TWI612056B - 自非乙醯化蛋白質分離乙醯化蛋白質 - Google Patents

Abstract

本發明係關於將乙醯化蛋白質與非乙醯化蛋白質分離之方法。具體而言，本發明係關於使用多元層析法，將乙醯化蛋白質與非乙醯化蛋白質分離之方法。在先前技術中，使用多元層析法分離抗體。本發明發現多元層析法可用於將乙醯化蛋白質與非乙醯化蛋白質分離。

Description

自非乙醯化蛋白質分離乙醯化蛋白質

本發明係關於將乙醯化蛋白質與非乙醯化蛋白質分離之方法。具體而言，本發明係關於使用多元層析法將乙醯化蛋白質與非乙醯化蛋白質分離之方法。

蛋白質之修飾將可能分子結構之範圍延伸超出由20個編碼胺基酸施加之限值，且(若可逆)產生控制及信號傳導之方式。乙醯化作為蛋白質之共轉譯及轉譯後修飾發生。至少對於真核蛋白質而言，乙醯化係已報告之200種以上類型中之最常見共價修飾。蛋白質之乙醯化係由多種乙醯基轉移酶催化，該等乙醯基轉移酶在不同位置處將乙醯基自乙醯基-輔酶A轉移至胺基末端殘基之α-胺基或離胺酸殘基之ε-胺基。胺基末端乙醯化在乙醯化真核蛋白質之主體上以共轉譯方式發生，且在原核核糖體蛋白質上及經處理真核調節肽上以轉譯後方式發生。此外，ε-離胺酸乙醯化在組蛋白、高遷移率族(HMG)蛋白質、轉錄因子、核受體及α-微管蛋白上以轉譯後方式發生。乙醯化影響許多蛋白質功能(包括酶活性、穩定性、DNA結合、蛋白質-蛋白質相互作用及肽-受體識別)，且在多種不同蛋白質上發生。因此，業內標的係純化乙醯化蛋白質。

另一方面，產生重組蛋白之方法已為業內所熟知。報導已顯示源自埃希氏大腸桿菌(E.coli)之重組蛋白因轉譯後修飾給予不同形式之混合物。舉例而言，Susumu Honda等 人報導具有Cys-Tyr-Cys之源自埃希氏大腸桿菌之人類干擾素-γ在N末端處經部分乙醯化且表明rIFN-7之N末端部分係異源的(Susumu Honda等人，Archives of Biochemistry and Biophysics，第269卷，第2期，3月，第612-622頁，1989)。Elodie Charbaut等人藉由基質輔助之雷射解析/離子化飛行時間質譜及nanoESI-Q-TOF串列質譜表徵5種在埃希氏大腸桿菌中表現之哺乳動物司他斯敏(stathmin)樣-亞結構域，且證實異位重組蛋白可在埃希氏大腸桿菌中廣泛地NK-乙醯化，且管控NK-乙醯化之規則較複雜且涉及如真核生物中之N末端區域。(Elodie Charbaut等人FEBS Letters 529(2002)341-345)。重組蛋白之同型異構體包括二聚體、含N-甲硫胺酸形式(美國專利第5,196,323號)、還原形式、二硫橋同型異構體(美國專利第4,765,903號)及電荷同型異構體(Klein ML等人，Arch.Biochem.Biophys.,276(2)：531-7,1990)。因此，正確修飾之同型異構體之分離並不簡單，此乃因該等組成及構象變體之性質與天然分子之性質極為類似。

