JP2014534205A - 非アセチル化タンパク質からのアセチル化タンパク質の分離 - Google Patents
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Abstract
本発明は、非アセチル化タンパク質からアセチル化タンパク質を分離する方法に関する。特に、本発明は、マルチモードクロマトグラフィーを使用して、非アセチル化タンパク質からアセチル化タンパク質を分離する方法に関する。先行技術においては、マルチモードクロマトグラフィーは抗体を単離するために使用されている。本発明は、マルチモードクロマトグラフィーを非アセチル化タンパク質からのアセチル化タンパク質の分離に使用することができることを発見した。
Description
本発明は、非アセチル化タンパク質からアセチル化タンパク質を分離する方法に関する。特に、本発明は、マルチモードクロマトグラフィーを使用して、非アセチル化タンパク質からアセチル化タンパク質を分離する方法に関する。
タンパク質修飾により、可能な分子構造の範囲は20種のコードされたアミノ酸により課される制限を超えて拡がっており、またその修飾が可逆的である場合には、制御および伝達の手段が提供される。アセチル化は、翻訳と同時および翻訳後に起こるタンパク質の修飾である。少なくとも真核細胞タンパク質では、アセチル化は、報告されている200種以上の共有結合性の修飾のうち、最も一般的な修飾である。タンパク質のアセチル化は、アセチル基を、アセチルコエンザイムAから、アミノ末端残基のαアミノ基または、様々な位置のリジン残基のεアミノ基のいずれかへ転移させる広汎なアセチルトランスフェラーゼによって触媒される。アミノ末端のアセチル化は、アセチル化真核細胞タンパク質の大半においては翻訳と同時に起こり、原核細胞リボソームタンパク質およびプロセス化された真核細胞制御ペプチドにおいては翻訳後に起こる。さらには、εリジンのアセチル化は、ヒストン、高速移動群(Highly mobility group;HMG)タンパク質、転写因子、核受容体およびαチューブリンにおいて翻訳後に起こる。アセチル化は、酵素活性、安定性、DNA結合性、タンパク質間相互作用、およびペプチド受容体認識を含む多くのタンパク質機能に影響を与え、多種多様なタンパク質が生じる。従って、アセチル化タンパク質の精製は、当該分野における課題である。
一方で、組み換えタンパク質を生産する方法は当分野でよく知られている。Escherichia coli (E.coli)由来の組み換えタンパク質は、翻訳後修飾のために種々の形態の混合物となることが報告されている。例えば、Susumu Hondaらは、E.coli由来の、Cys-Tyr-Cysを有するヒトインターフェロンγが、N末端で部分的にアセチル化されることを報告し、ｒIFN-7のN末端部位がヘテロであることを示唆している(Susumu Honda et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 269, No. 2, March, pp. 612-622, 1989)。Elodie Charbautらは、E.coli内で発現させた5つの哺乳類スタスミン(stathmin)様サブドメインを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)およびナノエレクトロスプレーイオン化飛行時間型タンデム質量分析(nanoESI-Q-TOF tandem mass spectrometry)によって明らかにし、E.coli内において異所性の組み換えタンパク質が広範囲でNK-アセチル化され得ること、および、NK-アセチル化を支配する規則性は複雑であり、真核細胞においてもN-末端領域を含んでいることを実証した(Elodie Charbaut et al. FEBS Letters 529 (2002)341-345)。組み換えタンパク質のアイソフォームには、二量体、N-メチオニン含有型(米国特許第5196323号)、還元型、ジスルフィド架橋アイソフォーム(米国特許第4765903号)、および電荷アイソフォーム(Klein ML et al., Arch. Biochem. Biophys., 276(2):531-7, 1990)が含まれる。従って、組成的および立体的なバリアントはそれらの天然分子に非常に類似した性質を有するため、正しく修飾されたアイソフォームの分離は簡単ではない。
