JPH08503227A - ヒトインターロイキン−１０の精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の精製方法を提供する。この方法はＩＬ−１０含有溶液に対してカチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを実施することから成る。本発明はまた、タンパク質画分中に存在する種々なＩＬ−１０ダイマーを、タンパク質画分にヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを実施することによって分離する方法をも含む。本発明はまた、タンパク質画分中に存在する、Ｎ末端アミノ酸配列において異なるタンパク質変異体を、タンパク質画分にヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを実施することによって、相互から分離する方法をも含む。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトインターロイキン−１０の精製 発明の背景 インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、最近発見されたリンホカインは、最 初はインターフェロン−γ合成の阻害剤として述べられ、体液性種類の免疫反応 の主要な仲介体として仮定された［フィオレンチオ（Fiorentono,D.F.）等，Ｊ ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：２０８１（１９８９）及びムーア（Moore,K.W.）等 ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４８：１２３０〜１２３４（１９９０）］。しばしば相互に 排他的な２種類の免疫反応は体液性（抗体−仲介）及び遅延型過敏症である。 これらの２種類の異なる免疫反応が２種類のヘルパーＴ細胞クローン、すなわ ち、独特のサイトカイン分泌パターンを示す、Ｔｈ１及びＴｈ２ヘルパーＴ細胞 から生ずることが仮定される［ムーア，上記文献；ヴィエイラ（Vieira,P.）等 ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８巻：１１７２（１９９１ ）］。マウスＴｈ１細胞クローンはインターフェロン−γとＩＬ−２とを分泌し 、優先的に遅延型過敏症反応を誘導するが、Ｔｈ２細胞クローンはＩＬ−４、Ｉ Ｌ−５及びＩＬ−１０を分泌し、体液性反応を支持する［フィオレンチオ等，上 記文献］。Ｔｈ１細胞クローンによって分泌されるインターフェロン−γが試験 管内でのＴｈ２細胞クローン増殖を阻害し、Ｔｈ２細胞クローンによって分泌さ れるＩＬ−１０がＴｈ１細胞クローンによるサイトカイン分泌を阻害するので、 免疫反応における対比が結果として生ずる可能性がある［フィオレンチオ等，上 記文献及びムーア等，上記文献］。したがって、これらの２種類のＴ−ヘルパー 細胞は相互に阻害的であり、２種類の異なる免疫反応の基礎を提供することがで きる。 ＩＬ−１０はネズミＴ細胞とヒトＴ細胞の両方からクローン化され、配列決定 されている［ムーア等，上記文献；ヴィエイラ等，上記文献］。両方の配列は１ ７８アミノ酸のポリペプチドをコードする読み取り枠（open reading frame）を １８アミノ酸のＮ末端疎水性リーダー配列と共に含み、７３％のアミノ酸配列相 同性を有する。 生物学的に活性なＩＬ−１０は分析用ゲル濾過によって判定されるようにダイ マーである。一般に、このダイマーは非還元性ドデシル硫酸ナトリウム−ポリア クリルアミドゲル電気泳動でのモノマーとしての移動に基づくと非共有結合して いる。組換え体ヒトＩＬ−１０は原核発現系と真核発現系の両方によって発現さ れることができる。 真核発現系によって産生された組換え体ヒトＩＬ−１０のＮ末端分析は、ＩＬ −１０ポリペプチドの少ない割合が最初の２つのＮ末端アミノ酸残基欠失を有す ることを示唆する。この切頭（truncated）ポリペプチドは△２ＩＬ−１０ポリ ペプチド、又は簡単には△２と呼ばれる。それ故、全長（full-length）鎖は△ ０と呼ばれ、アミノ酸が欠失していないことを示す。したがって、生物学的に活 性な真核発現（eukaryotically expressed）ＩＬ−１０は３種類の異なるダイマ ーとして発生することができる。第１生物学的活性ダイマーと主要な形状は△０ ：△０であり、ダイマーの両ポリペプチドがアミノ酸の全長鎖を有するホモダイ マーである。第２ＩＬ−１０ダイマーは△０：△２であり、ポリペプチド鎖の１ つがアミノ酸の全長鎖を有し、第２鎖、△２が最初の２つのＮ末端アミノ酸残基 欠失を有するヘテロダイマーである。第３ＩＬ−１０ダイマーは△２：△２であ り、ダイマーの両方のポリペプチド鎖が最初の２つのＮ末端アミノ酸残基欠失を 有するホモダイマーである。したがって、ＩＬ−１０を精製する方法が必要であ り、特に、ＩＬ−１０の異なるダイマーを相互から分離する方法が必要である。 原核発現系によって発現される封入体（inclusion body）中に含まれるＩＬ− １０は変性し、再生し（refolded）、宿主（host）タンパク質、ＩＬ−１０の修 飾変異体及びこれらの変異体のヘテロダイマーを含む汚染物から精製しなければ ならない。さらに、原核系では、ＩＬ−１０モノマーはリシン残基の１個以上に おいてアセチル化されることができる。アセチル化モノマーが他のアセチル化モ ノマーに結合する場合には、アセチル化ホモダイマーが得られる。しかし、非ア セチル化モノマーが他の非アセチル化モノマーに結合する場合には、非アセチル 化ホモダイマーが得られる。アセチル化モノマーが非アセチル化モノマーに結合 する場合には、ヘテロダイマーが得られる。さらに、ＩＬ−１０は通常、非共有 結合ホ モダイマーとして得られる。しかし、封入体の変性及びＩＬ−１０の再生（refo lding）中に、共有結合ホモダイマーすなわち非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上では ダイマーとして移動するが、還元性条件下ではモノマーとして移動するホモダイ マーが得られる可能性がある。これは恐らく、２つのモノマーの間に形成される １個以上の分子間ジスルフィド結合によって生ずると思われる。したがって、Ｉ Ｌ−１０を宿主タンパク質汚染物から精製して、アセチル化ホモダイマー、ヘテ ロダイマー変異体及び共有結合ダイマーを含まない、本質的に純粋な非共有結合 ダイマーＩＬ−１０を得ることが必要である。 可能な免疫反応仲介体としてのその役割及びインターフェロン−γ合成の阻害 剤としてのその活性を考慮すると、ＩＬ−１０は自己免疫疾患又は移植片拒絶に 臨床的有用性を有する。しかし、臨床的設定では、ＩＬ−１０が他の汚染性の宿 主タンパク質及び培地（medium）タンパク質又はポリペプチドを実質的に含まな い、高度に純粋な状態であることが非常に望ましい。したがって、これらの目的 を達成する、ＩＬ−１０の精製方法の必要性がある。 発明の概要 本発明は下記工程： （ａ）ＩＬ−１０を含む溶液に対してカチオン交換クロマトグラフィーを実施 し、それによってＩＬ−１０含有画分を得る工程と； （ｂ）工程（ａ）からのＩＬ−１０含有画分に対してアニオン交換クロマトグ ラフィーを実施し、それによってＩＬ−１０含有画分を得る工程と； （ｃ）工程（ｂ）からのＩＬ−１０含有画分に対してヒドロキシアパタイトク ロマトグラフィーを実施し、それによってＩＬ−１０の単独単離ダイマーを含む 画分を得る工程と； （ｄ）工程（ｃ）からのＩＬ−１０含有画分に対してゲル濾過クロマトグラフ ィーを実施し、それによって高分子量不純物も低分子量不純物も含まないＩＬ− １０含有画分を得る工程と を含む、溶液中に含まれるＩＬ−１０を精製する方法を提供することによって、 この必要性を満たす。 ＩＬ−１０のこの精製方法は、細菌発現系又は真核発現系において発現される ＩＬ−１０に対して適用することができる。 本発明はさらに、ダイマー混合物を含むタンパク質画分中に含まれる種々のＩ Ｌ−１０ダイマーを分離する方法であって、該画分に対してヒドロキシアパタイ トクロマトグラフィーをダイマーが相互から分離する条件下で実施することを含 む前記方法を提供する。 