Andreas O.Helbig等人報導藉由使用基於質譜之專用蛋白質組學技術可以半綜合方式闡明N末端處理方法。所報導多蛋白酶方法可鑑別HEK293細胞中之1391乙醯化人類蛋白質N末端且揭示倒數第二個位置對由甲硫胺酸胺基肽酶之裂解效率的作用自埃希氏大腸桿菌至人類基本上保守(Andreas O.Helbig等人，Molecular & Cellular Proteomics 9：928-939,2010)。此外，已使用且組合多種不同層析方法 以分離乙醯化蛋白質。最常見蛋白質分離方法係根據欲純化蛋白質與污染物之間之大小、電荷及溶解性差異來預測。基於該等參數之方案包括親和層析、離子交換層析、尺寸排除層析及疏水性相互作用層析。Evert-Jan Sneekesa等人揭示，使用毛細管聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)單片管柱差異性分離乙醯化完整IM9蛋白質同型異構體，且表明乙醯化之數量及於蛋白質上之乙醯化位置二者均對保留具有顯著效應(Evert-Jan Sneekesa等人，Journal of Chromatography A,1194(2008)199-204)。US 6,620,918提供使用離子交換層析將多肽單體與二聚體及/或其他多聚體分離之方法。US 6,005,075證實純化干擾素-α-2a之方法；簡言之，已證實於0.6 M胍溶液中再摺疊且利用空氣氧化後之層析方案。

然而，尚未達成乙醯化蛋白質之分離。因此，業內仍需要研發以高回收率分離乙醯化蛋白質之方法。

本發明成功研發採用多元層析法將乙醯化蛋白質與非乙醯化蛋白質分離之簡單且節省時間的方法；舉例而言，分離期望乙醯化蛋白質或去除微生物重組蛋白產生期間生成之乙醯化變體。

本文所提及之所有出版物及專利皆以引用方式併入本文中，以達成闡述並揭示(例如)可結合本文所述本發明使用之出版物中所述的構築體及方法的目的。本文所論述公開案僅因為其揭示內容先於本申請案之申請日期而提供。絕 不能由於揭示內容為先前發明或任何其他原因而理解為承認本發明無權先於該揭示內容。

除非本文另外定義，否則結合本發明使用之科學及技術術語應具有彼等熟習此項技術者通常所瞭解之含義。該等術語之含義及範疇應明確；然而，本文所提供之定義即使有任何潛在歧義亦優先於任何字典或非固有定義。

除非上下文另外明確指明，否則本文及在隨附申請專利範圍中所使用單數形式「一」(「a」、「an」)及「該」(「the」)皆包括複數個指示物。

本文所用術語「重組蛋白」定義如下蛋白質：期望以相對純形式回收且包括具有天然蛋白質及其類似物之胺基酸序列的蛋白質及具有經取代、刪除、置換或以其他方式經修飾之序列的突變蛋白。

術語「重組表現載體」係指用於表現來自DNA(RNA)序列之蛋白質的質粒或噬菌體或病毒或載體。表現媒介可包含含有以下組裝之轉錄單元：(1)在基因表現中具有調節作用之遺傳元件，例如啟動子或增強子，(2)轉錄成mRNA且轉譯成蛋白質之結構或編碼序列，及(3)適當轉錄起始及終止序列。

術語「轉譯後修飾」意指蛋白質在其轉譯後化學修飾。

術語「共轉譯」意指經由重組DNA上生成之雜合mRNA分子的轉譯作用來合成由所期望蛋白質產物共價連接至所採用有機體分泌之正常蛋白質而組成的雜合分子。

術語「轉化」意指將DNA引入有機體中，以便DNA能作 為染色體外成份或藉由染色體整合來複製。術語「轉染」係指不管實際上是否表現任何編碼序列，皆由適宜宿主細胞佔用表現載體。

本文所用術語「生物活性」(「biologically activity」及「biological activities」)係指活系統中(例如)與天然或非天然存在之分子類似或相同之結構、調節、生物化學或其他生物功能。

術語「多元層析載體」係指能夠提供至少兩個可與欲結合化合物相互作用之不同但可以合作之位點之載體。舉例而言，其中一個位點可在配體與目標物質之間產生有吸引力類型之電荷-電荷相互作用。另一位點可產生電子受體-供體相互作用及/或疏水性及/或親水性相互作用。電子供體-受體相互作用包括諸如氫鍵結、π-π、陽離子-π、電荷轉移、偶極-偶極、誘發之偶極等相互作用。「多元層析載體」亦稱作「混合模型」分離基質。US 7,714,112係關於自液體試樣中之另一或其他化合物分離抗體之方法，其中使包含該試樣之移動相與多元分離基質接觸，以吸附不期望化合物，同時使抗體游離於液體中，其中多元分離基質包含能夠與靶化合物之帶負電位點相互作用的第一基團及能夠與該等靶化合物進行至少一種除電荷-電荷相互作用以外之相互作用的第二基團。此先前技術參考文獻已以引用方式併入本文中。

