JP2000501939A - 組み換えヒトインターロイキン―８の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 種々な方法で得られた組み換えヒトインターロイキン−８を精製する方法及びＧＭＰ条件下でのインターロイキン−８の製造のための方法の可能な使用が記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】 組み換えヒトインターロイキン−８の精製法 本発明は、種々の方法で得られた組み換えヒトインターロイキン−８の精製法 に関する。 組み換えヒトインターロイキン−８の精製法は既に公知である。多くの研究グ ループが種々の精製法を開発している。精製法は、主として選択されているクロ マトグラフィ工程において異なっており、次の方法が記載されている：引き続く 逆相ＨＰＬＣを伴うモノＳ (Lind1ey，I.; Aschauer，H.; Seifert，J.-M.; Lam，C.; Brunowski，W.; Kownatzki，E.; Thelen，M.; Peveri,P.; Dewald，B.; von Tscharner，V.; Walz，A.; Baggiolini，M. (1988): Synthesis and expression in E. coli of the gene encoding monocyte-derived neutrophil-activating factor: Biological equivalence between natural and recombinant neutrophil-activating factor. Proceedings of the National Academy of Science，USA，85)、 ヘパリンファロースに関するセファセル流過に引き続くセファクリルＳ−２００ 及びＣＭ−３ＳＷカラム(Matsushima,K.;Oppenheimer,J.J.(1989):Interleukin- 8 and MCAF:novel flammatory cytokines inducibleby IL i and TNF.Cytokine 1)、引き続くToyopearl HW-55を用いるＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂ（Furuta, R.;Yamagishi,J,;Kotani,H,;Sakamoto,F.;Fukui,T,;Matsui,Y.;Sohmura,Y.;Yama da,M.;Yoshimura,T.:Lars on,C,G,;Oppenheim,J.J.;Matsushima,K.(1989):Production and characterizati on of recombinant humanneutrophil chemotactic factor.Journal of Biochemi stry,Vol.106,No.3）及び酸性珪酸塩に引き続くへパリンセファロースＣＬ−６ Ｂ及びウトロゲルＡＣＡ ５４による浴吸着（Van Damme,J,;Van,Beeumen,J.;Co nings,R,;Decock,B.;Billau,A.(1989):Purification of granulocyte chemotact ic peptide/interleukin-8 reveals N-terminal sequence heterogeneity simil ar to taht of β-thronmboglobulin,European Journal of Biochemistry 181） 。商業的規模でのＧＭＰ条件下でのインターロイキン−８の製造のための流下処 理は未知である。 これら公知の方法の欠点は、収率が低く、インターロイキン−８の純度の欠如 及び同時に高い材料コストである。公知方法のもう一つの欠点は、それらの使用 が研究の目的にのみであること、即ち、それらはＧＭＰに適合する製法に移行す ることが不可能であることである。 ところで、今般、これら公知方法の欠点を克服する組み換えインターロイキン −８の精製法を開発した。 