JPH0788395B2 - タンパク質の精製方法 - Google Patents
タンパク質の精製方法Info
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- JPH0788395B2 JPH0788395B2 JP63508950A JP50895088A JPH0788395B2 JP H0788395 B2 JPH0788395 B2 JP H0788395B2 JP 63508950 A JP63508950 A JP 63508950A JP 50895088 A JP50895088 A JP 50895088A JP H0788395 B2 JPH0788395 B2 JP H0788395B2
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- protein
- impurities
- csf
- ion exchange
- chromatography
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J39/00—Cation exchange; Use of material as cation exchangers; Treatment of material for improving the cation exchange properties
- B01J39/26—Cation exchangers for chromatographic processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
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Description
【発明の詳細な説明】 背景 イオン交換クロマトグラフィーは通常のクロマトグラフ
技法であり、本来穏やかな技法であって、低コストであ
り、容量が大きく、しかも簡単に評価できる技術であ
る。しかしながら、現在のところ、この技法はタンパク
質（特に、rDNAタンパク質）からこれと密接に関連した
不純物を分離するための有用な技法であるとは言えな
い。
技法であり、本来穏やかな技法であって、低コストであ
り、容量が大きく、しかも簡単に評価できる技術であ
る。しかしながら、現在のところ、この技法はタンパク
質（特に、rDNAタンパク質）からこれと密接に関連した
不純物を分離するための有用な技法であるとは言えな
い。
前記rDNAタンパク質の例はヒト組換えGM−CSFである。
血液中の顆粒球とマクロファージの生長および発生を促
進する因子であるGM−CSFの相補DNA（cDNA）は、最近に
なって、多くの研究室によってクローン化され、その塩
基配列が決定された。さらに、非組換えGM−CSFは（米
国特許第4438032号に記載される）Mo細胞系列の培養上
清から精製され、Ｎ末端からの最初の16個のアミノ酸が
決定された（Gasson et al.,Science,vol.226,1339−13
42（1984）を参照されたい）。多くのヒトGM−CSFの中
に、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列の不均質性が観察
された。例えば、アミノ酸レベルでは、Ｎ末端アラニン
に対して100位にトレオニンとイソロイシンの両方が観
察されており、このことはGM−CSFの数種類の対立遺伝
子形態（すなわち、多形）がヒト集団内に存在しうるこ
とを示唆している。
血液中の顆粒球とマクロファージの生長および発生を促
進する因子であるGM−CSFの相補DNA（cDNA）は、最近に
なって、多くの研究室によってクローン化され、その塩
基配列が決定された。さらに、非組換えGM−CSFは（米
国特許第4438032号に記載される）Mo細胞系列の培養上
清から精製され、Ｎ末端からの最初の16個のアミノ酸が
決定された（Gasson et al.,Science,vol.226,1339−13
42（1984）を参照されたい）。多くのヒトGM−CSFの中
に、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列の不均質性が観察
された。例えば、アミノ酸レベルでは、Ｎ末端アラニン
に対して100位にトレオニンとイソロイシンの両方が観
察されており、このことはGM−CSFの数種類の対立遺伝
子形態（すなわち、多形）がヒト集団内に存在しうるこ
とを示唆している。
現在、GM−CSFのcDNAのような、cDNAの新たな作製およ
びクローニング、並びにcDNAライブラリーの構築には、
いろいろな方法が利用されている。一例として、所望の
活性を示すポリペプチドを生産する細胞（例えば、非形
質転換ヒトＴ細胞源）から全mRNAが抽出される。この全
mRNAから、プライマー開始逆転写を用いて、初めに各mR
NA配列の相補体をつくり、次に第二鎖の合成を開始させ
ることにより、二本鎖cDNAが作製される。続いて、この
cDNAは、相補的なホモポリマー尾部を介して、あるいは
適当な制限部位を含んだリンカーセグメントにより作ら
れた付着末端を介して、それらを適切なプラスミドまた
はバクテリオファージベクターに結合させ、その後適当
な宿主を形質転換することによって、クローニングされ
る。本発明方法により精製されるタンパク質を生産させ
るためには、広範囲の発現系（すなわち、宿主−発現ベ
クターの組み合わせ）を使用することができる。利用可
能な宿主細胞の種類には、限定するものではないが、細
菌、酵母、昆虫、哺乳動物などの細胞が含まれる。
びクローニング、並びにcDNAライブラリーの構築には、
いろいろな方法が利用されている。一例として、所望の
活性を示すポリペプチドを生産する細胞（例えば、非形
質転換ヒトＴ細胞源）から全mRNAが抽出される。この全
mRNAから、プライマー開始逆転写を用いて、初めに各mR
NA配列の相補体をつくり、次に第二鎖の合成を開始させ
ることにより、二本鎖cDNAが作製される。続いて、この
cDNAは、相補的なホモポリマー尾部を介して、あるいは
適当な制限部位を含んだリンカーセグメントにより作ら
れた付着末端を介して、それらを適切なプラスミドまた
はバクテリオファージベクターに結合させ、その後適当
な宿主を形質転換することによって、クローニングされ
る。本発明方法により精製されるタンパク質を生産させ
