JPH02169522A - インターロイキン１ポリペプチドを有効成分とする抗潰瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、インターロイキン１ポリペプチド並びにその
主要部を有するポリペプチドを有効成分とする抗潰瘍剤
に関する。

インターロイキン１ポリペプチド（以下、ＩＬ−１と略
記する）は、マクロファージ細胞をはじめとする諸々の
細胞から産生され・る生理活性物質である。その代表的
な生理活性として、Ｔ細胞及びＢ細胞に対する分化増殖
促進作用、リンパ球活性化作用、マクロファージの活性
化作用、発熱惹起作用、プロスタグランジンＥ２の産生
誘導作用及び線維芽細胞の増殖促進作用等が知られてお
り（Ｏｐｐｅｎｈａｉｍ、　Ｊ、Ｊ、ら、　　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ、　７巻。

４５頁、　　１９８６年；　Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ、Ｃ，
Ａ、、　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　
Ｄｌｓｅａｓｅｓ、　６巻、５１頁、　　１９８４年）
、生体における免疫ｔｉ！福等の調節因子として、重要
な役割を担っている。　ＩＬ−１の有するこれらの多様
な生理活性が注目され、　ＩＬ−１の抗癌作用、放射線
照射等による骨髄機能傷害に対する予防治療効果、ｒ！
、染症に対する予防治療効果、鎮痛・消炎効果などが報
告［Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｓ、ら、　Ｊｐｎ、Ｊ、Ｃａ
ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、＋７７巻、７６７頁、　　１９８６
年；　Ｎｅｔａ、Ｒ，ら＋　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
。

１３６巻、　２４８３頁、　１９８６年；　０ｚａｋｉ
、Ｙ、ら、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉ
ｔｙ、　５５巻、　　１４３６頁、　　１９８７年：特
開昭６２−２９２７２６（１２／１９）、　ＰＣＴ　Ｗ
Ｏ３Ｂ１０３０３１（５１５）］され、医薬品としての
有用性が明らかにされてきている。

本発明者等は、ＩＬ−１の薬理学的有用性について、更
に鋭意研究の結果、全く意外にも非経口投与のみならず
経口投与においても優れた抗潰瘍作用を示すことを見い
出し、本発明を完成した。

本発明には、各種動物由来のインターロイキン１ポリペ
プチド並びにその主要部を有するポリペプチド、即ち抗
潰瘍活性が消失しない限度において修飾されたポリペプ
チドが、その対象物質として用いられる。

これらの対象物質は、天然から抽出されたもの、遺伝子
組み換え技術により製造されたもの、化学的に合成され
たもののいずれでもよい。

好ましい対象物質としては、α型ヒ１−ＩＬ−１（Ｆｕ
ｒｕｔａｎｉ、Ｙ、ら、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ、、　　１３巻。

５８６９頁、　１９８５年；　Ｍａｒｃｈ、Ｃ，Ｊ、ら
、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１５巻。

６４１頁、　１９８５年）、即ち下記の第１表の式［１
１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド：第１
表 Ｓａｒ　　Ｗ Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ Ｓａｒ　　ｌ１ｅ Ｔｈｒ　　Ａｌａ Ａｌａ　　Ｖａｌ Ｓｅｒ　　５ｅｒ １１ｅ　　Ｌｅｕ Ｖａｌ　　Ｔｈｒ Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ Ｔｈｒ　　ｌ１ｅ Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ Ｔｙｒ　　Ｐｈａ Ｐｈｅ　　ｌ１ｅ Ｃｙｓ　　Ｌａｄ Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　５ｅｒ Ａｓｎ　　Ｐｈｅ　　Ｍｅｔ １１ｅ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ １１ｅ　　Ａｒｇ　　Ａｌａ Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｐ Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ Ａｒｇ　　ＩＩｓ　５ｅｒ Ａｌａ　　Ｇｌｎ　Ａｓｐ Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｍａｔ Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　５ｅｒ Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｔ Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ Ａｌａ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ Ａｒｇ　　ＩＩｓ　　ｌ１ｅ Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ ＸＡｓｐＧｌｎ ）（ｉｓ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ Ｍｅｔ　　Ｇｌｙ　Ａｌａ Ａｌａ　Ｌｙｓ　　ｌ１ｅ Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ Ｇｌｕ　Ａｓｐ　　Ｇｉｎ Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　ｌ１ｅ Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｎ Ｈｌｓ　　Ｇｌｙ　　丁ｈｒ Ａｌａ　　Ｈｉｓ　　Ｐｒ。

