HU218263B

HU218263B - Eljárás rekombináns humán interleukin-10 tisztítására

Info

Publication number: HU218263B
Application number: HU9502586A
Authority: HU
Inventors: Susan Cannon-Carlson; John Tang; Gary Vellekamp
Original assignee: Schering Corp.
Priority date: 1993-03-05
Filing date: 1994-03-03
Publication date: 2000-06-28
Also published as: EP0688335A1; AU6351594A; JPH08503227A; KR960701084A; NZ263006A; AU683458B2; CA2157358C; KR0178304B1; US5328989A; JP2802168B2; WO1994020525A1; HU9502586D0; FI954047A; FI954047A0; IL108837A0; CN1119018A; HUT73102A; US5710251A; IL108837A; CA2157358A1

Abstract

A találmány tárgya eljárás oldatban lévő, rekombináns úton előállítotthumán interleukin–10 (IL–10) tisztítására, amely abban áll, hogy (i)az IL–10-tartalmú oldatot kationcserélő oszlopkromatográfiának vetikalá, és az IL–10-tartalmú frakciókat összegyűjtik; (ii) az (i)lépésben kapott IL–10-tartalmú frakciókat anioncserélőoszlopkromatográfiának vetik alá, és az IL– 10 tartalmú frakciókatösszegyűjtik; (iii) az (ii) lépésben kapott IL–10-tartalmú frakciókathidroxil-apatit-kromatográfiának vetik alá, és az egymástól elkülönültIL–10 dimereket tartalmazó frakciókat összegyűjtik; és kívánt esetben(iv) az (iii) lépésben kapott, egyetlen IL–10 dimert tartalmazófrakciókat gélszűréses kromatográfiával tovább tisztítják. A találmányszerinti eljárás mind eukarióta, mind prokarióta expressziósrendszerekben kifejezett IL–10 tisztítására alkalmazható, és ezzellényegében tiszta, nem kovalensen kötött IL–10 dimer állítható elő. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás oldatban lévő, rekombináns úton előállított humán interleukin-10 (IL—10) tisztítására.

Az interleukin-10-et (IL-10-et) - amely egy legújabban felfedezett limfokin - eredetileg úgy jellemezték, hogy a γ-interferonszintézis inhibitora, és kimondták, hogy az immunválasz humorális osztályának fő mediátora [D. F. Fiorentino et al., J Exp. Med., 170, 2081 (1989); K. W. Moore et al., Science, 248, 1230-1234 (1990)]. A gyakran egymást kölcsönösen kizáró immunválaszok két osztályát a humorális (antitestközvetített) immunválasz és a késői típusú túlérzékenység képezi.

Megállapították, hogy ez a két különböző immunválasz két helper T-sejt klóntól, nevezetesen a Thl és Th2 helper T-sejtektől ered, és ez megkülönböztethető szekréciós rendszerekre utal [Moore, lásd előbb; P. Vieira et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 1172 (1991)]. Az egér Thl-sejt kiónok γ-interferont és IL-2-t szekretálnak, és elsősorban késői típusú hiperszenzitivitást indukálnak, míg a Th2-sejt kiónok IL-4-et, IL-5-öt és IL- 10-et szekretálnak, és a humorális válaszokat segítik elő (Fiorentino et al., lásd előbb). Az immunválaszban mutatkozó ellentét arra vezethető vissza, hogy a Thl-sejt kiónok által szekretált γ-interferon in vitro gátolja a Th2-klón proliferációját, míg a Th2-sejt kiónok által szekretált IL— 10 gátolja a Thl-sejt kiónok citokinszekrécióját (Fiorentino et al., lásd fentebb; Moore et al., lásd fentebb). Tehát a két T helper sejt típus kölcsönösen gátolhatja egymást, és ez a két eltérő immunválasz számára támogatást jelenthet.

Mind az egér, mind a humán T-sejtekből előállított IL-10-et klónozták és szekvenálták (Moore et al., lásd előbb; Vieira et al., lásd előbb). Mindkét szekvencia egy 178 aminosavhosszúságú - 18 aminosavból álló N-terminális hidrofób vezérszekvenciát tartalmazó polipeptidet kódoló nyílt leolvasási keretet foglal magába. A két aminosavszekvencia homológiája 73%-os.

A biológiailag aktív IL-10, analitikai gélszűréssel végzett meghatározás szerint, dimer molekula. A dimer többnyire nem kovalens kötésű, ugyanis monomerként vándorol nem redukáló nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélben (SDS-PAGE) elektroforetizálva. A rekombináns humán IL-10 mind prokarióta, mind eukarióta expressziós rendszerekben kifejezhető.

Az eukarióta expressziós rendszerben termelt rekombináns humán IL-10 N-terminális analízise kimutatta, hogy az IL-10 polipeptid kis százalékánál a két első Nterminális aminosavmaradék hiányzik. Ennek a csonka polipeptidnek a neve Δ2 IL-10 polipeptid, vagy egyszerűen Δ2. Ennélfogva a teljes hosszúságú láncot ΔΟ-nak nevezik, ami azt jelenti, hogy benne egyetlen aminosav sem törlődött. Tehát a biológiailag aktív, eukarióták által kifejezett IL-10 három különböző dimer alakban jelenhet meg. Az első, biológiailag aktív dimer és fő forma a Δ0: Δ0 homodimer, amelyben a dimer mindkét polipeptidje teljes hosszúságú aminosavláncból áll. A második IL-10 a Δ0:Δ2 heterodimer, amelyben az egyik polipeptidlánc teljes hosszúságú aminosavláncból áll, és a második, Δ2 láncban az első két N-terminális aminosav hiányzik. A harmadik IL-10 dimer a A2:A2 homodimer, amelyben a dimer mindkét polipeptidláncából aí első két N-terminális aminosavmaradék hiányzik. Ezért igény merült fel az IL-10 tisztítására szolgáló eljárás iránt, azaz elsősorban egy olyan eljárás iránt, amely az IL-10 különböző dimereit elválasztja egymástól.

A prokarióta expressziós rendszer által kifejezett zárványtestekben lévő IL-10-et denaturálni kell, ezután újból felgombolyítani, majd meg kell tisztítani a szennyezésektől, beleértve a gazdasejt proteinjeit, az IL -10 módosult variánsait és ezen variánsok heterodimereit. Egy prokarióta rendszerben ezenfelül az IL -10 monomer egy vagy több lizin maradéka lehet at etilezett. Ha egy acetilezett monomer egy másik acetilezett monomerhez kötődik, acetilezett homodimer keletkezik. Ha azonban egy nem acetilezett monomer kötődik egy másik nem acetilezett monomerhez, úgy egy nem acetilezett homodimer jön létre. Ha egy acetilezett monomer egy nem acetilezett monomerhez kötődik, akkor heterodimer keletkezik. Ezenfelül, rendes körülmények között, az IL-10 mint nem kovalensen kötött homodimer képződik. A zárványtestek denaturálása és az IL-10 újbóli felgombolyítása folyamán azonban kovalens kötésű homodimer keletkezhet, azaz olyan, amely dimerként vándorol nem redukáló SDS-PAGE-rendszerben és monomerként redukáló feltételek mellett. E <t valószínűleg a két monomer között képződött egy vagy több intermolekuláris diszulfídkötés okozza. Tehat szükségessé vált, hogy az IL-10-et megtisztítsuk a gazdasejt proteinszennyezéseitől, és hogy lényegében tiszta, nem kovalens kötésű olyan IL-10 dimerhez jussunk, amely nem tartalmaz acetilezett homodimert, heterodimer variánsokat és kovalens dimereket.

Potenciális immunválasz mediátor szerepe és γ-ίηterferonszintézis inhibitoraktivitása következtében az II.—10 klinikailag hasznosítható lehet autoimmun betegségekben vagy transzplantátum-kilökődés eseteiben. Azonban klinikai alkalmazás esetén igencsak kívánatos, hogy az IL-10 nagy tisztaságú legyen, lényegében ne tartalmazzon gazdasejt és táptalaj eredetű más szennyező proteineket vagy polipeptideket, és lényegében mentes legyen az acetilezett homo- és heterodimer variánsoktól, valamint a csonka és kovalensen kötött dimerektől. Ezért tehát szükség van az IL-10-nél alkalmazható olyan tisztítási eljárásra, amely megoldja ezeket a problémákat.