るためには、広範囲の発現系（すなわち、宿主−発現ベ
クターの組み合わせ）を使用することができる。利用可
能な宿主細胞の種類には、限定するものではないが、細
菌、酵母、昆虫、哺乳動物などの細胞が含まれる。
宿主細胞からGM−CSFを抽出し次いでそれを精製するた
めの方法がいろいろ開示されているが、GM−CSFは必ず
しもよい収量でかつ生物学的活性を保持した状態で適切
に精製されるとは限らない。
めの方法がいろいろ開示されているが、GM−CSFは必ず
しもよい収量でかつ生物学的活性を保持した状態で適切
に精製されるとは限らない。
発明の要約 本発明は、粗製タンパク質を比較的純粋なタンパク質画
分と不純なタンパク質画分とに分離する方法を提供し、
その方法は純粋なタンパク質と不純物とが反対の電荷を
もつようなpHで粗製タンパク質をイオン交換樹脂に接触
させ、これにより前記画分の一方をイオン交換樹脂に選
択的に結合させることを特徴としている。イオン交換樹
脂は好ましくは強イオン交換樹脂であり、純粋なタンパ
ク質画分をイオン交換樹脂に結合させることが好まし
い。そして、イオン交換樹脂に結合された画分が好まし
くは溶離される。
分と不純なタンパク質画分とに分離する方法を提供し、
その方法は純粋なタンパク質と不純物とが反対の電荷を
もつようなpHで粗製タンパク質をイオン交換樹脂に接触
させ、これにより前記画分の一方をイオン交換樹脂に選
択的に結合させることを特徴としている。イオン交換樹
脂は好ましくは強イオン交換樹脂であり、純粋なタンパ
ク質画分をイオン交換樹脂に結合させることが好まし
い。そして、イオン交換樹脂に結合された画分が好まし
くは溶離される。
粗製タンパク質のpHは、好ましくは、前記画分間に増幅
された実効電荷数の差が存在するような、分離すべきタ
ンパク質画分の等電点の範囲内のpHに調節される。
された実効電荷数の差が存在するような、分離すべきタ
ンパク質画分の等電点の範囲内のpHに調節される。
また、本発明は、粗製タンパク質を比較的純粋なタンパ
ク質画分と不純なタンパク質画分とに分離するためのpH
を決定する方法を提供し、その方法は回収すべき純粋な
タンパク質と除去すべき不純物の等電点を測定し、純粋
なタンパク質と不純物とが反対の電荷をもちかつ前記電
荷数間に増幅された差が存在するような等電点の範囲内
のpHを決定することを特徴としている。タンパク質画分
の等電点は、好ましくはコンピュータシミュレーション
により、または等電点電気泳動ゲルを使用することによ
り決定される。
ク質画分と不純なタンパク質画分とに分離するためのpH
を決定する方法を提供し、その方法は回収すべき純粋な
タンパク質と除去すべき不純物の等電点を測定し、純粋
なタンパク質と不純物とが反対の電荷をもちかつ前記電
荷数間に増幅された差が存在するような等電点の範囲内
のpHを決定することを特徴としている。タンパク質画分
の等電点は、好ましくはコンピュータシミュレーション
により、または等電点電気泳動ゲルを使用することによ
り決定される。
前記方法はrDNAタンパク質、特に顆粒球・マクロファー
ジコロニー形成刺激因子（GM−CSF）の精製に有用であ
り、より詳細には、GM−CSFをΔ4GM−CSFから分離する
ことによるGM−CSFの精製に有用である。
ジコロニー形成刺激因子（GM−CSF）の精製に有用であ
り、より詳細には、GM−CSFをΔ4GM−CSFから分離する
ことによるGM−CSFの精製に有用である。
特に好適な方法では、タンパク質は順次以下の物質： A.好ましくは架橋デキストラン、セルロース、アガロー
ス、またはアクリル樹脂担体に結合された、第四アミン
樹脂のような陰イオン交換樹脂； B.架橋デキストラン、セルロース、アガロース、または
アクリル樹脂担体に結合されたスルホネート官能基をも
つ陽イオン交換樹脂；および C.好ましくは約5,000〜約100,000ダルトンのタンパク質
分画化範囲をもつ、ゲル濾過手段 と接触させることにより精製される。
ス、またはアクリル樹脂担体に結合された、第四アミン
樹脂のような陰イオン交換樹脂； B.架橋デキストラン、セルロース、アガロース、または
アクリル樹脂担体に結合されたスルホネート官能基をも
つ陽イオン交換樹脂；および C.好ましくは約5,000〜約100,000ダルトンのタンパク質
分画化範囲をもつ、ゲル濾過手段 と接触させることにより精製される。
詳細な説明 本発明は、粗製タンパク質、特に粗製rDNAタンパク質を
精製するための、高分離能のイオン交換クロマトグラフ
ィー分離技法に関する。この技法では、回収しようとす
る純粋なタンパク質と除去しようとする不純物の等電点
付近でクロマトグラフィーが実施され、好ましくは純粋
なタンパク質と不純物の電荷数間に増幅された（例え
ば、最大の）差が存在しかつこれらの分子が相反して荷
電される（分極される）ようなpHで実施される。この増
幅された実効電荷数の差（等電点付近でのみ起こる）
は、電荷がほとんど存在しない状態でイオン交換樹脂へ
の選択的結合をもたらす適当なイオン交換クロマトグラ
フィー条件を選択するために使用することができる。便
宜上、この技法は以後デルタ等電点（Delta Isoelectri
c Point:DIP）クロマトグラフィーと呼ぶことにする。
精製するための、高分離能のイオン交換クロマトグラフ
ィー分離技法に関する。この技法では、回収しようとす
る純粋なタンパク質と除去しようとする不純物の等電点
付近でクロマトグラフィーが実施され、好ましくは純粋
なタンパク質と不純物の電荷数間に増幅された（例え
ば、最大の）差が存在しかつこれらの分子が相反して荷
電される（分極される）ようなpHで実施される。この増
幅された実効電荷数の差（等電点付近でのみ起こる）
は、電荷がほとんど存在しない状態でイオン交換樹脂へ
の選択的結合をもたらす適当なイオン交換クロマトグラ
フィー条件を選択するために使用することができる。便
宜上、この技法は以後デルタ等電点（Delta Isoelectri
c Point:DIP）クロマトグラフィーと呼ぶことにする。
目的のrDNAタンパク質に密接に関連したrDNA不純物は、
ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、逆相高性
能液体クロマトグラフィー、金属キレート化アフィニテ
ィークロマトグラフィー、および他の常用されるクロマ
トグラフィーによって粗製タンパク質から分離すること
が困難である。通常、これらの密接に関連した不純物は
対象のタンパク質産物に近似した分子量および電荷分布
