ES2070855T5

ES2070855T5 - Metodo para purificar una proteina.

Info

Publication number: ES2070855T5
Application number: ES88309824T
Authority: ES
Inventors: David Naveh; John Chu-Tay Tang
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 1987-10-23
Filing date: 1988-10-19
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2008-10-19
Also published as: CN1031943C; KR930008447B1; ES2070855T3; IE72219B1; HUT52783A; EP0313343A1; EP0313343B1; AU626008B2; HU204537B; IE883168L; FI103974B; DE3853610T3; ZA887862B; FI902017A0; NO303451B1; HU886264D0; JPH03500649A; NO901769L; CN1032661A; DK99690A

Abstract

TECNICA DE CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO PARA PURIFICAR PROTEINAS CRUZADAS, QUE CONTIENEN INPUREZAS MUY SIMILARES, EN LA QUE SE DETERMINAN LOS PUNTOS ISOELECTRICOS DE LA PROTEINA DESEADA Y DE LAS INPUREZAS. TAMBIEN SE INCLUYE LA APLICACION DE LA TECNICA A LA PURIFICACION DE GM - CSF USANDO UNA RSINA CAMBIADORA DE CATIONES.

Description

Método para purificar una proteína.

Antecedentes

La cromatografía de intercambio iónico es una técnica cromatográfica convencional, inherentemente suave, de bajos costes, de gran capacidad y que se puede cambiar de escala fácilmente. Sin embargo, hasta la fecha no ha habido una técnica útil para separar impurezas relacionadas estrechamente de proteínas, especialmente proteínas de ADNr.

Un ejemplo de una proteína de ADNr tal es el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) humano recombinante. Los ADN complementarios (ADNc) de GM-CSF, factores que apoyan el crecimiento y el desarrollo de granulocitos y macrófagos en la sangre, se han clonado y secuenciado recientemente en un número de laboratorios. Además, GM-CSF no recombinante se ha purificado a partir del material sobrenadante de cultivos de la línea celular Mo (descrita en la Patente de EE.UU. 4.438.032), y se han secuenciado los primeros dieciséis aminoácidos del extremo N-terminal, Gasson et al., Science, vol. 226, págs. 1339-1342 (1984). Entre las GM-CSFs humanas, se ha observado heterogeneidad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos. Por ejemplo, a nivel de aminoácidos, se ha observado tanto treonina como isoleucina en la posición 100 en relación con la alanina del extremo N-terminal, sugiriendo que pueden existir varias formas alélicas, o polimorfos, de GM-CSF en poblaciones humanas.

En la actualidad, una variedad de métodos están disponibles para la preparación de novo y la clonación de ADNc, tales como ADNc para GM-CSF, y para la construcción de genotecas de ADNc. A modo de ejemplo, el ARNm total se extrae a partir de células (p. ej., una fuente de células T humanas no transformadas) que producen polipéptidos que muestran la actividad deseada. Los ADNc bicatenarios se pueden construir a partir de este ARNm total, utilizando la transcripción inversa iniciada con un cebador para hacer primero el complemento de cada secuencia de ARNm, y a continuación cebando para la síntesis de la segunda cadena. Posteriormente, los ADNc se pueden clonar uniéndolos a los vectores adecuados de plásmidos o bacteriófagos mediante colas homopoliméricas complementarias o extremos cohesivos creados con segmentos enlazadores que contienen los sitios de restricción apropiados y después transformando un hospedador adecuado. Una amplia gama de sistemas de expresión (es decir, combinaciones de vectores de expresión- hospedadores) se puede utilizar para producir las proteínas purificadas mediante el procedimiento de esta invención. Los posibles tipos de células hospedadoras incluyen, pero no están limitados a, bacterias, levaduras, células de insectos, de mamíferos y similares.

