JP3133305B2 - 好中球活性化因子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、免疫調節物質に関するものである。

さらに詳しくは、この発明は、ヒト中性好性白血球を
活性化し得る免疫刺激因子に関するものである。前記因
子については、以後、好中球活性化因子（NAF）と称す
る。

1.背景 中性好性白血球（好中球）は、最も多く存在する白血
球であり、ヒト血液における白血球の約2/3を占める。
それらは、微生物感染から宿主生物を防御するという一
つの主機能を有する。好中球は移動性であり、感染後に
生ずる走化性刺激に反応を示し、感染組織中へ移動する
ことにより微生物を殺すことができる。この殺微生物作
用は、微生物を包み込み、酸素ラジカルおよび殺菌酵素
を放出するという好中球の能力に依るものである（B.M.
ベイバー、「ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ
・メディシン」298［1978］659−668およびM.バッジオ
リーニ、「エクスペリエンチア」40［1984］906−90
9）。それらの生成物の放出は、好中球の活性化による
ものである。すなわち、この明細書に記載されている好
中球活性化因子のような物質を用いることにより、好中
好の活性化、従って、人体の抗菌防御機構を高めること
ができる。

ヒト単核白血球は、ヒト好中球においてエキソサイト
ーシスおよび呼吸バースト（酸素基形成および酵素放
出）を誘発、すなわち抗菌作用において重要な好中球活
性化特性を示す因子を分泌することが見出された。

この因子は刺激されたヒト単核白血球の培養液から得
られ、SDS−ゲル電気泳動において約6000、より正確に
は約6500の見かけ上の分子量を有する。

単核白血球は、好中球と類似した食細胞である。しか
しながら、好中球とは反対に、単核白血球は寿命が長
い。それらは、血液から、それらがマクロファージに形
質転換し得る全ての組織部位に移動する。また単核白血
球からマクロファージへの形質転換は、細胞培養実験に
おいて観察され得る。組織におけるマクロファージは、
様々な機能、主に好ましくない物質の食作用並びに分泌
される非常に多様なペプチドおよび蛋白質の生産機能を
有する。マクロファージは持続的感染部位に集まり、こ
れらの部位においては、これらの細胞がNAFを産生する
ことにより、好中球の宿主防御能が高められ、病態生理
学的に適切な機能が発現され得る。

NAFは、その好中球活性化特性、すなわち酸素ラジカ
ルの生成を伴ういわゆる呼吸バーストの誘発および酵素
放出の誘発を特徴とする。分子という点からみると、NA
Fは次に述べる性質を特徴とする。すなわち、SDS−ゲル
電気泳動における見かけ上の分子量が約6500であり、等
電点が約8.6であり、耐熱性が80℃であり、若干の変性
因子については耐性を示すが、プロテアーゼに対しては
感受性を示す。これはNAFがポリペプチドであることを
示唆している。ヒト好中球に対するNAFの作用は、２種
の公知走化性刺激剤、アナフィラトキシンC5aおよび細
菌性ペプチドのＮ−ホルミル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−ロ
イシル−Ｌ−フェニルアラニン（fMLP）の作用と類似し
ているが、NAFが結合し、ヒト好中球の公知アゴニスト
の受容体とは異なる表面受容体により仲介される。NAF
は、ヒトリンパ球ではなく、ヒト単核白血球により培養
生産される。この生産は、刺激物質、例えば細菌性リポ
多糖類（LPS）、フィトヘマグルチニン（PHA）またはコ
ンカナバリンＡ（ConA）の存在並びに刺激物質濃度およ
びインキュベーション時間により異なる。前記生産はシ
クロヘキシミドにより阻害されるため、新たに蛋白質の
合成が要求されることを示している。

既に示した通り、単核白血球およびマクロファージ
は、多様な生物活性ペプチドおよび蛋白質の豊富な供給
源である（C.F.ネイサン、「ジャーナル・オブ・クリニ
カル・インベスティゲーション」79［1987］319−32
6）。それらは、３種の異なるサイトカイン（cytokin
e）、インターロイキン１（IL−１）、腫よう壊死因子
（TNF）およびインターフェロン−アルファ（IFN−α）
の生産体として同定されている。また単核白血球および
マクロファージが、前述のものとは異なる好中球に対し
て作用する因子を生産することを示す幾つかの報告が公
表されている。それらは好中球に対して活性を示すた
め、これらの因子についてはある程度詳細に後述する。
肺胞マクロファージが、好中球に対して走化性であり
（J.A.カスミエロフスキー等、「ジャーナル・オブ・ク
リニカル・インベスティゲーション」59［1977］273−2
81、W.W.メリル等、「ジャーナル・オブ・クリニカル・
インベスティゲーション」65［1980］268−270およびG.
W.ハニンゲイク等、「ジャーナル・オブ・クリニカル・
インベスティゲーション」66［1980］473−483）、肺に
おいて抗菌性防御を促進し得る因子を放出することが様
々な出版物において報告された。その後、これらの因子
は好中球の抗菌活性を高めることが示された（J.E.ペニ
ントン等、「ジャーナル・オブ・インフェクシャス・デ
ィジーズ」148［1983］101−109および「ジャーナル・
オブ・クリニカル・インベスティゲーション」75［198
5］1230−1237）。ゲルろ過およびクロマトフォーカシ
ング精製を行うことにより、肺胞マクロファージにより
生産され、分子量が6000および等電点が7.6であるプロ
テアーゼ感受性因子（NAFと称す）が同定された。この
因子は走化性が弱く、好中球により食された細菌の殺菌
性を高めるが、それ自体は酸素基生成も酵素放出も誘導
しないことが報告された。高い抗菌活性の似た機構は他
の研究者により報告されており（A.フェランテ等、「ク
リニカル・アンド・エクスペリメンタル・イムノロジ
ー」56［1984］559−566）、それによると、ヒト好中球
がネイグレリア・フォウレリの殺菌作用を誘導するため
には、単核白血球またはマクロファージ由来の培養培地
の添加を必要とすることが示された。LPS−刺激ヒト単
核白血球により生産されるか粒球活性化伝達物質（GRA
M）は、他の研究者（A.キャップ等、「ジャーナル・オ
ブ・インベスティゲイティブ・ダーマトロジー」86［19
86］523−528およびF.E.マリー等、「リンホカイン・リ
サーチ」５［1986］21−33）により報告された。２種の
GRAMが記載され、大きい方は見かけ上の分子量が60000
であり、小さい方は見かけ上の分子量が10000であり、
化学光が示すところでは、ヒト好中球において遅い呼吸
バースト応答を誘発するものであった。これらの因子は
熱およびトリプシンに敏感であり、それらの生産は、LP
Sによる単核白血球の刺激および、明らかに、新たな蛋
白質合成に依存している。

幾つかの報告は、好中球に対する走化活性を有する単
核白血球および／またはマクロファージに由来する因子
を記載している。「単核細胞由来ケモタキシン」（MO
C）と称する因子で、明らかにGRAMとは異なる分子量100
00のペプチドが報告された（E.コブナツキー等、「クリ
ニカル・アンド・エクスペリメンタル・イムノロジー」
64［1986］214−222）。また、LPSにより刺激されたヒ
ト血液単核白血球により生産される、分子量約10000で
等電点８−8.5の好中球走化性因子が知られていた（T.
吉村等、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」139［198
7］788−793）。最後にまた、LPSにより培養中で刺激さ
れたうさぎ腹膜マクロファージは選択的好中球走化性因
子を放出することが報告された（F.Q.クーナ等、「ジャ
ーナル・オブ・メデイカル・アンド・バイオロジカル・
リサーチ」19［1986］775−777および「ヨーロピアン・
ジャーナル・オブ・ファーマコロジー」129［1986］65
−76）。