をもつタンパク質であり、一般に１個（またはそれ以
上）の電荷アミノ酸を欠いている。これらの不純物の例
は、タンパク質加水分解やクロマトグラフィー相互作用
を受けやすいペプチド末端にニックが、導入されること
により形成されたタンパク質加水分解産物である。この
種の不純物は通常のイオン交換クロマトグラフィーでは
分離できないと考えられる。
ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、逆相高性
能液体クロマトグラフィー、金属キレート化アフィニテ
ィークロマトグラフィー、および他の常用されるクロマ
トグラフィーによって粗製タンパク質から分離すること
が困難である。通常、これらの密接に関連した不純物は
対象のタンパク質産物に近似した分子量および電荷分布
をもつタンパク質であり、一般に１個（またはそれ以
上）の電荷アミノ酸を欠いている。これらの不純物の例
は、タンパク質加水分解やクロマトグラフィー相互作用
を受けやすいペプチド末端にニックが、導入されること
により形成されたタンパク質加水分解産物である。この
種の不純物は通常のイオン交換クロマトグラフィーでは
分離できないと考えられる。
DIPクロマトグラフィー技法は通常のイオン交換クロマ
トグラフィーといろいろな点で異っている。DIPは分離
しようとするタンパク質が極めて小さい実効電荷をもつ
ようなpHで行われる。これは目的タンパク質およびそれ
に密接に関連した不純物の等電点（pI）からわずかな分
数のpH単位だけ離れたpHでイオン交換樹脂に負荷するこ
とにより達成される。このことは対象のタンパク質が強
い電荷をもつpHで実施される通常のイオン交換クロマト
グラフィーと対照的であり、通常のイオン交換クロマト
グラフィーでは、DIPクロマトグラフィーより大きく、p
Iから約１−２の整数のpH単位離れたpHで負荷が行われ
る。
トグラフィーといろいろな点で異っている。DIPは分離
しようとするタンパク質が極めて小さい実効電荷をもつ
ようなpHで行われる。これは目的タンパク質およびそれ
に密接に関連した不純物の等電点（pI）からわずかな分
数のpH単位だけ離れたpHでイオン交換樹脂に負荷するこ
とにより達成される。このことは対象のタンパク質が強
い電荷をもつpHで実施される通常のイオン交換クロマト
グラフィーと対照的であり、通常のイオン交換クロマト
グラフィーでは、DIPクロマトグラフィーより大きく、p
Iから約１−２の整数のpH単位離れたpHで負荷が行われ
る。
DIPを行うためのpHは、荷電密度対タンパク質および関
連不純物のpHのコンピュータシミュレーションにより、
あるいは等電点電気泳動ゲルの使用のような分析技術に
より予測される。通常のイオン交換クロマトグラフィー
では、負荷pHが目的タンパク質の全体の実効電荷を求め
ることにより決定され、そして負荷条件は最適化される
にしても経験的に最適化される。溶離条件を決定するた
めには、退屈な試行錯誤の実験作業を必要とする。
連不純物のpHのコンピュータシミュレーションにより、
あるいは等電点電気泳動ゲルの使用のような分析技術に
より予測される。通常のイオン交換クロマトグラフィー
では、負荷pHが目的タンパク質の全体の実効電荷を求め
ることにより決定され、そして負荷条件は最適化される
にしても経験的に最適化される。溶離条件を決定するた
めには、退屈な試行錯誤の実験作業を必要とする。
目的タンパク質に対して不純物を分極する試みが全くな
されない通常のイオン交換クロマトグラフィーと違っ
て、DIPクロマトグラフィーでは、負荷pHが密接に関連
した不純物のpIと目的タンパク質のpIとの間にあるよう
に選ばれ、従って、目的タンパク質は分極された不純物
と反対の電荷を獲得する。
されない通常のイオン交換クロマトグラフィーと違っ
て、DIPクロマトグラフィーでは、負荷pHが密接に関連
した不純物のpIと目的タンパク質のpIとの間にあるよう
に選ばれ、従って、目的タンパク質は分極された不純物
と反対の電荷を獲得する。
DIPクロマトグラフィーにおいては、負荷の間のタンパ
ク質−タンパク質相互作用を低減させるために、高イオ
ン強度の環境が課せられ、そして強イオン交換体が用い
られる。通常のイオン交換技法では、最大の分離能を得
るために、より低いイオン強度の負荷条件と共に弱イオ
ン交換樹脂を使用することが適している。DIPクロマト
グラフィーにおいて、負荷の間のタンパク質−タンパク
質相互作用を低く抑えると、高度に選択的な結合並びに
極めて分離が負荷の間に得られ、そして通常の勾配溶離
の間に更なる分離が得られる。通常のイオン交換クロマ
トグラフィーでは、負荷の間に非選択的な結合が起こ
り、それ故に負荷中には大まかな分離が達成されるにす
ぎない；分離はもっぱら、固体マトリックスに高度に局
所的に結合されたタンパク質の密集状態から生じる強い
タンパク質−タンパク質相互作用のもとで、溶離の間に
得られる。
ク質−タンパク質相互作用を低減させるために、高イオ
ン強度の環境が課せられ、そして強イオン交換体が用い
られる。通常のイオン交換技法では、最大の分離能を得
るために、より低いイオン強度の負荷条件と共に弱イオ
ン交換樹脂を使用することが適している。DIPクロマト
グラフィーにおいて、負荷の間のタンパク質−タンパク
質相互作用を低く抑えると、高度に選択的な結合並びに
極めて分離が負荷の間に得られ、そして通常の勾配溶離
の間に更なる分離が得られる。通常のイオン交換クロマ
トグラフィーでは、負荷の間に非選択的な結合が起こ
り、それ故に負荷中には大まかな分離が達成されるにす
ぎない；分離はもっぱら、固体マトリックスに高度に局
所的に結合されたタンパク質の密集状態から生じる強い
タンパク質−タンパク質相互作用のもとで、溶離の間に
得られる。
荷電密度対pHのコンピュータシミュレーションは、市販
のソフトウェアおよび適当なコンピュータ（例．大型メ
インフレームコンピュータ、マイクロコンピュータ、パ
ーソナルコンピュータ）を使って行われる。例えば、VA
Xコンピュータ（Digital Corp.）は“ポリペプチド分析
システム”（Intellegentics,Inc.,1981,1982,1983,198
4および1986年に版権を得る）のようなソフトウェアパ
ッケージと共に使用することができる。このソフトウェ
アを使うことにより、一次アミノ酸配列がインプットさ
れ、異なるpHでの荷電密度分布を得ることができる。別
の方法として、当分野でよく知られた方法による等電点