Andrea O. Helbigらは、専用の質量分析によるプロテオミクス技術を使用し、半網羅的手法でN末端プロセシングを解明することができることを報告した。報告されたマルチプロテアーゼ法により、HEK293細胞において、1391のアセチル化されたヒトタンパク質のN末端が同定され、メチオニンアミノペプチドによる切断効率における、最後から二番目の位置が果たす役割は、大腸菌からヒトまで必須に保護されていることが明らかにされた(Andreas O. Helbig et al., Molecular & Cellular Proteomics 9:928-939, 2010)。さらには、多くの様々なクロマトグラフィー法が使用され、アセチル化タンパク質の分離と組み合わせられてきた。この、最も一般的なタンパク質分離法は、精製されるタンパク質と混入物との間のサイズ、電荷および相溶性の違いを基礎としている。これらのパラメーターに基づいたプロトコルには、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーが含まれる。Evert-Jan Sneekesaらは、キャピラリーポリスチレン-ジビニルベンゼン(PS-DVB)一体型カラムを使用し、アセチル化が異なる無傷のIM9タンパク質アイソフォームを分離したことを開示し、アセチル化の数だけでなくタンパク質上の位置が、保持に重大な影響を及ぼすことを示唆した(Evert-Jan Sneekesa et al., Journal of Chromatography A, 1194 (2008)199-204)。米国特許第6620918号は、イオン交換クロマトグラフィーを使用し、ポリペプチドモノマーをダイマーおよび/または他のマルチマーから分離する方法を提供している。米国特許第6005075号は、インターフェロン-α-2aを精製する方法、要するに、0.6Mグアニジン溶液でのリフォールディングおよび空気による酸化の後のクロマトグラフィー的スキームを示している。
しかしながら、アセチル化タンパク質の分離は、未だ達成されていない。従って、高い回収率でアセチル化タンパク質を分離する方法を開発する必要性がある。
Susumu Honda et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 269, No. 2, March, pp. 612-622, 1989
Klein ML et al., Arch. Biochem. Biophys., 276(2):531-7, 1990)
Elodie Charbaut et al. FEBS Letters 529 (2002)341-345
本発明は、非アセチル化タンパク質からアセチル化タンパク質の分離;例えば、所望のアセチル化タンパク質の分離または微生物による組み換えタンパク質生産の間に生じたアセチル化バリアントの除去を、マルチモードクロマトグラフィーを用いる単純で時間を節約する方法を成功裏に開発する。
本明細書において言及するすべての刊行物および特許文献は、例えば、記載された本発明に関連して使用され得る刊行物に記載された構成及び方法論を記載するおよび開示する目的で、参照により本明細書中に組み込まれる。本明細書で議論された刊行物は、単に本明細書の出願日前の開示を提供するにすぎない。本明細書のいかなる記載も、このような先行発明またはその他のいかなる理由により、発明者が特許を与えられないことを認めるものではない。
本発明書において他に定義がない場合は、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当技術分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解される意味を有する。用語の意味および範囲は、明らかであるが、万一潜在的に不明瞭性がある場合には、本明細書で提供された定義が、辞書または付帯的ないかなる定義にも優先する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される際、単数形は、文脈上明らかに示されていない限りは、複数形を含む。
用語「組み換えタンパク質」は、本明細書において使用される場合、比較的純粋な形態で回収することが望ましいタンパク質であると定義され、天然タンパク質およびそれらのアナログならびに置換、欠失、転換または修飾された配列を有する変異体のアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。
用語「組み換え発現ベクター」は、DNA(RNA)配列からタンパク質を発現するためのプラスミドもしくはファージもしくはウイルスまたはベクターのことをいう。発現ビヒクルは、(1)遺伝子エレメントまたは遺伝子発現を制御する役割を有するエレメント、例えばプロモーターまたはエンハンサー、(2)mRNAへ転写およびタンパク質へ翻訳される構造領域またはコード領域、および、(3)適切な転写開始配列および停止配列のアセンブリを含む転写ユニットを含む。
用語「翻訳後修飾」は、翻訳後のタンパク質の化学的修飾を意味する。
用語「同時翻訳」は、組み換えDNAにおいて生じるハイブリッドmRNA分子の翻訳を通じて、使用された臓器から分泌される正常タンパク質に共有結合する所望のタンパク質産物からなるハイブリッド分子の合成を意味する。