これらの報告に含まれる生化学情報は予備的な性質で
あるため、記載されている様々な因子間の構造類似性お
よび相異に関して推測することは不可能である。

この発明に関する優先権主張日（複数もあり得る）の
後に、NAFに対応すると思われるペプチドの精製法が、
バン・デイム等により報告され（J.バン・デイム等、
「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシ
ン」167［1988］1364−1376）、レクチン刺激ヒトリン
パ球の上清から精製されたペプチドに関してNAFの配列
と同一の配列が、グレゴリー等により報告された（H.グ
レゴリー等、「バイオケミカル・アンド・バイオフィジ
カル・リサーチ・コミュニケーションズ」151［1988］8
93−890）。MDNCFをコードするcDNA（T.吉村等、「プロ
シーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステ
ーツ・オブ・アメリカ」84［1987］9233−9237）は、最
近クローン化され（K.松島等、「ジャーナル・オブ・エ
クスペリメンタル・メディシン」167［1988］1883−189
3）、３−10C cDNAに相当することが見出された（J.シ
ュミットおよびC.バイスマン、「ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー」139［1987］250−256）。シュミットおよ
びバイスマンは、３−10C cDNAによりコードされたペ
プチドが、血小板第４因子、ベータ−トロンボグロブリ
ン、結合組織活性化ペプチドIII（CTAP−III）およびイ
ンターフェロン−ガンマ−誘導ペプチド（ガンマ−IP−
10）との構造相同性を有することを示した。これらの分
子はまた、メラノーマ成長刺激特性を有する73−残基ペ
プチド（MGSA）と相同性を示し（A.リッチモンド等、EM
BOジャーナル、７［1988］2025−2033、その配列は、線
維芽細胞から分離されたgro−cDNAから誘導された配列
と近似している（A.アニソビッツ等、「プロシーディン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ
・アメリカ」84［1987］7188−7192）。また、上記蛋白
質と関連性を有し得るねずみマクロファージ由来の炎症
性蛋白質（MIP）が報告された（G.ダバテリス等、「ジ
ャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン」16
7［1988］1939−1944）。これは、RANTES、すなわちIL
−２依存性の抗原刺激ヒトＴ細胞クローンから単離され
たcDNAの8kd生成物を含むペプチドの種類の一員である
と思われる（T.J.シャール等、「ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー」141［1988］1018−1029）。これらのペプ
チドの機能は概ね未知である。MGSAおよびCTAP−III
（C.W.カスター等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ
・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」80
［1983］765−769）は、細胞分裂促進性であることが報
告され、血小板第４因子は、免疫調節作用を有すること
が示された（A.D.バロン等、「ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー」263［1988］8710−871
5）。

得られた結果は、NAFが、走化性アゴニストにより開
始される場合と似た受容体仲介プロセスにより好中球を
選択的に活性化することを示唆している。

2.発明の要旨 この発明のNAFは、先に述べた全ての受容体とは異な
る選択的受容体を介して作用することによりヒト好中球
において酸素基形成および酵素放出を誘発することが見
出された。

LPS刺激ヒト単核白血球から精製されたNAFの総アミノ
酸配列を決定し、主なNAF種をコードする遺伝子を合成
し、その天然相同体と同じ好中球活性化特性を有する組
換えペプチドとして発現させた。

すなわち、この発明は、NAFおよび天然供給源、例え
ばヒト単核白血球からその分離に関するものである。

またこの発明は、合成、特に組換えNAF並びにその製
造および発現に関するものである。

3.詳細な記載 公知配列決定方法により、NAFの完全なアミノ酸配列
を決定した。

SHメチル化およびアミノ−スクシニル化NAFの脱離後
に得られた完全蛋白質並びに定型的フラグメントT7−26
およびT27−47のエドマン分解により、47位までの配列
が得られた。75％ぎ酸による加水分解およびエドマン分
解後、20アミノ酸から成る２つのほぼ等モルの配列、次
いで20位を越えるNAFのアミノ末端配列に対応する単一
パターンが得られた。カルボキシ末端ペプチドA53−72
の配列を消去法により決定し、定型的ペプチドT61−72
の分析により確認した。カルボキシペプチダーゼＡおよ
びＢは検出可能な開裂生成物を生じないが、カルボキシ
ペプチダーゼＹにより１ナノモルNAFを処理した後、120
ピコモルのセリンが放出され、これはカルボキシ末端と
してのセリンを示している。

NAFの様々なバッチの分析により、何等かのアミノ末
端異種性が示された。上記配列は主たる成分に関するも
のである（約70％）、これが生物活性に大きく関与して
いると信じられる。さらに３種の変異型を同定すること
ができた。

すなわち、上記完全配列において、Ｎ−末端をさらに
Ala−Val−Leu−Pro−Arg−により延長した（すなわち
完全蛋白質は77アミノ酸を有する）。

すなわち、上記完全配列において、Ｎ−末端からSer
−Ala−を省くことにより短縮した（すなわち完全蛋白
質は70アミノ酸を有する）。

すなわち、上記完全配列において、Ｎ−末端からSer
−Ala−Lys−を省くことにより短縮した（すなわち完全
蛋白質は69アミノ酸を有する） これらの配列は全て、99アミノ酸から成る３−10C c
DNAから予測された配列に対して一直線に合致し得る
（J.シュミットおよびC.バイスマン、「ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー」139［1987］250−254）。主NAFペプ
チドは、３−10Cアミノ酸配列の28〜99位に対応する
が、上記３種の変異型は、その23位（配列１）、30位
（配列２）および31位（配列３）から始まる配列に対応
する。

上記配列データにより３−10C cDNAから誘導された
配列を比較すると、単核食細胞は、細胞内生成されるNA
Fの前駆体を合成することが示される。77残基ペプチド
は、それがcDNA誘導配列から22アミノ酸を有する予測さ
れたシグナルペプチドを除いた配列に相当するため、NA
Fの最大分泌形態を表し得る。主たる72残基NAF種並びに
70および69残基を有する類似体は、さらに翻訳後修飾か
ら形成され得る。

NAFの全形態は、メルカプトエタノールが阻害性であ
ることが見出されたことから活性に重要であると思われ
る鎖内ジスルフィド橋を形成することが予想される４つ
のシステイン残基を有する（P.ペベーリ等、「ジャーナ
ル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン」167［198
8］1547−1560）。ジスルフィド橋は、部分的にNAFと相
同性であるベータ−トロンボグロブリンおよび血小板第
４因子の場合と同様、７−34位および９−50位を結合す
ると思われる。

β−トロンボグロブリンとの相同性に従うと、NAFは
２つの分子内ジスルフィド橋を有する。従って、算出さ
れた分子量は、SDS−電気泳動による見かけ上の分子量
よりも明らかに高い8384.7である。

天然供給源、例えばヒト単核白血球からのNAFの製造
は収率が悪いため、大規模で複雑な精製工程が必要であ
る。

さらに優れた収率で大量にNAFを製造するためには、
合成方法、例えば完全化学合成または組換えDNA技法が
適している。また、原核生物または真核生物発現系、例
えばエシェリヒア・コリにおける発現を含む、例えば組
換えDNA方法による合成NAFの製造はこの発明の一部であ
る。また、合成NAF、すなわち合成方法、例えば組換えD
NA方法により製造されたNAFは、この発明の一部であ
る。合成NAF、例えば細菌から単離された組換えNAFは、
天然NAFと同じアミノ酸配列（複数も可）並びに同じ生
物学的特性および活性を有する。「組換えNAF」は、組
換えDNA技法により得られたNAFを意味する。

組換えDNA方法によるNAFの製造は、公知手順に従い、
すなわち対応するオリゴヌクレオチドの合成、精製およ
び結合、合成NAF遺伝子のクローニング、例えばエシェ
リヒア・コリにおける発現、最後に組換えNAFの回収お
よび精製により行なわれる。例えば、72アミノ酸NAFを
コードする遺伝子を、好ましくはコドンを最大限に活用
して合成し、次いでクローニングし、エシェリヒア・コ
リにおいて発現させる。

