JPS6140794A - λフア−ジ調節領域の制御下にインタ−ロイキン２活性を有するポリペプタイドをコ−ドする遺伝子の発現ベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトインターロイキン２活性を有するポリペ
プクイドの発現のためのベクターおよびそれらのベクタ
ーによって形質転換された微生物に関する。

〔従来の技術〕

”ｒ１１Ｉ胞生長囚子の１つであるインターロイキン２
（以下、ＩＬ−２と略すこともある）は一般的にリンホ
カインとして知られている可溶性タンパクであり、レク
チンや抗原によってＴ細胞を刺激することにより産生さ
れる〔モーガン、ディー。

工仁ら（Ｍｏｒｇａｎ、　Ｄ、Ａ、＋　ｅＬ　ａｌ、）
　＋　サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　　１９３．　
１００７−１００８　（１９７６）　　ニ　ギリス１ニ
ス、ら（Ｇｉｌｌｉｓ、　ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、）＋、
ジャーナルオブ　イムノロジー（Ｊ、　Ｉ＋ｍｍｕｎｏ
１．）、　１２０．２０２７−２０３３　（１９７８）
　）　、　　Ｉ　Ｌ　−２は抗原特異的エフェクター１
９７８球の試験管内長期培養の促進因子として、リンパ
球の反応性を調節することができる〔ギリス、ニス、ら
（Ｇｉｌｌｉｓ、　Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、）＋ネーチ＋
−（ＮａＬｕｒｅ）、　２６８．１５４−１５６　（１
９７７））　。

また、ヌードマウス牌細胞の培養において、ＩＬ−２が
胸腺細胞分裂促進〔チェン、ビー、エム。

らＣＣｈｅｎ、　Ｂ、Ｍ、、　ａｔ　ａｌ、）、　Ｃｅ
１１．、Ｉｓａ＋ｕｎｏ１．．２２＋２１１−２２４　
（１９７７）　：　’ｉ＋つ、ジェイ、ら　（Ｓｈａｗ
。

Ｊ、、　ｅＬ　ａｌ、）、　　ジャーナル　オプ　イム
ノロ・ソー（Ｊ、　ＩＩＩｍｕｎｏｌ、）、　１２０．
１９６７−１９７３　（１９７８））　、細胞毒性Ｔ細
胞応答の誘導〔ワグナ−、エイチ、ら（１１ａｇｎｅｒ
＋　Ｉｌ、、　ａｔ　ａｔ、）、　　ネーチ＋−（Ｎａ
ｔｕｒｅ）。

２８４、２７８−２８０　（１９８０））あるいは抗−
５Ｒ［ｌＣプラーク形成細胞応答など、他の生物学的活
性を有することも知られている。それゆえに、このリン
パ球調節物質は液性および細胞性免疫応答の増強に、ま
た免疫不全状態から正常な液性および細胞性免疫状態へ
の回復に有用である。これらの認められたＩＬ−２の免
疫学的活性は、ＩＩＵＪ！；、微生物あるいはウィルス
性悪染、免疫不全症または自己免疫症などの免疫学的疾
患に対する医学的な免疫療法に′４−ｒ川であることが
強く示唆される。またインターフェロンと同様に、ＩＬ
−２もナチュラルキラー細胞活性を増強し、腫瘍治療に
利用できることが示唆されている。ＩＬ−２は機能的に
同一なＴ細胞の継代維持が可能であり、Ｔ細胞分化の分
子種の研究やＴ細胞抗原受容体のメカニズムのように分
化したＴ＠胞のｍ能的メカニズムの研究Ｌ７　：Ｆ；い
７中心的役割を演じることは明らかである。−そして、
Ｊｌｌ−性Ｔ細胞の長期培養によって、広い分野に有用
な他の多くのＴｗｌ胞由来りンホカインの製造にとって
も存用である。さらにＩＬ−２に対するリンパ球の応答
において、ＩＬ−２産生は免疫機能の異常性を知る病気
診断に有用な免疫学的な機能の１つのパラメーターとな
り得る。

先行文献中、ＩＬ−２はマウス、う、ト又はヒトなどの
リンパ球をマイトジェンによって刺激することより製造
される〔ポリス。工不、ら（Ｇｉｌｌｉｓ。

Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、）、不−チｗ　−（Ｎａｔｕｒｅ
）＋　２６８＋　１５４−１５６　（１９７？）　：　
　ファーラー、ジェイ、ら（Ｆａｒｒａｒ。

Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、）、　　ジャーナル　オプ　イム
ノロジー〇、　　Ｉａｕｗｕｎｏｌ、）、　　１２１．
　１３５３−１３６０　（１９７８）　　：　ギリス、
ニス、ら（Ｇｕｉｌｔｓ、　ｓ、、　ａｔ　ａｌ、）＋
　ジャーナルオブ　イムノロジー（Ｊ、　ｌｍ５ｕｎｏ
１．）、　１２０．２０２７−２０３３　（１９７８）
　）が、またマイトジェンによってヒト末梢血リンパ球
を刺激することによっても製造することができる〔ギリ
ス、ニス、ら（Ｇｉｌｌｊｓ。

Ｓ、、　ａｔ　ａｌ、）＋　　ジャーナル　オブ　イム
ノロジー（Ｊ、　Ｉｍｓ＋ｕｎｏ１．）、　１２４．１
９５４−１９６２　（１９８０）　）−ギリス（Ｇｉｌ
ｌｉｓ）　らはマウスＴ細胞リンパ球セルラインから得
られたマウスＩＬ−２の分離について〔ギリス、エース
、ら（Ｇｉｌｌｉｓ、　Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、）＋　　
ジャーナル　オブ　イムノロジー（Ｊ’、　Ｉｓｗｕｎ
ｏｌ、）＋月匝、　２５７０−２５７８　（１９８０）
）　、さらに白血病用１胞由来セルラインからのヒトＩ
Ｌ−２の分離について〔ギリス、ニス、ら（Ｇｉｌｌｉ
ｓ、　Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、）＋　Ｊ。

