KR0178304B1 - 사람 인터루킨-10의 정제방법 - Google Patents

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에릭 에스. 딕커
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Abstract

인터루킨-10(IL-10)의 정제 방법이 기술되어 있다. 본 방법은 IL-10 함유 용액을 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피함을 포함한다. 본 발명은 또한 단백질 분획을 수산화인회석 크로마토그래피함으로써 단백질 분획 중에 존재하는 상이한 IL-10 이량체를 분리하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한, 단백질 분획을 수산화인회석 크로마토그래피함으로써 단백질 분획중에 존재하는 N-말단 아미노산 서열이 상이한 단백질 변이체를 서로로부터 분리하는 방법을 포함한다.

Description

[발명의 명칭]
사람 인터루킨-10의 정제방법
[발명의 배경]
최근 발견된 림포킨인 인터루킨-10(IL-10)은 본래 인터페론-γ-합성의 억제제로서 기술되었고 체액성 면역 반응의 주요 조절자로서 추정된다[Fiorentino, D.F., et al., J. Exp. Med. 170: 2081 (1989) and Moore et al., K.W., et al., Science 248: 1230-1234 (1990)]. 종종 서로간에 배타적인 면역 반응의 2가지 계열은 체액성(항체-매개된) 및 지연형 과민성 반응이다.
이들 2가지 상이한 면역 반응은 2가지 타입의 헬퍼 T-세포 클론, 즉 Th1 및 Th2 헬퍼 T-세포로부터 야기될 수 있는데, 이것은 구분되는 사이토킨 분비 패턴을 입증한다[Moore supra; Vieira, P. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA Vol. 88: 1172 (1991)]. 마우스 Th1 세포 클론은 인터페론-γ 및 IL-2를 분비하고 주로 지연형의 과민성 반응을 유도하는 반면, TH-2 세포 클론은 IL-4, IL-5 및 IL-10을 분비하여 체액성 반응을 지원한다[Fiorentino et al., supra]. Th1 세포 클론에 의해 분비되는 인터페론-γ는 시험관내에서 Th2 클론 증식을 억제하는 반면, Th2 세포 클론에 의해 분비되는 IL-10 세포 클론에 의한 사이토킨 분비를 억제하기 때문에 면역반응에 있어서 대조적이다[Fiorentino et al., 및 Moore et al., supra]. 따라서 2가지 T-헬퍼 세포 타입은 상호간에 억제성이며 2가지 유사하지 않은 면역 반응에 대한 근거를 제공할 수 있다.
IL-10을 사람 및 뮤린 T세포로부터 클론화하여 서열화 하였다[Moore et al; Vieira et al., supra]. 두 서열은 18개아미노산의 N-말단 소수성 리더 서열을 갖는 178개 아미노산의 폴리펩타이드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 함유하며, 73%의 아미노산 서열 상동성을 갖는다.
생물학적 활성 IL-10은 분석학적 겔 여과에 의해 측정 되는 바 이량체이다. 일반적으로, 이량체는 비-환원성 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 상에서 단량체로서의 이동을 근거로 비-공유적으로 결합된 상태이다. 재조합 사람 IL-10은 원핵 및 진핵 발현 시스템 모두에 의해 발현될 수 있다.
진핵 발현 시스템에서 생산되는 재조합 사람 IL-10의 N-말단 분석은 적은 %의 IL-10 폴리펩타이드만이 처음 2개의 N-말단 아미노산 잔기가 결실되어 있음을 나타낸다. 이같이 절단된 폴리펩타이드를 △2 IL-10 폴리펩타이드, 또는 단순히 △2로 언급한다. 따라서 완전한 길이의 쇄는 아미노산 결실이 없다는 의미에서 △0으로 언급한다. 따라서, 생물학적으로 활성이며, 진핵 발현된 IL-10은 3가지 상이한 이량체로서 나타날 수 있다. 첫 번째 생물학적 활성 이량체이며 주요 형태인 것은 △0 : △0으로, 이량체의 두 폴리펩타이드가 완전한 길이의 아미노산을 갖는 종 이량체이다. 두 번째 IL-10 이량체는 △0 : △2로서, 폴리펩타이드 쇄중 하나는 완전한 길이의 쇄이고 두 번째 쇄 △2는 처음2개 N-말단 아미노산이 결실된 이종 이량체이다. 세 번째 IL-10 이량체는 △2 : △2로서, 이량체의 두 폴리펩타이드 쇄가 처음 2개 N-말단 아미노산 잔기가 결실되어 있는 동종 이량체인 것이다. 따라서, IL-10을 정제하기 위한 방법이 요망되고, 특히 IL-10의 상이한 이량체를 서로로부터 분리시키는 방법이 요망되어 왔다.
원핵 발현 시스템에 의해 발현되는 봉입체중에 함유된 IL-10은 변성되고, 재폴딩되어, 숙주 단백질, IL-10의 변형된 변이체 및 이들 변이체의 이종 이량체를 포함하는 불순물로부터 정제되어야 한다. 또한, 원핵 시스템에서, IL-10 단량체는 하나 이상의 리신 잔기에서 아세틸화될 수 있다. 아세틸화 단량체가 또다른 아세틸화 단량체에 결합되는 경우 아세틸화 동종 이량체가 생산된다. 하지만, 비-아세틸화 단량체가 다른 비-아세틸화 단량체에 결합되는 경우, 비-아세틸화 동종 이량체가 생산된다. 아세틸화 단량체가 비-아세틸화 단량체가 결합되는 경우, 이종 이량체가 생산된다. 추가로, 보통 IL-10은 비-공유적으로 결합된 동종 이량체로서 생산된다. 하지만, 봉입체의 변성, 및 IL-10의 재폴딩중에, 공유적으로 결합된 동종 이량체가 생산될 수 있는데, 즉 비-환원 SDS-PAGE 상에서는 이량체로서, 환원조건하에서 단량체로서 이동하는 것이다. 이것은 아마도 2개의 단량체 사이에 형성되는 분자간 디설파이드 결합 하나 이상에 의해 야기되는 것 같다. 따라서, 숙주 단백질 불순물로부터 IL-10을 정제하여 아세틸화 동종 이량체, 이종 이량체 변이체 및 공유 이량체가 유리된 실질적으로 순수한 비-공유적으로 결합된 이량체성 IL-10을 수득할 수 있다.
강력한 면역 반응 조절제로서의 이의 역할 및 인터페론-γ 합성의 억제제로서 이의 활성 견지에서, IL-10은 자가면역 질환 또는 이식 거부에 있어 임상적 유용성을 가질 수 있다. 하지만 임상적 셋팅에 있어, 기타 오염성 숙주 및 매질 단백질 또는 폴리펩타이드가 실질적으로 유리된, 고도의 순수한 상태의 IL-10이 매우 바람직할 수 있다. 따라서, 이들 목적을 성취하기 위한 IL-10을 정제하는 방법이 필요하다.
[발명의 요약]
본 발명은,
(a) IL-10을 함유하는 용액을 양이온 교환 크로마토그래피하여 IL-10을 함유하는 분획을 수득하는 단계;
(b) 단계(a)로부터의 IL-10-함유 분획을 음이온 교환 크로마토그래피하여 IL-10을 함유하는 분획을 수득하는 단계;
(c) 단계(b)로부터의 IL-10-함유 분획을 수산화인회석 크로마토그래피하여 IL-10의 단일 분리된 이량체를 함유하는 분획을 수득하는 단계; 및
(d) 단계(c)로부터의 IL-10-함유 분획을 겔-여과 크로마토그래피하여 고분자량 및 저분자량 불순물이 유리된 IL-10 함유 분획을 수득하는 단계들을 포함하여, 용액중에 함유된 IL-10을 정제하는 방법을 제공함으로써 이러한 필요성을 충족한다.