術語「層析」涵蓋一族緊密相關之分離方法。區分層析與大多數物理及化學分離方法之特徵在於使兩個相互不混 溶相接觸，其中一個相穩定且另一相移動。

術語「功能性」在本文中用於在能夠與靶分子或靶化合物相互作用方面起作用之基團或分子。

術語「洗脫劑」以其習用含義用於此領域中，即適於自分離基質釋放一或多種化合物之pH及/或離子強度之緩衝液。

術語「干擾素」係指在暴露於各種環境刺激(包括病毒感染或暴露於分裂素)時由多種真核細胞產生之一族分泌蛋白質。除具有抗病毒性質外，已顯示干擾素亦可影響多種細胞功能。所有干擾素單元在本文中皆參照WHO國際標準94/786(rHuIFN-α共有)及95/650(rHuIFN-α2a)表示。根據本發明，干擾素包括共有干擾素及干擾素樣產物。

在一個態樣中，本發明提供將乙醯化蛋白質與非乙醯化蛋白質分離之方法，其包含將包含乙醯化及非乙醯化蛋白質之不純製劑施加至多元層析載體及利用pH變化實施洗脫。

根據本發明，不純製劑係任何包括乙醯化蛋白質及非乙醯化蛋白質者。較佳地，於介於6與7之間之pH下施加不純製劑。較佳地，不純製劑係源自細胞。更佳地，不純製劑係源自原核細胞。

根據本發明，多元層析載體用於將乙醯化蛋白質與非乙醯化蛋白質分離。多元層析載體包含疏水性基團及陰離子交換基團。

多元層析載體較佳提供於層析管柱中。較佳地，多元層 析載體係Capto^TM adhere。多元層析法揭示於以下中：Kjell Eriksson等人之BioProcess International 7(2)(2009年2月)；Jie Chen等人之2010,Journal of Chromatography A,1217，第216-224頁；及美國專利第7,714,112號，其全文皆併入本文中作為參考文獻。在該等先前技術參考文獻中，使用多元層析法分離單株抗體。該等參考文獻均不使用多元層析法分離乙醯化蛋白質。

在一實施例中，多元層析載體用於液相層析中，即藉由使流動相通過包含多元層析載體之層析管柱。載體可呈多孔或非多孔粒子形式，例如基本上球形粒子、單塊、過濾器、膜、表面、毛細管或任一其他常用格式。在一替代實施例中，多元層析載體以粒子(例如基本上球形粒子，包含高密度填充劑)形式用於膨脹床層析中，即藉由將移動相添加至分離基質之膨脹床。在另一替代實施例中，多元層析載體用於分批過程中，其中將分離基質添加至包含液體試樣之容器中。

根據本發明，多元層析載體之疏水性基團包含芳香族基團、雜芳香族或非芳香族疏水性基團(例如烷基)。較佳地，疏水性基團係己基、丁基、苯基或醚基團。

根據本發明，多元層析載體之陰離子交換基團可為強陰離子交換劑。在此上下文中，術語「強」陰離子交換劑應理解為在寬pH範圍內保持帶電之基團。在一有利實施例中，強陰離子交換基團係四級胺。在一替代實施例中，多元層析載體之陰離子交換基團可為弱離子交換劑。在此上 下文中，術語「弱」陰離子交換劑應理解為意指在特定pH值下帶電但可因pH改變損失電荷之基團。

在一個實施例中，對於分離乙醯化蛋白質，使試樣與多元層析載體接觸以吸附乙醯化蛋白質且隨後利用pH變化實施洗脫，以便洗脫非乙醯化蛋白質，同時乙醯化蛋白質留在載體上。在一個實施例中，在第一步驟中，在使乙醯化蛋白質吸附至載體之條件下使包含乙醯化蛋白質之試樣通過多元層析載體。應小心不超過載體之容量，即流速應足夠緩慢以容許滿意吸附。在後續步驟中，在pH梯度及洗脫非乙醯化蛋白質之其他條件下使用多元層析載體實施洗脫。根據本發明，用於洗脫之pH變化係逐步的或呈梯度的。較佳地，在7與3之間實施pH變化。更佳地，在6.0至7.0之pH範圍內裝載蛋白質混合物且在5.5至3.0之間實施pH變化。在一較佳實施例中，洗脫溶液包括乙酸鹽及銨。根據本發明，洗脫非乙醯化蛋白質之其他條件通常係由鹽濃度(即離子強度、疏水性等)提供。層析之一般原則已為此領域中所熟知，且此領域內之熟習人員可容易地採用使用本發明方法必需之參數。