本発明はさらに、その中の種々なダイマーが異なるＮ末端アミノ酸配列を有す るタンパク質画分中に含まれるタンパク質の種々なダイマーの分離方法であって 、該タンパク質画分に対してヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーをダイマ ーが相互から分離する条件下で実施することを含む前記方法を提供する。 本発明はさらに、その中のタンパク質の変異体が種々なＮ末端アミノ酸配列を 有するタンパク質画分中に含まれるタンパク質の変異体の分離方法であって、該 タンパク質画分に対してヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーをタンパク質 の変異体が相互から分離する条件下で実施することを含む前記方法を提供する。 本発明はさらになお、溶液中に含まれるＩＬ−１０のアセチル化ホモダイマー とＩＬ−１０のアセチル化ヘテロタイマーとからＩＬ−１０の非アセチル化ホモ ダイマーを分離する方法であって、該溶液に対してアニオン交換クロマトグラフ ィーを非アセチル化ホモダイマーがＩＬ−１０のアセチル化ダイマーから分離さ れる条件下で実施することを含む前記方法を提供する。 発明の説明 本明細書に引用する全ての参考文献はそれらの全体において本明細書に援用さ れる。 本明細書で用いるかぎり、“インターロイキン−１０”又は“ＩＬ−１０”は ヒトＩＬ−１０（ｈＩＬ−１０）か又はネズミＩＬ−１０のいずれかでありうる 。ヒトＩＬ−１０は（ａ）国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０３５５４号、第ＷＯ ９１／００３４９号に対応する、１９９２年７月２０日出願の米国特許出願第０ ７／９１７，８０６号に開示されるような、成熟（すなわち、分泌リーダー配列 を有さない）ｈＩＬ−１０の既知配列に実質的に同じのアミノ酸を有し、かつ（ ｂ） ネイティブ（native）ｈＩＬ−１０に共通である生物学的活性を有するタンパク 質として定義される。 ＩＬ−１０はタンパク質を分泌することができる活性化Ｔ細胞の培養培地から 得ることができる。しかし、ＩＬ−１０はＩＬ−１０ポリペプチドをコードする 単離核酸を用いる組換え体方法によって優先的に得られる。分子生物学の一般的 な方法は、例えばサムブロック（Sambrook）等，分子クローン化（Molecular Cl oning），Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈ（ニューヨーク州，コールドスプリングハーバ ー）、第２版、１９８９及びアウスベル（Ausubel）等（編集），分子生物学に おける現在のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology），Ｇｒ ｅｅｎ／Ｗｉｌｅｙ，ニューヨーク（１９８７及び定期的増刊）によって述べら れている。ゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから、適当な配列を得 ることができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を用いることができる。 例えば、ＰＣＲプロトコール：方法及び用途の手引き（PCR Protocol:A Guide t o Methods and Applications），１９９０，Ｉｎｎｉｓ等（編集），Ａｃａｄｅ ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州，ニューヨークを参照のこと。 ライブラリーは適当な細胞から抽出される核酸から構成する。例えば、ＩＬ− １０を生成するための組換え体方法を開示する国際出願公開第ＷＯ９１／００３ ４９号を参照のこと。例えば、核酸に関するＧｅｎ Ｂａｎｋ及びＥＭＢＬ、タ ンパク質に関するＰＩＲ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ｃ／ｏＩｎｔｅｌｌｉｇｅ ｎｅｔｉｃｓ（ウィスコンシン州，マウンテンビュー）、又はＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐｓ，ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセン ター（ウィスコンシン州，マディソン）（これらは本明細書に援用される）のよ うな、種々な配列データベースに有用な遺伝子配列を見いだすことができる。 ヒトＩＬ−１０（ｈＩＬ−１０）をコードする配列を含むクローンはＡｍｅｒ ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（メ リーランド州，ロックビル）に受け入れ番号６８１９１及び６８１９２で寄託さ れている。ＩＬ−１０をコードする配列を含む他のクローンの確認は核酸ハイブ リッド化によって又は、発現ベクターを用いる場合には、コードされるタンパク 質の免疫学的検出によって行われる。寄託された配列に基づくオリゴヌクレオチ ドプローブは国際出願公開第ＷＯ９１／００３４９号に開示される。配列の確認 のために有用なオリゴヌクレオチドプローブは、他の種の関連遺伝子の保存領域 （conserved region）から作製することもできる。或いは、ＩＬ−１０のアミノ 酸配列に基づく変性プローブ（degenerate probe）を用いることもできる。 ＩＬ−１０をコードするＤＮＡを発現させるために、種々な発現ベクターを用 いることができる。原核細胞及び真核細胞における組換え体タンパク質の発現に 用いられる通常のベクターを用いることができる。好ましいベクターには、Ｏｋ ａｙａｍａ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．３巻，２８０〜２８９頁（１９８３ ）及びＴａｋｅｂｅ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．８巻，４６６〜４７２頁（ １９８８）によって開示されるｐｃＤベクターがある。他のＳＶ−４０に基づく 哺乳動物発現ベクターには、Ｋａｕｆｍａｎｎ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ ．２巻，１３０４〜１３１９頁（１９８２）及び米国特許第４，６７５，２８５ 号に開示される発現ベクターがある。これらのＳＶ−４０に基づくベクターはＣ ＯＳ７サル細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）並びに例えばマウスＬ細胞 及びＣＨＯ細胞のような、他の哺乳動物細胞に特に有用である。 標準トランスフェクション方法を用いて、大量のポリペプチドを発現させる真 核細胞ラインを製造することができる。本発明の方法は、タンパク質が発現され る細胞上清（cell supernatant）から、真核細胞によって発現されるＩＬ−１０ の精製方法である。真核細胞ラインには、哺乳動物、酵母及び昆虫の細胞ライン がある。典型的な哺乳動物細胞ラインには、ＣＯＳ−７細胞、マウスＬ細胞及び チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞がある。Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の上記 文献及びＡｕｓｕｂｅｌ等の上記文献を参照のこと。 さらに、本発明の方法は遺伝的形質転換細菌、特に大腸菌（E.coli）によって 産生されるＩＬ−１０の精製方法を提供する。本明細書で用いるかぎり、“形質 転換細菌”なる用語は、哺乳動物タンパク質を産生するように遺伝子操作された （genetically engineered）細菌を意味する。このような遺伝子操作（genetica lly engineering）は通常、細菌中への発現ベクターの導入を必然的に伴う。この発 現ベクターは自律増殖することができ、細菌ゲノム中の遺伝子に関してタンパク 質発現することができる。所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列が既 知であるか、さもなくば入手可能であるかぎり、細菌発現の構築は技術上周知で ある。例えば、ＤｅＢｏｅｒは米国特許第４，５５１，４３３号において細菌発 現ベクターに用いるためのプロモーターを開示し；Ｇｏｅｄｄｅｌ等は米国特許 第４，６０１，９８０号において、またＲｉｇｇｓは米国特許第４，４３１，７ ３９号において大腸菌発現系による哺乳動物タンパク質の産生を開示し；Ｒｉｇ ｇｓの上記文献、Ｆｅｒｒｅｔｔｉ等のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．