Ｇｉｎ　　Ａｓｐ　　Ｔｙｒ Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　５ｅｒ Ａｓｎ　　Ｖａｌ Ｌｙｓ　Ｔｙｒ Ａｓｎ　　Ｇｉｎ Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ Ａｓｐ　Ｇｌｕ Ｔｙｒ　　Ｌｙｓ 丁ｈｒ　　Ｖａｌ Ｌｅｕ　Ｔｙｒ Ｐｒｏ　　Ｖａｌ Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　　Ａｓｎ Ａｓｎ　　Ｌｅｕ Ｔｒｐ　　Ｖａｌ １１ｅ　　Ｔｈｒ Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　Ｇｉｎ　　Ｉｌｅ　　Ｌｅｕ　　
Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ａｌａ式［Ｉ］ （上記式中ＷはＳｅｒ又はＡｌａを意味し、ＸはＡｓｎ
又はＡｓｐを意味する。）、そのＮ末端から１〜１４残
基及び／又はＣ末端から１〜４残基のアミノ酸或いはペ
プチドが欠失したポリペプチド（ヨーロッパ公開特許第
０１８８９２０号）やアミノ酸変換体（Ｃａｍｅｒｏｎ
＊Ｐ、　　Ｍ、ら、　Ｊ、　　Ｅｘｐ、　　Ｍａｄ、、
　　１６４巻、２３７頁、　１９８６年；　Ｗｌｎｇｆ
ｉａｌｄ、Ｐ、ら、　Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
。

１６５巻、５３７頁、　１９８７年）が挙げられる。

また、β型のヒトＩＬ−１（Ａｕｒｏｎ、Ｐ、ら、　Ｐ
ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８１巻、　７
９０９頁、　１９８４年）、即ち下記の第２表の式［Ｉ
Ｉ］で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド： 第２表 Ａｌａ　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　Ｓｅｒ　　Ｌ
ｅｕ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　　Ｔｈｒ　ＬｅｕＡｒｇ　Ａｓ
ｐ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　Ｌｅ
ｕ　Ｖａｌ　　ＭｅｔＳｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　　Ｔｙ
ｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｈｌｓ
Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　　
Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　’／ａｌＶａｌ　　Ｐｈｅ　
　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　　Ｇ
ｌｎ　Ｇｌｙ　ＧｌｕＧｌｕ　Ｓｅｒ　　Ａｓｎ　Ａｍ
ｐ　　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ａｌ
ａ　　ＬｅｕＧｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ
　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　５ｅｒＣｙｓ　Ｖ
ａｌ　　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐ
ｒｏ　　Ｔｈｒ　ＬｅｕＧｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅ
ｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ
Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｌ
ｙｓ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　ＶａｌＰｈｅＡｓｎ　Ｌｙｓ　
　ＩＩｓ　Ｇｌｕ　　ＩＩｓ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ
　ＬｅｕＧｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　Ａｌａ　
Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　ＴｒｐＴｙｒ　
　Ｉｌｅ　　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｌａ
　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　ＭｅｔＰｒｏ　　Ｖａｌ　　Ｐｈ
ｅ　　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌ
ｙ　ＧｌｙＧｌｎ　Ａｓｐ　　ＩＩｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ
　Ｐｈｅ　　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　ＰｈｅＶａｔ　
　Ｓｅｒ　　Ｓｅｔ 式［ＩＩ］ や、そのＮ末端から１〜３残基及び／又はＣ末端から１
〜３残基のアミノ酸或いはペプチドが欠失したポリペプ
チド（Ｍｏｓｌｅｙ、Ｂ、ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ｔＪｓＡ、　８４巻、　４５７２頁、　１９８７年）が
、好ましい対象物質として挙げられる。

