 조건들을 이용하였다:
- 컬럼: 1 mL의 Capto adhere
- 평형 버퍼: pH 7.0(HCl 1N을 사용하여 조절된 pH)의 20 mM Bis Tris
- 용출 버퍼: Bis Tris 버퍼(20 mM, pH 4, 이는 HCl 1N을 사용하여 조절된 pH임)를 이용한 구배
- 로딩: 약 15 mg의 항-CD38 mAb를 포함한 10 mL의 조 단백질 용출액. 이 용출액은 위의 단락 1.1에서 설명한 제2 크로마토그래피로부터 생성되었다. Capto adhere 컬럼에 로딩하기 전에, 1M Bis Tris 용액을 사용하여 상기 용출액의 pH를 pH 7.2로 조절하였다.
상기 조건들을 이용하였을 때에는 항체가 세척 단계 동안에 용출되지 않았다. 따라서 이와 같은 분석은, Bis Tris 버퍼를 사용하면 세척 단계 동안에 항체의 원치 않은 용출을 방지할 수 있다는 것을 확인시켜 준다. 그러나, 아세트산이 아닌 HCl를 사용하여 pH를 조절하였을 때 pH는 용출 단계 동안 빠르게 감소되지 않았다. 이에 따라, 아세트산이 아닌 HCl를 사용하여 pH를 조절하였을 때 항체의 용출이 덜 효율적이었다.
결론적으로, 놀랍게도 본 발명가들은 다중성분 수지 크로마토그래피 단계 동안, Bis Tris를 포함한 평형 버퍼 및 용출 버퍼를 사용하면 세척 및 위생 단계 동안에 항체의 원치 않는 용출을 피할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한 본 발명가들은 아세트산을 사용하여 Bis Tris 버퍼의 pH를 조절하는 것이 유리하였음을 발견하였다. Bis Tris 버퍼는 또한 Protein A 크로마토그래피 단계를 수행하는데 적합하다는 것이 밝혀졌기 때문에, 본 발명가들은 화합물들의 동일한 매트릭스로 버퍼를 모두 제조가능한 정제 방법을 발견하였으며, 이는 버퍼 제조를 상당히 용이하게 한다.
모두가 Bis Tris는 물론, pH 조절 목적의 아세트산을 포함하는 평형 버퍼, 세척용 버퍼 및 2개의 용출 버퍼에 최적인 pH를 정하기 위해, 추가 실험을 수행하였다. 본 발명가들은 또한 예기치 않게도 NaCl를 상기 버퍼들에 첨가하는 것이 유리할 수 있다는 것을 발견하였다. 이들 추가 실험에 이어, 실시예 2 내지 7에 설명되는 버퍼 정제 및 프로토콜이 행해졌다.
실시예 2: 정제 버퍼의 조제
본원에 기술된 2단계 정제 방법은 평형 버퍼, 세척 및 위생용 버퍼, 및 2개의 용출 버퍼 등 4개의 버퍼를 활용하며, 이들 모두는 동일한 모액으로부터 제조되었다. 프로토콜의 개략도를 도 1에 도시하였으며, 다음과 같다: 당량의 20 mM Bis Tris 및 당량의 20mM NaCl를 모액으로서의 100 L 주입용수(water for injection, WFI)에 첨가하고, 이렇게 얻은 용액의 pH를 아세트산을 사용하여 7.4로 조절하였다. 그런 후에는, 생성된 용액의 50 L를 수거하고, 평형 버퍼로 보관하였다. 이어서, 평형 버퍼의 25 L를 제거하고, 당량의 1M NaCl를 첨가함으로써, pH를 3.5까지 감소시켰다. 이렇게 생성된 25 L의 용액을 세척 및 위생용 버퍼로 정하였다. 모액의 남아있는 50 L의 pH를 아세트산을 사용하여 4.5로 조절하였다. 그런 후에는 이 용액의 25 L를 용출 버퍼들 중 하나로서 수거하였다. 이어서, 모액의 남아있는 25 L의 pH를 아세트산을 사용하여 3.5로 조절하여, 나머지 용출 버퍼를 생성하였다.
