KR100197110B1

KR100197110B1 - 활성 사람 호중구 화학주성 인자 폴리펩티드의 제조방법

Info

Publication number: KR100197110B1
Application number: KR1019900700891A
Authority: KR
Inventors: 마시아끼 야마다; 리유우지 후루다; 준이찌 야마기시; 고우지 마쯔시마
Original assignee: 로버트 란만; 유나이티드 스테이츠 가번먼트, 애즈 리프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬스 앤드 휴먼서비시즈; 다이닛뽄 파마슈티칼 컴패니 리미티드
Priority date: 1988-08-29
Filing date: 1989-08-29
Publication date: 1999-06-15
Also published as: US5401643A; DE68919085T2; KR900702031A; EP0431042A4; JPH04500156A; EP0431042B1; WO1990002178A1; EP0431042A1; JP3053631B2; ATE113312T1; DE68919085D1

Abstract

내용 없음.

Description

활성 사람 호중구 화학주성 인자 폴리펩티드의 제조방법

본 발명은 사람 호중구 화학주성 인자 폴리펩티드의 생산용 발현 벡터를 은닉하고 있는 형실전환 세포로부터 상기 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

사람 호중구 화학주성인자(NCF로 약칭한다)는 생리적으로 활성 폴리펩티드이며, T 림프구의 갑상선 및 림프절로의 이동(호우밍:homing)과 같은 발생 및 생체 항상성 메카니즘에서, 및 면역반응과 조절에서 중요한 역할을 담당한다. NCF는 호중구 및 림프구를 끌어당겨서 이들 세포를 활성화시키는 생물학적 활성을 가지고 있는 것으로 보고되어 있다(Yoshimura, T. et al., J. Immunol., 139, 788, 1987; Walz, A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 755, 1987; Gregory, H. et al., Biochem. Biophys Res. Commun. 151, 833, 1988). 이러한 발견은 NCF가 악성종양 및 면역결핍질병 환자에 대하여 유용한 면역치료제임을 시사한다.

본 발명자들은 숙주세포로서 대장균을 사용하여 재조합 DNA 기법에 의하여 사람 NCF의 제조에 성공하였고, 또한 형질전환체 호모게네이트(homogenate)의 가용성 분획으로부터 상기 폴리펩티드를 단리하는데 성공하였으며, 이런 발명에 대한 특허출원은 1988년 5월 2일 미국 특허청에 일련번호 189,164로 출원되었다. 나아가, 본 발명자들은 형질전환체 호모게네이트로부터 사람 NCF 폴리펩티드를 제조하는 간단하고 효과적인 방법을 연구하였고, 그 결과 놀랍게도, 재조합 DNA 기법에 의하여 사람 NCF 폴리펩티드를 코드화 하는 발현 벡터를 은닉하고 있는 대장균 세포에서 생산되는 대량의 상기 폴리펩티드가 형질전환체 호모게네이트로부터 원심분리에 의하여 수집된 침전 분획에 주로 분포된다는 것과, 활성 사람 NCF 폴리펩티드가 상기 침전 분획을 요소 및 구아니딘 하이드로클로라이드 같은 단백질 변성제로 처리하고 상기 변성제를, 예컨대 투석에 의하여 제거함으로써 간단하게 상기 침전 분획으로부터 효과적으로 얻어질 수 있음을 발견하였다.

본 발명의 목적은 형질전환제 호모게네이트로부터 활성 사람 NCF 폴리펩티드를 대강 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한 형질전환체 호모게네이트의 침전 분획으로부터 활성 사람NCF 폴리펩티드를 정제하기 위한 간단하고 효과적인 방법을 제공하는 것이다.

다른 목적들도 다음의 설명으로부터 이해될 것이다.

사람 NCF 폴리넵티드의 전형적인 아미노산 서열은 표 1에 제시된 식 [Ⅰ]로 표시된다. 그러나, 사람 NCF는 상기 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드일 뿐만 아니라, 표 1에 제시된 식 [Ⅰ]로 표시된 것과 유사한 서열과 사람 NCF 활성을 가지는 폴리펩티드를 의미한다.