［！ｘｐ、　Ｍａｄ、、　１５２．１７０９−１７１９
　（１９８０））報告している。

ヨーロッパ特許出願第８３１０１０３５号公報にはＩＬ
−２活性を有するポリペプタイドをコードする遺伝子の
分離について開示されている０組換えＤＮＡは、真核細
胞および原核細胞中にて複製可能なベクター中、プロモ
ーター遺伝子の下流に該遺伝子をクローニングすること
によって作製される。

開示される適当な発現用さフタ−とはストリンジェント
あるいはリラックスＥＫ型のプラスミドベクターやＡｇ
ｔ型ファージベクターが含まれる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

遺伝子ｍ換技術によるＩＬ−２の製造は知られているが
、これらの方法は、ＩＬ−２製造が低レベルであり、ま
た分離が困難な状態にあった。それゆえに、ＩＬ−２活
性を有するポリペプタイドを高レベルで製造する方法や
、また分離の容易な形ごポリペプタイドを産生させる方
法が必要である。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明はヒトＩ　Ｌ−２（Ｈｒ　Ｌ−２）発現に有用な
ベクターに関する。さらに詳しくは、ＨＩＬ−２遺伝子
（通常の方法にて得られたｍＲＮＡから作られたｃＤＮ
Ａ）が、そのベクター中の雑種関節領域に結合されたも
のである。この発現機構は雑種λＯＬ／　Ｐ　１ｍ節領
域に結合されたＨＩＬ−２遺伝子を含んだプラスミドを
包含している。これらの雑種ベクターを使用することに
よって、高レベルでのＨＩＬ−２の細胞内産生は、不溶
性凝結物あるいは、もっばらＨＩＬ−２凝結物を含んだ
封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｉｅｓ）の形で産
生される。

本発明のベクターは、ＨＩＬ−２活性を有するポリペプ
タイドに特異的なりＮＡ配列の５゛末端にプロモーター
／オペレーター領域とリボソーム結合部位を有し、それ
自身本来のヒトプロモーターは含んでいないものであっ
て、雑種λファージ調節領域が前記のＤＮＡ配列の転写
、翻訳を指令するために適当な位置に存在し、前記調節
領域が２つのλファージプロモーター／オペレーター領
域の雑種である。

本発明による発現用ベクターとは、雑種調節領域が、修
飾されたＨ［Ｌ−２構造遺伝子に結合したものである０
本発明の新規な発現用ベクターは、形質軸１負細胞にお
いてＨＩＬ−２を高レベルで発現することが可能である
。とりわけＨＩＬ−２は本タンパクの回収や精製を容易
にする形によって発現される。

新規な雑種調節領域は、高度に調節された高レベルプロ
モーターを有している。その調節領域は２つのλファー
ジプロモーター／オペレーター領域の雑種であり、ＯＬ
／　Ｐ　ａと表現される。　ＯＬ／Ｐ５とは第一のプロ
モーター／オペレーター領域の完全なプロモーター配列
を第二のプロモーター／オペレーター領域のオペレータ
ー配列へ結合しタモのであり、前記の第二のプロモータ
ー／オペレーター領域のオペレーター配列が前記の第一
のブロモ−゛ターによって制御される転写をその本来の
オペレーター配列よりも高い効率で調節することができ
るものである。この雑種調節領域は、米国、特許出願第
５３４，９８２号（対応日本出ａ：特開昭６０−８７７
９２号）中あるいはそこに上げた文献に述べられている
。

ＨＩＬ−２発現用ベクターは、温度域受性λファージ抑
制因子を産生ずる遺伝子を持った宿主細胞に導入するこ
とによって有効性を発揮する。好ましい抑制遺伝子はλ
ｃ［８５７遺伝子てあり、宿主細胞の染色体上に存在し
ていてもよい、相対的な低温下（約３０℃）において、
抑制因子タンパクは雑種λファージ調節領域に作用しＨ
ＩＬ−２遺伝子の転写を十分に抑制する。ゆえに、細胞
にとってを害であるかも知れないようなＨＩＬ−２の高
レベルの産生なしに、適当な細胞増殖が可能である。そ
して十分な増殖の後に、抑制因子の不活性化を引き起こ
す温度（４２℃）まで上昇させ、その抑制を解除させて
ｍＲＮＡ合成に導く。

修飾されたＨＩＬ−２遺伝子とｏＬ／ｐ＊１ｔ１節領域
を有するプラスミドがｐＧＸ１０９９として表わされ、
プラスミドｐＧＸ１０９９によって形質転換されたエセ
リシア・コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）細胞が、１＋ｙｈ
されたＩＩＩＬ−２タンパクを効率よく産生ずることが
示される。このタンパクは、第１番目のアミノ酸（ＯＣ
Ａによってコードされたアラニン）がメチオニン（開始
コドンＡＴＣによってコードされたもの）に置き代えら
れているのを除けば、天然のＨＩ　Ｌ　−２のものと同
一のアミノ酸配列を有している。プラスミドｐＧＸ１０
９９によって形質転換されたＥ、　ｃｏｌｉ株はＧＸ１
１９９と表現され、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション〔アメリカ合衆国、メリーランド州、ロン
クビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ＋　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　
Ｕ、Ｓ、八、）〕にＡＴＣＣ３９６９６として寄託され
ている。

