JP2802168B2 - ヒトインターロイキン−１０の精製 - Google Patents

ヒトインターロイキン−１０の精製

Info

Publication number
JP2802168B2
JP2802168B2 JP6520030A JP52003094A JP2802168B2 JP 2802168 B2 JP2802168 B2 JP 2802168B2 JP 6520030 A JP6520030 A JP 6520030A JP 52003094 A JP52003094 A JP 52003094A JP 2802168 B2 JP2802168 B2 JP 2802168B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
buffer
fraction
column
exchange chromatography
eluting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP6520030A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH08503227A (ja
Inventor
ヴェレカンプ，ゲイリー
キャナン−カールソン，スーザン
タン，ジョン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Sharp and Dohme Corp
Original Assignee
Schering Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering Corp filed Critical Schering Corp
Publication of JPH08503227A publication Critical patent/JPH08503227A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2802168B2 publication Critical patent/JP2802168B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5428—IL-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 インターロイキン−10（IL−10）、最近発見されたリ
ンホカインは、最初はインターフェロン−γ合成の阻害
剤として述べられ、体液性種類の免疫反応の主要な仲介
体として仮定された［フィオレンチオ（Fiorentono,D.
F.）等,J,Exp.Med.170:2081（1989）及びムーア（Moor
e,K.W.）等,Science248:1230〜1234（1990）］。しばし
ば相互に排他的な２種類の免疫反応は体液性（抗体−仲
介）及び遅延型過敏症である。
これらの２種類の異なる免疫反応が２種類のヘルパー
Ｔ細胞クローン、すなわち、独特のサイトカイン分泌パ
ターンを示す、Th1及びTh2ヘルパーＴ細胞から生ずるこ
とが仮定される［ムーア，上記文献；ヴィエイラ（Viei
ra.P.）等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88巻:1172（199
1）］。マウスTh1細胞クローンはインターフェロン−γ
とIL−２とを分泌し、優先的に遅延型過敏症反応を誘導
するが、Th2細胞クローンはIL−４、IL−５及びIL−10
を分泌し、体液性反応を支持する［フィオレンチオ等，
上記文献］。Th1細胞クローンによって分泌されるイン
ターフェロン−γが試験管内でのTh2細胞クローン増殖
を阻害し、Th2細胞クローンによって分泌されるIL−10
がTh1細胞クローンによるサイトカイン分泌を阻害する
のて、免疫反応における対比が結果として生ずる可能性
がある［フィオレンチオ等，上記文献及びムーア等，上
記文献］。したがって、これらの２種類のＴ−ヘルパー
細胞は相互に阻害的であり、２種類の異なる免疫反応の
基礎を提供することができる。
IL−10はネズミＴ細胞とヒトＴ細胞の両方からクロー
ン化され、配列決定されている［ムーア等，上記文献；
ヴィエイラ等，上記文献］。両方の配列は178アミノ酸
のポリペプチドをコードする読み取り枠（open reading
frame）を18アミノ酸のＮ末端疎水性リーダー配列と共
に含み、73％のアミノ酸配列相同性を有する。
生物学的に活性なIL−10は分析用ゲル濾過によって判
定されるようにダイマーである。一般に、このダイマー
は非還元性ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動でのモノマーとしての移動に基づくと非
共有結合している。組換え体ヒトIL−10は原核発現系と
真核発現系の両方によって発現されることができる。
真核発現系によって産生された組換え体ヒトIL−10の
Ｎ末端分析は、IL−10ポリペプチドの少ない割合が最初
の２つのＮ末端アミノ酸残基欠失を有することを示唆す
る。この切頭（truncated）ポリペプチドは△2IL−10ポ
リペプチド、又は簡単には△２と呼ばれる。それ故、全
長（full−length）鎖は△０と呼ばれ、アミノ酸が欠失
していないことを示す。したがって、生物学的に活性な
真核発現（eukaryotically expressed）IL−10は３種類
の異なるダイマーとして発生することができる。第１生
物学的活性ダイマーと主要な形状は△0:△０であり、ダ
イマーの両ポリペプチドがアミノ酸の全長鎖を有するホ
モダイマーである。第2IL−10ダイマーは△0:△２であ
り、ポリペプチド鎖の１つがアミノ酸の全長鎖を有し、
第２鎖、△２が最初の２つのＮ末端アミノ酸残基欠失を
有するヘテロダイマーである。第3IL−10ダイマーは△
2:△２であり、ダイマーの両方のポリペプチド鎖が最初
の２つのＮ末端アミノ酸残基欠失を有するホモダイマー
である。したがって、IL−10を精製する方法が必要であ
り、特に、IL−10の異なるダイマーを相互から分離する
方法が必要である。
原核発現系によって発現される封入体（inclusion bo
dy）中に含まれるIL−10は変性し、再生し（refolde
d）、宿主（host）タンパク質、IL−10の修飾変異体及
びこれらの変異体のヘテロダイマーを含む汚染物から精
製しなければならない。さらに、原核系では、IL−10モ
ノマーはリシン残基の１個以上においてアセチル化され
ることができる。アセチル化モノマーが他のアセチル化
モノマーに結合する場合には、アセチル化ホモダイマー
が得られる。しかし、非アセチル化モノマーが他の非ア
セチル化モノマーに結合する場合には、非アセチル化ホ
モダイマーが得られる。アセチル化モノマーが非アセチ
ル化モノマーに結合する場合には、ヘテロダイマーが得
られる。さらに、IL−10は通常、非共有結合ホモダイマ
ーとして得られる。しかし、封入体の変性及びIL−10の
再生（refolding）中に、共有結合ホモダイマーすなわ
ち非還元性SDS−PAGE上ではダイマーとして移動する
が、還元性状条件下ではモノマーとして移動するホモダ
イマーが得られる可能性がある。これは恐らく、２つの
モノマーの間に形成される１個以上の分子間ジスルフィ
ド結合によって生ずると思われる。したがって、IL−10
を宿主タンパク質汚染物から精製して、アセチル化ホモ
ダイマー、ヘテロダイマー変異体及び共有結合ダイマー
を含まない、本質的に純粋な非共有結合ダイマーIL−10
を得ることが必要である。
可能な免疫反応仲介体としてのその役割及びインター
フェロン−γ合成の阻害剤としてのその活性を考慮する
と、IL−10は自己免疫疾患又は移植片拒絶に臨床的有用
性を有する。しかし、臨床的設定では、IL−10が他の汚
染性の宿主タンパク質及び培地（medium）タンパク質又
はポリペプチドを実質的に含まない、高度に純粋な状態
であることが非常に望ましい。したがって、これらの目
的を達成する、IL−10の精製方法の必要性がある。
発明の概要 本発明は下記工程： （ａ）IL−10を含む溶液に対してカチオン交換クロマグ
ラフィーを実施し、それによってIL−10含有画分を得る
工程と； （ｂ）工程（ａ）からのIL−10含有画分に対してアニオ
ン交換クロマトグラフィーを実施し、それによってIL−
10含有画分を得る工程と； （ｃ）工程（ｂ）からのIL−10含有画分に対してヒドロ
