NO303451B1 - FremgangsmÕte for separasjon av en rÕproteinblanding - Google Patents
FremgangsmÕte for separasjon av en rÕproteinblanding Download PDFInfo
- Publication number
- NO303451B1 NO303451B1 NO901769A NO901769A NO303451B1 NO 303451 B1 NO303451 B1 NO 303451B1 NO 901769 A NO901769 A NO 901769A NO 901769 A NO901769 A NO 901769A NO 303451 B1 NO303451 B1 NO 303451B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- protein
- exchange resin
- ion exchange
- csf
- proteins
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 title claims abstract description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 90
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 90
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims abstract description 38
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims description 24
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims description 24
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 16
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 8
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 claims description 7
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 5
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims description 4
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 claims description 3
- 102100021809 Chorionic somatomammotropin hormone 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 3
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 3
- 101000895818 Homo sapiens Chorionic somatomammotropin hormone 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000956228 Homo sapiens Chorionic somatomammotropin hormone 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 claims description 3
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 claims description 3
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 claims description 3
- 102100024819 Prolactin Human genes 0.000 claims description 3
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 claims description 3
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims description 3
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 claims description 3
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 3
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 claims description 3
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 claims description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000011409 Transcobalamins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010023603 Transcobalamins Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 claims 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 abstract description 8
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 71
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 5
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 125000001273 sulfonato group Chemical group [O-]S(*)(=O)=O 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101710190786 PI protein Proteins 0.000 description 2
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N azane;7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole-4-sulfonic acid Chemical compound N.OS(=O)(=O)C1=CC=C(F)C2=NON=C12 JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000013499 data model Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011268 retreatment Methods 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 108010053455 riboflavin-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J39/00—Cation exchange; Use of material as cation exchangers; Treatment of material for improving the cation exchange properties
- B01J39/26—Cation exchangers for chromatographic processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Bakgrunn
Ionebytterkromatografi er en vanlig kromatografisk teknikk som er naturlig skånsom, billig, har stor kapasitet og kan lett måles. Imidlertid har denne teknikk til dags dato ikke vært anvendelig for adskillelse av nært beslektede urenheter fra proteiner, spesielt rDNA-proteiner.
Et eksempel på et slikt rDNA-protein er humant rekombinant GM-CSF. Komplementære DNA-molekyler (cDNA) til GM-CSF, som er faktorer som støtter vekst og utvikling av granulo-cytter og makrofager i blodet, har nylig blitt klonet og sekvensbestemt av et antall laboratorier. Dessuten er ikke-rekombinant GM-CSF renset fra kultursupernatanter av MO-cellelinjen (beskrevet i US patent 4 438 032), og de første 16 aminosyrer fra den N-terminale ende er sekvensbestemt, Gasson et al., Science, vol. 226, s. 1339-1342 (1984). Blant de humane GM-CSF er det observert heterogenitet i nukleotid-sekvens og aminosyresekvens. F.eks. er det på aminosyrenivå observert både threonin og isoleucin ved posisjon 100 med hensyn til den N-terminale alanin, noe som tyder på at flere allele former, eller polymorfe former av GM-CSF kan eksistere innen humane populasjoner.
Flere forskjellige fremgangsmåter er nå tilgjengelige for de novo-fremstilling og kloning av cDNA-molekyler, slik som cDNA GM-CSF, og for oppbygningen av cDNA-biblioteker. Eksempelvis ekstraheres totalt mRNA fra celler (f.eks. en ikke-transformert human T-celle-kilde) som gir polypeptider som utviser den ønskede aktivitet. De dobbeltstrengede cDNA-molekyler kan oppbygges fra dette totale mRNA ved anvendelse av primer-initiert revers transkripsjon for først å danne komplementet av hver mRNA-sekvens, og deretter ved priming for syntese av den andre streng. Deretter kan cDNA-molekylene klones ved å sammenføye dem med egnede plasmid- eller bakter-iofage vektorer gjennom komplementære homopolymere haler og kohesive ender som er dannet med linkersegmenter inneholdende egnede restriksjonsseter,etterfulgt av transformering av en egnet vert. Et bredt område av ekspresjonssystemer (dvs., vert-ekspresjonsvektorkombinasjoner) kan anvendes for å danne proteinene renset ved hjelp av fremgangsmåten ifølge fore liggende oppfinnelse. Mulige typer av vertceller innbefatter, men er ikke begrenset til, bakterieceller, gjærceller, insekt-celler, pattedyrceller og lignende.
Forskjellige fremgangsmåter er beskrevet for ekstra-hering av GM-CSF fra vertceller med etterfølgende rensing, men GM-CSF renses ikke alltid tilstrekkelig med godt utbytte og med bibehold av biologisk aktivitet.