IL-10의 정제 방법은 세균 또는 진핵 발현 시스템에서 발현되는 IL-10에 대해 사용될 수 있다.
본 발명은, 이량체가 서로로부터 분리되는 조건하에 분획을 수산화인회석 크로마토그래피함을 포함하여, 이량체 혼합물을 함유하는 단백질 분획중에 함유된 상이한 IL-10 이량체를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로, 단백질의 상이한 이량체가 서로로부터 분리되는 조건하에 단백질 분획을 수산화인회석 크로마토그래피함을 포함하여, 상이한 이량체가 상이한 N-말단 아미노산 서열을 갖는 단백질 분획내에 함유된 단백질의 상이한 이량체를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 단백질 변이체가 서로로부터 분리되는 조건하에 단백질 분획을 수산화인회석 크로마토그래피함을 포함하여, 단백질 변이체가 상이한 N-말단 아미노산 서열을 갖는 단백질 분획내에 함유된 단백질 변이체를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 비-아세틸화 동종 이량체가 IL-10의 아세틸화 이량체로부터 분리되는 조건하에 용액을 음이온 교환 크로마토그래피함을 포함하여, 용액내에 함유된 IL-10 아세틸화 동종-이량체 및 아세틸화 IL-10 이종 이량체로부터 IL-10의 비-아세틸화 동종 이량체를 분리하는 방법을 제공한다.
[발명의 기술]
본원중 인용된 모든 참조문헌은 그들 전체가 참조로 인용되고 있다.
본원중 사용된 용어 인터루킨-10 또는 IL-10은 사람 IL-10(h IL-10) 또는 뮤린의 IL-10일 수 있다. 사람 IL-10은, (a) 국제 특허원 제PCT/US90/03554호(공고 번호 WO91/00349)에 상응하는 1992년 7월 20일 출원된 미합중국 특허원 제07/917,806호에 기술된 성숙한(즉, 분비성 리더 서열이 결여된) hIL-10의 공지된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖고, (b) 천연 hIL-10과 동일한 생물학적 활성을 갖는 단백질로서 정의된다.
IL-10은 단백질 분비할 수 있는 활성화된 T-세포의 배양 배지로부터 수득될 수 있다.
하지만, 바람직하게는, 이것은 IL-10 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산을 사용하는 재조합 기술에 의해 수득된다. 분자 생물학의 일반적인 방법이 다음 문헌에 기술되어 있다[참조: Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publish, Cold Spring Harbor, New York, 2d ed. 1989 and by Ausubel et al., (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Green/Wiley, New York(1987 and periodic supplements)]. 적절한 서열은 게놈 또는 cDNA 라이브러리로 부터 수득될 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술 또한 사용할 수 있다[참조: PCR Protocols; A Guide to Methods and Applications, 1990, Innis et al., (Ed.), Academic Press, New York, New York].
라이브러리는 적절한 세포로부터 추출된 핵산으로 작제된다. 참조로 국제특허공보 제WO91/00349호는 IL-10을 제조하는 재조합 방법을 기술한다. 유용한 유전자 서열은 예를 들면 다양한 서열 데이타 베이스, 즉 핵산인 경우 Gen Bank 및 EMBL에서, 단백질인 경우 PIR 및 Swiss-Prot에서 찾을 수 있고 업체[c/o Intelligenetics, Mountain View, California 또는 the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin]가 참조로 언급될 수 있다.
사람 IL-10(hIL-10)을 암호화하는 서열을 포함하는 클론은 메릴랜드 록크빌의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 기탁번호 제68191 및 68192호로 기탁되어 있다. IL-10을 암호화는 서열을 지닌 기타 클론의 동정은 핵산 하이브리드화 또는 발현 벡터가 사용되는 경우에는 암호화된 단백질의 면역학적 검출에 의해 수행된다. 기탁되어 있는 서열을 근거로 한 올리고뉴클레오타이드 프로브는 국제 특허공보 제WO90/00349호에 기술되어 있다. 서열의 동정을 위해 유용한 올리고뉴클레오타이드 프로브는 또한 기타 종에서 관련된 유전자의 보존된 영역으로부터 제조될 수 있다. 달리, IL-10의 아미노산 서열을 기본으로 하는 축퇴성 프로브를 사용할 수 있다.
다양한 발현 벡터를 사용하여 IL-10을 암호화하는 DNA를 발현할 수 있다.
원핵 또는 진핵 세포중에서 재조합 단백질의 발현을 위해 사용되는 통상의 벡터를 사용할 수 있다. 바람직한 벡터는 문헌[Okayama et al., Mol. Cell. Bio. Vol. 3: 280-289(1983); and Takebe et al., Mol. Cell. Biol. Vol. 8: 466-472(1988)]에 기술된 pcD 벡터를 포함한다. 기타 SV40-기본 포유동물 발현 벡터는 문헌[Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. Vol. 2: 1304-1319(1982) and U. S. Patent No. 4,675,285]에 기술된 것을 포함한다. 이들 SV40-벡터는 COS7 멍키 세포(ATCC No. CRL 1651) 및 마우스 L 세포 및 CHO 세포와 같은 다른 포유동물 세포에서 특히 유용하다.
표준 형질감염 방법을 사용하여 다량의 폴리펩타이드를 발현하는 진핵성 세포주를 생산할 수 있다. 본 발명의 방법은 단백질이 발현되는 세포 상등액으로부터 진핵 세포에 의해 발현되는 IL-10을 정제하는 방법이다. 진핵 세포주는 포유동물, 효모 및 곤충 세포주를 포함한다. 포유동물 세포주는 예를 들어, COS-7 세포, 마우스 L 세포 및 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함한다[Sambrook et al., supra and Ausubel et al, supra].
추가로, 본 발명의 방법은 유전자 형질전환된 세균, 특히 이.콜라이에 의해 생산되는 IL-10을 정제하는 방법을 제공한다. 본원중, 용어 형질전환된 세균은 포유동물 단백질을 생산하도록 유전자 조작된 세균을 의미한다. 이러한 유전자 조작은 통상 발현 벡터를 세균 내로 도입함을 수반한다. 발현 벡터는 세균 게놈중의 유전자에 대해 자가 복제 및 단백질 발현이 가능하다. 세균 발현물의 작제는, 목적하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 공지되어 있거나 달리 입수가능하다면, 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 미합중국 특허 제4,551,433호[De Boer]는 세균 발현 벡터에 사용하기 위한 프로모터를; 미합중국 특허 제4,601,980호(Goeddel et al) 및 제4,431,739호(Riggs)는 이.콜라이 발현 시스템에 의한 포유동물 단백질의 제조를; 및 문헌[Riggs supra, Ferretti et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 83:599(1986), Sproat et al., Nucleic Acid Research 13:2959(1985) and Mullenbach et al., J. Biol. Chem 261:719(1986)]은 세균내 발현을 위한 합성 유전자 작제 방법을 기술하고 있다. 다수의 세균 발현 벡터가 시판되고 메릴랜드 록크빌의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)을 통해 입수가능하다.
본 발명의 방법은, 양이온-교환, 음이온-교환, 수산화인회석 및 겔-여과 크로마토그래피를 연속 적용함을 포함한다. 고순도 및 최대 수율을 성취하기 위하여, 각각 4개의 크로마토그래피 단계를 선택하여, pH, 전도성, 완충액 조성, 유속 및 컬럼 치수에 대해 최적화한다. 순도 및 수율의 이와 같은 최적화를 결정하기 위해 사용되는 분석 방법은 웨스턴 블롯, 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)[Laemmli, U.K., Nature 227:680 (1970)], 효소 결합된 면역 흡착 검정(ELISA), 280 및 260㎚에서의 UV 흡광도 및 단백질 농도 측정[Bradford, M., Anal. Biochem., 72:248 (1976)]이다.