電気泳動（IEF）ゲルを使って、pIを測定することがで
きる。
のソフトウェアおよび適当なコンピュータ（例．大型メ
インフレームコンピュータ、マイクロコンピュータ、パ
ーソナルコンピュータ）を使って行われる。例えば、VA
Xコンピュータ（Digital Corp.）は“ポリペプチド分析
システム”（Intellegentics,Inc.,1981,1982,1983,198
4および1986年に版権を得る）のようなソフトウェアパ
ッケージと共に使用することができる。このソフトウェ
アを使うことにより、一次アミノ酸配列がインプットさ
れ、異なるpHでの荷電密度分布を得ることができる。別
の方法として、当分野でよく知られた方法による等電点
電気泳動（IEF）ゲルを使って、pIを測定することがで
きる。
DIPクロマトグラフィーは、タンパク質が変性を受けな
いpH範囲に等電点を有するタンパク質、特に組換えタン
パク質に適用される。多くのタンパク質の等電点は知ら
れている。例えば、J.Chrom.,220（1981）,p.115−194
（Chromatography Reviews）中のRighettiらによる“タ
ンパク質の等電点および分子量−新しい表”に掲載され
る広範な記録を参照されたい。DIPクロマトグラフィー
に適する等電点アロトロピズムを示す治療上重要なタン
パク質の例は、GM−CSF、白血球およびリンパ芽球イン
ターフェロン、成長ホルモン、スーパーオキシドジスム
ターゼ、およびエリトロポエチンである。その他のタン
パク質にはアンチトロンビンIII、ラクトーゲン、プラ
スミノーゲン、プロラクチン、ウロキナーゼ、およびビ
タミンB12−結合タンパク質が含まれる。
いpH範囲に等電点を有するタンパク質、特に組換えタン
パク質に適用される。多くのタンパク質の等電点は知ら
れている。例えば、J.Chrom.,220（1981）,p.115−194
（Chromatography Reviews）中のRighettiらによる“タ
ンパク質の等電点および分子量−新しい表”に掲載され
る広範な記録を参照されたい。DIPクロマトグラフィー
に適する等電点アロトロピズムを示す治療上重要なタン
パク質の例は、GM−CSF、白血球およびリンパ芽球イン
ターフェロン、成長ホルモン、スーパーオキシドジスム
ターゼ、およびエリトロポエチンである。その他のタン
パク質にはアンチトロンビンIII、ラクトーゲン、プラ
スミノーゲン、プロラクチン、ウロキナーゼ、およびビ
タミンB12−結合タンパク質が含まれる。
DIPクロマトグラフィーの適用例は以下のヒト組換えGM
−CSFの精製方法である。GM−CSF精製の特に困難な面
は、デルタ４（Δ４）として知られる、４個のＮ末端ア
ミノ酸を欠くGM−CSFの分解産物の除去である。GM−CSF
は一般に第四アミノエチルカラムによる陰イオン交換、
ゲル濾過および逆相クロマトグラフィーの組み合わせに
より精製されるが、この方法はΔ４不純物を除去するの
に効果的でない。
−CSFの精製方法である。GM−CSF精製の特に困難な面
は、デルタ４（Δ４）として知られる、４個のＮ末端ア
ミノ酸を欠くGM−CSFの分解産物の除去である。GM−CSF
は一般に第四アミノエチルカラムによる陰イオン交換、
ゲル濾過および逆相クロマトグラフィーの組み合わせに
より精製されるが、この方法はΔ４不純物を除去するの
に効果的でない。
しかしながら、DIPクロマトグラフィーはΔ４不純物を
除くことに成功した。最初に、完全なGM−CSFタンパク
質のコンピュータシミュレーションが、Δ４不純物のコ
ンピュータシミュレーションと比較され、GM−CSFのpI
が5.24であり、Δ４不純物のpIが4.98であると判明し
た。次に、この範囲内の使用pHを決定しなければならな
かった。この使用pHにおいて、（ａ）GM−CSFはΔ４不
純物と反対の電荷を獲得し、かつ（ｂ）これらの電荷数
の差の相対的な大きさが分離を可能にする程度に増幅さ
れる。完全なGM−CSFとΔ不純物との間には、１電荷／
分子（1ch/mol）のわずかな電荷数差が広いpH範囲にわ
たって存在する（すなわち、pH0.5では、それぞれの電
荷は＋16および＋15であり、pH11.5では、それぞれの電
荷は−11.1および−12である）。しかしながら、コンピ
ュータ模擬実験により予測されたように、pH5付近にお
いて、完全なGM−CSFとΔ４不純物との電荷数の差は増
幅され（すなわち、相対的電荷数差が増加され）かつ分
子が分極される：すなわち、pH5において、GM−CSFは＋
0.9ch/molを有するが、Δ４不純物はたったの−0.1ch/m
olをもつにすぎない。こうして、DIPに必要な２つの条
件（荷電分極および増幅）が満たされる。
除くことに成功した。最初に、完全なGM−CSFタンパク
質のコンピュータシミュレーションが、Δ４不純物のコ
ンピュータシミュレーションと比較され、GM−CSFのpI
が5.24であり、Δ４不純物のpIが4.98であると判明し
た。次に、この範囲内の使用pHを決定しなければならな
かった。この使用pHにおいて、（ａ）GM−CSFはΔ４不
純物と反対の電荷を獲得し、かつ（ｂ）これらの電荷数
の差の相対的な大きさが分離を可能にする程度に増幅さ
れる。完全なGM−CSFとΔ不純物との間には、１電荷／
分子（1ch/mol）のわずかな電荷数差が広いpH範囲にわ
たって存在する（すなわち、pH0.5では、それぞれの電
荷は＋16および＋15であり、pH11.5では、それぞれの電
荷は−11.1および−12である）。しかしながら、コンピ
ュータ模擬実験により予測されたように、pH5付近にお
いて、完全なGM−CSFとΔ４不純物との電荷数の差は増
幅され（すなわち、相対的電荷数差が増加され）かつ分
子が分極される：すなわち、pH5において、GM−CSFは＋
0.9ch/molを有するが、Δ４不純物はたったの−0.1ch/m
olをもつにすぎない。こうして、DIPに必要な２つの条
件（荷電分極および増幅）が満たされる。
残存する大腸菌宿主細胞の低pI不純物およびタンパク質
加水分解不安定化因子からの完全なGM−CSFの分離をさ
らに高めるために、負荷の間に高イオン強度が用いられ
た。これは分子間の静電相互作用を少なくする。それ故
に、これらの高イオン強度条件下で、pH5にて強陽イオ
ン交換体、例えば架橋デキストラン、セルロース、アガ
ロース、またはアクリル樹脂担体にスルホネート官能基
が結合されているカラム（例.S−Sepharose,Pharmacia,