Az említett igényt a találmány szerint úgy elégítjük ki, hogy oldatban lévő, rekombináns úton előállított humán IL-10 tisztítására az alábbi lépésekből álló eljárást alkalmazzuk:

(i) az IL-10-tartalmú oldatot kationcserés kromatográfiával tisztítjuk, és az IL-10-tartalmú frakciókat összegyűjtjük;

(ii) az (i) lépésben kapott IL-10-tartalmú frakciókat anioncserés kromatográfiával tisztítjuk, és az IL—10tartalmú frakciókat összegyűjtjük;

(iii) az (ii) lépésben kapott IL— 10-tartalmú frakciókat hidroxil-apatiton kromatografáljuk, és az egymástól elkülönült, egyetlen izolált IL-10 dimert tartalmazó frakciókat összegyűjtjük; és

HU 218 263 3 kívánt esetben (iv) az (iii) lépésben kapott IL- 10-tartalmú frakciókat gélszűréses kromatográfiával tovább tisztítjuk, és ezáltal olyan IL-10-tartalmú frakciókat kapunk, amelyek magas és alacsony molekulatömegű szennyezésektől mentesek.

Az IL-10 ezen tisztítási eljárása mind bakteriális, mind eukarióta expressziós rendszerekben kifejezett IL- 10-re alkalmazható.

A találmány tárgya továbbá egy eljárás oldatban lévő különböző IL-10 dimerek szétválasztására, ahol a különböző dimerek különböző N-terminális aminosavszekvenciát tartalmaznak. A módszer abból áll, hogy az oldatot hidroxil-apatiton kromatografáljuk olyan feltételek mellett, amelyek lehetővé teszik, hogy az IL-10 különböző dimerei szétváljanak.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy olyan eljárás, amely oldatban lévő nem acetilezett IL-10 homodimereknek acetilezett IL-10 homodimerektől és acetilezett IL-10 heterodimerektől való elválasztására szolgál. Az eljárás szerint az oldatot anioncserélőn kromatografáljuk olyan feltételek mellett, amelyek lehetővé teszik, hogy a nem acetilezett IL-10 homodimer az acetilezett IL-10 dimerektől elváljék.

Az idézett szakirodalmi közleményeket teljes egészükben referenciaként tekintjük.

A találmányi leírásban az „interleukin-10” vagy „IL-10” kifejezés vagy humán IL-10-et (hIL-10) vagy egér IL-10-et jelenthet. A humán IL-10 egy olyan protein, amelynek (a) az aminosavszekvenciája lényegében azonos a 07/917,806 sorszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtva 1992. július 20-án) - amely megfelel a WO 91/00349 számon közzétett PCT/US90/03554 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésnek - szerinti érett hIL-10 ismert szekvenciájával, és (b) biológiai aktivitása azonos a natív IL-10-ével.

Az IL- 10-et az ezen proteint szekretálni képes aktivált T-sejtek táptalajtenyészetéből izolálhatjuk. Kedvezőbb azonban, ha rekombináns technikákkal állítjuk elő IL-10 polipeptidet kódoló izolált nukleinsavak használata révén. A találmány szerinti eljárásban tisztítandó humán IL - 10-et rekombináns úton állítjuk elő. A molekuláris biológia általános módszereinek a leírása megtalálható például a következő kiadványokban: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publish., Cold Spring Harbor, New York, 2. kiadás (1989); Ausubel et al., (szerk.) Current Protocols in Molecular Biology, Green/Wiley, New York (1987 és időszakos kiegészítések). A helyes szekvenciák vagy genomiális, vagy cDNS-tárakból izolálhatok. Használhatunk polimeráz láncreakció (PCR) technikákat is. Lásd például: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (szerk.), Academic Press, New York (1990, New York).

A tárak a megfelelő sejtekből kivont nukleinsavból készíthetők. Lásd például a WO 91/00349 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentést, amely IL-10 előállítására szolgáló rekombináns módszereket tartalmaz. Használható génszekvenciák találhatók például a különböző szekvencia-adatbázisokban, ilyen például a Gén Bank és az EMBL nukleinsavak számára és a PÍR és a Swiss-Prot proteinek számára, vagy ilyen a c/o Intelligenetics (Mountain View, Califomia), vagy a Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center (Madison, Wisconsin). Az említett adatbázisokat referenciának tekintjük.

Humán IL-10-et (hIL-10) kódoló szekvenciákat tartalmazó kiónokat az American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland) intézményben, 68191 és 68192 letéti számokon helyeztek letétbe. Más IL-10-et kódoló szekvenciákat tartalmazó kiónok azonosítását vagy nukleinsavhibridizáció segítségével végezzük, vagy a kódolt protein immunológiai kimutatásával, ha expressziós vektort használunk. A WO 91/00349 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés olyan ol gonukleotid szondákat ír le, amelyek a letétbe helyezett szekvenciákon alapulnak. A szekvenciák azonosításé a használható oligonukleotid szondákat más fajok rokcn génjeinek állandó szakaszaiból is előállíthatjuk, vagy használhatunk olyan degenerált szondákat is, amelyeket az IL-10 aminosavszekvenciájára alapoztunk.

Az IL-10-et kódoló DNS kifejezéséhez különböző expressziós vektorok használhatók. Rekombináns proteinek prokarióta vagy eukarióta sejtekben való expressziójához hagyományos vektorokat használhatunk. Előnyös vektorok például az Okayama és munkatársai [Mól. Cell. Bioi., 3, 280-289 (1983)] és Takebe és munkatársai [Mól. Cell. Bioi., 8, 466-472 (1988)] által le rt pcD vektorok. Más SV40 alapú emlősvektorokat említettek Kaufman és munkatársai [Mól. Cell. Bioi., 2, 1304-1319 (1982)], valamint a 4,675,285 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. Ezek az SV40 alapú vektorok különösen jól használhatók COS7 majomsejtekben (ATCC CRL 1651) és más emlőssejtekben, így például egér L-sejtekben és CHOsejtekben.

Standard transzfekciós módszereket alkalmazhatunk olyan eukarióta sejtvonalak előállítására, amelyek nagy mennyiségű polipeptidet fejeznek ki. A találmány szerinti eljárás alapján eukarióta sejtek által kifejezett IL-10-et tisztítunk egy olyan sejtfelülúszóból, amelybe a protein kifejeződött. Eukarióta sejtvonalak lehetnek emlős-, élesztő- és rovarsejtvonalak. Emlőssejtvon; lak például a COS7-sejtek, az egér L-sejtek és a kínaihórcsögpetefészek- (Chinese Hamster Ovary = CHO) sejtek. [Lásd: Sambrook et al. (lásd előbb); Ausubel et al (lásd előbb).]

A találmány szerinti eljárás a genetikailag transzformáit baktériumok - főként E. coli - által termelt IL -10 tisztítására is alkalmas. A találmányi leírásban használt „transzformált baktériumok” kifejezés alatt olyan baktériumokat értünk, amelyeket genetikailag úgy manipuláltak, hogy emlősproteint termeljenek. Az ilyen genetikai manipuláció rendszerint azzal jár, hogy egy expressziós vektort visznek be egy baktériumba. Az expressziós vektor a bakteriális genom génjeihez viszonyítva autonóm replikációra és proteinexpresszióra kcpes. A bakteriális expresszió tervezése jól ismert ezen a szakterületen. Feltétele, hogy a kívánt proteint kodoló nukleotidszekvencia ismert vagy más módon

HU 218 263 Β hozzáférhető legyen. Például a 4,551,433 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban DeBoer bakteriális expressziós vektorokban használatos promotereket ismertet; a 4,601,980 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Goeddel és munkatársai és a 4,431,739 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Riggs emlősproteinek E. coli expressziós rendszerekben való termelését írják le; továbbá Riggs (lásd előbb), Ferretti et al. [Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 599 (1986)], Sproat et al. [Nucl. Acids Rés., 13, 2959 (1985)] és Mullenbach et al. [J. Bioi. Chem., 261, 719 (1986)] leírják, hogyan kell szintetikus géneket szerkeszteni baktériumokban való kifejezés céljára. Számos bakteriális expressziós vektor beszerezhető a kereskedelemből és az American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) intézményen keresztül.