추가로, 크로마토그래피 단계의 순서는 생성물 순도 및 수율뿐 아니라 효율적이고 신속한 대규모 공정에 대해 최적화 된다. 이것은, 1) 용적 핸들링을 감소시키기 위한 제1단계(양이온 교환)중의 생성물 농축; 2) 별도의 공정 없이 신속한 단계의 생성물이 다음 컬럼 상으로 신속하게 로오딩될 수 있도록 하는 제2단계(음이온 교환)에 대한 투과(flow-through) 양식; 3) 기타 단백질에 의한 간섭 없이 IL-10이 제3컬럼(수산화인회석)상에서 분리되도록 처음 두 단계중의 거의 모든 오염 단백질의 제거 및, 4) 미량의 상이한 분자량의 오염물 및 IL-10 단량체의 분리 이외에, 겔 여과 크로마토그래피의 완충액 교환이 최종 생성물 IL-10이 추가의 약제학적 제형에 요구되는 완충액 중에 수득되도록 하는 것을 포함한다.
양이온 교환 크로마토그래피 단계는, IL-10이 양이온 교환 수지에 잘 흡착하기 때문에 먼저 사용한다. 카복시메틸, 설포프로필 및 설포네이트 같은 어떠한 양이온 교환 그룹도 사용할 수 있다. 양이온 교환 그룹은 셀룰로스, 덱스트란, 아가로즈 및 폴리스티렌을 포함한 어떠한 고체-상 지지체에 부착될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
바람직한 양이온 교환 그룹은 아가로즈 팩킹 지지체 매트릭스에 부착된 설포네이트[S-SEPHAROSE FastFlow, Pharmacia, Piscataway, N.J.]이다. 평형 완충액의 pH는 IL-10의 pI값인 7.8 이하이어야만 하고 바람직하게는 S-세파로즈에 대해 약 6.5로하여 IL-10 단백질에 충분한 양전하가 나타나도록 한다. 이로써 IL-10 단백질이 양이온 교환 그룹에 우수하게 부착된다.
IL-10이 포유동물 세포 배양 발현 시스템에 의해 생산되는 경우, 80 내지 90%의 오염 단백질, 특히 혈청 알부민 같은 주요 오염 단백질이 결합되지 않도록 조건을 최적화한다. 로오딩될 수 있는 단백질의 양은 제조업자의 정보에 따라 실험적으로 측정할 수 있다. 5x28㎝S-세파로즈급속 유동 컬럼을 사용하여, 베드용적 ㎖당 약 100㎎의 단백질을 1.1㎝/분의 유속에서 적용할 수 있다. 상등액을 로오딩한 후, 컬럼을 단계적 또는 선형 구배 염 용액, 바람직하게는 S-세파로즈컬럼에 대해 70 내지 300mM NaCl 선형 구배로 전개한다. IL-10은 약 150mM NaCl의 농도에서 약 17mS에서 A280의 현저한 피크에서 용출된다. 이상적으로 IL-10 함유 분획은 농축된 후 펠리컨(PELLICON) 10K막을 사용하여 투석여과 된다.
IL-10이 세균 발현 시스템중 봉입체중에서 생산되는 경우, IL-10은 일반적으로 변성된 후 재폴딩된다. 그런 다음, 재폴딩된 IL-10을 함유하는 용액을 상기한 바와 같은 양이온 교환 수지에 가한다. 80 내지 90%의 오염 단백질이 결합되지 않도록 조건을 최적화한다. 로오딩되는 단백질의 양은 제조업자가 제공하는 정보를 기본으로 하여 실험적으로 측정할 수 있다. 12x36㎝ S-세파로즈급속 유동 컬럼을 사용하여, 베드 용적 ㎖당 약 15㎎의 단백질을 1㎝/분의 유속에서 적용할 수 있다. 상등액을 로오딩한 후, 컬럼을 단계적 또는 선형 구배 염 용액, 바람직하게는 S-세파로즈컬럼에 대해 65 내지 400mM NaCl 선형 구배로 전개한다. IL-10은 약 150mM NaCl의 농도에서 약 17mS에서 A280의 현저한 피크에서 용출된다. 이상적으로는 IL-10 함유 분획은 농축된 후 펠리컨10K막을 사용하여 투석여과 된다.
양이온 교환 크로마토그래피로부터의 IL-10 함유 분획을 음이온 교환 크로마토그래피하여 잔여 숙주 또는 세포 배양 단백질 오염물을 실질적으로 제거한다. 어떠한 음이온 교환 그룹도 사용할 수 있다. 예로서 4급 아미노에틸, 혼합된 아민 또는 기타 중간체 염기 또는 약 염기 교환 그룹을 들 수 있다. 4급 아미노에틸이 바람직한 음이온 교환 그룹이다. 4급 아미노에틸 그룹은 덱스트란, 셀룰로스, 아가로즈 또는 아크릴계 지지체 매트릭스에 부착될 수 있다. 바람직하게는 지지체는 아가로즈이다. 이상적인 QAE 아가로즈 음이온 교환 수지는 Q-세파로즈(Pharmacia, Piscataway, N.J.)이다.
포유동물 세포 배양 시스템에 의해 생산되는 IL-10은 적정 pH 8.0 내지 8.3에서 QAE 음이온 교환 수지에 흡착되지 않는다. 즉, IL-10은 QAE 컬럼을 통해 투과되지만, ㎖베드 용적 당 ㎎단백질이 4 이하인 경우 대부분의 오염 단백질이 흡착된다.
분획중에 함유된 IL-10의 아세틸화는, 먼저 IL-10의 변이체를 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분리하여 측정할 수 있다. 그런 다음, 완전 단백질 또는 트립신-분해된 단편의 질량 분광분석을 수행할 수 있다. 질량 스펙트럼 분석은, IL-10 또는 단편이 아세틸화되는 경우 아세틸 그룹의 질량과 동등한 IL-10 또는 이의 단편의 질량 증가를 나타낸다. 추가로, 트립신-분해 단편의 N-말단 서열 분석은, IL-10이 아세틸화되는 경우 아세틸화-리신 표준과 부합하는 피크를 나타낸다. 원핵 시스템중에 생산되는 비-아세틸화 IL-10은, 단백질을 함유하는 용액이 전도도가 1.0 내지 1.5이고 pH 8.7인 경우 투과함에 따라 음이온 교환 수지에 약하게 흡착한다. 아세틸화 이량체 및 오염 숙주 단백질은 컬럼에 보다 강하게 흡착된다.
음이온 교환 컬럼으로부터 수득되는 IL-10 함유 단백질 분획을 수산화인회석 크로마토그래피하여, 분획중 존재하는 IL-10의 상이한 이량체 형태를 분리시킨다. 이것은 음이온 교환 컬럼이 수산화인회석 컬럼 바로 위에 위치함으로써 음이온 교환 컬럼으로부터의 분획이 이로부터 내려감에 따라 수산화인회석 컬럼상으로 바로 로오딩되도록 하는 급속 유동 방법에 의해 수행될 수 있다.