用語「形質転換」は、DNAを生物に導入して、染色体外エレメントとしてまたは染色体に統合することによってDNAを複製可能とすることを意味する。用語「形質移入」は、コード配列が実際に発現しているかどうかに関わらず、適する宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。
用語「生物学的活性」は、本明細書において使用される場合、例えば天然または非天然に発生する分子と類似または同一の、生命体における構造的、制御的、生化学的またはその他の生物学的機能を意味する。
用語「マルチモードクロマトグラフィー支持体」は、結合する化合物と相互作用する、少なくとも二種の、異なるが同時に作用する部位を提供することができるものをいう。例えば、これらの部位のうちの一つが、リガンドと対象物質の電荷-電荷相互作用の引力を有する型を提供し得る。他方の部位は、電子供与性-受容性相互作用ならびに/または疎水性および/もしくは親水性相互作用を提供し得る。電子供与性-受容性相互作用には、水素結合、パイ-パイ、陽イオン-パイ、電荷輸送、双極子-双極子、誘起双極子などの相互作用が含まれる。「マルチモードクロマトグラフィー支持体」はまた、「ミックスモード」分離マトリクスとしても知られている。米国特許第7714112号は、液体サンプル中のその他の化合物から抗体を分離する方法に関している。当該方法においては、抗体が液体中で遊離したまま、前記サンプルを含む移動相はマルチモード分離マトリクスに接触して望ましくない化合物を吸着しており、マルチモード分離マトリクスは、標的化合物の負の電荷を有する部位と相互作用することができる第一の基、および、標的化合物と電荷-電荷相互作用以外の少なくとも一種の相互作用をすることができる第二の基を含む。この先行技術文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
用語「クロマトグラフィー」は、分離方法に密接に関連する系統を包含する。クロマトグラフィーを他の大部分の物理的および化学的な分離方法と区別する特徴は、相互に混和しない二つの相が接触し、一方の層が固定され他方の層が移動するという点である。
用語「官能基」は、本明細書において、標的分子または標的化合物と相互作用することができるという意味で官能性のある基または分子に対して使用される。
用語「溶出液」は、当分野における通常の意味(すなわち、一つまたは複数の化合物を分離マトリクスから放出させるために適するpHおよび/またはイオン強度の緩衝液)で使用される。
用語「インターフェロン」は、ウイルス感染またはマイトジェンの曝露を含む様々な環境刺激に曝露された種々の真核細胞によって生産される分泌タンパク質の系統をいう。抗ウイルス特性を有することに加え、インターフェロンは広汎な細胞機能に影響を与えることが示されている。すべてのインターフェロンユニットは、本明細書において、WHO国際基準、94/786(rHuIFN-.α コンセンサス)および95/650(rHuIFN-.α2a)を参照として表される。本発明によると、インターフェロンにはコンセンサスインターフェロンおよびインターフェロン様産物が含まれる。
。
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一態様において、本発明は、アセチル化タンパク質および非アセチル化タンパク質を含む未精製物をマルチモードクロマトグラフィー支持体に適用し、pHを変化させて溶出を行う工程を含む、アセチル化タンパク質を非アセチル化タンパク質から分離する方法を提供する。
本発明によると、未精製物はアセチル化タンパク質および非アセチル化タンパク質を含む任意のものである。好ましくは、未精製物は、pH6と7の間で適用される。好ましくは、未精製物は細胞に由来する。さらに好ましくは、未精製物は原核細胞に由来する。
本発明によると、マルチモードクロマトグラフィー支持体は、非アセチル化タンパク質からアセチル化タンパク質を分離するために使用される。マルチモードクロマトグラフィー支持体は、疎水性基および陰イオン交換基を含む。
マルチモードクロマトグラフィー支持体は、好ましくはクロマトグラフィーカラムで提供される。好ましくは、マルチモードクロマトグラフィー支持体は、Capto(商標)adhereである。マルチモードクロマトグラフィーは、参照として全体が本明細書に組み込まれるKjell Erikssonら(BioProcess International 7(2) (February2009); Jie Chen et al, 2010, Journal of Chromatography A, 1217, pp.216-224)、および米国特許第7714112号に開示されている。これらの先行技術文献においては、マルチモードクロマトグラフィーを使用して、モノクローナル抗体を分離している。これらの文献のいずれも、アセチル化タンパク質の分離においてマルチモードクロマトグラフィーを使用していない。