天然NAFに対して生じた抗血清を用いる粗細菌抽出物
のウエスタン・ブロット分析は、天然NAFと共に移動す
る単一バンドを示す。均質に精製された組換えNAFは、7
2アミノ酸天然NAFと同一のアミノおよびカルボキシ末端
配列を有する。ヒト好中球に関して試験した場合、それ
は、化学走性、細胞質ゾル遊離Ca²＋の急速な上昇、呼
吸バーストの活性化並びに特異か粒およびアズール好性
か粒内容物の放出の誘導において天然NAFと同じ活性お
よび効力を有することが見出された。

第13図は、合成NAF遺伝子の設計を示す。エシェリヒ
ア・コリでの発現を容易にするための３−10C cDNAの
コード配列における改変は明白である。３′−末端にお
いて、天然ターミネーターTAAをトリプル・ターミネー
ターTAATAATGAと置換し、BamH I部位をすぐ下流に加え
る。５′−末端において、Sph IおよびCla I部位を加え
ることにより、各々クローニングおよび発現ベクターー
の挿入を可能にする。塩基34では、ArgコドンをAGAから
CGAに変えることにより、Taq I制限部位を後の５′−末
端操作のために作成する。

ブロック的アニーリング（オリゴヌクレオチド１−
２、３−４および５−６）は、６つのオリゴヌクレオチ
ド全部の同時ライゲーションに有利な点をもたない。全
オリゴヌクレオチドの５′−ホスホリル（燐酸）化の結
果、予想されたサイズよりも大きいライゲーション生成
物が生成されるが、末端オリゴヌクレオチド（１および
６）がホスホリル化されていない場合、高分子量を有す
る生成物は248/240塩基を有する完全な遺伝子である。
この遺伝子をSph I/BamH I−切断pBS M13−中にライゲ
ーションし、エシェリヒア・コリに形質転換する。６つ
の生成したアンピシリン耐性コロニーから単離されたプ
ラスミドDNAをCla I/BamH Iにより切断すると、どの場
合も1.4％アガロース・ゲル上に237bpバンドが形成され
る。DNA配列分析は、正しい配列を含むクローンを示
す。正しいクローンから得られたCla I/BamH Iバンドを
ゲルから除去し、Trpプロモーター・ベクターpIL402（T
erm）にクローン化する。発現を高め得る手段として、
合成転写ターミネーター（実施例17参照）を、BamH I部
位においてヒトGM−CSF遺伝子の３′−末端に結合され
た前記ベクターに組み込み得る。従って、NAF遺伝子
を、プロモーターにおける転写開始部位のこのBamH I部
位およびCla I部位下流間に挿入することにより、GM−C
SF遺伝子を置き換える。生成したNAF発現プラスミド、
ｐ（NAF）−6T3を第14図に示す。

ｐ（NAF）−6T3を含むインドールアクリル酸誘導エシ
ェリヒア・コリ抽出物の銀染色およびウエスタン・ブロ
ット分析は、天然NAFと共に移動し、天然NAFに対する抗
血清と反応するペプチドの時間依存性生産を立証する。

また、上記発現システムを用いることにより、前述の
NAF変異型または他の生物活性NAFフラグメント、例えば
アミノ先端切断NAFフラグメントを製造することができ
る。

NAFの生物特性は種特異性である。ウサギにおける活
性は、ヒトにおける活性を非常に密接に反映したもので
ある。マウス、ラットおよびモルモットにおける予備試
験は明白な活性を全く示さなかった。

NAFは、局所的または全身的に、PMN（多形核細胞−好
中球）の数または活性化状態の修飾に伴うかまたはこれ
を原因とする状態の処置における使用に適している。NA
FはこれらのPMNパラメーターを広範に修飾するため、PM
Nの数または活性化状態が上昇すると臨床的改善が為さ
れる状態、例えば細菌、マイコプラズマ、酵母および真
菌およびウイルス感染症の処置における使用に適してい
る。さらにNAFは、炎症性疾患、例えば乾せん、関節炎
状態およびぜん息、または異常に低い好中球数および／
または全身的に低い好中球レベルの状態、並びにこれら
の適応症に使用されるきっ抗物質の製造での使用に適し
ている。

4.図面の説明 第１図:LPSにより誘導されるNAF産生： 実施例１の記載に従い分離された単核細胞を24ウェル
の培養プレートに播種し（1ml中５×10⁶細胞）、指示濃
度のLPSにより刺激する。様々な時間間隔で培地を集
め、遠心分離（20000rpm、20分間、４℃）により透明に
し、NAF活性を測定する。単一ドナーから得られた細
胞、デュプリケイト培養の平均。これらの結果は、異な
るドナーの細胞を用いた４つの類似実験の代表値であ
る。

第２図：リンパ球ではなく単核食細胞によるNAFの産
生： ａ）総単核細胞フラクション（●，■,5×10⁶細胞/m
l）およびそこから誘導された付着細胞（○，□）を100
ngのLPSの存在下（●，○）および非存在下（■，□）
に24時間培養する。

ｂ）水ひにより精製された単核白血球（○,10⁶細胞/m
l）およびリンパ球（△,4×10⁶細胞/ml）を100ngのLPS
の存在下で培養する。

グラフは、各々２回繰り返された５（ａ）および６
（ｂ）独立実験から得られたエラスターゼ放出の平均相
対値を表す。パネルａにおける●およびパネルｂにおけ
る○の24時間値を1.0に換算し、それに対応する他の値
（平均±標準偏差）を計算することにより、データを規
格化する。一方ではNAF生産における個々の変動および
他方ではNAFの試験に使用される好中球の応答性におけ
る個々の変動を説明するために、このタイプの表示形式
が選ばれる。

第３図：ホスホセルロース・クロマトグラフィーによ
るNAFの部分精製： 蛋白質 NAF（○）およびIL−１（△）の分布を示す。最高のNAF
活性を有するフラクションを指示通りプールする。

第４図:HPLCゲルろ過によるNAFの精製： ａ）蛋白質（280nmでの吸光度）の分布および分子量
マーカーの溶離時間（矢印:1＝分子量66200、２＝分子
量42700、３＝分子量21500、４＝分子量6500および５＝
分子量1255）。

ｂ）NAF活性のプロフィール。

第５図：ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィ
ーによるNAFの精製： 部分精製NAFを低塩濃度でカラムに仕込み、次いで１
モルNaCl含有緩衝液により溶離する。棒線はNAF活性を
示す。

第６図：ヘパリン−セファロース・クロマトグラフィ
ーによるNAFの精製： 部分精製NAFを低塩濃度でカラムに仕込み、次いで1.5
モルNaCl含有緩衝液により溶離する。棒線はNAF活性を
示す。

第７図:C4カラム逆相HPLCによるNAFの精製： ａ）精製NAFを0.1％トリフルオロ酢酸中RPカラムに充
填する。カラムは、0.1％トリフルオロ酢酸中アセトニ
トリルの一次勾配により展開される。

ｂ）棒線はNAF活性を示す。

第８図:CN−プロピル・カラム逆相HPLCによるNAFの精
製： ａ）精製NAFを0.1％トリフルオロ酢酸中ベーカーボン
ドCN−プロピル・カラムに充填する。カラムは、0.1％
トリフルオロ酢酸中ｎ−プロパノールの一次勾配により
展開される。

ｂ）棒線はNAFを示す。

第９図：クロマトフォーカシングによるNAFの精製： 部分精製NAFをクロマトフォーカシング・カラムに仕
込む。カラムをポリバファー96−HCl、pH7.0により展開
する。フラクションをNAF活性 について試験する。