インターロイキン−８の精製のための本発明の方法は、次の工程を特徴とする ： ａ）先ず、緩衝溶液中で細胞を溶解させ、 ｂ）生じるリゼート（lysate：溶解物）を、次のよう な繰り返しクロスーフロー限外濾過： ｉ）第１濾過工程で、インターロイキン−８をより大きい付随成分から分離す る、 ｉｉ）第２濾過工程で、より小さい成分から分離する による分子量排除の手段で処理し、 ｃ）方法工程ｂ）からの緩衝された濾液をカチオン交換クロマトグラフィを用い て高分解能精製を行い、この際、インターロイキン−８分子の高い正に荷電され た表面を、適用及び溶離ｐＨ値がインターロイキンー８がなお結合しているのに 充分高く選択される様な形で使用し、次いで、 ｄ）方法工程ｃ）からのインターロイキン−８溶離液の緩衝された溶液を、ゲル 濾過、透析又は限外濾過により交換し、かつ最後に ｅ）方法工程ｄ）を経て得られたインターロイキン−８溶液を凍結乾燥させる。 方法工程ａ）による細胞溶解は、細胞内で形成された蛋白質の場合にのみ、酵 素的（例えばリゾチームを用いる）、化学的（例えば有機溶剤を用いる）に必要 であり、他の細胞溶解の物理的方法（例えば超音波を用いる）も可能である。商 業的な細胞溶解のためには物理的方法が一般に有利である（Schwedes and Bun ge,1988 Mechanische Zellaufschlussverfahren,Jahrbuch der Biotechnolo gie,VCH Verlagsgesellsc haft mhB,Weinheim,Germany）。これら物理的方法の内、ボールミルを別として 、殊に高圧均質化（Agerkvist and Enfors,1990,Sauer et al.,1988）が、 細胞溶解のための確立され、かつ良好に記載されている方法として挙げられる。 前記の種々の細胞溶解法が、本発明の精製法のために使用できる。 本発明の方法工程ａ）のために、高圧均質化を選択するのが有利である。この 細胞の溶解は、２０００〜１５０００ｐｓｉの圧力及び１〜６サイクルで、より 好ましくは５０００〜７０００ｐｓｉの圧力及び３〜５サイクルで、最も好まし くは、６０００ｐｓｉ及び４サイクルで行う。この方法で、細胞、例えばＥ．コ リー細胞の９５％より多くが溶解される。 方法工程ｂ）による繰り返しクロスーフロー限外濾過による分子量排除は、原 則的に、１及び３ＫＤ ＮＭＷＬ（Nominal Molecular Weight Limit:公称分 子量限界）のフィルターモジュールでの濾過により減少できる（Cheryan,M.(198 6):Ultrafiltration Handbook,Thechnomic Publishing Company,Inc.,Lancas ter,Pennsilvania,USA）。この濾過は物理的濾過法（Vlauck,W.R.A.;Mueller,H. A.(1994):Grundoperationen chemischer Verfahrenstechnik,Deutscher Verl ag fuer Grundstoffindustrie,Leipzig,Federal Republic of Germany）で あり、不溶性蛋白質の分離除 去のための流下処理で屡々用いられている。従って、クロス−フロー限外濾過は 、全細胞及び細胞破片の分離除去及び内包体の分離での流下処理において屡々使 用されている。可溶性付随物質、殊に付随蛋白質の分離除去の例は、実験室規模 での限外濾過に関して記載されている（Cheryan,M.(1986):Ultrafiltration Ha ndbook,Thechnomic Publishing Company,Inc.,Lancaster,Pennsilvania,USA） 。しかしながら、可溶性付随物質の分離除去のためのクロス−フロー限外濾過の 商業的使用は公知ではなく、明白でもない。 方法工程ｂ）で、異なるカットオフを有する２クロス−フロー限外濾過の連続 的装置が、特定の分子寸法及び／又は特定の分子量範囲の分離のために使用され る。この装置は、第１濾過工程でインターロイキン−８をより大きい付随成分か ら分離し、第２濾過工程で濃縮し、より小さい成分から分離するように選択する 。できるだけ明確にインターロイキン−８及び付随成分の分離を得るために種々 の可能性が利用される。これは、第１のクロスフロー限外濾過で、インターロイ キン−８の分子量に比べて名目上小さいカットオフを有する膜の濾液中でインタ ーロイキン−８を得るために好適な操作パラメータを選択することにより可能で ある。