IL-10이 포유동물 세포 배양 시스템중에서 생산되는 경우, 수산화인회석 컬럼을 pH 약 8.1의 표준 염 용액으로 평형시킨다. 이러한 목적에 적합한 완충액은 20mM 트리스-Cl 및 20mM NaCl, pH 8.1로 이루어진다. IL-10 함유 분획을 수산화인회석 컬럼 상으로 로오딩하고, 바람직하게는 pH 약 8.0에서 150mM 인산칼륨 완충액의 20 베드 용적 선형 구배로 용출시킨다. 용출은 약 6% 농도의 K3PO4는 동일한 농도 수준에서 사용할 수 있다. △0 : △0 IL-10 이량체는 약 20 내지 25% 농도의 150mM K3PO4완충액에서 용출된다. 다른 2가지 이량체는 약 30 내지 35%의 150mM K3PO4완충액에서 용출된다. 이후 △0 : △2는 바람직하게는 컬럼 길이를 2배로 하고, △0 : △2 및 △2 : △2가 각각의 분획중에서 나올때까지 수득된 분획을 가하고 재부가함으로써 △2 : △2로부터 분리할 수 있다. 수산화인회석 크로마토그래피를 사용하여, IL-10 함유 분획중에 함께 존재하는 상이한 IL-10 이량체를 서로로부터 분리할 수 있다. 상이한 이량체가 사실상 분리된다는 사실은 N-말단 아미노산 자기 서열 분석에 의해 측정할 수 있다.
IL-10이 원핵 발현 시스템중에서 생산되는 경우, 절단된 이량체는 드물다. 하지만, 비-공유적으로 결합된 IL-10 이량체는 공유적으로 결합된 IL-10 이량체로 부터 분리되어야 한다. 이것은 수산화인회석 크로마토그래피에 의해 수행된다. 수산화인회석 컬럼은 약 7.4의 pH에서 표준 염 용액으로 평형화시킨다. 이러한 목적에 적합한 완충액은 20mM 트리스-Cl 및 20mM NaCl, pH 7.4로 이루어진다. IL-10 함유 분획을 수산화 인회석 컬럼 상으로 로오딩하여 바람직하게는 150mM 인산나트륨 완충액 pH 7.4의 20 베드 용적의 선형 구배로 용출시킨다. 용출은 약 5% 농도의 Na3PO4완충액으로 출발하여, 약 100%의 농도에 달할때까지 점차적으로 증가시킨다. K3PO4또한 동일 농도 수준에서 사용할 수 있다 비-공유적으로 결합된 이량체는 먼저 7 내지 10mS에서 용출되고, 공유적으로 결합된 이량체는 약 12mS에서 용출된다.
그런 다음, 수산화인회석 컬럼으로부터 수득된 분리된 IL-10-이량체-함유 분획을 겔 여과한다. 겔 여과를 사용하여, IL-10 단량체를 포함한 고 및 저분자량 불순물을 분리한다. 특히 유용한 2가지 겔은 단백질에 대한 분획화 범위가 5kDa 내지 약 250kDa 인 세파크릴(SEPHACRYL) S-200 HR및, 단백질에 대한 분획화 범위가 1 내지 100kDa 인 세파크릴 S-100이다. 단백질에 대해 약 1 내지 약 600kDa의 분획화 범위를 갖는 기타 겔 또한 사용할 수 있다.
N-말단 아미노산 서열이 상이한 단백질의 변이체 형태를 수산화인회석 크로마토그래피로 사용하여 분리할 수 있다. 단량체 또는 올리고머성 단백질은 정제될 수 있으나 하나 이상의 N-말단 아미노산 결실된 변이체로 인해 여전히 이질성이 잔존한다. 이들 변이체를 수산화인회석 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있다. 이들 분리를 수행하기 위해, 다수의 실험적 변수를 검사한다. 먼저 용출시키는데 필요한 인산염 농도, 및 인산염 농도 구배이다. 검사할 2번째 변수는 컬럼 길이, 단백질 로오딩, pH, 총 전도성 및 저 수준의 2가 양이온에 대한 것이다. 다소 변형된 조건하에서 재크로마토그래피는 변이체 형태의 수율 및 순도를 개선시키는 것 같다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 포함되었고 이를 제한하지 않는다.
[실시예 1]
[CHO-세포주 배양 배지로부터 사람 IL-10의 정제]
중국산 햄스터 난소(CHO) 세포를 IL-10 유전자를 함유하는 벡터로 형질감염시키고, 25% 신생 송아지 혈청, 호르몬 성장 인자 및 기타 영양소(Collaborative Research)를 함유하는 배지 보충물인 5% NUSERUM V및 송아지 혈청 알부민, 인슐린, 트랜스페린, 페투인, 지방산, 에탄올아민 및 셀레늄 (Irvine Scientific)을 함유하는 혈청-유리 보충물인 HBCHO로 보충된, 염, 완충액, 비타민, 아미노산 및 글루코스를 함유하는 기초 배지인 이스코브 변형된 둘베코 배지(IMDM)(Sigma, St. Louis, Missouri)중에서 성장시킨다. 형질감염된 CHO 세포를 37℃, pH 7.2에서 세포 배지중에서 성장시킨다. 성장 5일후, 세포 배양 상등액 총 177ℓ를 흘러보내고, 교차유동 미세여과시킨후 한외여과에 의해 약 17.6ℓ로 농축시킨다. 그후 CHO-세포 배양 상등액을 20mM MES(2-[N-모르폴리노]에탄설폰산), (65mM NaCl), (pH 4)로 투석여과시킨다. 수득된 상등액을 다음 크로마토그래피 방법으로 처리한다(모두 4℃에서 수행).
[양이온-교환 크로마토그래피]
농축된 투석여과된 CHO-세포 상등 농축액을, 20mM MES, 70mM NaCl pH 6.5로 평형화된 5x28㎝ S-세파로즈급속 유동 컬럼 상으로 로오딩한다. 약 100㎎ 단백질/베드 용적 ㎖를 1.1㎝/분의 유속으로 가한다. 컬럼을 8.5베드 용적의 평형 완충액으로 세척한다. 이후 0.6㎝/분의 감소된 유속에서 13베드 용적의 70 내지 300mM NaCl 구배로 용출시킨다. hIL-10은 약 17mS에서 A280의 현저한 피크에서 용출하는데 이는 약 150mM NaCl에 상응하며, 이것은 16 내지 20mS에서 용출되는 주요 단백질이다. hIL-10을 함유하는 분획을 농축시키고, 20mM 트리스-Cl, 20mM NaCl, pH8.1로 이루어진 완충액 A로 투석여과한다(PELLICON, 10K막).
S-세파로즈를 이용하는 양이온-교환 크로마토그래피로 우수한 흡착이 이루어져, 이는 첫번째 정제 단계로서 선택된다. 상기 조건을 사용하면, 80 내지 90%의 오염 단백질이 결합되지 않는다. hIL-10이 초기 단백질의 1%에 불과할지라도, 이것은 16 내지 20mS에서 용출되는 주요 단백질로 50배 정제된다. 하기 표 1을 참조한다. pH, 전도성, 유속 및 컬럼 치수의 최적 조건은 다양한 크로마토그래피에서 280 및 260nM에서 UV 흡광도, 단백질 농도, ELISA 값, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 결과를 평가하여 측정한다.
[음이온-교환 크로마토그래피]
양이온-교환 크로마토그래피 단계로부터 수득된, 농축된 투과여과된 IL-10-함유 분획을, 완충액 A로 평형화된 5x13㎝ Q-세파로즈급속 유동 컬럼 상에 로오딩한다. 단백질 로오딩 0.5㎝/분에서 베드 용적 ㎖당 약 3.5㎎이다. A280에서의 흡광도가 최소가 될 때까지 컬럼을 완충액 A로 세척한다. Q-세파로즈에 흡착되지 않는 단백질은 hIL-10을 함유하며, 이를 수산화인회석 상으로의 직접적인 로오딩을 위해 수거한다.