在一較佳實施例中，若需要，可在本發明方法之任何該等步驟之前或之間施加一或多個洗滌步驟。

根據本發明，該等方法可用於分離轉譯後乙醯化蛋白質及重組蛋白產生之共轉譯期間在表現系統中生成的乙醯化雜質。較佳地，本發明方法可用於純化胰島素、生長激素、介白素、干擾素或生長調節素。

在一個實施例中，本發明方法可用於純化重組蛋白以自其去除乙醯化形式。因此，本發明提供純化自表現系統獲得之重組蛋白產物的方法，其包含i)將自表現系統獲得之再摺疊重組蛋白混合物施加至多元層析載體及ii)利用pH變化實施洗脫以獲得基本上不含乙醯化蛋白質之重組蛋白產物。較佳地，表現系統係微生物、酵母或哺乳動物表現系統。

在又一實施例中，本發明方法用於純化重組干擾素。因此，本發明提供純化自表現系統產生之重組干擾素以獲得其非乙醯化形式的方法，其包含以下步驟：(a)使自表現系統產生之溶解且再摺疊干擾素經過疏水性相互作用層析，其中干擾素包含乙醯化形式及非乙醯化形式；及(b)使步驟(a)之干擾素經過本文提及之將乙醯化蛋白質與非乙醯化蛋白質分離之過程，以便可獲得非乙醯化形式之干擾素。

根據本發明，在表現系統中，欲純化之干擾素可自宿主細胞(例如埃希氏大腸桿菌或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))獲得，經含有編碼乙醯化蛋白質之基因之表現載體轉化，如先前技術中所揭示。更佳地，干擾素係干擾素-α。更佳地，干擾素係IFN-α2a及IFN-α2b。借助離心或過濾自培養基回收重組宿主細胞，且隨後藉由施加習用技術(例如滲透衝擊、超音波處理、研磨或化學試劑)使其破碎以分離不溶體。較佳藉由緩衝液(較佳Tris緩衝液)洗滌 不溶體。在一個實施例中，用Tris/胍鹽酸鹽(GdHCl)緩衝液洗滌包涵體。

根據本發明之方法，在步驟(a)中，使自表現系統產生之溶解且再摺疊干擾素經過疏水性相互作用層析(HIC)。HIC係對於分析及製備型分離生物分子之有力技術。該技術利用位於蛋白質表面上之疏水性區域。HIC適於困難的分離，尤其其中雜質具有類似等電點或分子量之分離。適於該目的之層析管柱可具有不同截面及長度且HIC樹脂選自彼等有市售者。蛋白質與吸附劑材料之間之接觸階段期間之pH係所供應溶液之pH。根據本發明之方法，適於該目的之HIC樹脂材料選自彼等可疏水性結合干擾素且以同商標名稱上市者。較佳地，HIC管柱係Toyopearl系列(Tosch Biosience LLC)。更佳地，HIC管柱係Toyopearl Buty-650M。

根據本發明之方法，在步驟(b)中，使步驟(a)之干擾素進一步經過採用多元層析法之本發明方法。多元層析法較佳係基於允許使用高流體速度之剛性瓊脂糖基質。高度交聯瓊脂糖基質載體使介質產生高度化學及物理穩定性。多元層析載體包含能夠與靶化合物之帶負電位點相互作用的第一基團及能夠與該等靶化合物進行至少一種除電荷-電荷相互作用以外之相互作用的第二基團。多元層析載體提供於層析管柱中。較佳地，多元層析法使用Capto^TM adhere。