A találmány szerinti eljárásban a kationcserés, anioncserés, hidroxil-apatitos és kívánt esetben gélszűréses kromatografálást egymás után alkalmazzuk. A három, illetve négy kromatográfiás lépést, amelyeket pH, vezetőképesség, pufferösszetétel, átfolyási sebesség és oszlopméretek szempontjából optimalizáltunk, annak érdekében választottuk, hogy nagy tisztaságot és maximális kihozatalt érjünk el. A tisztaság és kihozatal optimális voltának meghatározásához a következő analitikai eljárásokat használtuk: Western blotting, nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézis (SDSPAGE) [U. K. Laemmli, Natúré, 227, 680 (1970)], enzim-immunassay (Enzyme Linked Immunoadsorbent Assay = ELISA), UV abszorpció mérés 280 és 260 nm-en és proteinkoncentráció-meghatározás [M. Bradford, Anal. Biochem., 72, 248 (1976)].

Ezenkívül meghatároztuk a kromatográfiás lépések sorrendjét a hatékony és gyors nagybani feldolgozás, valamint a tennék tisztasága és kihozatala érdekében. A következőképpen jártunk el: 1) az első lépés (kationcsere) folyamán a terméket koncentráltuk, hogy csökkentsük a térfogatot a kezelhetőség érdekében; 2) a második lépésben (anioncsere) úgy módosítottuk az átfolyást, hogy ebben a gyors lépésben a terméket külön feldolgozás nélkül rögtön rávihessük a következő oszlopra; 3) a két első lépés folyamán úgy távolítunk el majdnem minden szennyező proteint, hogy ezek az idegen proteinek ne befolyásolják a harmadik oszlopon (hidroxil-apatit) az IL-10 formák szétválását; és kívánt esetben 4) a gélszűréses kromatográfiánál amellett, hogy elválasztjuk a más molekulatömegű nyomnyi szennyezéseket és az IL-10 monomert - ha jelen vannak -, a puffercsere lehetővé teszi, hogy az IL -10 végterméket a kívánt pufferben kapjuk meg a későbbi gyógyszerformulázáshoz.

Azért használjuk elsőként a kationcserés kromatográfiás lépést, mivel az IL-10 jól adszorbeálódik kationcserélő gyantán. Bármilyen kationcserélő csoport használható, például karboxi-metil-, szulfo-propil- és szulfonátcsoport. A kationcserélő csoportot hozzá lehet kapcsolni valamilyen szilárd fázisú hordozóhoz, ez lehet cellulóz, dextránok, agaróz és polisztirol vagy más. Az előnyben részesített kationcserélő csoport a szulfonát, agarózzal burkolt hordozómátrixhoz kötve, ilyen például a Pharmacia cégtől (Piscataway, N. J.) származó SSepharose Fást Flow. A kiegyensúlyozó puffer pH-ja alacsonyabb legyen 7,8-nál - ez az IL-10 pl értéke -, előnyösen körülbelül pH: 6,5 S-Sepharose esetén, annak érdekében, hogy elégséges pozitív töltést létesítsen az IL-10 proteinen, és ez az IL-10 proteinnek a kationcseré ő csoporthoz való jó adhézióját teremtse meg.

Ha az IL- 10-et emlőssejttenyésztő expressziós rendszerben állítjuk elő, a feltételeket úgy választjuk meg, hogy a szennyező proteinek 80-90%-a - elsősorban a szérumalbumin - ne kötődjék. A felvitelre szánt protein mennyiségét kísérletileg határozhatjuk meg a gyártó cég ál al rendelkezésre bocsátott információk alapján. Ha egy 5x28 cm-es S-Sepharose Fást Flow oszlopot használunk, körülbelül 100 mg protein/ml ágytérfogat alkalmazható 1,1 cm/perc átfolyási sebesség mellett. A felülúszó felvitele után az oszlopot sóoldattal - vagy egy lépésben vagy lineáris gradiensben - fejlesztjük ki, SSepharose oszlop esetén előnyösen 70-300 mM nátrium-klorid lineáris gradiensben. Az IL-10 körülbelül 150 mM nátrium-klorid-koncentrációnál oldódik le hítározott A₂go csúccsal, körülbelül 17 mS mellett. A tisztán IL-10-tartalmú frakciókat ezután koncentráljuk és diaszűrjük, például Pellicon 10K membrán használatával.

Ha az IL-10-et bakteriális expressziós rendszerben, zárványtestekben állítjuk elő, az IL-10-et általában denaturáljuk, majd újból felgombolyítjuk. A visszagombolyított IL-10-tartalmú oldatot ezután kationcserélő gyantára visszük, amint fent leírtuk. A feltételeket úgy optimalizáljuk, hogy a szennyező proteinek 80-90%-a ne kötődjék meg. A felkötendő protein mennyiségét kísérletileg határozzuk meg a gyártó cégtől kapott információk alapján. Ha egy 12x36 cm-es S-Sepharose Fást Flow oszlopot használunk, körülbelül 15 mg/ml ágytérfogat alkalmazható 1 cm/perc átfolyási sebesség mellett. A felülúszó felvitele után az oszlopot sóoldattal - egy lépésben vagy ennek lineáris gradiensében - fejlesztjük ki, S-Sepharose oszlopnál előnyösen 65-400 mM nátrium-klorid lineáris gradiensében. Az IL-10 körülbelül 150 mM nátrium-klorid-konct ntrációnál oldódik le, határozott A₂₈₀ csúccsal, körülbelül 17 mS mellett. A tisztán IL-10-tartalmú frakciókat ezután koncentráljuk és diaszűrjük, például Pellicon 10K membrán használatával.

A kationcserés kromatográfiával kapott IL-10-tartalmú frakciókat anioncserés kromatográfiával tisztítjuk, ami lényegében eltávolítja a gazdasejt vagy sejttenyészet eredetű maradék proteinszennyezéseket. Bármily en anioncserélő csoport használható. Ilyenek például a kvatemer amino-etil, kevert amin vagy más, közepesen bázikus vagy gyengén bázikus anioncserélő csoporté k. Előnyös anioncserélő csoport a kvatemer aminoetil-csoport. A kvatemer amino-etil- (QAE) csoportot hozzákapcsolhatjuk dextrán, cellulóz, agaróz vagy akril hordozómátrixhoz. Előnyös, ha a hordozó agaróz. Ideális QAE agaróz anioncserélő gyanta a Q-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, N. J.).

Az emlőssejttenyésztő rendszerben termelt IL-10 nem adszorbeálódik QAE anioncserélő gyantához az optimális 8,0-8,3 pH-η, és 4 mS-nél alacsonyabb

HU 218 263 Β vezetőképességeknél. Ezért tehát az IL-10 áthalad a QAE oszlopon, míg a legtöbb szennyező protein adszorbeálódik, ha a protein mg/ml ágytérfogat-hányados értéke 4 alatt van.

Egy frakcióban az IL-10 acetilezettsége úgy határozható meg, hogy az IL-10-variánsokat először reverz fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (high performance liquid chromatography=HPLC) választjuk el. Ezután elvégezhetjük az ép protein vagy a tripszinnel emésztett fragmentumok tömegspektrometriás analízisét. Ha az IL-10 vagy fragmentuma acetilezett, a tömegspektrometriás vizsgálat az IL-10 vagy a fragmentum tömegében olyan mértékű növekedést mutat ki, ami azonos egy acetilcsoport tömegével. Ezenkívül, ha az IL -10 acetilezett, a tripszines emésztéssel kapott fragmentumok N-terminális szekvenciaanalízise egy olyan csúcsot mutat, amely megegyezik egy acetilezett lizin standardéval. A prokarióta rendszerben termelt, nem acetilezett IL-10 gyengén adszorbeálódik az anioncserélő gyantához, amikor átmegy rajta, ha a proteintartalmú oldat vezetőképessége 1,0-1,5 mS, és pH-ja 8,7. Az acetilezett dimerek és a szennyező gazdasejtproteinek sokkal erősebben adszorbeálódnak az oszlophoz.

Az anioncserélő oszlopról kapott IL -10-tartalmú proteinfrakciókat ezután hidroxil-apatiton kromatografáljuk a frakcióban jelen levő IL-10 különböző dimer formáinak elválasztása végett. Ezt fást flow-módszerrel oldhatjuk meg, amelyben az anioncserélő oszlopot közvetlenül a hidroxil-apatit-oszlop fölé helyezzük úgy, hogy az anioncserélő oszlopról kapott frakciók ahogy az anioncserélő oszlopról lejönnek, azonnal a hidroxil-apatit-oszlopra kerüljenek.