８３：５９９（１９８６）、Ｓｐｒｏａｔ等のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒ ｅｓｅａｒｃｈ，１３：２９５９（１９８５）及びＭｕｌｌｅｎｂａｃｈ等のＪ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：７１９（１９８６）は細菌中に発現するための 合成遺伝子の構築方法を開示する。多くの細菌発現ベクターは商業的に及びＡｍ ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ） （メリーランド州，ロックビル）から入手可能である。 本発明の方法はカチオン交換、アニオン交換、ヒドロキシアパタイト及びゲル 濾過のクロマトグラフィーの逐次適用を含む。高純度と最大収率とを達成するた めに、４種類のクロマトグラフィー工程の各々をｐＨ、導電率、バッファー組成 、流量及びカラム寸法に関して選択し、最適化した。純度及び収率のこの最適化 を評価するために用いられる分析操作はウェスタンブロット、ドデシル硫酸ナト リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）［Ｌａｅｍｍｌ ｉ，英国，Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０（１９７０）］、酵素免疫吸着測定方 法（ＥＬＩＳＡ）値、２８０ｎｍと２６０ｎｍにおけるＵＶ吸光度、及びタンパ ク質濃度測定［Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ.，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ.，７２：２ ４８（１９７６）］であった。 さらに、効果的で迅速な大規模加工と、生成物純度と収率とに関して、クロマ トグラフィー工程の順序を最適化した。これは（１）大量取り扱い（volume han dling）を減ずるための第１工程（カチオン交換）中の生成物濃縮；（２）この 迅 速工程の生成物を特別な加工なしに次のカラムに直接負荷することができるよう な、第２工程（アニオン交換）の流動形式；（３）第３カラム（ヒドロキシアパ タイト）上でのＩＬ−１０形の分離（resolution）を他の汚染タンパク質が妨害 しないように、最初の２工程中のこれらの汚染タンパク質の殆ど全ての除去；及 び（４）異なる分子量の微量汚染物とＩＬ−１０モノマーとの分離の他に、この 後の薬剤組成物のために望ましいバッファー中に最終生成物ＩＬ−１０が得られ ることを可能にするゲル濾過クロマトグラフィーのバッファー交換を含む。 ＩＬ−１０はカチオン交換樹脂に良好に吸着するので、カチオン交換クロマト グラフィー工程を最初に用いる。例えばカルボキシメチル、スルホプロピル及び スルホネートのような、任意のカチオン交換基を用いることができる。セルロー ス、デキストラン、アガロース及びポリスチレンをこれらに限定することなく含 む、任意の固相サポートにカチオン交換基を取り付けることができる。好ましい カチオン交換基は、例えばＰｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャーシー州，ピスカタ ウェイ）からのＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（登録商標）のよ うな、アガロース充填サポートマトリックスに取り付けたスルホネートである。 平衡バッファーは７．８（ＩＬ−１０のｐＩ）より低いｐＨであるべきであり、 好ましくは、ＩＬ−１０タンパク質に充分な正電荷を生成するために、Ｓ−ＳＥ ＰＨＡＲＯＳＥに対しては約６．５であるべきである。これはカチオン交換基へ のＩＬ−１０タンパク質の良好な接着を生ずる。 ＩＬ−１０を哺乳動物細胞の培養発現系によって産生する場合には、汚染タン パク質の８０〜９０％及び特に、主要な汚染タンパク質である血清アルブミンが 結合しないように、条件を最適化する。負荷されるべきタンパク質の量は、製造 業者によって提供される情報に基づいて算出することができる。５ｘ２８ｃｍＳ −ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムを用いて、約１０ ０ｍｇタンパク質／ｍｌベッドボリュームを１．１ｃｍ／分の流量で供給するこ とができる。この上清を負荷させた後に、カラムを段階的又は線形勾配（linear gradient）塩溶液によって、好ましくは、Ｓ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標 ）カラムに対しては７０〜３００ｍＭ ＮａＣｌ線形勾配によって展開させる。 Ｉ Ｌ−１０は、約１７ｍＳにおけるＡ₂₈₀の明確なピークにおいて約１５０ｍＭ Ｎ ａＣｌの濃度で溶離する。理想的には、ＩＬ−１０を含有する画分を濃縮し、例 えばＰＥＬＬＩＣＯＮ（登録商標）、１０Ｋ膜を用いて透析濾過する。 細菌発現系においてＩＬ−１０を封入体で産生する場合には、ＩＬ−１０を一 般に変性させ、次に再生する。次に、再生ＩＬ−１０を含む溶液を上述のように カチオン交換樹脂に供給する。汚染タンパク質の８０〜９０％が結合しないよう に、条件を最適化する。負荷されるべきタンパク質量は、製造業者によって提供 される情報に基づいて算出することができる。１２ｘ３６ｃｍ Ｓ−ＳＥＰＨＡ ＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムを用いて、約１５ｍｇタンパク 質／ｍｌベッドボリュームを１ｃｍ／分の流量で供給することができる。この上 清を負荷させた後に、カラムを段階的又は線形勾配塩溶液によって、好ましくは Ｓ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）カラムに対しては６５〜４００ｍＭ Ｎａ Ｃｌ線形勾配によって展開させる。ＩＬ−１０は、約１７ｍＳにおけるＡ₂₈₀の 明確なピークにおいて約１５０ｍＭ ＮａＣｌの濃度で溶離する。理想的には、 ＩＬ−１０を含有する画分を濃縮し、例えばＰＥＬＬＩＣＯＮ（登録商標）、１ ０Ｋ膜を用いて透析濾過する。 カチオン交換クロマトグラフィーからのＩＬ−１０含有画分にアニオン交換ク ロマトグラフィーを実施し、残留する宿主又は細胞培養のタンパク質汚染物を実 質的に除去する。任意のアニオン交換基を用いることができる。例は第４級アミ ノエチル、混合アミン又は他の中間体塩基若しくは弱塩基交換基である。第４級 アミノエチル基が好ましいアニオン交換基である。第４級アミノエチル基はデキ ストラン、セルロース、アガロース又はアクリルサポートマトリックスに結合す ることができる。好ましくは、サポートはアガロースである。理想的なＱＡＥア ガロースアニオン交換樹脂はＱ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ，ニュージャーシー州，ピスカタウェイ）である。 哺乳動物細胞培養系によって産生されるＩＬ−１０は８．０〜８．３の最適ｐ ＨではＱＡＥアニオン交換樹脂に吸着しない。したがって、ＩＬ−１０はＱＡＥ カラムを通過し、タンパク質ｍｇ／ベッドボリュームｍｌが４未満であるならば 、 大抵の汚染タンパク質は吸着される。 画分に含まれるＩＬ−１０のアセチル化は、ＩＬ−１０の変異体を逆相高性能 液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって最初に分離することによって評価 することができる。次に、完全タンパク質又はトリプシン消化フラグメントの質 量スペクトロメトリーを実施することができる。この場合に、ＩＬ−１０又はフ ラグメントがアセチル化される場合には、スペクトル分析がアセチル基の質量に 等しい、ＩＬ−１０又はそのフラグメントの質量増加を実証する。さらに、トリ プシン消化フラグメントのＮ末端配列分析はＩＬ−１０がアセチル化される場合 に、アセチル化リシン基準（standard）に匹敵するピークを示す。原核系におい て産生される非アセチル化ＩＬ−１０は、タンパク質含有溶液が１．０〜１．５ の導電率及びｐＨ８．７であるときに通過するので、アニオン交換樹脂に弱く吸 着する。アセチル化ダイマーと汚染宿主タンパク質とはカラムに強度に吸着する 。 