根據本發明，HIC及多元層析法能夠分離序列變體。 HIC之第一管柱步驟旨在去除共價聚集物，且第二多元層析管柱意欲分離乙醯化變體。

根據本發明，藉由溶解表現系統中自重組蛋白之製造所獲得之重組干擾素之不溶體，且隨後在氧化試劑存在下再摺疊所得干擾素，獲得步驟(a)中之溶解且再摺疊干擾素。根據本發明，本發明中可使用任何能夠溶解不溶體之適宜試劑。在本發明之一個實施例中，可使用離液劑或洗滌劑溶解包涵體。較佳地，離液劑係脲、胍鹽酸鹽且洗滌劑係SDS、N-乙醯基三甲基氯化銨或N-月桂醯基肌胺酸鈉。更佳地，增溶劑係胍鹽酸鹽。分離及溶解不溶體之技術已為業內所知，例如彼等揭示於Journal of Bioscience and Bioengineering(第99卷，第4期，303-310，2005)中者，其全文已以引用方式併入本文中。在一個實施例中，將包涵體以1-5 mg/mL溶於Tris/GdHCl/Tween中以獲得干擾素。

根據本發明，在氧化試劑存在下實施溶解干擾素之再摺疊。氧化試劑可選擇性氧化半胱胺酸。較佳地，氧化試劑係碘或氧碘基苯甲酸鹽；較佳地，氧化試劑係鄰-氧碘基苯甲酸鹽。氧化試劑用於以選擇性及化學計量方式氧化半胱胺酸殘基。就此而言，術語「選擇性」指示氧化試劑(1)將半胱胺酸氧化至二硫鍵程度，而不或不顯著氧化至更高程度，及(2)優先氧化定位接近經還原蛋白質之活性半胱胺酸。氧化試劑與合成蛋白質之莫耳比可端視所用氧化試劑廣泛變化。莫耳比可為至少化學計量(1：1或更大)且通常將在1：1至100：1範圍內。在鄰-氧碘基苯甲酸鹽之情形下，莫 耳比通常將在約1：1至約5：1範圍內。在所有情況下，氧化試劑在反應之末端部分中過量以確保經還原蛋白質完全氧化。該等條件可藉由在其整個持續時間內運行與過量氧化試劑反應或在大部分反應時段內運行與適當等莫耳份數之反應物反應及在接近反應時段結束時添加過量氧化劑來達成。藉由(例如)使用鄰-氧碘基苯甲酸鹽之硫醇基團之氧化可參照全文併入本文中之美國專利第4,530,787號。

本發明之主要目的係去除主體雜質同時維持高回收率。本發明證實在業內之層析中採用兩管柱步驟代替四管柱步驟之方法。本文獲得之產物具有高純度及產率；例如，可獲得高達30-40%之總回收率及高於95%純度之產率。

實例 實例1 使用本發明方法之IFN-α-2a之純化 基因選殖、質粒構築體及細胞培養

根據重組DNA技術實施IFN-α基因選殖、質粒構築體及密碼子優化。重組IFN-α-2a在具有含IFN-α-2a之基因之質粒PET30a的細菌BL21(DE3)細胞中表現為不溶性包涵體。利用設定於30%下之溶解氧含量在5-L分批進料發酵中實施發酵。於1 mM IPTG下誘發3小時後，藉由離心自培養液收穫細胞。將細胞團用20 mM Tris pH 7.4/0.5 mM EDTA緩衝液洗滌且隨後重新懸浮於相同緩衝液溶液中用於藉由超音波處理使細胞破碎。藉由離心收集IB。

包涵體溶解

用適當體積之50 mM Tris pH7.4/7.0 GdHCl/2% tween 80 溶解IB以獲得4 mg/mL之IFN-α-2a。藉由於室溫下輕柔攪拌1 hr達成完全溶解。將蛋白質溶液用50 mM Tris pH7.4緩衝液稀釋11倍。藉由冷離心30 min去除不溶性碎片。

二硫化物氧化

在二硫化物氧化之前製備存於50 mM Tris pH7.4緩衝液中之1 mM碘苯甲酸酯。每小時5次將10 μM碘苯甲酸酯引入蛋白質溶液中(總共50 μM)。於室溫下在輕柔攪拌下培育蛋白質溶液。