본 발명을 보다 상세히 설명하면, 형질전환체 호모게네이트의 침전 분획이 단백질변성제, 예컨대 요소 또는 구아니딘 하이드로클로라이드로, 바람직하게는 4M 이상, 보다 바람직하게는 6 내지 10M의 최종 농도에서 용해된 후, 상기 변성제는, 예컨대 10-5OmM 인산염 또는 트리스-HCℓ완충액(pH 6-8)에 대하여 수행되는 것이 바람직한 투석에 의하여 제거된다.

그러면 변형된 NCF를 함유하는, 본질적으로 불용성 물질만이 재침전된다.

그 결과의 침전물을 제거함으로써, 대량의 가용성 활성 사람 NCF 폴리펩티드를 함유하는 용액이 쉽게 얻어질 수 있다.

형질전환체 호모게네이트로부터 침전분획을 분리하기 전에, 데옥시리보뉴클레아제를 이용한 소화에 의해 형질전환체 호모게네이트중의 핵산을 분해하기 위한 처리를 수행하는 것이 바람직하다.

상기 침전분획으로부터 회수된 가용성 활성 NCF 폴리펩티드는 예컨대 염석처리, 음이온 및/ 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 한외여과, 겔 여과, 투석, 전기영동, 특정 항체를 사용하는 친화성 크로마토그래피 등의 조합에 의하여 추가로 정제될 수 있다.

형질전환 세포중의 사람 NCF 폴리펩티드는 사람 NCF 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 로 제조된 발현 벡터로 형질전환된 세포를 배양함으로써 생산된다. 즉, 첫 번째로, 사람 NCF 폴리펩티드를 생산하기 위한 발현 플라스미드는, 예컨대 참고예 1에 기재된 것과 같은 방법을 따라 또는 종래방법을 사용하는 전체합성에 의해 분리되는 상기 폴리펩티드를 코드화하는 DNA로, 예컨대 참고예 2에 따라 제조될 수 있다. 2 번째 단계로서, 사람 NCF 폴리펩티드 생산용 형질전환세포는 코헨 등의 방법(Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 69,2110, 1972)을 따라 상기 발현 플라스미드를 도입함으로써 얻을 수 있다. 마지막 단계로서, 사람 NCF 폴리펩티드는 그 결과의 형질전환세포를 적당한 배양 조건하에 배양함으로써 생산될 수 있다.

또한 형질전환체 호모게네이트는 예컨대 리소짐(lysozyme) 소화 및 동결-해동, 초음파 처리에 의해 또는 프렌치 프레스(French press)를 사용함으로써 세포를 파괴함으로써 제조될 수 있다.

실시예에 의해 제조된 사람 NCF와 화학적 및 생물학적 성질은 참고예 2에 기재된 것과 같은 방법을 따라, 각 사람 NCF 폴리펩티드의 단백질 분해효소소화 후 고성능 액체 크로마토그레피에 의해 수행된 펩티드 지도화 분석에 의해, 및 다중웰 헤모택시스 보이든 챔버(multiwell hemotaxis Boyden chamber)(Neuro Probe, Inc., USA)에서 측정된 호중구 화학주성 측정에 의해, 형질전환체 호모게네이트의 가용성분획으로부터 제조된 사람 NCF 폴리펩티드의 제반성질과 동일하였다.

설명을 간단히 하기 위해서, 본 명세서 및 청구범위에 다음의 약호를 사용한다.

A : 아데닌

C : 시토신

G : 구아닌

T : 티민

I : 이노신

dATP : 데옥시아데노신 트리포스페이트

dCTP : 데옥시시토신 트리포스페이트

dGTP : 데옥시구아노신 트리포스페이트

dTTP : 데옥시티미딘 트리포스페이트

ATP : 아데노신 트리포스페이트

DNA : 데옥시리보핵산

cDNA : 상보DNA

kbp : 킬로염기쌍

SD서열 : 샤인-달가노서열(Shine-Palgarno Sequence)

kD : 킬로달톤

SDS : 라우릴황산나트륨

본 명세서 및 청구범위에 있어서, 단일 가닥에 의해 제시된 뉴클레오티드 서열은 센스 가닥의 뉴클레오티드 서열이며, 좌측끝은 5'-말단이고 우측끝은 3'-말단이다. 아미노산 서열에서, 좌측끝은 N-말단이며, 우측끝은 C-말단이다.