Ha az IL-10-et emlőssejttenyésztő rendszerben állítjuk elő, a hidroxil-apatit-oszlopot standard sóoldattal pH körülbelül 8,1 - hozzuk egyensúlyba. Egy erre a célra alkalmas puffer összetétele a következő: 20 mM triszC1 és 20 mM nátrium-klorid, pH 8,1. Az IL-10-tartalmú frakciókat ráengedjük a hidroxil-apatit-oszlopra, majd előnyösen 150 mM kálium-foszfát-puffer - pH körülbelül 8,0 - 20 ágytérfogat mennyiségű lineáris gradiensével eluáljuk. Az elúciót a kálium-foszfát-puffer körülbelül 6%-os koncentrációjával kezdjük, amit fokozatosan addig emelünk, amíg egy körülbelül 75%-os koncentrációt el nem érünk. Nátrium-foszfátot is használhatunk ugyanilyen koncentrációértékek mellett. A Δ0:Δ0 IL-10 dimer körülbelül 30-35% 150 mM kálium-foszfát-koncentrációnál oldódik le. A Δ0: Δ2 dimert ezután előnyösen úgy választjuk el a Δ2: Δ2 dimertől, hogy megkétszerezzük az oszlop hosszát, és a kapott frakciókat addig visszük fel újra meg újra, ameddig a Δ0:Δ2 és a Δ2: Δ2 elválasztott frakciókként nem jönnek le az oszlopról. Hidroxil-apatit-kromatográfia használatával el lehet egymástól választani az IL-10 tartalmú frakciókban együtt jelen lévő különböző IL-10 dimereket. A tényt, hogy a különböző dimerek valóban elváltak, N-terminális aminosavmaradékszekvencia-analízissel határozhatjuk meg.

Ha az IL-10-et prokarióta expressziós rendszerben állítjuk elő, ritkán kapunk csonka dimereket. A nem kovalens kötésű IL-10 dimereket azonban el kell választani a kovalens kötésű IL-10 dimerektől. Ez hidroxil-apatit kromatográfiával érhető el. A hidroxil-apatit-oszlopot standard sóoldattal - pH körülbelül 7,4 - hozzuk egyensúlyba. Az erre a célra alkalmas puffer 20 mM trisz-Cl-t és 20 mM nátrium-kloridot (pH 7,4) tartalmaz. Az IL - 10-et tartalmazó frakciókat rávisszük a hidroxil-apatit oszlopra, majd előnyösen 150 mM nátrium-foszfátpvffer - pH körülbelül 7,4 - 20 ágytérfogatnyi lineáris gradiensével eluáljuk. Az elúciót körülbelül 5%-os nátrium-foszfát-puffer koncentrációval indítjuk el, majd fokozatosan addig emeljük a koncentrációt, amíg a l( 0%-ot el nem érjük. Használhatunk kálium-foszfátot is. ugyanilyen koncentrációértékek mellett. A nem kovalens kötésű dimer 7-10 mS mellett oldódik ki elsőként, mrjd 12 mS-nél a kovalens kötésű dimer csúcsok jelennek meg.

A hidroxil-apatit-oszlopról kapott izolált IL-10 dimer tartalmú frakciókat ezután gélszűréssel tovább tisztíthatjuk. A gélszűréssel a nyomnyi magas és alacsony m üekulatömegű szennyezéseket - beleértve az IL-10 m momert - választhatjuk el, ha jelen vannak a 3. lépés útin kapott végtermékben. Két igen jól használható gél a Sephacryl S-200 HR, amelynek frakcionálási tartománya proteinekre 5 kD-tól körülbelül 250 kD-ig terjed, és a Sephacryl S-100 HR, amelynek frakcionálási ta tománya proteinekre 1-100 kD. Más olyan géleket is használhatunk, amelyeknek a frakcionálási tartománya proteinekre 1 kD-tól 600 kD-ig terjed.

Az olyan proteinvariáns formák, amelyekben az Nte minális aminosavszekvenciák különböznek, hidroxilajatit-kromatográfia használatával választhatók el. Bár egy protein - akár monomer, akár oligomer - tisztítható de megtartja azon variánsainak megfelelő heterogenitá iát, amelyekből egy vagy több N-terminális aminosav hiányzik. Ezek a variánsok hidroxil-apatit-kromatográfinval választhatók el. Annak érdekében, hogy megvalósí¹ suk ezeket az elválasztásokat, több változatot vizsgálta nk meg kísérletileg. Először a kioldáshoz szükséges foszfátkoncentrációt és a foszfátkoncentráció-gradienst vizsgáltuk. A másodsorban vizsgálandó változók a következők voltak: az oszlop hossza, a proteinfelvitel, pH, ebktromos vezetőképesség és a kétértékű kationok alacsony szintjei. A kissé megváltoztatott feltételek mellett végzett újbóli kromatografálás, úgy tűnik, javította a variáns formák kihozatalát és tisztaságát.

Az alábbi példák csupán a szemléltetést szolgálják, semmiképp sem korlátozzák a találmány oltalmi körét.

1. példa

Humán IL-10 tisztítása CHO sejtvonal-tenyésztő táptalajból

Kínaihörcsögpetefészek- (Chinese Hamster Ovary=CHO) sejteket IL-10 gént tartalmazó vektorral transzfektálunk, és a sejteket Iscove által módosított Dulbecco-féle (IMDM) alaptáptalajban tenyésztjük, amely sókat, puffereket, vitaminokat, aminosavakat és glükózt tartalmaz (Sigma, St. Louis, Missouri), kiegészítve 5% NU-SERUM V-vel [táptalaj-kiegészítő, amely 25% újszülöttborjú-szérumot, hormonokat, növekedési faktorokat és más tápanyagokat (Collaborative

HU 218 263 Β

Research) tartalmaz] és HBCHO-val [szérummentes kiegészítő, amely marhaszérum-albumint, inzulint, transzferrint, fetuint, zsírsavakat, etanol-amint és szeléniumot (Irvine Scientific) tartalmaz]. A transzfektált CHO-sejteket a sejttenyésztő táptalajban (pH 7,2) 37 °C-on tenyésztjük. Ötnapos növekedés után összesen 177 liter tenyészet-felülúszót veszünk le, amelyet „crossflow” mikroszűrőn szűrtünk át, és ultraszűréssel körülbelül 17,6 literre koncentrálunk. A CHO sejttenyészet felülúszóját ezután 20 mM MES (2-morfolinoetánszulfonsav) és 65 mM nátrium-klorid-tartalmú oldattal (pH 4,0) diaszűrjük. A kapott felülúszó folyadékot ezután kromatográfiás eljárásokkal tisztítjuk. A kromatografálásokat 4 °C-on végezzük.

Kationcserés kromatográfia

A koncentrált, diaszűrt CHO sejtfelülúszó-koncentrátumot egy 5 χ 28 cm-es S-Sepharose Fást Flow oszlopra visszük fel, amelyet 20 mM MES és 70 mM nátrium-klorid-tartalmú oldattal (pH 6,5) hoztunk egyensúlyba. Agytérfogat ml-enként körülbelül 100 mg proteint viszünk az oszlopra 1,1 cm/perc átfolyási sebesség mellett. Az oszlopot 8,5 ágytérfogatnyi kiegyensúlyozó pufferrel mossuk. Ezután következik az elúció 13 ágytérfogatnak megfelelő mennyiségű 70-300 mM nátrium-klorid-gradienssel, kisebb, azaz 0,6 cm/perc átfolyási sebesség mellett. Az IL-10 különálló A₂₈₀ csúcsként eluálódik körülbelül 17 mS-nél, amely körülbelül 150 mM nátrium-kloridnak felel meg, és ez a 16-20 mS között leoldódó protein nagyobb részét képviseli. A hIL- 10-tartalmú frakciókat koncentráljuk, és Puffer A-val (20 mM trisz-Cl és 20 mM nátriumklorid; pH 8,1) diaszűrjük (PELLICON, 10K. membrán). Az S-Sepharose használatával végzett kationcserés kromatográfia jó adszorpciót eredményez, ezért ezt választottuk első tisztítási lépésként. A fent leírt feltételek mellett a szennyező proteinek 80-90%-a nem kötődik meg. Bár a kiindulási protein 1%-a hIL-10, mégis ez a 16-20 mS között leoldódó protein nagy része, és a tisztulás 50-szeres. Lásd alább az 1. táblázatot. A pH, vezetőképesség, átfolyási sebességek és az oszlopméretek optimális feltételeit úgy határoztuk meg, hogy számos kromatografálásnál értékeltük a 280 és 260 nm-en mért UV-abszorpciót, proteinkoncentrációt, az ELISAval kapott értékeket, az SDS-PAGE és Westem-blot eredményeket.