第10図：部分精製NAFに対する呼吸バースト応答： ａ）スーパーオキサイドの生成：好中球（３×10⁶/m
l）を37゜で２分間１μｍのPAFの存在下または非存在下
にプレインキュベーションし、次いで増量のNAFにより
刺激する。NAF添加後のチトクロムｃ還元の記録を示
す。

ｂ）H₂O₂−依存性化学光：部分精製NAF並びにほぼ等
活性濃度のC5aおよびfMLPによる刺激後のプログレス曲
線を左方に示す。応答の初期相を右方に詳しく示す。刺
激物質を50μのPBS−BSA中で加える。

第11図:NAFおよびC5a間の識別： C5aおよびNAFを新鮮なヒト血清またはPBSと15分間イ
ンキュベーションし、調製物の活性（スーパーオキサイ
ド生成）を測定する。

ａ）PBS中C5a、 ｂ）血清中C5a、 ｃ）血清単独、 ｄ）PBS中NAF、 ｅ）血清中NAF。

第12図：部分精製NAF、C5aおよびfMLPによる連続刺激
に応じたスーパーオキサイド形成： ａ）好中球（３×10⁶/ml）を37℃で５分間プレインキ
ュベーションし、次いで（矢印で）示した種々のアゴニ
ストにより刺激する。

ｂ）NAFおよびC5aによる連続または反復刺激。ａ）の
場合と同様の条件。

矢印は示されたアゴニストの添加を示す。C5aの濃度
は、ａ）では0.5ナノモルおよびｂ）では0.2ナノモルで
あり、fMLPの濃度は、両実験共20ナノモルである。アゴ
ニストを50μのPBS−BSA中で加える。

第13図：合成NAF遺伝子のヌクレオチド配列： 遺伝子構築に使用される単一オリゴヌクレオチド、ON
−１〜ON−６を破線で示す。（下線）ヌクレオチド数
は、２本鎖の右側上部に記載されている。主形態の対応
するペプチド配列に、アミノ末端（Ser）から始めて番
号を付す。Cla IおよびBamH I制限部位を２本鎖上部に
示す。また、アルギニン・コドンのＡをＣで置換するこ
とにより作成されたTaq I部位を示す。

第14図：発現ベクターｐ（NAF）−6T3: A^R＝アンピシリン耐性遺伝子 Trp P/O＝トリプトファン・プロモーター Ｔ＝合成転写ターミネーター 第15図：天然および組換えNAFの同定： 上のグラフ：天然（左）および組換え（右）NAFによ
り誘発された細胞質ゾル遊離Ca²＋変化。好中球（４×1
0⁶細胞/ml）を0.1ナノモルquin−2/AMと共に負荷し、次
いで３ナノモルNAF（マーク）により刺激する。V.フォ
ン・チャーナー等、「ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー」261（1986）10163−10168頁の記載
に従い、quin−２の飽和度の変化を測定する。

下のグラフ：天然（左）および組換え（右）NAFによ
り誘発された呼吸バースト。好中球（10⁶細胞/ml）を
３、10および30ナノモルのNAFにより０時点で刺激し、
過酸化水素生成を化学発光により測定する（M.P.ワイマ
ン等、「アナリティカル・バイオケミストリー」165［1
987］371−378）。

第16図：皮膚部位への血しょうしん出： NAFまたはエンドトキシンの皮内注射後、 持続時間:4時間、 ３匹のウサギの平均±平均応答の標準誤差。

第17図：皮膚部位における好中球蓄積： 第16図でプロットされた応答との同時測定。

第18図：好中球蓄積に対するポリミキシンＢの作用： NAF（10−^９モル／部位）、fMLP（10−^９モル／部
位）またはエンドトキシン（10−¹³モル／部位）の皮内
注射後、 ポリミキシンB:40μg/部位、 持続時間:2時間、 ３匹のウサギの平均±平均応答の標準誤差。

第19図：好中球蓄積に対するアクチノマイシンＤの作
用： NAF（10−^９モル／部位）、fMLP（10−^９モル／部
位）またはエンドトキシン（10−¹³モル／部位）による
皮膚部位の刺激後、 持続時間:2時間、 ３匹のウサギの平均±平均応答の標準誤差。

5.実施例 以下、実施例によりこの発明を説明する。温度は全て
摂氏である。次の省略形を用いる。

PHA:フィトヘマグルチニン。

ConA:コンカナバリンＡ。

LPS:エシェリヒア・コリ・リポ多糖類。

BSA:うし血清アルブミン。

fMLP:N−ホルミル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−ロイシル−
Ｌ−フェニルアラニン。

PAF:1−Ｏ−ヘキサデシル−２−Ｏ−アセチル−sn−
グリセロ−３−ホスホコリン（血小板活性化因子）。

MEM:イーグル最小必須培地（ゼローメド・ゲゼルシャ
フト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング、ミュン
ヘン、西ドイツ国）、25μg/mlネオマイシンによる補
足、25ミリモルNaHCO₃および20ミリモルHEPESによりpH
7.4に緩衝。

MEM−PPL:上と同様、ただし、さらに１％の低温殺菌
血しょう蛋白質溶液（５％PPL−SRK、スイス・レッド・
クロス・ラボラトリー、ベルン、スイス国）および100I
U/mlペニシリンおよびストレプトマイシン（ギブコ・ア
クチエン・ゲゼルシャフト、バーゼル、スイス国）を含
有。

PBS:Ca²＋およびMg²＋不含有燐酸緩衝食塩水（137ミ
リモルNaCl、2.7ミリモルKCl、8.1ミリモルNaH₂PO₄およ
び1.5ミリモルKH₂PO₄、pH7.4に調節）。

PBS−BSA:0.9ミリモルCaCl₂、0.49ミリモルMgCl₂およ
び2.5mg/mlBSAにより補足したPBS。

HEPES:N−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−
２−エタンスルホン酸。

PPL−SRK:血しょう蛋白質溶液（スイス・レッド・ク
ロス）。

NAF:好中球活性化因子または蛋白質。

CX:シクロヘキシミド。

IL−1:インターロイキン−１。

SOD:スーパーオキサイド。

C5a:アナフィラトキシン。

CPC:制御多孔質ガラス。

PAGE:ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動。

GM−CSF:か粒球−マクロファージ・コロニー−刺激因
子。

CB:サイトカラシンＢ（５μg/ml）。

MES:2−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸。

HPLC:高速液体クロマトグラフィー。

SDS:ドデシル硫酸ナトリウム。

第１部：ヒト単核白血球によるNAF産生。

実施例１ LPSにより刺激されたヒト単核白血球によるNAFの産生。

ヒト単核白血球を、ドナー血液（スイス・レッド・ク
ロス・ラボラトリー、ベルン、スイス国）の軟膜からフ
ィコル−パーク勾配による遠心分離により単離する。こ
の方法は、いわゆる単核細胞、すなわち単核白血球（約
20％）およびリンパ球（約80％）の混合物から好中球を
分離するものである。３種の単核白血球調製物、すなわ
ち（ｉ）全単核細胞フラクション、（ii）付着により単
核細胞フラクションから濃化された単核白血球、および
（iii）遠心水はによりリンパ球から分離された90％純
度の単核白血球を使用する（G.ガロッタ等、「バイオケ
ミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュ
ニケーションズ」140［1986］948−954およびK.J.クレ
メッツォン等、「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタ
ル・メディシン」161［1985］972−983）。細胞をMEM−
PPL中で培養し、濃度の高めた（0.1ng〜１μg/ml）LPS
により刺激する。異なる時点で、培養培地のアリコート
試料を採取し、サイトカラシンＢにより前処理されたヒ
ト好中球からのエラスターゼ放出誘導能としてNAF活性
を測定する（B.デュウォルド等、「バイオケミカル・フ
ァーマコロジー」36［1987］2505−2510）。