Se han descrito varios métodos para extraer el GM-CSF a partir de las células hospedadoras y posteriormente purificarlo, pero GM-CSF no se purifica siempre adecuadamente con buen rendimiento y manteniendo la actividad biológica.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método para separar GM-CSF de GM-CSF \Delta4, que comprende: poner en contacto una mezcla de proteínas que comprende GM-CSF y GM-CSF \Delta4 con una resina de intercambio iónico fuerte, caracterizado porque la mezcla de proteínas se ajusta a un valor de pH seleccionado al cual sólo uno de GM-CSF y GM-CSF \Delta4 es unido por la resina y el otro no, en el que dicho valor de pH seleccionado yace entre, y está alejado sólo unas unidades fraccionarias de pH de, los puntos isoeléctricos determinados de GM-CSF y GM-CSF \Delta4, por lo que, a dicho valor de pH seleccionado, el GM-CSF y GM-CSF \Delta4 poseen cargas eléctricas muy pequeñas, están cargados de manera opuesta, y sólo uno de GM-CSF y GM-CSF \Delta4 se une a la resina de intercambio iónico, y recuperar GM-CSF.

El pH de la mezcla de proteína en bruto se ajusta a un pH dentro del intervalo de los puntos isoeléctricos de las fracciones de proteínas, que se van a separar, de modo que hay una diferencia de carga neta amplificada entre las fracciones.

El método de la presente invención incluye la etapa de determinar los puntos isoeléctricos de la proteína pura que se va a recuperar y de la impureza que se va a separar y determinar el pH dentro del intervalo de los puntos isoeléctricos de forma que la proteína pura y la impureza están cargadas de forma opuesta y existe una diferencia amplificada entre dichas cargas. Los puntos isoeléctricos de las fracciones de proteínas se determinan preferentemente por simulación por ordenador o utilizando geles de isoelectroenfoque.

En un método particularmente preferido, la proteína se purifica poniendo en contacto secuencialmente la proteína con:

A. una resina de intercambio aniónico tal como una resina de amina cuaternaria unida preferentemente a un dextrano reticulado, celulosa, agarosa o soporte acrílico;

B. una resina de intercambio catiónico que tiene preferentemente una funcionalidad sulfonato unida a un dextrano reticulado, celulosa, agarosa o soporte acrílico; y

C. unos medios de filtración en gel que tienen preferentemente un intervalo de fraccionamiento de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 100.000 daltons para proteínas.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a una técnica de separación cromatográfica por intercambio iónico de alta resolución para purificar GM-CSF. En esta técnica, la cromatografía se realiza próxima a los puntos isoeléctricos de la proteína pura que se quiere recuperar y de la impureza que se quiere separar, preferentemente a un pH en el que existe una diferencia amplificada (p. ej. la máxima) entre las cargas en la proteína pura y la impureza, y en el que las moléculas están cargadas de forma opuesta (polarizadas). Esta diferencia de carga neta amplificada, que tiene lugar sólo cerca del punto isoeléctrico, se puede utilizar para seleccionar las condiciones adecuadas de la cromatografía de intercambio iónico, dando por resultado la unión selectiva a la resina de intercambio iónico con casi ausencia de cargas. Por comodidad, esta técnica se denomina posteriormente cromatografía de Punto Isoeléctrico-Delta (DIP, del inglés Delta Isoelectric Point).

Las impurezas de ADNr relacionadas estrechamente con una proteína de ADNr deseada son difíciles de separar de la proteína en bruto por cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa, cromatografía de afinidad por quelación de metales, así como otros tipos convencionales de cromatografía. Estas impurezas relacionadas estrechamente son normalmente proteínas con un peso molecular y una distribución de la carga parecidos al producto proteico de interés, normalmente perdiendo un (o varios) aminoácido cargado. Los ejemplos son impurezas que son productos de la degradación proteolítica formadas mellando un extremo peptídico que es accesible a la proteolisis, así como a la interacción cromatográfica. Dichas impurezas se consideran inseparables por cromatografía de intercambio iónico convencional.

La técnica de cromatografía DIP difiere de la cromatografía de intercambio iónico convencional en distintos aspectos. DIP se lleva a cabo con un pH en el que las proteínas que se van a separar poseen cargas eléctricas netas muy pequeñas. Esto se consigue introduciendo la resina de intercambio iónico a un pH que sólo difiere en unidades de pH fraccionarias del punto isoeléctrico (pI) de la proteína deseada y sus impurezas estrechamente relacionadas. Esto está en contraposición con la cromatografía de intercambio iónico convencional, que se realiza con valores de pH en los que las proteínas de interés poseen cargas eléctricas fuertes, y en la que la alimentación se lleva a cabo con aproximadamente 1-2 unidades totales de pH distintas del pI, un orden de magnitud mayor que en la cromatografía DIP.