Anioncserés kromatográfia

A kationcserés kromatográfiás lépésben kapott, koncentrált, diaszűrt, IL-10-tartalmú frakciókat egy 5x13 cm-es, előzőleg Puffer A-val kiegyensúlyozott Q-Sepharose Fást Flow oszlopra visszük fel. A felvitt protein mennyisége 0,5 cm/perc átfolyási sebesség mellett 1 ml ágytérfogatra számítva körülbelül 3,5 mg. Az oszlopot ezután Puffer A-val addig mossuk, amíg A₂₈₀nál az abszorpció minimális nem lesz. A Q-Sepharosehoz nem adszorbeálódott protein tartalmazza az IL-10et, és ezt az oldatot egyesítjük a hidroxil-apatitra való közvetlen felvitelhez.

A humán IL- 10-nek kicsi az affinitása a különböző anioncserélő oszlopokhoz. Ezekhez minimális kötődést mutat pH 8,1-ig és 4 mS-nél kisebb vezetőképességeknél. Ez teszi lehetővé a Q-Sepharose kromatográfia áteresztéses módját, amikor is a hIL-10 közvetlenül átfoly k az oszlopon, míg a legtöbb szennyező protein adsz jrbeálódik, ha a protein mg/ml ágytérfogat értékét 4 alatt tartjuk. Minthogy a hidroxil-apatit-kromatográfi; előtt a Q-Sepharose-t pufferrel nem állítjuk be, a két oszlopot tandem kapcsolhatjuk egymáshoz olyan módon, hogy a Q-Sepharose oszlopról lejövő folyadék közvetlenül a hidroxil-apatit-oszlopra kerüljön. Hdroxil-apatit-kromatográfia

A Q-Sepharose oszlopról kapott IL-10-tartalmú frakciókat egy 2,6x26 cm-es hidroxil-apatit-oszlopra visszük rá. Az oszlopot előzőleg Puffer A-val hozzuk egyensúlyba, hogy elválasszuk az IL-10 dimereket, amelyek jelen vannak a frakciókban. A Pentax által gyártott és az American International Chemical Inc. álta forgalmazott kerámia hidroxil-apatitot használjuk hidroxil-apatit gyanánt. A kerámia hidroxil-apatitot úgy készítik, hogy a hidroxil-apatit-kristályokat szemcsékké olvasztják, azaz zsugorítják. A standard, azaz nem zsugorított hidroxil-apatit (Biorad) szintén elfogadhító. A proteinfelvitel körülbelül 2,5 mg/ml ágytérfog£t 0,6 cm/perc átfolyási sebesség mellett. Az oszlopot 9+% Puffer A és 6% Puffer B keverékének 5 ágytérfogc tnyi mennyiségével mossuk. A Puffer B 150 mM k;lium-foszfát-oldat (pH 8,0). Az IL-10-et 6%-75% Puffer B lineáris gradiensével eluáljuk. A Δ0:Δ0 dimer körülbelül 20-25% Puffer B koncentrációnál oldódik le A Δ0:Δ2 és Δ2: Δ2 dimerek körülbelül 30-35% Puffer B koncentrációnál oldódnak le.

G ílszűréses kromatográfia

A Δ0: Δ0 IL -10 dimert tartalmazó, külön bekoncentrált (mintegy 20 mg/ml-ig) hidroxil-apatit-részleteket vt.gy Sephacryl S-200 HR vagy Sephacryl S-100 HR oszlopra (2,6 χ 85 cm) visszük. Az oszlopot Puffer C-vel (összetétele: 20 mM trisz-Cl, 150 mM nátrium-klorid; pH 8,1) hozzuk egyensúlyba és oldjuk ki. A felvitt minta térfogata az ágytérfogat kevesebb mint 4%-a, az átfolyási sebesség 0,1 cm/perc. A csúcs-frakciókat egyesítjük, és -20 °C-on tároljuk.

Mind a Sephacryl S-200 HR, mind a Sephacryl S-100 HR oszlopon végzett gélszűréses kromatográfia alapján megállapítható, hogy a hIL-10 molekulatömege dimer formának felel meg. Minden felvitt proteinkoncentrációnál (0,2-20 mg/ml ágytérfogat) az uralkodó forma a Δ0: Δ0 dimer. Egy A₂₈₀ profilnál kis mennyiségű IL-10 monomer (< 5%) látható elhúzódó vállkent, de ezeket a frakciókat kizárjuk a sorozatból.

A teljes tisztítási eljárás sejttenyésztő táptalaj literenként körülbelül 1,1 mg legalább 98%-os tisztaságú Δϋ:Δ0 humán IL- 10-et eredményez. A tisztaságot nátri am-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) határozzuk meg [U. K. Laemmli; Natúré, 227, 680 (1970)]. A HPLC-kromatográfia akár reverz fázisú (C₄), akár méretkizárásos ZORBEX 250 - csak egy csúcsot mutat. Az egyes tisztítási lépések eredményességét a következő táblázatban mutatjuk bt\ A táblázatban három, körülbelül 175 literes CHO sejtfelülúszó (5% NU-Serum-tartalommal) tisztítási eljárásánál kapott eredmények átlaga szerepel.

HU 218 263 Β

1. táblázat

CHO-eredetű hIL-10 tisztítása

Tisztítási lépés	Abszorpció (A₂₈o cgys.)	Összprotein (ng)	hIL -10’ (mg)	Kihozatal³ (%)	Tisztaság^b (%)
Sejttenyészet	55,000	57,00C	600	100	Li
S-Sepharose	680	890	430	72	48
Q-Sepharose	190	360	290	48	81
Hidroxil-apatit	130	200	210	35	92
Sephacryl S-200	73	180	200	33	98

^aA hIL-10 koncentrációját cs kihozatalát ELISA assayvel mértük.

^bA sejttcnyészet-koncentrátum, S-Sepharosc pool és Q-Sepharose pool tisztaságot a következőképpen határozzuk meg:

hIL-10 mg (ELISA-mcghatározás)/összprotein mg (Bradford assayvel meghatározva, lásd előbb) x 100. A hidroxil-apatit pool és a Sephacryl S-200 pool tisztaságát SDS-PAGE rendszerben határozzuk meg úgy, hogy összehasonlítjuk változó proteinmennyiségek mellett a sávok intenzitását. Ennél a technikánál a minták ismert mennyiségét - 0,005-25 pg tartományban - futtatjuk az SDS-PAGE gél különböző sávpályáin.

2. példa

E. coli eredetű hIL-10 tisztítása

Escherichia colit (E. coli) transzformálunk rekombináns humán interleukin-10-et (rhuIL-10) kódoló és kifejező gént tartalmazó expressziós plazmiddal. A plazmid az erős hibrid tac promotert hordozza az rhuIL-10 transzkripciója számára [S. M. Zurawski et al., J. Immunoi., 137, 3354-3360 (1986)]. Az lpp 3’-kódoló és nem kódoló szakaszok, beleértve a transzkripcióterminátort, az rhuIL—10 kódoló szakaszától 3’-irányban helyezkednek el. Az a vélemény, hogy az lpp gén ezen szakasza - amely a pINIIIompA-ból származik - az ettől 5’-felé eső mRNS-nek stabilitást kölcsönöz [J. Ghrayeb, et al., EMBO J., 3, 2437-2442 (1984)]. A plazmid egy pVU208-ból - amely a pCloDF 13-ból származó kontroll mutáns másolat [M. J. J. Hakkart, et al., 183, 326-332 (1981)] - származó, hővel indukálható replikációs origót tartalmaz. Közölték, hogy megemelt hőmérsékleten, például 42 °C-on ha egy másik plazmid hordozza ezt a replikációs origót, e plazmid másolatszáma kromoszómaekvivalensenként körülbelül 30 másolatról sok száz másolatig nő meg [P. M. Andreoli, et al., J. Bacteriol., 135, 612-621 (1987)]. A plazmid a pBR322 eredetű tetraciklinrezisztencia-gént hordozza a plazmid fenntartása érdekében [J. G. Sutcliffe, C. S. H. Symp. Quant. Bioi., 43, 77-90 (1978)]. Az expressziós szerkezet olyan rhuIL-10-et eredményez, amely intracellulárisan oldhatatlan zárványtestek formájában termelődik. A transzformált E. colit agarlemezre szélesztjük (a táptalaj literenként 20 g Tryptont, 10 g élesztőkivonatot, 5 g nátrium-kloridot és 10 mg tetraciklint tartalmaz). Az agarlemezről egyetlen, jól izolált telepet szúrunk ki találomra, és ezt egy második agarlemezre szélesztjük.