約1:5の比率での単核白血球およびリンパ球から成る
単核細胞培養（５×10⁶細胞/ml）は、LPS（100ng/ml）
により刺激されるとNAFを生産する。NAFは24時間にわた
り培地に蓄積し、生産量は24時間ないし48時間の間に横
這い状態になる。刺激物質の非存在下ではNAFは全く形
成されない。第１図は、既に0.1ng/mlおよび1ng/mlの間
で活性を示しているLPSの時間経過および濃度依存性を
示す。

様々な単核細胞調製物を用いてNAFの供給源を試験す
る。第2a図は、全単核細胞フラクションおよびそこから
付着により選択された単核白血球によるNAFのLPS−依存
生産性を示す。これらの結果は、NAF生成がLPSに依存し
ていることを確認し、NAFが単核白血球により生成され
ることを示す。リンパ球の存在は、NAFの生産量に影響
するとは思われない。水はにより精製された単核白血球
およびリンパ球を用いても同様の結果が得られる。第2b
図に示された通り、NAFはリンパ球ではなく単核白血球
により生成される。

実施例２ PHAまたはConAにより刺激されたヒト単核白血球によるN
AFの産生。

実施例１の記載に従いヒト血液軟膜から分離された単
核細胞フラクションを、実施例１で概略を示した条件下
で培養し、PHA（５μg/ml）またはConA（10μg/ml）に
より刺激する。NAF生産の時間経過は、100ng/mlのLPSに
より刺激された単核細胞により観察された時間経過と類
似している。約24時間後、最大値に到達する。

実施例３ シクロヘキシミドによるNAF生成の阻害。

NAFが、刺激物質濃度により異なるにせよ、単核白血
球の刺激直後には放出されず、数時間内に放出されると
いう事実は、新たな蛋白質合成が要求されること、およ
びNAF産生が現実には刺激物質により誘発されることを
示唆している。蛋白質合成の必要条件は、シクロヘキシ
ミドの添加によりNAF生成が阻害される実験により立証
される。代表的実験の結果を第１表に示す。

シクロヘキシミド（CX、10μg/ml）をLPS（100ng/m
l）の４または８時間後に加える。活性を、エラスター
ゼ放出を表す蛍光単位で示す。

第２部:NAF精製 実施例４ ホスホセルロース・クロマトグラフィーによるNAFおよ
びIL−１の分離。

実施例１の記載に従いドナー血液軟膜から得られた単
核細胞を、撹はん培養瓶中（1.5、５×10⁶細胞/m
l）、100ng/mlのLPSの存在下にMEM−PPL中で48時間培養
する。次いで、培養上清を集め、４゜で20分間20000rpm
で遠心分離することにより、粒状物質を除去し、20ミリ
モルNaClおよび５％グリセリンを含有する20ミリモル燐
酸カリウム緩衝液、pH7.2により平衡状態にした10mlホ
スホセルロース・カラム（ワットマンP11、1.4×6cm）
に負荷する。カラムを上記緩衝液30mlにより洗浄し、次
に同緩衝液中、直線NaCl濃度勾配（0.02モル〜1.5モ
ル）90mlにより溶離する。2mlのフラクションを0.1％ポ
リエチレングリコール中で集め、NAFおよびIL−１活性
について試験する。280nmでの吸光度を蛋白質の尺度と
して継続的にモニターする。

第３図は、蛋白質の分布プロフィール（280nmでの吸
光度）並びに２種の生物活性、すなわち、NAF活性の尺
度としてのエラスターゼ放出およびIL−１活性の尺度と
しての胸腺細胞増殖を示す。大部分の蛋白質およびIL−
１活性は、フルー−スルー容積で回収される。直線NaCl
勾配により溶離すると、低イオン強度でIL−１活性が得
られ、次いでNAFに対応するエラスターゼ放出活性のピ
ークが得られる。これは、0.5モルで溶離し始め、0.8モ
ルNaClでその最大値に到達する。ピークは対称であり、
小さな肩が先行する。UV−吸収材料の中には塩勾配によ
り溶離されるものもある。しかしながら、そのプロフィ
ールは、測定された生物学的活性とは一致しない。第３
図で示す通り、IL−１およびNAFは完全に分離され得
る。IL−１と関連のあるエラスターゼ放出活性も、NAF
と関連のある胸腺細胞増殖誘発活性も存在しない。分画
化後のNAFの収率はほぼ100％であり、培地が阻害剤また
は活性剤を含まないことを示している。

実施例５ ゲルろ過によるNAFの精製。

ホスホセルロース・クロマトグラフィー（実施例４）
により部分精製されたNAF200μの試料を、TSK−GSWP
プレカラム（7.5×75mm）付HPLC TSK−G2000SWカラム
（7.5×600mm）に適用する。100ミリモルNaClを含む100
ミリモルNaHPO₄、pH7.0中、カラムから0.5ml/分の速度
で溶出させる。うし血清アルブミン（分子量66200）、
卵アルブミン（分子量42700）、大豆トリプシン阻害剤
（分子量21500）、アプロチニン（分子量6500）および
アクチノマイシンＤ（分子量1255）を測定標準として使
用する。NAFは、アプロチニンの直後およびアクチノマ
イシンＤのかなり上に僅かな非対称ピークを伴って溶離
する。従って、NAFの見かけ上の分子量は約6500であ
る。NAF活性は、記されたピークの前または後には溶離
されない（第４図）。

実施例６ ヒドロキシアパタイトによるNAFの精製。

15mlの総容量（約800mlの非分画化培養上清に相当）
でホスホセルロース・クロマトグラフィー（実施例４）
から得られたフラクションのプールを、充填緩衝剤（0.
1％ポリエチレングリコール6000中10ミリモルの燐酸ナ
トリウム、pH6.9）により1:10に希釈し、充填緩衝液中
平衡状態である3mlヒドロキシアパタイト・カラム（バ
イオゲルHTP）に注入する。カラムを3ml分量の充填緩衝
剤により３回洗浄し、次いで１モルNaClを補った充填緩
衝液により溶離する。この手順により、NAFはカラムか
ら回収される。続いて0.5モル燐酸ナトリウム緩衝液、p
H6.9により溶離してもそれ以上NAF活性は得られない
（第５図）。

実施例７ ヘパリン−セファロースによるNAFの精製。

ホスホセルロース・クロマトグラフィー（実施例４）
により部分精製されたNAF1mlの試料を、0.1％ポリエチ
レングリコール6000および50ミリモルNaClを補った10ミ
リモル燐酸ナトリウム、pH7.3において平衡状態に達し
たヘパリン−セファロース4Bの0.5mlカラムに注入す
る。カラムを同緩衝液で洗浄し、次いで1.5モルNaClを
補った10ミリモル燐酸ナトリウム、pH7.3で溶離する。
カラム洗浄後、少量のNAFがフロー−スルー流体中に検
出されるが、カラムに結合した活性の大部分は、さらに
高いイオン強度の緩衝液により溶離される（第６図）。

実施例８ C4カラム逆相高圧液体クロマトグラフィーによるNAFの
精製。

ホスホセルロース・クロマトグラフィー（実施例
４）、次いでヒドロキシアパタイト精製（実施例６）に
より精製されたNAFの試料を、広孔逆相C4カラム（バイ
オラッドRP304）に適用する。0.66％／分の割合で増加
させながら、0.1％トリフルオロ酢酸中０〜80％アセト
ニトリルの勾配によりカラムを溶離する。流速は0.5ml/
分である。フラクションを集め、真空乾燥する。残留物
を0.1％ポリエチレングリコール6000含有PBS100μに
再懸濁し、NAF活性について試験する。NAFは約60分の保
持時間で溶離し、単一の鋭いピークとして約40％アセト
ニトリルに対応する（第７図）。