El pH con el que se realiza DIP se prevé por simulaciones en ordenador de la densidad de la carga en función del pH para la proteína y las impurezas relacionadas, o por técnicas analíticas tales como el uso de geles de enfoque isoeléctrico. En la cromatografía de intercambio iónico convencional, el pH de la alimentación se determina por la carga neta total en la proteína deseada, y las condiciones de alimentación se optimizan empíricamente, si tan siquiera. Se necesita experimentación tediosa mediante ensayos para determinar las condiciones de elución.

Al contrario de la cromatografía de intercambio iónico convencional, en la que no se han hecho intentos de polarizar las impurezas relacionadas con la proteína deseada, en la cromatografía DIP el pH de alimentación se selecciona de forma que permanece entre el pI de la impureza relacionada estrechamente y el de la proteína deseada, y de esta manera, la proteína deseada consigue una carga eléctrica opuesta a la impureza polarizada.

Para la cromatografía DIP, se impone un entorno de alta fuerza iónica para reducir las interacciones proteína-proteína durante la alimentación, y se utiliza un intercambiador iónico fuerte. En la tecnología convencional de intercambio iónico, para obtener una resolución máxima se prefieren resinas de intercambio iónico débiles con condiciones de alimentación con fuerza iónica débil. La débil interacción proteína-proteína durante la alimentación en la cromatografía DIP da como resultado uniones altamente selectivas y resolución extremadamente fina durante la fase de alimentación, y la separación adicional se consigue durante la elución normal con gradiente. En la cromatografía de intercambio iónico convencional, la unión no selectiva tiene lugar durante la alimentación y por ello sólo se consigue la separación de grupos durante la alimentación; la mayor parte de la separación se obtiene durante la fase de elución, bajo fuertes interacciones proteína-proteína resultantes de las altas densidades de proteínas unidas localmente a la matriz sólida.

La simulación en ordenador de la densidad de carga en función del pH se puede realizar usando un programa a disposición comercialmente y un ordenador apropiado (p. ej. ordenador de gran potencia, microordenador u ordenador personal). Por ejemplo, un ordenador VAX (Digital Corp.) se puede utilizar con un paquete de programas, tal como "Polypeptide Analysis System" de Intellegentics, Inc., copyright 1981, 1982, 1983, 1984, 1985 y 1986. Utilizando este programa la secuencia primaria de aminoácidos es la entrada de datos y la distribución de la densidad de carga se puede obtener con valores de pH diferentes. Alternativamente, el pI se puede determinar utilizando la electroforesis en gel de enfoque isoeléctrico (IEF) según los procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Esta patente se refiere a la aplicación de la cromatografía DIP es el siguiente procedimiento para la purificación de la GM-CSF humana recombinante. Un aspecto con particular dificultad de la purificación de GM-CSF, es la separación del producto de degradación de GM-CSF al que le faltan cuatro aminoácidos N- terminales y es conocido como Delta 4 (\Delta;4). GM-CSF se purifica normalmente con una combinación de cromatografía de intercambio aniónico en una columna de aminoetilo cuaternario, cromatografía de filtración en gel y cromatografía de fase inversa, cuyo procedimiento no es eficaz para separar la impureza \Delta4.

La cromatografía DIP, sin embargo, ha tenido éxito al separar la impureza \Delta4. Primero, se comparó una simulación por ordenador de la proteína GM-CSF intacta con la simulación por ordenador de la impureza \Delta4, y se determinó que el pI de GM-CSF es 5,24 y el pI de la impureza \Delta4 es 4,98. A continuación, tenía que ser determinado un pH de trabajo dentro de este intervalo con el que (a) GM-CSF consiga una carga opuesta a la impureza \Delta4, y (b) la magnitud relativa de la diferencia entre las cargas está suficientemente amplificada para permitir la separación. Una diferencia de carga diminuta de 1 carga/molécula (1 ch/mol) entre la GM-CSF intacta y la impureza \Delta4 existe a lo largo de un amplio intervalo de pH (es decir, a pH 0,5, las cargas respectivas son +16 y +15 y a un pH 11,5, las cargas son -11,1 y -12). Sin embargo, como se había pronosticado con el modelo por ordenador, cerca pH 5, la diferencia de carga entre GM-CSF intacta y la impureza \Delta4 está amplificada (es decir, la diferencia de carga relativa está aumentada) y las moléculas están polarizadas: a pH 5, GM-CSF tiene +0,9 ch/mol, mientras que la impureza \Delta4 posee sólo -0,1 ch/mol. Por tanto, se cumplen las dos condiciones necesarias para DIP: polarización de carga y amplificación.

