JP3151867B2 - 血清アルブミンの精製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物培養液等から血
清アルブミン（ＳＡ）を精製する方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】ＳＡは動物体内、特に肝臓で大量に合成
される血漿蛋白質であり、コロイド浸透圧の維持や種々
の血液蛋白質あるいは低分子物質の運搬などの生理作用
に重要な役割を担っている。近年では、ＳＡは薬剤とし
て大量に使用されている。

【０００３】例えばヒト血清アルブミン（Human Serum
Albumin,ＨＳＡ）は、熱傷、ネフロ−ゼ、出血性ショッ
ク等に対し、静注投与される蛋白製剤であり、その需要
は極めて大きくなっている。

【０００４】このように需要の大きいＨＳＡ等につい
て、従来はヒト血漿から製造されているが、原料不足か
ら生じる製造量の限界や病原体混入の恐れ等から、非血
漿由来のＨＳＡ等を製造する必要が生じている。

【０００５】遺伝子組換え法はこのような非血漿由来Ｓ
Ａの製造には好適な方法であり、例えば特開昭２−２７
６５８９号、特開平３−８３５９５号又はBiotechnolog
y,8,p 42,1990 年等には、酵母を宿主として、大量製造
が要求されるＨＳＡ等（ＨＳＡのヒトへの投与量は、通
常５から１０ｇである）を効率的に製造する方法が記載
されている。

【０００６】このように、遺伝子組換え法によりＳＡを
製造した場合、宿主である微生物により製造されたＳＡ
は培養液に遊離されることが多いが、同時に培養液中に
は、宿主に由来する他の蛋白質、脂質、多糖類も遊離さ
れているため、培養液からＳＡを精製する操作が必要と
なる。

【０００７】ＳＡの精製方法については、例えばエタノ
−ルを用いる方法（Cohnら、J.Amer.Chem.Soc.68,p459,
1946年、Kistler-Nitschmannら、Vox Sang.,7,p 414,19
62年Fosterら、Methods of Plasma Protein Fractionat
ion,Curling,J.M.,ed.,Academic Press,London,p17,198
0 年）、ポリエチレングリコ−ルによる沈殿と各種クロ
マトグラフィ−を組み合わせる方法（Hao ら、Methods
of PlasmaProtein Fractionation,Curling,J.M.,ed.,Ac
ademic Press,London,p57,1980 年）、ジエチルアミノ
エチル（ＤＥＡＥ）基又はカルボキシメチル（ＣＭ）基
を有するイオン交換ゲルを使用する方法（Curling ら、
Methods of Plasma Protein Fractionation,Curling,
J.M.,ed.,Academic Press,London,p77,1980 年）又は、
脂肪酸、ヘパリン、ブル−デキストラン、シバクロンブ
ル−、３ＧＡ等をリガンドとしたアフィニティクロマト
グラフィ−による方法（伴野丞計、動物成分利用集成・
陸産動物編、Ｒ＆Ｄプランニング、p 166,1987年）等
の、血漿からのＨＳＡの精製方法が知られている。

【０００８】

【従来技術の課題】前記したように、従来ＳＡの精製方
法が知られていない分けではない。しかしながらこれら
の精製方法は、基本的に血漿中のＳＡを精製するための
方法であって、遺伝子組換え法で微生物により製造され
たＳＡを微生物培養液から精製するための方法ではな
い。血漿成分と微生物培養液成分は大きく性質が異なっ
ているため、血漿成分からの精製方法により微生物培養
液からの精製が効率よく実施し得ないのである。

【０００９】前記した血漿からのＳＡの精製方法の中で
も、シバクロンブル−等をリガンドとしたアフィニティ
−クロマトグラフィ−は、ＳＡとの親和性を利用するも
のであり、微生物培養液からのＳＡの精製にも有用であ
ることが予想される（Travisら、Biochem.J.,157,p301,
1976年）。しかしながら、アフィニティ−クロマトグラ
フィ−の手法は、高価な官能基を使用する必要から精製
工程のコスト高を招くことになり、また、そのような官
能基を担持するゲルの保存管理を厳密に行う必要があ
り、かつ、ゲルの保存管理を厳密に行ったとしても、能
力劣化しやすい等の改善すべき点がある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、遺伝子組
換え法で微生物により製造されたＳＡを、微生物培養液
から効率的に精製する方法について鋭意検討を行った結
果、金属キレ−トクロマトグラフィ−を使用することで
目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至
った。即ち本発明は、金属キレ−トクロマトグラフィ−
を使用する微生物培養液中の血清アルブミンの精製方法
である。以下本発明を詳細に説明する。