キシアパタイトクロマトグラフィーを実施し、それによ
ってIL−10の単独単離ダイマーを含む画分を得る工程
と； （ｄ）工程（ｃ）からのIL−10含有画分に対してゲル濾
過クロマトグラフィーを実施し、それによって高分子量
不純物も低分子量不純物も含まないIL−10含有画分を得
る工程と を含む、溶液中に含まれるIL−10を精製する方法を提供
することによって、この必要性を満たす。
IL−10のこの精製方法は、細菌発現系又は真核発現系
において発現されるIL−10に対して適用することができ
る。
本発明はさらに、ダイマー混合物を含むタンパク質画
分中に含まれる種々のIL−10ダイマーを分離する方法で
あって、該画分に対してヒドロキシアパタイトクロマト
グラフィーをダイマーが相互から分離する条件下で実施
することを含む前記方法を提供する。
本発明はさらに、その中の種々なダイマーが異なるＮ
末端アミノ線配列を有するタンパク質画分中に含まれる
タンパク質の種々なダイマーの分離方法であって、該タ
ンパク質画分に対してヒドロキシアパタイトクロマトグ
ラフィーをダイマーが相互から分離する条件下で実施す
ることを含む前記方法を提供する。
本発明はさらに、その中のタンパク質の変異体が種々
なＮ末端アミノ酸配列を有するタンパク質画分中に含ま
れるタンパク質の変異体の分離方法であって、該タンパ
ク質画分に対してヒドロキシアパタイトクロマトグラフ
ィーをタンパク質の変異体が相互から分離する条件下で
実施するこを含む前記方法を提供する。
本発明はさらになお、溶液中に含まれるIL−10のアセ
チル化ホモダイマーとIL−10のアセチル化ヘテロダイマ
ーとからIL−10の非アセチル化ホモダイマーを分離する
方法であって、該溶液に対してアニオン交換クロマトグ
ラフィーを非アセチル化ホモダイマーがIL−10のアセチ
ル化ダイマーから分離される条件下で実施することを含
む前記方法を提供する。
発明の説明 本明細書に引用する参考文献はそれらの全体において
本明細書に援用される。
本明細書で用いるかぎり、“インターロイキン−10"
又は“IL−10"はヒトIL−10（hIL−10）か又はネズミIL
−10のいずれかでありうる。ヒトIL−10は（ａ）国際出
願第PCT/US90/03554号、第WO91/00349号に対応する、19
92年７月20日出願の米国特許出願第07/917,806号に開示
されるような、成熟（すなわち、分泌リーダー配列を有
さない）hIL−10の既知配列に実質的に同じのアミノ酸
を有し、かつ（ｂ）ネイティブ（native）hIL−10に共
通である生物学的活性を有するタンパク質として定義さ
れる。
IL−10はタンパク質を分泌することができる活性化Ｔ
細胞の培養培地から得ることができる。しかし、IL−10
はIL−10ポリペプチドをコードする単離核酸を用いる組
換え体方法によって優先的に得られる。分子生物学の一
般的な方法は、例えばサムブロック（Sambrook）等，分
子クローン化（Molecular Cloning）,A Laboratory M
anual,Cold Spring Harbor Publish（ニューニョー
ク州，コールドスプリングハーバー）、第２版、1989及
びアウスベル（Ausubel）等（編集），分子生物学にお
ける現在のプロトコール（Current protocols in Molec
ular Biolog）,Green/Wiley,ニューヨーク（1987及び定
期的増刊）によって述べられている。ゲノムライブラリ
ー又はcDNAライブラリーから、適当な配列を得ることが
できる。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）方法を用いるこ
とができる。例えば、PCRプロトコール：方法及び用途
の手引き（PCR Protocol:A Guide to Methods and Appl
ications）,1990,Innsi等（編集）,Academic Press,ニ
ューヨーク州，ニューヨークを参照のこと。
ライブラリーは適当な細胞から抽出される核酸から構
成する。例えば、IL−10を生成するための組換え体方法
を開示する国際出願公開第WO91/00349号を参照のこと。
例えば、核酸に関するGen Bank及びEMBL、タンパク質に
関するPIR及びSwiss−Prot、c/oIntelligenetics（ウィ
スコンシン州，マウンテンビュー）、又はGenetics Com
puter Groups,ウィスコンシン大学バイオテクノロジー
センター（ウィスコンシン州，マディソン）（これらは
本明細書に援用される）のような、種々の配列データベ
ースに有用な遺伝子配列を見いだすことができる。
ヒトIL−10（hIL−10）をコードする配列を含むクロ
ーンはAmerican Type Culture Collection（ATCC）（メ
リーランド州，ロックビル）に受け入れ番号68191及び6
8192で寄託されている。IL−10をコードする配列を含む
他のクローンの確認は核酸ハイブリッド化によって又
は、発現ベクターを用いる場合には、コードされるタン
パク質の免疫学的検出によって行われる。寄託された配
列に基づくオリゴヌクレオチドプローブは国際出願公開
第WO91/00349号に開示される。配列の確認のために有用
なオリゴヌクレオチドプローブは、他の種の関連遺伝子
の保存領域（conserved region）から作製することもで
きる。或いは、IL−10のアミノ酸配列に基づく変性プロ
ーブ（degenerate probe）を用いることもできる。
IL−10をコードするDNAを発現させるために、種々を
発現ベクターを用いることができる。原核細胞及び真核
細胞における組換え体タンパク質の発現に用いられる通
常のベクターを用いることができる。好ましいベクター
には、Okayama等，Mol.Cell.Bio.3巻,280〜289頁（198
3）及びTakebe等，Mol.Cell.Bio.8巻,466〜472頁（198
8）によって開示されるpcDベクターがある。他のSV−40
に基づく哺乳動物発現ベクターには、Kaufmann等，Mol.
Cell.Biol.2巻,1304〜1319頁（1982）及び米国特許第4,
675,285号に開示される発現ベクターがある。これらのS
V−40に基づくベクターはCOS7サル細胞（ATCC No.CRL16
51）並びに例えばマウスＬ細胞及びCHO細胞のような、
他の哺乳動物細胞に特に有用である。
標準トランスフェクション方法を用いて、大量のポリ
ペプチドを発現させる真核細胞ラインを製造することが
できる。本発明の方法は、タンパク質が発現される細胞
上清（cell supernatant）から、真核細胞によって発現
されるIL−10の精製方法である。真核細胞ラインには、
哺乳動物、酵母及び昆虫の細胞ラインがある。典型的な
哺乳動物細胞ラインには、COS−７細胞、マウスＬ細胞
及びチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞がある。S
ambrook等の上記文献及びAusubel等の上記文献を参照の
こと。
さらに、本発明の方法は遺伝的形質転換細菌、特に大
腸菌（Ｅ．coil）によって産生されるIL−10の精製方法
を提供する。本明細書で用いるかぎり、“形質転換細
菌”なる用語は、哺乳動物タンパク質を産生するように
遺伝子操作された（genetically engineered）細菌を意
味する。このような遺伝子操作（genetically engineer
ing）は通常、細菌中への発現ベクターの導入を必然的
に伴う。この発現ベクターは自律増殖することができ、
細菌ゲノム中の遺伝子に関してタンパク質発現すること
ができる。所望のタンパク質をコードするヌクレオチド
配列が既知であるか、さもなくば入手可能であるかぎ
り、細菌発現の構築は技術上周知である。例えば、DeBo
erは米国特許第4,551,433号において細菌発現ベクター
に用いるためのプロモーターを開示し;Goeddel等は米国
特許第4,601,980号において、またRiggsは米国特許第4,
431,739号において大腸菌発現系による哺乳動物タンパ
ク質の産生を開示し;Riggsの上記文献、Ferretti等のPr
oc.Natl.Acad.Sci.83:599（1986）、Sproat等のNucleic
Acid Research,13:2959（1985）及びMullenbach等のJ.