実施例９ CN−プロピル・カラム逆相高圧液体クロマトグラフィー
によるNAFの精製。

実施例８記載の逆相クロマトグラフィーにより精製
し、真空乾燥した、0.1％ポリエチレングリコール含有P
BS100μに再懸濁したNAFの試料を、１倍容量の0.1％
トリフルオロ酢酸により希釈し、ベーカーボンド広孔シ
アノ（CN）−プロピル・カラム（ベーカー・リサーチ・
プロダクツ、フィリップスバーグ、ニュージャージー、
アメリカ合衆国）に適用する。0.41％/mlの割合で増加
させながら、0.1％トリフルオロ酢酸中０から50％への
ｎ−プロパノール勾配によりカラムを溶離する。流速は
0.5ml/分である。フラクションを集め、真空乾燥する。
残留物を0.1％ポリエチレングリコール6000含有燐酸緩
衝食塩水100μに再懸濁し、NAF活性について試験す
る。NAFは２つの鋭いピークで溶離する。これらのピー
クの大きい方は、53分の保持時間で22％のｎ−プロパノ
ールに対応し、全活性の30％に満たない小さい方のピー
クは、66分の保持時間で27.5％のｎ−プロパノールに対
応する（第８図）。

実施例10 NAFのクロマトフォーカシング。

ホスホセルロース・クロマトグラフィー（実施例４）
により部分精製したNAF4mlの試料を、25ミリモルのエタ
ノールアミン−HCl、pH9.4および0.1％ポリエチレング
リコール6000から成る出発緩衝液に対して透析し、同緩
衝液により平衡状態に達しているPBE94カラム（0.7×19
cm、ファルマシア）に注入する。次に、カラムを200ml
の0.1％ポリエチレングリコール6000含有ポリバファー9
6−HCl（水で1:10に希釈）、pH7.0により溶離する。10
分フラクションを10−14ml/時の流速で集め、NAF活性に
ついて測定する。活性の大部分はpH8.5〜pH8.8の領域で
溶離する（第９図）。

第３部:NAFの物理化学的および生物学的特性検定。

実施例11 NAFの物理化学特性。

ホスホセルロース・クロマトグラフィー（実施例４）
により得られた部分精製NAFをこれらの実験において使
用する。ホスホセルロース・クロマトグラフィー後、最
高のNAF活性を有するフラクションを、分子量カットオ
フが1000ダルトンである膜を用いて４゜で一夜PBSに対
して透析する。次いで、得られた調製物に対し、次の処
理を行う。すなわち、ａ）トリプシン、キモトリプシン
またはプロテイナーゼＫ（100μg/ml）の存在下および
非存在下37゜でインキュベーションし、次いで過剰のBS
A（2mg/ml）を添加することによりNAFの蛋白質加水分解
を止める、ｂ）56゜、80゜または95゜に加熱する（対照
の場合の22゜と比較）、ｃ）pH2または10（22゜で）に
暴露し、次いでpH7.4に調節する（対照のpH7.4と比
較）、ｄ）２モルの塩化リチウム、６モルのグアニジウ
ムクロリド、１％の２−メルカプトエタノールまたは0.
5％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）に３時間22゜で暴
露し、次いでPBSに対して４゜で24時間透析する。添加
を行うとき、NAF不含有試料を同様に操作し、NAF検定に
及ぼし得る影響について試験する。

第２表に示す通り、NAFは不活化に著しい抵抗を示
す。その活性は、種々のプロテアーゼとのインキュベー
ション後に破壊され、NAFがポリペプチドであることを
示している。反対に、NAFは、加熱、酸およびアルカリp
H条件またはSDS暴露によって容易には不活化されない。
２−メルカプトエタノール、塩化リチウムおよびグアニ
ジウムクロリドによりある程度不活化は達成される。

実施例12 NAF誘発エキソサイトーシス（ヒト好中球でのNAFによる
か粒放出の誘発）。

PBS/BSAに懸濁した好中球（５×10⁶/ml）を、37゜で
５分間サイトカラシンＢ（５μg/ml）の存在下または非
存在下にプレインキュベーションする。次いで、刺激物
質、例えばNAFまたは標準刺激物質を加えることにより
か粒放出を開始させる。氷中で急速冷却することにより
15分後に反応を止め、次に遠心分離により細胞を沈澱さ
せる。ビタミンB12結合蛋白質、β−グルクロニダーゼ
および乳酸デヒドロゲナーゼを細胞不含有培地および細
胞沈澱物において測定し、これらの成分の放出を全細胞
成分のパーセントとして計算する（B.デュウォルトおよ
びM.バッジョリーニ、「メソッズ・イン・エンザイモロ
ジー」132［1986］267）。

ビタミンB12結合蛋白質およびβ−グルクロニダーゼ
（各々、特異か粒およびアズール好性か粒の成分であ
る）の放出に対するNAFの作用を第３表に要約する。

正常な好中球において、NAFは特異か粒のみのエキソ
サイトーシスを誘発する。しかしながら、細胞をサイト
カラシンＢで前処理すると、両タイプのか粒からの充分
な放出が達成される。後者の条件下において、β−グル
クロニダーゼの放出は、NAF活性の試験に使用されるマ
ーカーである（実施例１）、エラスターゼの放出と平行
している。量的な点では、NAFのエキソサイトーシス誘
発特性は、走化性ペプチドfMLPの場合と類似している。
いずれの刺激物質も細胞質ゾル酵素、乳酸デヒドロゲナ
ーゼの放出を誘発せず、細胞障害がごく僅かであること
を示している。

実施例13 NAF誘発呼吸バースト（ヒト好中球でのNAFによるスーパ
ーオキサイド形成の誘発）。

フェリチトクロムｃのSOD感受性還元として、スーパ
ーオキサイド形成を37゜で測定する（M.マーケート等、
「メソッズ・イン・エンザイモロジー」132［1984］26
7）。検定混合物（800μ）は、85マイクロモルのチト
クロムｃを含む、0.75×10⁶細胞/mlのPBS−BSAにより構
成される。サーモスタット式７プレート・キュベット交
換器を備えたヒューレット−パッカード8451A二極管配
列分光光度計において、吸光度変化を記録する。第４表
は、ヒト好中球におけるNAFの呼吸バースト誘発能を示
す。

スーパーオキサイド生成の最大速度および合計量の漸
増は、NAF量を増すことにより達成される。比較実験が
示し得る通り、最大レベルのスーパーオキサイド生成を
誘発するNAFの量は、最大エキソサイトーシス誘発量に
対応する。

実施例14 H₂O₂形成（ヒト好中球における呼吸バーストの刺激物質
としてのNAFとfMLPおよびC5aとの比較）。

刺激された細胞によるスーパーオキサイドまたは過酸
化水素の生成を評価することにより、呼吸バースト刺激
物質としてのNAF、fMLPおよびC5aの特性を比較する。実
施例13の記載に従いスーパーオキサイド生成を測定す
る。化学発光により過酸化水素形成を測定する（M.P.ワ
イマン等、「アナリティカル・バイオケミストリー」16
5［1987］371−378）。0.1Mナトリウムアジド、0.01mM
ルミノール、9U/ml西洋わさびペルオキシダーゼおよび1
0⁶好中球を含むPBS−BSAから成る検定混合物を37゜で10
分間プレインキュベーションし、小型注射器で刺激物質
を加えることにより反応を開始させる。