사람 IL-10은 다양한 음이온 교환 컬럼에 대해 거의 친화성이 없으며, pH 8.1 이하 및 4mS 이하의 전도도에서 최소의 결합을 나타낸다. 이것은 Q-세파로즈크로마토그래피의 투과 양식이, 베드 용적 ㎖당 단백질 ㎎의 비가 4 이하에서 유지되는 경우 hIL-10은 컬럼을 통해 바로 투과되고 대부분의 오염 단백질은 흡수될 수 있도록 한다. 수산화인회석 크로마토그래피 이전 Q-세파로즈풀의 완충액 조절이 없기 때문에, 2개의 컬럼이 병렬로 연결되어 Q-세파로즈컬럼의 용출액이 수산화인회석 컬럼 상에 직접 로오딩할 수 있다.
[수산화인회석 크로마토그래피]
Q-세파로즈컬럼으로부터 수득된 IL-10 함유 분획을 2.6x2.6㎝ 수산화인회석 컬럼 상에 로오딩하고, 완충액 A로 평형화하여 분획중에 존재하는 IL-10 이량체를 분리한다. 사용되는 수산화인회석은 펜탁스(Pentax) 제조, 아메리칸 인터내셔날 케미칼 인코포레이티드(American International Chemical Inc.) 시판되는 세라믹 수산화인회석이다. 세라믹 수산화인회석은, 수산화인회석 결정을 비이드로 가열, 즉 소결시켜 형성시킨다. 표준, 예를 들면, 비-소결된 수산화인회석(Biorad) 또한 허용된다. 단백질 로오딩은 0.6㎝/분의 유속에서 베드 용적 ㎖당 약 2.5㎎이다. 컬럼을 94% 완충액 A 및 6% 완충액 B의 혼합물 5베드 용적으로 세척한다. 완충액 B는 150mM K3PO4, pH 8.0으로 이루어진다. IL-10을 완충액 B 6%에서 75%의 선형 구배로 용출시킨다.
△0 : △0 이량체가 완충액 B 약 20 내지 25% 농도에서 용출된다. △0 : △2 및 △2 : △2 이량체는 완충액 B 약 30 내지 35% 농도에서 용출된다.
[겔-여과 크로마토그래피]
△0 : △0 IL-10 이량체(약 20㎎/㎖ 이하)를 함유하는 별개의 농축된 수산화인회석 풀을 평형된 세파크릴S-200 HR 또는 세파크릴S-100HR 컬럼(2.6x85㎝) 상으로 로오딩 하고, 20mM 트리스-Cl, 150mM NaCl, pH 8.1을 포함하는 완충액 C로 용출한다. 샘플 로오딩 용적은 베드 용적의 4% 미만이고, 유속은 0.1㎝/분이다. 피크 분획을 모으고 -20℃에서 보관한다.
세파크릴S-200 HR 또는 세파크릴S-100 HR중 겔 여과 크로마토그래피는 hIL-10이 이량체 형태와 일치하는 분자량을 나타낸다고 지시한다. △0 : △0 이량체는 로오딩된 모든 단백질 농축물(베드 용적 ㎖당 0.2 내지 20㎎)에 대해 우세한 형태이다. 소량(5%)의 hIL-10 단량체는 A280프로파일상의 트레일링 쇼울더로서 나타나고, 이들 분획을 풀로부터 배제시킨다.
전체적인 정제 방법으로 세포 배양 배지 ℓ당 98% 이상의 순수한 △0 : △0 사람 IL-10 약 1.1㎎을 수득한다. 순도는 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE), [Laemmli, U.K., Nature, 227: 680 (1970)]으로 측정한다. 추가로, 역-상(C4) 또는 크기 배척 조르벡스(ZORBEX) 250을 사용한 HPLC 크로마토그래피는 단일 피크만을 나타낸다. 각각의 정제 단계의 수행은 하기 표에 나타나 있는데, 여기서 결과는 약 175ℓ의 각각의 CHO 세포 상등액(5% Nu-혈청 V 함유)으로 3회 정제 수행한 평균치이다.
a) hIL-10의 농도 및 수율은 ELISA 검정을 기초로한다.
b) 순도는, 세포 배양 농축액, S-세파로즈 풀 및 Q-세파로즈 풀에 대해, 총 단백질 ㎎당(브래드포드 검정으로 측정) hIL-10 (ELISA로 측정) ㎎으로서 측정한다. 순도는 수산화인회석 풀 및 세파크릴 S-200풀에 대해 다양한 단백질 양에서 밴드 강도를 비교하여 SDS-PAGE로부터 측정한다. 이러한 기술에 있어, 0.005 내지 25㎍ 범위로 공지된 양의 샘플을 SDS-PAGE 겔의 상이한 레인에서 수행한다. 고 로오딩에서 나타나는 오염물의 상대량을 낮은 로오딩에서 나타나는 IL-10의 밴드 강도와 비교하여 측정한다.
[실시예 2]
[이.콜라이로부터 사람 IL-10의 정제]
에스케리챠 콜라이(이.콜라이)를 재조합 사람 인터루킨-10(rhuIL-10)을 암호화하고 발현하는 유전자를 함유하는 발현 플라스미드로 형질전환한다. 플라스미드는 rhuIL-10의 전사를 위한 강력한 하이브리드 tac 프로모터를 함유한다[Zurawski, S.M. et al., J. Immunol. 137:3354-3360 (1986)]. 전사 터미네이터를 포함하는 ℓpp3' 암호화 및 비-암호화 영역은 rhuIL-10 암호화 영역 하부에 펼쳐져 있다. pINIIIompA로부터 유도된 ℓpp 유전자의 이러한 영역은 이의 상부 mRNA에 대해 안정성을 부여하는 것으로 간주된다[Ghrayeb, J. et al., EMBO J., 3:2437-2442(1984)]. 플라스미드는, pCloDF13으로부터 유도된 복제 조절 돌연변이체 pVU208로부터 유도된 열유도성 복제원을 함유한다[Hakkart, M. J. J. et al., 183: 326-332 (1981)]. 승온, 예를 들면 42℃에서, 이러한 복제원을 함유하는 상이한 플라스미드에 대한 플라스미드 카피수는 염색체 당량당 약 30 카피로부터 수백까지 증가한다고 보고된 바 있다[Andreoli, P. M. et al., J. Bacteriol. 135:612-621(1978)]. 플라스미드는 플라스미드 유지를 위해 pBR322로부터의 테트라사이클린 내성 유전자를 함유한다[Sutcliffe, J. G., C.S.H. Symp. Quant. Biol. 43: 77-90 (1978)]. 발현 작제물에 의해 세포내적으로 불용성 봉입체로서 rhIL-10이 생산되었다. 형질전환된 이.콜라이를, 20g/L 트립톤, 10g/L 효모 추출물, 5g/L NaCl 및 10㎎/L 테트라사이클린을 함유하는 한천 상에 도말한다. 단일 분리된 콜로니를 한천 평판으로 무작위로 취하고 제2한천 평판상에 재스트리킹한다.
그런 다음, 새로 재스트리킹한 한천 평판으로부터의 2개 콜로니를 30g/L 카사미노산, 20g/L 효모 추출물, 5g/L K3PO4[일염기성], 20g/L 글리세롤, 1g/L MgSO4, pH 7을 함유하는 LYM-1 배지 1㎖중에 현탁시킴으로써 마스터 세포 뱅크를 제조한다. 이후 이것을 사용하여, 300㎖ 배플 플라스크중의 10㎎/L 테트라사이클린을 함유하는 LYM-1 브로스[LYM-1/Tc10] 100㎖를 접종한 다음, 30℃에서 배양하고, 세포밀도가 Klett540=DIR 400(초기 대수상)에 도달할 때까지, 분 당 300회전(RPM)으로 회전 진탕기를 사용하여 진탕시킨다. 이 배양물을 1:1 비율로 40% 글리세롤(v/v)가 혼합하여, 최종 글리세롤 농도가 20%가 되게 한다. 이후 1㎖의 분취량을, 액체 질소하에서 신속하게 냉동된 미리 표지시킨 저온 바이알내로 분배한 후, 사용전까지 -80℃에서 셋팅시킨 냉장고에 보관한다.