アニオン交換カラムから得られるＩＬ−１０含有タンパク質画分に、この画分 中に含まれる種々なダイマー形を分離するために、ヒドロキシアパタイトクロマ トグラフィーを実施する。これは迅速流動方法によって実施することができ、こ の方法ではアニオン交換カラムからの画分が、アニオン交換カラムを出るときに 、ヒドロキシアパタイトクロマトカラムに直接負荷されるように、アニオン交換 カラムをヒドロキシアパタイトカラム上に直接配置する。 ＩＬ−１０が哺乳動物細胞培養系によって産生される場合には、ヒドロキシア パタイトカラムを約８．１のｐＨの標準塩溶液によって平衡させる。このための 適当なバッファーは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌと２０ｍＭ ＮａＣｌから構成さ れる（ｐＨ８．１）。ＩＬ−１０含有画分をヒドロキシアパタイトカラムに負荷 させ、好ましくは、約ｐＨ８．０の１５０ｍＭリン酸カリウムバッファーの２０ ベッドボリュームの線形勾配によって溶離させる。溶離は約６％濃度のＫＰＯ₄ バッファーによって開始し、約７５％濃度に達するまで徐々に増加する。ＮａＰ Ｏ₄も同じ濃度レベルで用いることができる。△０：△０ＩＬ−１０ダイマーは １５０ｍＭＫＰＯ₄バッファーの約２０〜２５％濃度で溶離する。他の２種類の ダイマーは１５０ｍＭ ＫＰＯ₄バッファーの約３０〜３５％濃度で溶離する。 次に、好ましくはカラム長さを２倍にし、得られる画分を△０：△２と△２：△ ２とが別々の画分として溶離するまて再供給することによって、△０：△２を△ ２：△２から分離することができる。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー を用いて、ＩＬ−１０含有画分中に共に存在する種々なＩＬ−１０ダイマーを相 互から分離することができる。種々なダイマーが実際に分離されたという事実は Ｎ末端アミノ酸残基配列分析によって確認することができる。 ＩＬ−１０が原核発現系において産生される場合には、切頭ダイマーは稀であ る。しかし、非共有結合ＩＬ−１０ダイマーは共有結合ＩＬ−１０ダイマーから 分離しなければならない。これはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによ って実施される。ヒドロキシアパタイトカラムを約７．４のｐＨの標準塩溶液に よって平衡させる。このための適当なバッファーは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌと ２０ｍＭ ＮａＣｌから構成される（ｐＨ７．４）。ＩＬ−１０含有画分をヒド ロキシアパタイトカラムに負荷させ、好ましくは、ｐＨ７．４の１５０ｍＭリン 酸ナトリウムバッファーの２０ベッドボリュームの線形勾配によって溶離させる 。溶離は約５％濃度のＮａＰＯ₄バッファーによって開始し、約１００％濃度に 達するまで徐々に増加する。ＫＰＯ₄も同じ濃度レベルで用いることができる。 非共有結合ダイマーは７〜１０ｍＳにおいて最初に溶離し、共有結合ダイマーは 約１２ｍＳにおいてピークに達する。 次に、ヒドロキシアパタイトカラムから得られる単離ＩＬ−１０ダイマー含有 画分にゲル濾過を実施する。ゲル濾過を用いて、ＩＬ−１０モノマーを含む高分 子量及び低分子量不純物を分離する。特に有用な２種類のゲルは、タンパク質に 関して５ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの分画範囲を有するＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ− ２００ＨＲ（登録商標）と、タンパク質に関して１ｋＤａ〜１００ｋＤａの分画 範囲を有するＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ−１００（登録商標）とである。タンパク 質に関して約１ｋＤａ〜６００ｋＤａの分画範囲を有する他のゲルも使用可能で ある。 Ｎ末端アミノ酸配列において異なるタンパク質の変異体形はヒドロキシアパタ イトクロマトグラフィーを用いて分離することができる。モノマー又はオリゴマ ーのタンパク質を精製することができるが、これらのタンパク質は１個以上のＮ 末端アミノ酸欠失変異体のためにまだ異種混合状態に留まる。これらの変異体は ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって分離することができる。これ らの分離を実施するために、幾つかの実験変数を試験する。第１変数は溶離のた めに必要なリン酸塩濃度と、リン酸塩濃度の勾配である。試験すべき第２変数は カラム長さ、タンパク質負荷、正味導電率（net conductivity）及び低レベルの 二価カチオンである。多少変化した条件下での再クロマトグラフィーは変異体形 の収率と純度とを改良する傾向がある。 下記実施例は本発明を限定するのではなく、説明するために提供するものであ る。 実施例１ ＣＨＯ細胞ラインからのヒトＩＬ−１０の精製 培養培地 チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をＩＬ−１０遺伝子含有ベクター によってトランスフェクトし、２５％ウシ新生仔血清、ホルモン成長因子及び他 の栄養素を含有する補充培地である５％ＮＵＳＥＲＵＭ Ｖ（登録商標）（Ｃｏ ｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）及びウシ血清アルブミン、インス リン、トランスフェリン、フェチュイン、脂肪酸、エタノールアミン及びセレン を含有する血清を含まない補充培地であるＨＢＣＨＯ（登録商標）（Ｉｒｖｉｎ ｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充された、塩、バッファー、ビタミン、アミノ 酸及びグルコースを含有する基準培地であるイスコヴ修飾ダルベッコ培地（Isco ve's ModifiedDulbecco's Medium）（ＩＮＩＤＭ）（ミズリー州、セントルイス 、Ｓｉｇｍａ）中で増殖させた。トランスフェクトしたＣＨＯ細胞をｐＨ７．２ 、３７℃の細胞培地で増殖させた。五日間の増殖後に、細胞培養上清液の全体で １７７リットルを取り出し、クロスフロー（ｃｒｏｓｓｆｌｏｗ）精密濾過を受 けさせ、限外濾過によって約１７．６リットルに濃縮した。次に、ＣＨＯ−細胞 培養上清を２０ｍＭ ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタノールスルホン酸、 ６５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４を用いて透析濾過を実施した。次に、生じた上清液 に 下記のクロマトグラフィー操作を実施し、これらはすべて４℃において行った。 カチオン−交換クロマトグラフィー 濃縮、透析濾過したＣＨＯ−細胞上清濃縮物を２０ｍＭ ＭＥＳ、７０ｍＭＮ ａＣｌｐＨ６．５と平衡させた５ｘ２８ｃｍ Ｓ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商 標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムに負荷させた。タンパク質約１００ｍｇ／ｍｌベ ッドボリュームを１．１ｃｍ／分の流量で供給した。このカラムを８．５ベッド ボリュームの平衡バッファーで洗浄した。次に、これを７０〜３００ｍＭのＮａ Ｃｌ勾配の１３ベッドボリュームによって０．６ｃｍ／分の低流量で溶離した。 ｈＩＬ−１０は、約１５０ｍＭのＮａＣｌに対応する約１７ｍＳにおいてＡ₂₈₀ の明確なピークで溶離し、これは、１６〜２０ｍＳにおいて溶離した主要なタン パク質であった。ｈＩＬ−１０を含有する画分を濃縮し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ− Ｃｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．１からなるバッファーＡで透析濾過（ＰＥ ＬＬＩＣＯＮ（登録商標）１０Ｋ膜）した。 Ｓ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）を用いるカチオン−交換クロマトグラフ ィーは良好な吸着を生じたので、第１精製工程として選択された。上記の条件を 用いると、８０−９０％の汚染タンパク質は結合しなかった。