Sammendrag av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for separasjon av en råproteinblanding i en første proteinfraksjon inneholdende et ønsket protein og en andre proteinfraksjon inneholdende ett eller flere, strukturelt nært beslektede, uønskede proteiner med ukjente isoelektriske punkter, omfattende at råproteinblandingen bringes i kontakt med en ionebytterharpiks ved en utvalgt pH, kjennetegnet ved at ionebytterharpiksen er en sterk ionebytterharpiks og at pH i råproteinblandingen justeres til en pH-verdi som utvelges ved: (a) bestemmelse av de isoelektriske punkter for et flertall proteiner i råproteinblandingen ved hjelp av datasimulering eller isoelektrofokuserende geler; (b) utvelgelse av en pH-verdi som ligger mellom de bestemte isoelektriske punkter for proteinene i fraksjonene som skal separeres, ved hvilken utvalgte pH-verdi proteiner i den første og andre proteinfraksjon er motsatt ladet og kun én av fraksjonene bindes til ionebytterharpiksen. Den ønskede proteinfraksjon bindes fortrinnsvis til ionebytterharpiksen. Fraksjonen bundet til ionebytterharpiksen elueres fortrinnsvis.
pH av råproteinet justeres fortrinnsvis til en pH innen området for de isoelektriske punkter av proteinfraksjonene som skal adskilles, slik at det foreligger en forsterket netto ladningsdifferanse mellom fraksjonene. Foreliggende oppfinnelse angår også en fremgangsmåte for separasjon av et ønsket protein fra en nært beslektet urenhet i en råproteinblanding, kjennetegnet ved at (a) de isoelektriske punkter for det ønskede protein og urenheten bestemmes; (b) pH i råproteinblandingen justeres til et punkt mellom de isoelektriske punkter for det ønskede protein og
urenheten; og
(c) råproteinblandingen bringes ved en slik pH i kontakt med en ionebytterharpiks,
hvorved det ønskede protein og urenheten er motsatt ladet og kun én av disse bindes til ionebytterharpiksen. De isoelektriske punkter for proteinfraksjonene bestemmes fortrinnsvis ved hjelp av datasimulering eller ved anvendelse av isoelektrisk fokuserende geler.
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåte er anvendelig for separering av rDNA-protein, spesielt granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF), leukocyttinterferon, lymfoblastoidinterferon, veksthormon, superoksyddismutase, erythropoiethin, antithrombin III, lactogen, plasminogen, prolactin, urokinase eller vitamin B12-bindingsprotein, nærmere bestemt for separering av GM-CSF ved adskillelse av denne fra
A4 GM-CSF.
I en spesielt foretrukket fremgangsmåte separeres protein ved sekvensielt å bringe proteinet i kontakt med: A. En anion-ionebytterharpiks, som en kvaternær aminharpiks, fortrinnsvis bundet til et tverrbundet dextran-, cellulose-, agarose- eller akrylstøttemateriale; B. en kation-ionebytterharpiks som fortrinnsvis har en sulfonatfunksjonalitet bundet til et tverrbundet dextran-, cellulose-, agarose- eller akrylstøttemateriale; og C. et gelfiltreringsmiddel som fortrinnsvis har et fraksjoneringsområde for proteiner på tilnærmet 5000 til 100 000 dalton.
Detaljert beskrivelse
Foreliggende oppfinnelse angår en høyoppløselig ione-bytterkromatografisk adskillelsesteknikk for separering av råproteiner, spesielt rDNA-proteiner. Ved denne fremgangsmåte utføres kromatograferingen nær de isoelektriske punkter for det ønskede protein som søkes gjenvunnet og de uønskede som søkes fjernet, fortrinnsvis ved en pH hvor det foreligger en forsterket (f.eks. den maksimale) differanse mellom ladninger på det ønskede protein og de uønskede, og hvor molekylene er motsatt ladet (polarisert). Denne forsterkede, netto ladningsdifferanse, som kun forekommer nær det isoelektriske punkt, kan anvendes for å utvelge egnede ionebytterkromatografiske betingelser, som fører til selektiv binding til ionebytterharpiksen ved nesten fravær av ladninger. For letthets skyld blir denne fremgangsmåte heretter referert til som Delta Isoelektrisk Punkt (DlP)-kromatografi.
Uønskede rDNA-proteiner som er nært beslektet med et ønsket rDNA- protein er vanskelig å fjerne fra råprotein ved hjelp av gelfiltreringskromatografi, ionebytterkromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi, reversert fase høyytelses-væskekromatografi, metallchelaterende affinitetskromatografi, så vel som andre konvensjonelle kromatograferingsmetoder. Disse nært beslektede proteiner er vanligvis proteiner med en molekylvekt og ladningsfordeling som er nært beliggende proteinproduktet av interesse, vanligvis manglende en (eller fler) ladete aminosyrer. Eksempler på dette er proteiner som er proteolytiske nedbrytningsprodukter dannet ved avkutting av en peptidterminal som er tilgjengelig for proteolyse så vel som for kromatografisk interaksjon. Slike proteiner er be-traktet å være uadskillelige ved hjelp av konvensjonell ionebytterkromatograf i .