完全な鎖長のＨＩＬ−２遺伝子とＯＬ／　Ｐ　縄調節領
域をイｒするプラスミドはｐＧＸ１１０４として表わさ
れ、プラスミドｐＧＸ１１０４によって形質転換された
Ｕ、　ｃｏｌｉ細胞が、完全な鎖長のＨＩＬ−２タンパ
クを効率よく産生ずることが示される。この菌株はＧＸ
１１９６と表現され、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションにＡＴＣＣ３９６９５として寄託されて
いる。

本発明のＨ［Ｌ−２発現機構と形質転換された微生物の
特徴的なを用性は、ＨＩＬ−２がタンパクの回収や精製
が容易になされるよ、うな形で、しかも畜レベルで製造
されることにある。ＨＩＬ−２タンパクは、不溶性ある
いは変性された形で、小さな目に見える粒子、いわゆる
封入体（ｉｎｃｌｕ−ｓｉｏｎ　ｂｏｄｉｅｓ）の形で
製造することができる。これら封入体の物理学的性質は
他の細胞内物質より効率的に分画することが可能であり
、目的物質を可溶化する上で回収収量に大きな利点を有
する。

ＨＩＬ−２の製造は、本発明の形質転換された微生物の
同化可能な炭素源、窒素源、成長促進のために必要な無
機物あるいは成長因子などを加えた栄養培地にて培養す
ることによって達成される。

適当な炭素源とはさまざまな度合にて精製された、ある
いは粗な炭素源、例えばグルコース、シュークロース、
糖みつ、でんぷん、麦芽などを用いることができる。好
ましい炭素源とはグルコースである。

窒素源としては、無機アンモニウム塩、例えばリン酸ア
ンモニウム、硝酸アンモニウムなどが、１１機含窒素物
としては、ソイビーンミール、ミートエキストラフＩ・
、アミノ酸、コーン・ステイープ・リカー、タンパクの
加水分解物、ペプトン、イースト工；１−ストラクトな
どが用いられる。

本発明の方法で用いられる好ましい窒素源はイースト抽
出物である。

ビタミン、無機物または他の成長因子、例えばニアシン
、チアミン、ビオチンなどのようなものは炭素源、窒素
源によって供給されるか、あるいは別々に加えることが
できる。これらの組成は用いられる微生物によって適宜
変化させることができる。特に亜鉛、マグネシウム、鉄
、コバルト、カルシウムなどの少量の無機物は、無機塩
として生長誘導■加えられる。これらの無機物は、水道
水、蒸留水あるいは海水の形で供給することが可能であ
る。栄養培地とは通常よく知られたものであって、゛そ
の組成は適宜変化させることができる。

温度怒受性抑制因子を有した好ましい微生物において、
細胞の成長は、抑制因子の不活性化するｆＡ４Ａ４下で
培養することによりて達成される。望ましい細胞密度に
達した後に、ＨＩＬ−２の産生を誘導するために温度を
上昇させる。

培養された細胞中の封入体は、通常、誘導後２時間程度
で見られるようになる。これらの封入体は、時に、ＨＩ
Ｌ−２の９０％以上をも含んでいる。

微生物によって産生されたＨＩＬ−２の回収は、封入体
の形をとることによってより有利に行われる０回収は、
まず、細胞の溶解（例えば機械的な破壊など）によって
行われ、遠心分離によりて可溶性物質から固体の封入体
として分画することができる０次に不溶性のＨＩＬ−２
は可溶化されて、固体の不純物より分離される。可溶化
は、ｐＨ７〜８にバ７ファナイズされたソディウム・ド
デシル・サルフェイト（Ｓ　ＯＳ）溶液のようにタンパ
ク溶解性の溶液を用いて効果的に行われる。可溶化され
たＨＩＬ−２は、通常用いられるタンパクの精製方法に
よって精製することができる。良く知られた例としては
、クロマトグラフ法や電気泳動法を使用することができ
る。ＨＩＬ−２を精製するための好適な方法としては、
ゲル濾過性の高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ
　Ｃ）や逆相ＨＰＬＣがある。ゲル濾過性のＨＰＬＣや
逆相ＨＰＬＣは、よく知られた方法であり、さまざまな
種類のクロマトグラフ用カラムが異なった分子量範囲の
タンパク分画用として販売されている。ＨＩＬ−２は、
分子量約１３，０００〜１４．０００の単一ピークとし
て溶出されることが見い出されている。

前述の方法にて産生され、回収されたＨＩＬ−２は、組
織培養によるＴ細胞成長の誘導がテストされ、生物学的
活性を有することが判明した。

発現用ベクター（例えばｐＧＸ１０９９）は、その染色
体ＤＮＡの配列中に抑制因子をもつように修飾されたＩ
！、　ｃｏｌｉ株に導入することができる。

宿主の選択番よ培養能力の適合性や発現レベルの向上に
よってなされる。

一連の細心の計画によって制限酵素部位を存在させるこ
とにより、プラスミドｐＧＸ１０９９やｐｃｘｚｏ４は
、遺伝子操作上の常法により作られる。

そのような方法により、転写開始や翻訳末端の配列ある
いはその周辺の配列に、遺伝子の挿入、修飾、欠失など
を起こさせることもできる。用いられる常法とは、複製
開始点の変換、選択用抗生物質マーカーの挿入、他の選
択されたＥ、　ｃｏｌｉ宿主の栄養要求性をコードする
遺伝子の挿入、または、本来のＨＩＬ−２配列を元にし
た修飾遺伝子の挿入などである。

以下、実施例を上げて本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

実施例１ 本実施例は、プラスミドｐＧＸ１０９９とｐＧＸ１１０
４の構造とこれらのプラスミドて形質転換されたε、　
ｃｏｌｉの形質転換体ＧＸ１１９９とＧＸ１１９６につ
いて示したものである。酵素的切断は、以下の方法によ
って市販の酵素を用いることによって行うことができる
。