第10図は、NAFの量を増すことにより誘発されるスー
パーオキサイド形成を示す。その開始が急速で、速度が
高く、早く横這い状態になることから、NAFに対する応
答は、fMLPまたはC5aにより誘発される応答と近似して
いる。NAFに対する応答は、PAFによる細胞の前処理によ
り著しく高められ（第10図）、またこの前処理によって
fMLPまたはC5aにより誘発されるスーパーオキサイド生
成も高められる。NAF、fMLPおよびC5aに対する応答の直
接比較を第９図に示す。H₂O₂形成速度対時間の化学発光
記録は、応答の類似性を強調している。さらに、これら
の測定および他の測定結果は、fMLP、C5a、PAFおよびロ
イコトリエンB₄に関する先の報告によると、刺激物質添
加およびNAF、fMLPおよびC5aによる誘発されるH₂O₂生成
の開始の間の時間が同一であり、約２秒後に達すること
を示している（M.P.ワイマン等、「ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー」262［1987］12048）。
NAF、fMLPおよびC5aに対する好中球応答の定性的および
定量的類似性は、NAFが表示受容体への結合により好中
球を活性化し、受容体アゴニストのように作用すること
を示す。

実施例15 NAFおよびC5a間の区別。

実施例14で報告した通り、ヒト好中球に対するNAF活
性のプロフィールはC5aの場合と似ている。これら２種
のペプチド間の類似性は、さらに物理化学特性、例えば
熱および酸に対する耐性を識別する場合にも当てはま
る。C5aおよびNAFは好中球に対して似た作用を有するた
め、これら２つを完全に区別するためにはさらに別の実
験を行わなければならない。NAFおよびC5aの試料を新鮮
なヒト血清に暴露する。この処理は、カルボキシペプチ
ダーゼによる開裂によりC5aをその比較的不活性のデス
−アルギニル誘導体に変換することが知られている。第
11図に示す通り、血清処理は完全にC5aの活性を破壊す
るが、NAFの活性には何等影響を与えない。これは、こ
れら２種の薬剤が構造的に異なることを示す。

実施例16 NAFが好中球にそれ自体の特異的受容体を有している証
拠。

同量の同じ受容体アゴニスト（例、fMLP）により好中
球を２回刺激し、スーパーオキサイド生成を好中球応答
の尺度として記録した場合、第２の刺激は事実上不活性
である。他方、異なる受容体に作用するアゴニストを連
続して用いた場合（例、fMLP、次いでC5a）、これらの
刺激により通常の応答が得られる。従って、このタイプ
の実験を用いることにより、NAFがそれ自体の受容体に
より作用するのか、他のアゴニストによっても使用され
る受容体により作用するのかを判断する。

第12a図は、NAFまたはC5aによる初回攻撃後、好中球
がfMLPに対し正常応答することを示す。第12b図では、N
AFおよびC5aによる反復刺激の結果を示す。まず、同量
のスーパーオキサイド生成誘発濃度のNAFおよびC5aによ
り細胞を刺激し、次に、同じかまたは代替的刺激物質に
より刺激する。同じアゴニストを２回適用した場合、細
胞は第２刺激には反応しない。逆に、NAFにより初回攻
撃された細胞ではC5aに対する正常応答が得られ、C5aに
より初回攻撃された細胞ではNAFに対する正常応答が得
られる。好中球はいずれかの刺激に対する完全な脱感作
性は示すが交差脱感作性は示さないことから、NAFおよ
びC5aは、非関連受容体によりそれらの刺激効果を発揮
すると思われ、それらが構造的に異なることを示す。ま
た、NAFとPAF、fMLPおよびロイコトリエンB₄との組み合
わせは交差脱感作性を示し得ない。従って、NAFは選択
的で現在まで未知の受容体を介して作用する。

実施例17 ウサギにおけるNAFにより誘発される好中球蓄積および
血しょうしん出。

意識のある2.0〜2.5kgニュージーランド産アルビノ・
ウサギの皮膚において炎症反応を試験する。ドナーのウ
サギから採取した血液中の赤血球を、ヒドロキシエチル
セルロース（ポリサイエンシーズ、ウォーリントン、ペ
ンシルバニア）により沈降させ、生成した白血球濃化血
しょう中の好中球を、パーコール（ファルマシア、ウプ
サラ、スエーデン）密度勾配遠心分離により精製する
（＞94％好中球）。10％低血小板血しょうを含むCa²＋
およびMg²＋不含有タイロード溶液に細胞を再懸濁して1
0⁶白血球/mlの濃度とし、10⁶細胞当たり40μCi¹¹¹イン
ジウム−オキシン（アマーシャム）により室温で15分間
標識する。標識細胞を10％低血小板血しょうによる遠心
分離により洗浄し、１容器当たり約10⁶細胞を10μCi¹²⁵
ヨウ素標識ヒト血清アルブミン（アマーシャム）と混合
し、試験下の炎症病変部を有するウサギの後部耳静脈に
静脈内注射を行う。次いで、炎症剤の皮内注射を行い、
アクチノマイシンＤおよびポリミキシンＢによる試験で
は２時間後、および用量応答試験では４時間後に動物を
殺す。放射能標識細胞が循環している期間の中途で、血
液試料を集め、好中球および血しょうの血中比活性を測
定する。各実験の最後に炎症病変部における放射能をマ
ルチチャンネル・ガンマ・カウンターで測定し、対照皮
膚部位の活性を控除し、炎症病変部に蓄積している好中
球の絶対数および血しょうの体積を比活性から算出す
る。チブルスキー等の方法（「アメリカン・ジャーナル
・オブ・パソロジー」124［1986］367）に従い、末梢血
液1mlにつき循環している10⁶好中球当たりの細胞数とし
て結果を表すことにより、炎症病変部の好中球数を動物
間で標準化する。

実施例19の記載に従い得られた組換えNAFを、400μg/
mlの割合で0.45モルNaCl（pH6.5）含有最小必須培地（5
0ミリモル）に溶解する。エンドトキシン（エシェリヒ
ア・コリ血清型O55:B5、シグマ、セントルイス、ミズー
リ）を発熱物質不含有規定食塩水に溶かす。fMLPをジメ
チルスルホキシドに溶かし（10−２モル）、PFS中作業
濃度に希釈する。ポリミキシンＢおよびアクチノマイシ
ンＤを1mlのエタノールに溶かし、PFS中NAF、エンドト
キシンまたはfMLPと混合することにより20倍に希釈す
る。炎症応答阻害試験では、40μｇのポリミキシンＢお
よび10−^７モルのアクチノマイシンＤを、皮膚部位当た
り10−^６モルのエンドトキシンと共に皮膚部位に注射す
る。全実験において、１部位当たり0.2mlの炎症剤を26
ゲージ針により皮内注射し、各動物において各処理を５
回反復する。

NAFは、試験用量範囲（１部位当たり10−¹¹〜10−^９
モル）において血しょうしん出（第16図）および好中球
蓄積（第17図）における用量依存性増加を誘発する。比
較した場合、エンドトキシンは、１部位当たり10−¹³モ
ルで同等の強度の血しょうしん出（第16図）および好中
球蓄積（第17図）を誘発する。５匹のウサギにおいて、
NAFは、血しょうしん出および好中球蓄積に対する刺激
物質としてfMLPよりも３〜10倍効力が強い。NAFを溶か
すのに使用される緩衝液を、１部位当たり10−^９モルを
送達する溶液中に存在する濃度に希釈することにより誘
発される好中球蓄積は、PFSのみ与えられた部位におけ
る応答とは異ならない。NAF調製物の活性がエンドトキ
シン汚染物質に起因し得るという可能性を、NAF、fMLP
またはエンドトキシンと一緒にポリミキシンＢ（40μg/
部位）を注射することにより試験する。ポリミキシンＢ
は、エンドトキシン（10−¹³モル）に対する応答の84％
阻害を誘発するが、NAF（10−９モル）またはfMLP（10
−^９モル）により誘発される好中球蓄積については影響
を及ぼさない（第18図）。

RNA転写の非可逆的阻害剤、アクチノマイシンＤ（10
−^７モル／部位）を10−¹³モルのエンドトキシンと一緒
に注射すると、好中球蓄積の90％阻害が誘発される（第
19図）。反対にアクチノマイシンＤは、NAF（10−^９モ
ル）またはfMLP（10−^９モル）により誘発される好中球
蓄積に対して影響を与えない（第19図）。