실시예 3: 2단계 단일클론 항체 정제 방법
MabSelect Sure 수지를 사용한 첫째 크로마토그래피 단계를 시작으로, 2단계 단일클론 항체(mAb) 정제 방법을 개시하였다. 평형 버퍼의 두 컬럼 부피(CV)를 컬럼에 통과시켰다. 그런 후에는 상기 mAb 용액을 컬럼에 로딩하였다. 세척용 버퍼의 두 CV에 이어, 평형 버퍼의 두 CV를 컬럼에 통과시켰다. 이어서, 제1 용출 버퍼의 한 CV를 사용하여 조 mAb 용액을 용출시켰다. 이들 두 크로마토그래피 단계 사이에 저 pH 처리를 시행하였다. 이는 1M 아세트산을 사용하여 pH 3.5 ± 0.1에 이르게 하는 저 pH 조절이거나, 1M Bis Tris를 사용하여 pH 5 ± 0.1에 이르게 하는 pH 조절일 수 있다. Capto Adhere 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 제2 크로마토그래피를 수행하였다. 평형 버퍼의 두 CV를 상기 컬럼에 통과시켰다. 그런 후에는 조 mAb 용액을 컬럼에 로딩하고, 이어서 평형 버퍼의 네 CV를 통과시켰다. 부분 정제된 mAb 용액을 제2 용출 버퍼의 한 CV를 사용하여 용출시켰다. 크로마토그래피 후, 나노여과법 및 한외여과법/정용여과법 둘 다를 이용하여 mAb를 여과시킬 수 있다. X0HC 및 VPD 프리필터(Millipore)를 사용한 예비-여과 단계로 시작하여, Viresolve Pro 필터(Millipore)를 사용한 나노여과 단계를 끝으로 나노여과법을 시행하였다. 그런 후에는 50 g/L의 농도를 목표로 한외여과 단계를 수행하고, 이어서 7가지 부피의 히스티딘 버퍼를 사용한 정용여과 단계를 수행하였다(본 방법의 개략도에 대한 도 2를 참조).
실시예 4: 인간화 13 C3 mAb 의 소량(small-batch) 정제
인간화 13C3 mAb 53 g의 소규모-배치 정제를 위해 실시예 2에 기술된 프로토콜을 활용하였다. 국제출원공개번호 WO 2009/065054에 기재되어 있는 바와 같이, 13C3 mAb는 인간 β-아밀로이드 단백질의 원섬유 형태에 결합한다.
mAb 벌크 수확물을 탁도(depth) 여과 시스템을 통해 정화하고, 0.22 μm 필터를 이용하여 여과시킨 후에, 정제에 앞서 50 L용 일회용 봉지에 96시간 동안 2 내지 8℃에서 보관하였다. 43 L의 벌크 수확물을 3.1 L MabSelect Sure 컬럼에 240 cm/시간의 흐름 속도로 로딩하였다. 전술한 바와 같이 첫째 크로마토그래피 단계를 수행하고, 6 L의 mAb 용액을 수거하였다. 그런 후에는 용출액을 4 L Milli-Q 물로 희석시켜, 약 5 g/L 농도의 용액을 생성하였다. 1 L의 1M Bis Tris를 사용하여, pH를 6.5로 재조절하였다. 총 부피 11.03 L를 C0HC 등급 탁도 필터 및 0.22 μm Millipak 필터를 통해 여과시켰다. 이렇게 11.58 L를 수거한 후, 2 내지 8℃에 보관하였다. 둘째 크로마토그래피 단계를 위해, MabSelect sure 용출액을 4L Capto adhere 컬럼에 240 cm/시간의 흐름 속도로 로딩하였다. 로딩 단계가 끝나면, 전술한 바와 같이 크로마토그래피를 수행하고, 이에 수득된 최종 부피 5.58 L를 10 L용 봉지에 담았다. 최종 생성물을 0.22 μm Millipak 필터를 통해 여과시키고, 2 내지 8℃에 보관하였다.