雑種ＯＬ／　Ｐ　ｍプロモーターを有するプラスミド（
ｐＧＸ２（ｉ０６）が、まず制限酵素Ｃ１ａｌ切断部位
を尋人するように修飾される。この新しいプラスミドは
ｐＧＸ１０７４として示され、ＯＬ／Ｐ＋＋プロモータ
ーとシャイン・ダルガノ領域（リボソーム結合部位）を
含むフラグメントを得るために制限酵素Ｃ１ａ　Ｉにて
切断することができる。

ＩＬＩＬ−２遺伝子は、５°末末端列が、開始コドン八
ＴＧとオーバーラツプし、ＨＩＬ−２配列の前にある制
限酵素ＣＩａ　Ｉ切断部位を有するように再構成される
。この修飾されたＨＩＬ−２遺伝子は、これらの配列の
両方に存在する制限酵素Ｃ１ａ＋切断部位を用いること
によって、ｐＧＸ１０７４のＯＬ／ＰＲ１１］節領域に
容易に語領域せることができる。その結果得られたもの
の構造は、完全なプロモーター、シャイン・ダルガノ領
域、そしてａｌ；訳開始のためのＡＴＧコドンを有して
いる。

第１６図に、制限酵素Ｃ１ａ　Ｉ切断部位とＡＴＧ開始
コドンを有するＨＩＬ−２構造遺伝子配列の修飾につい
て示す、ＨＩＬ−２遺伝子は、プラスミドｐＢＲ，３２
２中にてクローニングされ、この組換えプラスミドはｐ
ＧＸ２０５３として表わされる。ＨＩＬ−２は、完全な
配列の５°末端とオーバーランプした形で、制限酵素Ｈ
ｇ１ＡＩ切断部位を有している６本酵素にて切断し、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ■の「クライノ−の断片」によって３
゛末端の１本鎖部分を取り除き、完全なＨＩＬ−２配列
の第２番目のコドン（ＣＣＴニブロリン）から始まるプ
ラントエンドフラグメントが得られる。

別のプラスミド、ｐＧＸ１０６５は、制限酵素Ｃｆａｒ
切断部位のあとに制限酵素５ｐｈｌ切断部位を有してい
る。このプラスミドは、制限酵素Ｓｐｈ夏によって切断
され、ＤＮＡポリメラーゼ■の「クライノ−の断片」に
よって３°末端からの１本鎖部分を取り除く、その結果
得られたプラントエンドフラグメントは、末端にＡＴＧ
コドンを有している。３°末端の制限酵素Ｃ１ａ、Ｉ認
識配列は、開始コドンのＡＴＣ，のＡＴの位置でオーバ
ーランプしている。それゆえに、プラスミドｐＧＸ１０
６５へのプラントエンドを有したＨＩＬ−２フラグメン
トの挿入は、その第２番目のコドン　　−（ＣＣＴ）で
始まるＨＩＬ−２構造遺伝子とＣ１ａ＋　−ＡＴＧ配列
の読み枠の融合によって成される。

この新しいプラスミドはｐ（１，Ｘ１０９２として表わ
される１本来のＨＩＬ−２構造遺伝子の第１番目のコド
ン、ＧＣＡ　（アラニン）の欠落は、通常用いられる技
術であるｉｎ　ｖｉＬｒｏ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏＬ
ｉｄｅｓｉＬｏ　ｄｉｒｏｃＬｏｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ法によって修復（リプレイス）される、この結果
得られるＯＣＡ　（アラニン）コドンが加えられたプラ
スミドはｐＧＸ１０９１として表わされる。

第２図に、完全な鎖長の、あるいはアラニンマイナス（
ａｌａＨ）のＨＩＬ−２配列にＯＬ／ＰＩ！Ｉ！１節領
域を融合する方法について示す、ブラスミＦｐＧＸ１０
９２とｐＧＸ１０９１は、制限酵素　　−Ｂ、ＩＩとＣ
１ａｌにて切断し、生じた一ＨＩＬ−２配列を含んだフ
ラグメントをポリアクリルアミドゲル電気永動によって
分離される。プラスミドｐＧＸ１０７４も同様に、同じ
制限酵素によって切断し、ＯＬ／　Ｐ　ｍ調節領域を含
んだフラグメントを分離される。そしてＯＬ／ＰＩフラ
グメントが、プラスミドｐＧＸ１０９２やｐＧＸ１０９
１から得られるＨＩＬ−２フラグメントと結合される。

その結果、発現用ベクターとして、ａｌａｉ→−ＨＩＬ
−２の配列を有するものがｐｃ、Ｘ１０９９、また完全
な鎖長のＨ・ＩＬ−２配列を有するものがｐＧＸ１１０
４として表わされる０両方の場合、本来のＨＩＬ−２の
制限酵素５ｔｕｌ認識切断部位まで３゛末端側に翻訳さ
れない配列が残されている。これらのプラスミドは、染
色体上に温度怒受性λｃ１８５７抑制囚子の遺伝子を有
する宿主細胞に導入することによって発現用ベクターと
して用いることができる。