操作パラメータの内、膜及びカットオフのタイプは決定的なパラメータで あり、これは原則としてインターロイキン−８分子をこの膜を通すために必要で ある。本発明の方法で、膜のカットオフは、インターロイキン−８の分子量より 下回るべきである。これら操作パラメータの変更の際に、カットオフが増加する と、膜はインターロイキン−８に対して浸透可能になる。 第１濾過工程ｉ）でのクロス−フロー限外濾過を、３ＫＤのカットオフで実施 するのが有利である。 操作パラメータの変更は、トランスメンブラン圧の増加の形で、例えば循環量 を増加するか又は添加剤、例えば有機溶剤、例えばプロパノール、ブタノールな ど、塩、例えば塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム等、カオトロピック剤、例え ば尿素、グアニジニウム塩等、界面活性物質、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ ＳＤＳ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ^R)、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ^R）等の添加によ り濾過速度を減少することにより、又はｐＨ値を変更することにより行うことが できる。本発明の方法の利点は、操作パラメータの変更による膜を通るターゲッ ト分子の物質移行の制御の可能性に帰する。従って、操作パラメータを増加する 前に、得られるターゲット分子を有しない濾液は分離除去できるので、更なるプ ロセスで、付随成分のいくつかは既に分離されている。この場合に、この膜を通 るインターロイキン−８のコントロールされた物質移行は、循環量を増加するこ とにより達成できる。 第２のクロスフロー限外濾過で、インターロイキン −８の分子量よりも小さいカットオフは、適当な操作パラメータの選択により得 ることができる。原則的に、ここで、第１クロスフロー限外濾過に既に記載され ていると同じ可能性が適用する。この場合に、インターロイキン−８は、充分に 小さいカットオフを有する膜を選択することにより、即ち適当な操作パラメータ を選択することにより、より小さい付随成分から分離することができた。 第２濾過工程ｉｉ）におけるクロス−フロー限外濾過は、０．１〜１.５ＫＤ 、好ましくは１ＫＤのカットオフを用いて実施される。 方法工程ｃ）で、インターロイキン−８の高い正の全体的電荷を結果として生 じる緩衝条件に基づき、カチオン交換クロマトグラフィによる高分解能精製工程 を、適用及び溶離ｐＨをインターロイキン−８がなお結合していることができる ように充分高く選択するような方法で実施する。溶離は、８〜１０のｐＨ範囲、 好ましくはｐＨ９.５で、塩化ナトリウム濃度を増加することにより行う。この クロマトグラフイ条件の利点は、非常に僅かのみの汚染物（付随蛋白質及びエン ドトキシン）がなお結合可能であるので、クロマトグラフィ材料の高い能力、溶 離液の高い純度及び高い収率にある。 方法工程ｄ）で実施されるコンデイシヨニングで、インターロイキン−８の溶 離液の緩衝溶液の変換は、 透析を用いて行なうのが有利である。 本発明の方法を用いて、インターロイキン−８又は例えば原核生物表現系、例 えばＥ．コリー細胞、真核生物表現系、例えば酵母細胞、殊にピチア・パストリ ス（Pichia Pastoris）、昆虫細胞系、殊にバクロウイルス（Baculovirus）− 感染昆虫細胞又は永久昆虫細胞系を用い、形質転換された咄乳動物細胞、例えば ＣＨＯ及びＢＨＫを用い、かつトランスジェニック動物、例えば牛又はヤギのミ ルクから得られた組み換えインターロイキン−８を精製することができる。 種々の表現系における遺伝子のクローニング及び表現の方法は、当該技術分野 の者に公知であり、関連文献から知ることができる。 方法工程ｂ）の第１濾過工程ｉ）におけるクロスフロー限外濾過は、２相で実 施することができる。 クロス−フロー限外濾過系の構成、殊にこのフィルターの表面積及び膜のタイ プに依存して、このフィルターの表面積は、生産規模のために５００〜１０００ ０ｃｍ²であってよい。従って、生じるトランスメンブラン圧： Ｐトランスメンブラン＝ （Ｐイン−Ｐアウト）／２ −Ｐ濾液 は、１〜１５０ｐｓｉの範囲内にあってよい。従って、操作パラメータ循環量及 び濾過速度は、１〜１０リットル／ｍｉｎ及び１〜２０ｍｌ／ｍｉｎの範囲内で 変動する。