종래의 mAb 정제법과 비교하여, 본원에 개시된 2단계 방법은 전체 수율 >90% 및 순도 >98%와 유사한 결과를 가져왔으며, 이 경우 구체적으로 순도는 99.4%, 최종 농도는 9.49 g/L였다.
실시예 5: 단일클론 항체의 대량 정제
2단계 정제 방법은 단일클론 항체의 대규모 정제에도 적용가능하다. 첫째 크로마토그래피 단계를 위해, 인간화 13C3 mAb의 벌크 수확물(216 L)을 네 분주량으로 나누고, 4개의 시행(run)에서 각각 약 54 L씩, 240 cm/시간의 흐름 속도로 3.1L MabSelect Sure 컬럼에 로딩하였다. 전술한 바와 같이 크로마토그래피를 수행하고, mAb 용출액을 Mobuis 100L용 봉지에 담았다. 또한, 각각의 로딩 단계가 끝나면, 평형 버퍼를 사용하여 컬럼을 평형화시켰다. 19.7 L 용액의 pH는 3.9인 것으로 측정되었다. 그런 후에는 60 L의 MilliQ 물을 사용하여 용출액을 5 g/L의 농도까지 희석하였다. 4.0 L의 1M 아세트산을 사용하여, 용출액의 pH를 약 1시간에 걸쳐 3.5로 조절하였다. 이러한 pH 유지에 이어, Capto Ahere 단계를 위해 7L의 1M Bis Tris 용액으로 용출액의 pH를 pH 6.5로 조절하였다. 이 단계에서 최종 부피는 91 L였으며, 생성물을 4℃에 보관하였다. 둘째 크로마토그래피 단계를 위해, 상기 MabSelect sure 용출액들을 나누고, 4개의 시행에서, 240 cm/시간의 흐름 속도로 3.5L Capto Adhere 컬럼에 로딩하였다. 각각의 로딩 단계가 끝나면, 평형 버퍼를 사용하여 컬럼을 평형화시켰다. 모든 용출액을 0.22 μm 필터에 통과시켜 동일한 50 L용 Flexboy 봉지에 모두 넣고, 각 단계가 끝나면, 세척용 버퍼를 사용하여 위생 단계를 수행하였다. 최종 부피는 22.1 L였으며, 이를 2 내지 8℃에 보관하였다. 그런 후에는 X0HC 필터(Millipore)를 이용하여 탁도 여과 단계를 수행하였다. 이 단계의 후속 단계에 사용되는 X0HC 필터와 VDF 프리필터 사이의 호환성 문제 때문에, VDF 프리필터를 X0HC 필터에 덧붙이고, 동일한 홀더에서 여과를 수행하였다. 수율 손실을 최소화시키기 위해, 이들 2개의 탁도 필터 다음에 Modus 1.3 나노필터를 일직선 형태로 설치하였다. 0.22m2의 X0HC 등급(2x0.11m2), 0.22m2의 VPF 필터(2x0.11m2), 및 Modus 1.3(0.21m2)을 통해 용액을 여과시켰다. 여과 플러시 후, 회수된 총 부피는 25.9 L였다. 460ml/분으로 1.8 bar에서 시작하여 약 1.3 bar로 끝나는 등, 압력 문제는 전혀 없는 것으로 나타났다. 최종 단계는 용액을 한외여과 및 정용여과시키는 단계였다. 이들 두 공정은 용량을 1.71m2까지 증가시킨 홀더를 갖춘 Millipore Cogent M에서 수행되었다. 배치를 9.3 L의 일정 부피로 Cogent M에 로딩시켜, 용액을 50 g/L까지 농축시켰다. 제1 농도는 12L/M/H 펌프 직교류(cross flow)로 50분이 지난 후에 도달되었다. 이어서, 14L/M/H 펌프 직교류로 7가지 부피의 10 mM 히스티딘 버퍼(pH 6.5)를 사용하여 165분 내로 정용여과를 수행하였다. 그 후, 생성물을 30분에 걸쳐 8 L/M/H 펌프 직교류로 천천히 농축시켰다. △P < 0.6 Bar 하에 유지되기 위해, 유량을 1670ml/분에서 시작하여 520ml/분으로 끝내는 등으로 유량을 조절하였다. 457 g의 mAb를 함유하며, 최종 농도가 175.7g/L (UV)인 수거된 용액의 최종 부피는 2.6 L였다. 마지막으로, 생성물을 0.22 μm Sartopore 2-150 필터를 이용하여 여과시킨 다음, 4℃에 보관하였다.
