DE3853610T2

DE3853610T2 - Verfahren zur Proteinreinigung.

Info

Publication number: DE3853610T2
Application number: DE3853610T
Authority: DE
Inventors: David Naveh; John Chu-Tay Tang
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1987-10-23
Filing date: 1988-10-19
Publication date: 1995-08-31
Anticipated expiration: 2008-10-20
Also published as: AU2624788A; JPH0788395B2; IL88118A; ES2070855T3; AU626008B2; DK99690A; MY108512A; OA09787A; IE72219B1; DE3853610T3; FI902017A0; DE3853610D1; DK99690D0; FI103974B; NZ226651A; KR890701618A; FI103974B1; TNSN88111A1; EP0313343B2; PT88813B

Description

HINTERGRUND

Die Ionenaustausch-Chromatographie ist eine konventionelle chromatographische Arbeitstechnik, die ihrer Natur nach schonend arbeitet und mit geringen Kosten verbunden ist, hohe Kapazität besitzt und ohne weiteres auch im Maßstab veränderbar ist. Bis heute ist sie jedoch keine brauchbare Technik zur Abtrennung nahe verwandter Verunreinigungen auf Proteinen, insbesondere rDNA-Proteinen.
Ein Beispiel für ein solches rDNA-Protein ist rekombinantes Human-GM-CSF. Komplementäre DNAs (cDNAs) für GM-CSF, Faktoren, die das Wachstum und die Entwicklung von Granulocyten und Makrophagen im Blut unterstützen, sind kürzlich von einer Anzahl Laboratorien kloniert und sequenziert worden. Darüber hinaus ist nicht-rekombinantes GM-CSF aus Kultur-Überständen der Mo-Zellinie (beschrieben in US-Patent 4 438 032) gereinigt worden, und die ersten 16 Aminosäuren vom N-Terminus sind sequenziert worden {Gasson et al., Science, Band 226, Seiten 1339-1342 (1984)}. Unter den Human-GM-CSFs sind Nucleotid- und Aminosäure-Sequenz-Heterogenität beobachtet worden. Beispielsweise wurden auf der Ebene der Aminosäuren sowohl Threonin als auch Isoleucin in der Position 100, relativ zu dem N-terminalen Alanin, beobachtet, was nahelegt, daß mehrere allele Formen oder Polymorphe von GM-CSF innerhalb von Human-Populationen existieren können.
Eine Vielfalt von Methoden steht nunmehr für eine erneute Herstellung und Klonierung von cDNAs, wie cDNAs für GM-CSF, und für die Errichtung von cDNA-Bibliotheken zur Verfügung. Beispielsweise wird die gesamte mRNA aus Zellen (z.B. einer Quelle nicht-transformierter Human-T-Zellen) extrahiert, die Polypeptide produzieren, die die gewünschte Aktivität zeigen. Die doppelsträngigen cDNAs können aus dieser gesamten mRNA durch Verwendung Primer-initiierter reverser Transkription aufgebaut werden, wobei zunächst das Komplement jeder mRNA-Sequenz erzeugt und dann für die Synthese des zweiten Strangs sensibilisiert wird. Nachfolgend können die cDNAs dadurch kloniert werden, daß sie mit geeigneten Plasmid- oder Bakteriophagen- Vektoren über komplementäre homopolymere Schwänze oder mit Linker-Segmenten, die geeignete Restriktionszentren enthalten, geschaffene klebrige Enden vereinigt werden und dann ein geeigneter Wirt transformiert wird. Ein breiter Bereich von Expressionssystemen (d.h. Wirt-Expressionsvektor-Kombinationen) kann verwendet werden, um die mittels des Verfahrens dieser Erfindung gereinigten proteine zu erzeugen. Zu möglichen Typen der Wirtszellen zählen, jedoch ohne Beschränkung auf die genannten, Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Säuger-Zellen und dergleichen.
Verschiedene Methoden zum Extrahieren des GM-CSF aus den Wirtszellen und seine anschließende Reinigung sind offenbart, jedoch GM-CSF wird nicht immer adäquat in guter Ausbeute und unter Retention der biologischen Aktivität gereinigt.

KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Auftrennen eines Rohproteins in eine relativ reine Protein-Fraktion und eine unreine Protein-Fraktion gerichtet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Rohprotein mit einem Ionenaustausch-Harz bei einem solchen pH-Wert in Berührung gebracht wird, daß das reine Protein und die strukturell nahe verwandte Verunreinigung entgegengesetzt geladen werden, wodurch eine der Fraktionen selektiv an das Ionenaustausch-Harz gebunden wird. Das Ionenaustausch-Harz ist ein starkes Ionenaustausch-Harz, und -3-
die reine Protein-Fraktion ist vorzugsweise an das Ionenaustausch-Harz gebunden. Die an das Ionenaustausch-Harz gebundene Fraktion wird vorzugsweise eluiert.
Der pH-Wert des Rohprotein-Gemischs wird auf einen pH-Wert im Bereich der isoelektrischen Punkte der zu trennenden Protein- Fraktionen in solcher Weise eingestellt, daß eine verstärkte Netto-Ladungsdifferenz zwischen den Fraktionen vorliegt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt den Schritt des Bestimmens der isoelektrischen Punkte des zu isolierenden reinen Proteins und der zu entfernenden Verunreinigung und des Bestimmens des pH-Wertes innerhalb des Bereichs der isoelektrischen Punkte in solcher Weise, daß das reine Protein und die Verunreinigung entgegengesetzt geladen werden und eine verstärkte Differenz zwischen den Ladungen existiert. Die isoelektrischen Punkte der Protein-Fraktionen werden vorzugsweise durch Computer-Simulation oder durch Verwendung isoelektrischer fokussierender Gele bestimmt.
Die obenbeschriebene Methode ist von Nutzen für die Reinigung von rDNA-Protein, insbesondere des Granulocyten-Makrophagen- Kolonie-stimulierenden Faktors (GM-CSF), spezieller für die Reinigung des GM-CSF durch Abtrennen desselben von A4-GM-CSF.
In einer besonders bevorzugten Arbeitsweise wird das Protein dadurch gereinigt, daß das Protein der Reihe nach mit
A. einem Anionenaustausch-Harz, wie einem quaternären Amin- Harz, das vorzugsweise an ein vernetztes Dextran, Cellulose, Agarose oder einen Acryl-Träger gebunden ist;
B. einem Kationenaustausch-Harz, das vorzugsweise eine an ein vernetztes Dextran, Cellulose, Agarose oder einen Acryl- Träger gebundene Sulfonat-Funktionalität hat; und
C. einem Mittel zur Gel-Filtration, das vorzugsweise für Proteine einen Fraktionierungs-Bereich von etwa 5 000 bis etwa 100 000 Dalton besitzt,
in Berührung gebracht wird.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Technik einer hochauflösenden Ionenaustausch-chromatographischen Trennung zur Reinigung von Rohproteinen, insbesondere von rohen rDNA-Proteinen. Bei dieser Technik wird die Chromatographie in der Nähe der isoelektrischen Punkte des reinen Proteins, dessen Gewinnung angestrebt wird, und der Verunreinigung, deren Entfernung angestrebt wird, durchgeführt, vorzugsweise bei einem pH-Wert, bei dem eine vergrößerte (z.B. die maximale) Differenz zwischen den Ladungen auf dem reinen Protein und der Verunreinigung existiert und bei dem die Moleküle entgegengesetzt geladen (polarisiert) sind. Diese verstärkte Netto-Ladungsdifferenz, die nur in der Nähe des isoelektrischen Punktes auftritt, kann dazu benutzt werden, geeignete Bedingungen der Ionenaustausch- Chromatographie zu wählen, was eine selektive Bindung an das Ionenaustausch-Harz nahezu in Abwesenheit von Ladungen ergibt. Aus Gründen der Zweckmäßigkeit wird diese Technik im folgenden als Delta-Isoelektrischer-Punkt (DIP)-Chromatographie bezeichnet.