Ezután sejt törzsbankot létesítünk úgy, hogy az újból szélesztett agarlemezről két telepet 1 ml LYM-1 táptalajban szuszpendálunk. A LYM-1 táptalaj literenkénti összetétele a következő: 30 g Casamino acids, 20 g élesztőkivonat, 5 g kálium-dihidrogén-foszfát, 20 g glicerin, 1 g magnézium-szulfát (pH 7). Ezután egy terelőlapáttal ellátott 300 ml-es lombikot, amely 10 mg/liter tetraciklinnel kiegészített 100 ml LYM-1 táptalajt (LYM-l/Tcl0) tartalmaz, beoltunk az 1 ml szuszpenzióval, majd a lombikot 30 °C-on inkubáljuk, és rázógépen rázzuk 300 fordulat/perc mellett, amíg a sejtsűrűség el nem éri a körülbelül 400 Klett₅₄₀ értéket (korai lóg fázis). A tenyészetet ezután 1:1 arányban 40%-os glicerinnel (térfogat/térfogat) keverjük össze, és így a glicerin végső koncentrációja 20% lesz. Ezután 1 ml aliquot mennyiségeket osztunk el előzőleg megjelölt kriofioláeba, amelyeket folyékony nitrogénben gyorsan lefagyasztunk. A fiolákat felhasználásig -80 °C-os hűtőben tá Oljuk.

Ezután sejt munkabankot hozunk létre úgy, hogy a sejt törzsbankból 1 fiolát felolvasztunk szobahőmérséklet levegőn, ezzel egy 100 ml LYM-1/Te 10 táptalajt tartalmazó, keverőlapáttal ellátott 300 ml-es lombikot okunk be, majd a lombikot 30 °C-on inkubáljuk, és rotációs rázógépen 300 ford/perc mellett rázzuk, amíg a tenyészet el nem éri a körülbelül 400 Klett értéket (korai lóg fázis). A tenyészetet ezután 1:1 arányban glicerinnel keverjük össze, majd előzőleg megjelölt kriofiolákba osztjuk szét 1 ml aliquot mennyiségekben. A fiolákat folyékony nitrogénben való gyors lefagyasztás után -80 °C-os hűtőben tároljuk.

A munka törzsszuszpenzióból egy 1,5 ml lefagyasztott fiolát szobahőmérsékleten felolvasztunk. Körülbelül 0.5 ml munka törzsszuszpenzióval oltunk be egy 2000 ml-es lombikot, amely 500 ml LYM-l/tcl0 táptalajt tartalmaz. A tetraciklint közvetlenül a beoltás előtt adjuk a táptalajhoz. A lombikot rotációs rázógépre helyezzük, és 30 °C-on 300 fordulat/perc mellett rázzuk. Klett₅₄₀ meghatározáshoz 6,5-7 óra múlva veszünk mintát a lombikból. A tenyészet Klett₅₄₀ értéke 200-300. A 2000 ml-es lombik tartalmával egy 1000 literes fermentort oltunk be, amely 800 liter LYM- 1/TclO táptalajt tartalmaz. A LYM-l/Tcl0 táptalaj összetétele literenként: 30 g Casein Digest-HyCase P (Sheffield), 20 g élesztőkivonat Type D (Bio Springer), 15 g káliumdihidrogén-foszfát (Monsanto), 0,5 ml 30%-os SAG4 T szuszpenzió (Union Carbid), 20 g 99,7%-os glicerin (Univar), 1 g magnézium-szulfát-víz (1/7) (PQ), 10 mg tetraciklin (Sigma), 2 ml vas-citrát törzsoldat [összetétele literenként: 2 ml kénsav, 15 g nátrium-citrát, 13,5 g

HU 218 263 Β vas(III)-klorid-víz (1/6)]. A táptalaj pH-ját 7-re állítjuk be 50%-os nátrium-hidroxid-oldattal és 75%-os foszforsavval. A beoltott táptalaj hőmérsékletét a fermentoron belül 3O±O,5 °C-on tartjuk, amíg az 1000+100 Klett₅₄₀egységet el nem ér, ezután a hőmérsékletet 38+0,5 °C-ra emeljük, és ezen a hőmérsékleten tartjuk 14 órán át. A fermentorban az oldott oxigén koncentrációját keveréssel 40% telítettség felett tartjuk.

A hőmérséklet 38 °C-ra való emelése után 14 órával állítjuk le a fermentálást úgy, hogy csökkentjük a keverést, és a táptalajt 5-15 °C-ra hűtjük. A sarzsot egy fékezett (contained) CSA-16 folyamatos szeparátorcentrifugát alkalmazva centrifugáljuk, hozzávetőleg 5-10 liter/perc ráfolyatási sebesség mellett. A tápfolyadék sebességét úgy állítjuk be, hogy átlátszó centrifugált anyagot kapjunk. Egy teljes szeparálást és egy részleges szeparálást [a kosár-idő (bowl time) 0,95 másodpercre való beállításával] végzünk, hogy 800 liter fermentlevet nyerjünk. A centrifugálási lépésben 40+2 kg sejtüledéket kapunk.

A centrifugálási lépésben kapott 40 kg sejtüledéket Gaulin M12 homogenizátorral homogenizáljuk, egyformán 476,35-544,4 atm (7000-8000 psi) üzemi nyomást alkalmazva a 6 passzázsnál. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy a sarzsot recirkuláltatjuk a tárolótankból a homogenizátoron és egy glikollal hűtött hőcserélőn keresztül vissza a tárolótankba, 10 liter/perc átfolyási sebesség mellett, hozzávetőleg 140 percig. A 140 percig tartó homogenizálás után mintát veszünk a homogenizált anyagból, és a mintát fáziskontraszt-mikroszkópon megvizsgáljuk. E vizsgálattal állapítjuk meg, hogy a sejtek mennyire zúzódtak össze. Ha - mikroszkópos kiértékeléssel becsülve - 95%-nál nagyobb mennyiségben nem zúzódtak a sejtek, akkor a homogenizálást folytatni kell.

A homogenizált sejtek inaktiválása céljából a homogenizátumot azonos térfogatú 4 M quanidinpufferrel [összetétele literenként: 6,05 g trisz(hidroxi-metil)-amino-metán (Sigma), 1,90 g dinátrium-EDTA-dihidrát (Sigma), 58,4 g nátrium-klorid (USP; Mallinckrodt), 382 g quanidin.HCl (Sigma)] keverjük össze. A reszuszpendálást 30 percen keresztül végezzük 10-15 °C hőmérsékleten, lassú rázás mellett. Az inaktivált, reszuszpendált anyagot ezután egy Sharples AS26SP centrifugán 17 000 fordulat/perc mellett centrifugáljuk 500 ml/perc átfolyási sebességgel. Az ebben a lépésben kapott zárványtesteket tartalmazó üledéket -10 °C-ra fagyasztjuk le. A zárványtestek olyan aggregátumok, amelyek a hIL-10 mellett az E. coli gazdasejtből származó különböző proteineket, nukleinsavakat és más sejttörmelékeket is tartalmazzák.

Az IL-10 kigombolyítása

A -10 °C-on tárolt zárványtestüledéket három napig 2-10 °C hőmérsékletű hideg szobában olvasztjuk fel. Az üledéket feltörjük, és hozzáadjuk 20 liter kigombolyítópufferhez. A kigombolyítópuffer összetétele a következő: 50 mM TRIZMA [trisz(hidroxi-metil)amino-metán], 7 M quanidin.HCl, 4 mM ditiotreitol (DTT); pH 8,5. A zárványtestüledéket Polytron homogenizátorral erős rázással homogenizáljuk, hogy finom szuszpenziót kapjunk. A szuszpenziót ezután a további oldás érdekében közel 3 órán át 2-10 °C-on lassan rázítjuk.