실시예 6: 다양한 단일클론 항체의 정제
전술된 상기 2단계 정제 방법을 이용하여, 인간화 13C3 항체 외에도, 추가 항체들, 즉 박테리아 표면 다당류 폴리-N-아세틸 글루코사민(PNAG)에 특이적으로 결합하는 인간 항체, 및 CD38 막관통 글리코단백질에 특이적으로 결합하는 인간화 단일클론 항체를 정제시켰다.
아래의 표는 상기 세 항체들의 정제시 얻은 전체 수율 및 순도를 나타낸다.
Figure 112014056840338-pct00003
1 전체 수율은 나노여과, 한외여과 및 정용여과 단계들 이전의 수율에 해당된다.
정제된 인간화 13C3 mAb 및 정제된 항-PNAG mAb를 임상 실험 형태로 인간에 투여하였다.
그 결과, 3개의 상이한 항체들의 경우, 본 2단계 정제 방법을 통해, 인간에 투여하기에 적합한 품질을 지닌 탁월한 순도의 정제된 항체를 양호한 수율로 수득할 수 있었다.
실시예 7: "1일 1 배치" 정제 방법
첫째 크로마토그래피 단계의 말미에 수득된 조 단백질 용출액을 직접 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 방식으로, 대규모 정제법 또한 다중모드식 컬럼에 부착된 Protein A 컬럼을 이용할 수 있다(도 3 참조). 대규모 정제 방법을 이용하는 것의 이점들 중 몇몇은 추가 희석, pH 조절, 또는 저장 단계가 불필요하다는 것이다. 그 밖에도, 본 방법은 조 항체 제조물의 신속한 로딩을 가능하게 한다. 7시간 30분에 걸쳐 340 g mAb 배치를 정제시키기 위해 대규모 항체 정제 방법을 정제용으로 이용하였다(도 4 참조). 이와 같은 정제 방법으로, 수율 98%(332/340 g) 및 순도 96.9%를 얻었다(도 5 참조). 또한, 상기 방법을 이용한 불순물 제거율은 종래의 정제 방법들에서 본 것과 비슷한 수준이었다.
전술한 대규모 정제 방법들을 이용하여, 예를 들면, 전-임상 실험 및 임상 실험에 사용되는 항체 제조물을 더 크게, 더 효율적으로 수행하기 위한 목표를 충족시킬 수 있다.
더 구체적으로, "1일 1 배치"로 불리는 본 방법을 인간화 13C3 mAb의 대규모 정제에 적용하였다. 저장, 개방 과정, 희석/조절 단계가 포함되지 않은 2개의 크로마토그래피 단계를 통해, 단 하루 만에 전체 200 L 배치를 정제시키는 것이 목표였다.
버퍼들은 도 6에 도시된 것과 같이 제조하였다.
첫째 크로마토그래피 단계를 위해, 벌크 수확물(179L)을 네 분주물로 나누고, 4번 시행으로 3.1L MabSelect Sure 컬럼에 로딩하였다. 모든 시행에서는, 버퍼 B(20 mM NaCl, 20 mM Bis Tris pH 7.4)를 사용하여 평형화시키고, 버퍼 D(1M NaCl, 20 mM Bis Tris pH7.4)를 사용하여 세척하고, 버퍼 C(20 mM NaCl, 20 mM Bis Tris pH3.5)를 사용하여 용출하였다. 각 용출액을 3.1L Capto MMC 컬럼에 직접 로딩하였다. 각 로딩을 시행하기에 앞서, 컬럼을 버퍼 C(20 mM NaCl, 20 mM Bis Tris pH 3.5)로 평형화시키고, 로드 이후 컬럼을 버퍼 B(20 mM NaCl, 20 mM Bis Tris pH 7.4)로 평형화시키고, 생성물을 버퍼 A(200 mM NaCl, 20 mM Bis Tris pH 8.2)로 용출하였다. 이런 식으로 아침 7시부터 오후 3시까지 한 작업일에 전체 배치를 정제시켰다.