【００１１】本発明は、例えば大腸菌、酵母、動物細胞
等を宿主として製造されたＳＡを、当該宿主の分泌物を
夾雑物として含む培養液から精製する方法である。本発
明で精製されるＳＡは、いずれの宿主により製造された
ものであっても制限はない。

【００１２】ところで、ＳＡにはヒトＳＡ（ＨＳＡ）、
ラビットＳＡ（ＲＳＡ、同一出願人による平成３年特許
願第１９４９８４号に記載）等、動物種により種々のＳ
Ａが存在することが知られている。しかし、ＨＳＡやＲ
ＳＡにおいては、２４アミノ酸残基からなるプレプロ配
列、３５個のシステイン残基の位置、金属との結合に関
与すると考えられるＮ末端３番目のＨｉｓ残基、更には
精製標品の等電点は同一であり、かつ、全体としても７
５％のホモロジーを有している。従って本発明は、単に
ＨＳＡの精製方法に止まらず、例えばウシ、ヤギ、ラッ
ト、マウス等、ＨＳＡ以外のＳＡにも適用し得る精製方
法である。

【００１３】本発明で使用する金属キレ−トクロマトグ
ラフィ−は、金属を担持するゲルを使用し、その金属と
ＳＡのキレ−ト反応を利用することでＳＡを精製する方
法である。金属を担持するゲルの基材はどのようなもの
でも制限はなく、それが使用される溶媒系で安定な物質
であれば良い。担持される金属は、例えば亜鉛、ニッケ
ル、銅、コバルト等を例示することができるが、中でも
亜鉛はＳＡと強固に結合することが可能であるため、本
発明では亜鉛を担持したゲルを使用することが好まし
い。なお、ゲルは、通常の金属キレ−トクロマトグラフ
ィ−の手法に従って適当なカラムに充填した状態で使用
するが、場合によりビ−カに入れた状態で使用しても、
培養液の中に投入するような形で使用しても良い。この
場合には、ＳＡを精製する当然の操作の一つとして、ゲ
ルを培養液から分離すれば良い。

【００１４】本発明では、培養液をトリス−塩酸緩衝液
を使用してｐＨ６．０から８．０程度に調整しておくこ
とにより、より効率的にその中のＳＡを金属を担持する
ゲルと吸着させることが可能である。吸着したＳＡをゲ
ルから分離し、溶出させるには、例えばイミダゾ−ル等
の低分子アミンを加えるか又はｐＨを下げる操作等に従
えば良い。しかし、再現性、操作性、分離特性、毒性等
の観点から、グリシンを含む溶液を分離液として使用す
ることが好ましい。

【００１５】遺伝子組換え法で製造されたＳＡを含む微
生物培養液であっても、本発明ではそれを試料として金
属を担持したゲルと接触させてＳＡを精製することが可
能である。しかしながら、精製効率を高めたり又は操作
を簡単にするため、例えば培養液について遠心分離、限
外濾過、硫安沈殿等を行い、微生物菌体や菌体破砕物等
を除去しておくことが好ましい。

【００１６】本発明の精製方法は、それ単独でもＳＡを
精製することが可能であるが、より高純度の精製を実現
するためには、例えばゲル濾過クロマトグラフィ−、イ
オン交換クロマトグラフィ−等を行ってＳＡを粗精製し
たものを試料として使用するか、又は本発明の精製を行
った後、このようなクロマトグラフィ−を実施すること
がことが好ましい。このようなクロマトグラフィ−はＳ
Ａを変性させる恐れがなく、かつ迅速に実施可能な方法
であり、発明の精製方法の前又は後処理に好適である。
ここで、ゲル濾過クロマトグラフィ−はＳＡの分子量を
もとに、イオン交換クロマトグラフィ−はＳＡの物性を
もとにこれを分離するものである。従って、本発明の前
又は後処理としては、これら２種のクロマトグラフィ−
を実施することが特に好ましい。

【００１７】例えばゲル濾過クロマトグラフィ−では、
排除限界分子量が蛋白質換算で１０万以上であり、その
分子量が５万から１０万付近の蛋白質の分離に優れたも
のを使用することが好ましい。ゲルの基材等に特別の制
限はないが、ＳＡの吸着を防ぐために親水性シリカゲ
ル、親水性ビニルポリマ−ゲル等の、親水性ゲルを使用
すると良い。一方、イオン交換クロマトグラフィ−で
は、ＳＡの物性から考えて陰イオン交換ゲルを使用する
と良い。このようなゲルとしては、例えばジエチルアミ
ノエチル（ＤＥＡＥ）基や四級アミノエチル（ＱＡＥ）
基を担持するゲルを使用することが例示できる。