rDNA-Verunreinigungen, die mit einem gewünschten rDNA-Protein nahe verwandt sind, lassen sich nur schwer aus dem Rohprotein mittels Gelfitrations-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe-Wechselwirkungs-Chromatographie, Phasenumkehr-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie, Metallchelatbildungs-Affinitäts-Chromatographie sowie andere konventionelle Typen der Chromatographie entfernen. Diese nahe verwandten Verunreinigungen sind gewöhnlich Proteine mit einem Molekulargewicht und einer Ladungsverteilung nahe denjenigen des interessierenden Protein-Produkts, gewöhnlich infolge Fehlens einer geladenen Aminosäure (oder mehrerer). Beispiele sind Verunreinigungen, die Produkte eines proteolytischen Abbaus sind, die durch Anschneiden eines der Proteolyse sowie der chromatographischen Wechselwirkung zugänglichen Peptid-Terminus gebildet worden sind. Solche Verunreinigungen werden als mittels herkömmlicher Ionenaustausch-Chromatographie nicht abtrennbar angesehen.
Die DTP-Chromatographie-Technik unterscheidet sich von der konventionellen Ionenaustausch-Chromatographie in einer Anzahl von Weisen. DIP wird bei einem pH-Wert durchgeführt, bei dem die zu trennenden Proteine sehr kleine elektrische Netto-Ladungen besitzen. Dies wird dadurch erreicht, daß das Ionenaustausch-Harz bei einem pH-Wert beladen wird, der nur um Bruchteile von pH- Einheiten von dem isoelektrischen Punkt (pI) des gewünschten Proteins und dessen nahe verwandter Verunreinigungen entfernt ist. Dies steht im Gegensatz zu der konventionellen Ionenaustausch-Chromatographie, die bei pH-Werten durchgeführt wird, bei denen die interessierenden Proteine starke elektrische Ladungen besitzen, und bei der das Beladen etwa 1 bis 2 ganzen pH-Einheiten von dem pI entfernt erfolgt, um eine Größenordnung höher als bei der DIP-Chromatographie.
Der pH-Wert, bei dem DIP durchzuführen ist, wird durch Computer-Simulationen der Ladungsdichte über dem pH-Wert für das Protein und die verwandten Verunreinigungen oder durch analytische Techniken wie die Verwendung isoelektrisch fokussierender Gele vorhergesagt. Bei der konventionellen Ionenaustausch-Chromatographie wird der pH-Wert des Beladens durch die Brutto-Netto-Ladung auf dem gewünschten Protein bestimmt, und die Beladungs-Bedingungen werden, wenn überhaupt, empirisch optimiert. Langwieriges Trial-and-Error-Experimentieren wird zur Bestimmung der Elutions-Bedingungen benötigt.
Anders als bei der konventionellen Ionenaustausch-Chromatographie, bei der kein Versuch unternommen wird, die Verunreinigungen relativ zu dem gewünschten Protein zu polarisieren, wird bei der DIP-Chromatographie der pH-Wert des Beladens so gewählt, daß er zwischen dem pI der nahe verwandten Verunreinigung und demjenigen des gewünschten Proteins liegt, und aufgrunddessen erhält das gewünschte Protein eine elektrische Ladung, die derjenigen der polarisierten Verunreinigung entgegengesetzt ist.
Für die DIP-Chromatographie wird eine Umgebung hoher Ionenstärke eingestellt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen während des Beladens zu reduzieren, und ein starker Ionenaustauscher wird verwendet. Um bei der herkömmlichen Ionenaustausch-Technik eine maximale Auflösung zu erzielen, werden schwache Ionenaustausch-Harze mit Beladungs-Bedingungen niedrigerer Ionenstärke bevorzugt. Die niedrige Protein-Protein-Wechselwirkung während des Beladens bei der DIP-Chromatographie resultiert in einer stark selektiven Bindung und einer extrem feinen Auflösung während der Phase des Beladens, und eine zusätzliche Trennung wird während einer normalen Gradienten-Elution erreicht. Bei der konventionellen Ionenaustausch-Chromatographie tritt während des Beladens eine nicht-selektive Bindung auf, und aus diesem Grunde wird während des Beladens nur eine Gruppen- Trennung erzielt; der größte Teil der Trennung wird während der Elutions-Phase unter starken Protein-Protein-Wechselwirkungen erhalten, die von hohen Dichten des lokal gebundenen Proteins auf der festen Matrix herrühren.