Biol.Chem.261:719（1986）は細菌中に発現するための
合成遺伝子の構築方法を開示する。多くの細菌発現ベク
ターは商業的に及びAmerican Type Culture Collection
（ATCC）（メリーランド州，ロックビル）から入手可能
である。
本発明の方法はカチオン交換、アニオン交換、ヒドロ
キシアパタイト及びゲル濾過のクロマトグラフィーの逐
次適用を含む。高純度と最大収率とを達成するために、
４種類のクロマトグラフィー工程の各々をpH、導電率、
バッファー組成、流量及びカラム寸法に関して選択し、
最適化した。純度及び収率のこの最適化を評価するため
に用いられる分析操作はウェスタンブロット、ドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SD
S−PAGE）［Laemmli,英国,Nature,227:680（1970）］、
酵素免疫吸着測定方法（ELISA）値、280nmと260nmにお
けるUV吸光度、及びタンパク質濃度測定［Bradford,M.,
Anal.Biochem.,72:248（1976）］であった。
さらに、効果的で迅速な大規模加工と、生成物純度と
収率とに関して、クロマトグラフィー工程の順序を最適
化した。これは（１）大量取り扱い（volume handlin
g）を減ずるための第１工程（カチオン交換）中の生成
物濃縮；（２）この迅速工程の生成物を特別な加工なし
に次のカラムに直接負荷することができるような、第２
工程（アニオン交換）の流動形式；（３）第３カラム
（ヒドロキシアパタイト）上でのIL−10形の分離（reso
lution）を他の汚染タンパク質が妨害しないように、最
初の２工程中のこれらの汚染タンパク質の殆ど全ての除
去；及び（４）異なる分子量の微量汚染物とIL−10モノ
マーとの分離の他に、この後の薬剤組成物のために望ま
しいバッファー中に最終生成物IL−10が得られることを
可能にするゲル濾過クロマトグラフィーのバッファー交
換を含む。
IL−10はカチオン交換樹脂に良好に吸着するので、カ
チオン交換クロマトグラフー工程を最初に用いる。例え
ばカルボキシメチル、スルホプロピル及びスルホネート
のような、任意のカチオン交換基を用いることができ
る。セルロース、デキストラン、アガロース及びポリス
チレンをこれらに限定することなく含む、任意の固相サ
ポートにカチオン交換基を取り付けることができる。好
ましいカチオン交換基は、例えばPharmacia（ニュージ
ャーシー州，ピスカタウェイ）からのＳ−SEPHAROSE Fa
st Flow（登録商標）のような、アガロース充填サポー
トマトリックスに取り付けたスルホネートである。平衡
バッファーは7.8（IL−10のpI）より低いpHであるべき
であり、好ましくは、IL−10タンパク質に充分な正電荷
を生成するために、Ｓ−SEPHAROSEに対しては約6.5であ
るべきである。これはカチオン交換基へのIL−10タンパ
ク質の良好な接着を生ずる。
IL−10を哺乳動物細胞の培養発現系によって産生する
場合には、汚染タンパク質の80〜90％及び特に、主要な
汚染タンパク質である血清アルブミンが結合しないよう
に、条件を最適化する。負荷されるべきタンパク質の量
は、製造業者によって提供される情報に基づいて算出す
ることができる。5x28cmS−SEPHAROSE（登録商標）Fast
Flowカラムを用いて、約100mgタンパク質/mlベッドボ
リュームを1.1cm/分の流量で供給することができる。こ
の上清を負荷させた後に、カラムを段階的又は線形勾配
（linear gradient）塩溶液によって、好ましくは、Ｓ
−SEPHAROSE（登録商標）カラムに対しては70〜300mM N
aCl線形勾配によって展開させる。IL−10は、約17mSに
おけるA280の明確なピークにおいて約150mM NaClの濃度
で溶離する。理想的には、IL−10を含有する画分を濃縮
し、例えばPELLICON（登録商標）、10K膜を用いて透析
濾過する。
細菌発現系においてIL−10を封入体で産生する場合に
は、IL−10を一般に変性させ、次に再生する。次に、再
生IL−10を含む溶液を上述のようにカチオン交換樹脂に
供給する。汚染タンパク質の80〜90％が結合しないよう
に、条件を最適化する。負荷されるべきタンパク質量
は、製造業者によって提供される情報に基づいて算出す
ることができる。12x36cm S−SEPHAROSE（登録商標）Fa
st Flowカラムを用いて、約15mgタンパク質/mlベッドボ
リュームを1cm/分の流量で供給することができる。この
上清を負荷させた後に、カラムを段階的又は線形勾配塩
溶液によって、好ましくはＳ−SEPHAROSE（登録商標）
カラムに対しては65〜400mM NaCl線形勾配によって展開
させる。IL−10は、約17mSにおけるA280の明確なピーク
において約150mM NaClの濃度で溶離する。理想的には、
IL−10を含有する画分を濃縮し、例えばPELLICON（登録
商標）、10K膜を用いて透析濾過する。
カチオン交換クロマトグラフィーからのIL−10含有画
分にアニオン交換クロマトグラフィーを実施し、残留す
る宿主又は細胞培養のタンパク質汚染物を実質的に除去
する。任意のアニオン交換基を用いることができる。例
は第４級アミノエチル、混合アミン又は他の中間体塩基
若しくは弱塩基交換基である。第４級アミノエチル基が
好ましいアニオン交換基である。第４級アミノエチル基
はデキストラン、セルロース、アガロース又はアクリル
サポートマトリックスに結合することができる。好まし
くは、サポートはアガロースである。理想的なQAEアガ
ロースアニオン交換樹脂はＱ−SEPHAROSE（登録商標）
（Pharmacia,ニュージャーシー州，ピスカタウェイ）で
ある。
哺乳動物細胞培養系によって産生されるIL−10は8.0
〜8.3の最適pHではQAEアニオン交換樹脂に吸着しない。
したがって、IL−10はQAEカラムを通過し、タンパク質m
g/ベッドボリュームmlが４未満であるならば、大抵の汚
染タンパク質は吸着される。
画分に含まれるIL−10のアセチル化は、IL−10の変異
体を逆相高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）によっ
て最初に分離することによって評価することができる。
次に、完全タンパク質又はトリプシン消化フラグメント
の質量スペクトロメトリーを実施することができる。こ
の場合に、IL−10又はフラグメントがアセチル化される
場合には、スペクトル分析がアセチル基の質量に等し
い、IL−10又はそのフラグメントの質量増加を実証す
る。さらに、トリプシン消化フラグメントのＮ末端配列
分析はIL−10がアセチル化される場合に、アセチル化リ
シン基準（standard）に匹敵するピークを示す。原核系
において産生される非アセチル化IL−10は、タンパク質
含有溶液が1.0〜1.5の導電率及びpH8.7であるときに通
過するので、アニオン交換樹脂に弱く吸着する。アセチ
ル化ダイマーと汚染宿主タンパク質とはカラムに強度に
吸着する。
アニオン交換カラムから得られるIL−10含有タンパク
質画分に、この画分中に含まれる種々なダイマー形を分
離するために、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ーを実施する。これは迅速流動方法によって実施するこ
とができ、この方法ではアニオン交換カラムからの画分
が、アニオン交換カラムを出るときに、ヒドロキシアパ
タイトクロマトカラムに直接負荷されるように、アニオ
ン交換カラムをヒドロキシアパタイトカラム上に直接配
置する。
IL−10が哺乳動物細胞培養系によって産生される場合
には、ヒドロキシアパタイトカラムを約8.1のpHの標準
塩溶液によって平衡させる。このための、適当なバッフ
ァーは20mM Tris−Clと20mM NaClから構成される（pH8.