Para mejorar adicionalmente la separación de GM-CSF intacta de las impurezas residuales de bajo pI de las células hospedadoras de E. coli y de los factores proteolíticos desestabilizantes, durante la alimentación se empleó fuerza iónica alta. Esta disminuye las interacciones electrostáticas entre las moléculas. Por ello, bajo esas condiciones de alta fuerza iónica, se prefiere por ello un intercambiador de cationes fuerte a pH 5, p. ej. una columna tal y como una funcionalidad de sulfonato unida a un dextrano reticulado, celulosa, agarosa o soporte acrílico (p. ej., S-Sepharose, fabricada por Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ).

Se encontró que con el uso de tal columna de resina de intercambio catiónico, se realizaba la separación en una etapa de la impureza \Delta4 no deseada, varias impurezas de pI bajo, una impureza de 20K de E. coli no separada previamente por otros procedimientos, y un factor proteolítico, estabilizando de esta manera el producto final. Realizando la cromatografía de intercambio catiónico se consigue la pureza de GM-CSF desde aproximadamente 50% hasta aproximadamente 90%, con rendimientos del 70-80%. Cuando se continua con una etapa de filtración en gel, la pureza de GM-CSF que se alcanza es aproximadamente del 99%.

Lo siguiente es una descripción general de un procedimiento para aislar y purificar GM-CSF. La cromatografía de intercambio aniónico, preferentemente en una columna de aminoetilo cuaternario, es una etapa convencional en la purificación de GM-CSF y se realiza para separar impurezas de alto pI a partir del material sobrenadante después de matar las células hospedadoras. La operación de filtración en gel, también convencional, se realiza para separar impurezas con peso molecular alto y bajo. Aunque a continuación se describe un procedimiento en el que la fracción de proteína purificada está unida a la resina de intercambio iónico, también se considera que en ciertas realizaciones de la invención la fracción de proteína impura puede estar unida a la resina de intercambio iónico fuerte. De forma similar, aunque la descripción y el ejemplo se dirigen al paso continuo de la proteína en bruto a través de la columna de resina de intercambio iónico, también se contemplan otros métodos de puesta en contacto, tales como al puesta en contacto por tandas.

Comentarios generales: las operaciones se realizan a 2-15ºC, a menos que se indique de otra forma. La concentración de proteína se determina en cada operación por un ensayo de fijación de azul Coomassie. Si no se alcanza el grado deseado de purificación en ningún procedimiento cromatográfico, las fracciones eluidas se pueden cromatografiar de nuevo en la misma columna, o, alternativamente, se pueden reciclar a través de una etapa previa o una serie de etapas previas. Este reprocesamiento se puede hacer en fracciones eluidas secundarias a partir de un lote o de una agrupación de lotes. La concentración se puede realizar en cualquier etapa mediante precipitación con sulfato de amonio, precipitación en el punto isoeléctrico y/o ultrafiltración. Las soluciones tampones están hechas con agua desionizada (DI), agua para ósmosis inversa (RO), o agua para inyección (WFI).

Etapa I Cromatografía en columna de amina cuaternaria

El pH del extracto en bruto de GM-CSF se ajusta a 5-7,5 con un tampón tal como Bis-tris(bis[2-hidroxietil]imino-tris-[hidroximetil]metano) 1 M y/o HCl 4 N. La solución se clarifica a continuación por centrifugación y/o filtración. La conductividad se ajusta por debajo de 10 milisiemens/centímetro (mS/cm) por dilución con agua o adición de una solución de sal como NaCl 4 N. El lote se aplica a una columna de amina cuaternaria (es decir, una funcionalidad de amina cuaternaria unida a dextrano reticulado, celulosa, agarosa o soporte acrílico, tal como Q-Sepharose, fabricado por Pharmacia Inc.) con una alimentación no superior a 50 gramos de proteína por litro de gel. La elución se realiza con un gradiente en el intervalo de NaCl 0-0,4 M u otra sal apropiada en un tampón como Bis-tris 20 mM. Las fracciones apropiadas se combinan para un procesamiento adicional.