DIP-kromatografifremgangsmåten adskiller seg fra konvensjonell ionebytterkromatograf i på mange måter. DIP ut-føres ved en pH hvor proteiner som skal adskilles har meget små elektriske nettoladninger. Dette oppnås ved at proteinene anbringes på ioneby tterharpiksen ved en pH som kun ligger brøkdeler av en pH-enhet fra det isoelektriske punkt (pl) for det ønskede protein og dets nær beslektede proteiner. Dette står i motsetning til konvensjonell ionebytterkromatograf!, som utføres ved pH verdier hvor proteiner av interesse har sterke elektriske ladninger, og hvori anbringelse av proteinene utføres ved tilnærmet 1-2 hele pH-enheter fra det isoelektriske punkt, en størrelsesorden høyere enn ved DIP-kromatograf i .
pH ved hvilken DIP skal utføres beregnes på forhånd ved hjelp av datasimuleringer av ladningstetthet i forhold til pH for proteinet og de beslektede proteiner, eller analyt-iske teknikker som anvendelsen av isoelektrisk fokuserende geler. Ved konvensjonell ionebytterkromatografi bestemmes pH ved anbringelse av protein ved hjelp av brutto nettoladning på det ønskede protein, og anbringelsesbetingelser optimali-
seres empirisk, hvis i hele tatt. Triviell eksperimentering med prøving og feiling er nødvendig for å bestemme eluerings-betingelser.
I motsetning til konvensjonell ionebytterkromatografi hvori ingen forsøk utføres for å polarisere de uønskede proteiner i forhold til det ønskede protein, utvelges ved DIP-kromatografi anbringelses-pH-verdien slik at den ligger mellom det isoelektriske punkt for den nært beslektede uønskede protein og det ønskede protein, og derfor oppnår det ønskede protein en motsatt elektrisk ladning i forhold til det polari-serte uønskede proteiner.
Ved DIP-kromatografi pålegges en omgivelse av høy ionestyrke for å redusere protein-protein-interaksjoner ved anbringelsen, og en sterk ionebytter anvendes. For å erholde en maksimal adskillelse, foretrekkes ved konvensjonell ione-bytterteknologi anvendelse av ionebytterharpikser med lavere ionestyrke-anbringelsesbetingelser. Den lave protein-protein-interaksjon under anbringelse ved DIP-kromatografi fører til ytterst selektiv binding og ytterst fin adskillelse under anbringelsesfasen, og ytterligere adskillelse oppnås under normal gradienteluering. Ved konvensjonell ionebytterkromatograf;!.,. foregår ikke-selektiv binding under anbringelse og derfor oppnås kun gruppeadskillelse under anbringelse; det meste av adskillelæn erholdes under elueringsfasen, under sterke protein-protein-interaksjoner som er et resultat av høye lokalt bundne proteintettheter på den faste matrix.
Datasimuleringer av ladningstetthet i forhold til pH kan utføres ved anvendelse av kommersielt tilgjengelig programvare og en egnet datamaskin (f.eks. prosessorenhet, mikrodatamaskin eller personlig datamaskin). F.eks. kan en VAX-datamaskin (Digital Corp.) anvendes med en programvare-pakke som "Polypeptide Analysis System" fra Intellegentics, Inc., copyright 1981, 1982, 1983, 1984 og 1985. Ved anvendelse av denne programvare representerer den primære aminosyresekvens input, og ladningstetthetsfordelingen kan erholdes ved forskjellige pH-verdier. Alternativt kan pl bestemmes ved anvendelse isoelektrisk fokusering (IEF)-gelelektroforese i overenstemmelse med fremgangsmåter velkjent for fagmannen.
DIP-kromatografi kan anvendes på proteiner, spesielt rekombinante proteiner, som har isoelektriske punkter i et pH-område hvori proteinet ikke er denaturert. De isoelektriske punkter for mange proteiner er kjent. Se f.eks. den omfattende oversiktsartikkel av Righetti, et. al., "Isoelectric Points and Molecular Weights of Proteins - A New Table", i J. Chrom., 220 (1981), s. 115-194 ( Chromatography Rewiews). Eksempler på terapeutisk vesentlige proteiner som utviser isoelektrisk punkt-allotropisme for hvilke DIP-kromatografi kan være egnet er GM-CSF, leukocytt- og lymfoblastoid-interferoner, veksthormon, superoksyddismutase og erythropoietin. Andre proteiner innbefatter antitrombin III, lactogen, plasminogen, prolactin, urokinase og vitamin B^-bindingsprotein.
Et eksempel på anvendelsen av DIP-kromatografi er den følgende fremgangsmåte for separering av humant rekombinant GM-CSF. Et spesielt vanskelig aspekt ved separering av GM-CSF er fjerningen av et GM-CSF-nedbrytningsprodukt som mangler fire N-terminale aminosyrer og kjent som Delta 4 (A 4). GM-CSF separeres vanligvis ved hjelp av en kombinasjon av anionebytte på en kva temaer aminoethylkolonne, gel f iltrering og reversert fase-kromatografi, hvilken fremgangsmåte ikke er effektiv for å fjerne A4-urenheten.