更に、前記のポリペプチド類の誘導体、即ち該ポリペプ
チドの頭上の＠鎖官能基、Ｎ末端のアミノ基又はＣ末端
のカルボキシル基を利用して形成される誘導体、例えば
カルボキシル基と脂肪族アルコールとのエステル類、第
１もしくは第２アミンとの酸アミド頚、アミノ基のＮ−
アシル誘導体、ヒドロキシル基の０−アシル誘導体、カ
ルバモイル基の水解体又はポリエチレングリコール等に
よる修飾体、更には該ポリペブチ、ドのカルボキシル基
又はアミノ基等とで形成される塩、例えば水酸化すＩ・
リウム、水酸化カリウム、アルギニン、カフェイン、プ
ロ力イン、塩酸、グルコン酸等との塩も本発明の対象物
質として挙げられる。

本発明の対象物質の投与形態としては、経口。

非経口投与のいずれでもよい、その投与量は症状、年齢
により異なるが、０．１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／日好ま
しくは１μｇ〜５ｍｇ／ｋｇ／日である。

本発明の対象物質の製剤化に際しては、賦形剤や安定化
剤を添加するのが好ましい、安定化剤としては２例えば
アルブミン、グロブリン、ゼラチン、プロタミン、プロ
タミン塩、グルコース、ガラクトース、キシロース、マ
ンニトール、グルクロン酸、トレハロース、デキストラ
ン、ヒドロキシエチルデンプン、非イオン界面活性剤（
ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレ
ンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェ
ニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エ
ステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル
、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレ
ンヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシブロビレン
アルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロ
ピレンブロックポリマー、ソルビタン脂肪酸エステル、
ショＩ！脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル）
等が挙げられる。

本発明の対象物質は、文献記載の方法、例えばヨーロッ
パ公開特許第０１８８９２０号、ヨーロッパ公開特許第
０１５５５４９号、前記引用文献及び後記参考例に記載
の方法やこれらの方法に準じた方法により製造すること
ができる。

尚、本明細書では記載の簡略化のために以下の略号を使
用する。

ＤＮＡ ＤＮＡ ＤＮＡ ＲＮＡ ＴＰ ＡＴＰ ＣＴＰ ＧＴＰ ＴＴＰ ｐ ｂｐ Ｄ ＤＳ ＴＴ ＧＥ２ 以下に、 アデニン シトシン グアニン チミン デオキシリボ核酸 相補性ＤＮＡ リボ核酸 伝令ＲＮＡ アデノシン三リン酸 デオキシアデノシン三リン酸 デオキシシチジン三リン酸 デオキシグアノシン三リン酸 デオキシチミジン三リン酸 塩基対 キロ塩基対 キロダルトン ラウリル硫酸すｌ−リウム ジチオスレイトール プロスタグランジンＥ２ 本発明の対象物質の抗潰瘍効果につき、実験例を挙げ具
体的に説明する。

実験例１　抗潰瘍作用 叉ユニ１ 後記参考例１で製造したヒトＩＬ−１αについて、ラッ
トの実験的胃潰瘍に対する効果を、ロバートらの方法（
Ｒｏｂｅｒｔ、Ａ、ら＊　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ
ｏｇｙ、　７７巻、４３３頁、　１９７９年）に準じて
評価した。即ち、ウィスター系雄性ラット（体重２００
〜２４０ｇ　）に絶食１４時間の後、ヒトｒＬ−１αを
経口的又は静脈内に投与した。更に、４時間後に０．４
Ｎ塩ａ−５０％エタノール液の１ｍｌを経口投与し、壊
死性潰瘍を惹起させた。