このことは 第１濾過工程の第１及び第２相の双方にあてはまる。 このクロス−フロー限外濾過において、第１相では１〜４リットル／ｍｉｎの 循環量、５〜８ｍｌ／ｍｉｎの濾過速度及び１〜２０ｐｓｉのトランスメンブラ ン圧を用い、第２工程では、３〜６リットル／ｍｉｎの循環量、１０〜１５ｍｌ ／ｍｉｎの濾過速度及び２０〜５０ｐｓｉのトランスメンブラン圧を使用するの が有利である。 この限外濾過時に、第１相では２〜３リットル／ｍｉｎの循環量、６.３ｍｌ ／ｍｉｎの濾過速度及び１０ｐｓｉのトランスメンブラン圧を用い、第２工程で は、４〜５リットル／ｍｉｎの循環量、１２．７ｍｌ／ｍｉｎの濾過速度及び３ ５ｐｓｉのトランスメンブラン圧を使用するのが殊に有利である。 この限外濾過時に、第１相で、２〜３リットル／ｍｉｎの循環量、６．３ｍｌ ／ｍｉｎの濾過速度及び１０ｐｓｉのトランスメンブラン圧を用い、第２工程で 、４〜５リットル／ｍｉｎの循環量、１８.７ｍｌ／ｍｉｎの濾過速度及び３５ ｐｓｉのトランスメンブラン圧を使用することも殊に有利である。 この場合のフィルターの表面積は、好ましくは、３ＫＤのカットオフで、２１ ００ｃｍ²である。 方法工程ｂ）の第２濾過工程ｉｉ）におけるクロスフロー限外濾過では、フィ ルターのタイプに応じて、 このフィルターの表面積は、５００〜１００００ｃｍ２であってよい。従って、 生じるトランスメンブラン圧： Ｐトランスメンブラン＝ （Ｐイン−Ｐアウト）／２ −Ｐ濾液 は、５〜１５０ｐｓｉの範囲内にあってよい。従って、操作パラメータ循環量及 び濾過速度は、０．５〜１０リットル／ｍｉｎ及び１〜２０ｍｌ／ｍｉｎの範囲 内で変動する。 方法工程ｂ）の第２濾過工程ｉｉ）によるクロス−フロー限外濾過において、 ０．５〜３リットル／ｍｉｎの循環量、４〜６ｍｌ／ｍｉｎの濾過速度及び８〜 １２ｐｓｉのトランスメンブラン圧を使用するのが有利である。 方法工程ｂ）の濾過工程ｉｉ）によるクロス−フロー限外濾過において、１〜 ２リットル／ｍｉｎの循環量、５ｍｌ／ｍｉｎの濾過速度及び１０ｐｓｉのトラ ンスメンブラン圧を使用するのが殊に有利である。この場合のフイルターの表面 積は、好ましくは、１ＫＤのカットオフで、７００ｃｍ²である。 更に、インターロイキン−８の収率を高めるために、方法工程ｂ）の第１濾過 工程ｉ）で得られた細胞破片を、 ａ）先ず尿素を用いて８Ｍ尿素溶液に適合させることができ、次いで、 ｂ）この尿素溶液を溶解されなかったインターロイキン−８を可溶化するために 二重の高圧均質化を行うことができ、かつ最後に ｃ）こうして得られた生成物を、方法工程ｃ）、ｄ）及びｅ）に従って更に精製 することができる。 ａ）及びｂ）に記載の８Ｍ尿素溶液は、９．５のｐＨ至適に適合させるのが有 利である。 ｂ）で実施される高圧均質化は、２０００〜１００００ｐｓｉの圧力及び１〜 ６サイクル、好ましくは４０００〜８０００ｐｓｉの圧力及び１〜３サイクルで 、殊に有利には６０００ｐｓｉの圧力及び２サイクルで実施される。 本発明の方法により精製されたインターロイキン−８は、研究、治療及び診断 の目的に使用することができる。 特に、インターロイキン−８を精製するための本発明の方法は、ＧＭＰ条件下 での使用のため、即ちＧＭＰに適合するインターロイキン−８生産のために好適 である非常に経済的な方法である。 その収率は、可溶性蛋白質に対して約５０％である。これは、ＧＭＰに従った 細菌的に発現される組み換え蛋白質の生産のための他の商業的精製法と比べて極 めて高く、経済的使用のためにより満足しうるものより大きい。従って、同じ結 果を得るために、リットル規模で複数のクロマトグラフィ工程が必要である慣用 法に比べて明確な利点が認められる。ＤＭＦ材料を用いる少なくとも４クロマト グラフィ工程を用いる慣用法での条件下で、かつ１工程当たり平均８０％の収率 で、理論的にはこの収率は０．８４＝０．４１又は４１％であると概算すること ができる。細胞破片及びＤＮＡを除去する結果としてのエントレインメント損失 及び再緩衝に基づく損失は、この概算には算入しなかった。１０〜２０％は、Ｇ ＭＰ条件下で細菌的に発現される蛋白質の商業的に良好な仕上げのために受け入 れることのできる収率と言われている。 この生産において負担される材料経費に関する限り、第１に、細菌的組み換え 蛋白質の仕上げが全体の生産コストの５０〜７０％になることのありうるいくつ かの一般的評価が引用されうる。仕上げコストの主な割合は、経費集中的なクロ マトグラフィ材料に起因する。