DIP-kromatografi har imidlertid vist seg vellykket for å fjerne A4-urenheten. Først ble en datasimulering av det intakte GM-CSF-protein sammenlignet med datasimuleringen av A4-urenheten, og det ble bestemt at pl for GM-CSF er 5,24 og pl for A4-urenheten er 4,98. Deretter måtte en arbeids-pH innen dette området bestemmes, ved hvilken (a) GM-CSF oppnådde en motsatt ladning av A4-urenheten og (b) den relative størrelse av differansen mellom ladningene er tilstrekkelig forsterket for å gjøre adskillelse mulig. Det foreligger en meget liten ladningsdifferanse på 1 ladning/molekyl (1 ch/mol) mellom det intakte GM-CSF og A4-urenheten over et bredt pH-område (dvs. ved pH 0,5 er de respektive ladninger +16 og +15, og ved pH 11,5 er ladningene -11,1 og -12). Nær pH 5 for-" sterkes imidlertid, som beregnet på forhånd ved hjelp av data-modellen, ladningsdifferansen mellom intakt GM-CSF og A4-urenheten (dvs. at den relative ladningsdifferanse økes) og molekylene polariseres: ved pH 5, har GM-CSF + 0,9 ladninger/mol, mens A4-urenheten har kun - 0,1 ladninger/mol. Således er de to nødvendige betingelser for DIP tilfredsstilt: ladnings-polarisering og forsterking.
For videre å øke adkillelsen av intakt GM-CSF fra gjenværende uønskede proteiner med lav pl i E. coli-vertceller og fra proteolytiske destabiliserende faktorer, ble høy ionestyrke anvendt under anbringelse. Dette reduserer elektrostat-iske interaksjoner mellom molekylene. Under disse betingelser med høy ionestyrke foretrekkes derfor en sterk kationutbytter ved pH 5, f.eks. en kolonne med sulfonatfunksjonalitet bundet til et tverrbundet dextran-, cellulose-, agarose- eller akryl-støttemateriale (f.eks. S-Sepharose, produsert av Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ).
Anvendelse av en slik kationebytterharpikskolonne gjorde det mulig å oppnå en ettrinns fjerning av den uønskede A4-urenhet, forskjellige uønskede proteiner med lav pl, et 20K E. coli protein som ikke tidligere kunne fjernes ved hjelp av andre fremgangsmåter, og en proteolytisk faktor, som derved stabiliserte sluttproduktet. Utførelse av kationutbytter-kromatografien øker utbyttet av GM-CSF fra tilnærmet 50 % til tilnærmet 90 %, med utbytter på 70-80 %. Ved et etterfølgende gelfiltreringstrinn økes utbyttet av GM-CSF til tilnærmet 99 %.
I det etterfølgende gis en generell beskrivelse av en fremgangsmåte for isolering og separering av GM-CSF. Anioneut-byttekromatografien, fortrinnsvis på en kvaternær aminoethylkolonne, er et konvensjonelt trinn ved separering av GM-CSF og utføres for å fjerne uønskede proteiner med høy pl fra supernatanten etter vertcellene er drept. Gelfiltreringstrinnet, som også er konvensjonelt, utføres for å fjerne uønskede proteiner med høy og lav molekylvekt. Mens det i det etter-følgende beskrives en fremgangsmåte hvori den ønskede proteinfraksjon er bundet til den sterke ionebytterharpiksen, er det også overveiet at i visse utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse kan den uønskede proteinfraksjon bindes til den sterke ionebytterharpiks. Mens beskrivelsen og eksemplet er rettet på den kontinuerlige passering av råproteinet gjennom en ionebytterharpikskolonne, er likeledes andre kontaktmetoder overveiet, slik som satsvis kontakt.
Generelle kommentarer: Fremgangsmåten utføres ved 2-15 °C hvis ikke annet er angitt. Proteinkonsentrasjonen bestemmes ved hvert trinn ved hjelp av en analysebestemmelse for binding med Coomassie-blått. Hvis det forventede utbytte ikke oppnås i en kromatografisk fremgangsmåte, kan eluerte fraksjoner rekromatograferes på den samme kolonnen, eller alternativt resirkuleres gjennom et tidligere trinn eller en tidligere serie av trinn. Denne ombehandling kan utføres på eluerte sidefraksjoner fra en sats eller flere sammenslåtte satser. Ved ethvert trinn kan konsentrering utføres ved hjelp av ammoniumsulfat-utfelling, isoelektrisk punkt-utfelling og/eller ultrafiltrering. Bufferoppløsninger lages med deionisert vann (DI), reversosmose-vann (RO), eller vann for injek-sjon (WFI).