다음 실시예 및 참고예는 본 발명을 보다 구체적으로 예시한다.

그러나 본 발명이 어떤 방식으로도 이들 실시예로 제한되지 않는다는 것이 주지되어야 한다.

다음 참고예를 더욱 잘 이해하도록 하기 위하여, 본 명세서에 개략도 1 내지 3을 첨부한다.

개략도 1은 발현 플라스미드 pHNP101(참고예2)의 제조방법을 도시한다; 개략도 2는 발현벡터 pEP205(참고예3)의 제조방법을 도시한다; 개략도 3은 발현 플라스미드 pHIPH383a(참고예4)의 제조방법을 도시한다.

[사람 NCF 폴리펩티드의 제조]

참고예 2-(2)에서 얻어진 사람 NCF 폴리펩티드를 생성하기 위한 형실전환세포, 대장균 HB101/pHNP101을 LB 브로스(broth)[조성; 1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨(pH 7.5)] 중에서 37℃에서 밤새 배양하였다.

배양액을 100배 부피의 영양배지 [조성; 1.5% 인산나트륨, 2 염기성 12-수(水), 0.3% 인산칼륨, 일염기성, 0.1%, 염화암모늄, 2mg/ℓ 비타민 B1, 0.5% 카사미노산, 2mM 황산마그네슘, 0.1mM 염화칼슘, 1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨 및 0.4% 글리세롤]로서 20μg/mℓ로 3-인돌아크릴산이 첨가된 것에 접종시켰다.

35℃에서 28시간 동안 배양하고, 세포를 원심분리에 의하여 수집한 후, 0.02%리소짐 함유 50mM 트리스-HCℓ 완충액(PH 8.0)에 현탁시켰다.

그 세포 현탁액을 30분 동안 빙수에 방치한 후, 추가로 드라이아이스/ 에탄올에서 동결시킨 후 37℃에서 녹이는 것을 반복하여 세포를 파괴하였다.

그 결과의 호모게네이트에 염화마그네슘과 데옥시리보뉴클레아제 I(Takara Shuzo Co., Ltd., Japan)을 최종 농도가 각각 1mM 및 2U/mℓ되도록 첨가하였다.

0℃에서 30분 동안 배양한 후, 불용성 펠릿(pellet)을 원심분리에 의하여 수집하고, 0.75M 요소 및 1% 트리톤 X-100을 함유하는 20mM 트리스-HCl완충액(pH 8.0)으로 2회 세척하였다. 세척된 펠릿을 5mM 인산염 완충액(pH 6.5)중의 6M 구아니딘 하이드로클로라이드로 용해하였다.

투명하게 된 추출물을 원심분리에 의해 얻고 20mM 인산염 완충액(pH 6.5)(이하 PB로 칭함) 에 대하여 투석하였다.

원심분리하여 투석 중에 형성된 침전물을 제거한 후, 투석물을 PB로 사전에 평형화시킨 CM-세파로스 CL-6B (Pharmacia, Sweden) 컬럼 상에 적용하였다.

컬럼을 PB로 세척하고, PB중의 0 내지 0.5M 농도의 염화나트륨의 선형구배로 용출하였다.

사람 NCF 폴리펩티드 함유 분획을 수집하고 모아서 한외 여과로 농축하였다.

또한, 농축물을 Toyopearl HW-55컬럼(TOSOH Co., Japan)상에서 겔 여과하여 고도로 정제된 사람 NCF 폴리펩티드를 얻었다.

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석에 의하여, 고도로 정제된 사람 NCF 폴리펩티드 제제에서는 어떠한 불순물도 검출되지 않았다.

[실시예 2]

[사람 NCF 폴리펩티드의 제조]

실시예 1에서 기재된 바와 같은 형질전환제 호모게네티트로부터의 세척된 펠릿을 5mM 인산염 완충액(pH 6.5)중의 8M 요소로 용해시켜, 실시예 1에 기재된 것과 동일한 과정을 사용함으로써 고도로 정제된 NCF를 얻었다.