Inc.製,Piscataway,NJ）を使用することが好適である。
加水分解不安定化因子からの完全なGM−CSFの分離をさ
らに高めるために、負荷の間に高イオン強度が用いられ
た。これは分子間の静電相互作用を少なくする。それ故
に、これらの高イオン強度条件下で、pH5にて強陽イオ
ン交換体、例えば架橋デキストラン、セルロース、アガ
ロース、またはアクリル樹脂担体にスルホネート官能基
が結合されているカラム（例.S−Sepharose,Pharmacia,
Inc.製,Piscataway,NJ）を使用することが好適である。
このような腸イオン交換樹脂カラムを使用すると、望ま
しくないΔ４不純物、種々の低pI不純物、20K大腸菌不
純物（他の方法で以前に除去されなかった）、およびタ
ンパク質加水分解因子の一段階除去が達成され、これに
より最終産物が安定化されることが分かった。腸イオン
交換クロマトグラフィーを行うことにより、GM−CSFの
純度は約50％から約90％に上昇し、そのときの収率は70
−80％である。これに続いてゲル濾過段階を行う場合に
は、GM−CSFの純度は約99％に高められる。
しくないΔ４不純物、種々の低pI不純物、20K大腸菌不
純物（他の方法で以前に除去されなかった）、およびタ
ンパク質加水分解因子の一段階除去が達成され、これに
より最終産物が安定化されることが分かった。腸イオン
交換クロマトグラフィーを行うことにより、GM−CSFの
純度は約50％から約90％に上昇し、そのときの収率は70
−80％である。これに続いてゲル濾過段階を行う場合に
は、GM−CSFの純度は約99％に高められる。
以下はGM−CSFの分離・精製方法の一般的な説明であ
る。陰イオン交換クロマトグラフィー（好ましくは、第
四アミノエチルカラムを使用）はGM−CSFの通常の精製
段階であり、宿主細胞死滅後の上清から高pI不純物を除
くために行われる。やはり慣用されるゲル濾過段階は高
および低分子量不純物を除くために行われる。以下の記
載は精製されたタンパク質画分を強イオン交換樹脂に結
合させる方法に関するものであるが、本発明のいくつか
の実施態様では、不純なタンパク質画分を強イオン交換
樹脂に結合させることもできるだろう。同様に、以下の
記載および実施例は粗製タンパク質をイオン交換樹脂カ
ラムを通して連続通過させることに関するが、バッチ接
触のような他の接触方法も使用できるだろう。
る。陰イオン交換クロマトグラフィー（好ましくは、第
四アミノエチルカラムを使用）はGM−CSFの通常の精製
段階であり、宿主細胞死滅後の上清から高pI不純物を除
くために行われる。やはり慣用されるゲル濾過段階は高
および低分子量不純物を除くために行われる。以下の記
載は精製されたタンパク質画分を強イオン交換樹脂に結
合させる方法に関するものであるが、本発明のいくつか
の実施態様では、不純なタンパク質画分を強イオン交換
樹脂に結合させることもできるだろう。同様に、以下の
記載および実施例は粗製タンパク質をイオン交換樹脂カ
ラムを通して連続通過させることに関するが、バッチ接
触のような他の接触方法も使用できるだろう。
一般的解説：操作は特に指定しない限り２−15℃で行
う。タンパク質濃度はクーマシーブルー結合検定により
各段階で測定する。クロマトグラフィーで期待された精
製度が得られない場合は、溶出画分を同一カラムで再度
クロマトグラフィーにかけることができ、また別の方法
として、前段階または先の一連の段階を通して再循環さ
せることもできる。この再処理は１つのバッチまたは複
数のバッチのプールからの溶出された副画分に対して実
施してもよい。どの段階においても、濃縮は硫安沈澱、
等電点沈澱および／または限外濾過により行われる。緩
衝溶液は脱イオン水（DI）、逆浸透水（RO）、または注
射用の水（WFI）を用いて調製される。
う。タンパク質濃度はクーマシーブルー結合検定により
各段階で測定する。クロマトグラフィーで期待された精
製度が得られない場合は、溶出画分を同一カラムで再度
クロマトグラフィーにかけることができ、また別の方法
として、前段階または先の一連の段階を通して再循環さ
せることもできる。この再処理は１つのバッチまたは複
数のバッチのプールからの溶出された副画分に対して実
施してもよい。どの段階においても、濃縮は硫安沈澱、
等電点沈澱および／または限外濾過により行われる。緩
衝溶液は脱イオン水（DI）、逆浸透水（RO）、または注
射用の水（WFI）を用いて調製される。
段階I:第四アミンカラムによるクロマトグラフィー GM−CSFの粗製抽出物のpHは、1Mビス−トリス（ビス
［２−ヒドロキシエチル］イミノ−トリス−［ヒドロキ
シメチル］メタン）のような緩衝液および／または4N H
Clで５−7.5に調節する。次に、この溶液を遠心および
／または濾過により澄明化する。水で希釈するか、また
は4N NaClのような塩溶液を添加して、この溶液の導電
率を10ミリジーメンス／センチメートル（mS/cm）以下
に調整する。第四アミンカラム（すなわち、架橋デキス
トラン、セルロース、アガロース、またはアクリル樹脂
担体に第四アミン官能基が結合しているカラム、例えば
Pharmacia,Inc.製のＱ−Sepharose）に50gタンパク質／
ゲルを越えない負荷量でバッチを装填する。溶離は20
mMビス−トリスのような緩衝液中の０−0.4M NaClまた
は他の適当な塩の勾配を用いて行う。適当な画分は合わ
せて後続の処理に供する。
［２−ヒドロキシエチル］イミノ−トリス−［ヒドロキ
シメチル］メタン）のような緩衝液および／または4N H
Clで５−7.5に調節する。次に、この溶液を遠心および
／または濾過により澄明化する。水で希釈するか、また
は4N NaClのような塩溶液を添加して、この溶液の導電
率を10ミリジーメンス／センチメートル（mS/cm）以下
に調整する。第四アミンカラム（すなわち、架橋デキス
トラン、セルロース、アガロース、またはアクリル樹脂
担体に第四アミン官能基が結合しているカラム、例えば
Pharmacia,Inc.製のＱ−Sepharose）に50gタンパク質／
ゲルを越えない負荷量でバッチを装填する。溶離は20
mMビス−トリスのような緩衝液中の０−0.4M NaClまた
は他の適当な塩の勾配を用いて行う。適当な画分は合わ
せて後続の処理に供する。
段階II:スルホネートカラムによるクロマトグラフィー 合わせた画分は酸（例.1M酢酸、4N HCl）または塩基