１時間後に胃を摘出し、摘出胃に生理食塩液１０ｍ１を
注入し、１０％ホルマリン液に５分間浸漬して固定した
。大臀に沿って切開した。腺胃部に認められる粘膜損傷
部の長径を尖体ｒＡｗ、鏡下にて測定した。

１匹当りの総和を潰瘍係数（ｍｍ）とした。

ヱユ五ゑ ヒトＩＬ−１αの抗潰瘍効果を、表４に示す。

表４ 参考例１ ヒトＩＬ−１αの一゛ （１）ヒトＩＬ−１ａ生産用形質発現ベクターｐＨＩＰ
８３８３ａの構築 ヒトＩＬ−１α前駆体をコードするクローン化ｃＤＮＡ
　（ＩＬ−１ａ　ｃＤＮＡと記す）は、ヨーロッパ公開
特許第０１８８９２０号に記載の方法に従って単離した
。

このヒ１−ＩＬ−１α　ｃＤＮＡが組み込まれた組み換
えプラスミドｐＨＬ４（Ｆｕｒｕｔａｎｉ、Ｙ、ら、　
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、　　１３巻、　
　５８６９頁、　　１９８５年）から、制限酵素Ｐｓｔ
ｒによる消化にて、ｃＤＮＡの領域を切り出し、更に制
限酵素ｉ１：ｃｏＲＩとＢｓｔＮＩにて消化し、成熟型
ヒトＩＬ−１αをコードする領域の中央部に相当する約
４１１ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片は
、前記ヨーロッパ公開特許第０１８８９２０号の第５表
記載の塩基番号第３９８〜８０８番目の塩基配列に相当
する。

このＤＮＡ断片に、下記の式［Ａ］及び［Ｂ］で示され
る２種類の化学合成オリゴデオキシリボヌクレオチドア
ダプター（単、に、化学合成アダプターという）を、Ｔ
４　Ｄ：＜ｋリガーゼを用いて結合させた。ここで得ら
れたＤＮＡ断片を＋　５Ｄ−ＩＬＬ断片と称す。

式［Ａ］の化学合成アダプターとは、下記式［ａ］〜ｒ
ｅ］で示される５ｆ１類のＤＮＡ断片な、順次結合させ
て作製したアダプターである。

式［Ｂ］の化学合成アダプターの塩基配列は、次の通り
である。

別途、形質発現ベクターｐＥＰ３０２（Ｆｕｒｕｔａｎ
ｉ、’／、ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｊｄｓ　Ｒｅｓ
、、　　１３巻、　５８６９頁、　　１９８５年）を、
制限酵素虫巨ＩとＢａｍＨＩにて消化し、大腸菌トリプ
トファン　プロモーター領域部分及びアンピシリン耐性
遺伝子を含む大きなりＮＡ断片（以下、ＥＰ３０２ベク
ターＤＮＡ断片という）を単離した。

このＥＰ３０２ベクターＤＮＡ断片を上記の５Ｄ−ＩＬ
Ｉ断片と、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させるこ
とにより、成熟型ヒトＩＬ−１α生産用の形實発現プラ
スミドｐＨＩＰ８３８３ａを構築した。

（２）ヒトＩＬ−１α生産菌の作製 上記の形’！ｆＲ現プラ現送ラスミドＰＨ３８３ａを、
次の方法に従って大腸菌ＨＢＩＯＩ株に導入し形質転換
体を作製した。　Ｆ、ＩＩち、大Ｒの８８１０１株をＬ
Ｂ培地［！ｌ成：ＩＸトリプトン、０．５％酵母エキス
、１％塩化ナトリウム（ｐＨ７，５）　］に接種し、３
０℃で一夜培養した。

その菌体懇濁液の１ｍｌを１００ｍ１のＬＢ培地に接種
し、濁度（波長６００ｎｍの吸光度）が約０．６に達す
るまで、３０℃で培養した。この培養液を氷水中で３０
分間静置したのち、遠心分離にて菌体を採取した。この
菌体を５０ｍ１の５６ｍＭ塩化カルシウム液中に再懸濁
させ、氷水中で６０分間静置したのち、遠心分離にて菌
体を採取し２０％グリセリンを含む５０ｍＭ塩化カルシ
ウム液の１０ｍ１に懸濁させた。