그런 다음, 실온에서 공기중의 마스터 세포 뱅크의 바이알 하나를 해동시킴으로써 작동(working) 세포 뱅크를 준비한 후, 이를 300㎖ 배플 플라스크중의 LYM-1/Tc10 배지 100㎖내로 접종한 후, 30℃에서 배양하고, 배양물의 Klett이 약 400(초기 대수)에 달할때까지 300RPM에서 회전 진탕기를 사용하여 진탕시킨다. 이 후 이 배양물을 1:1로 40% 글리세롤과 혼합한다. 그 후 분취량 1㎖를 액체 질소하에 급속 냉동시킨 미리 표시한 저온 바이알내로 분배하고, -80℃로 셋팅한 냉장고중에 보관한다.
작동 스톡의 1.5㎖ 냉동 바이알을 실온에서 해동한다. 작동 스톡 약 0.5㎖를, LYM-1/Tc10 배지 500㎖를 함유하는 2000㎖ 플라스크내로 옮긴다. 접종하기 직전 테트라사이클린을 가한다. 플라스크를 회전 진탕기 위에 놓고 30℃에서 300RPM에서 진탕한다. 6.5 내지 7시간후 Klett540측정을 위해 플라스크로부터 샘플을 제거한다. 배양물은 Klett540은 200 내지 300이다. 그런 다음, LYM-3/Tc10 배지 800ℓ를 함유하는 1000ℓ 발효조를 2000㎖ 플라스크 내용물로 접종한다. LYM-3/Tc10 배지는 30g/ℓ Casein-Digest-HyCase P(Sheffield), 20g/ℓ 효모 추출물-타입 D(Bio Springer), 15g/ℓ 일염기성 인산칼륨(Monsanto), 0.5㎖/ℓ의 30% SAG-471(Union Carbide)의 30% 현탁액, 20g/ℓ 글리세틴 99.7%(Univar), 1g/ℓ 황산마그네슘-7 H2O(PQ), 10㎎/ℓ 테트라사이클린(Sigma), 2㎖/ℓ 황산, 15g/ℓ 시트르산나트륨, 13.5g/ℓ 염화제이철 6수화물로 이루어진 2㎖/ℓ 철 시트레이트 스톡 용액으로 이루어진다. 배지의 pH를 50% NaOH 용액 및 75% H3PO4용액으로 약 7로 조정한다. 발효조내 접종된 배지의 온도를, 1000±100의 Klett540값에 도달할때까지 30℃±0.5℃에서 유지시킨 후, 온도를 38℃±0.5℃로 14시간 동안 승온시킨다. 발효조 내의 용해된 산소 농도를 교반에 의해 40% 이상의 포화 수준에서 유지한다.
온도가 38℃로 승온된지 14시간 후 교반을 감속하고, 배지를 5 내지 15℃로 냉각시킴으로써 발효물을 회수한다. 뱃치를 함유된 CSA-16을 사용하여 원심분리하고 분당 약 5 내지 10ℓ의 공급 유동률(lpm)로 원심분리기를 지속적으로 탈슬럿지 처리한다. 유동률은 맑은 원심분리액을 수득하도록 조정된다. 한 번의 완전한 탈슬럿지 및 한 번의 부분적인 탈슬럿지(보울(bowl) 시간은 0.95초로 고정)를 사용하여 발효물 800ℓ를 회수한다. 40±2㎏의 세포 펠렛을 원심분리 단계중 회수한다.
원심분리 단계중 회수된 40㎏ 세포 펠렛을 작동압 7000 내지 8000psi에서 가울린 M12 균질화기를 사용하여 6회 상응하게 통과시켜 균질화한다. 이것은 균질화기 및 글리콜-냉각된 가열 교환기를 통해 홀드 탱크로부터 뱃치를 재순환시켜 수행한 후 약 140분 동안 10lpm의 유동률로 홀드 탱크로 복귀시킨다. 140분 균질화한 후, 균질물 샘플을 회수하고 위상차 현미경하에서 검정한다. 이것은 세포 파괴를 평가하기 위해 수행한다. 현미경 평가에 의해 95% 이상의 파괴가 측정되지 않는 경우, 균질화는 지속되어야 한다.
균질화된 세포는 균질물을, 6.05g/ℓ TRIZMA-BASE(트리스[하이드록시메틸]아미노메탄)(Sigma), 1.90g/ℓ 이나트륨 EDTA 이수화물(Sigma), 58.4g/ℓ NaCl USP(Mallinckrodt) 및 382g/ℓ 구아니딘 HCl(Sigma)로 이루어진 4M 구아니딘 완충액 등량과 혼합하여 불활성화시킨다. 서서히 교반하여 10 내지 15℃에서 30분간 재현탁물을 유지시킨다. 불활성화 재현탁물을 분당 500㎖의 유동률 및 17.000rpm의 원심분리 속도로 샤플(Sharples) AS26SP 원심분리기로 원심분리한다. 이 단계에서 회수된 봉입체를 함유하는 펠렛을 -10℃에서 냉동시킨다. 봉입체는 hIL-10 이외에 다양한 이.콜라이 숙주 단백질, 핵산 및 기타 세포 잔사를 함유하는 응집체이다.
[IL-10 비폴딩]
-10℃에서 보관된 봉입체 펠렛을 냉실에서 2 내지 10℃에서 3일간 해동한다. 펠렛을 파괴하고 비폴딩 완충액 20ℓ로 가한다. 비폴딩 완충액은 50mM TRIZMA(트리스[하이드록시메틸]아미노메탄)(Sigma), 7M 구아니딘 HCl 및 4mM 디티오트레이톨(DIT), pH 8.5로 이루어진다. 봉입체 펠렛을 폴리트론 균질화기로 격렬히 교반하여 미세한 현탁액을 형성시킨다. 이후 이 현탁액을 2 내지 10℃에서 약 3시간 서서히 교반하여 좀 더 가용화한다.
[IL-10 재폴딩]
이후 가용성 단백질 용액을 재폴딩 완충액내로 약 25배 희석한다. 재폴딩 완충액은 50mM TRIZMA, 0.12M 구아니딘 HCl, 0.05mM 글루타티온(환원), pH 8.5로 이루어진다. 희석된 재폴딩 용액은 여과시켜 즉시 청정화한다; 그런 다음 산화 글루타티온 용액을 0.45mM의 최종 농도로 가하고 재폴딩을 10 내지 24시간 지속한다.
[농축/투과 여과]
재폴딩 단계 말기에, 한외여과 이전 0.45㎛ 여과기를 사용하여 여과시켜 용액을 청정화한다. 추가로, 여과기를 한외여과기와 일직선상에 위치시켜 한외여과중의 청정성을 보장할 수 있다. 재폴딩된 IL-10을 함유하는 용액을 약 10배 농축한다. 이것은 10,000 공칭 분자량 PLGC막이 있는 한외여과 시스템 밀리포어 펠리콘(Millopore PELLICON) 한외여과기로 수행한다. 이후 농축물을 투과여과하여 농축물 전도도를 약 6mS 감소시킨다. 투과여과 완충액은 pH 8.5, 20mM 트리스, 20mM NaCl로 이루어진다.