この種の典型的方法では、この方法を用いる場合 におけると同じ収率で高純度の蛋白質を得るためには、リットル規模の複数のク ロマトグラフィカラムが使用されている。開発されたこの方法の主な利点の一つ は、古典的なリットル規模に比べてミリリットル規模で高純度の蛋白質を単離す るためにただ一つのクロマトグラフィ工程が必要であることである。従って、典 型的な精製法に比べて経費がかなり削減される。 図面の説明 第１図は、総蛋白質濃度がサイクルの数の関数であ ることを示している。全ての数学的モデルが、相応する式及びパラメータと一緒 に示されている。 第２図は、時間に対する濾液ＩＩＩ中のインターロイキン−８の全量を示して いる。 次の実施例は、本発明の精製法を説明するが、本発明は実施された例のみに限 定されるものではない。 作業例 １．インターロイキン−８のクローニング及び発酵 蛋白質の７２アミノ酸形を コードするヒトインターロイキン−８遺伝子の部分をプラスミドｐＭＳ１１９Ｅ Ｈ（Ｌ）中に挿入した。生じる表現ベクターｐＩＬ８／ｔａｃを菌株Ｅ．コリー ＴＧＩ中に形質転換させた。インターロイキン−８がこうして得られたＥ．コリ ークローンＴＧＩ（ｐＩＬ８／ｔａｃ）中に発現された。発酵条件は次の通りで ある： ２０μｌを、−７０℃でのグリセロール中のＥ．コリ−ＴＧＩ（ｐＩＬ８／ｔ ａｃ）連続培養液から取り、Ｌ−媒体（トリプトファン（Difco）１０ｇ／ｌ、 酵母エキス（Difco）５ｇ／Ｉ、ＮａCl １０ｇ／ｌ）及びアンピシリン２００ ｍｇ／ｌを有する寒天培養液中、３７℃で４８時間恒温保持した。次いでコロニ ーをＬ−媒体５ｍｌでリンスした。この培養液の１００μｌを、Ｌ−媒体１００ ｍｌを含有する５００ｍｌ振動フラスコに接種するために使用した。この最初の 前培養物を、３７℃で、１８０ｒｅｖ／ｍｉｎの振動数 で１６時間恒温保持した。この前培養物の１０ｍｌを、第２の前培養物をＬ−媒 体１０００ｍｌを含有する２リットル振動フラスコ中に接種するために使用した 。前記条件下に４８時間恒温保持した。この第２の前培養物の１０００ｍｌをＬ −媒体２００リットルを含有する３００リットル発酵槽に接種するために使用し た。この発酵槽を、１５０ｒｅｖ／ｍｉｎ、２８℃で撹拌し、かつ５ｍ³／ｈで 空気導入した。４時間発酵の後に、ＩＰＴＧ ０．２５ミリモル／ｌの添加によ りインターロイキン−８発現を誘導し、更に８時間発酵を継続させた。次いで、 ０．１％の濃度までのオクタノールの添加により、細菌細胞を殺した。オクタノ ールの添加の後に、内容物を、４５ｒｅｖ／ｍｉｎで２分間撹拌し、更に撹拌せ ずに５分間恒温保持した。セパレータを用い、６６００×ｇ及び２００リットル ／ｈで細胞を収穫し、２００リットルから７リットルまで濃縮させた。この７リ ットルから遠心分離により細菌細胞ペレットが得られた。 ２．インターロイキン−８の精製 ２．１ 高圧均質化による細胞溶解（方法工程ａ） 細胞物質４２３．３５ｇ（湿った重量）を、５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔ ＲＩＳ、ｐＨ８．０中に懸濁させて最終量１７３０ｍｌとし、高圧均質化を用い て溶解させ、再懸濁された細胞物質のこの溶解を、６０００ｐｓｉの圧力、４サ イクルで実施した。細胞溶解を 、総蛋白質測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＬＩＳＡを用いて分析した。高圧均質 化でのサイクル数の関数としての総蛋白質濃度の状態を図１に示す。可溶性総蛋 白質の濃度で見ると、この細胞溶解は、一次反応であることが見て取れる。総蛋 白質濃度の曲線は、サイクル数が増加するにつれて勾配の著しい減少を示してい る。これは、４サイクルでの適当な細胞溶解の点を選択するのが有利である。更 に、この細胞溶解を記載するための経験的適合を見つけることができる。インタ ーロイキン−８濃度は、個々のサイクル中で、第１サイクルの後の０．１５ｍｇ ／ｍｌから第４サイクルの後の０．１７ｍｇ／ｍｌへの僅かな変化のみを示した 。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、サイクル数の増加に伴う個々のバンドの間の良好な分離 効果（これは、おそらくＤＮＡのフラグメント化に帰因する）が観察された。可 溶性蛋白質の全量はＢＣＡ法により６６４３．２ｍｇであることが測定された。 