（例.6N NaOH）を用いて、DIPクロマトグラフィーで分
離されるタンパク質画分の等電点の範囲内であるpH5に
調節する。NaOHでpH5に調節した0.01M酢酸のような緩衝
液を加えて、導電率を13mS/cmに調整する。この溶液は
0.2ミクロンフィルターを通して濾過し、スルホネート
カラム（すなわち、架橋デキストラン、セルロース、ア
ガロース、またはアクリル樹脂担体にスルホネート官能
基が結合しているカラム、例えばＳ−Sepharose）に20g
タンパク質／カラム材料を越えない負荷量で装填す
る。溶離は緩衝液（例.20mM酢酸、0.13M Nacl、pH5.0緩
衝液）中に0.5Mまでの濃度勾配の塩（例.NaCl）を含む
溶液を用いて行う。適当な画分を合わせて後続の処理に
供する。このクロマトグラフィー段階は通常繰り返して
行う。
（例.6N NaOH）を用いて、DIPクロマトグラフィーで分
離されるタンパク質画分の等電点の範囲内であるpH5に
調節する。NaOHでpH5に調節した0.01M酢酸のような緩衝
液を加えて、導電率を13mS/cmに調整する。この溶液は
0.2ミクロンフィルターを通して濾過し、スルホネート
カラム（すなわち、架橋デキストラン、セルロース、ア
ガロース、またはアクリル樹脂担体にスルホネート官能
基が結合しているカラム、例えばＳ−Sepharose）に20g
タンパク質／カラム材料を越えない負荷量で装填す
る。溶離は緩衝液（例.20mM酢酸、0.13M Nacl、pH5.0緩
衝液）中に0.5Mまでの濃度勾配の塩（例.NaCl）を含む
溶液を用いて行う。適当な画分を合わせて後続の処理に
供する。このクロマトグラフィー段階は通常繰り返して
行う。
段階III:硫安沈澱 合わせたＳ−Sepharose画分に硫安を加えて50％〜60％
飽和の最終濃度とする。沈澱物を遠心により集める。沈
澱物は冷蔵保存することができる。
飽和の最終濃度とする。沈澱物を遠心により集める。沈
澱物は冷蔵保存することができる。
段階IV:ゲル濾過クロマトグラフィー 硫安沈澱物を0.35Mまでの塩（例．塩化ナトリウム）を
含む緩衝液（例.10mMリン酸ナトリウム、50mMクエン
酸、pH6緩衝液）に溶解する。この溶液を遠心し、0.2ミ
クロン範囲のフィルターを通して濾過し、その後同一緩
衝液で予め平衡化しておいた、約5,000〜約100,000ダル
トンのタンパウ質分画化範囲をもつゲル濾過カラム
（例.Sephacryl S−200HR,Pharmacia,Inc.製）に装填す
る。負荷量は3.5gタンパク質／ゲルを越えない。この
カラムを同一緩衝液で溶離し、適当な画分を合わせる。
画分は10mMリン酸塩、2mMクエン酸、pH7.2緩衝液のよう
な緩衝液に対して透析する。これとは別に、段階IVの全
体をこの後者の緩衝液により実施することができる。
含む緩衝液（例.10mMリン酸ナトリウム、50mMクエン
酸、pH6緩衝液）に溶解する。この溶液を遠心し、0.2ミ
クロン範囲のフィルターを通して濾過し、その後同一緩
衝液で予め平衡化しておいた、約5,000〜約100,000ダル
トンのタンパウ質分画化範囲をもつゲル濾過カラム
（例.Sephacryl S−200HR,Pharmacia,Inc.製）に装填す
る。負荷量は3.5gタンパク質／ゲルを越えない。この
カラムを同一緩衝液で溶離し、適当な画分を合わせる。
画分は10mMリン酸塩、2mMクエン酸、pH7.2緩衝液のよう
な緩衝液に対して透析する。これとは別に、段階IVの全
体をこの後者の緩衝液により実施することができる。
段階V:精製されたバルクGM−CSF 合わせた画分は細孔寸法が0.2ミクロンまたはそれ以下
のウィルターを通して濾過し、−20℃以下で保存する。
のウィルターを通して濾過し、−20℃以下で保存する。
代表的なIEFゲル電気泳動法は以下の文献に記載されて
いる： 1.電気泳動技術,Academic Press,（1983） Ed.:G.F.Simpson ＆ M.Whittaker “等電点電気泳動の最近の動向"J.S.Fawcett,p.57 2.通電点電気泳動：理論、方法論および応用， P.G.Righetti,Elsevier Biomedical Pres,（1983）p.14
8 3.pH4−６の範囲内での等電点電気泳動分離の適用， P.Gill,Electrophoresis ６:282（1985） 4.ポリアクリルアミドゲルによる超薄層等電点電気泳動
におけるタンパク質の迅速染色， M.D.Frey,Electrophoresis ３:27−32（1982） 5.セキレイの肝臓試料における酵素の超薄層等電点電気
泳動， M.Germeiner,Electrophoresis ３:146（1982） 以下の実施例はDIP技法に基づいたGM−CSFの精製方法を
例示するものである。
いる： 1.電気泳動技術,Academic Press,（1983） Ed.:G.F.Simpson ＆ M.Whittaker “等電点電気泳動の最近の動向"J.S.Fawcett,p.57 2.通電点電気泳動：理論、方法論および応用， P.G.Righetti,Elsevier Biomedical Pres,（1983）p.14
8 3.pH4−６の範囲内での等電点電気泳動分離の適用， P.Gill,Electrophoresis ６:282（1985） 4.ポリアクリルアミドゲルによる超薄層等電点電気泳動
におけるタンパク質の迅速染色， M.D.Frey,Electrophoresis ３:27−32（1982） 5.セキレイの肝臓試料における酵素の超薄層等電点電気
泳動， M.Germeiner,Electrophoresis ３:146（1982） 以下の実施例はDIP技法に基づいたGM−CSFの精製方法を
例示するものである。
実施例１ GM−CSFの精製 段階1:第四アミンカラムクロマトグラフィー 180の粗製GM−CSF抽出物のpHを1Mビス−トリス緩衝液
（pH6.0）3.6および4N HCl 2.0でpH6.0に調節し
た。この溶液はSharples遠心機を使って0.75／分の供
給量で遠心することにより澄明化した。上清を冷脱イオ
ン水で約1.55倍に希釈して最終導電率を5.5mS/cmとし
た。12のＱ−Sepharoseカラムを10倍カラム容量の20m
Mビス−トリス緩衝液（pH6.0）で平衡化し、43.6の抽
出物を20mgタンパク質/ml樹脂の負荷量でこのカラムに
装填した。カラム（直径25cm）は120の平衡緩衝液を