[양이온 교환 크로마토그래피]
재폴딩된 h-IL-10을 함유하는 농축 용액을, 1M BIS-TRIS 및 4H HCl을 부가하여 20mM BIS-TRIS, pH 6.5로 조정한다. 이후 용액을 여과시켜 청정화한다. 이후 약 1.2㎎의 단백질/㎖을 함유하는 청정화된 공급 용액을 1㎝/분의 속도로 12ℓ(12㎝ x 36㎝ 직경)S-세파로즈급속 유동 설포네이트 컬럼(Pharmacia, Piscataway, New Jersey)으로 가한다. 컬럼은 pH 6.5, 20mM BIS-TRIS, 0.065M NaCl 완충액, pH 6.5의 10베드 용적으로 1㎝/분의 속도로 예비-평형화한다. 0.065 내지 0.4M NaCl, 20mM BIS-TRIS, pH 6.5 완충액중 20컬럼 용적 구배로 0.5㎝/분의 속도로 용출을 수행한다. 용출 프로파일의 h-IL-10 피크 분획을 A280에 의해 측정하고 일반적인 pH 및 전도도 범위에 의해 다양화시킨다. h-IL-10을 함유하는 분획은 11 내지 18mS, 100 내지 170mM NaCl에서 용출하여 다음 공정을 위해 함께 모은다.
[음이온 교환 크로마토그래피]
h-IL-10을 함유하는 양이온 교환 크로마토그래피로부터의 모은 분획을, 10,000 공칭 분자량 PLGC막이 있는 한외여과 시스템 밀리포어 펠리콘한외여과기를 사용하여 0.5컬럼 용적으로 농출시킨다. 이후 농축액을 10mM 트리스 완충액 pH 8.7을 사용하여 약 1.5mS로 투과여과한다. 투과여과된 농축액의 pH를 HCl 또는 NaCl로 pH 8.7로 조정한다. 약 13㎎/㎖의 단백질을 함유하는 용액을, 10mM 트리스, 8mM NaCl, pH 8.7 완충액으로 예비-평형된 6ℓ(18㎝ 직경x23.5㎝) 4급 암모늄 컬럼 Q-세파로즈급속 유동 컬럼(Pharmacia)에 0.5㎝/분의 유속으로 가한다. h-IL-10은 분획중에 함유된 불순물에 대해 수지에 차별적인 친화성을 가져 이소크래틱 용출 상에서 분리되어, 10mM 트리스, 8mM NaCl, pH 8.7 완충액으로 컬럼 용출액으로 수거된다. 아세틸화 동종 이량체 및 아세틸화 이종 이량체는 수지에 좀더 강하게 흡착됨으로써, 비-아세틸화 동종 이량체로부터 분리된다. A280에 의해 측정된 용출 프로파일의 비-아세틸화 h-IL-10 피크 분획을 추가의 공정을 위해 모은다.
[수산화인회석 크로마토그래피]
음이온 교환 크로마토그래피 단계로부터 수득된 h-IL-10을 함유하는 풀을, 20mM 트리스, 20mM NaCl, pH 7.4 완충액으로 예비-평형된 4ℓ(26㎝x14㎝ 직경) 수산화인회석 컬럼(예: 세라믹 수산화인회석, Biorad MACROPREP)으로 가한다. 20mM 트리스 완충액의 양을 100%에서 95%로 감소시키고 pH 7.4, 0.15M 인산나트륨 완충액의 수준을 0%에서 5%로 증가시킴으로써 약 4컬럼 용적에 대해 컬럼 세척을 수행한다. 용출은 5%에서 100%로 17베드 용적 용출 구배중에 인산염 완충액의 %를 증가시켜 수행한다. 비-공유적으로 결합된 이량체는 7 내지 10mS에서 용출되고, 공유적으로 결합된 이량체는 12mS에서 피크를 나타낸다. A280에 의해 측정된 h-IL-10 피크 분획을 다음 공정을 위해 모은다.
[겔 여과 크로마토그래피]
비-아세틸화, 비-공유적으로 결합된 IL-10 이량체를 함유하는 수산화인회석 공정 단계로부터의 풀을 10,000n 분자량 막을 함유하는 한외여과 시스템 상에서 농축시킨다. 농축물은, 10mM 트리스 완충액, pH 7.4로 예비-평형된 14.8ℓ(96㎝x14㎝ 직경)세파크릴S-200 HR인 겔 여과 컬럼에 가한다. 컬럼을 pH 7.4, 10mM 트리스 완충액으로 용출한다. A280에 의해 측정된 용출 프로파일의 h-IL-10의 피크 분획을 다음 공정을 위해 모은다. 겔 여과 풀을 0.2㎛ 여과기를 통해 여과한다. 여액, 최종 정제된 벌크 약물을 -20℃에서 보관한다.
세파크릴S-200 HR 또는 세파크릴S-100 HR 중 겔 여과 크로마토그래피는 hIL-10이 이량체 형태와 일치하는 분자량을 나타냄을 보이고 있다. 비-아세틸화, 비-공유적으로 결합된 이량체가 로오딩된 모든 단백질 농축물에 대해 우세한 형태이다(0.2-20㎎/㎖ 베드 용적). 소량(5%)의 hIL-10 단량체가 종종 A280프로파일상의 트레일링 쇼율더로서 보이며, 이들 분획은 풀로부터 배제한다.
각각의 정제 단계의 수행은 하기 표 2에 나타난 바와 같다.
a. hIL-10의 농도, 수율 및 순도는 역상 HPLC 분석을 기본으로한다.
b 농축, 투과여과 및 pH 조정후
[실시예 3]
[재폴링된 사람 IL-10의 소수성 상호작용 크로마토그래피]
재폴링된 IL-10의 투과여과의 대안으로서 하기 방법을 사용하여 재폴딩되고 변성된 완충액을 제거한다. 이.콜라이 중에서 발현된 사람 IL-10을 함유하는 봉입체를 10:1(v/w)의 비폴딩 완충액 대 봉입체의 비로 재현탁시킨다. 비폴딩 완충액은 6M 구아니딘 하이드로클로라이드(GdnHCl), 4mM 디티오트레이톨(DTT), 50mM 트리스 pH 8.5, 1mM 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA) 및 1mM 페닐메틸설폭실 플루오라이드 (PMSF)로 이루어진다. 봉입체 함유 완충액을 4℃에서 3시간 교반시키고 배양하며, 비폴딩 변성된 사람 IL-10을 제조한다.
비폴딩된 변성 IL-10을, 50mM 트리스 pH 8.5, 1mM EDTA, 최종 농도 0.5M의 GdnHCl, 4.17mM 환원 글루타티온, 0.83mM 산화 글루타티온, 2mM 벤즈아미딘을 함유하는 재폴딩 완충액 내로 100배 희석시키고 4℃에서 17시간 배양한다.
재폴딩후, 혼합물을 0.45㎛ 여과기로 여과시키고, 25% 황산암모늄 농도로 되게한 후 재여과한다. 여액을 선형 유속 1㎝/분으로 수지 ㎖당 봉입체 0.25 내지 0.5g의 비로 부틸-토요펄(Buty-Toyopearl) 650M 소수성 상호작용(TosoHaas) 컬럼(25%, 황산암모늄, 20mM 트리스 pH 8.5로 예비 평형)으로 가한다. 이 단계에서, IL-10은 컬럼에 부착하지만, 다수의 단백질 및 대부분의 비-단백질 오염물, 즉 재폴딩 공정 시약(예: 글루타티온 및 GdnHCl), 저분자량 오염물 및 재폴딩 혼합물의 특징인 이.콜라이 성분의 단편 등은 컬럼을 통해 투과된다. 그런 다음 결합된 사람 IL-10을 20mM 트리스 pH 8.5, 20-50mM NaCl로 이소크래틱 용출시킨다. 21-베드 용적 분획을 모은다. 사람 IL-10은 이소크래틱 구배로 2 베드 용적을 용출하기 시작한다. 통상, 분획 2 내지 15를 모은다. 이후 소수성 상호작용 풀을 다음의 정제를 위해 좀 더 가공할 수 있다.