プラスミドｐｒ、Ｘｌｌ１１４で形質転換されたＥ。

ｃｏｌｉは菌株ＧＸ１１９６であり、これは本来の完全
な鎖長のＨＩＬ−２タンパクを産生ずる。またプラスミ
ドｐＧＸ１０９２で形質転換されたＥ。

ｃｏｌｉは菌株ＧＸ１１９９であり、これはａｌａｆ→
のＨＩＬ−２タンパクを産生する。

実施例２：　　Ｉ！、ｃｏｌｉ　　ＧＸ１１９６　（＋
）ＧＸｌ１０４）によるＨ　Ｉ　Ｌ　−２の製造方法Ｈ
ＩＬ−２産生のための接種培養は、２つの種培養段階を
経てスケ−ルアラフされる。まず最初の種培養は、産生
菌株（ＧＸ１１９６）を１１００ｐ／−のアンピシリン
を含んだＬＢ培地のアガープレートにて、３０℃、１８
〜２４時間生育させ、次にそのコロニーを１１００ｐ／
ｍｌのアンピシリンを含む肉汁とＬＢ培地２０−の入っ
た２〜１２５　＋ａＺ容の密栓付フラスコに移植して、
３０℃、７時間振とう培養する。そして第二の種培養は
、１１００ｐ　／−のアンピシリンを含むＬＢ肉汁培地
２００耐の入った２〜５００−容の密栓付フラスコに最
初の神培養を移植することによって行われ、このフラス
コを３０℃、３時間振とう培養する。

両種培養に用いられたＬＢ培地の組成を以下に示す。

ＬＢ培ｌ曳 トリプトン（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）　　　１０ｍｇ酵母抽
出物　　　　　　　　５ｇ ＮａＣ＋　　　　　　　　　　　　５ 蒸留水（ＤＩ−１１１０）適量にて１０００＠７とする
。

上記培地は１５ポンド／平方インチの圧力下、オートク
レーブにて滅菌し、室温まで冷却する。またアンピシリ
ン（１００Ｐｒ／ｄ）は、植菌の際に加える。

ＨｒＬ−２は、６１ファーメンタ−にて製造される。そ
のバッチ培地に含まれる成分を以下に示す。

バヱ土廣埴 （ＮＨａ）ｚｓＯ４２４ｇ ＫＨｘＰＯａ　　　　　　　　　　１２　ｇに＊１ＩＰ
Ｏｎ　　　　　　　　　　４．０　ｇ−工」ＪＳ仁ぶ…
杜ハ上−一一」Ｌす１−蒸留水適量にて３０００−とす
る。

上記培地は１５ボンド／平方インチの圧力下、オートク
レーブにて４５分間滅菌処理し、３２℃まで冷却して使
用する。

また、ファーメンタ−には以下に示す溶液を滅菌後加え
た。

グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）　　８０　ｇ　（蒸留水
１６〇−にて溶解） す°イアシン（Ｎｉａｃｉｎ）　　　４．５１Ｉｌ　（
ストック溶液）トレース１（Ｔｒａｃｅ　１）　　８．
０＠ｌ（ストックン容ン＆）トレース２（Ｔｒａｃｅ　
２）　　２．０ａＺ　（ストック溶液）トレース３（Ｔ
ｒａｃｅ　３）　　０．８ａ＋７　（ストックｉ容液）
ＣａＣＩｔ　＋　２１１ｚ０　　　　　２．ＯａＺ　（
ストック溶液）°チアミン（Ｔｈｉａ＋ｍ１ｎｅ）　　
７．０ｍ１（ストック溶液）それぞれのスト７り溶液は
以下に示す。

１、　ナイアシン ナイアシン　　　　　　１０ｍ／７！留水１　ｔａｒ本
ストック溶液は濾過滅菌される。

２、トレース１ ＺｎＳＯａ　　　　　　　　　　　７．２　ｇＦｅＣＩ
ｉ　’　６１１ｇ０　　　　　　２７．ＯｇＭＩＩＣＩ
！　・４１１Ｊ　　　　　　　　４．９５　ｇＣｕＳＯ
ａ　・５ｌｌｔｏ　　　　　　　　１．２５　ｇＣｏＣ
ｌｔ　＋　６１１．ｏ　　　　　　　　１．１９ｇ１１
ＪＯｚ　　　　　　　　　　　０．３１　ｇ’ｊｆｉ１
ｊ１４　　　　　　　　　　６６．２５１ｍ１蒸留水に
て１０００−とする。

トレース１熔液は１５ボンド／平方インチの圧力下、オ
ートクレーブにて滅菌される。

３、トレース２ Ｍｇ５Ｏａ・７１＋、０　　　　　　　２４６．４　ｇ
−声　　　　　　　　　　　１７９．２　ｍ蒸留水にて
１０００　＠ｔとする。

トレース２／８液は濾過によるか、あるいは１５ボンド
／平方インチの圧力下、オートクレーブにて滅菌される
。

４、トレース３ ＮａｚＭｏＯｍ　’　２１ｈ０　　　　　　２４−１　
　ｇ蒸留水にて１０００−とする。

トレース３？８液は濾過によるか、あるいは１５ボンド
／平方インチの圧力下、オートクレーブにて滅菌される
。

蒸留水にて１０００−とする。

ＣａＣＩｍ・２１１ｔＯ溶液は濾過によるか、あるいは
１５ボンド／平方インチの圧力下、オートクレーブにて
滅菌される。

６、　チアミン チアミン　　　　　　　　　　　３０ 蒸留水にて１０００−とする。

チアミン溶液は濾過滅菌される。

培養時の培地のｐｎは、２９％Ｎ　Ｈ，ＯＨとＩＮＨｘ
　Ｐ　ＯａによってｐＨ７，０に調節され維持される。

培地に、前記したように体積が１０％の第二の種培菱国
体（３時間培養したもの）を接種し、次に３２℃にて１
２時間培養を行う、ファーメンタ−の攪拌は、８００　
ｒｐ＋ａであり、培地中には４．（１／分の流量によっ
て滅菌空気を通気する。はじめのＩｆｊ￥に：体積は３
．６１である。

８時間の培養後、攪拌を１０００ｒｐ＋＊に強めて、溶
存酸素■を２０％飽和の状態に維持する。９．５時間後
、溶存酸素量を２０％飽和の状態に維持するように酸素
ガスを供給して培養を続ける。