この懇濁液に上記の形質発現プラスミドｐＨｌＰＨ３８
３ａを添加し、氷水中で２０分間、室温で１０分間反応
させたのち、ＬＢ培地を添加して３７℃で６０分間振盪
培培養た。その面体懸濁液の一定量を、２５μｇ／ｍｌ
濃度のアンピシリンを含むＬＢ寒天平板（寒天濃度１．
５％）に播き、３７℃で一夜培養し、アンピシリン耐性
クローンを得た。このアンピシリン耐性クローン、即ち
形質転換体を大腸菌）ＩＢＩＯＩ／ｐＨｌＰＨ３８３ａ
と名付け、ヒトＩＬ−１αの生産菌とした。

（３）ヒトＩＬ−１αの製造 上記の形質転換体大腸菌ＨＢＩＯＩ／ｐＨｌＰＨ３８３
ａを、ＬＢ培地にて３７℃で一夜培養したのち、その菌
体懸濁液を約１００倍量の栄養培地［ｊｆｌ成：１．５
％リン酸二ナトリウム・１２水塩、０．３％リン酸−カ
リウム、０．１％塩化アンモニウム、２ｍｇ／　Ｗλビ
タミンＢ１．０．５％カザミノ酸、２ｍＭ　Ｋ酸マグネ
シウム、０．１ｍＭｔＸ化カルシウム、０．０５％塩化
ナトリウム、０．５％ブドウ＄１］に接種し、更にイン
ドール−３−アクリル酸をｌ＆終濃度２０μｇ／ｍ　ｌ
になるように添加したのち、３７℃で２４時間培養した
。菌体を遠心分離により採取し、０．１％リゾチーム及
び３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ　トリス塩￥
ｉｆ！街液（ｐＨ８，０）に懸濁させた。

氷水中で３０分間静置したのちドライアイス／エタノー
ル浴での凍結と３７℃でのｒａ解を繰り返して国体を破
壊した。これに１７５０容量の１０％ポリエチレンイミ
ンを加えて静１ののち遠心分離にて凹体残査等を除いた
抽出液を得た。この抽出液に嵩容量の池和硫酸アンモニ
ウム水溶液を添加し、静置ののち遠心分離により沈澱を
採取した。この沈澱を、２０ｒｎＭ　トリス塩酸緩填凍
（ｐ）１８．０）に溶解し、同緩衝液に対して透析した
のち、同ｔＩｆｆ液にて平衡化したＤＥＡＥ−セファロ
ースＣＬ−６Ｂカラム（ファルマシア。

スウェーデン）に負荷した。同Ｈ１街液にて該カラムを
洗浄した後、塩化ナトリウムの濃度勾配（０〜０、５Ｍ
）にて溶出した。ヒトＩＬ−１αを含む溶出画分を集め
限外−過にて濃縮した後、セファクリルＳ−２００カラ
ム（ファルマシア）を用いるゲル濾過に付した。更に、
上記のＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムによる
精製及びセファクリルＳ−２００カラムを用いるゲル濾
過を操り返すことにより、ヒトＩＬ−１αの精製品を得
た。

（以下余白） ベク　−　ＥＰ２０５の プラスミドｐＢＲ３２２を、制限酵素ＡｖａＩとＰｖｕ
　ＩＩにて消化し、得られた大きな断片（約３．７ｋｂ
ｐ）を単離した。このＤＮＡ断片の両端を、　ＤＮＡポ
リメラーゼエ（クレノーフラグメント）及びｄＧＴＰ、
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰを用いて平滑末端とし
たのち、　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼにて結合させることに
、より、プラスミドＰＢＲ３２２の複製開始点近傍のコ
ピー数制御領域を欠失させたプラスミドベクターを作製
した。この新規プラスミドベクターをＰＢＲ３６と名付
けた。