상기 2개의 크로마토그래피 단계가 끝나면, 모든 용출된 분획물들을 STIC 막에 통과시킨 다음, 50 L용 봉지에 담았다.
제1 컬럼에 로딩된 총 부피는 179 L였으며, mAb의 농도는 1.61 g/L였다. 정제된 총 부피는 35.7 L였으며, mAb의 역가는 7.26 g/L였다. 전체 수율은 90%였다.
본 발명의 상세한 설명 및 본 발명의 특정 구현예들을 참조하면, 첨부된 청구범위 내에 정의된 본 발명의 범주에서 벗어나지 않으면서 수정 및 변경이 가능하다는 것이 명백할 것이다. 더 구체적으로는, 비록 본 발명의 일부 양태들이 본원에서 특히 유리한 것으로 확인되었지만, 본 발명이 이들 특정 양태로 반드시 제한되는 것은 아님을 이해한다.
본원에서 기술 및/또는 인용된 각 참조문헌은 그 전체가 참조로 통합된다.

Claims (43)

  1. - 용액을 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    - 제1 용출 버퍼를 사용하여 제1 크로마토그래피 컬럼으로부터 조 단백질 용출액을 용출하는 조작
    을 포함한 (a) 첫째 크로마토그래피 단계; 및
    - (a) 단계의 말미에 수득된 조 단백질 용출액을 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    - 제2 용출 버퍼를 사용하여 제2 크로마토그래피 컬럼으로부터 정제된 단백질을 회수하는 조작
    을 포함한 (b) 둘째 크로마토그래피 단계를 포함하며,
    각각의 버퍼는 Bis Tris를 포함하는 것인,
    용액으로부터 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편(fragment)의 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 2개의 크로마토그래피 단계의 각각은
    - 평형 버퍼를 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    - 용액을 또는 조 단백질 용출액을 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    - 평형 버퍼를 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    - 용출 버퍼를 사용하여 조 단백질 용출액을 용출시키거나, 정제된 단백질을 크로마토그래피 컬럼으로부터 회수하는 조작
    을 포함하며,
    각각의 버퍼는 Bis Tris를 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 2개의 크로마토그래피 단계의 각각은
    - 평형 버퍼를 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    - 용액을 또는 조 단백질 용출액을 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    - 평형 버퍼를 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    - 세척 및 위생용 버퍼를 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    - 평형 버퍼를 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    - 용출 버퍼를 사용하여 조 단백질 용출액을 용출시키거나, 정제된 단백질을 크로마토그래피 컬럼으로부터 회수하는 조작
    을 포함하며,
    각각의 버퍼는 Bis Tris를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 각 버퍼는 동일한 화학물질들이 버퍼마다 상이한 농도로 구성된 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 각 버퍼는 Bis Tris, 아세트산, NaCl 및 물로 구성된 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 크로마토그래피 단계만 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 컬럼들 중 하나는 친화성 크로마토그래피 컬럼 또는 Protein A 친화성 크로마토그래피 컬럼인 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 컬럼들 중 하나는 다중성분 수지 크로마토그래피 컬럼인 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 단계는 조 단백질 용출액의 pH를 Bis Tris 용액을 사용하여 조절하는 조작, 또는 조 단백질 용출액의 pH를 Bis Tris 용액을 사용하여 6 내지 7에 속한 값으로 조절하는 조작을 더 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 단계의 말미에 수득된 조 단백질 용출액은 pH 조절, 버퍼 교환 또는 희석과 같은 어떠한 처리도 거치지 않고 직접 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은
    (i) 평형 버퍼를 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    (ii) 용액을 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    (iii) 평형 버퍼를 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    (iv) 세척 및 위생용 버퍼를 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    (v) 평형 버퍼를 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작; 및
    (vi) 제1 용출 버퍼를 사용하여 제1 크로마토그래피 컬럼으로부터 조 단백질 용출액을 용출하는 조작
    을 포함한 (a) 첫째 크로마토그래피 단계; 및
    (i) 평형 버퍼를 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    (ii) (a) 단계로부터의 조 단백질 용출액을 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    (iii) 평형 버퍼를 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작; 및