この量のインターロイキン−８分は、控え目な評価で４．４％に相当している。 ２．２ 繰り返しクロス−フロー限外濾過による分子量排除（方法工程ｂ） 方法工程ａ）からの細胞溶解物の完全ホモジェニテートを、３ＫＤのカットオ フを有する膜を用いるクロス−フロー限外濾過した。得られた濾液を、同じ技術 により１ＫＤのカットオフで更に処理した。２相で３ＫＤ限外濾過を実施し、こ の濾過を、２１００ｃｍ² のフイルターの表面積を有する３ＫＤ ＮＭＷＬ（公称分子量限界）変性ＰＥＳ 膜を用いて実施した。選択した操作条件は次の通りであった： 濾過緩衝液： ５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ Ｎａ Ｃｌ、２０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ９． ５ 第１相： 循環量： ２〜３リットル／ｍｉｎ 濾過速度： ６．３ｍｌ／ｍｉｎ トランスメンブラン圧： １０ｐｓｉ ２容量変換の後に、濾過条件を増加させた。 第２相： 循環量： ４〜５リットルｌ／ｍｉｎ 濾過速度： １２．７ｍｌ／ｍｉｎ トランスメンブラン圧： ３５ｐｓｉ 濾液Ｉ ８６２０ｍｌ及び保留物Ｉ １１１０ｍｌが得られた。ＢＣＡを用い る総蛋白質の分析では、細胞溶解から全可溶性蛋白質の当初６６４３．２ｍｇが 示され、なお、保留物Ｉ中に２５０８．６ｍｇが、かつ濾液Ｉ中に２２９３．３ ｍｇが再発見できた。可溶性インターロイキン−８の分析では、逆相Ｃ４カラム を用いる分析ＨＰＬＣの後に、保留物Ｉ及び濾液Ｉ中の濃度は、０．００５ｍｇ ／ｍｌより低い検出限界以下であった。ＥＬＩＳＡ法を用いる更なる分析では、 保留物Ｉ中の０．００２ｍｇ／ｍｌのインターロイキン−８の濃度を示した（イ ンターロイキン−８の２．２ｍｇ）。 濾液Ｉを、ＩＫＤ濾過で更に処理した。ＩＫＤクロスーフロー限外濾過を、７ ００ｃｍ²のフィルター表面積を有する１ＫＤ ＮＭＷＬ（公称分子量限界）変 性ＰＥＳ膜を用いて実施した。選択した操作条件は次の通りであった： 循環量： １〜２リットルｌ／ｍｉｎ 濾過速度： ５．０ｍｌ／ｍｉｎ トランスメンブラン圧： １０ｐｓｉ 濾液Ｉ ８６２０ｍｌを保留物ＩＩ ６００ｍｌまで濃縮させ、濾液ＩＩ ８ ０２０ｍｌを生じさせた。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いる保留物ＩＩの分析では、インターロイキン−８の分子 量範囲での強いバンドを示した。更なる実質的により弱い２バンドが、インター ロイキン−８より低い分子量範囲に検出できた。総蛋白質に基づくインターロイ キン−８の純度は、おおざっぱにＨＰＬＣ逆相溶離プロフィルから２５％である と評価できた。Ｅｄｍａｎによる保留物ＩＩ中のインターロイキン−８のＮ−末 端配列決定は、同様に純粋を確認した。ＥＬＩＳＡ法を用いる濃度を測定するた めの更なる分析では、保留物ＩＩに関して、インターロイキン−８ ０．３１ｍ ｇ／ｍｌの濃度（インターロイキン−８の１８６ｍｇ）を示し、濾液ＩＩはイン ターロイキン−８ ０．０００１ｍｇ／ｍｌ以下（インターロイキン−８の＜０ ．８ｍｇ）の濃度を示した。１回の前処理の後に、＞２５％の純度を有する再発 見率６ ３．２％が測定された。 ２．３ カチオン交換クロマトグラフィを用いる高分解能精製（方法工程ｃ） ４５ｍｌＣＭ−セファロースカラム（ＦＰＬＣ系を有するＸＫ２６カラム）に 、保留物ＩＩ６００ｍｌを、９０％キャパシテイの装荷率で装入した。この４５ ｍｌ ＣＭ−セファロースカラムのクロマトグラフィプログラムを次の表中に示 す： 逆相Ｃ４−ＨＰＬＣを用いて分析を実施し、９０％より高い収率が明らかにな り；もはや付随蛋白質は検出できなかった。段階的溶離からのインターロイキン −８溶離液として、分析的逆相Ｃ４−ＨＰＬＣに従って、インターロイキン−８ の１７３．４ｍｇの全量が得られた。この溶離液の濃度は、２．１ｍｇ／ｍｌで 、比較的高く、もはや付随蛋白質は検出できなかった。弱いカチオン交換体を用 いるクロマトグラフィの間にエンドトキシン及びＤＮＡも通常分離除去されるの で、インターロイキン−８溶離液を純度（ゲルの過負荷を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ ）及びエンドトキシン（ＬＡＬテスト）に関して試験した。