培養中、グルコース、種々の微量金属およびチアミンを
含むグルコース溶液をバッチワイズ法にて供給する。そ
のグルコース溶液の組成を以下に示す。

グルコース　　　１０００ｇ／蒸留水１４００　ａｔト
レース１．１ＱＱａＺ トレース２　　　　　２５　ｍ１ トレース３　　　　１〇− ＣａＣ１ｚ　・２１ｈＯ２５，ＯＩｌｌチアミン　　　
　　　５．〇− 培養中、グルコースが使い果たされた時には、前記グル
コース７８液８０＠ｌを培地に添加する。

４２℃に培養温度を上昇させ、１２時間培養させた後に
ＩＬ−２が産生される。この時期、培地は吸光度６００
ｎｍにおいて０Ｄａｅ、５−６８．０であり、培養温度
はこれ以後も維持される。

封入体の産生は、１〜２時間毎に顕微鏡によって観察す
る。培養１５時間後、封入体は細胞の約６０％に含まれ
、１７時間後には細胞の約８０％に含まれるようになる
。培養細胞は封入体の産生と大きさが最高に達する培養
後１９時間で集菌され、以下の実験に供される。

実施例３：ＨＩＬ−２の回収と精製 ＨＩ　Ｌ　−２の誘導のため４２℃にて培養した菌　。

株ＧＸ１１９！］細胞の４１培地を約１１に濃縮し、次
いで、（ｉ、１１００　ｘｇにて２０分間遠心分離を行
い集菌する。上ｔ：１′を除いた沈澱細胞は、淘国体と
して１２７ｒＸであり、これを−２０℃にて保存する。

これらの細胞のうち４６．５ｇ（乾燥重量として１０、
（ｉｇ）を１０ｗＭ）リス−塩酸緩衝液ｐｌ＋８．０（
１＋ｗＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含むＨ５０＋ａＺで懸濁
した。この懸濁液をフレンチプレス（１６，０００〜１
８，０００　ｐｓ＋）にて破壊し、この破壊細胞を６，
８００　ｘｇで２５分間遠心分ね【し、その沈澱物を前
記緩衝液にて再懸濁する。

この細胞懸濁液（細胞膜、封入体、未破壊の細胞等を含
む）を前記方法にて再度フレンチプレスにかける。遠心
後、沈澱物をｍｓ液にて再懸濁し、０．８００　ｘｇ、
２５分間遠心洗浄する。この洗浄処理の際、ピペットに
て沈澱物をほぐして、３０分間はどよく混ぜ合わせる必
要がある。

この封入体の洗浄は３回以上行い、吸光度２８０ｎｓに
おいてＯＤ！ｌ１１１−１．２に達するまで行う、最終
沈澱物を３０Ｉｌｌの５０ＩＩＭトリスー塩酸緩衝液ｐ
Ｈ８，０にてＱｉし、４℃にて保存する。この封入体の
１部を凍結乾燥し、重量を測定すると、収量４００ｍｇ
と換算される。これを３１）Ｓ−ＰＡＧＥ電気泳動に供
すると、分子量約１４，０００の位置に主要クンバクが
存在し、その量は封入体タンパクの７５％以上と換算さ
れる。

次に封入体タンパクは、１％５ＤＳ（１０＋＊ＭＨｅｐ
ｅｓ　ｐＨ７，３，０，１Ｍ　ＮａＣｌ１，０．４ａ＋
Ｍ　　ＥＤＴＡ　、　’ｌＯ＋ｏ？Ｉ　　ジチオスレイ
トール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を含む〕溶液
によって可溶化される。この試料は、ゲル濾過性のＨＰ
　Ｌ　Ｃ（３０ＬＪＧ３０００ＳＷ　（ＴＳＫ）カラム
と３０　ｅｌｌ　　Ｇ２０００ＳＷ　（ＴＳに）カラム
を連結させたカラム〕に供することによって精製される
。カラムは可溶化用緩衝液（１％ＳＤＳ溶液中、１．０
１　ジチオスレイトールを含む溶液）にて平衡化し、流
速０．５ｍ／分にて溶出させて溶出液を吸光度２８０ｎ
ｍにより測定する。

このカラムは、平衡化用緩衝液中、４分間沸騰さゼた低
分子ｆｆｉ標準タンパク〔ベセスダ　リサーチ　ラボラ
トリーズ（ＢｅＬｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ
ｂｏｒａ−Ｌｏｒｉｅｓ　））にて容量計測する。用い
た低分子量標準タンパクを以下に示す。

タンパク　　　　　　　　ツ インシュリン（Ａ、　Ｂ鎖）　　　　　　　３．０００
牛トリプシン阻害剤　　　　　　　６，２００（Ｂｏｖ
ｉｎｅ　Ｔｒｙｐｓｉｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）チトク
ロームＣ１２，３００ （Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ） リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙ＋ｓｅ）　　　　　　１４．
３００β−ラクトグロブリン　　　　　１８，７００（
［ｌａＬａ−Ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）α−キモト
リプシノゲン　　　　　２５，７００（八Ｉｐｈａ−Ｃ
ｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎ）オボアルブミン（Ｏ
ｖａｌｂｕｍｉｎ）　　　　４３，０００本実験条件下
、分子量と溶出体積の間には直線的な相関関係が見られ
る。

容量計測後、可溶化された封入体試料１００パから１０
００　ｐＪ量（タンパク濃度として５ｍｇ／＋ａ／）を
カラムに流すと、いずれの場合もほぼ同様な溶出パター
ンを示す、これらの溶出パターンは、ボイドボリューム
の溶出位置（高分子ｔｗｔ域）とチトクロームＣの直前
の溶出位置に主要バンドを有し、分子量約１３，０００
−１４，０００と嵜えラレル。