    (iv) 제2 용출 버퍼를 사용하여 제2 크로마토그래피 컬럼으로부터 정제된 단백질을 회수하는 조작
    을 포함한 (b) 둘째 크로마토그래피 단계
    를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, (a) 첫째 크로마토그래피 단계가
    (vii) Bis Tris 용액을 사용하여 조 단백질 용출액의 pH를 조절하는 조작을 추가로 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 친화성 크로마토그래피 컬럼 또는 Protein A 친화성 크로마토그래피 컬럼인 방법.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 크로마토그래피 컬럼은 다중성분 수지 크로마토그래피 컬럼인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 방법은
    (i) 평형 버퍼를 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    (ii) 용액을 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    (iii) 평형 버퍼를 제1 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작; 및
    (iv) 제1 용출 버퍼를 사용하여 제1 크로마토그래피 컬럼으로부터 조 단백질 용출액을 용출하는 조작
    을 포함한 (a) 첫째 크로마토그래피 단계; 및
    (i) 평형 버퍼를 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    (ii) (a) 단계로부터의 조 단백질 용출액을 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    (iii) 평형 버퍼를 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    (iv) 세척 및 위생용 버퍼를 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작;
    (v) 평형 버퍼를 제2 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 조작; 및
    (vi) 제2 용출 버퍼를 사용하여 제2 크로마토그래피 컬럼으로부터 정제된 단백질을 회수하는 조작
    을 포함한 (b) 둘째 크로마토그래피 단계
    를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, (a) 첫째 크로마토그래피 단계가
    (v) Bis Tris 용액을 사용하여 조 단백질 용출액의 pH를 조절하는 조작을 추가로 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제3항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 다중성분 수지 크로마토그래피 컬럼인 방법.
  18. 제1항 내지 제3항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 크로마토그래피 컬럼은 친화성 크로마토그래피 컬럼 또는 Protein A 친화성 크로마토그래피 컬럼인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 단일클론 항체가 인간의 β-아밀로이드 단백질의 원섬유(protofibrillar) 형태에 특이적으로 결합하는 항체, 박테리아 표면 다당류 폴리-N-아세틸 글루코사민(PNAG)에 특이적으로 결합하는 항체, 및 CD38 막관통 글리코단백질에 특이적으로 결합하는 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제3항, 제15항, 제16항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계 후, 조 단백질 용출액을 막 흡착기에 통과시키는 (c) 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 막 흡착기는 내염성 상호반응 크로마토그래피 막 흡착기인 방법.
  22. 제20항에 있어서, (b) 또는 (c) 단계 후, 나노여과 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 나노여과 단계 후, 한외여과(ultrafiltration) 및 정용여과(diafiltration) 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제3항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용출 버퍼는 15 내지 25 mM Bis Tris 및 15 내지 25 mM NaCl를 포함하며, 아세트산을 사용하여 3 내지 4에 속한 pH로 조절된 pH를 갖는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제3항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 용출 버퍼는
    - 15 내지 25 mM Bis Tris 및 15 내지 25 mM NaCl를 포함하며, 아세트산을 사용하여 4 내지 5에 속한 pH로 조절된 pH를 가지거나, 또는
    - 15 내지 25 mM Bis Tris 및 150 내지 250 mM NaCl를 포함하며, 아세트산을 사용하여 8 내지 9에 속한 pH로 조절된 pH를 갖는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제3항, 제15항, 제16항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용출 버퍼는
    - 15 내지 25 mM Bis Tris 및 15 내지 25 mM NaCl를 포함하며, 아세트산을 사용하여 4 내지 5에 속한 pH로 조절된 pH를 갖거나, 또는
    - 15 내지 25 mM Bis Tris 및 150 내지 250 mM NaCl를 포함하며, 아세트산을 사용하여 8 내지 9에 속한 pH로 조절된 pH를 갖는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제3항, 제15항, 제16항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 용출 버퍼는 15 내지 25 mM Bis Tris 및 15 내지 25 mM NaCl를 포함하며, 아세트산을 사용하여 3 내지 4에 속한 pH로 조절된 pH를 갖는 것인 방법.