A: IL-10 újbólifelgombolyítása

Az oldható proteinoldatot ezután mintegy 25-szörösére hígítjuk a visszagombolyító pufferben. A visszagombolyító puffer összetétele a következő: 50 mM TRIZMA, 0,12 M quanidin.HCl, 0,05 mM glutation (redukált); pH 8,5. A felhígított visszagombolyító oldatot haladék nélkül szűréssel derítjük; a szűrlethez ezután oxidált glutationoldatot adunk 0,45 mM végső koncentrációig, és a visszagombolyítást 10-24 órán át folytatjuk. K mcentróilás/diaszürés

A visszagombolyítási lépés végén az oldatot - ultraszűrés előtt - szűréssel derítjük, 0,45 pm-os szűrőt használva. Az ultraszűrőhöz további szűrőt helyezhetünk, hogy biztosítsuk az oldat tisztaságát az ultraszűrés alatt. A visszagombolyodott IL- 10-et tartalmazó oldatot ezután körülbelül tizedére koncentráljuk. A koncentrálást ultraszűrőrendszerben végezzük, 10 000 névleges molekulatömegnek megfelelő PLGC membránokkal ellátott Millipore PELLICON ultraszűrőberendezés használatával. A koncentrátumot ezután diaszűrjük, hogy a koncentrátum vezetőképességét 6 mS-re csökkentsük. A diaszűrő puffer 20 mM trisz-t és 20 mM natrium-kloridot (pH 8,5) tartalmaz.

K itioncserés kromatográfia

A visszagombolyodott hIL - 10-et tartalmazó koncentrált oldatot 20 mM bisz-trisz (pH 6,5) tartalomra állítjuk be 1 M bisz-trisz és 4 M sósavoldat hozzáadásával. Az oldatot ezután szűréssel derítjük. Az oldatot, amely mlenként körülbelül 1,2 mg proteint tartalmaz, 1 cm/perc sebességgel felvisszük egy 12 literes (12x36 cm átmérőjű) S Sepharose Fást Flow szulfonát oszlopra (Pharmacia, P:scataway, N. J.). Az oszlopot előzőleg 10 ágytérfogat 20 mM bisz-trisz és 0,065 M nátrium-klorid-tartalmú pufferrel (pH 6,5) hozzuk egyensúlyba 1 cm/perc sebesség mellett. A kioldást 20 oszloptérfogat-gradienssel végezzük, 0,065-0,4 M nátrium-klorid 20 mM bisz-trisz (pH 6.5) gradiensben, 0,5 cm/perc átfolyási sebesség használatával. Az elúciós profil hIL-10 csúcsfrakcióit A₂₈₀ leolvasással határozzuk meg, és a jellemző pH- és vezetőképesség-tartományokkal ellenőrizzük. A hIL-10-et tartalmazó frakciók 11-18 mS-nél, 100-170 mM nátriumki orid-koncentrációnál oldódnak le, és ezeket a frakciókat a további feldolgozáshoz egyesítjük.

A lioncserés kromatográfia

A kationcserés kromatográfiás eljárással kapott h)L-10-et tartalmazó egyesített frakciókat ultraszűrórendszerben 0,5 oszloptérfogatra koncentráljuk 10 000 névleges mokekulatömegnek megfelelő PLGC membránokkal ellátott Millipore PELLICON ultraszűrcvel. A koncentrátumot ezután 10 mM trisz puffért (pH 8,7) használva, körülbelül 1,5 mS-re diaszűrjük. A diaszűrt koncentrátum pH-ját 8,7-re állítjuk be nátri rm-hidroxiddal vagy sósavval. Az oldatot, amely mlenként körülbelül 13 mg proteint tartalmaz, 0,5 cm/perc átfolyási sebességgel egy 6 literes (18x23,5 cm átmérőjű) kvatemer ammónium Q-Sepharose Fást Flow (Pharmacia) oszlopra visszük fel, amelyet előzőleg egy 10 mM trisz-t és 8 mM nátrium-kloridot tartalmazó puf8

HU 218 263 Β ferrel (pH 8,7) hozunk egyensúlyba. A frakciókban lévő szennyezésekkel szemben a hIL-10-et különbözőképpen adszorbeálja a gyanta, így az izokratikus elúció révén a hIL-10 a szennyezésektől elválik, és összegyűlik az oszlopról elfolyó 10 mM trisz 8 mM nátrium-klorid-tartalmú pufferban (pH 8,7). Az acetilezett homodimerek és acetilezett heterodimerek erősebben adszorbeálódnak a gyantához, és ezeket a gyanta elválasztja az acetilezetlen homodimerektől. Az elúciós profil nem acetilezett hIL-10 csúcsfrakcióit - A₂₈₀ leolvasással meghatározva - egyesítjük a további feldolgozáshoz.

Hidroxil-apatit-kromatográfia

Az anioncserés kromatográfiás lépésben kapott hIL- 10-tartalmú poolt egy 4 literes (26 χ 14 cm átmérőjű) hidroxil-apatit-oszlopra (például: Ceramic Hydroxylapatite, Biorad, MACROPREP) visszük fel, amelyet előzőleg 20 mM trisz, 20 mM nátrium-kloridtartalmú pufferrel (pH 7,4) hoztunk egyensúlyba. Az oszlop mosását úgy végezzük, hogy a 20 mM trisz puffer mennyiségét 100%-ról 95%-ra csökkentjük, és körülbelül 4 oszloptérfogatnál megnöveljük a 0,15 M nátrium-foszfát-puffer (pH 7,4) szintet 0%-ról 5%-ra. Az elúciót úgy végezzük, hogy növeljük a foszfát-puffer százalékát, amikor is 17 oszloptérfogat alatt 5%-ról 100%-ig terjedő elúciós gradienst alkalmazunk. A nem kovalens kötésű dimer 7-10 mS-nél oldódik le, míg a kovalens kötésű dimer csúcsa 12 mS-nél alakul ki.

A hIL-10 csúcsfrakciókat - A_28O leolvasással meghatározva - egyesítjük a további feldolgozáshoz.

G élszűréses kromatográfia

A hidroxil-apatit-kromatográfiás lépésben kapott poolt, amely az acetilezetlen, nemkovalens kötésű IL -10 dimert tartalmazza, olyan ultraszűrőrendszerben koncentráljuk, amely 10 000 névleges molekulatömeghez megfelelő membránt tartalmaz. A koncentrátumot egy 14,8 literes, előzőleg 10 mM trisz-pufferrel (pH

7,4) kiegyensúlyozott Sephacryl S-200 HR gélszűrő oszlopra (96x14 cm átmérő) visszük. Az oszlopot 10 mM trisz-pufferrel (pH 7,4) eluáljuk. Az elúciós profil hIL-10 csúcsfrakcióit - A₂₈₀ leolvasással meghatározva - egyesítjük a további feldolgozáshoz. A gélszű15 réssel kapott poolt 0,2 pm-es szűrőn szűrjük. A szűrleter, azaz az utolsó tisztítási lépésen átment anyagot egy tételben -20 °C-on tároljuk.

Akár Sephacryl S-200 HR, akár Sephacryl S -100 HR használatával végezzük a gélszűréses kro20 matográfiát, kimutatható, hogy a hIL-10 molekulatömege dimer formának felel meg. Minden felvitt proteinkoncentrációnál (0,2-20 mg/ml ágytérfogat) a nem acetilezett, nem kovalens kötésű dimer forma van túlsúlyban. Az A_28O profilnál nagy ritkán kis mennyiségű (<: 5%) hIL -10 monomer látható elhúzódó vállként, és e?eket a frakciókat kizárjuk a poolból.

Az egyes tisztítási lépések eredményességét a 2. táblázatban mutatjuk be.

2. táblázat

E. coli által kifejezett hIL-10 tisztítása

Tisztítási lépés	Abszorpció (A₂₈₀ cgys.)	Összprotein (ing)	hlL-10³ (mg)	Kihozatal³ (%)	Tisztaság³ (%)
Visszagombolyítva^b	183 000	161 000	44 800	100	45
S-Sepharose	21 700	42 000	28 900	65	81
Q-Sepharose	6 860	18 900	17 300	39	99
Hidroxil-apatit	5 670	16 500	13 700	31	99
Sephacryl S-200	4 950	14 400	12 000	27	99

³ A hIL-10 koncentrációját, kihozatalát cs tisztaságát reverz fázisú HPLC analízis alapján állapítottuk meg. ^b Koncentrálás, diaszűrés és pH beállítás után.