Die Computer-Simulation der Ladungsdichte über dem pH-Wert kann unter Benutzung von Software, die im Handel erhältlich ist, und einem geeigneten Rechner (z.B. Großrechner, Mikrocomputer oder Personalcomputer) durchgeführt werden. Beispielsweise kann ein VAX-Rechner (Digital Corp.) mit einem Software-Paket wie "Polypeptide Analysis System" von Intellegentics, Inc., Copyright 1981, 1982, 1983, 1984, 1985 und 1986, eingesetzt werden. Bei Verwendung dieser Software ist die Eingabe die primäre Aminosäure-Sequenz, und die Ladungsdichte-Verteilung kann bei unterschiedlichen pH-Werten erhalten werden. Alternativ kann der pI durch Anwendung der Gel-Elektrophorese mit Hilfe isoelektrisch fokussierender (IEF) Gele nach Arbeitsweisen bestimmt werden, die Fachleuten wohlbekannt sind.
Die DIP-Chromatographie kann auf Proteine, insbesondere rekombinante Proteine, angewandt werden, die isoelektrische Punkte in einem pH-Bereich haben, in dem das Protein nicht denaturiert wird. Die isoelektrischen Punkte vieler Proteine sind bekannt; siehe beispielsweise den ausgedehnten Übersichtsartikel von Righetti et al., "Isoelectric Points and Molecular Weights of Proteins - A New Table", in J. Chrom., 220 (1981), Seiten 115- 194 Cchromatography Reviews). Beispiele therapeutisch signifikanter Proteine, die eine Allotropie des isoelektrischen Punktes zeigen, für die die DIP-Chromatographie geeignet sein kann, sind GM-CSF, Leukozyten- und Lymphoblastoid-Interferone, Wachstumshormon, Superoxiddismutase und Erythropoietin. Zu anderen Proteinen zählen Antithrombin III, Lactogen, Plasminogen, Prolactin, Urokinase und Vitamin B&sub1;&sub2;-bindendes Protein.
Ein Beispiel für die Anwendung der DIP-Chromatographie ist die folgende Arbeitsweise für die Reinigung von rekombinantem Human-GM-CSF. Bin besonders schwieriger Aspekt der Reinigung von GM-CSF ist die Entfernung des GM-CSF-Abbau-Produkts, dem vier N-terminale Aminosäuren fehlen und das als Delta 4 (Δ4) bekannt ist. GM-CSF wird gewöhnlich durch eine Kombination aus Anionenaustausch auf einer Säule von quaternärem Aminoethyl, Gel-Filtration und Phasenumkehr-Chromatographie gereinigt, eine Arbeitsweise, die in bezug auf die Entfernung der Δ4-Verunreinigung nicht wirksam ist.
Die DTP-Chromatographie ist jedoch bei der Entfernung der Δ4- Verunreinigung erfolgreich. Zunächst wurde eine Computer- Simulation des intakten GM-CSF-Proteins mit der Computer- Simulation der Δ4-Verunreinigung verglichen, und es wurde bestimmt, daß der pI des GM-CSF 5,24 beträgt und der pI der Δ4- Verunreinigung 4,98 beträgt. Als nächstes mußte ein Arbeits-pH innerhalb dieses Bereichs bestimmt werden, bei dem
(a) GM-CSF eine Ladung erhält, die derjenigen der Δ4-Verunreinigung entgegengesetzt ist, und
(b) die relative Größe der Differenz zwischen den Ladungen hinreichend vergrößert wird, um eine Trennung zu ermöglichen
Eine geringfügige Ladungs-Differenz von 1 Ladung/Molekül (1 ch/mol) zwischen dem intakten GM-CSF und der Δ4-Verunreinigung existiert über einen breiten pH-Bereich (d.h. bei pH 0,5 sind die betreffenden Ladungen +16 und +15, und bei einem pH 11,5 sind die betreffenden Ladungen -11,1 und -12). Wie jedoch durch das Computer-Modell vorhergesagt wird, wird nahe bei pH 5 die Ladungs-Differenz zwischen dem intakten GM-CSF und der Δ4- Verunreinigung vergrößert (d.h. die relative Ladungs-Differenz wird erhöht), und die Moleküle werden polarisiert; bei pH 5 hat GM-CSF +0,9 ch/mol, während die A4-Verunreinigung nur -0,1 ch/mol besitzt. Dementsprechend sind die beiden notwendigen Bedingungen für DIP erfüllt: Ladungs-Polarisation und Verstärkung.