疏水性相互作用層析

將1 mM EDTA及10 mM甲硫胺酸添加至蛋白質溶液中，之後添加固體硫酸銨以獲得1 M。用乙酸將pH調節至6.5。在藉由離心及過濾去除顆粒後，如下實施層析純化：Toyopearl Butyl-650M，5×5 cm，流速25 ml/min。

緩衝液A：20 mM NaPi pH 6.5/1.0M AmSO₄/1 mM EDTA/10 mM甲硫胺酸；緩衝液B：20 mM NaPi pH 6.5/1 mM EDTA/10 mM甲硫胺酸。

將蛋白質溶液裝載至經緩衝液A平衡之管柱上。在裝載後，將管柱用至少5 CV之100%緩衝液A洗滌直至OD280達到接近零為止。將蛋白質用一系列步驟洗脫：經2 CV 20% B，經2 CV 40% B，經2 CV 60% B，經2 CV 80% B及經2 CV 100% B。將管柱用水、0.5 N NaOH及0.1 N HCl洗滌，之後用緩衝液A再生。收集18 mL之每一流份並取樣藉由RP-HPLC進行分析。彙集基本上不含聚集IFN-α-2a之流 份。

多元層析法

引入5 mM乙酸銨pH 6.5緩衝液以稀釋硫酸銨直至最終導電率小於15 mS/cm為止。如下實施層析純化：Capto Adhere 2.6×6 cm，流速6.7 ml/min。

緩衝液C：25 mM乙酸銨緩衝液，藉由添加50%乙酸使pH為6.5；緩衝液D：5 mM乙酸。

將稀釋蛋白質溶液裝載至先前經緩衝液C平衡之管柱上。在完成時，將管柱用3 CV之60% D洗滌。將靶蛋白質用80% D洗脫。IFN-α-2a之層析圖示於圖1中。將管柱先後用100% C及2M NaCl、1N NaOH、2M NaCl及0.1 M乙酸清潔。收集17-mL之每一流份並取樣藉由RP-HPLC分析。彙集基本上不含乙醯化同型異構體之流份。藉由比較各別純度評價所得產物。SDS-PAGE分析之結果係如圖2中所示。

無菌過濾

彙集來自滿足純度規範之Capto Adhere管柱之流份並使用3-KD離心過濾器濃縮至3 mg/mL以上。經由0.2 μm膜進一步過濾純化主體。IFN-α-2a之每一步驟產率示於表I中。乙醯化IFN於包涵體中之量係約20-30%。在實施上文提及之層析步驟後，未檢測到乙醯化IFN。

總產率：29.6%

實例2 使用本發明方法之IFN-α-2b之純化

以與實例1相同之方式實施IFN-α-2b之產生。IFN-α-2b之總產率示於表II中。彙集基本上不含乙醯化同型異構體之流份。IFN-α-2b之層析圖示於圖3中。藉由比較各別純度評價所得產物。SDS-PAGE分析之結果係如圖4中所示。乙醯化IFN於包涵體中之量係約20-30%。在實施上文提及之層析步驟後，未檢測到乙醯化IFN。

總產率：42.2%

實例3 實例1之IFN-α-2a及實例2之IFN-α-2b的分析測試

分析實例1之IFN-α-2a及實例2之IFN-α-2b。

藉由RP-HPLC測定之IFN-α-2a及IFN-α-2b及有關蛋白質雜質之純度示於圖5中。

圖1顯示IFN-α-2a之多元層析圖。

圖2顯示用銀染色IFN-α-2a之14% SDS-PAGE。該分析係基於EP 6.0專論-干擾素α-2a濃溶液實施。M：標記；泳道1：Roferon，1 μg；泳道2：內部參照IFN-α-2a，0.05 μg；泳道3：內部參照IFN-α-2a，0.25 μg；泳道4：內部參照IFN-α-2a，1.25 μg；泳道5：內部參照IFN-α-2a，6.25 μg；泳道6：內部參照IFN-α-2a，31.25μg；泳道7：IFN-α-2a之純化主體，5 μg；泳道8：IFN-α-2a之純化主體，25 μg。