一実施形態において、マルチモードクロマトグラフィー支持体は、液体クロマトグラフィー（すなわち、マルチモードクロマトグラフィー支持体を含むクロマトグラフィーカラムを移動相が通過することによって）において使用される。支持体は、本質的に球状の粒子などの多孔質または非多孔質の粒子の形態、モノリス、フィルター、膜、表面、キャピラリーまたはその他の一般的に使用される任意の形式であり得る。別の実施形態において、マルチモードクロマトグラフィー支持体は、拡張床クロマトグラフィー(すなわち、移動相を、本質的に球状の粒子などの粒子の形態の、高密度フィラーを含む分離マトリクスの拡張床に加えることによる)において使用される。別の実施形態において、マルチモードクロマトグラフィー支持体は、分離マトリクスを液体サンプルを含む管に加える、バッチ法において使用される。
本発明によると、マルチモードクロマトグラフィー支持体の疎水性基は、芳香族基、複素芳香族基または非芳香族疎水性基(アルキル基など)を含む。好ましくは、疎水性基はヘキシル基、ブチル基、フェニル基またはエーテル基である。
本発明によると、マルチモードクロマトグラフィー支持体の陰イオン交換基は、強力な陰イオン交換体であり得る。この文脈において、用語「強力な」陰イオン交換体は、広汎なpH範囲内で電荷を有するままである基として理解される。より有利な実施形態において、強力な陰イオン交換基は、第四級アミンである。別の実施形態において、マルチモードクロマトグラフィー支持体の陰イオン交換基は弱いイオン交換体であり得る。この文脈において、用語「弱い」陰イオン交換体とは、あるpH値で電荷を有し、pHが変わることによって電荷を失い得る基を意味するものとして理解される。
一実施形態において、アセチル化タンパク質を分離するために、サンプルがマルチモードクロマトグラフィー支持体に接触してアセチル化タンパク質が吸着され、次に、pH変化と共に溶出を行って、アセチル化タンパク質を支持体に保持する一方で非アセチル化タンパク質を溶出する。一実施形態において、第一ステップにおいて、アセチル化タンパク質を含むサンプルを、アセチル化タンパク質の支持体への吸着を可能にする条件下で、マルチモードクロマトグラフィー支持体を通過させる。支持体の容量を超えないよう(すなわち、フローは十分な吸着を可能にするよう十分に低速であるべきである)注意を要する。次のステップにおいては、pH勾配下および非アセチル化タンパク質を溶出するその他の条件下で、マルチモードクロマトグラフィー支持体を使用して溶出を行う。本発明によると、溶出のためのpH変化は段階的または勾配を有する。好ましくは、pH変化は7〜3の間で実施する。より好ましくは、投入されるタンパク質混合物は6.0〜7.0のpH範囲であり、pH変化は5.5〜3.0の間で行う。好ましい実施形態においては、溶出液は酢酸およびアンモニウムを含む。本発明によると、非アセチル化タンパク質を溶出するその他の条件は、一般的には塩濃度(すなわちイオン強度、疎水性など)により提供される。クロマトグラフィーの一般的原理は、当分野においてよく知られており、この分野の当業者は、本発明の方法を使用するために必要なパラメーターを容易に選定することができる。
好ましい実施形態において、必要であれば、一つまたは複数の洗浄ステップを、本発明の方法の任意のステップの前または間に適用し得る。
本発明の方法によると、前記方法は、翻訳後アセチル化タンパク質、および発現系における組み換えタンパク質生産の同時翻訳の間に生じたアセチル化不純物の分離において使用され得る。好ましくは、本発明の方法は、インスリン、ソマトトロピン、インターロイキン、インターフェロンまたはソマトメジンの精製において使用され得る。
一実施形態において、本発明の方法は、組み換えタンパク質の精製において使用され、それらからアセチル化形態を除去することができる。従って、本発明は、発現系から得られた組み換えタンパク質産物を精製する方法であって、i)マルチモードクロマトグラフィー支持体に、発現系から得られ、リフォールディングされた組み換えタンパク質混合物を適用するステップ、および、ii)pH変化を伴う溶出を行い、本質的にアセチル化タンパク質を含まない組み換えタンパク質産物を得るステップを含む方法を提供する。好ましくは、発現系は、微生物、酵母または哺乳類の発現系である。
さらなる実施形態において、本発明の方法は、組み換えインターフェロンを精製するために使用される。よって、本発明は、発現系から得られた組み換えインターフェロン産物を精製してそれらの非アセチル化形態を得る方法を提供し、当該方法は、