Um die Trennung des intakten GM-CSF von verbleibenden Nieder- pI-Verunreinigungen der E. coli-Wirtszellen und von proteolytischen destabilisierenden Faktoren weiter zu vergrößern, wurde eine hohe Ionenstärke während des Eeladens angewandt. Dies vermindert elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den Molekülen. Unter diesen Bedingungen hoher Ionenstärke wird aus diesem Grunde ein starker Kationenaustauscher bei pH 5, z.B. eine Säule wie eine Sulfonat-Funktionalität, die an ein vernetztes Dextran, Cellulose, Agarose oder einen Acryl-Träger (z.B. S-Sepharose, hergestellt von Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) gebunden ist, bevorzugt.
Es wurde gefunden, daß die Verwendung einer solchen Kationenaustausch-Harz-Säule eine einstufige Entfernung der unerwünschten Δ4-Verunreinigung, verschiedener Nieder-pI-Verunreinigungen, einer 20 K E. coli-Verunreinigung, die zuvor durch andere Arbeitsweisen nicht entfernt wurde, und eines proteolytischen Faktors zustandebringt und dadurch das Endprodukt stabilisiert. Die Durchführung der Kationenaustausch-Chromatographie steigert die Reinheit des GM-CSF von etwa 50 % auf etwa 90 % mit Ausbeuten von 70 bis 80 %. Wenn sich ein Schritt der Gel-Filtration anschließt, wird die Reinheit des GM-CSF auf etwa 99 % gesteigert.
Das Folgende ist eine allgemeine Beschreibung einer Arbeitsweise zur Isolierung und Reinigung von GM-CSF. Die Anionenaustausch-Chromatographie, vorzugsweise auf einer Säule von quaternärem Aminoethyl, ist ein konventioneller Schritt bei der Reinigung von GM-CSF und wird durchgeführt, um nach dem Abtöten der Wirtszellen die Hoch-pI-Verunreinigungen aus dem Überstand zu entfernen. Der Schritt der Gel-Filtration, ebenfalls konventionell, wird durchgeführt, um nieder- und hochmolekulare Verunreinigungen zu entfernen. Während das Folgende ein Verfahren beschreibt, bei dem die gereinigte Protein-Fraktion an das starke Ionenaustausch-Harz gebunden wird, wird ebenfalls in Betracht gezogen, daß bei bestimmten Ausführungsformen die Fraktion des unreinen Proteins an das starke Ionenaustausch- Harz gebunden wird. Wiewohl die Beschreibung und das Beispiel auf den kontinuierlichen Durchgang des Rohproteins durch eine Ionenaustausch-Harz-Säule gerichtet sind, sind auch andere Methoden des In-Berührung-Bringens, etwa das chargenweise In-Berührung-Bringen, in die Überlegungen einbezogen.
Allgemeine Anmerkungen: Die Arbeitsgänge werden bei 2 ºC bis 15 ºC durchgeführt, sofern nichts anderes angegeben ist. Die Protein-Konzentration wird in jedem Stadium mittels eines Coomassie-Blau-Bindungs-Assay bestimmt. Falls der erwartete Grad der Reinigung bei irgendeiner chromatographischen Arbeitsweise nicht erreicht wird, können eluierte Fraktionen auf derselben Säule nochmals chromatographiert oder, alternativ, durch einen früheren Schritt oder eine Serie früherer Schritte im Kreislauf zurückgeführt werden. Diese Wiederaufarbeitung kann an eluierten Nebenfraktionen aus einem Ansatz oder einer Sammelmenge von Ansätzen erfolgen. In jedem Schritt kann die Konzentrierung durch eine Ammoniumsulfat-Fällung, eine Fällung am isoelektrischen Punkt und/oder eine Ultrafiltration durchgeführt werden. Die Puffer-Lösungen werden mit entionisiertem Wasser (DI), Wasser aus der umgekehrten Osmose (RO) oder Wasser zur Injektion (WFI) hergestellt.