ｈＩＬ−１０は、 初期タンパク質の１％であったが、１６〜２０ｍＳで溶離した主要なタンパク質 であり、５０倍に精製されたものであった。下記の表１参照。ｐＨ、導電率、流 量及びカラム寸法の最適条件は、２８０及び２６０ｎｍにおけるＵＶ吸光度、タ ンパク質濃度、ＥＬＩＳＡ値、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び多くのクロマトグラフィー のウエスタンブロット結果を評価することによって決定した。 アニオン−交換クロマトグラフィー カチオン−交換クロマトグラフィー工程から得られた、濃縮、透析濾過したＩ Ｌ−１０−含有画分をバッファ−Ａと平衡させた５ｘ１３ｃｍ Ｑ−ＳＥＰＨＡ ＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムに負荷させた。タンパク質負荷 は、０．５ｃｍ／分において約３．５ｍｇ／ｍｌベッドボリュームであった。次 に、Ａ₂₈₀における吸光度が最小になるまで、このカラムをバッファーＡで洗浄 した。Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）に吸着しなかったタンパク質はｈ ＩＬ−１０を含有しており、ヒドロキシアパタイトに直接負荷させるためにプー ルした。 ヒトＩＬ−１０は種々なアニオン交換カラムに殆どアフィニティーを有さず、 ｐＨ８．１まで及び４ｍＳまでの導電率において最小の結合を示した。これは、 流動形式におけるＱ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）を可能にし、ｈＩＬ−１ ０はカラムを直接通過し、蛋白質ｍｇ／ｍｌベッドボリュームを４以下に保つ場 合には、大抵の汚染タンパク質が吸着した。ヒドロキシアパタイトクロマトグラ フィーの前に、Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）プールのバッファー調節は ないので、Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）カラムの流出液がヒドロキシア パタイトカラム上に直接負荷されるように、２つのカラムは直列に（in tandem ）連結させることができる。 ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）カラムから得られたＩＬ−１０含有画分 を２．６ｘ２６ｃｍヒドロキシアパタイトカラムに負荷させ、画分に存在するＩ Ｌ−１０ダイマーを分離させるために、バッファーＡによって平衡させた。用い たヒドロキシアパタイトは、Ｐｅｎｔａｘで製造され、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎ ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社によって販売されるセラミックヒ ドロキシアパタイトであった。セラミックヒドロキシアパタイトは、ヒドロキシ アパタイト結晶を加熱（焼結）して、ビーズにすることによって形成される。標 準（すなわち、非焼結）ヒドロキシアパタイト（Ｂｉｏｒａｄ）もまた許容され る。タンパク質負荷は、０．６ｃｍ／分の流量において約２．５ｍｇ／ｍｌベッ ドボリュームであった。このカラムを９４％バッファーＡと６％バッファーＢと の混合液の５ベッドボリュームで洗浄した。バッファーＢは１５０ｍＭ ＫＰＯ₄ 、ｐＨ８．０から成るものであった。ＩＬ−１０は、６％〜７５％の線形勾配 のバッファーＢで溶離した。△０：△０ダイマーは、約２０〜２５％濃度のバッ ファーＢで溶離した。△０：△２及び△２：△２ダイマーは、約３０〜３５％濃 度のバッファーＢで溶離した。 ゲル濾過クロマトグラフィー △０：△０ＩＬ−１０ダイマーを含有する別々の濃縮ヒドロキシアパタイトプ ール（約２０ｍｇ／ｍｌまで）をＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（登録商標）Ｓ−２００Ｈ Ｒ又はＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（登録商標）Ｓ−１００ＨＲカラム（２．６ｘ８５ｃ ｍ）に負荷させ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８． １からなるバッファーＣによって平衡させ、溶離させた。サンプル負荷量は４％ 未満のベッドボリュームであり、流量は０．１ｃｍ／分であった。ピーク画分は プールし、−２０℃において保存した。 ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（登録商標）Ｓ−２００ＨＲ又はＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（登 録商標）Ｓ−１００ＨＲにおけるゲル濾過クロマトグラフィーは、ｈＩＬ−１０ がダイマー形と一致した分子量を示すことを明らかにした。△０：△０ダイマー は、負荷した全てのタンパク質濃度（０．２〜２０ｍｇ／ｍｌベッドボリューム ）に関する主要な形状であった。少量（＜５％）のｈＩＬ−０モノマーは、トレ ーリングショルダー（trailing shoulder）としてＡ₂₈₀プロフィルに時折見られ 、これらの画分はプールから除外された。 総精製操作によって、細胞培養培地１リットルにつき約１．１ｍｇの少なくと も９８％純度△０：△０ヒトＩＬ−１０が得られた。純度は、ドデシル硫酸ナト リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）［Ｌａｅｍｍｌ ｉ、英国、Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０（１９７０）］によって測定した。さ らに、逆相（Ｃ₄）又はサイズ排除ＺＯＲＢＥＸ（登録商標）２５０によるＨＰ ＬＣクロマトグラフィーは、単一ピークのみを示した。各精製工程の実施は、次 の表に示す。この結果は各ＣＨＯ細胞上清（５％Ｎｕ−Ｓｅｒｕｍ Ｖ含有）約 １７５リットルの３精製ランからの平均値である。 ａ 濃度及びｈＩＬ−１０の収率はＥＬＩＳＡアッセイに基づいた。 ｂ 純度は、細胞培養濃縮物、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅプール及びＱ−Ｓｅｐｈ ａｒｏｓｅプールに関しては、ｈＩＬ−１０ ｍｇ（ＥＬＩＳＡによって測定） ／ｍｇ総タンパク質［Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙ（上記文献に記載）によっ て測定］ｘ１００によって測定した。純度は、ヒドロキシアパタイトプール及び Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００プールに関しては、種々なタンパク質量におけ る吸収帯強度（band intensity）の比較によってＳＤＳ−ＰＡＧＥから測定した 。この方法において、０．００５〜２５μｇの範囲の既知量のサンプルを、異な るレーンのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいてランさせた。高負荷で見られる汚染物 の相対量を、低負荷において見られるＩＬ−１０の吸収帯強度との比較によって 算出した。 実施例２ Ｅ．ｃｏｌｉからのヒトＩＬ−１０の精製 大腸菌（E.coli）は、組換え体ヒトインターロイキン−１０（ｒｈｕＩＬ−１ ０）をコードし、発現させる遺伝子を含有する発現プラスミドによって形質転換 させた。このプラスミドは、ｒｈｕＩＬ−１０の転写のための強ハイブリッドｔ ａｃプロモーターを有した［Ｚｕｒａｗｓｋｉ、Ｓ．Ｍ．等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ １．１３７：３３５４〜３３６０（１９８６）］。転写ターミネーターを含有す る１ｐｐ３’コード領域及び非コード領域は、ｒｈｕＩＬ−１０コード領域の下 流にある。ｐＩＮＩＩＩｏｍｐＡに由来する、１ｐｐ遺伝子のこの領域は、この 上流でｍＲＮＡに安定性を与えると考えられる［Ｇｈｒａｙｅｂ，Ｊ．等、ＥＭ ＢＯ Ｊ．、３：２４３７−２４４２（１９８４）］。このプラズマは、ｐＣｌ ｏＤＦ１３に由来するコピーコントロールミュータント（copy control mutant ）であるｐＶＵ２０８に由来する、熱誘導性の（thermoinducible）複製起源を 有する［Ｈａｋｋａｒｔ，Ｍ．