Trinn I: Kromatografi på kvarternær aminkolonne
pH av råekstraktet av GM-CSF justeres til 5-7,5 med
en buffer slik som IM Bis-tris (bis ^2-hydroksyethyl^ imino-tris-£hydroksymethyl| methan) og/eller 4N HC1. Oppløsningen klares deretter ved sentrifugering og/eller filtrering.Ledningsevnen justeres til under 10 millisiemen/centimeter (mS/cm) ved fortynning med vann eller tilsetning av saltopp-løsning som 4N NaCl. Satsen anbringes på en kvarternær aminkolonne (dvs. en kvarternær aminfunksjonalitet bundet til et tverrbundet dextran-, cellulose-, agarose- eller akryl-støttemateriale, som Q-Sepharose, produsert av Pharmacia, Inc.) ved en anbringelsesmengde som ikke er større enn 50 g protein pr. liter gel. Eluering utføres med en NaCl-gradient i områdét"0-0,4M, eller annet egnet salt i en buffer som 20mM Bis-tris. Egnede fraksjoner kombineres for videre be-handling.
Trinn II: Kromatografi pa sulfonatkolonne
De kombinerte fraksjoner justeres til pH 5, som er innenfor området for isoelektriske punkter av proteinfraksjonene som bestemt ved DIP-kromatografi, med en syre som IM eddiksyre eller 4N HC1, eller en base som 6N NaOH. Lednings-evnen justeres til 13 mS/cm med en buffer som 0,01M eddiksyre justert til pH 5 med NaOH. Oppløsningen filtreres gjennom et 0,2 micron filter og anbringes på en sulfonatkolonne (dvs. en sulfonatfunksjonalitet bundet til et tverrbundet dextran-, cellulose-, agarose- eller akrylstøttemateriale som S-Sepharose) i en mengde som ikke er større enn 20 gram protein pr. liter kolonnemateriale. Eluering utføres med en oppløsning av et salt som NaCl ved en konsentrasjonsgradient opp til 0,5M i en buffer som 20mM eddiksyre -0,13M NaCl, pH 5,0*.. Egnede fraksjoner kombineres for videre behand-ling. Dette kromatografitrinn blir vanligvis gjentatt.
Trinn III; Ammoniumsulfatutfelling
Ammoniumsulfat tilsettes til de kombinerte S-Sepharose-fraksjoner til en sluttkonsentrasjon på 50-60 % metning. Bunnfallet oppsamles ved hjelp av sentrifugering. Bunnfallet kan lagres nedkjølt.
Trinn IV: Gelfiltreringskromatografi
Ammoniumsulfatbunnfallet oppløses i en buffer som lOmM natriumfosfat - 50mM sitronsyre, pH 6, inneholdende opptil 0,35M av et salt som natriumklorid. oppløsn-ingen sentrifugeres og filtreres gjennom et filter med pore-størrelse på 0,2 micron forut for anbringelse på en gelfil-treringskolonne med et fraksjoneringsområde fra tilnærmet 5000 til tilnærmet 100 000 dalton for proteiner, f.eks. Sephacryl S-200 HR (produsert av Pharmacia, Inc.), på forhånd ekvilibrert med den samme buffer. Anbringelsesmengden er ikke større enn 3,5 g protein pr. liter gel. Kolonnen elueres med den.samme buffer og egnede fraksjoner kombineres. Fraksjonene dialyseres mot en buffer som lOmM fosfat - 2mM citrat, pH 7,2. Alternativt kan hele trinn IV utføres i denne siste buffer.
Trinn V: Hovedmengde av GM- CSF
De kombinerte fraksjoner filtreres gjennom et filter med porestørrelse 0,2 micron eller mindre og lagres ved
- 20 °C eller lavere..
Typiske IEF-gelelektroforesefremgangsmåter beskrives i de følgende referanser: 1. Elektroforeseteknikker, Academic Press, (1983) Red.: G.F. Simpson & M. Whittaker, "Recent Developments in Isoelectric-focusing", J.S. Fawcett, s. 57. 2. Isoelektrisk fokusering: Teori, metologi og anvendelse, P.G. Righetti, Elsevier Biomedical Press, (1983) s. 148. 3. Anvendelse av separator-isoelektrisk fokusering innen pH området 4-6, P. Gill, Electrophoresis 6^:282 ( 1985). 4. Hurtig farving av proteiner ved ultratynn isoelektrisk fokusering i polyakrylamidgel,
M.D.Frey, Electrophoresis 3:27-32 (1987).
5. Ultra-tynnskikt-isoelektrisk fokusering av enzymer i leverprøver fra linerler,
M. Germeiner, Electrophoreses _3: 146 ( 1982).
I det følgende presenteres et eksempel som illustrerer fremgangsmåter for separering av GM-CSF basert på DIP-teknikken.