[참고예 1]

[사람 NCF를 코드화하는 cDNA의 클로닝]

6 시간동안 10μg/ml의 당지방질로 자극한 정상인 사람 단구(monocyte)로부터 얻어진 주형폴리아데닐화된 mRNA로부터 합성한 cDNA를, 파지벡터 람다 gt10의 EcoRI 부위에 삽입함으로써 cDNA 라이브러리를 제조하였다.

50만개의 개개의 플라크를 다음 식 [C]와 [D]로 표시되는 [³²P]-표지된 2 종류의 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 프로브와의 혼성화에 대하여 스크리닝하였다.

및

첫 번째 스크리닝에서 13개의 양성으로 추정되는 클론을 얻었다.

이들 양성 클론 중에서 다른 프로브의 사용에 의한 제2스크리닝에서 하나의 클론(r-MDNCF 2-1이라고 칭한다)을 선택하였다.

r-MDNCF 2-1 중의 파지 DNA를 pUC19 플라스미드에 서브클로닝하였다.

그 결과의 재조합 플라스미드를 pUC19-1.7-5라 명명하였다.

재조합 플라스미드 pUC19-1.7-5에 클로닝된 cDNA는 표 2에 도시된 사람 NCF를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다.

[참고예 2]

[사람 NCF 폴리펩티드의 제조]

표 1의 식 [Ⅰ]로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 사람 NCF 폴리펩티드를 다음 방법에 의하여 제조하였다.

[발현 플라스미드 pHNP101의 제조]

참고예 1에 언급된 바와 같이 사람 NCF cDNA가 삽입되어 있는 재조합 플라스미드 pUC19-1.7-5로부터, 사람 NCF 선구 폴리펩티드의 N-말단으로부터 18번째 위치에서 97번째 위치까지의 아미노산 (표 2의 염기번호 52에서 291까지의 염기서열에 해당한다)에 해당하는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA단편을, 제한 엔도뉴클레아제 PstⅠ과 EcoRI으로 소화함으로써 분리하였다.

그런 다음 이 DNA단편을 파지벡터 M13mp18(Takara Shuzo Co. Ltd., Japan)에, 폴리링커 서열에 있는 PstⅠ의 제한 엔도뉴클레아제 절단부위와 EcoRI의 부위사이의 영역에 클로닝하였다. 그 결과 형성된 재조합 파지 DNA를 사용하여 특이한 염기서열 5'-TTTAAATTATG-3'을, 사람 NCF 선구 폴리펩티드의 N-말단으로부터 27번째 위치에 있는 Arg에 해당하는 코돈과 28번째 위치의 Ser에 해당하는 코돈 사이에, 쿤켈등의 방법(Kunkel, et al., Methods in Enzymol., 154, 367, 1987)을 따라서 부위-특정 돌연변이 생성법에 의해 삽입하였다.

부위-특정 돌연변이 생성은 제조자 매뉴얼(Bio-Rad Labs., USA)에 따라 MutaGene 시험관내 돌연변이 생성 키트를 사용하여 수행하였다.

대장균 JM105를 재조합파지 DNA로 감염시킨 후, 배양하여 재조합 파지를 수집하였다.

그런 다음, 대장균 Cj236을 상기와 같이 얻어진 재조합 파지로 감염시키고, 우리딘(1μg/ml) 및 클로람페니콜(20 μg/ml)이 첨가된 2xTY 배지 [조성; 1.6% 트립톤, 1% 효모추출물, 0.5% 염화나트륨] 중에서 37℃에서 5시간 동안 배양하였다.

우라실 함유 단일-가닥 파지 DNA를 배양배지로부터 분리하였다.

별도로, 다음 식 [Ⅰ]로 표시되는 33 염기로 이루어지는 돌연변이 유발원 올리고데옥시리보뉴클레오티드 프라이머를 화학적으로 합성하였다.

돌연변이 유발원 프라이머의 5'-끝을 사전에 인산화하였다.