Ｊ．Ｊ．等１８３：３２６〜３３２（１９８１） ］。高温（例えば４２℃）において、この複製起源を有する、種々なプラスミド に関するプラスミドコピー数は、染色体当量（chromosomal equivalent）につき 約３０コピーから数百コピーまで増加すると報告されている［Ａｎｄｒｅｏｌｉ 、Ｐ．Ｍ．等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３５：６１２〜６２１（１９７８） ］。このプラスミドは、プラスミド維持のためにｐＢＲ３２２からのテトラサイ クリン耐性遺伝子を有する［Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊ．Ｇ．、Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｓｙ ｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４３：７７〜９０（１９７８）］。この発現構築 物は、不溶封入体としてのｒｈＩＬ−１０の細胞内産生をもたらす。形質変換さ せたＥ．ｃｏｌｉを、２０ｇ／ｌ トリプトン、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、５ｇ ／ｌ ＮａＣｌ及び１０ｍｇ／ｌ テトラサイクリンを含有する寒天の上に置い た。単一の充分に単離されたコロニーをその寒天プレートからランダムに採取し 、第２寒天プレートに再ストリークした（restreaked）。 次に、新たに再ストリークした寒天プレートからの２つのコロニーを、３０ｇ ／ｌ カザミノ酸、２０ｇ／ｌ 酵母エキス、５ｇ／ｌ ＫＰＯ₄［一塩基度］ 、２０ｇ／ｌ グリセロール、１ｇ／ｌ ＭｇＳＯ₄、ｐＨ７を含有する、ＬＹ Ｍ−１培地１ｍｌに懸濁させることによって、マスター細胞バンクを作製した。 次に、これを用いて、３００ｍｌバッフル付きフラスコ（baffled flask）中の １０ｍｇ／ｌ テトラサイクリンを含有するＬＹＭ−１ブロス［ＬＹＭ−１／Ｔ ｃ１０］１００ｍｌに接種し、次に、これを３０℃においてインキュベートし、 細胞密度が約４００のＫｌｅｔｔ₅₄₀（初期対数期）に達するまで、３００回転 ／分（ＲＰＭ）において回転式振とう培養機を用いて振とうした。次に、この培 養物 を４０％グリセロール（ｖ／ｖ）と１：１で混合し、２０％の最終グリセロール 濃度を得た。次に、１ｍｌのアリコートを、予めラベルしたクライオバイアル（ cryovial）に分配し、液体窒素下で急激に冷凍し、−８０℃にセットしたフリザ ー中に使用するまで保存した。 次に、室温における大気中でマスター細胞バンクの１バイアルを解凍すること によってワーキング細胞バンク（working cell bank）を作製し、これを３００ ｍｌバッフル付きフラスコ中のＬＹＭ−１／Ｔｃ１０培地１００ｍｌに接種し、 次に、これを３０℃においてインキュベートし、細胞密度が約４００のＫｌｅｔ ｔ（初期の対数期）に達するまで、３００ＲＰＭにおける回転式振とう培養機を 用いて振とうした。次に、この培養物を４０％グリセロール（ｖ／ｖ）と１：１ で混合した。次に、１ｍｌのアリコートを、予めラベルしたクライオバイアルに 分配し、液体窒素下で急激に冷凍し、−８０℃にセットしたフリザー中に保存し た。 ワーキングストックの１．５ｍｌ冷凍バイアルを室温において解凍した。約０ ．５ｍｌのワーキングストックを、５００ｍｌのＬＹＭ−１／Ｔｃ１０培地を含 有した２０００ｍｌフラスコに移した。接種の直前にテトラサイクリンを加えた 。このフラスコを回転式振とう培養機に載せ、３０℃、３００ＲＰＭにおいて振 とうした。６．５〜７時間後に、Ｋｌｅｔｔ₅₄₀測定のためにサンプルをこのフ ラスコから取り出した。この培養物は、２００〜３００のＫｌｅｔｔ₅₄₀を有し た。次に、８００リットルのＬＹＭ−３／Ｔｃ１０培地を含有する１０００リッ トル発酵機に２０００ｍｌフラスコの内容物を接種した。ＬＹＭ−３／Ｔｃ１０ 培地は、３０ｇ／ｌ Ｃａｓｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔ−ＨｙＣａｓｅ Ｐ（Ｓｈｅ ｆｆｉｅｌｄ）、２０ｇ／酵母エキス−タイプＤ（Ｂｉｏ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ） 、１５ｇ／ｌ リン酸カリウム（一塩基度）（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、０．５ ｍ ｌ／ｌ ＳＡＧ−４７１（登録商標）（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ）の３０％ 懸濁液、２０ｇ／ｌ グリセリン９９．７％（Ｕｎｉｖａｒ）、１ｇ／ｌ 硫酸 マグネシウム７Ｈ₂Ｏ（ＰＱ）、１０ｍｇ／ｌ テトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ ）並びに２ｍｌ／ｌ 硫酸、１５ｇ／ｌ クエン酸ナトリウム、１３．５ｇ／ｌ 塩化第二鉄六水和物からなる２ｍｌ／ｌ クエン酸鉄ストック溶液から構成さ れる。 この培地のｐＨを、５０％ＮａＯＨ溶液と７５％Ｈ₃ＰＯ₄溶液とによって約７に 調節した。この発酵機中の接種済み培地の温度を、Ｋｌｅｔｔ₅₄₀が１０００± １００に達するまでは３０℃±０．５℃に維持し、次に温度を１４時間、３８℃ ±０．５℃に上昇させた。発酵機中の溶解酸素濃度は、撹拌によって４０％飽和 より大きいレベルに維持した。 温度が３８℃に上昇した１４時間後に、撹拌を弱め、培地を５℃〜１５℃に急 冷することによって、発酵を回収した。内蔵（contained）ＣＳＡ−１６連続脱 スラッジ（desludging）遠心機を約５〜１０リットル／分（１ｐｍ）の供給流量 で用いて、このバッチを遠心分離した。透明な濃縮物が得られるように、流量を 調節した。完全な脱スラッジ（desludge）と不完全な脱スラッジ（ボウル時間（ bowl time）０．９５秒に設定）を用いて、発酵の８００リットルを回収した。 この遠心分離工程では、４０±２ｋｇの細胞ペレットが回収された。 遠心分離工程で回収された細胞ペレット４０ｋｇを同等の６回パスに対して７ ０００〜８０００ｐｓｉの操作圧力でＧａｕｌｉｎ Ｍ１２ホモジナイザーを用 いて均質化した。バッチを保持タンクからホモジナイザーとグリコール冷却熱交 換噐とに通して再び保持タンクに、１０ １ｐｍの流量において約１４０分間再 循環させることによって、これは達成された。１４０分間の均質化後に、ホモジ ネートのサンプルを抽出し、位相差顕微鏡下で検査した。これは細胞破壊を評価 するために実施した。顕微鏡評価によって見積もって、９５％を越える破壊が観 察されない場合には、均質化を続けるべきである。 このホモジネートを、６．０５ｇ／ｌ ＴＲＩＺＭＡ−ＢＡＳＥ（登録商標） （トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン）（Ｓｉｇｍａ）、１．９０ｇ／ｌ ＥＤＴＡ二ナトリウム塩二水和物（Ｓｉｇｍａ）、５８．４ｇ／ｌ ＮａＣｌ米 国薬局方（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）及び３８２ｇ／ｌ グアニジンＨＣｌ （Ｓｉｇｍａ）から成る等量の４Ｍグアニジンバッファーと混合することによっ て、均質化細胞を不活化した。緩慢に撹拌しながら、再懸濁液を１０〜１５℃に ３０分間維持した。不活化した再懸濁液を次にＳｈａｒｐｌｅｓ ＡＳ２６ＳＰ 遠心機において５００ｍｌ／分の流量及び１７０００ｒｐｍの遠心機速度で遠心 分離した。この工程で回収された封入体含有ペレットを−１０℃において冷凍し た。封入体は、ｈＩＬ−１０の他に、種々な大腸菌宿主タンパク質、核酸及び他 の細胞デブリ（debris）を含む凝塊（aggregate）である。 ＩＬ−１０の変性（unfolding） −１０℃に保存した封入体ペレットを低温室中で２〜１０℃において３日間か けて解凍した。このペレットを破壊し、変性用バッファー（unfolding buffer） ２０リットル中に加えた。変性用バッファーは５０ｍＭ ＴＲＩＺＭＡ（登録商 標）（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン）（Ｓｉｇｍａ）、７Ｍ グア ニジンＨＣｌ及び４ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ｐＨ８．