Stufe I: Chromatographie an einer Säule mit quaternärem Amin

Der pH-Wert des rohen Extrakts von GM-CSF wird mit einem Puffer wie 1 M Bis-tris(bis[2-hydroxyethyl]imino-tris[hydroxymethyl]methan) und/oder 4 N HCl auf 5 bis 7,5 eingestellt. Die Lösung wird dann durch Zentrifugation und/oder Filtration geklärt. Die Leitfähigkeit wird durch Verdünnen mit Wasser oder Zusatz einer Salz-Lösung wie 4 N NaCl auf einen Wert unterhalb von 10 mS/cm eingestellt. Der Ansatz wird auf eine Säule mit quaternärem Amin (d.h. einer quaternären Amin-Funktionalität, die an ein vernetztes Dextran, Cellulose, Agarose oder einen Acryl-Träger wie Q-Sepharose, hergestellt von Pharmacia, Inc., gebunden ist) gebracht, wobei die Beladung nicht größer als 50 g Protein pro 1 l Gel ist. Die Elution erfolgt mit einem Gradienten im Bereich von 0 bis 0,4 M NaCl oder einem anderen geeigneten Salz in einem Puffer wie 20 mM Bis-tris. Die geeigneten Fraktionen werden für die weitere Verarbeitung vereinigt.

Stufe II: Chromatographie an einer Sulfonat-Säule

Die vereinigten Fraktionen werden mit einer Säure, wie 1 M Essigsäure oder 4 N HCl, oder einer Base, wie 6 N NaOH, auf pH 5 eingestellt, der innerhalb des Bereichs der isoelektrischen Punkte der Protein-Fraktionen liegt, wie durch DIP- Chromatographie bestimmt wurde. Die Leitfähigkeit wird mit einem Puffer, wie 0,01 M Essigsäure, die mit NaOH auf pH 5 eingestellt wurde, auf 13 ms/cm eingestellt. Die Lösung wird durch ein 0,2 um-Filter filtriert und auf eine Sulfonat-Säule aufgetragen (d.h. eine Sulfonat-Funktionalität, die an ein vernetztes Dextran, Cellulose, Agarose oder einen Acryl-Träger wie S-Sepharose gebunden ist), wobei die Beladung nicht größer als 20 g Protein pro 1 1 des Säuleninaterials ist. Die Elution erfolgt mit einer Lösung eines Salzes wie NaCl bei einem Konzentrations-Gradienten bis zu 0,5 M in einem Puffer wie 20 mM Essigsäure, 0,13 M NaCl, pH 5,0 Puffer. Geeignete Fraktionen werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Dieser Chromatographie-Schritt wird typischerweise wiederholt.

Stufe III: Ammoniumsulfat-Fällung

Ammoniumsulfat wird zu den vereinigten S-Sepharose-Fraktionen zu einer Endkonzentration einer 50- bis 60-proz. Sättigung hinzugefügt. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation gesammelt. Das Präzipitat kann unter Kühlung aufbewahrt werden.

Stufe IV: Gel-Filtrations-Chromatographie

Das Ammoniumsulfat-Präzipitat wird in einem Puffer gelöst, etwa 10 mM Natriumphosphat, 50 mM Citronensäure, pH 6-Puffer, der bis zu 0,35 M eines Salzes wie Natriumchlorid enthält. Die Lösung wird zentrifugiert und durch ein Filter des 0,2 um- Bereichs filtriert, bevor sie auf eine Gel-Filtrations-Säule mit einem Fraktionierungs-Bereich von etwa 5 000 bis etwa 100 000 Dalton für Proteine geladen wird, z.B. Sephacryl S-200 HR (hergestellt von Pharmacia, Inc.), die zuvor mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist. Die Beladung ist nicht größer als 3,5 g Protein pro 1 l Gel. Die Säule wird mit dem gleichen Puffer eluiert, und geeignete Fraktionen werden vereinigt. Die Fraktionen werden gegen einen Puffer, wie 10 mM Phosphat, 2 mM Citrat, pH 7,2-Puffer, dialysiert. Alternativ kann die gesamte Stufe IV in diesem letzteren Puffer durchgeführt werden.