この結果は、ゲル濾過性のＨＰＬＣにかける前の試料を
、５ＤＳ−Ｐ／ｊＣ；Ｅ電気泳動にかけた時の結果と同
様である。このカラムから溶出されたフラクションの各
０．５−をＴ細胞成長の誘導による生物学的活性の測定
、タンパク定量、そしてまた、５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅ１７
）測定などに用いる。　　１４．０００ダルトンまでの
ピークに関連するすべてのフラクションには、組織培養
培地（５％牛脂児血？〃）で希釈した後、Ｔ細胞成長の
誘導活性が見い出される。ピークフラクションの比活性
は、１．０〜２．０×１０＆単位／ｍｇｔ’、これはス
ミス（Ｓｓ＋ｉ　ｔｈ）　　らによってヒトリンパ球由
来Ｔ細胞（Ｊａｒｋａｔ　ｃｅｌｌ）から得られたＩＬ
−２についての報告とほとんど類似したものである。５
Ｏ３−ＰＡＧＥ１ｉ気泳動の結果は、はぼ単一バンドを
示し、分子ｆｆｉ　２０．０００以上の高分子■の不純
物はほとんど見られない。

実施例４；ＩＩＩＬ−２の回収と精製 培養したＧＸ１１９６細胞を実施例３と同様な方法にて
集菌し、１＋ｎＭ　　ＥＤＴＡを含むＩＯｄトリス−塩
酸、ｐｌ＋８緩衝液に懸濁し、悲ＦＪ液をガラリン　ホ
モゲナイザ−（Ｇａｕｌｉｎｅ　ＩＩｏｏ＋ｏｇｅｎｉ
ｚｅｒ）を通して細胞を破壊した。この破壊細胞を１３
．　Ｔｏ。

ｘＢで遠心分ＮＩＬ、その沈澱を前記緩衝液にて再懸澗
した。この工程を繰り返し、ＨＴＬ−２を含む封入体の
分離と洗浄を行った。

分離された封入体の可溶化は、先の工程の最終沈澱を１
０ｍＭ）リス−塩酸＋ｐｌ（８でバッファナイスされた
１０ｍＭＤＴＴを含む６Ｍグアニジン−塩酸（Ｇｕａｎ
ｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ　）で溶解することによって達成さ
れた０本法において使用される封入体は、２４時間以内
であればよく、通常６Ｍグアニジン−塩酸３００ａＺに
対してｌｏｇ　（１０ＩＬ培養によって得られる細胞量
の約ｌ／２）程度である。

可溶化は４℃にて約３時間攪拌し、その後溶液を２０．
０００　ｘＢで３５分間遠心洗浄し、上清を０．４５−
の膜を通して濾過した。この濾過された試料はＨＰＬＣ
カラムに供するまで４℃にて保存された。

ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製は、２つのＰｒｅｐ　−Ｐａ
ｋ　５００　／　Ｃ１８カラム（５，０Ｘ３０ｃ＋ａ）
を連結させたＭｏｄｅｌ　５００−Ａ　ｐｒｅｐａｒａ
ｔｉｖｅ液体クロマトグラフィーシステム〔ウォーター
ズ（Ｗａｔｅｒｓ）社〕を用いて行われた。カラムに供
する６Ｍグアニジン−塩酸可溶化封入体の体積は、昔通
、１００〜１５０社であり、それはタンパク量として約
５ｇである。カラムは試料を流す前に４０％アセトニト
リル（０，１％トリフルオロ酢酸を含む）にて平衡化し
た。また、ポンプ中に試料が沈澱することを防ぐために
、試料を流す直前に約２０＠ｌの６Ｍグアニジン−塩酸
を流してやる必要があり、同じ理由で、試料を流し終え
た直後にも２０ＩＩＩｌの６Ｍグアニジン−塩酸を流し
た。試料を流す流速は、５０−７分とした。そして、カ
ラムを４０％アセトニトリルで洗い、流速を１００１１
１７／分に上げた。

４０％アセトニトリル８）でカラムを洗った後、段階的
な溶出は最初に５０％、次に６０％Ｓ最柊に８０％とア
セトニトリルの濃度を高めることによって効果的に行わ
れた。カラムから溶出されたフラクションは、使用前に
発熱物質による障害がないように３００℃で３時間熱処
理されたＨｚ容のＷｌ＋ｅＩＩＬｏｎ　　ボトルに集め
た。この分取工程を通して、ボトル内に発熱物質が混入
するのを防ぐために操作はヒユーム・フード（ｆｕｍｅ
　ｈｏｏｄ　）中にて行われた。　１ｌｊｌｉ菌した発
熱物質による障害のないシリンジにて各ボトルよりｌ−
づつ部分標本を４本採取し、それぞれ＋ａ＋生物学的活
性測定、（ｂ）エントド−１−シン測定、［ＣＩ　Ｓ　
Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ測定、ｆｄ＋タンパク定量に
供した。エンドトキシン測定のための試料は、滅菌され
た発熱物質による障害のないバイアル（ｌ１ｌｋｉｎ−
５ｉｎｎ　）に入れられ、リムラステスト（Ｃｌ＋ｒｏ
＋ｇｏ８ｅｎｉｃ　Ｌｉ＋ＩＩｕｌｕｓ　ａｍｅｂｏｃ
ｙｔｅ　１ｙｓａｔｅａｓｓａｙ　（Ｍ、八、　ｌ１ｉ
ｏｐｒｏｄｕｃｔｓ　）　）によって測定された。