인산화된 프라이머를 상기와 같이 제조된 우라실 함유 단일-가닥 파지 DNA와, 아닐링(annealing) 완충액 [2mM 염화마그네슘 및 50mM 염화나트륨 함유 20mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.4)] 중에서 70℃에서 10 분동안 인큐베이션한 후, 분당 1℃의 속도로 30℃로 냉각함으로써 아닐링시켰다.

그런 다음, 프라이머를 합성완충액[0.4mM의 각각 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(dGTP, dATP, dCTP, dTTP), 0.75mM ATP, 3.75mM 염화마그네습 및 1.5mM 디티오트레이톨 함유 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.4)] 중에서 T4 DNA 중합효소로 연장시켜서 상보 가닥을 합성하였고, 그 끝을 T4 DNA 리가제로, 차례로 얼음 상에서 5분 동안, 25℃에서 5분 동안, 그리고 37℃에서 90분 동안 계속해서 인큐베키션함으로써 연결시켰다. 반응을 -20℃에서 동결시킴으로써 중지시켰다.

원형 이중-가닥 DNA(헤테로이중체)을 대장균 JM 105 세포에 도입시키고, 그것을 배양하여 돌연변이 된 이중-가닥 복제 형태 DNA를 단리하였다.

돌연변이 된 DNA의 뉴클레오티드 서열을, 배양 배지로부터 단리한 단일-가닥 DNA를 서열분석 함으로써 확인하였다.

그 결과의 돌연변이 된 이중-가닥 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 DraⅠ과 EcoRI으로 소화하여 사람 NCF 폴리펩티드에 대한 코딩영역의 대부분을 함유하는 DNA단편을 분리시켰다.

분리한 DNA 단편을 이하 NCF(DraⅠ-EcoRI)-단편이라 언급한다.

이 NCF(DraⅠ-EcoRI)-단편을 T4 DNA 리가제에 의해 다음 식 [F]로 표시되는 화학적으로 합성된 올리고데옥시뉴클레오티드 어댑터와 연결시켰다.

그 결과 연결된 DNA단편은 NCF(DraⅠ-XhoI)-단편으로 칭한다.

별도로, 참고예 3에서 언급한 발현 플라스미드 pEP205를 제한 엔도뉴클레아제 DraⅠ과 XhoI으로 소화한 후 형성된 암피실린내성 유전자 및 복제개시점을 함유하는 보다 큰 DNA 단편 (이하 EP205 벡터-DNA단편이라 칭한다)을 분리하고, 이 EP205벡터-DNA단편을 T4 DNA 리가제에 의해 앞서 제조한 NCF(DraⅠ-XhoI)-단편과 연결시켜서 사람 NCF를 생산하는 발현 플라스미드 pHNP101을 제조하였다 (개략도1 참조).

[대장균의 형질전환]

그 결과의 발현 플라스미드 pHNP101을 다음 방법에 의하여 대장균 HB101에 도입하였다.

대장균 HB101을 LB 브로스 [조성; 1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨(pH 7.5)]에 접종시키고, 30℃에서 밤새 배양하였다.

그 결과의 배양액 1ml을 100ml의 LB 브로스에 접종시킨 후, 배양액의 600nm에서의 혼탁도가 대략 0.6이 될 때까지 30℃에서 추가로 배양하였다.

빙수 중에서 30분 동안 방치한 후, 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 그것들을 50ml의 50mM 염화칼슘에 현탁시켜서, 빙수 중에서 60분동안 방치하였다.

그런 다음, 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 그것을 20% 글리세롤 함유 50mM 염화칼슘 10ml에 다시 현탁하였다.

이 세포 현탁액에, 발현 플라스미드 pHNP101을 혼합하고 계속해서 빙수 중에서 20분 동안 그리고 실온에서 60분 동안 차례로 배양하였다. 그런 다음 LB 브로스를 세포 현탁액에 첨가하고, 37℃에서 60분 동안 진동시키면서 배양하였다.

그 결과의 세포 현탁액의 분액을 25μg/ml의 암피실린을 함유하고 있는 LB 한천(1.5% 한천) 위에 접종하였다.

37℃에서 밤새 배양한 후, 암피실린내성 콜로니를 선택하여 형질전환체을 얻었다.