Stufe V: Gereinigte GM-CSF-Hauptmenge

Die vereinigten Fraktionen werden durch ein Filter der Porengröße 0,2 umn oder kleiner filtriert und bei -20 ºC oder darunter aufbewahrt.
Typische Arbeitsweisen der IEF-Gel-Elektrophorese sind in den folgenden Literaturstellen offenbart:
1. ELECTROPHORETIC TECHNIQUES, Academic Press (1983), Hrsg. G.F. Simpson & M. Whittaker, Recent Developments in Isoelectric-focusing", J.S. Fawcett, S. 57.
2. ISOELECTRIC-FOCUSING: Theory, Methodology and Application, P.G. Righetti, Elsevier Biomedical Press (1983), S. 148.
3. APPLICATION OF SEPARATOR ISOELECTRIC-FOCUSING within pH RANGE 4-6, P. Gill, Electrophoresis 6: 282 (1985).
4. RAPID STAINING OF PROTEINS IN ULTRA THIN ISOELECTRIC FOCUSING IN POLYACRYLAMIDE GEL, M.D. Frey, Electrophoresis 3: 27-32 (1982).
5. ULTRA THIN LAYER ISOELECTRIC-FOCUSING OF ENZYMES IN LIVER SAMPLES OF WAGTAILS, M. Germeiner, Electrophoresis 3: 146 (1982).
Nachstehend wird ein Beispiel angegeben, das die Arbeitsgänge zur Reinigung von GM-CSF auf der Basis der DIP-Technik erläutert.

Beispiel 1

Reinigung von GM-CSF

Schritt 1:

Chromatographie an einer Säule mit quaternärem Amin

Der pH-Wert von 180 l rohem GM-CSF-Extrakt wurde mit 3,6 l 1 M Bis-tris-Puffer (pH 6,0) und mit 2,0 1 4 N HCl auf pH 6,0 eingestellt. Die Lösung wurde durch Zentrifugation unter Verwendung einer Sharples-Zentrifuge mit einer Einspeisungs-Rate von 0,75 l/min geklärt. Der Überstand wurde ungefähr 1,55-fach mit kaltem entionisiertem Wasser verdünnt, um am Ende eine Leitfähigkeit von 5,5 ms/cm zu erreichen. Eine 12 l-Säule mit Q-Sepharose wurde mit 10 Säulen-Volumina 20 mM Bis-tris-Puffer bei pH 6,0 äquilibriert, und 43,6 l Extrakt wurden mit einer Beladung von 20 mg Protein pro 1 ml Harz aufgetragen. Die Säule (Durchmesser 25 cm) wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 250 ml/min mit 120 l Äquilibrierungs-Puffer gewaschen. Ein linearer Gradient wurde eingestellt zwischen 78 l 0,03 NaCl bei pH 6,0 enthaltendem 20 mM Bis-tris-Puffer und 78 l 0,32 M NaCl bei pH 6,0 enthaltendem 20 mM Bis-tris-Puffer. Fraktionen (jeweils 1,2 l) wurden auf der Basis der Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) vereinigt, und das vereinigte Protein (4,9 l) wurde in Schritt 2 chromatographiert.

Schritt 2:

Chromatographie an einer Sulfonat-Säule

Die vereinigten Fraktionen (4,9 l) aus Schritt 1 wurden mit 49 ml 1 M Essigsäure (pH 5,0) auf pH 5 eingestellt, und die Leitfähigkeit wurde mit 2 l 0,01 M Essigsäure, die mit NaOH auf pH 5 eingestellt worden war, auf 15 mS/cm eingestellt. Die Lösung wurde durch ein 0,2 um-Filter filtriert und dann auf eine 0,8 l S-Sepharose-Säule gebracht, die zuvor mit 0,13 M NaCl bei pH 5 enthaltender 20 mM Essigsäure mit einer Beladungs-Rate von 4,7 mg pro 1 ml des Säulenmaterials äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 2,4 l Äquilibrierungs- Puffer gewaschen und dann mit einem linearen Gradienten eluiert, der zwischen 5,6 l 0,13 M NaCl bei pH 5 enthaltender 20 mM Essigsäure und 5,6 l 0,5 M NaCl bei pH 5 enthaltender 20 mM Essigsäure eingestellt worden war. Die Fraktionen wurden auf der Basis der Gel-Elektrophorese vereinigt. Dieser Chromatographie-Schritt wurde wiederholt.

Schritt 3:

Ammoniumsulfat-Fällung

Ammoniumsulfat wurde zu den vereinigten Fraktionen aus Schritt 2 (240 l) hinzugefügt, so daß eine Konzentration von 351 g/l (55-proz. Sättigung) erreicht wurde. Die Lösung wurde 2 h auf 4 ºC gehalten, ohne zu vermischen; dann wurde 30 min bei 4 ºC mit 4 500 U/min zentrifugiert, um das Präzipitat zu erhalten.