Eksempel 1
Separering av GM- CSF
Trinn 1: Kvaternært amin-kolonnekromatografi
pH av 180 liter råekstrakt av GM-CSF ble justert til pH 6,0 med 3,6 liter IM Bis-tris buffer (pH 6,0) og med 2 liter 4N HC1. Oppløsningen ble klaret ved hjelp av sentrifugering under anvendelse av en Sharples sentrifuge ved en tilføringshastighet på 0,75 liter/minutt. Supernatanten ble fortynnet tilnærmet 1,55 ganger med kaldt deionisert vann for å nå en sluttlig ledningsevne på 5,5 mS/cm. En 12 1 Q-Sepharosekolonne ble ekvilibrert med 10 kolonnevolumer 20mM Bis-tris buffer .med pH 6,0, og 43,6 1 ekstrakt ble anbragt på kolonnen i en anbringelsesmengde på 20 mg protein pr. ml harpiks. Kolonnen (diameter 25 cm) ble vasket ved en gjennom-strømningshastighet på 250 ml/min med 120 1 ekvilibrert buffer. En lineær gradient ble etablert mellom 78 1 20mM Bis-tris buffer inneholdende 0,03 NaCl ved pH 6,0 og 78 1 20mM Bis-tris buffer ved pH 6,0 inneholdende 0,32M NaCl. Fraksjoner (hver på 1,2 1) ble kombinert på basis av gelelektroforese (SDS-PAGE) og det oppsamlede protein (4,9 1) ble kromatografert i trinn 2.
Trinn 2: Sulfonatkolonnekromatografi
De kombinerte fraksjoner (4,9 1) fra trinn 1 ble justert til pH 5 med 49 ml IM eddiksyre (pH 5,0) og lednings-evnen ble justert til 15 mS/cm med 2 1 0,01M eddiksyre, justert til pH 5 med NaOH. Oppløsningen ble filtrert gjennom et 0,2 micron filter og deretter anbragt på en 0,8 1 S- Sepharosekolonne som på forhånd var ekvilibrert med 20mM eddiksyre inneholdende 0,13M NaCl ved pH 5 med en anbringelsesmengde på 4,7 mg/ml kolonnemateriale. Kolonnen ble vasket med 2,4 1 ekvilibreringsbuffer, deretter eluert med en lineær gradient etablert mellom 5,6 1 20mM eddiksyre ved pH 5 inneholdende 0,13M NaCl, og 5,6 1 20mM eddiksyre ved pH 5 inneholdende 0,5M NaCl. Fraksjonene ble kombinert på basis av gelelektroforese. Dette kromatograferingstrinn ble gjentatt.
Trinn 3: Utfelling med ammoniumsulfat
Ammoniumsulfat ble tilsatt til de kombinerte fraksjoner fra trinn 2 (240 1), til en konsentrasjon på 351 g/l (55 % metning). Oppløsningen ble opprettholdt ved 4 °C uten om-røring i 2 timer, og ble deretter sentrifugert ved 4500 rpm i 30 minutter ved 4 °C for å erholde bunnfallet.
Trinn 4: Gelfiltreringskromatografi
Ammoniumsulfatpelleten ble oppløst i 36 ml 18mM natriumfosfat - 2mM sitronsyre, pH 7,2 buffer. Oppløsningen ble sentrifugert ved 4500 rpm i 30 minutter og supernatanten ble filtrert gjennom et 0,2 micron filter. Filtratet ble anbragt på en 1,8 1 Sephacryl S-200HR-kolonne som på forhånd var ekvilibrert med fosfat-citrat pH 7,2 buffer ved en anbringelsesmengde på 0,21 mg/ml gel. Kolonnen ble eluert med 1,9 1 av den samme pH 7,2 buffer. Fraksjoner ble kombinert på basis av proteinbestemmelse.
Trinn 5: Filtrering
De kombinerte fraksjoner fra trinn 4 ble filtrert gjennom et 0,2 micron filter og lagret ved - 20 °C.
Claims (10)
1. Fremgangsmåte for separasjon av en råproteinblanding i en første proteinfraksjon inneholdende et ønsket protein og en andre proteinfraksjon inneholdende ett eller flere, strukturelt nært beslektede, uønskede proteiner med ukjente isoelektriske punkter, omfattende at råproteinblandingen bringes i kontakt med en ionebytterharpiks ved en utvalgt pH,karakterisert vedat ionebytterharpiksen er en sterk ionebytterharpiks og at pH i råproteinblandingen justeres til en pH-verdi som utvelges ved: (a) bestemmelse av de isoelektriske punkter for et flertall proteiner i råproteinblandingen ved hjelp av datasimulering eller isoelektrofokuserende geler; (b) utvelgelse av en pH-verdi som ligger mellom de bestemte isoelektriske punkter for proteinene i fraksjonene som skal separeres, ved hvilken utvalgte pH-verdi proteiner i den første og andre proteinfraksjon er motsatt ladet og kun én av fraksjonene bindes til ionebytterharpiksen.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat fraksjonen inneholdende det ønskede protein bindes til ionebytterharpiksen.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat fraksjonen som er bundet til ionebytterharpiksen deretter elueres.
4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-3,karakterisert vedat det ønskede protein er et rekombinant protein.
5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-4,karakterisert vedat det ønskede protein er granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF), leukocyttinterferon, lymfoblastoidinterferon, veksthormon, superoksyddismutase, erythropoiethin, antithrombin III, lactogen, plasminogen, prolactin, urokinase eller vitamin B12-bindingsprotein.