Etapa II Cromatografía en columna de sulfonato

Las fracciones combinadas se ajustan a pH 5, que está dentro del intervalo de los puntos isoeléctricos de las fracciones de proteínas, tal y como se determinan por cromatografía DIP, con un ácido como ácido acético 1 M o HCl 4 N o una base como NaOH 6 N. La conductividad se ajusta a 13 mS/cm con un tampón tal como ácido acético 0,01 M ajustado a pH 5 con NaOH. La solución se filtra a través de un filtro de 0,2 micrómetros y se carga sobre una columna de sulfonato (es decir, una funcionalidad de sulfonato unida a dextrano reticulado, celulosa, agarosa o soporte acrílico, tal como S-Sepharose) con una alimentación no superior a 20 gramos de proteína por litro de material de columna. La elución se realiza con una solución de una sal tal como NaCl con un gradiente de concentración superior a 0,5 M en un tampón como ácido acético 20 mM, NaCl 0,13 M, pH 5,0. Las fracciones apropiadas se combinan para un procesamiento adicional. Esta etapa de la cromatografía se repite típicamente.

Etapa III Precipitación con sulfato de amonio

El sulfato de amonio se añade a las fracciones de S-Sepharose combinadas, hasta una concentración final con 50% a 60% de saturación. El precipitado se recoge por centrifugación. El precipitado se puede almacenar bajo refrigeración.

Etapa IV Cromatografía de filtracion en gel

El precipitado de sulfato de amonio se disuelve en un tampón tal como un tampón de fosfato sódico 10 mM, ácido cítrico 50 mM, pH 6, que contiene hasta 0,35 M de una sal tal como cloruro sódico. La solución se centrifuga y se filtra a través de un filtro del intervalo de 0,2 micrómetros antes de la alimentación en una columna de filtración en gel que tiene un intervalo de fraccionamiento desde aproximadamente 5.000 hasta aproximadamente 100.000 daltons para proteínas, p. ej., Sephacryl S-200 HR (fabricado por Pharmacia, Inc.), pre-equilibrado con el mismo tampón. La alimentación no es superior a 3,5 gramos de proteína por litro de gel. La columna se eluye con el mismo tampón y se combinan fracciones apropiadas. Las fracciones se dializan contra un tampón tal como un tampón fosfato 10 mM, citrato 2 mM, pH 7,2. Alternativamente, la operación IV completa puede ser realizada en el último tampón.

Etapa V GM-CSF en masa purificada

Las fracciones combinadas se filtran a través de un filtro de tamaño de poros 0,2 micrómetros o menor y se almacenan a –20ºC o inferior.

Procedimientos típicos de electroforesis en gel IEF se describen en las siguientes referencias:

1.: ELECTROPHORETIC TECHNIQUES, Academic Press, (1983) Ed: G.F. Simpson & M. Whittaker "Recent Developments in Isoelectric-focusing" J.S. Fawcett, pág. 57

2.: ISOELECTRIC-FOCUSING: Theory, Methodology and Application P.G. Righetti, Elsevier Biomedical Press, (1983) pág. 148

3.: APPLICATION OF SEPARATOR ISOELECTRIC-FOCUSING WITHIN pH RANGE 4-6, P. Gill, Electrophoresis 6:282 (1985)

4.: RAPID STAINING OF PROTEINS IN ULTRA THIN ISOELECTRIC FOCUSING IN POLYACRYLAMIDE GEL, M.D. Frey, Electrophoresis 3:27-32 (1982)

5.: ULTRA THIN LAYER ISOELECTRIC-FOCUSING OF ENZYMES IN LIVER SAMPLES OF WAGTAILS, M. Germeiner, Electrophoresis 3:146 (1982)

A continuación, se presenta un ejemplo que ilustra los procedimientos para purificar GM-CSF basados en la técnica DIP.