이런 형질전환체 중의 하나를 대장균 HB101/ pHNP101이라 칭하고 사람 NCF 폴리펩티드 제소를 위해 사용하였다.

[사람 NCF 폴리펩티드의 제조]

상기와 같이 얻어진 대장균 HB101/pHNP101을 LB 브로스 중에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양액을 100배 부피의, 실시예에서 언급한 3-인돌아크릴산 20μg/ml이 첨가된 영양배지에 접종시킨 후, 35℃에서 28시간 동안 배양하고, 세포를 원심분리에 의하여 수집한 후, 0.1% 리소짐 및 30mM 염화나트륨 함유 50mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)에 현탁시켰다.

그 현탁액을 30분 동안 빙수에 세워 놓은 후, 추가로 드라이아이스/ 에탄올에서 동결시킨 후 37℃에서 녹이는 것을 반복하여 세포를 파괴하였다.

1/50부피의 10% 에틸렌아민 중합체를 첨가한 후, 원심분리에 의하여 맑아진 세포 추출물을 얻었다. 이 세포-추출물에 황산암모늄을 70% 포화농도까지 첨가한 후, 형성된 침전물을 원심분리에 의해 수집하였다.

침전물을 증류수에 녹이고 5mM 인산염 완충식염수(pH 6.5)에 대해 투석하였다.

투석물을 세파크릴 S-200 컬럼 상에 적용시키고, 약 6 내지 10kD 분자량을 가지는 폴리펩티드 함유 분획을 수집하여 모았다.

각 용출액 중의 폴리펩티드의 분자크기를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석에 의해 측정하였다.

모아진 분획을 실시예에서 언급한 PB에 대하여 투석한 후, 투석물을 PB로 사전에 평형화시킨 CM-세파로스 CL-6B 컬럼 상에 적용하였다. 컬럼을 PB로 세척하고, PB중의 0 내지 0.5M 농도의 염화나트륨의 선형구배로 용출하였다.

사람 NCF 폴리펩티드 함유 분획을 수집하고 모아서 한외 여파로 농축하였다.

또한, 농축물을 Toyopearl HW-55 컬럼(TOSOH Co., Japan)상에서 겔여과하여 고도로 정제된 사람 NCF 폴리펩티드를 얻었다

[참고예 3]

[발현펩터 pEP205의 제조]

플라스미드 pBR322를 제한 엔도뉴클레아제 AvaI과 PvuⅡ로 소화하고, 그 결과 형성되는 보다 큰 DNA 단편(약 3.7kbp 크기)을 단리하였다.

그의 접착성(cohesive) 끝을 대장균 DNA 중합효소 Ⅰ(클레노우(klenow)단편)을 사용하여 dGTP, dATP, dCTP 및 dTTP의 존재 하에 채워서 블런트-끝으로 만든 후에, 2개의 끝을 T4 DNA 리가제에 의해 연결하여 플라스미드 pBR322의 복제 개시점에 가까이 위치한 카피 수 조절 유전자 영역이 결실되어 있는 새로운 플라스미드 벡터(pBRS6으로 표시함)를 만들었다.

플라스미드 벡터 pBRS6을 제한 엔도뉴클레아제 EcoRⅠ과 PstⅠ으로 소화하여, 암피실린내성 유전자의 위쪽 영역을 함유하고 있는 보다 작은 DNA 단편(약 0.75kbp 크기)을 단리하였다.

그 결과의 DNA 단편을 Amp(PstⅠ-EcoRⅠ)단편으로 칭한다.

이 Amp(PstⅠ-EcoRⅠ)-단편을 실시예에서 언급한 바와 같은 파지벡터 M13mp18에 클로닝하였다. 그 결과 형성된 재조합 파지 DNA를 사용함으로써, Amp(PstⅠ-EcoRⅠ)-단편의 뉴클레오티드 서열중의 한 염기(T)를 참고예 2에서 언급한 바와 같은 방법을 따르는 부위-특정 돌연변이 법에 의해 다른 염기(C)로 변경하여 제한 엔도뉴클레아제 DraⅠ으로 인지 가능한 특이한 뉴클레오티드 서열(AAATTT)을 제거하였다.