クマシー蛋白質染色 を伴う過負荷ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に、付随蛋白質も検出できなかった。このエ ンドトキシン除去は、非常に有効であることを証明した。エンドトキシンの濃度 は、インターロイキン−８の１．５ｐｇ／μｇより低く、検出限界以下であった 。溶離液をコンデイシヨニングし、最終生成物コントロールに供した。 ２．４ 透析（方法工程ｄ） インターロイキン−８溶離液をＰＢＳに対して透析させ、１．００ｍｇ／ｍｌ の濃度に調節した。３．５ＫＤの膜カットオフでこの透析を実施した。インター ロイキン−８溶離液を、１、２．５及び２０時間に渡って、各時間で、パロジェ ン不含のＰＢＳ緩衝液５リットルに対して透析させた。透析の後にインターロイ キン−８の１４１．７ｍｇが再発見でき、これは８２％の収率に相当した。透析 の後に濃度を、パイロジェン不含のＰＢＳ緩衝液を用いてインターロイキン−８ １． ００ｍｇ／ｍｌに調節し、参照蛋白質としてのＢＳＡを用いるＰｉｅｒｃｅ Ｂ ＣＡ 蛋白質分析により確認した。 ２．５ 凍結乾燥（方法工程ｅ） ＰＢＳ中のインターロイキン−８ １．００ｍｇ／ｍｌの濃度の確立の後に、 凍結乾燥を実施した。この目的のために、この溶液を１．００ｍｌずつの適当な 小瓶（１瓶当たりのインターロイキン−８ １．００ｍｇ）に分け、−７０℃で 低温凍結させた。−７０℃で１２時間の後に、凍結乾燥を３６時間実施した。サ ンプル瓶を封鎖し、−７０℃で貯蔵した。ランダムに選択したサンプルを最終生 成物コントロールに供した。 ３．精製プロセスの収率 本発明の精製プロセスの収率は、約５０％である。 これは、細菌的に発現された蛋白質に関する意想外に高い収率である。次の表に 、この精製プロセスの分析をまとめる： ^*細胞リゼートの可溶性インターロイキン−８の２９４．１ｍｇに対する。 二重クロスーフロー限外濾過での至適化実験は、６３．２％の収率が８０％以 上まで増加できることを示していた。従って、至適化された精製プロセスは、６ ５％までの収率を提供できる。 ４．このプロセスの生産特性 製品コントロールのために、純粋な最終製品上で、同定、濃度、純度、エンド トキシン含有率及び生物学的活性に関してし検査を実施し、これらのすべては、 次のように、ヒト用のＧＭＰ生産に関するＦＤＡ規定に適合した： ４．１ 同定 ＥｄｍａｎによるＮ−末端配列決定（１９５０） インターロイキン−８の所望の配列は、明確に確認できた。 ポリ−及びモノ−クローナルなインターロイキン−８抗体でのドットブロット このドットブロットで、精製された内容物の信号強度と濃度との間の直接的線 状関係を示した。 ４．２ 濃度 Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ 蛋白質検定 Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ 蛋白質検定及び参照蛋白質としてのＢＳＡを用いる総 蛋白質濃度の測定は、１．００ｍｇ／ｍｌを示した。 ４．３ 純度 ＨＰＬＣ逆相 Ｃ４カラムを用いる異種蛋白質に関するＨＰＬＣ逆相試験では、２１４ｎｍで 付随蛋白質は検出できなかった。 銀染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ 銀染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥも唯一のインターロイキン−８バンドのみを示 した。他のバンドは見つけることができなかった。 クマシー染色を伴うＤＳ−ＰＡＧＥ及びバンド強度測定 クマシー染色を伴うＤＳ−ＰＡＧＥの分析及び引き続くバンド強度測定は、精 製された装入物に関して９ ９％より大きい純度を示した。 ４．４ エンドトキシン ＬＡＬ試験 このＬＡＬ試験は、インターロイキンー８ １．００ｍｇ／ｍｌの濃度で、イ ンターロイキン−８の１．５ｐｇ／μｇ以下のエンドトキシン含有率を示した。 ４．５ 生物学的活性 走化性好中球反応 走化性好中球反応で測定したＥＤ₅₀は、０．８４ミリモル／ｌであった。 ５．細胞破片中に残るインターロイキン−８の可溶化 −７０℃で貯蔵され、高 圧均質化を用いて溶解され、３ＫＤ濾過（インターロイキン−８の第２精製参照 ）を用いて処理された細胞破片を、氷中で打解（thawed）し、室温まで加温し、 結晶尿素と一緒に充分混合することにより溶解させて、８Ｍ尿素の最終濃度を生 じさせた。ｐＨ値は９．