(a)発現系から生産され、可溶化およびリフォールディングされたインターフェロンを、疎水性相互作用クロマトグラフィーに供するステップであって、インターフェロンがアセチル化形態および非アセチル化形態を含むステップ、および
(b)ステップ(a)で得られたインターフェロンを、本明細書で言及した非アセチル化タンパク質からアセチル化タンパク質を分離する方法に供して、非アセチル化形態のインターフェロンを得ることができるステップ、
を含む。
(a)発現系から生産され、可溶化およびリフォールディングされたインターフェロンを、疎水性相互作用クロマトグラフィーに供するステップであって、インターフェロンがアセチル化形態および非アセチル化形態を含むステップ、および
(b)ステップ(a)で得られたインターフェロンを、本明細書で言及した非アセチル化タンパク質からアセチル化タンパク質を分離する方法に供して、非アセチル化形態のインターフェロンを得ることができるステップ、
を含む。
本発明によると、発現系においては、精製されるインターフェロンは、先行技術で開示された、アセチル化タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された大腸菌(Escherichia coli)または出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)などの宿主細胞から得ることができる。さらに好ましくは、インターフェロンはインターフェロン-αである。さらに好ましくは、インターフェロンはIFN-α2aおよびIFN-α2bである。不溶性部分を分離するために、組み換え宿主細胞を、遠心分離またはフィルター濾過とその後の従来技術を適用する破砕(例えば、浸透圧ショック、超音波処理、粉砕または化学薬品)により、培養液から回収する。不溶性部分を、緩衝液で、好ましくはTris緩衝液で好ましくは洗浄する。一実施形態において、封入体を、Tris/グアニジン塩酸(GdHCl)緩衝液で洗浄する。
本発明の方法によると、ステップ(a)においては、発現系で生産され、可溶化されリフォールディングされたインターフェロンを疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)に供する。HICは、生体分子の分析分離および調製分離の両方において、強力な技術である。当該技術は、タンパク質表面に位置する疎水性領域に対して有利である。HICは困難な分離、特に不純物の等電点または分子量が類似している場合に適している。当該目的に適するクロマトグラフィーカラムは、種々の区分及び長さでよく、HIC樹脂は商業的に入手可能なものから選択される。タンパク質と吸着材料が接触する段階中のpHは、供給される溶液のpHである。本発明の方法によると、本発明の目的に適するHIC樹脂材料は、インターフェロンに疎水的に結合することができ、様々な商標下で商標的に入手可能であるものから選択される。好ましくは、HICカラムは、Toyopearlシリーズ (Tosch Biosience LLC)である。より好ましくは、HICカラムはToyopearl Buty-650Mである。
本発明の方法によると、ステップ(b)において、ステップ(a)に由来するインターフェロンをさらに、マルチモードクロマトグラフィーを用いる本発明の方法に供する。マルチモードクロマトグラフィーは、好ましくは、高流速で使用する事が可能である固いアガロースマトリクスに基づく。高架橋アガロースベース支持体は、高い化学的及び物理的安定性を媒体に付与する。マルチモードクロマトグラフィー支持体は、標的化合物の負の電荷を有する部位と相互作用することができる第一の基、および、当該標的化合物と電荷-電荷相互作用以外の少なくとも一つの相互作用をすることができる第二の基を含む。マルチモードクロマトグラフィー支持体は、クロマトグラフィーカラムにおいて提供される。好ましくは、マルチモードクロマトグラフィーはCapto(商標)adhereを使用する。
本発明によると、HICおよびマルチモードクロマトグラフィーは、配列バリアントを分離することができる。HICの第一のカラムのステップは、共有結合性の凝集体を除去することを目的としており、第二のマルチモードクロマトグラフィーカラムは、アセチル化バリアントを分離することを意図している。
本発明によると、ステップ(a)において、発現系における組み換えタンパク質産物から得られた組み換えインターフェロンの不溶性体を可溶化し、その後得られたインターフェロンを酸化剤の存在下でリフォールディングすることにより、可溶化しリフォールディングしたインターフェロンが得られる。本発明によると、不溶性体を可溶化することが出来る任意の適した可溶化剤を、本発明において使用することが出来る。本発明の一実施形態において、カオトロピック剤または洗浄剤を、封入体の可溶化に使用することが出来る。好ましくは、カオトロピック剤は尿素、グアニジン塩酸塩であり、洗浄剤はSDS、N-アセチルトリメチルアンモニウムクロリド、またはN-ラウロイルサルコシンナトリウムである。より好ましくは、可溶化剤はグアニジン塩酸塩である。不溶性体を分離し可溶化する技術は、本明細書にその全体が参照として組み込まれているJournal of Bioscience and Bioengineering(Vol. 99, No.4, 303-310, 2005)などに開示されている通り、当分野において知られている。一実施形態において、封入体をTris/GdHCl/Tweenに溶解し、1〜5mg/mLのインターフェロンを得る。