1）。IL−10含有画分をヒドロキシアパタイトカラムに
負荷させ、好ましくは、約pH8.0の150mMリン酸カリウム
バッファーの20ベッドボリュームの線形勾配によって溶
離させる。溶離は約６％濃度のKPO4バッファーによって
開始し、約75％濃度に達するまで徐々に増加する。NaPO
4も同じ濃度レベルで用いることができる。△0:△0IL−
10ダイマーは150mMKPO4バッファーの約20〜25％濃度で
溶離する。他の２種類のダイマーは150mM KPO4バッファ
ーの約30〜35％濃度で溶離する。次に、好ましくはカラ
ム長さを２倍にし、得られる画分を△0:△２と△2:△２
とが別々の画分として溶離するまで再供給することによ
って、△0:△２を△2:△２から分離することができる。
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて、IL
−10含有画分中に共に存在する種々なIL−10ダイマーを
相互から分離することができる。種々なダイマーが実際
に分離されたという事実はＮ末端アミノ酸残基配列分析
によって確認することができる。
IL−10が原核発現系において産生される場合には、切
頭ダイマーは稀である。しかし、非共有結合IL−10ダイ
マーは共有結合IL−10ダイマーから分離しなければなら
ない。これはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
によって実施される。ヒドロキシアパタイトカラムを約
7.4のpHの標準塩溶液によって平衡させる。このための
適当なバッファーは20mM Tris−Clと20mM NaClから構成
される（pH7.4）。IL−10含有画分をヒドロキシアパタ
イトカラムに負荷させ、好ましくは、pH7.4の150mMリン
酸ナトリウムバッファーの20ベッドボリュームの線形勾
配によって溶離させる。溶離は約５％濃度のNaPO4バッ
ファーによって開始し、約100％農追に達するまで徐々
に増加する。KPO4も同じ濃度レベルで用いることができ
る。非共有結合ダイマーは７〜10mSにおいて最初に溶離
し、共有結合ダイマーは約12mSにおいてピークに達す
る。
次に、ヒドロキシアパタイトカラムから得られる単離
IL−10ダイマー含有画分にゲル濾過を実施する。ゲル濾
過を用いて、IL−10モノマーを含む高分子量及び低分子
量不純物を分離する。特に有用な２種類のゲルは、タン
パク質に関して5kDa〜約250kDaの分画範囲を有するSEPH
ACRYL Ｓ−200HR（登録商標）と、タンパク質に関して
1kDa〜100kDaの分画範囲を有するSEPHACRYL Ｓ−100
（登録商標）とである。タンパク質に関して約1kDa〜60
0kDaの分画範囲を有する他のゲルも使用可能である。
Ｎ末端アミノ酸配列において異なるタンパク質の変異
体形はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用い
て分離することができる。モノマー又はオリゴマーのタ
ンパク質を精製することができるが、これらのタンパク
質は１個以上のＮ末端アミノ酸欠失変異体のためにまだ
異種混合状態に留まる。これらの変異体はヒドロキシア
パタイトクロマトグラフィーによって分離することがで
きる。これらの分離を実施するために、幾つかの実験変
数を試験する。第１変数は溶離のために必要なリン酸塩
濃度と、リン酸塩濃度の勾配である。試験すべき第２変
数はカラム長さ、タンパク質負荷、正味導電率（net co
nductivity）及び低レベルの二価カチオンである。多少
変化した条件下での再クロマトグラフィーは変異体形の
収率と純度とを改良する傾向がある。
下記実施例は本発明を限定するのではなく、説明する
ために提供するものである。
実施例１ CHO細胞ラインからのヒトIL−10の精製 培養培地 チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞をIL−10遺
伝子含有ベクターによってトランスフェクトし、25％ウ
シ新生仔血清、ホルモン成長因子及び他の栄養素を含有
する補充培地である５％NUSERUM Ｖ（登録商標）（Col
laborative Research）及びウシ血清アルブミン、イン
スリン、トランスフェリン、フェチュイン、脂肪酸、エ
タノールアミン及びセレンを含有する血清を含まない補
充培地であるHBCHO（登録商標）（Irvine Scientific）
を補充された、塩、バッファー、ビタミン、アミノ酸及
びグルコースを含有する基準培地であるイスコヴ修飾ダ
ルベッコ培地（Iscove's Modified Dulbecco's Mediu
m）（IMDM）（ミズリー州、セントルイス、Sigma）中で
増殖させた。トランスフェクトしたCHO細胞をpH7.2、37
℃の細胞培地で増殖させた。五日間の増殖後に、細胞培
養上清液の全体で177リットルを取り出し、クロスフロ
ー（crossflow）精密濾過を受けさせ、限外濾過によっ
て約17.6リットに濃縮した。次に、CHO−細胞培養上清
を20mM MES（２−［Ｎ−モルホリノ］エタノールスルホ
ン酸、65mM NaCl、pH4を用いて透析濾過を実施した。
次に、生じた上清液に下記のクロマトグラフィー操作を
実施し、これらはすべて４℃において行った。
カチオン−交換クロマトグラフィー 濃縮、透析濾過したCHO−細胞上清濃縮物を20mM ME
S、70mM NaCl pH6.5と平衡させた5x28cm Ｓ−SEPHARO
SE（登録商標）Fast Flowカラムに負荷させた。タンパ
ク質約100mg/mlベッドボリュームを1.1cm/分の流量で供
給した。このカラムを8.5ベッドボリュームの平衡バッ
ファーで洗浄した。次に、これを70〜300mMのNaCl勾配
の13ベッドボリュームによって0.6cm/分の低流量で溶離
した。hIL−10は、約150mMのNaClに対応する約17mSにお
いてA280の明確なピークで溶離し、これは、16〜20mSに
おいて溶離した主要なタンパク質であった。hIL−10を
含有する画分を濃縮し、20mM Tris−Cl、20mM NaCl、
pH8.1からなるバッファーＡで透析濾過（PELLICON（登
録商標）10K膜）した。
Ｓ−SEPHAROSE（登録商標）を用いるカチオン−交換
クロマトグラフィーは良好な吸着を生じたので、第１精
製工程として選択された。上記の条件を用いると、80−
90％の汚染タンパク質は結合しなかった。hIL−10は、
初期タンパク質の１％であったが、16〜20mSで溶離した
主要なタンパク質であり、50倍に精製されたものであっ
た。下記の表１参照。pH、導電率、流量及びカラム寸法
の最適条件は、280及び260nmにおけるUV吸光度、タンパ
ク質濃度、ELISA値、SDS−PAGE及び多くのクロマトグラ
フィーのウエスタンブロット結果を評価することによっ
て決定した。
アニオン−交換クロマトグラフィー カチオン−交換クロマトグラフィー工程から得られ
た、濃縮、透析濾過したIL−10−含有画分をバッファー
Ａと平衡させた5x13cm Ｑ−SEPHAROSE（登録商標）Fas
t Flowカラムに負荷させた。タンパク質負荷は、0.5cm
/分において約3.5mg/mlベッドボリュームであった。次
に、A280における吸光度が最小になるまで、このカラム
をバッファーＡで洗浄した。QpSEPHAROSE（登録商標）
に吸着しなかったタンパク質はhIL−10を含有してお
り、ヒドロキシアパタイトに直接負荷させるためにプー
ルした。
ヒトIL−10は種々なアニオン交換カラムに殆どアフィ
ニティーを有さず、pH8.1まで及び4mSまでの導電率にお
いて最小の結合を示した。これは、流動形式におけるＱ
−SEPHAROSE（登録商標）を可能にし、hIL−10はカラム
を直接通過し、蛋白質mg/mlベッドボリュームを４以下
に保つ場合には、大抵の汚染タンパク質が吸着した。ヒ
ドロキシアパタイトクロマトグラフィーの前に、Ｑ−SE
PHAROSE（登録商標）プールのバッファー調節はないの
で、Ｑ−SEPHAROSE（登録商標）カラムの流出液がヒド
ロキシアパタイトカラム上に直接負荷されるように、２
つのカラムは直列に（in tandem）連結させることがで
きる。
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー Ｑ−SEPHAROSE（登録商標）カラムから得られたIL−1
0含有画分を2.6x26cmヒドロキシアパタイトカラムに負
荷させ、画分に存在するIL−10ダイマーを分離させるた
めに、バッファーＡによって平衡させた。用いたヒドロ
キシアパタイトは、Pentaxで製造され、American Inte
rnational Chemical社によって販売されるセラミック
ヒドロキシアパタイトであった。セラミックヒドロキシ
アパタイトは、ヒドロキシアパタイト結晶を加熱（焼
結）して、ビーズにすることによって形成される。標準
（すなわち、非焼結）ヒドロキシアパタイト（Biorad）
もまた許容される。タンパク質負荷は、0.6cm/分の流量
において約2.5mg/mlベッドボリュームであった。このカ
ラムを94％バッファーＡと６％バッファーＢとの混合液
の５ベッドボリュームで洗浄した。バッファーＢは150m
M KPO4、pH8.0から成るものであった。IL−10は、６％
〜75％の線形勾配のバッファーＢで溶離した。△0:△０
ダイマーは、約20〜25％濃度のバッファーＢで溶離し
た。△0:△２及び△2:△２ダイマーは、約30〜35％濃度
のバッファーＢで溶離した。
ゲル濾過クロマトグラフィー △0:△0IL−10ダイマーを含有する別々の濃縮ヒドロ
キシアパタイトプール（約20mg/mlまで）をSEPHACRYL
（登録商標）Ｓ−200HR又はSEPHACRYL（登録商標）Ｓ−
100HRカラム（2.6x85cm）に負荷させ、20mM Tris−C
l、150mM Nacl,pH8.1からなるバッファーＣによって平
衡させ、溶離させた。サンプル負荷量は４％未満のベッ
ドボリュームであり、流量は0.1cm/分であった。ピーク
画分はプールし、−20℃において保存した。
SEPHACRYL（登録商標）Ｓ−200HR又はSEPHACRYL（登
録商標）Ｓ−100HRにおけるゲル濾過クロマトグラフィ
ーは、hIL−10がダイマー形と一致した分子量を示すこ
とを明らかにした。△0:△０ダイマーは、負荷した全て
のタンパク質濃度（0.2〜20mg/mlベッドボリューム）に