次いで、プラスミドベクターｐＢＲ３６を、制限酵素Ｅ
ｃｏＲ１とＰｓｔＩにて消化し、アンピシリン耐性遺伝
子の上流領域と含む小さなりＮＡ断片（約０．７５ｋｂ
ｐ）を単離した。このＤＮＡ断片をＡｍｐ　（Ｐｓ　ｔ
　Ｉ−ＥｃｏＲＩ）断片という、このＡｍｐ　（Ｐｓ　
ｔ　Ｉ−ＥｃｏＲｌ）　！ｔＩＩ片を、ニジ１３ｒｉｐ
　１Ｂフアージベクター（宝酒造、京都）のポリリンカ
ー領域にある制限＃素１１とＥｃｏＲＩの切断部位の領
域に挿入した。この組み換えファージＤＮＡを用い、部
位特異的変異誘導法により、Ａｍｐ（ＰｓｔＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ）断片中の１塩基（Ｔ）を他のＪ基（Ｃ）に変換す
ることにより、制限酵素Ｄｒａｌの切断認識配列（ＡＡ
ＡＴＴＴ）を消去した０部位特異豹変Ｂ誘導には、Ｍｔ
ＪＴＡ−ＧＥＮＥインビトロムタジェネシスキット（バ
イオ−ラド米国）を用い、操作手順書に従って行った。

即ち、上記の組み換えファージＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０
５株に５染させ、これを培養してファージを採取した。

次いで、このファージを大腸菌ＣＪ２３６株に感染させ
るとともに、ウリジン（１Ｍｇ／ｍ　１　）及びクロラ
ムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を含有する２ｘＴＹ
培地［組成＝１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０
゜５Ｘ塩化ナトリウム］中、３７℃で５時間培養し、そ
の培養上清からウラシルが導入された単鎖ファージＤＮ
Ａを単離した。

変異ｖ４導プラ・イマーとして、下記式［Ａ］で示され
る塩基配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを
常法に従って化学合成した。

５°−ＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＣ−３’
　　　　［Ａ、　］このｆ：異誘導プライマーの５゛末
端にリン酸基を付加し、このリン酸化ブライマーを先に
調製したウラシルが導入されたＵＩＬ鎖ファージＤＮＡ
とアニル１１１衝液［組成：　２ｍＭ塩化マグネシウム
及び５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ　トリス塩
ｎ　ｔｉ　ａｌｒ液（ｐＨ７，４）］中、７０℃で１０
分間反応させのち、１分間に１℃の割合で３０℃まで徐
々に冷却することにより、変異誘導プライマーをファー
ジＤＮＡに結合させた。

次いで、合成１１衝液［各０．４ｍＭのｄＧＴＰ、　ｄ
ＣＴＰ、　ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ　、　０．７５ｍＭ　
ＡＴＰ、３．７５ｍＭ塩化マグネシウム及び１．５ｍＭ
　ＤＴＴを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　緩ｍ液（
ｐＨ７，４）］中、水中に５分間、２５℃で５分間及び
３７°Ｃで９０分間の反応条件下で、　Ｔ４　ＤＮＡポ
リメラーゼを作用させ鋳型のファージＤＮＡに対して相
補的なりＮＡを合成し、その末端をＴ４　ＤＮＡリガー
ゼにて結合させ、反応を　−２０℃での凍結にて停止さ
せることにより、環状二重鎖ＤＮＡを作製した。