3. példa

A visszagombolyított humán IL-10 hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatografálása

A visszagombolyított IL-10 diaszűrése helyett a következő eljárást alkalmazhatjuk alternatív megoldásként a visszagombolyító és denaturálópufferek eltávolítására. Az E. coliban kifejeződött humán IL-10-et tartalmazó zárványtesteket kigombolyítópufferben reszuszpendáljuk. A puffer-zárványtest arány 10:1 (térfogat/tömeg). A kigombolyítópuffer összetétele: 6 M quanidinhidroklorid (GdnHCl), 4 mM ditiotreitol (DTT), 50 mM trisz, pH 8,5, 1 mM etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA) és 1 mM fenil-metánszulfonil-fluorid (PMSF). A zárványtesteket tartalmazó puffért keverés mellett 3 órán át 4 °C-on inkubáljuk, és ennek eredményeként kigombolyodott, denaturált IL- 10-et kapunk.

A kigombolyodott, denaturált IL- 10-et százszorosára hígítjuk a visszagombolyító pufferrel, amely 50 mM tr szt (pH 8,5), 1 mM EDTA-t, 0,5 M (végső koncentráció) GdnHCl-t, 4,17 mM redukált glutationt, 0,83 mM oxidált glutationt és 2 mM benzamidint tartalmaz, és ezután 17 órán át 4 °C-on inkubáljuk.

A visszagombolyítás után az oldatot 0,45 pm-os S2Ürőn szűrjük. A szűrlet ammónium-szulfát-koncentrációját 25%-ra állítjuk be, majd újból szűrjük. A szűrletet egy előzőleg 25%-os ammónium-szulfát- és 20 mM tr sz (pH 8,5) tartalmú oldattal kiegyensúlyozott ButylT iyopearl 650 M Hydrophobic Interaction oszlopra (TosoHaas) visszük, amikor is 1 ml gyantához 0.25-0,5 g zárványtestet alkalmazunk, egyenletes, 1 cm/perc átfolyási sebesség mellett. Ebben a lépésben az IL-10 az oszlophoz kötődik, míg számos protein- és

HU 218 263 8 a legtöbb nem proteinszennyezés, így a visszagombolyító eljárás reagensei, mint a glutation és a GdnHCl, valamint a kis molekulatömegű szennyezések, az E. coli sejt alkotórészek stb., amelyek jellemzőek a visszagombolyító elegyekre, áthaladnak az oszlopon. A megkötött humán IL-10 ezután izokratikus elúcióval, 20 mM trisz (pH 8,5), 20-50 mM nátrium-klorid-tartalmú oldat használatával nyerhető vissza. Húsz teljes ágytérfogatnyi frakciót gyűjtünk. Az izokratikus gradiensben a humán IL-10 két ágytérfogat után kezd leoldódni. Általában 2-15 frakciót egyesítünk. A hidrofób kölcsönhatás alkalmazásával kapott pool ezután a további tisztításhoz feldolgozható.

Jóllehet a fentiekben speciális kiviteli alakokkal szemléltettük a találmányt, azonban a gyakorlott szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a találmány számos alternatív megoldással, módosítással és változtatással is kivitelezhető. Úgy gondoljuk, hogy minden ilyen alternatív megoldás, módosítás és változtatás a találmány oltalmi körébe tartozik, és a találmányt csak az igénypontok korlátozzák.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás oldatban lévő, rekombináns úton előállított humán interleukin-10 (IL—10) tisztítására, azzal jellemezve, hogy (i) az IL- 10-tartalmú oldatot kationcserélő oszlopkromatográfiának vetjük alá, és az IL -10-tartalmú frakciókat összegyűjtjük;

(ii) az (i) lépésben kapott IL-10 tartalmú frakciókat anioncserélő oszlopkromatográfiának vetjük alá, és az IL- 10-tartalmú frakciókat összegyűjtjük;

(iii) az (ii) lépésben kapott IL-10 tartalmú frakciókat hidroxil-apatit-kromatográfiának vetjük alá, és az egymástól elkülönült IL-10 dimereket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük; és kívánt esetben (iv) az (iii) lépésben kapott, egyetlen IL-10 dimert tartalmazó frakciókat gélszűréses kromatografálóoszlopon tovább tisztítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás prokarióta expressziós rendszerben termelt humán interleukin-10 tisztítására, azzal jellemezve, hogy (i) zárványtestekből denaturált és tisztítás előtt visszagombolyított IL- 10-et tartalmazó oldatot kationcserélő oszlopkromatográfiának vetjük alá, és az IL- 10-tartalmú frakciókat összegyűjtjük;

(ii) az (i) lépésben kapott IL-tartalmú frakciókat anioncserélő oszlopkromatográfiának vetjük alá, melyben izokratikus elúciót alkalmazunk egy 8,5-8,7 pH-jú és 1,0-1,5 mS vezetőképességű pufferrel;

(iii) a hidroxil-apatit-kromatográfíás oszlopot egy kálium- vagy nátrium-foszfátot tartalmazó lineáris gradiens pufferrel - pH 7,2-7,4 és a vezetőképesség 7-12 mS - eluáljuk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás eukarióta expressziós rendszerben termelt humán IL-10 tisztítására sejttenyésztő táptalajból, azzal jellemezve, hogy (i) a sejttenyészet felülúszóját kationcserélő oszlopkromatográfiának vetjük alá, és az IL-10-tartalmú frakciókat összegyűjtjük;

(ii) az (i) lépésben kapott IL-10-tartalmú frakciókat anioncserélő oszlopkromatográfiának vetjük alá, melyben az oszlopot 8,0-8,3 pH-jú és legfeljebb 4 mS vezetőképességű pufferrel eluáljuk;

(iii) a hidroxil-apatit-kromatográfíás oszlopot egy kálium- vagy nátrium-foszfátot tartalmazó lineáris gradiens pufferrel - pH 8,0-8,1 - eluáljuk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben alkalmazott kationcserélő kromatografálóoszlop hordozómátrixra kötött szulfonátcsoportokat tartalmaz.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hordozómátrix agaróz.
6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (ii) lépésben alkalmazott anioncserélő oszlop hordozómátrixra kötött kvatemer aminoet 1-csoportokat tartalmaz.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hordozómátrix agaróz.
8. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (iii) lépésben színtereit hidrc xil-apatit-oszlopot használunk.
9. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (iv) lépést is végrehajtjuk.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (iv) lépésben alkalmazott gél frakcionálási tartománya 1-600 kD.
11. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (iii) lépésben a Δ0:Δ0 IL-10 dimert gyűjtjük össze.
12. Eljárás oldatban lévő különböző IL-10 dimerek szétválasztására, ahol a különböző dimerek eltérő N-terminális aminosavszekvenciával rendelkeznek, azzal jellemezve, hogy az oldatot hidroxil-apatit-oszlopkromate gráfiának vetjük alá, melyben az oszlopot egy kálium- vagy nátrium-foszfátot tartalmazó lineáris gradiens pufferrel - pH 8,0-8,1 - eluáljuk, és az egymástól elkülönült IL-10 dimereket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oldat Δ0:Δ0 IL-10, Δ0:Δ2 IL-10 és Δ2: Δ2 IL-10 dimert tartalmaz.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezvt ’, hogy a Δ0: Δ0 IL-10 dimert gyűjtjük össze.
15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Δ0: Δ2 IL-10 dimert gyűjtjük össze.
16. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Δ2: Δ2 IL-10 dimert gyűjtjük össze.
17. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy színtereit hidroxil-apatitot használunk.
18. Eljárás oldatban lévő nem acetilezett IL-10 homodimerek acetilezett IL-10 homodimerektől és acetilezett IL-10 heterodimerektől való elválasztására, azzal jellemezve, hogy az oldatot anioncserélő kromatografiának vetjük alá, melyben izokratikus elúciót alkalmazunk egy 8,5-8,7 pH-jú és 1,0-1,5 mS vezetőképességű pufferrel.