関する主要な形状であった。少量（＜５％）のhIL−０
モノマーは、トレーリングショルダー（trailing shold
er）としてA280プロフィルに時折見られ、これらの画分
はプールから除外された。
総精製操作によって、細胞培養培地１リットルにつき
約1.1mgの少なくとも98％純度△0:△０ヒトIL−10が得
られた。純度は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）［Laemmli、英国、
Nature、227:680（1970）］によって測定した。さら
に、逆相（C4）又はサイズ排除ZORBEX（登録商標）250
によるHPLCクロマトグラフィーは、単一ピークのみを示
した。各精製工程の実施は、次の表に示す。この結果は
各CHO細胞上清（５％Nu−Serum Ｖ含有）約175リット
ルの３精製ランからの平均値である。
実施例２ E.coliからのヒトIL−10の精製 大腸菌（E.coli）は、組換え体ヒトインターロイキン
−10（rhuIL−10）をコードし、発現させる遺伝子を含
有する発現プラスミドによって形質転換させた。このプ
ラスミドは、rhuIL−10の転写のための強ハイブリッドt
acプロモーターを有した［Zurawski、S.M.等、J.Immuno
l.137:3354〜3360（1986）］。転写ターミネーターを含
有するlpp3′コード領域及び非コード領域は、rhuIL−1
0コード領域の下流にある。pINIIIompAに由来する、lpp
遺伝子のこの領域は、この上流でmRNAに安定性を与える
と考えられる［Ghrayeb,J.等、EMBO J.、3:2437−2442
（1984）］。このプラズマは、pCloDF13に由来するコピ
ーコントロールミュータント（copy control mutant）
であるpVU208に由来する、熱誘導性の（thermoinducibl
e）複製起源を有する［Hakkart,M.J.J.等183:326〜332
（1981）］。高温（例えば42℃）において、この複製起
源を有する、種々なプラスミドに関するプラスミドコピ
ー数は、染色体当量（chromosomal equivalent）につき
約30コピーから数百コピーまで増加すると報告されてい
る［Andreoli、P.M.等、J.Bacteriol.135:612〜621（19
78）］。このプラスミドは、プラスミド維持のためにpB
R322からのテトラサイクリ耐性遺伝子を有する［Sutcli
ffe、J.G.、C.S.H.Symp.Quant.Biol.43:77〜90（197
8）］。この発現構築物は、不溶封入体としてのrhIL−1
0の細胞内産生をもたらす。形質変換させたE.coliを、2
0g/l トリプトン、10g/l 酵母エキス、5g/l NaCl及
び10mg/l テトラサイクリンを含有する寒天の上に置い
た。単一の充分に単離されたコロニーをその寒天プレー
トからランダムに採取し、第２寒天プレートに再ストリ
ークした（restreaked）。
次に、新たに再ストリークした寒天プレートからの２
つのコロニーを、30g/l カザミノ酸、20g/l 酵母エキ
ス、5g/l KPO4［一塩基度］、20g/l グリセロール、1
g/l MgSO4、pH7を含有する、LYM−１培地1mlに懸濁さ
せることによって、マスター細胞バンクを作製した。次
に、これを用いて、300mlバッフル付きフラスコ（baffl
ed flask）中の10mg/l テトラサイクリンを含有するLY
M−１ブロス［LYM−1/Tc10］100mlに接種し、次に、こ
れを30℃においてインギュベートし、細胞密度が約400
のKlett540（初期対数期）に達するまで、300回転／分
（RPM）において回転式振とう培養機を用いて振とうし
た。次に、この培養物を40％グリセロール（v/v）と1:1
で混合し、20％の最終グリセロール濃度を得た。次に、
1mlのアリコートを、予めラベルしたクライオバイアル
（cryovial）に分配し、液体窒素下で急激に冷凍し、−
80℃にセットしたフリザー中に使用するまで保存した。
次に、室温における大気中でマスター細胞バンクの１
バイアルを解凍することによってワーキング細胞バンク
（working cell bank）を作製し、これを300mlバッフル
付きフラスコ中のLYM−1/Tc1培地100mlに接種し、次
に、これを30℃においてインキュベートし、細胞密度が
約400のKlett（初期の対数期）に達するまで、300RPMに
おける回転式振とう培養機を用いて振とうした。次に、
この培養物を40％グリセロール（v/v）と1:1で混合し
た。次に、1mlのアリコートを、予めラベルしたクライ
オバイアルに分配し、液体窒素下で急激に冷凍し、−80
℃にセットしたフリザー中に保存した。
ワーキングストックの1.5ml冷凍バイアルを室温にお
いて解凍した。約0.5mlのワーキングストックを、500ml
のLYM−1/Tc10培地を含有した2000mlフラスコに移し
た。接種の直前にテトラサイクリンを加えた。このフラ
スコを回転式振とう培養機に載せ、30℃、300RPMにおい
て振とうした。6.5〜７時間後に、Klett540測定のため
にサンプルをこのフラスコから取り出した。この培養物
は、200〜300のKlett540を有した。次に、800リットル
のLYM−3/Tc10培地を含有する1000リットル発酵機に200
0mlフラスコの内容物を接種した。LYM−3/Tc10培地は、
30g/l Casein Digest−HyCass Ｐ（Sheffield）、20
g/酵母エキス−タイプＤ（Bio Springer）、15g/l リ
ン酸カリウム（一塩基度）（Monsanto）、0.5ml/l SAG
−471（登録商標）（Union Carbide）の30％懸濁液、2
0g/l グリセリン99.7％（Univar）、1g/l 硫酸マグネ
シウム7H2O（PQ）、10mg/l テトラサイクリン（Sigm
a）並びに2ml/l 硫酸、15g/l クエン酸ナトリウム、1
3.5g/l 塩化第二鉄六水和物からなる2ml/l クエン酸
鉄ストック溶液から構成される。この培地のpHを、50％
NaOH溶液と75％H3PO4溶液とによって約７に調節した。
この発酵機中の接種済み培地の温度を、Klett540が1000
±100に達するまでは30℃±0.5℃に維持し、次に温度を
14時間、38℃±0.5℃に上昇させた。発酵機中の溶解酸
素濃度は、撹拌によって40％飽和より大きいレベルに維
持した。
温度が38℃に上昇した14時間後に、撹拌を弱め、培地
を５℃〜15℃に急冷することによって、発酵を回収し
た。内蔵（contained）CSA−16連続脱スラッジ（deslud
ging）遠心機を約５〜10リットル／分（1pm）の供給流
量で用いて、このバッチを遠心分離した。透明な濃縮物
が得られるように、流量を調節した。完全な脱スラッジ
（desludge）と不完全な脱スラッジ（ボウル時間（bowl
time）0.95秒に設定）を用いて、発酵の800リットルを
回収した。この遠心分離工程では、40±2kgの細胞ペレ
ットが回収された。
遠心分離工程で回収された細胞ペレット40kgを同等の
６回パスに対して7000〜8000psiの操作圧力でGaulin M
12ホモジナイザーを用いて均質化した。バッチを保持タ
ンクからホモジナイザーとグリコール冷却熱交換器とに
通して再び保持タンクに、10 lpmの流量において約140
分間再循環させることによって、これは達成された。14
0分間の均質化後に、ホモジネートのサンプルを抽出
し、位相差顕微鏡下で検査した。これは細胞破壊を評価
するために実施した。顕微鏡評価によって見積もって、
95％を越える破壊が観察されない場合には、均質化を続
けるべきである。
このホモジネートを、6.05g/l TRIZMA−BASE（登録
商標）（トリス］［ヒドロキシメチル］アミノメタン）
（Sigma）、1.90g/lEDTA二ナトリウム塩二水和物（Sigm
a）、58.4g/l NaCl米国薬局方（Mallinckrodt）及び38
2g/l グアニジンHCl（Sigma）から成る等量の4Mグアニ
ジンバッファーと混合することによって、均質化細胞を
不活化した。緩慢に撹拌しながら、再懸濁液を10〜15℃
に30分間維持した。不活化した再懸濁液を次にSharples
AS26SP遠心機において500ml/分の流量及び17000rpmの
遠心機速度で遠心分離した。この工程で回収された封入
体含有ペレットを−10℃において冷凍した。封入体は、
hIL−10の他に、種々な大腸菌宿主タンパク質、核酸及
び他の細胞デブリ（debris）を含む凝塊（aggregate）
である。
IL−10の変性（unfolding） −10℃に保存した封入体ペレットを低温室中で２〜10
℃において３日間かけて解凍した。このぺレットを破壊
し、変性用バッファー（unfolding buffer）20リットル
中に加えた。変性用バッファーは50mM TRIZMA（登録商
標）（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン）（Si
gma）、7M グアニジンHCl及び4mM ジチオスレイトー
ル（DTT）、pH8.5から構成された。封入体ペレットをポ
リトロンホモジナイザーによって激しく撹拌して、微細
懸濁液（fine suspension）を形成した。次に、この懸
濁液を２〜10℃における約３時間の緩慢な撹拌によっ
て、さらに可溶化させた。
IL−10の再生 この溶解性タンパク質溶液を再生用バッファー（refo
lding buffer）中で約25倍に希釈した。再生用バッファ
ーは50mM TRIZMA（登録商標）、0.12M グアニジンHCl
及び0.05mM グルタチオン（還元）、pH8.5から構成さ
れた。希釈した再生用溶液は濾過によって直ちに透明に
なった；次に酸化型グルタチオン溶液を0.45mMの最終濃
度になるまで加え、再生を10〜24時間続けた。
濃縮／透析濾過 再生工程の終了時に、限外濾過の前の0.45μｍフィル
ターを用いる濾過によって溶液を再び透明にした。さら
に、フィルターを限外フィルター（ultrafilter）に直
列に配置して、限外濾過中の透明性を確実にした。次
に、再生IL−10を含む溶液を約10倍に濃縮した。これ
は、10,000公称分子量PLGC膜付き限外濾過系Millipore
PELLICON（登録商標）限外フィルターによって実施し