５であった。次いで、二重高圧均質化を、ホモジナイザ ーを用いて実施し、８Ｍ尿素懸濁液を６０００ｐｓｉの圧力で２サイクルに供し た。個々の工程をインターロイキン−８ ＥＬＩＳＡテストを用いて分析した。 次の表に、商業的規模でのインターロイキン−８ 可溶化の個々の工程及びその 結果をまとめて表示する： ^* 可溶性蛋白質（インターロイキン−８の２９４．ｌｍｇ）に対する。 商業的可溶化プロセスの最終工程の後に、インターロイキン−８の２２８．０ ｍｇが得られた。商業的反応プロセスで、尿素添加及び１２時間の尿素処理は、 この可溶化に最も大きく影響していることが判明した。 他方、二重均質化は、インターロイキン−８濃度の僅かな増加のみを提供した。 更なる試験では、ｐＨ９．５で８Ｍ尿素溶液の長時間恒温保持により、より高 い収率が得られることを示した。実験室的規模で、同じ条件下で２４、３６及び ４８時間の尿素処理により２〜３倍の収率を得ることが できた。 この処理の後に、８Ｍ尿素溶液を脱イオンＨ²Ｏ（millipore Q system）（ １：１希釈）を用いて４ｍ尿素濃度に調節し、再び３ＫＤ濾過を行い、生じる濾 液ＩＩＩを更に、前記の方法に従って、１ＫＤ濾過により更に処理する。保留物 Ｉの濾過を２工程で実施した。第１工程で、この４Ｍ尿素溶液を濃縮し、第２工 程で５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ９．５ を用いて濾過した。 濾過緩衝液： ５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＴＲＩＳ 、 ｐＨ９．５ 第１相： 循環量： ２〜３リットル／ｍｉｎ 濾過速度： ６．３ｍｌ／ｍｉｎ トランスメンブラン圧： １０ｐｓｉ ２容量変換の後に、この濾過パラメータを増加させた。 第２相： 循環量： ４〜５リットル／ｍｉｎ 濾過速度： １８．７ｍｌ／ｍｉｎ トランスメンブラン圧： ３５ｐｓｉ 濾液ＩＩＩ中のインターロイキン−８の量をＥＬＩＳＡ法を用いて分析した。 結果を第２図に示す。濾過特性に関してＳ字状曲線が認められ、移行領域は、先 ず第一に操作パラメータを濾過工程まで増加することにより起こる。その後、濾 過特性を得るために一次反 応の像が形成されている。 保留物Ｉから３ＫＤ濾過を用いて１８時間に分離できた濾液ＩＩＩ中の可溶化 されたインターロイキン−８の総量は、０．０１５ｍｇ／ｍｌの濃度で２３２． ０ｇであった。濾液ＩＩＩを更に１ＫＤ濾過により処理した。逆相Ｃ４−ＨＰＬ Ｃを用いる分析は、濾液ＩＩＩ７８１５ｍｌを保留物ＩＶ１２５０ｍｌまで濃縮 の後に、インターロイキン−８ ０．０８７ｍｇ／ｍｌの濃度（インターロイキ ン−８の１０９．０ｍｇ）を示した。これは、９０％より大きい収率に相当して いる。 濾液ＩＶは、インターロイキン−８ ０．００５ｍｇ／ｍｉｎ以下の濃度で、検 出の限界を下回った。インターロイキン−８の総収率は、この可溶化工程におけ るもののほぼ２倍であり得ることが認められる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ヴェルナー ボイドル ドイツ連邦共和国 ベルリン ホルシュタ イニッシェ シュトラーセ 56 (72)発明者 アンドレ コルターマン ドイツ連邦共和国 ゲッティンゲン マグ デブルガー ヴェーク 10

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． インターロイキン−８を精製する方法において、ａ）先ず、緩衝溶液中 で細胞を溶解させ、 ｂ）生じるリゼートを、次のような繰り返しクロスーフロー限外濾過： ｉ）第１濾過工程で、インターロイキン−８をより大きい付随成分から分離す る、 ｉｉ）第２濾過工程で、より小さい成分から分離する による分子量排除の手段で処理し、 ｃ）方法工程ｂ）からの緩衝された濾液をカチオン交換クロマトグラフィを用い て高分解能精製を行い、この際、インターロイキン−８の高い正に荷電された表 面を、適用及び溶離ｐＨ値がインタ一ロイキン−８がなお結合できるるのに充分 高く選択されている様な形で使用し、次いで、 ｄ）方法工程ｃ）からのインターロイキン−８溶離液の緩衝された溶液を、ゲル 濾過、透析又は限外濾過により交換し、かつ最後に ｅ）方法工程ｄ）を経て得られたインターロイキン−８溶液を凍結乾燥させる ことを特徴とするインターロイキン−８の精製法。