本発明によると、可溶化させたインターフェロンのリフォールディングは、酸化剤の存在下で実施する。酸化剤はシステインを選択的に酸化することができる。好ましくは、酸化剤はヨウ素またはヨードソベンゾエートであり；好ましくは、酸化剤はo-ヨードソベンゾエートである。酸化剤は、システイン残基を選択的及び化学量論的に酸化するために使用される。この点において、用語「選択的」とは、酸化剤が、(1)システインを、ジスルフィドレベルに酸化し、より高いレベルにまで酸化しないまたはわずかに酸化するに留まり、(2)還元されたタンパク質中に近接して位置する活性なシステインを優先的に酸化することを意味する。合成タンパク質に対する酸化剤のモル比は、使用される酸化剤によって幅広く変わり得る。当該モル比は、少なくとも化学量論的(1:1またはより多い)であり、典型的には1:1から100：1の範囲である。o-ヨードソベンゾエートの場合は、当該モル比は通常約1：1から約5：1の範囲である。すべての例において、酸化剤は、反応の最終部分の間、還元されたタンパク質の完全な酸化を確実にする量を超える。これらの条件は、反応期間全体にわたって酸化剤過剰で反応が進行することによって、または、反応期間の大部分にわたって凡そ等モル量の反応物質で反応が進行し、反応期間の終わり近くに過剰量の酸化剤を添加することによって、達成され得る。o-ヨードソベンゾエートの使用などによるチオール基の酸化は、本明細書に参照としてその全体が組み込まれている米国特許第4530787号で参照することが出来る。
高い回収率を維持する一方で、宿主の不純物を除去することは、本発明の主要な課題である。本発明は、当分野におけるクロマトグラフィーで4つのカラムのステップを用いる方法に代わって、2つのカラムのステップを用いる方法を実証する。本明細書で得られた生産物は、純度および収率が高く；例えば、全体の回収率は最大30-40％であり、95％よりも高い純度の収率を達成することが出来る
実施例1 本発明の方法を使用するIFN-α-2aの精製
<遺伝子クローニング、プラスミド設計および細胞培養>
IFN-α遺伝子クローニング、プラスミド設計およびコドン最適化を、組み換えDNA技術によって実施した。組み換えIFN-α-2aは、IFN-α-2aの遺伝子を含有するプラスミドPET30aを有するBL21(DE3)菌(細胞)において、不溶性封入体として発現させた。培養は、5L流加培養において、溶存酸素レベル30％で実施した。1mM IPTGで3時間誘導後、遠心分離によって細胞を培養液から回収した。細胞ペーストを20 mM Tris pH 7.4/ 0.5 mM EDTA緩衝液で洗浄し、その後、超音波処理によって細胞を破砕するために、同じ緩衝液で再懸濁した。IBを遠心分離によって収集した。
<遺伝子クローニング、プラスミド設計および細胞培養>
IFN-α遺伝子クローニング、プラスミド設計およびコドン最適化を、組み換えDNA技術によって実施した。組み換えIFN-α-2aは、IFN-α-2aの遺伝子を含有するプラスミドPET30aを有するBL21(DE3)菌(細胞)において、不溶性封入体として発現させた。培養は、5L流加培養において、溶存酸素レベル30％で実施した。1mM IPTGで3時間誘導後、遠心分離によって細胞を培養液から回収した。細胞ペーストを20 mM Tris pH 7.4/ 0.5 mM EDTA緩衝液で洗浄し、その後、超音波処理によって細胞を破砕するために、同じ緩衝液で再懸濁した。IBを遠心分離によって収集した。
<封入体の可溶化>
IBを適切な体積の50 mM Tris pH7.4/7.0 GdHCl/2% tween 80に溶解し、4 mg/mLのIFN-α-2aを得た。室温で1時間穏やかに撹拌し、完全に溶解した。タンパク質溶液を50 mM Tris pH7.4緩衝液で11倍に希釈した。不溶性のデブリスを、30分間の冷却遠心で除去した。
IBを適切な体積の50 mM Tris pH7.4/7.0 GdHCl/2% tween 80に溶解し、4 mg/mLのIFN-α-2aを得た。室温で1時間穏やかに撹拌し、完全に溶解した。タンパク質溶液を50 mM Tris pH7.4緩衝液で11倍に希釈した。不溶性のデブリスを、30分間の冷却遠心で除去した。
<ジスルフィド酸化>