５から構成 された。封入体ペレットをポリトロンホモジナイザーによって激しく撹拌して、 微細懸濁液（fine suspension）を形成した。次に、この懸濁液を２〜１０℃に おける約３時間の緩慢な撹拌によって、さらに可溶化させた。 ＩＬ−１０の再生 この溶解性タンパク質溶液を再生用バッファー（refolding buffer）中で約２ ５倍に希釈した。再生用バッファーは５０ｍＭ ＴＲＩＺＭＡ（登録商標）、０ ．１２Ｍ グアニジンＨＣｌ及び０．０５ｍＭ グルタチオン（還元）、ｐＨ８ ．５から構成された。希釈した再生用溶液は濾過によって直ちに透明になった； 次に酸化型グルタチオン溶液を０．４５ｍＭの最終濃度になるまで加え、再生を １０〜２４時間続けた。 濃縮／透析濾過 再生工程の終了時に、限外濾過の前の０．４５μｍフィルターを用いる濾過に よって溶液を再び透明にした。さらに、フィルターを限外フィルター（ultrafil ter）に直列に配置して、限外濾過中の透明性を確実にした。次に、再生ＩＬ− １０を含む溶液を約１０倍に濃縮した。これは、１０，０００公称分子量ＰＬＧ Ｃ膜付き限外濾過系Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰＥＬＬＩＣＯＮ（登録商標）限外フ ィルターによって実施した。この濃縮物を次に透析濾過して、濃縮物導電率を約 ６ｍＳに低下させた。透析濾過バッファーはｐＨ８．５、２０ｍＭ ＴＲＩＳと 、２０ｍＭ ＮａＣｌとから構成された。 カチオン−交換クロマトグラフィー 濃縮した再生ｈＩＬ−１０含有溶液をＩＭ ＢＩＳ−ＴＲＩＳと４Ｎ ＨＣｌ との添加によって２０ｍＭ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ｐＨ６．５に調節した。この溶 液を次に濾過によって透明にした。タンパク質約１．２ｍｇ／ｍｌを含む透明化 供給溶液を次に、１２リットル（１２ｘ３６ｃｍ直径）Ｓ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ （登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ニュージャーシ ー州，ピスカタウェイ）に１ｃｍ／分の速度で供給した。このカラムは１０ベッ ドボリュームの２０ｍＭ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ，０．０６５Ｍ ＮａＣｌバッファ ー，ｐＨ６．５によって１ｃｍ／分の速度で予め平衡させたものであった。溶離 は、０．０６５〜０．４Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ，ｐＨ６． ５バッファーの範囲内の２０カラムボリューム勾配（column volume gradient） によって０．５ｃｍ／分の速度で実施した。溶離プロフィルのｈＩＬ−１０ピー ク画分はＡ₂₈₀によって測定し、典型的なｐＨと導電率の範囲によって実証した 。ｈＩＬ−１０含有画分は１１〜１８ｍＳ、１００〜１７０ｍＭ ＮａＣｌにお いて溶離し、これらの画分は、その後の処理のために、一緒にプールした。 アニオン−交換クロマトグラフィー カチオン−交換クロマトグラフィー工程からプールしたｈＩＬ−１０含有画分 を、１０，０００公称分子量ＰＬＧＣ膜付きの限外濾過系ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰ ＥＬＬＩＣＯＮ（登録商標）限外フィルターによって０．５カラムボリュームに まで濃縮した。この濃縮物を次に１０ｍＭ ＴＲＩＳバッファー，ｐＨ８．７を 用いて約１．５ｍＳまで限外濾過した。透析した濃縮物のｐＨはＨＣｌ又はＮａ ＯＨによってｐＨ８．７に調節した。約１３ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含む溶液 を、１０ｍＭ ＴＲＩＳ，８ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．７バッファーと予め平衡 させた、６リットル（１８ｃｍ直径ｘ２３．５ｃｍ）第４級アンモニウムカラム Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）に０．５ｃｍ／分の流量で供給した。ｈＩＬ−１０は画分中に含まれる不純物 に比べて特異な、樹脂に対する吸引力（attraction）を有して、定組成（isocra tic）溶離時に分離され、１０ｍＭ ＴＲＩＳ，８ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．７ バッフ ァーによるカラム流出液中に回収された。アセチル化ホモダイマーとアセチル化 ヘテロダイマーとは樹脂に強く吸着したので、非アセチル化ホモダイマーから分 離された。Ａ₂₈₀によって確認された溶離プロフィルの非アセチル化ｈＩＬ−１ ０ピーク画分はこの後の処理のためにプールした。 ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー アニオン交換クロマトグラフィー工程から得られたｈＩＬ−１０含有プールを 、２０ｍＭ ＴＲＩＳ，２０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４バッファーと予め平衡 させた、４リットル（２６ｘ１４ｃｍ直径）ヒドロキシアパタイトクロマトグラ フィーに供給した。４カラムボリュームに関して、２０ｍＭ ＴＲＩＳバッファ ー量を１００％から９５％に減少し、ｐＨ７．４，０．１５Ｍリン酸ナトリウム バッファーのレベルを０％から５％に上昇させることによって、カラム洗浄を実 施した。溶離は、１７ベッドボリューム溶離勾配（elution gradient）中にリン 酸塩バッファーの割合を５％から１００％に上昇させることによって、実施した 。非共有結合ダイマーは７〜１０ｍＳにおいて溶離し、共有結合ダイマーは１２ ｍＳにおいてピークに達した。Ａ₂₈₀によって確認されたｈＩＬ−１０ピーク画 分はその後の処理のためにプールした。 ゲル濾過クロマトグラフィー 非アセチル化非共有結合ＩＬ−１０ダイマーを含む、ヒドロキシアパタイトプ ロセス工程からのプールを１０，０００公称分子量ＰＬＧＣ膜含有限外濾過系に おいて濃縮した。濃縮物を、１０ｍＭ ＴＲＩＳバッファー，ｐＨ７．４と予め 平衡させた、１４．８リットル（９６ｃｍｘ１４ｃｍ直径） ＳＥＰＨＡＣＲＹ Ｌ（登録商標）Ｓ−２００ＨＲであるゲル濾過カラムに供給した。このカラムを １０ｍＭ ＴＲＩＳバッファー，ｐＨ７．４によって溶離した。Ａ₂₈₀によって 確認され溶離プロフィルのｈＩＬ−１０ピーク画分はその後の処理のためにプー ルした。このゲル濾過プールを０．２μｍフィルターに通して濾過した。濾液、 最終精製したバルクドラッグ（bulk drug）を−２０℃において保存した。 ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（登録商標）Ｓ−２００ＨＲ又はＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（登 録商標）Ｓ−１００ＨＲのいずれかにおけるゲル濾過クロマトグラフィーは、ｈ ＩＬ−１０がダイマー形に一致する分子量を示すことを明らかにした。非アセチ ル化非共有結合ダイマーは、負荷させた全てのタンパク質濃度（０．２〜２０ｍ ｇ／ｍｌベッドボリューム）に関する主要形態であった。少量（＜５％）のｈＩ Ｌ−１０モノマーがＡ₂₈₀プロフィル上にトレイリングショルダーとして時折見 られ、これらの画分はプールから除外した。 各精製工程の性能は下記表２に示す。 ａ ｈＩＬ−１０の濃度、収率及び純度は逆相ＨＰＬＣ分析に基づいた。 ｂ 濃縮、透析濾過及びｐＨ調節後。 実施例３ 再生ヒトＩＬ−１０の疎水性相互作用クロマトグラフィー 再生ＩＬ−１０の透析濾過の代替え手段として、下記操作を用いて、再生用及 び変性用バッファーを除去することができる。大腸菌に発現されたヒトＩＬ−１ ０を含む封入体を１０：１（ｖ／ｗ）比の変性用バッファー対封入体中に再懸濁 させた。変性用バッファーは６Ｍグアニジン塩酸（ＧｄｎＨＣｌ）、４ｍＭ ジ チオスレイトール（ＤＴＴ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、１ｍＭエチ レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び１ｍＭフェニルメチルスルホキシルフルオ リド（ＰＭＳＦ）から構成された。