用いて250ml/分の流量で洗った。0.03M NaClを含む20mM
ビス−トリス緩衝液（pH6.0）78と0.32M NaClを含む2
0mMビス−トリス緩衝液（pH6.0）78との間に線状勾配
を確立した。ゲル電気泳動（SDS−PAGE）に基づいて画
分（各々1.2）を合わせ、プールしたタンパク質（4.9
）を段階２でクロマトグラフィーにかけた。
（pH6.0）3.6および4N HCl 2.0でpH6.0に調節し
た。この溶液はSharples遠心機を使って0.75／分の供
給量で遠心することにより澄明化した。上清を冷脱イオ
ン水で約1.55倍に希釈して最終導電率を5.5mS/cmとし
た。12のＱ−Sepharoseカラムを10倍カラム容量の20m
Mビス−トリス緩衝液（pH6.0）で平衡化し、43.6の抽
出物を20mgタンパク質/ml樹脂の負荷量でこのカラムに
装填した。カラム（直径25cm）は120の平衡緩衝液を
用いて250ml/分の流量で洗った。0.03M NaClを含む20mM
ビス−トリス緩衝液（pH6.0）78と0.32M NaClを含む2
0mMビス−トリス緩衝液（pH6.0）78との間に線状勾配
を確立した。ゲル電気泳動（SDS−PAGE）に基づいて画
分（各々1.2）を合わせ、プールしたタンパク質（4.9
）を段階２でクロマトグラフィーにかけた。
段階2:スルホネートカラムクロマトグラフィー 段階１からの合わせた画分（4.9）は1M酢酸（pH5.0）
49mlでpH5に調節し、NaOHでpH5に調節した0.01M酢酸２
を用いて導電率を15mS/cmに調整した。この溶液は0.2
ミクロンフィルターを通して濾過し、その後0.13M NaCl
を含む20mM酢酸（pH5）で予め平衡化しておいた0.8の
Ｓ−Sepharoseカラムに4.7mg/mlカラム材料の負荷量で
装填した。このカラムは2.4の平衡緩衝液で洗い、そ
の後0.13M NaClを含む20mM酢酸（pH5）5.6と0.5M NaC
lを含む20mM酢酸（pH5）5.6との間に確立した線状勾
配で溶離した。ゲル電気泳動に基づいて画分を合わせ
た。このクロマトグラフィー段階は繰り返して行った。
49mlでpH5に調節し、NaOHでpH5に調節した0.01M酢酸２
を用いて導電率を15mS/cmに調整した。この溶液は0.2
ミクロンフィルターを通して濾過し、その後0.13M NaCl
を含む20mM酢酸（pH5）で予め平衡化しておいた0.8の
Ｓ−Sepharoseカラムに4.7mg/mlカラム材料の負荷量で
装填した。このカラムは2.4の平衡緩衝液で洗い、そ
の後0.13M NaClを含む20mM酢酸（pH5）5.6と0.5M NaC
lを含む20mM酢酸（pH5）5.6との間に確立した線状勾
配で溶離した。ゲル電気泳動に基づいて画分を合わせ
た。このクロマトグラフィー段階は繰り返して行った。
段階3:硫安沈澱 段階２からの合わせた画分（240）に硫安を加えて351
g/（55％飽和）の濃度とした。この溶液は混合せずに
４℃で２時間放置し、その後4500rpm,4℃で30分間遠心
して沈澱物を得た。
g/（55％飽和）の濃度とした。この溶液は混合せずに
４℃で２時間放置し、その後4500rpm,4℃で30分間遠心
して沈澱物を得た。
段階4:ゲル濾過クロマトグラフィー 硫安沈澱物を18mMリン酸ナトリウム、2mMクエン酸、pH
7.2緩衝液36mlに溶解した。この溶液を4500rpmで30分間
遠心し、上清を0.2ミクロンフィルターを通して濾過し
た。瀘液はリン酸塩−クエン酸pH7.2緩衝液で予め平衡
化しておいた1.8のSephacryl S−200HRカラムに0.21m
g/mlゲルの負荷量で装填した。このカラムを同じpH7.2
緩衝液1.9で溶離した。タンパク質検定に基づいて画
分を合わせた。
7.2緩衝液36mlに溶解した。この溶液を4500rpmで30分間
遠心し、上清を0.2ミクロンフィルターを通して濾過し
た。瀘液はリン酸塩−クエン酸pH7.2緩衝液で予め平衡
化しておいた1.8のSephacryl S−200HRカラムに0.21m
g/mlゲルの負荷量で装填した。このカラムを同じpH7.2
緩衝液1.9で溶離した。タンパク質検定に基づいて画
分を合わせた。
段階5:濾過 段階４からの合わせた画分は0.2ミクロンフィルターを
通して濾過し、−20℃で保存した。
通して濾過し、−20℃で保存した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 タン，ジョン・チュウ‐タイ アメリカ合衆国ニュージャージー州07039, リビングストン，キャメロット・ドライブ 19 (56)参考文献 特開 昭61−78799（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−57200（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−120058（ＪＰ，Ａ) 日本生化学会編「生化学講座１ タンパ ク質の化学Ｉ−分離・精製−」東京化学同 人（1976年３月22日発行）111〜133頁
Claims (5)
- 【請求項１】粗製タンパク質混合物を所望のタンパク質
を含む第１タンパク質画分と、所望のタンパク質と構造
的に密接に関連する１または２以上の望ましくないタン
パク質を含む第２タンパク質画分とに分離する方法であ
って、 （ａ） 粗製タンパク質混合物中のタンパク質の等電点
を決定し； （ｂ） 粗製タンパク質混合物のpHを所望のタンパク質
の等電点と望ましくないタンパク質の等電点との間の値
に調整し；そして （ｃ） 前記pHにおいて粗製タンパク質混合物を強イオ
ン交換樹脂と接触させる； の各工程を含み、これにより第１タンパク質画分中のタ
ンパク質と第２タンパク質画分中のタンパク質が反対に
荷電して、前記タンパク質画分のうちの一方のみがイオ
ン交換樹脂に結合することを特徴とする方法。 - 【請求項２】所望のタンパク質が組換えタンパク質であ
る、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】所望のタンパク質がGM−CSFである、請求
項２記載の方法。 - 【請求項４】所望のタンパク質を、粗製タンパク質混合
物中の、所望のタンパク質と構造的に密接に関連する不
純物から分離する方法であって、 （ａ） 所望のタンパク質および不純物の等電点をコン
ピュータシミュレーションまたは等電点電気泳動ゲルに