우라실 함유 단일-가닥의 파지 DNA를 상기 재조합 파지 DNA로 감염된 대장균 CJ236의 배양배지로부터 단리하였다.

돌연변이 생성원 프라이머로서, 다음 식 [G]로 표시되는 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 화학적으로 합성하였다.

인산화된 프라이머를 우라실-함유 DNA 주형과 아닐링시켰다.

참고예 2에 기재된 방법을 따라 바라는 대로 돌연변이를 일으킨 이중가닥 DNA를 단리하였다.

그 결과의 돌연변이 이중-가닥 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 PstⅠ과 EcoRⅠ으로 소화하여, 상기 언급한 바와 같은 Amp(PstⅠ-EcoRⅠ)-단편에 해당하지만 제한 엔도뉴클레아제 DraⅠ 절단 인지서열은 함유하지 않은 DNA 단편 [이하 돌연변이 된 Amp (PstⅠ-EcoRⅠ)-단편이라 한다]을 단리하였다.

돌연변이 Amp(PstⅠ-EcoRⅠ)-단편을 제한 엔도뉴클레아제 EcoRⅠ과 PstⅠ으로 벡터pBRS6 을 소화시킴으로써 단리된 보다 큰 DNA 단편과 연결시켜서, 플라스미드벡터 pBRS6의 암피실린내성 유전자 중의 DraⅠ 절단인지 서열이 제거되어 있는 새로운 벡터를 제조하였다. 이 새로운 벡터는 pBRS601로 명명한다.

다시, 이 새로운 벡터 pPBRS601을 제한 엔도뉴클레아제 DraⅠ으로 소화시키고, 그 결과 형성되는 보다 큰 DNA 단편을 단리하였다.

보다 큰 DNA 단편을 T4 DNA 리가제에 의해 SmaⅠ 링커(Takara Shuzo Co., Japan)와 연결시켜 새로운 플라스미드 벡터를 제조하였다.

이 결과의 새로운 플라스미드 벡터는 플라스미드 pBRS6의 유도체이고 제한 엔도뉴클레아제 DraⅠ에 대한 어떠한 인지서열도 함유하지 않는다.

이 새로운 플라스미드 벡터를 pBRS602로 명명한다.

SmaⅠ 링커의 뉴클레오티드 서열은 아래 제시한 바와 같다.

나아가, 이 새로운 벡터 pBRS602를 제한 엔도뉴클레아제 AatⅡ와 SalⅠ으로 소화하고, 그 결과 생성된 보다 큰 DNA 단편[ 이하 pBRS602(AatⅡ-SalⅠ)-단편이라 칭함]을 단리하였다.

별도로, 참고예 4에서 언급하는 바와 같이 사람 인터류킨-1α를 생산하기 위한 발현 플라스미드 pHIPH383a를 제한 엔도뉴클레아제 AatⅡ와 SalⅠ으로 소화시키고, 그 결과 생성된 대장균 트립토판 프로모터서열 및 사람 인터류킨-1α를 코딩하는 영역을 함유하는 DNA 단편을 단리하였다.

이 결과의 단편을 trp프로모터/1L- 1α- DNA 단편이라 칭한다.

이 trp프로모터/1L- 1α-DNA 단편을 T4 DHA 리가제에 의하여 pBRS602(AatⅡ-SalⅠ)-단편과 연결시켜서 새로운 발현 플라스미드를 제조하였다(개략도 2 참조).

이 새로운 발현플라스미드를 pEP205로 표시한다.

[참고예 4]

[발현 플라스미드 pHIPH383a의 제조]

사람 인터류킨-1α 선구 폴리펩티드를 코드화하는 클로닝된 cDNA를 유럽 특허공고 제 0188920호에 기재된 방법에 따라 단리하였다.

사람 인터류킨-1α선구 cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드 pHL4 (Furutani, Y., et al., Nucleic Acids Res., 13, 5869, 1985)로부터 cDNA 삽입물을 제한 엔도뉴클레아제 PstⅠ으로의 소화에 의하여 단리하고, 다시 제한 엔도뉴클레아제 EcoRⅠ과 BstNⅠ으로 소화하여 성숙한 사람 인터류킨-1α에 대한 코딩영역의 중간부분을 함유하는 DNA 단편(411bp 크기)을 단리하였다.