封入体含有バッファーを４℃において撹拌し ながら３時間インキュベートし、変性した（unfolded）変性ヒトＩＬ−１０を得 た。 変性した変性ＩＬ−１０を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、１ｍＭ Ｅ ＤＴＡ）０．５Ｍ最終濃度のＧｄｎＨＣｌ、４．１７ｍＭ還元グルタチオン、０ ．８３ｍＭ酸化グルタチオン及び２ｍＭベンズアミジンを含む再生用バッファー 中で１００倍に希釈し、４℃において１７時間インキュベートした。 再生後に、混合物を０．４５μｍフィルターに通して濾過し、２５％硫酸アン モニウム濃度にして、再び濾過した。濾液をＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒ１６ ５０Ｍ疎水性相互作用（ＴｏｓｏＨａａｓ）カラム（２５％硫酸アンモニウム， ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５に予め平衡化）に封入体０．２５〜０．５ｇ／ ｍｌ樹脂の比で、１ｃｍ／分の線形流量において供給した。この工程において、 ＩＬ−１０はカラムに結合し、多くのタンパク質と、再生用混合物の特徴である 、例えば、グルタチオンとＧｄｎＨＣｌとのような再生プロセス試薬、低分子量 汚染物、大腸菌細胞成分フラグメント等のような非タンパク質汚染物の大部分と はカラムを通過した。次に、結合したヒトＩＬ−１０を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐ ｈ８．５），２０〜５０ｍＭ ＮａＣｌによって定組成的に（isocratically） に溶離した。２１ベッドボリューム画分を回収した。ヒトＩＬ−１０は２ベッド ボリュームを定組成勾配（isocratic gradient）中に溶離し始めた。一般に、画 分２〜１５をプールした。次に、疎水性相互作用プールをその後の精製のために さらに処理することができる。 本発明を上記特定の実施態様に関連して説明したが、その多くの代替え、改良 及び変更は当業者に明らかであると思われる。このような代替え、改良及び変更 の全ては、請求の範囲によってのみ制限される、本発明の要旨及び範囲に入るよ うに意図される。

【手続補正書】 【提出日】１９９５年９月５日 【補正内容】 （１）請求の範囲を以下の通り補正する。 『 １．溶液中に含まれるヒトインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の精製方 法であって、 （ａ）ＩＬ−１０を含む溶液に対してカチオン交換クロマトグラフィーを実施 し、それによってＩＬ−１０含有画分を得る工程と； （ｂ）工程（ａ）からのＩＬ−１０含有画分に対してアニオン交換クロマトグ ラフィーを実施し、それによってＩＬ−１０含有画分を得る工程と； （ｃ）工程（ｂ）からのＩＬ−１０含有画分に対してヒドロキシアパタイトク ロマトグラフィーを実施し、それによってＩＬ−１０の単独単離ダイマーを含む 画分を得る工程とを含む前記方法。 ２．ＩＬ−１０が原核発現系によって産生され、封入体から変性され、精製 前に再生される請求項１記載の方法。 ３．ＩＬ−１０含有タンパク質画分中に存在する種々なＩＬ−１０ダイマー を分離する方法であって、 ＩＬ−１０含有画分に対して、種々なＩＬ−１０ダイマーが相互から分離する 条件下でのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを実施する工程を含む前記 方法。 ４．異なるダイマーが異なるＮ末端アミノ酸配列を有するタンパク質画分中 に含まれるタンパク質の種々なダイマーを分離する方法であって、 タンパク質画分に対して、タンパク質の種々なダイマーが相互から分離する条 件下でのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを実施する工程を含む前記方 法。 ５．溶液中に含まれるアセチル化ＩＬ−１０ホモダイマーとアセチル化ＩＬ −１０ヘテロダイマーとから、非アセチル化ＩＬ−１０ホモダイマーを分離する 方法であって、 溶液に対して非アセチル化ホモダイマーがアセチル化ホモダイマー及びアセチ ル化ヘテロダイマーから分離される条件下でアニオン交換クロマトグラフィーを 適用する工程を含む前記方法。』

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｋ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 タン，ジョン アメリカ合衆国ニュージャージー州07039, リヴィングストン，キャメロット・ドライ ブ 19

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．溶液中に含まれるヒトインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の精製方 法であって、 （ａ）ＩＬ−１０を含む溶液に対してカチオン交換クロマトグラフィーを実施 し、それによってＩＬ−１０含有画分を得る工程と； （ｂ）工程（ａ）からのＩＬ−１０含有画分に対してアニオン交換クロマトグ ラフィーを実施し、それによってＩＬ−１０含有画分を得る工程と； （ｃ）工程（ｂ）からのＩＬ−１０含有画分に対してヒドロキシアパタイトク ロマトグラフィーを実施し、それによってＩＬ−１０の単独単離ダイマーを含む 画分を得る工程とを含む前記方法。 ２．工程（ａ）のカチオン交換クロマトグラフィーカラムがサポートマトリ ックスに結合したスルホネート交換基を含む請求項１記載の方法。 ３．サポートマトリックスがアガロースである請求項２記載の方法。 ４．アニオン交換クロマトグラフィーカラムがサポートマトリックスに結合 した第４級アミノエチル交換基を含む請求項１記載の方法。 ５．サポートマトリックスがアガロースである請求項４記載の方法。 ６．工程（ｃ）から得られたＩＬ−１０含有画分をゲル濾過クロマトグラフ ィーカラムに供給して、高分子量不純物も低分子量不純物も実質的に含まないダ イマーＩＬ−１０を得る工程をさらに含む請求項１記載の方法。 ７．ゲルが１〜６００ｋＤａの分画範囲を有する請求項６記載の方法。 ８．ＩＬ−１０が原核発現系によって産生され、封入体から変性され、精製 前に再生される請求項１記載の方法。 ９．ＩＬ−１０が細胞培養培地中で真核細胞から分泌される請求項１記載の 方法。 １０．ＩＬ−１０含有タンパク質画分中に存在する種々なＩＬ−１０ダイマ ーを分離する方法であって、 ＩＬ−１０含有画分に対して、種々なＩＬ−１０ダイマーが相互から分離する 条件下でのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを実施する工程を含む前記 方法。 １１．タンパク質画分中に存在するＩＬ−１０ダイマーが△０：△０、△０ ：△２及び△２：△２ＩＬ−１０ダイマーであり、△０：△０ダイマーを回収す る請求項１０記載の方法。 １２．存在するＩＬ−１０ダイマーが非共有結合ＩＬ−１０ダイマーと共有 結合ＩＬ−１０ダイマーとであり、非共有結合ＩＬ−１０ダイマーを回収する請 求項１０記載の方法。 １３．異なるダイマーが異なるＮ末端アミノ酸配列を有するタンパク質画分 中に含まれるタンパク質の種々なダイマーを分離する方法であって、 タンパク質画分に対して、タンパク質の種々なダイマーが相互から分離する条 件下でのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを実施する工程を含む前記方 法。 １４．タンパク質の変異体が種々なＮ末端アミノ酸配列を有するタンパク質 画分中に含まれるタンパク質の変異体の分離方法であって、 タンパク質画分に対してタンパク質の変異体が相互から分離する条件下でヒド ロキシアパタイトクロマトグラフィーを実施する工程を含む前記方法。 １５．溶液中に含まれるアセチル化ＩＬ−１０ホモダイマーとアセチル化Ｉ Ｌ−１０ヘテロダイマーとから、非アセチル化ＩＬ−１０ホモダイマーを分離す る方法であって、 溶液に対して非アセチル化ホモダイマーがアセチル化ホモダイマー及びアセチ ル化ヘテロダイマーから分離される条件下でアニオン交換クロマトグラフィーを 適用する工程を含む前記方法。