6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-5,karakterisert vedat det ønskede protein er GM-CSF.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat GM-CSF separeres fra A4 urenheten.
8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-7,karakterisert vedat den første proteinfraksjon bindes til en anionebytterharpiks, elueres og deretter underkastes gelfiltreringskolonnekromatografi.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for separasjon av et ønsket protein fra en nært beslektet urenhet i en råproteinblanding,
karakterisert vedat (a) de isoelektriske punkter for det ønskede protein og urenheten bestemmes; (b) pH i råproteinblandingen justeres til et punkt mellom de isoelektriske punkter for det ønskede protein og urenheten; og (c) råproteinblandingen bringes ved en slik pH i kontakt med en ionebytterharpiks,
hvorved det ønskede protein og urenheten er motsatt ladet og kun én av disse bindes til ionebytterharpiksen.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert vedat det ønskede protein er GM-CSF, urenheten er A4 GM-CSF og pH i råproteinblandingen justeres til pH 5.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11188687A | 1987-10-23 | 1987-10-23 | |
| PCT/US1988/003589 WO1989003840A1 (en) | 1987-10-23 | 1988-10-19 | Method of purifying protein |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO901769D0 NO901769D0 (no) | 1990-04-20 |
| NO901769L NO901769L (no) | 1990-04-20 |
| NO303451B1 true NO303451B1 (no) | 1998-07-13 |
Family
ID=22340970
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO901769A NO303451B1 (no) | 1987-10-23 | 1990-04-20 | FremgangsmÕte for separasjon av en rÕproteinblanding |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0391934A1 (no) |
| JP (1) | JPH0788395B2 (no) |
| KR (1) | KR930008447B1 (no) |
| CN (1) | CN1031943C (no) |
| AT (1) | ATE121418T1 (no) |
| AU (1) | AU626008B2 (no) |
| DE (1) | DE3853610T3 (no) |
| DK (1) | DK99690A (no) |
| ES (1) | ES2070855T5 (no) |
| FI (1) | FI103974B1 (no) |
| HU (1) | HU204537B (no) |
| IE (1) | IE72219B1 (no) |
| IL (1) | IL88118A (no) |
| MY (1) | MY108512A (no) |
| NO (1) | NO303451B1 (no) |
| NZ (1) | NZ226651A (no) |
| OA (1) | OA09787A (no) |
| PT (1) | PT88813B (no) |
| TN (1) | TNSN88111A1 (no) |
| WO (1) | WO1989003840A1 (no) |
| ZA (1) | ZA887862B (no) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989010932A1 (en) * | 1988-05-13 | 1989-11-16 | Amgen Inc. | Compositions and method for treating or preventing infections in animals |
| US7217689B1 (en) | 1989-10-13 | 2007-05-15 | Amgen Inc. | Glycosylation analogs of erythropoietin |
| US5110913A (en) * | 1990-05-25 | 1992-05-05 | Miles Inc. | Antibody purification method |
| US5463029A (en) * | 1992-11-23 | 1995-10-31 | Immunex Corporation | Purification of fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
| JPH09502728A (ja) * | 1993-09-15 | 1997-03-18 | アルファ セラピューティク コーポレイション | α▲下１▼−酸性糖タンパク質の精製方法及び精製物 |
| US5808011A (en) * | 1996-07-01 | 1998-09-15 | Biopure Corporation | Method for chromatographic removal of prions |
| US7304150B1 (en) | 1998-10-23 | 2007-12-04 | Amgen Inc. | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia |
| DK1165119T3 (da) | 1999-04-08 | 2003-12-15 | Genentech Inc | Sammensætning baseret på modsat ladede polypeptider |
| SI2261230T1 (sl) * | 2002-09-11 | 2017-08-31 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Postopek čiščenja proteinov |
| DE10360841A1 (de) * | 2003-12-20 | 2005-07-14 | Henkel Kgaa | Helle, stabile, staub- und geruchsarme Enzymgranulate |
| CN104610422A (zh) * | 2005-03-11 | 2015-05-13 | 惠氏公司 | 弱分配层析的方法 |
| SE529259C2 (sv) * | 2005-08-31 | 2007-06-12 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | Tillverkning av kromarografimatriser, en kromarografimatris, en vätskekromatografikolonn, prcess för att isolera målföreningar och användning av en kromarografimatris för vätskekromatografi |
| EP2117330B1 (en) * | 2006-11-10 | 2017-07-26 | Murray Goulburn Co-Operative Co. Limited | Process for the preparation of angiogenin |
| CN101556261B (zh) * | 2009-05-25 | 2012-01-11 | 北京理工大学 | 微管内等电聚焦和剪断吹出培养测定微生物等电点的方法 |
| CN101556260B (zh) * | 2009-05-25 | 2012-01-11 | 北京理工大学 | 固定化pH梯度毛细管等电聚焦测定微生物等电点的方法 |
| WO2013075740A1 (en) * | 2011-11-23 | 2013-05-30 | Sanofi | Antibody purification method |
| BR112014015101A8 (pt) * | 2011-12-22 | 2021-06-08 | Genentech Inc | métodos para intensificar eficiência de etapas de cromatografia a jusante para purificação de anticorpos |