【００１８】

【実施例】以下に本発明を更に詳細に説明するために実
施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。

【００１９】実施例１ 同一出願人による、平成３年特許願第１９４９８４号の
記載に従って作製したウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）
を酵母で製造するためのプラスミド（ｐＹＲＳＡ３）を
ＢａｍＨＩによって線状化し、スフェロプラスト法（Ｃ
ｒｅｇｇら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５，
ｐ３３７６，１９８５年）により酵母（Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＴＳ１１５株、特開昭６３−１６
４８９１号）を形質転換し、メタノール資化性のＭｕｔ
⁻株を調製した（特開昭６３−１６４８９１号）。

【００２０】この形質転換菌をグリセロ−ル培地で増殖
させ、メタノ−ル培地に転換して５日間培養を続けてＲ
ＳＡを製造、培養液中に遊離させた。

【００２１】実施例２ 実施例１で得られた酵母培養液を遠心分離して菌体や菌
体破砕物を除去した試料について、限外濾過膜（東ソ−
（株）製、ＴＳ−３００）で濾過して高分子物質を除去
し、更に限外濾過膜（東ソ−（株）製、ＴＳ−１０）で
濃縮した。

【００２２】濃縮した試料を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に対して４℃で一晩透析し、同緩衝液
で平衡化したイオン交換カラム（ＤＥＡＥ ＴＯＹＯＰ
ＥＡＲＬ ６５０（東ソ−（株）製）に供し、０〜０．
５Ｍ ＮａＣｌグラジエントにより溶出させた。

【００２３】ＲＳＡの溶出画分を ％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
を行って確認した後、これを５０ｍＭ ＮａＣｌ及び５
％（ｗ／ｖ）酢酸亜鉛を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．０）で平衡化したキレ−トカラム（ファル
マシア社製、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）に供し、同緩衝液で洗浄した後
０〜０．２Ｍグリシンのグラジエント溶出によりＲＳＡ
を溶出させた。

【００２４】イオン交換カラムからの溶出画分の様子を
図１に、キレ−トカラムからの溶出画分の様子を図２に
示す。図１及び図２によれば、イオン交換カラムで精製
した段階（前処理）に比較して本発明の精製方法を実施
した後には、夾雑物の存在が認められない、純度の高い
ＲＳＡが取得できたことが分かる。

【００２５】実施例３ 実施例２で得られた透析物を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．０）で平衡化したイオン交換カラム（東ソ
−（株）製、ＤＥＡＥ−５ＰＷ）に供し、０〜０．５Ｍ
ＮａＣｌグラジエントにより溶出させた。

【００２６】ＲＳＡの溶出画分を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを行って確認し、これを５０ｍＭＮａＣｌ及び５％
（ｗ／ｖ）酢酸亜鉛を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化したキレ−トカラム（東ソ−
（株）製、キレ−ト５ＰＷ）に供し、同緩衝液で洗浄し
た後０〜０．１４Ｍグリシンのグラジエント溶出により
ＲＳＡを溶出させた。

【００２７】溶出したＲＳＡ画分について、更に１００
ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化したゲル濾過カラム（東ソ−（株）製、Ｇ
３０００ＳＷＸＬ）を２本直列に連結したカラムに供し
た。

【００２８】また、イオン交換カラム、キレ−トカラム
又はゲル濾過カラムからの溶出画分を１０％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥに供し、それそれの夾雑物の様子を観察した。

【００２９】イオン交換カラムからの溶出画分の様子を
図３に、キレ−トカラムからの溶出画分の様子を図４
に、ゲル濾過カラムからの溶出の様子を図５に、これら
３つの溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を図６
に示す。これらの図からは、イオン交換カラムで精製し
た段階（前処理）に比較して本発明の精製方法を実施し
た後には大幅に夾雑物が減少し、更にゲル濾過カラムで
の処理（後処理）により、高度に精製されたＲＳＡが取
得できたことが分かり、図６からは、最終的に得た標品
では夾雑物バンドが存在しないことが分かる。

【００３０】実施例４ 実施例１で使用した酵母をホモジナイザ−で破砕し、こ
れをマウスに免疫して抗ピキア酵母ポリクロ−ナル抗体
を調製し、実施例３で得た３つの溶出画分についてWest
ern blotting試験（Towbinら、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,76,p4350,1979年）を行った。