Ejemplo 1 Purificacion de GM-CSF

Paso 1

Cromatografía en columna de aminas cuaternarias

El pH de 180 litros de extracto de GM-CSF en bruto se ajustó a pH 6,0 con 3,6 litros de tampón Bis-tris 1 M (pH 6,0) y con 2,0 litros de HCl 4 N. La solución se clarificó por centrifugación usando una centrífuga de Sharples con un caudal de alimentación de 0,75 l/min. El material sobrenadante se diluyó aproximadamente 1,55 veces con agua fría desionizada para alcanzar una conductividad final de 5,5 mS/cm. Una columna de 12 litros de Q-Sepharose se equilibró con 10 volúmenes de columna de tampón Bis-tris 20 mM a pH 6,0, y 43,6 litrosde extracto se aplicaron a la columna con una alimentación de 20 mg de proteína por ml de resina. La columna (diámetro 25 cm) se lavó con un caudal de 250 ml/min con 120 litros de tampón de equilibrio. Se estableció un gradiente lineal entre 78 litros de tampón Bis-tris 20 mM que contenía NaCl 0,03 M a pH 6,0 y 78 litros de tampón Bis-tris 20 mM a pH 6,0 que contenía NaCl 0,32 M. Las fracciones (1,2 litros cada una) se combinaron basadas en electroforesis en gel (SDS-PAGE) y la proteína reunida (4,9 litros) se cromatografió en la Etapa 2.

Paso 2

Cromatografía en columna con sulfonato

Las fracciones combinadas (4,9 litros) de la Etapa 1 se ajustaron a pH 5 con 49 ml de ácido acético 1 M (pH 5,0) y la conductividad se ajustó a 15 mS/vm con 2 litrosde ácido acético 0,01 M ajustado a pH 5 con NaOH. La solución se filtró a través de un filtro de 0,2 micrómetros y después se cargó en una columna de S-Sepharose de 0,8 litros, previamente equilibrada con ácido acético 20 mM que contenía NaCl 0,13 M a pH 5 con un caudal de alimentación de 4,7 mg/ml de material de columna. La columna se lavó con 2,4 litros de tampón de equilibrio, a continuación se eluyó con un gradiente lineal establecido entre 5,6 litros de ácido acético 20 mM a pH 5 que contenía NaCl 0,13 M y 5,6 litros de ácido acético 20 mM a pH 5 que contenía NaCl 0,5 M. Las fracciones se combinaron basadas en electroforesis en gel. Esta etapa de la cromatografía se repitió.

Paso 3

Precipitación con sulfato de amonio

Se añadió sulfato de amonio a las fracciones combinadas de la Etapa 2 (240 litros), dando una concentración de 351 g/l (55% de saturación). La solución se mantuvo a 4ºC sin mezclar durante 2 horas, después se centrifugó a 4.500 rpm durante 30 min a 4ºC para obtener el precipitado.

Paso 4

Cromatografía de filtración en gel

El sedimento de sulfato de amonio se disolvió en 36 ml de tampón fosfato sódico 18 mM, ácido cítrico 2 mM, pH 7,2. La solución se centrifugó a 4.500 rpm durante 30 min y el material sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,2 micrómetros. El filtrado se introdujo en una columna de 1,8 litros de Sephacryl S-200HR previamente equilibrada con tampón fosfato-citrato pH 7,2 con un caudal de alimentación de 0,21 mg/ml de gel. La columna se eluyó con 1,9 litros del mismo tampón con pH 7,2. Las fracciones se combinaron basadas en el ensayo de proteínas.

Paso 5

Filtración

Las fracciones combinadas de la Etapa 4 se filtraron a través de un filtro de 0,2 micrómetros y se almacenaron a –20ºC.

Claims

1. Un método para separar GM-CSF de GM-CSF \Delta4, que comprende poner en contacto una mezcla de proteínas que comprende GM-CSF y GM-CSF \Delta4 con una resina de intercambio iónico fuerte, caracterizado porque la mezcla de proteínas se ajusta a un valor de pH seleccionado al cual sólo uno de GM-CSF y GM-CSF \Delta4 es unido por la resina y el otro no, en el que dicho valor de pH seleccionado yace entre, y está alejado sólo unas unidades fraccionarias de pH de, los puntos isoeléctricos determinados de GM-CSF y GM-CSF \Delta4, por lo que, a dicho valor de pH seleccionado, el GM-CSF y GM-CSF \Delta4 poseen cargas eléctricas muy pequeñas, están cargados de manera opuesta, y sólo uno de GM-CSF y GM-CSF \Delta4 se une a la resina de intercambio iónico, y recuperar GM-CSF.

2. El método de la reivindicación 1, el que el GM-CSF se une a una resina de intercambio aniónico, se eluye y después se somete a cromatografía en columna de filtración en gel.

3. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que el pH de la mezcla de proteínas en bruto se ajusta a pH 5.