た。この濃縮物を次に透析濾過して、濃縮物導電率を約
6mSに低下させた。透析濾過バッファーはpH8.5、20mM
TRISと、20mM NaClとから構成された。
カチオン−交換クロマトグラフィー 濃縮した再生hIL−10含有溶液を1M BIS−TRISと4N
HClとの添加によって20mM BIS−TRIS、pH6.5に調節し
た。この溶液を次に濾過によって透明にした。タンパク
質約1.2mg/mlを含む透明化供給溶液を次に、12リットル
（12x36cm直径）Ｓ−SEPHAROSE（登録商標）Fast Flow
カラム（Pharmacia,ニュージャーシー州，ピスカタウェ
イ）に1cm/分の速度で供給した。このカラムは10ベッド
ボリュームの20mM BIS−TRIS,0.065M NaClバッファ
ー,pH6.5によって1cm/分の速度で予め平衡させたもので
あった。溶離は、0.065〜0.4M NaCl,20mM BIS−TRIS,
pH6.5バッファーの範囲内の20カラムボリューム勾配（c
olumn volume gradient）によって0.5cm/分の速度で実
施した。溶離プロフィルのhIL−10ピーク画分はA280に
よって測定し、典型的なpHと導電率の範囲によって実証
した。hIL−10含有画分は11〜18mS、100〜170mM NaCl
において溶離し、これらの画分は、その後の処理のため
に、一緒にプールした。
アニオン−交換クロマトグラフィー カチオン−交換クロマトグラフィー工程からプールし
たhIL−10含有画分を、10,000公称分子量PLGC膜付きの
限外濾過系MilliporePELLICON（登録商標）限外フィル
ターによって0.5カラムボリュームにまで濃縮した。こ
の濃縮物を次に10mM TRISバッファー,pH8.7を用いて約
1.5mSまで限外濾過した。透析した濃縮物のpHはHCl又は
NaOHによってpH8.7に調節した。約13mg/mlのタンパク質
を含む溶液を、10mM TRIS,8mM NaCl,pH8.7バッファと
予め平衡させた、６リットル（18cm直径x23.5cm）第４
級アンモニウムカラムＱ−SEPHAROSE（登録商標）Fast
Flow（Pharmacia）に0.5cm/分の流量で供給した。hIL
−10は画分中に含まれる不純物に比べて特異な、樹脂に
対する吸引力（attraction）を有して、定組成（isocra
tic）溶離時に分離され、10mM TRIS,8mM NaCl,pH8.7
バッファーによるカラム流出液中に回収された。アセチ
ル化ホモダイマーとアセチル化ヘテロダイマーとは樹脂
に強く吸着したので、非アセチル化ホモダイマーから分
離された。A280によって確認された溶離プロフィルの非
アセチル化hIL−10ピーク画分はこの後の処理のために
プールした。
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー アニオン交換クロマトグラフィー工程から得られたhI
L−10含有プールを、20mM TRIS,20mM NaCl,pH7.4バッ
ファーと予め平衡させた、４リットル（26x14cm直径）
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供給した。
４カラムボリュームに関して、20mM TRISバッファー量
を100％から95％に減少し、pH7.4,0.15Mリン酸ナトリウ
ムバッファーのレベルを０％から５％に上昇させること
によって、カラム洗浄を実施した。溶離は、17ベッドボ
リューム溶離勾配（elution gradient）中にリン酸塩バ
ッファーの割合を５％から100％に上昇させることによ
って、実施した。非共有結合ダイマーは７〜10mSにおい
て溶離し、共有結合ダイマーは12mSにおいてピークに達
した。A280によって確認されたhIL−10ピーク画分はそ
の後の処理のためにプールした。
ゲル濾過クロマトグラフィー 非アセチル化非共有結合IL−10ダイマーを含む、ヒド
ロキシアパタイトプロセス工程からのプールを10,000公
称分子量PLGC膜含有限外濾過系において濃縮した。濃縮
を、10mM TRISバッファー,pH7.4と予め平衡させた、1
4.8リットル（96cmx14cm直径）SEPHACRYL（登録商標）
Ｓ−200HRであるゲル濾過カラムに供給した。このカラ
ムを10mM TRISバッファー,pH7.4によって溶離した。A
280によって確認され溶離プロフィルのhIL−10ピーク画
分はその後の処理のためにプールした。このゲル濾過プ
ールを0.2μｍフィルターに通して濾過した。濾液、最
終精製したバルクドラッグ（bulk drug）を−20℃にお
いて保存した。
SEPHACRYL（登録商標）Ｓ−200HR又はSEPHACRYL（登
録商標）Ｓ−100HRのいずれかにおけるゲル濾過クロマ
トグラフィーは、hIL−10がダイマー形に一致する分子
量を示すことを明らかにした。非アセチル化非共有結合
ダイマーは、負荷させた全てのタンパク質濃度（0.2〜2
0mg/mlベッドボリューム）に関する主要形態であった。
少量（＜５％）のhIL−10モノマーがA260プロフィル上
にトレイリングショルダーとして時折見られ、これらの
画分はプールから除外した。
各精製工程の性能は下記表２に示す。
実施例３ 再生ヒトIL−10の疎水性相互作用クロマトグラフィー 再生IL−10の透析濾過の代替え手段として、下記操作
を用いて、再生用及び変性用バッファーを除去すること
ができる。大腸菌に発現されたヒトIL−10を含む封入体
を10:1（v/w）比の変性用バッファー対封入体中に再懸
濁させた。変性用バッファーは6Mグアニジン塩酸（GdnH
Cl）、4mM ジチオスレイトール（DTT）、50mM Tris
（pH8.5）、1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）及び1m
Mフェニルメチルスルホキシルフルオリド（PMSF）から
構成された。封入体含有バッファーを４℃において撹拌
しながら３時間インキュベートし、変性した（unfolde
d）変性ヒトIL−10を得た。
変性した変性IL−10を、50mM Tris（pH8.5）、1mM
EDTA、0.5M最終濃度のGdnHCl、4.17mM還元グルタチオ
ン、0.83mM酸化グルタチオン及び2mMベンズアミジンを
含む再生用バッファー中で100倍に希釈し、４℃におい
て17時間インキュベートした。
再生後に、混合物を0.45μｍフィルターに通して濾過
し、25％硫酸アンモニウム濃度にして、再び濾過した。
濾液をButyl−Toyopear1650M疎水性相互作用（TosoHaa
s）カラム（25％硫酸アンモニウム,20mM Tris pH8.5
に予め平衡化）に封入体0.25〜0.5g/ml樹脂の比で、1cm
/分の線形流量において供給した。この工程において、I
L−10はカラムに結合し、多くのタンパク質と、再生用
混合物の特徴である、例えば、グルタチオンとGdnHClと
のような再生プロセス試薬、低分子量汚染物、大腸菌細
胞成分フラグメント等のような非タンパク質汚染物の大
部分とはカラムを通過した。次に、結合したヒトIL−10
を20mM Tris（ph8.5）,20〜50mM NaClによって定組成
的に（isocratically）に溶離した。21ベッドボリュー
ム画分を回収した。ヒトIL−10は２ベッドボリュームを
定組成勾配（isocratic gradient）中に溶離し始めた。
一般に、画分２〜15をプールした。次に、疎水性相互作
用プールをその後の精製のためにさらに処理することが
できる。
本発明を上記特定の実施態様に関連して説明したが、
その多くの代替え、改良及び変更は当業者に明らかであ
ると思われる。このような代替え、改良及び変更の全て
は、請求の範囲によってのみ制限される、本発明の要旨
及び範囲に入るように意図される。
フロントページの続き (72)発明者 タン，ジョン アメリカ合衆国ニュージャージー州 07039，リヴィングストン，キャメロッ ト・ドライブ 19 (56)参考文献 特開 昭58−49319（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−502560（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．170 （1989）Ｐ．2081−Ｐ．2095 Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ａｎｄ Ｃｙ ｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏ ｌ．11，Ｎｏ．２（1992）Ｐ．87−Ｐ. 93 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/54 C07K 1/16 - 1/22 ＣＡ（ＳＴＮ) ＣＡＯＬＤ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】真核発現系によって産生された、２又はそ
    れを越える組換えヒトインターロイキン−10（IL−10）
    の変異体を含有する溶液内に含まれるIL−10の精製方法
    であって、 （ａ）IL−10を含む溶液に対して塩溶液で溶離するカチ
    オン交換クロマトグラフィーに付し、それによってIL−
    10含有画分を得て； （ｂ）工程（ａ）からのIL−10含有画分に対して、8.0
    〜8.3のpHを有する緩衝液で溶離するアニオン交換クロ
    マトグラフィーに付し、それによってIL−10含有画分を
    得て； （ｃ）工程（ｂ）からのIL−10含有画分に対して、異な
    るIL−10の変異体が相互に異なる画分に分離する条件下
    で、線形勾配のリン酸カリウム又はリン酸ナトリウムを
    含む緩衝液で溶離するヒドロキシアパタイトクロマトグ
    ラフィーに付し；そして （ｄ）望ましいIL−10の変異体を含有する画分を単離す
    ることを含む方法。
  2. 【請求項２】工程（ａ）の塩溶液が65〜400mMNaCl線形
    勾配を含み、工程（ｃ）の緩衝液が約６〜約75％の150m
    Mリン酸カリウム又はリン酸ナトリウム線形勾配を含
    む、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】望ましいIL−10の変異体がΔ0:Δ0 IL−10