ジスルフィド酸化に先立ち、50 mM Tris pH7.4緩衝液中の1 mMヨードソベンゾエートを調製した。10μΜヨードソベンゾエートを、1時間ごとに5回タンパク質溶液に導入した(合計50μΜ)。タンパク質溶液を穏やかに撹拌しながら室温でインキュベートした。
ジスルフィド酸化に先立ち、50 mM Tris pH7.4緩衝液中の1 mMヨードソベンゾエートを調製した。10μΜヨードソベンゾエートを、1時間ごとに5回タンパク質溶液に導入した(合計50μΜ)。タンパク質溶液を穏やかに撹拌しながら室温でインキュベートした。
<疎水性相互作用クロマトグラフィー>
1 mM EDTAおよび10 mMメチオニンをタンパク質溶液に加え、続いて固体硫酸アンモニウムを加えて1 Mとした。pHを酢酸でpH6.5に調節した。粒子を遠心分離および濾過で除去した後、クロマトグラフィー精製を以下の通り実施した。
Toyopearl Butyl-650M, 5x5 cm, 流速 25 ml/分、
緩衝液A: 20 mM NaPi pH 6.5/1.0M AmS04/l mM EDTA/ 10 mM メチオニン、
緩衝液B: 20 mM NaPi pH 6.5/1 mM EDTA/ 10 mM メチオニン。
1 mM EDTAおよび10 mMメチオニンをタンパク質溶液に加え、続いて固体硫酸アンモニウムを加えて1 Mとした。pHを酢酸でpH6.5に調節した。粒子を遠心分離および濾過で除去した後、クロマトグラフィー精製を以下の通り実施した。
Toyopearl Butyl-650M, 5x5 cm, 流速 25 ml/分、
緩衝液A: 20 mM NaPi pH 6.5/1.0M AmS04/l mM EDTA/ 10 mM メチオニン、
緩衝液B: 20 mM NaPi pH 6.5/1 mM EDTA/ 10 mM メチオニン。
タンパク質溶液を、緩衝液Aで平衡化したカラムに投入した。投入後、カラムを、OD280がほぼ0になるまで、少なくとも5CVの100％の緩衝液Aで洗浄した。タンパク質を、2CVより多い20％の緩衝液B、2CVより多い40％の緩衝液B、2CVより多い60％の緩衝液B、2CVより多い80％の緩衝液B、および2CVより多い100％の緩衝液Bで、一連の手順で溶出した。カラムを水、0.5 NのNaOHおよび0.1 NのHClで浄化した後、緩衝液Aで再生した。各画分18 mLを収集し、サンプルをRP-HPLCで分析した。本質的に凝集したIFN-α-2aを含まない画分をプールした。
<マルチモードクロマトグラフィー>
5 mM酢酸アンモニウム緩衝液(pH6.5)を導入し、硫酸アンモニウムを最終伝導率15 mS/cm未満になるまで希釈した。クロマトグラフィー精製を以下の通り実施した。
Capto Adhere 2.6x6 cm、流速6.7 ml/分、
緩衝液C: 50% 酢酸を加えることによる、25 mM酢酸アンモニウム緩衝液(pH 6.5)、
緩衝液D: 5 mM 酢酸
5 mM酢酸アンモニウム緩衝液(pH6.5)を導入し、硫酸アンモニウムを最終伝導率15 mS/cm未満になるまで希釈した。クロマトグラフィー精製を以下の通り実施した。
Capto Adhere 2.6x6 cm、流速6.7 ml/分、
緩衝液C: 50% 酢酸を加えることによる、25 mM酢酸アンモニウム緩衝液(pH 6.5)、
緩衝液D: 5 mM 酢酸
希釈タンパク質溶液を、予め緩衝液Cで平衡化したカラムに投入した。完了後、カラムを3CVの60％の緩衝液Dで洗浄した。標的タンパク質を80％の緩衝液Dで溶出した。IFN-α-2aのクロマトグラムを図1に示す。カラムを、100％の緩衝液C、続いて2M NaCl、1N NaOH、2M NaClおよび0.1 M酢酸で浄化した。各画分17 mLを収集し、サンプルをRP-HPLCによって分析した。本質的にアセチル化アイソフォームを含まない画分をプールした。得られた産物を、それぞれの純度を比較することによって評価した。SDS-PAGE分析の結果を図2に示す。
純度において仕様が適合するCapto Adhereカラムに由来する画分をプールし、3-KD遠心式フィルターを使用して3 mg/mLより高い濃度に濃縮した。精製された大部分をさらに、0.2μmのメンブレンで濾過した。各段階におけるIFN-α-2aの収率を表1に示す。アセチル化IFNの量は、封入体で約20〜30％であった。前記クロマトグラフィーのステップを実施した後、アセチル化IFNは検出されない。
実施例2 本発明の方法を使用するIFN-α-2bの精製
IFN-α-2b生産を実施例1と同じやり方で実施した。IFN-α-2bの全体の収率を表2に示す。本質的にアセチル化アイソフォームを含まない、得られた画分をプールした。IFN-α-2bのクロマトグラムを図3に示す。得られた産物を、それぞれの純度を比較することによって評価した。SDS-PAGE分析の結果を図4に示す。アセチル化IFNの量は、封入体で約20〜30％であった。前記クロマトグラフィーのステップを実施した後、アセチル化IFNは検出されない。