５０５−ＰＡＧＥの結果、５０％アセトニトリルで多く
、の夾雑タンパクが溶出され、これらのフラクソヨンに
はほとんどＩＬ−２が見られなかった。他方、６０％ア
セトニトリル溶液によって有、意な量のＩＩＩ　Ｌ−２
が溶出された。数回のＨＰ　ＬＣ操作によっても、６０
％アセトニトリルによる溶出フラクションには有意のエ
ンドトキシン混入が見られた。添加量のＨＩＬ−２は８
０％アセトニトリルによって７容出することができ、こ
のものは相対的に低いエンドトキシン量であり、５Ｏ３
−ＰＡＧＥ測定によってより均一であると認められた。

以上の全工程により、５Ｄｓ−ｐＡｃＨｔ４定後、ゲル
・スキャンニングにより測定した結果、９０％以上純粋
な物質が得られた。凍結乾燥後、未変化体の平均比活性
は、標準測定法を用いたＴ細胞増殖活性測定により１．
０Ｘ１０’単位／ｍｇであった。このときの精製ＨＩＬ
−２に混入したエンドトキシンは平均４０　ｎｇ／ｍｇ
ＨＩ　Ｌ　　２であり、その範囲は分８８０フラクショ
ンに対して１〜１１００ｎ／ｓｇＨＩ　Ｌ　−２であっ
た。

【図面の簡単な説明】

第１１４１は、その２番目のコドン（ＣＣＴ）から始ま
るＩＩ　Ｉ　Ｌ　−２構造遺伝子を含むプラスミドｐＧ
Ｘ１０９２の構造を示したものである。 第２図は、プラスミドｐＧＸ１１０４とｐＧＸ１０９９
の構造を示したもので、プラスミドｐＧＸ１１０４は完
全な鎖長のＨＩＬ−２遺伝子を有し、ｐｃｘ１０９９は
その第２番目のコドンより始まるｔｌ　Ｉ　Ｌ　−２を
有し、それらはともに雑種λファージプロモーターによ
って発現が１１１１１　ｆｉｌされているものである。 １頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’　　　　　　　識別記号　　　庁内
整理番号発明者　　　チャールズ　エイ、バ　　アメリ
カ合衆国、スレッド　　　　　　　　ン、アンブラー発
　明　者　　マイケル　ダブル、パ　　アメリカ合衆国
、ントリアーノ　　　　　　プリング、マンチ２０８９
５　　メリーランド州、ケンシントドライブ　４４１０ ２０９０１　　メリーランド州、シルバー　スエスター
　ロード　８５３６

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトインターロイキン２活性を有するポリペプタ
   イドをコードするＤＮＡ配列の５′末端にプロモーター
   ／オペレーター領域とリボソーム結合部位を含み、それ
   自身本来のヒトプロモーターは含んでいないものであっ
   て、雑種λファージ調節領域が、前記のＤＮＡ配列の転
   写、翻訳を指令するために適当な位置に存在し、前記調
   節領域が２つのλファージプロモーター／オペレーター
   領域の雑種であるλファージ調節領域を含有しているバ
   クテリア内で自己複製が可能なベクター。
2. （２）第一のλファージプロモーター／オペレーター領
   域の完全なプロモーター配列と第二のλファージプロモ
   ーター／オペレーター領域のオペレーター配列を結合し
   たものから成り、前記の第二のプロモーター／オペレー
   ター領域のオペレーター配列が前記の第一のプロモータ
   ー／オペレーター領域由来のプロモーターをその本来の
   オペレーター配列よりも高い効率で制御できる特許請求
   の範囲第（１）項記載のベクター。
3. （３）λファージプロモーター配列Ｐ＿Ｒをλファージ
   プロモーター／オペレーター領域Ｐ＿Ｌのオペレーター
   配列へ結合した雑種調節領域を有する特許請求の範囲第
   （１）項記載のベクター。
4. （４）原核生物内で転写あるいは翻訳を指令することが
   できる特許請求の範囲第（３）項記載のベクター。
5. （５）前記原核生物がエセリシア属である特許請求の範
   囲第（４）項記載のベクター。
6. （６）特許請求の範囲第（１）項記載のベクターによっ
   て形質転換された微生物。
7. （７）前記微生物がエセリシア属である特許請求の範囲
   第（６）項記載の微生物。
8. （８）前記微生物がエセリシア・コリである特許請求の
   範囲第（７）項記載の微生物。
9. （９）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
   にＡＴＣＣ３９６９５として寄託されている菌株ＧＸ１
   １９６と同様な性質を有するエセリシア・コリである微
   生物。
10. （１０）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
    ンにＡＴＣＣ３９６９６として寄託されている菌株ＧＸ
    １１９９と同様な性質を有するエセリシア・コリである
    微生物。
11. （１１）同化可能な炭素源、窒素源、主要な無機物およ
    び生長因子を含む栄養培地中にて特許請求の範囲第（６
    ）、（７）、（８）、（９）および（１０）項記載の微
    生物を、前記タンパクが大量に蓄積するまで培養させ、
    その生成したタンパクを回収することから成るヒトイン
    ターロイキン２の生物学的活性を有するタンパクの製造
    法。
12. （１２）微生物が温度感受性のλファージ抑制因子の遺
    伝子を含むものであり、前記栄養培地中、前記微生物が
    十分な細胞密度に達するまで抑制因子の不活性化温度よ
    りも低い温度で培養し、その後抑制因子不活性化温度よ
    り高い温度まで上昇させ、ヒトインターロイキン２の生
    物学的活性を有するタンパクの生成を誘導する特許請求
    の範囲第（１１）項記載の製造法。
13. （１３）温度感受性抑制因子がλファージ抑制因子ｃ１
    ８５７である特許請求の範囲第（１２）項記載の製造法
    。
14. （１４）温度上昇の後、微生物が多量のヒトインターロ
    イキン２タンパクを含んだ封入体を生成するように培養
    される特許請求の範囲第（１２）項記載の製造法。