    ダイマーである、請求項１又は２記載の方法。
  4. 【請求項４】原核発現系によって産生された、２又はそ
    れを越える組換えヒトインターロイキン−10（IL−10）
    の変異体を含有する溶液内に含まれるIL−10の精製方法
    であって、 （ａ）IL−10を含む溶液に対して塩溶液で溶離するカチ
    オン交換クロマトグラフィーに付し、それによってIL−
    10含有画分を得て； （ｂ）工程（ａ）からのIL−10含有画分に対して、8.7
    のpHを有する緩衝液で溶離するアニオン交換クロマトグ
    ラフィーに付し、それによってIL−10含有画分を得て； （ｃ）工程（ｂ）からのIL−10含有画分に対して、異な
    るIL−10の変異体が相互に異なる画分に分離する条件下
    で、線形勾配のリン酸カリウム又はリン酸ナトリウムを
    含む緩衝液で溶離するヒドロキシアパタイトクロマトグ
    ラフィイに付し；そして、 （ｄ）望ましいIL−10の変異体を含有する画分を単離す
    ることを含む方法。
  5. 【請求項５】工程（ａ）の塩溶液が65〜400mMNaCl線形
    勾配を含み、工程（ｃ）の緩衝液が約５〜約100％の150
    mMリン酸カリウム又はリン酸ナトリウム線形勾配を含
    む、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】望ましいIL−10の変異体が非アセチル化Ｌ
    −10ホモダイマーである、請求項４又は５記載の方法。
  7. 【請求項７】原核発現系によって産生されたIL−10が封
    入体から変性され、精製前に再生されたIL−10であり、
    望ましいIL−10の変異体が、非共有結合非アセチル化Ｌ
    −10ホモダイマーである、請求項４又は５記載の方法。
  8. 【請求項８】工程（ａ）のカチオン交換クロマトグラフ
    ィーカラムが、サポートマトリックスに結合したスルホ
    ネート、カルボキシメチル又はスルホプロピル交換基を
    含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】サポートマトリックスが、アガロース、セ
    ルロース、デキストラン又はポリスチレンである、請求
    項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】工程（ｂ）のアニオン交換クロマトグラ
    フィーカラムが、サポートマトリックスに結合した第４
    級アミノエチル、混合アミン又は中間若しくは弱塩基交
    換基を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】サポートマトリックスが、アガロース、
    デキストラン、セルロース又はアクリルである、請求項
    10記載の方法。
  12. 【請求項１２】工程（ａ）のカチオン交換クロマトグラ
    フィーカラムが、アガロース、セルロース、デキストラ
    ン又はポリスチレンであるサポートマトリックスに結合
    したスルホネート、カルボキシメチル又はスルホプロピ
    ル交換基を含み、そして工程（ｂ）のアニオン交換クロ
    マトグラフィーカラムが、アガロース、デキストラン、
    セルロース又はアクリルであるサポートマトリックスに
    結合した第４級アミノエチル、混合アミン又は中間若し
    くは弱塩基交換基を含む、請求項１〜７のいずれか１項
    に記載の方法。
JP6520030A 1993-03-05 1994-03-03 ヒトインターロイキン−１０の精製 Expired - Lifetime JP2802168B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/026,942 US5328989A (en) 1993-03-05 1993-03-05 Purification of human interleukin-10 from a cell culture medium
US08/026,942 1993-03-05
US26,942 1993-03-05
PCT/US1994/001909 WO1994020525A1 (en) 1993-03-05 1994-03-03 Purification of human interleukin-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH08503227A JPH08503227A (ja) 1996-04-09
JP2802168B2 true JP2802168B2 (ja) 1998-09-24

Family

ID=21834690

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP6520030A Expired - Lifetime JP2802168B2 (ja) 1993-03-05 1994-03-03 ヒトインターロイキン−１０の精製

Country Status (12)

Country Link
US (2) US5328989A (ja)
EP (1) EP0688335A1 (ja)
JP (1) JP2802168B2 (ja)
KR (1) KR0178304B1 (ja)
CN (1) CN1119018A (ja)
AU (1) AU683458B2 (ja)
CA (1) CA2157358C (ja)
FI (1) FI954047A0 (ja)
HU (1) HU218263B (ja)
IL (1) IL108837A (ja)
NZ (1) NZ263006A (ja)
WO (1) WO1994020525A1 (ja)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6106823A (en) * 1991-01-16 2000-08-22 Schering Corporation Treatment of neoplastic disease with interleukin-10
US5328989A (en) * 1993-03-05 1994-07-12 Schering-Plough Purification of human interleukin-10 from a cell culture medium
CA2144576A1 (en) * 1994-03-17 1995-09-18 Donald W. Nicholson A single step purification of recombinant human interleukin-5
US6022536A (en) * 1995-08-09 2000-02-08 Schering Corporation Combined use of interleukin 10 and cyclosporin for immunosuppression therapy
US7361331B2 (en) * 1996-10-18 2008-04-22 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Plant bioreactors
CN1326565C (zh) * 1997-10-14 2007-07-18 中外制药株式会社 淋巴细胞肿瘤抗体的增强剂
EP1141338A4 (en) * 1998-12-31 2002-09-25 Arch Dev Corp RECOMBINANT HERPES SIMPLEX VIRUS USEFUL IN THE TREATMENT OF NEOPLASTIC DISEASES
WO2001006233A1 (en) * 1999-07-16 2001-01-25 Human Genome Sciences, Inc. Real-time, in situ biomanufacturing process monitoring and control in response to ir spectroscopy
WO2001008717A1 (en) * 1999-08-03 2001-02-08 Smith & Nephew, Inc. Controlled release implantable devices
DE60039893D1 (ja) * 1999-08-23 2008-09-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd
WO2002064159A1 (en) * 2001-02-07 2002-08-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remedies for tumor in hematopoietic organs
US20050152902A1 (en) * 2001-06-05 2005-07-14 Advanced Biotherapy, Inc. Treatment of diabetic retinopathy
SI2261230T1 (sl) * 2002-09-11 2017-08-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Postopek čiščenja proteinov
US20050276807A1 (en) * 2004-06-15 2005-12-15 Advanced Biotherapy, Inc. Treatment of acne
EP2768844B1 (en) * 2011-10-21 2016-04-27 Tanvex Biologics Corp. Separation of acetylated proteins from unacetylated proteins
US20140228539A1 (en) * 2011-10-21 2014-08-14 Tanvex Biologics Corp. Separation of acetylated proteins from unacetylated proteins
CN103360461B (zh) * 2012-03-31 2016-12-14 中国科学技术大学 一种人il-12亲和纯化层析柱、其制备方法及利用其纯化重组人il-12的方法
CA2908198A1 (en) 2013-04-18 2014-10-23 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