これを大ＭＩｌＩＪＭ１０５株に感染させ、各クローン
についてそれぞれ培養し、その培−ｆｆＨ木から目的と
する変異型復製型二重鎖ＤＮＡを単離した。この変異誘
導二重鎖ＤＮＡから制限酵素Ｐｓｔ！とＥｃｏＲＩによ
る消化にて、　Ａｍｐ　（Ｐｓ　ｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ）
断片に対応し制限９素ＤｒａＩの切断認識配列が消去さ
れたＤＮＡ断片を切り出した。このＤＮＡ断片を変異型
Ａｍｐ（ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ）断片と称す、この変異
型Ａｍｐ　（Ｐｓｔ　ｒ−ＥｃｏＲＩ）断片を、前記の
ベクターｐＢＲｓｅから制限酵素ＥｃｏＲＩと阻Ｉにて
切り出される大きなりＮＡ断片にＴ４　ＤＮＡリガーゼ
を用いて結合させることにより、プラスミドベクターＰ
ＢＲ５６の塩基配列中、アンピシリン耐性遺伝子領域に
存在する制限酵素ＤｒａＩの切Ｉｌｉ認識配列が消去さ
れたプラスミドを作製し、これをｐＢＲ３６０１と名付
けた。

更に、このプラスミドベクターｐＢＲ５６０１を、制限
酵素ｍＩ■による消化にて得られた大きなりＮＡ断片に
、　Ｓｍａｌリンカ−（宝酒造）をＴ４　ＤＮＡリガー
ゼにて結合させることにより、新規プラスミドベクター
を作製した。この新規プラスミド　ベクターは、プラス
ミドｐＢＲ３２２の２異誘導体であり、その塩基配列中
制限酵素ＤｒａＩの切凹認識塩基配列が完全に消去され
たものであり、　ｐＢＲ３６０２と名けけた。

尚、ＳｍａＩリンカ−の塩基配列は下記のとおりである
。

更に、この新規ベクターｐＢＲ３６０２より、制限酵素
ＡａｔＩＩと５ａｌＩにて消化して得られる大きなりＮ
Ａ断片な単４した。この断片を、ｐＢＲ５６０２（Ａａ
ｔＩＩ−３ａｌｌ）断片と称す。

別途に９考例２に記載したヒトＩＬ−１α生産用形質発
現プラスミドＰＨＩＰＨ３８３Ｊｌから制限＃素Ａａｔ
ＩＩとシュｌによる消化にて単離したＤＮＡ断片、即ち
トリプトファンプロモーター領域及びヒトＩＬ−１αを
コードする領域を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮ
Ａ断片を、プロモーター／ＩＬＩα−ＤＮＡ断片と称す
。

このプロモーター／ＩＬＩα−ＤＮＡ断片を、上記のｐ
ＢＲ５６０２（Ａａ　ｔ　Ｉ　ｌ−３ａ　ｌ　Ｄ断片と
Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させることにより、
新規の発現プラスミドを構築した。この発現プラスミド
をｐＥＰ２０５と名付けた。

特許出願人　大日本製薬株式会社 代　　理　　人　　坪　　井　　有　　四　　部５’−
ＣＣＣＧＧＧ−３″

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）インターロイキン１ポリペプチド又はその主要部
   を有するポリペプチドを有効成分 とする抗潰瘍剤。
2. （２）下記式［ I ］で示されるアミノ酸配列を有する
   α型インターロイキン１ポリペプチ ドを有効成分とする抗潰瘍剤。 【遺伝子配列があります】 式［ I ］ （式中ＷはＳｅｒ又はＡｌａを意味し、ＸはＡｓｎ又は
   Ａｓｐを意味する。）
3. （３）特許請求の範囲第２項記載のアミノ酸配列［ I
   ］において、そのＮ末端側の１〜１ ４個のアミノ酸及び／又はＣ末端側の１〜 ４個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を 有するポリペプチドを有効成分とする抗潰 瘍剤。
4. （４）下記式［II］で示されるアミノ酸配列を有するβ
   型インターロイキン１ポリペプチ ドを有効成分とする抗潰瘍剤。 【遺伝子配列があります】 式［II］
5. （５）特許請求の範囲第４項記載のアミノ酸配列［II］
   において、そのＮ末端側の１〜３ 個のアミノ酸及び／又はＣ末端側の１〜３ 個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有 するポリペプチドを有効成分とする抗潰瘍 剤。
6. （６）特許請求の範囲第２〜５項のいずれかに記載のポ
   リペプチドの誘導体を有効成分と する抗潰瘍剤。