圖3顯示IFN-α-2b之多元層析圖。

圖4顯示用銀染色IFN-α-2b之14% SDS-PAGE。該分析係基於EP 6.0專論-干擾素α-2b濃溶液實施。M：標記；泳道1：內部參照IFN-α-2b，0.05 μg；泳道2：內部參照IFN-α-2b，0.25 μg；泳道3：內部參照IFN-α-2b，1.25 μg；泳道4：內部參照IFN-α-2b，6.25 μg；泳道5：內部參照IFN-α-2b，31.25 μg；泳道6：IFN-α-2b之純化主體，5 μg；泳道7：IFN-α-2b之純化主體，25 μg。

圖5顯示藉由RP-HPLC之純度及有關蛋白質。將試樣用水稀釋至1 mg/mL且將50 μg注射至C18管柱上。層析條件係基於EP 6.0專論-干擾素α-2濃溶液實施。

Claims (23)

1. 一種將乙醯化蛋白質與非乙醯化蛋白質分離之方法，其包含將包含乙醯化及非乙醯化蛋白質之不純製劑施加至多元層析載體，及利用pH變化進行洗脫，其中該多元層析載體包含疏水性基團及陰離子交換基團，且其中用於洗脫之該pH係呈逐步或梯度的變化。
2. 如請求項1之方法，其中該多元層析載體之該等疏水性基團包含芳香族基團、雜芳香族或非芳香族疏水性基團。
3. 如請求項2之方法，其中該非芳香族疏水性基團係烷基。
4. 如請求項1之方法，其中該疏水性基團係己基、丁基、苯基或醚基團。
5. 如請求項1之方法，其中該多元層析載體之該等陰離子交換基團可為強陰離子交換劑。
6. 如請求項1之方法，其中該多元層析載體係Capto^TM adhere。
7. 如請求項1之方法，其中於介於6與7之間之pH下施加該不純製劑。
8. 如請求項1之方法，其中該不純製劑係源自細胞。
9. 如請求項1之方法，其中該不純製劑係源自原核細胞。
10. 如請求項1之方法，其中該pH變化係在7至3之間進行。
11. 如請求項1之方法，其中該洗脫之pH變化係在5.5至3.0之 間進行。
12. 如請求項1之方法，其中利用包含乙酸鹽及銨之溶液進行該洗脫。
13. 如請求項1之方法，其可用於純化胰島素、生長激素、介白素、干擾素或生長調節素。
14. 一種純化表現系統所產生之重組干擾素以獲得其非乙醯化形式的方法，其包含以下步驟：(a)使自表現系統產生之溶解且再摺疊干擾素經過疏水性相互作用層析，其中該等干擾素包含乙醯化形式及非乙醯化形式；及(b)使步驟(a)之該等干擾素經過多元層析載體及利用pH變化進行洗脫將乙醯化蛋白質與非乙醯化蛋白質分離之過程，以便獲得該等非乙醯化形式之干擾素，其中該多元層析載體包含疏水性基團及陰離子交換基團，且其中用於洗脫之該pH係呈逐步或梯度的變化。
15. 如請求項14之方法，其中該干擾素係干擾素-α。
16. 如請求項14之方法，其中該干擾素係IFN-α2a及IFN-α2b。
17. 如請求項14之方法，其中藉由溶解表現系統中自重組蛋白之製造所獲得之該等重組干擾素之不溶體，且隨後在氧化試劑存在下再摺疊該等所得干擾素，獲得步驟(a)中之該等溶解且再摺疊干擾素。
18. 如請求項17之方法，其中利用諸如離液劑或洗滌劑等增 溶劑進行該溶解法。
19. 如請求項18之方法，其中該離液劑係脲或胍鹽酸鹽。
20. 如請求項18之方法，其中該洗滌劑係SDS、N-乙醯基三甲基氯化銨或N-月桂醯基肌胺酸鈉。
21. 如請求項18之方法，其中該增溶劑係胍鹽酸鹽。
22. 如請求項17之方法，其中該氧化試劑係碘或氧碘基苯甲酸鹽。
23. 如請求項17之方法，其中該氧化試劑係鄰-氧碘基苯甲酸鹽。