본 발명은 상기 특정 양태와 함께 기술되었으나, 이의 많은 대안, 변형 및 변이가 당해 분야의 통상의 숙련가에게 명백해진다. 이러한 모든 대안, 변형 및 변이는 본 발명의 취지 및 범위내에서 부합되며 특허청구의 범위에 의해서만 제한될 수 있다.

Claims (19)

  1. 비아세틸화된 IL-10 동종 이량체, 아세틸화된 IL-10 동종 이량체 및 아세틸화된 IL-10 이종 이량체를 함유하는 용액을 pH 8.0 내지 8.3의 완충액으로 용출시키며 음이온 교환 크로마토그래피함으로써 비아세틸화된 동종 이량체를 아세틸화된 동종 이량체 및 아세틸화된 이종 이량체로부터 분리시키고, 비아세틸화된 동종이량체를 함유하는 분획을 수거함을 포함하여, 용액내에 함유된 아세틸화된 IL-10 동종이량체 및 아세틸화된 IL-10의 이종이량체로부터 비아세틸화된 IL-10 동종 이량체를 분리하는 방법.
  2. (a) IL-10을 함유하는 용액을 염용액으로 용출시키며 양이온 교환 크로마토그래피하여 IL-10을 함유하는 분획을 수득하는 단계; (b) 단계(a)로부터의 IL-10 함유 분획을 pH 8.0 내지 8.3의 완충액으로 용출시키며 음이온 교환 크로마토그래피하여 IL-10을 함유하는 분획을 수득하는 단계; (c) 단계(b)로부터의 IL-10 함유 분획을 선형 농도 구배의 인산칼륨 또는 인산 나트륨을 포함하는 완충액으로 용출시키며 수산화인회석 크로마토그래피함으로써 IL-10의 상이한 이량체를 상이한 분획중에서 서로로부터 분리시키는 단계; 및 (d) 목적하는 IL-10의 이량체를 함유하는 분획을 분리하는 단계들을 포함하여, 진핵 발현 시스템중에서 생산되는 2개 이상의 IL-10 이량체를 함유하는 용액중에 함유된 사람 IL-10을 정제하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 단계(a)의 염용액이 선형 농도 구배의 65 내지 400mM NaCl을 포함하고 단계(c)의 완충액이 약 6% 내지 약 75%의 선형 농도 구배의 150mM 인산칼륨 또는 인산나트륨을 포함하는 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 용액중에 존재하는 이량체가 △0:△0, △0:△2 및 △2:△2 IL-10 이량체이고 △0:△0 이량체가 수거되는 방법.
  5. (a) IL-10을 함유하는 용액을 염용액으로 용출시키며 양이온 교환 크로마토그래피하여 IL-10을 함유하는 분획을 수득하는 단계; (b) 단계(a)에서 수득한 IL-10 함유 분획을 pH 8.7 의 완충액으로 용출시키며 음이온 교환 크로마토그래피하여 IL-10을 함유하는 분획을 수득하는 단계; (c) 단계(b)로부터 수득한 IL-10 함유 분획을 선형 농도 구배의 인산칼륨 또는 인산나트륨을 포함하는 완충액으로 용출시키며 수산화인회석 크로마토그래피함으로써 IL-10의 상이한 이량체를 상이한 분획중에서 서로로부터 분리시키는 단계; 및 (d) 목적하는 IL-10의 이량체를 함유하는 분획을 분리하는 단계들을 포함하여, 원핵 발현 시스템중에서 생산되는 2개 이상의 IL-10 이량체를 함유하는 용액중에 함유된 재조합 사람 IL-10을 정제하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 단계(a)의 염용액이 선형 농도 구배의 65 내지 400mM NaCl을 포함하고 단계(c)의 완충액이 약 5% 내지 약 100%의 선형 농도 구배의 150mM 인산칼륨 또는 인산나트륨을 포함하는 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 목적하는 IL-10의 이량체가 비아세틸화된 동종이량체인 방법.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, IL-10이 원핵 발현 시스템에 의해 생산되어 정제이전에 봉입체로부터 변성되고 재폴딩되며, 목적하는 IL-10 이량체가 비공유결합되고 비아세틸화된 동종이량체인 방법.
  9. 제2항 또는 제3항에 있어서, 단계(a)의 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 지지체 매트릭스에 부착된 설포네이트, 카복시메틸 또는 설포프로필 교환 그룹으로 구성되는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 지지체 매트릭스가 아가로즈, 셀룰로즈, 덱스트란 또는 폴리스티렌인 방법.
  11. 제2항 또는 제3항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 지지체 매트릭스에 결합된 2급 아미노 에틸, 혼합된 아민, 중염기(intermediate base) 또는 약염기 교환 그룹으로 구성되는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 지지체 매트릭스가 아가로즈, 덱스트란, 셀룰로즈 또는 아크릴계 지지체 매트릭스인 방법.
  13. 제2항 또는 제3항에 있어서, 단계(a)의 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 아가로즈, 셀룰로즈, 덱스트란 또는 폴리스티렌인 지지체 매트릭스에 부착된 설포네이트, 카복시메틸 또는 설포프로필 교환 그룹으로 구성되고, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 아가로즈, 덱스트란, 셀룰로즈 또는 아크릴계 지지체 매트릭스에 부착된 4급 아미노 에틸, 혼합된 아민, 중염기 또는 약염기 교환 그룹으로 구성되는 방법.
  14. 제5항 또는 제6항에 있어서, 단계(a)의 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 지지체 매트릭스에 부착된 설포네이트, 카복시메틸 또는 설포프로필 교환 그룹으로 구성되는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 지지체 매트릭스가 아가로즈, 셀룰로즈, 텍스트란 또는 폴리스티렌인 방법.
  16. 제5항 또는 제6항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 지지체 매트릭스에 결합된 4급 아미노 에틸, 혼합된 아민, 중염기 또는 약염기 교환 그룹으로 구성되는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 지지체 매트릭스가 아가로즈, 덱스트란, 셀룰로즈 또는 아크릴계 지지체 매트릭스인 방법.
  18. 제5항 또는 제6항에 있어서, 단계(a)의 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 아가로즈, 셀룰로즈, 덱스트란 또는 폴리스티렌인 지지체 매트릭스에 부착된 설포네이트, 카복시메틸 또는 설포프로필 교환 그룹으로 구성되고, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 아가로즈, 덱스트란, 셀룰로즈 또는 아크릴계 지지체 매트릭스에 부착된 4급 아미노 에틸, 혼합된 아민, 중염기 또는 약염기 교환 그룹으로 구성되는 방법.
  19. IL-10 함유 분획을 선형 농도 구배의 인산칼륨 또는 인산나트륨을 포함하는 완충액으로 용출시키며 수산화인회석 크로마토그래피 함으로써 상이한 IL-10 이량체를 서로로부터 분리시킨 후, 목적하는 이량체를 함유하는 분획을 수거함을 포함하여, △0:△0, △2 및 △2:△2 IL-10 이량체를 함유하는 단백질 분획중에 존재하는 상이한 IL-10 이량체로부터 △0:△0 IL-10을 분리시키는 방법.
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