より決定し； （ｂ） 粗製タンパク質混合物のpHを所望のタンパク質
の等電点と不純物の等電点との間に調整し；そして （ｃ） 前記pHにおいて粗製タンパク質混合物を強イオ
ン交換樹脂と接触させる； の各工程を含み、これにより所望のタンパク質と不純物
が反対に荷電して、一方のみがイオン交換樹脂に結合す
ることを特徴とする方法。 - 【請求項５】所望のタンパク質がGM−CSFであり、不純
物がΔ４不純物である、請求項４記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11188687A | 1987-10-23 | 1987-10-23 | |
| US111,886 | 1987-10-23 | ||
| PCT/US1988/003589 WO1989003840A1 (en) | 1987-10-23 | 1988-10-19 | Method of purifying protein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03500649A JPH03500649A (ja) | 1991-02-14 |
| JPH0788395B2 true JPH0788395B2 (ja) | 1995-09-27 |
Family
ID=22340970
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63508950A Expired - Lifetime JPH0788395B2 (ja) | 1987-10-23 | 1988-10-19 | タンパク質の精製方法 |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0391934A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0788395B2 (ja) |
| KR (1) | KR930008447B1 (ja) |
| CN (1) | CN1031943C (ja) |
| AT (1) | ATE121418T1 (ja) |
| AU (1) | AU626008B2 (ja) |
| DE (1) | DE3853610T3 (ja) |
| DK (1) | DK99690A (ja) |
| ES (1) | ES2070855T5 (ja) |
| FI (1) | FI103974B1 (ja) |
| HU (1) | HU204537B (ja) |
| IE (1) | IE72219B1 (ja) |
| IL (1) | IL88118A (ja) |
| MY (1) | MY108512A (ja) |
| NO (1) | NO303451B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ226651A (ja) |
| OA (1) | OA09787A (ja) |
| PT (1) | PT88813B (ja) |
| TN (1) | TNSN88111A1 (ja) |
| WO (1) | WO1989003840A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA887862B (ja) |
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| US5110913A (en) * | 1990-05-25 | 1992-05-05 | Miles Inc. | Antibody purification method |
| US5463029A (en) * | 1992-11-23 | 1995-10-31 | Immunex Corporation | Purification of fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
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| US7304150B1 (en) | 1998-10-23 | 2007-12-04 | Amgen Inc. | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia |
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| SE529259C2 (sv) * | 2005-08-31 | 2007-06-12 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | Tillverkning av kromarografimatriser, en kromarografimatris, en vätskekromatografikolonn, prcess för att isolera målföreningar och användning av en kromarografimatris för vätskekromatografi |
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| WO2013075740A1 (en) * | 2011-11-23 | 2013-05-30 | Sanofi | Antibody purification method |
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| DK3301115T3 (da) | 2013-05-06 | 2022-01-31 | Sanofi Sa | Kontinuerlig flertrinsfremgangsmåde til oprensning af antistoffer |
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Non-Patent Citations (1)
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| 日本生化学会編「生化学講座１タンパク質の化学Ｉ−分離・精製−」東京化学同人（１９７６年３月２２日発行）１１１〜１３３頁 |
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