US9823255B2 (en) 2013-06-17 2017-11-21 Armo Biosciences, Inc. Method for assessing protein identity and stability
AU2014311432A1 (en) 2013-08-30 2016-03-03 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
MX2016005915A (es) 2013-11-11 2016-12-16 Armo Biosciences Inc Metodos de uso de interleucina-10 para tratar enfermedades y trastornos.
CN106573072A (zh) 2014-06-02 2017-04-19 阿尔莫生物科技股份有限公司 降低血清胆固醇的方法
CN107001438A (zh) 2014-10-14 2017-08-01 阿尔莫生物科技股份有限公司 白细胞介素‑15组合物及其用途
CN107106655A (zh) 2014-10-22 2017-08-29 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白细胞介素‑10治疗疾病和病症的方法
US10618970B2 (en) 2015-02-03 2020-04-14 Armo Biosciences, Inc. Method of treating cancer with IL-10 and antibodies that induce ADCC
EP3302547A1 (en) 2015-05-28 2018-04-11 Armo Biosciences, Inc. Pegylated interleukin-10 for use in treating cancer
WO2017035232A1 (en) 2015-08-25 2017-03-02 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
CN106222222B (zh) * 2016-08-08 2019-10-29 湖北医药学院 一种重组人白血病抑制因子的制备方法
MX2022001975A (es) * 2019-08-16 2022-03-11 Applied Molecular Transport Inc Composiciones, formulaciones y produccion y purificacion de interleucinas.
CN112501126B (zh) * 2020-12-03 2023-04-07 康立泰生物医药(青岛)有限公司 一种cho-dhfr+细胞株及其应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3110611A1 (de) * 1981-03-18 1982-10-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen "mitogene der leukozyten und des entzuendungsgewebes:natuerliche leukopoetine zur selektiven anregung der teilung und differenzierung von leukozyten"
US4855238A (en) * 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
US4751078A (en) * 1985-07-03 1988-06-14 Nagabhushan Tattanahalli L Process for the purification of gamma interferon
US4929700A (en) * 1987-04-16 1990-05-29 Cetus Corporation Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1
US5227302A (en) * 1988-12-20 1993-07-13 Ludwig Institute For Cancer Research DNA encoding platelet derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF)
US5055555A (en) * 1989-01-05 1991-10-08 Helmut Sassenfeld Purification of G-CSF
IL94878A (en) * 1989-06-28 2003-01-12 Schering Corp Cytokine synthesis inhibitory factor, antagonists thereof and methods of using same
US5231012A (en) * 1989-06-28 1993-07-27 Schering Corporation Nucleic acids encoding cytokine synthesis inhibitory factor (interleukin-10)
US5368854A (en) * 1992-08-20 1994-11-29 Schering Corporation Use of IL-10 to treat inflammatory bowel disease
US5328989A (en) * 1993-03-05 1994-07-12 Schering-Plough Purification of human interleukin-10 from a cell culture medium

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１７０（１９８９）Ｐ．２０８１−Ｐ．２０９５
Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．２（１９９２）Ｐ．８７−Ｐ．９３

Also Published As

Publication number Publication date
EP0688335A1 (en) 1995-12-27
HU218263B (hu) 2000-06-28
AU6351594A (en) 1994-09-26
JPH08503227A (ja) 1996-04-09
KR960701084A (ko) 1996-02-24
NZ263006A (en) 1997-07-27
AU683458B2 (en) 1997-11-13
CA2157358C (en) 2000-05-16
KR0178304B1 (ko) 1999-04-01
US5328989A (en) 1994-07-12
WO1994020525A1 (en) 1994-09-15
HU9502586D0 (en) 1995-10-30
FI954047A (fi) 1995-08-29
FI954047A0 (fi) 1995-08-29
IL108837A0 (en) 1994-06-24
CN1119018A (zh) 1996-03-20
HUT73102A (en) 1996-06-28
US5710251A (en) 1998-01-20
IL108837A (en) 2001-01-11
CA2157358A1 (en) 1994-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2802168B2 (ja) ヒトインターロイキン−１０の精製
EP0077670B1 (en) Human immune interferon
JP4317890B2 (ja) 疎水性ポリペプチドの細菌生産
US5096705A (en) Human immune interferon
JP2864996B2 (ja) 免疫学的疾患治療用医薬組成物
JP2633227B2 (ja) 動物インターフエロン
JPS61224985A (ja) 酸化耐性ミユ−テイン
US5582824A (en) Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon
AU610182B2 (en) Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1
US4675387A (en) Method for extracting protein with organic acid
EP0618220B1 (en) Method for purifying interleukin-4
JPS60221094A (ja) 発現ビヒクル
Cannon-Carlson et al. Expression, purification, and characterization of recombinant human interleukin-13 from NS-0 cells
EP0230781B1 (en) Lymphotoxin gene, method for its production, and lymphotoxin
Jin et al. Purification and renaturation of recombinant human lymphotoxin (tumour necrosis factor beta) expressed in Escherichia coli as inclusion bodies
Liu et al. Expression and purification of a mutant of human interleukin-2 in Pichia pastoris
IE75354B1 (en) Method for purifying interleukin-4
IL120009A (en) Method for production of interferon - ?? polypeptide in a host cell
JPH02169522A (ja) インターロイキン１ポリペプチドを有効成分とする抗潰瘍剤
WO1997048808A1 (en) Bacterial production of interferon-beta using low levels of sodium and potassium ions