【００３１】結果を図７に示す。図７からは、単にイオ
ン交換カラムによる精製操作を実施して得たＲＳＡ標品
では酵母に由来する夾雑物が大量に含まれているもの
の、本発明のキレ−トカラムにより精製した後のＲＳＡ
標品は、夾雑物が除去された高純度標品であることが分
かる。

【００３２】

【発明の効果】本発明によれば、迅速かつ簡単に、微生
物培養液中のＳＡを精製することができる。従来の血漿
からのＳＡの精製方法が、血漿成分からのＳＡの精製を
目的としていたのに比較して、本発明は遺伝子組換えに
おいて宿主として使用された微生物に由来する蛋白質、
脂質、多糖類からのＳＡの精製方法を提供するものであ
る。

【００３３】本発明はそれ自体効率的なＳＡの精製方法
であるが、前又は後処理としてイオン交換クロマトグラ
フィ−やゲル濾過クロマトグラフィ−を実施すること
で、より高純度のＳＡを提供し得る精製方法である。本
発明の精製方法は、人体等への投与量が５〜１０ｇと大
量であり、従って当然に夾雑物を可能な限り排除しなけ
ればならないＨＳＡ等を精製する場合に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例２におけるイオン交換カラムか
らの溶出画分のクロマトグラムである。図中、溶出ピ−
クの上に示したコの字型の記号は、ＲＳＡ画分としてキ
レ−トカラムに供した画分を示している。また図中、０
Ｍから始まる線はグラジエントの様子を示すものであ
る。

【図２】図２は、実施例２におけるキレ−トカラムから
の溶出画分のクロマトグラムである。図中、溶出ピ−ク
の上に示したコの字型の記号は、ＲＳＡ画分として取得
した画分を示している。また、図中０Ｍから始まる線は
グラジエントの様子を示すものである。

【図３】図３は、実施例３におけるイオン交換カラムか
らの溶出画分のクロマトグラムである。図中、溶出ピ−
クの上に示したコの字型の記号分は、ＲＳＡ画分として
キレ−トカラムに供した画分を示している。図中、０Ｍ
から始まる線はグラジエントの様子を示すものであり、
Injectは溶出液の添加開始を示し、溶出の様子を示す曲
線の下の数字は溶出液の添加開始からの時間を、溶出ピ
−クの上の数字は各ピ−クの溶出時間を示している。

【図４】図４は、実施例３におけるキレ−トカラムから
の溶出画分のクロマトグラムである。図中、溶出ピ−ク
の上に示したコの字型の記号は、ＲＳＡ画分としてゲル
濾過カラムに供した画分を示している。図中、０Ｍから
始まる線はグラジエントの様子を示すものであり、Inje
ctは溶出液の添加開始を示している。

【図５】図５は、実施例３におけるゲル濾過カラムから
の溶出画分のクロマトグラムである。図中、溶出ピ−ク
の上に示したコの字型の記号は、ＲＳＡ画分として取得
した画分を示している。図中、溶出の様子を示す曲線の
下の数字は、カラムに試料を添加してからの時間を、溶
出ピ−クの上の数字は各ピ−クの溶出時間を示してい
る。

【図６】図６は、実施例３における、イオン交換カラム
からの溶出画分、キレ−トカラムからの溶出画分及びゲ
ル濾過カラムからの溶出画分についてのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅの結果を示すものである。Ｍは分子量マ−カ−につい
ての結果であり、１は実施例１において調製された培養
液濃縮液についての結果であり、２はイオン交換カラム
からの溶出画分についての結果であり、３はキレ−トカ
ラムからの溶出画分についての結果であり、４はゲル濾
過カラムからの溶出画分についての結果である。図中、
図の左横の数字は分子量マ−カ−についての結果から推
定される分子量を示し、ＲＳＡの矢印はＲＳＡのバンド
を示すものである。

【図７】図７は、実施例４の結果を示すものである。図
中１はイオン交換カラムからの溶出画分についての結果
であり、２はキレ−トカラムからの溶出画分についての
結果であり、３はゲル濾過カラムからの溶出画分につい
ての結果である。図中、図の左横の数字は別途実施した
分子量マ−カ−についての結果から推定される分子量で
あり、ＲＳＡの矢印はＲＳＡのバンドを示すものであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 21/02 C07K 14/765 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】亜鉛を担持したゲルを使用する金属キレー
   トクロマトグラフィーを使用する、微生物培養液中の血
   清アルブミンの精製方法。
2. 【請求項２】血清アルブミンをトリス−塩酸緩衝液中で
   亜鉛を担持した金属キレートゲルに吸着させ、後にグリ
   シンを含む溶出液で溶出させることを特徴とする、請求
   項１の精製方法。