Schritt 4:

Gel-Filtrations-Chromatographie

Das Ammoniumsulfat-Pellet wurde in 36 ml 18 mM Natriumphosphat, 2 mM Citronensäure, pH 7,2-Puffer gelöst. Die Lösung wurde 30 min mit 4 500 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde durch ein 0,2 um-Filter filtriert. Das Filtrat wurde auf eine 1,8 l-Säule Sephacryl S-200HR gebracht, die zuvor mit Phosphat- Citrat-Puffer pH 7,2 mit einer Beladungs-Rate von 0,21 mg pro 1 ml Gel äqulibriert worden war. Die Säule wurde mit 1,9 l des gleichen Puffers, pH 7,2, gewaschen. Die Fraktionen wurden auf der Basis eines Protein-Assay vereinigt.

Schritt 5:

Filtration

Die vereinigten Fraktionen aus Schritt 4 wurden durch ein 0,2 um-Filter filtriert und bei -20 ºC aufbewahrt.

Claims

1. Verfahren zum Auftrennen eines Rohprotein-Gemischs in eine erste, ein gewünschtes Protein enthaltende Protein- Fraktion und eine zweite, ein oder mehrere unerwünschte, strukturell nahe verwandte Proteine enthaltende Fraktion, umfassend das In-Berührung-Bringen des Rohprotein-Gemischs bei einem ausgewählten pH-Wert mit einem Ionenaustausch- Harz, dadurch gekennzeichnet, daß das Ionenaustausch-Harz ein starkes Ionenaustausch-Harz ist und der pH-Wert des Rohprotein-Gemischs auf einen ausgewählten pH-Wert eingestellt wird, der dadurch ausgewählt wird, daß

(a) die isoelektrischen Punkte einer Mehrzahl Proteine in dem Rohprotein-Gemisch bestimmt werden;

(b) ein pH-Wert ausgewählt wird, der zwischen bestimmten isoelektrischen Punkten der Proteine der aufzutrennenden Fraktionen liegt, wodurch bei dem betreffenden ausgewählten pH-Wert Proteine in der ersten Protein- Fraktion und Proteine in der zweiten Protein-Fraktion entgegengesetzt geladen werden und nur eine der Fraktionen an das Ionenaustausch-Harz bindet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die das gewünschte Protein enthaltende Fraktion an das Ionenaustausch-Harz bindet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die an das Ionenaustausch-Harz gebundene Fraktion anschließend eluiert wird.

4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, worin die isoelektrischen Punkte der Proteine durch Computer- Simulation oder durch Verwendung isoelektrischer fokussierender Gele bestimmt werden.

5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, worin das gewünschte Protein ein rekombinantes Protein ist.

6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin das gewünschte Protein GM-CSF, Leukozyten-Interferon, Lymphoblastoid-Interferon, Wachstumshormon, Superoxiddismutase, Erythropoietin, Antithrombin III, Lactogen, Plasminogen, Prolactin, Urokinase oder Vitamin B&sub1;&sub2;-bindendes Protein ist.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin das gewünschte Protein GM-CSF ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin GM-CSF von der Δ4-Verunreinigung getrennt wird.

9. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, worin die erste Protein-Fraktion an ein Anionenaustausch-Harz gebunden, eluiert und dann der Gelfiltrations-Säulenchroinatographie unterzogen wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1 zum Abtrennen eines gewünschten Proteins von einer strukturell nahe verwandten Verunreinigung in einem Rohprotein-Gemisch, umfassend

(a) das Bestimmen der isoelektrischen Punkte des gewünschten Proteins und der Verunreinigung;

(b) das Binstellen des pH-Wertes des Rohprotein-Gemischs auf einen Punkt zwischen den isoelektrischen Punkten des gewünschten Proteins und der Verunreinigung;

(c) das In-Berührung-Bringen des Rohprotein-Gemischs bei einem solchen pH-Wert mit einem Ionenaustausch-Harz, wodurch das gewünschte Protein und die Verunreinigung entgegengesetzt geladen werden und nur eine von beiden an das Ionenaustausch-Harz bindet.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin das gewünschte Protein GM-CSF ist, die Verunreinigung die Δ4-Verunreinigung ist und der pH-Wert des Rohprotein-Gemischs auf pH = 5 eingestellt wird.