IFN-α-2b生産を実施例1と同じやり方で実施した。IFN-α-2bの全体の収率を表2に示す。本質的にアセチル化アイソフォームを含まない、得られた画分をプールした。IFN-α-2bのクロマトグラムを図3に示す。得られた産物を、それぞれの純度を比較することによって評価した。SDS-PAGE分析の結果を図4に示す。アセチル化IFNの量は、封入体で約20〜30％であった。前記クロマトグラフィーのステップを実施した後、アセチル化IFNは検出されない。
実施例3 実施例1のIFN-α-2aおよび実施例2のIFN-α-2bの分析試験
実施例1のIFN-α-2aおよび実施例2のIFN-α-2bを分析した。
RP-HPLCにて決定されたIFN-α-2aおよびIFN-α-2bならびに関連タンパク質の不純物を、図5に示す。
Claims (24)
- アセチル化および非アセチル化タンパク質を含む未精製物をマルチモードクロマトグラフィー支持体に適用するステップ、および
pHを変化させて溶出を行うステップ
を含み、非アセチル化タンパク質からアセチル化タンパク質を分離する方法。 - 前記マルチモードクロマトグラフィー支持体が、疎水性基および陰イオン交換基を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記マルチモードクロマトグラフィー支持体の疎水性基が、芳香族基、複素芳香族基または非芳香族疎水性基(アルキル基など)を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記疎水性基が、ヘキシル基、ブチル基、フェニル基またはエーテル基である、請求項2に記載の方法。
- 前記マルチモードクロマトグラフィー支持体の陰イオン交換基が、強力な陰イオン交換体である、請求項2に記載の方法。
- 前記マルチモードクロマトグラフィー支持体が、Capto(商標)adhereである、請求項1に記載の方法。
- 前記未精製物が、pH6〜7の間で適用される、請求項1に記載の方法。
- 前記未精製物が、細胞由来である、請求項1に記載の方法。
- 前記未精製物が、原核細胞由来である、請求項1に記載の方法。
- 前記溶出のためのpH変化が、段階的であるまたは勾配を有する、請求項1に記載の方法。
- pH変化が、3〜7の間で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記溶出のpH変化が、3.0〜5.5の間で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記溶出が、酢酸およびアンモニウムを含む溶液で行われる、請求項1に記載の方法。
- インスリン、ソマトトロピン、インターロイキン、インターフェロンまたはソマトメジンの精製において使用される、請求項1に記載の方法。
- (a)発現系から生産され、可溶化されおよびリフォールディングされたインターフェロンを、疎水性相互作用クロマトグラフィーに供するステップであって、当該インターフェロンがアセチル化形態および非アセチル化形態を含むステップ、および
(b)ステップ(a)で得られたインターフェロンを、本明細書で言及した非アセチル化タンパク質からアセチル化タンパク質を分離する方法に供して、非アセチル化形態のインターフェロンを得ることができるステップ、
を含む、発現系で生産された組み換えインターフェロンを精製してその非アセチル化形態を得る方法。 - 前記インターフェロンがインターフェロンαである、請求項15に記載の方法。
- 前記インターフェロンが、IFN-α2aおよびIFN-α2bである、請求項15に記載の方法。
- ステップ(a)において可溶化されリフォールディングされた前記インターフェロンが、発現系における組み換えタンパク質生産によって得られた組み換えインターフェロンの不溶性体の可溶化と、その後得られたインターフェロンを酸化剤の存在下でリフォールディングすることによって得られる、請求項15に記載の方法。
- 前記可溶化が、カオトロピック剤または洗浄剤などの可溶化剤で行われる、請求項18に記載の方法。
- 前記カオトロピック剤が、尿素またはグアニジン塩酸塩である、請求項19に記載の方法。
- 前記洗浄剤が、SDS、N-アセチルトリメチルアンモニウムクロリドまたはN-ラウロイルサルコシンナトリウムである、請求項19に記載の方法。
- 前記可溶化剤が、グアニジン塩酸塩である、請求項19に記載の方法。
- 前記酸化剤が、ヨウ素またはヨードソベンゾエートである、請求項18に記載の方法。
- 酸化剤が、o-ヨードソベンゾエートである、請求項18に記載の方法。
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