  28. 제2항에 있어서, 평형 버퍼는 15 내지 25 mM Bis Tris 및 15 내지 25 mM NaCl를 포함하며, 아세트산을 사용하여 7 내지 8에 속한 pH로 조절된 pH를 갖는 것인 방법.
  29. 제3항에 있어서, 세척 및 위생용 버퍼는 15 내지 25 mM Bis Tris 및 0.9 내지 1.1 mM NaCl를 포함하며, 아세트산을 사용하여 7 내지 8에 속한 pH로 조절된 pH를 갖는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제3항, 제15항, 제16항, 제19항, 제28항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 정제 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 85% 이상의 수율로 회수되는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제3항, 제15항, 제16항, 제19항, 제28항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 정제 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 95% 이상의 순도를 나타내는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제3항, 제15항, 제16항, 제19항, 제28항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 정제 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 약학적 조성물로 조제하는 단계를 더 포함하는 방법.
  33. i) 최종 농도 15 내지 25 mM Bis Tris 및 15 내지 25 mM NaCl를 함유한 용액을 생성하는 단계;
    ii) 용액의 pH를 아세트산을 사용하여 7 내지 8에 속한 값으로 조절하는 단계;
    iii) 용액의 절반을 수거함으로써, 평형 버퍼를 수득하는 단계;
    iv) (iii) 단계로부터의 용액의 나머지 절반의 pH를 아세트산을 사용하여 4 내지 5에 속한 값으로 조절하는 단계;
    v) (iv) 단계에서 수득된 용액의 절반을 수거함으로써, 용출 버퍼를 수득하는 단계;
    vi) (v) 단계로부터의 용액의 나머지 절반의 pH를 아세트산을 사용하여 3 내지 4에 속한 값으로 조절함으로써, 추가 용출 버퍼를 수득하는 단계; 및
    vii) (iii) 단계에서 수득된 평형 버퍼의 절반을 수거하고, NaCl를 첨가하되 최종 NaCl 농도가 0.9 내지 1.1 mM에 속한 농도가 되도록 첨가함으로써, 세척 및 위생용 버퍼를 수득하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제3항, 제15항, 제16항, 제19항, 제28항 및 제29항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 버퍼의 제조 방법.
  34. i) 최종 농도 15 내지 25 mM Bis Tris 및 15 내지 25 mM NaCl를 함유한 용액을 생성하는 단계;
    ii) 용액의 pH를 아세트산을 사용하여 8 내지 9에 속한 값으로 조절하는 단계;
    iii) 용액의 1/4을 수거함으로써, 용출 버퍼를 수득하는 단계;
    iv) (iii) 단계로부터의 나머지 용액의 pH를 아세트산을 사용하여 7 내지 8에 속한 값으로 조절하는 단계;
    v) (iv) 단계에서 수득된 용액의 2/3를 수거함으로써, 평형 버퍼를 수득하는 단계;
    vi) (v) 단계로부터의 나머지 용액의 pH를 아세트산을 사용하여 3 내지 4에 속한 값으로 조절함으로써, 추가 용출 버퍼를 수득하는 단계; 및
    vii) (v) 단계에서 수득된 평형 버퍼의 절반을 수거하고, NaCl를 첨가하되 최종 NaCl 농도가 0.9 내지 1.1 mM에 속한 농도가 되도록 첨가함으로써, 세척 및 위생용 버퍼를 수득하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제3항, 제15항, 제16항, 제19항, 제28항 및 제29항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 버퍼의 제조 방법.
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