| DK3301115T3 (da) | 2013-05-06 | 2022-01-31 | Sanofi Sa | Kontinuerlig flertrinsfremgangsmåde til oprensning af antistoffer |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4658018A (en) * | 1984-03-13 | 1987-04-14 | Immunex Corporation | Process for producing homogeneous colony stimulating factor |
| IL76360A0 (en) * | 1984-09-26 | 1986-01-31 | Takeda Chemical Industries Ltd | Mutual separation of proteins |
| ZA872781B (en) * | 1986-05-19 | 1987-10-05 | Immunology Ventures | B-cell stimulating factor |
-
1988
- 1988-10-19 HU HU886264A patent/HU204537B/hu not_active IP Right Cessation
- 1988-10-19 EP EP88909648A patent/EP0391934A1/en active Pending
- 1988-10-19 ES ES88309824T patent/ES2070855T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-19 DE DE3853610T patent/DE3853610T3/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-19 AU AU26247/88A patent/AU626008B2/en not_active Ceased
- 1988-10-19 KR KR1019890701131A patent/KR930008447B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-10-19 EP EP88309824A patent/EP0313343B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-19 JP JP63508950A patent/JPH0788395B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-19 WO PCT/US1988/003589 patent/WO1989003840A1/en active IP Right Grant
- 1988-10-19 AT AT88309824T patent/ATE121418T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-10-20 ZA ZA887862A patent/ZA887862B/xx unknown
- 1988-10-20 NZ NZ226651A patent/NZ226651A/xx unknown
- 1988-10-20 MY MYPI88001190A patent/MY108512A/en unknown
- 1988-10-20 TN TNTNSN88111A patent/TNSN88111A1/fr unknown
- 1988-10-20 IE IE316888A patent/IE72219B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-10-20 PT PT88813A patent/PT88813B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-10-21 CN CN88107266A patent/CN1031943C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-21 IL IL88118A patent/IL88118A/xx not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-04-17 OA OA59777A patent/OA09787A/en unknown
- 1990-04-20 NO NO901769A patent/NO303451B1/no not_active IP Right Cessation
- 1990-04-23 DK DK099690A patent/DK99690A/da unknown
- 1990-04-23 FI FI902017A patent/FI103974B1/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO303451B1 (no) | FremgangsmÕte for separasjon av en rÕproteinblanding | |
| EP0212960B1 (en) | Purification and activation of proteins from insoluble inclusion bodies | |
| US5451662A (en) | Method of purifying protein | |
| Tarnowski et al. | [23] Large-scale purification of recombinant human leukocyte interferons | |
| EP1329461B1 (en) | Method of eliminating human serum albumin polymers | |
| CN109879930B (zh) | 一种重组蛋白的纯化方法 | |
| Khan et al. | Large-scale production of recombinant proteins: human leukocyte interferon | |
| JP6232130B2 (ja) | ダルベポエチンアルファの精製方法 | |
| US11220525B2 (en) | Method for dynamically removing recombinant human nerve growth factor precursor by hydrophobic interaction chromatography | |
| EP0299746B1 (en) | Purification of gm-csf | |
| IE910027A1 (en) | Purification of human interleukin-4 from a secreted escherichia coli mutant | |
| EP0210588B1 (en) | Antitumor polypeptide and a method of preparing the same | |
| CN111925450B (zh) | 一种去除毕赤酵母表达重组蛋白聚集体和/或降解片段的方法 | |
| JP3151867B2 (ja) | 血清アルブミンの精製方法 | |
| Cruz et al. | Preparative isolation of recombinant human insulin-A chain by ion exchange chromatography | |
| EP0446850B1 (en) | Process for purifying recombinant human beta-interferon | |
| RU2132386C1 (ru) | Способ получения рекомбинантного интерферона-гамма человека | |
| KR0140263B1 (ko) | 재조합 인간 인터페론 베타의 정제방법 | |
| EP2768844B1 (en) | Separation of acetylated proteins from unacetylated proteins | |
| CN116948039A (zh) | 一种抗b7h3抗体-细胞因子融合蛋白的纯化方法 | |
| Azadi et al. | Improvements in the Downstream Processing of rhGH production in Pichia pastoris: Optimization of hGH purification using activated carbon clarification in Pichia pastoris | |
| Ghosh et al. | Production of Therapeutic Polypeptides through Escherichia coli: A Perspective | |
| Gu | Purification techniques for human growth hormone (hGH) and an hGH antagonist | |
| Horn et al. | Production of an immunologically and biologically active GIP in Escherichia coli through expression of a chemically synthesized gene |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |
Free format text: LAPSED IN APRIL 2001 |