단리된 DNA 단편은 유럽특허공고 제 0188920호에 도시된 표 5의 염기번호 398에서 808까지의 뉴클레오티드 서열에 해당한다.

이 DNA 단편을 계속해서 T4 DNA 리가제를 사용하여 다음 식 [H]와 [J]로 표시되는 화학적으로 합성되는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 어댑터와 연결시켰고, 그 결과 생성되는 DNA단편을 SD-IL-1-단편으로 언급한다.

합성 올리고데옥시리보뉴클레오티드 어댑터[H]는 다음 식 [a]-[e]로 표시되는 다음 5 종류의 DNA 단편의 순차적인 연결에 의하여 제조하였다.

식[J]의 염기서열은 다음과 같았다;

별도로, 발현벡터 pEP302(Furutani, Y., et al., Nucleic Acids Res., 13, 5869, 1985)를 제한 엔도뉴클레아제 HpaⅠ과 BamHⅠ으로 소화시켰고, 그 결과 생성되는 대장균 트립토판 프로모터 서열 및 암피실린내성 유전자를 함유하는 보다 큰 DNA 단편을 단리하였다(이하 EP302벡터-DNA단편이라 칭함).

EP302 벡터-DNA단편을 T4 DNA 리가제에 의해 상기와 같이 제조한 SD-IL-1-단편과 연결시켜 성숙한 사람 인터류킨-1α 폴리펩티드를 생산하기 위한 발현 플라스미드 pHIPH383a를 제조하였다(개략도 3 참조).

[개략도 1]

[개략도 1](계속)

[개략도 2]

[개략도 2](계속)

[개략도 3]

Claims

직접 발현에 의해 하기 식의 아미노산 서열로 구성되는 활성 재조합 사람 호중구 화학주성인자 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서,

상기 폴리펩티드를 코드화하는 염기서열을 포함하는 발현벡터가 내재하는 E.coli 세포를 배양하는 단계; 형질전환체-호모게이트를 형성하도록 상기 세포를 분쇄하는 단계; 상기 형질전환체-호모게이트로부터 침전을 수집하는 단계; 그리고 상기 폴리펩티드를 용해시키기에 충분한 농도의 요소 또는 구아니딘 하이드로클로라이드로 상기 침전을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 요소 또는 구아니딘 하이드로클로라이드를 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 호중구 화학주성인자 폴리펩티드를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 요소 또는 구아니딘 하이드로클로라이드의 상기 농도가 4M 이상인 것을 특징으로 하는 사람 호중구 화학주성인자 폴리펩티드를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 요소 또는 구아니딘 하이드로클로라이드의 상기 농도가 6M 내지 10M인 것을 특징으로 하는 사람 호중구 화학주성인자 폴리펩티드를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 요소 또는 구아니딘 하이드로클로라이드의 상기 농도가 4M 내지 10M인 것을 특징으로 하는 사람 호중구 화학주성인자 폴리펩티드를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 용해시키기 위해 구아니딘 하이드로클로라이드가 사용되는 것을 특징으로 하는 사람 호중구 화학주성인자 폴리펩티드를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 용해시키기 위해 요소가 사용되는 것을 특징으로 하는 사람 호중구 화학주성인자 폴리펩티드를 제조하는 방법,
제2항에 있어서, 상기 용해된 폴리펩티드를 얻기 위해 상기 요소 또는 구아니딘 하이드로클로라이드가 투석에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 사람 호중구 화학주성인자 폴리펩티드를 제조하는 방법.
제8항에 있어서, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석에 의해 불순물이 검출될 수 없는 매우 정제된 폴리펩티드를 얻기 위해 상기 폴리펩티드는 더 정제되는 것을 특징으로 하는 사람 호중구 화학주성인자 폴리펩티드를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 핵산을 분해하기 위해 상기 형질전환체-호모게네이트가 데옥시리보뉴클레아제로 처리되는 것을 특징으로 하는 사람 호중구 화학주성인자 폴리펩티드를 제조하는 방법.