結果は、NAFがインビボ活性であり、好中球の用量依
存性蓄積および炎症病変部への血しょうのしん出を誘発
することを示している。NAFのモル効力は、古典的走化
性物質C5aおよびLTBと同等であり、fMLPよりも３〜５倍
高い。NAFにより誘発される好中球蓄積は、蛋白質合成
阻害剤（アクチノマイシンＤ）の同時皮内注射により阻
害されない。すなわち、NAFは、エンドトキシンとは異
なるが、走化性アゴニスト、例えばfMLPと同様に直接作
用する。

実施例18 NAF誘発エキソサイトーシス（ウサギ好中球に対する作
用）。

ウサギ好中球を、デキストラン沈降、次いでハイパー
ク−フィコル密度勾配遠心分離により末梢血液（耳静脈
または動脈から得られた）から分離する。精製天然NAF
を使用する。

エキソサイトーシス条件:37゜で５分間サイトカラシ
ンＢにより前処理された0.6×10⁶細胞（0.15mlの全体積
中）をNAF（0.1−100ナノモル）またはfMLP（100ナノモ
ル）により15分間刺激する。Ｎ−アセチル−β−グルコ
サミニダーゼ、すなわちアズール好性か粒マーカーを細
胞不含有培地において測定する。結果を第５表に示す。

第４部：組換えNAF 実施例19 エシェリヒア・コリにおけるNAFの合成および発現。

ａ）オリゴヌクレオチド合成および精製。

オリゴヌクレオチドON−１〜ON−６（第13図参照）
を、固体支持体、例えばフラクトシル・シリカゲルまた
は制御多孔質ガラス（CPG）上、モノマーとして３′−
β−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホアミド
化ヌクレオシドとの標準化学作用を用いた自動式DNAシ
ンセサイザーにおいて合成する（S.L.ビューケージおよ
びM.H.カルサーズ、「テトラヘドロン・レターズ」22
［1981］1859、N.D.ジーナ等、「ヌクレイック・アシッ
ズ・リサーチ」12［1984］4539）。

脱トリチル化材料を、室温で25％アンモニアによる２
時間処理により支持体から分離し、アンモニア含有溶液
を20時間55゜に加熱することにより保護基を全て脱離さ
せ、生成物を凍結乾燥する。20V/cmで12％アクリルアミ
ド、0.3％ビスアクリルアミド。７モル尿素、0.089モル
のトリス−ボラート、0.089モルほう酸、0.002モルEDTE
を用いたポリアクリルアミド−ゲル電気泳動（PAGE）に
より粗材料の分離を行う。蛍光シリカゲル・プレートに
おける紫外線シャドウイングにより完全長のオリゴヌク
レオチドを配置させ、ゲル部分を取り除き、溶離チャン
バにおいて電気溶離する。濃縮溶液を、バイオゲルP2カ
ラム（30×0.9cm）において10％エタノールで溶離する
ことにより脱塩し、凍結乾燥する。ON−１〜ON−６の試
料を³²P−γ−ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼによ
り放射能標識する。PAGEによる分析およびオートラジオ
グラフィーにより、それらが均一であることが確認され
る。修飾ろ紙上に固定したオリゴヌクレオチドのマクサ
ム−ギルバート配列決定法により正しい配列を確認する
（A.ローゼンタール等、「ヌクレイック・アシッズ・リ
サーチ」13「1985］173−1184）。

ｂ）アニーリングおよびライゲーション。

アニーリングおよびライゲーションするため、250ピ
コモル分量のオリゴヌクレオチドを、20μのキナーゼ
緩衝液中４μCi³²P−ATP（5000μCi/ミリモル）および
９単位のポリヌクレオチドキナーゼにより37゜で40分間
ホスホリル化し（T.マニアチス等、「モレキュラー・ク
ローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル［1982］、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニュ
ーヨーク）、次いで５ミリモルの非標識ATPにより20分
チェースを行う。70゜で１μの0.5モルEDTAにより反
応を止める。ネンソーブ20カートリッジ（デュポン）吸
着および20％エタノールでの溶離によりホスホリル化オ
リゴヌクレオチドを精製すると、収率は約90％である。
等量の30〜100ピコモルの５′−ホスホリル化ON−２〜O
N−５および非ホスホリル化ON−１およびON−６の同時
アニーリングおよびライゲーションを、25ミリモルMgCl
₂を含む25μの緩衝液（125ミリモルのトリス−HCl、p
H7.6）中で行う。混合物を４分間90゜に加熱し、３時間
以内で14゜に冷却し、さらに14時間14゜でインキュベー
ションする。50ナノモルのトリス−HCl、pH7.6、10ミリ
モルMgCl₂、10ミリモルのジチオトレイトール、１ミリ
モルのATP、1600〜2000単位のT4−リガーゼ含有0.1mg/m
lうし血清アルブミンにより体積を60μに調節する。1
4時間14゜でライゲーションを行い、１μの0.5モルED
TAを加え、70゜に加熱することにより止める。フェノー
ル抽出後、水溶液を0.3モル酢酸ナトリウム、0.01モル
酢酸マグネシウムに導入し、DNAをエタノール沈澱さ
せ、0.5mm厚さのゲルの1.5cmスロット当たり10ピコモル
DANの最大ローディングによるPAGE（８％アクリルアミ
ド、７モル尿素）により生成物を精製する。オートラジ
オグラフィーにより正しい長さの生成物を同定し、ゲル
部分を削り取り、DNAをバイオトラップBT100中200Vで６
時間電気溶離し、エタノール沈澱させると、100ピコモ
ルのオリゴヌクレオチド当たり最終収量５〜８ピコモル
の精製２本鎖DNAが得られる。

ｃ）合成遺伝子のクローニング。

110ngの分離合成NAF遺伝子の試料を、260ngのアガロ
ース・ゲル−精製Sph I/BamH I切断pBS M13−プラスミ
ドDNA（ストラタジーン）とライゲーションする。この
ライゲーション混合物の10分の１を用いることにより、
D.ハナハンの方法（「ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー」166［1983］557−580）によりコンピ
ーテントにされた200μのエシェリヒア・コリ株5K細
胞の形質転換を行った結果、約320のアンピシリン耐性
コロニーがインプットDNA1ngにつき生成される。６クロ
ーンを抜粋し、Ｌ−ブロス／アンピシリン中で一夜生長
させる。プラスミドDNAを製造し（H.C.ビルンボルムお
よびJ.ドリー、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」
７［1979］1513−1523）、１％アガロース・ゲル上で泳
動させる。バンドを3MMペーパー（ワットマン）に電気
泳動させ、エッペンドルフ管中に遠心分離することによ
り、純粋スーパーコイルDNAを分離する。フェノール抽
出およびエタノール沈澱後、T3およびT7プライマー（ス
トラタジーン）およびシーケナーゼ酵素を用いたアルカ
リ変性プラスミド鎖末端方法によりDNAを配列させる
（E.J.チェン等、DNA４［1985］165−170）。

６クローンのうち３クローン、すなわちクローン１、
２および６は、正しいNAF配列を含んでいた。他の３つ
のクローンは誤った配列を有していた。クローン３はAT
G出発コドン後に挿入された余分のＧ残基を有していた
ため、完全コード配列は位相が異なっている。クローン
５では、34位においてＣがＴにより置き換えられている
ため、停止コドンは６番アミノ酸の後に形成される。最
後に、クローン４は、13位にＧを欠いている。この位置
は、コード配列ではなく、出発コドンおよびリボソーム
結合部位間の領域に存在する。

正しい配列を含むプラスミド（クローン６）を、制限
酵素Cla IおよびBamH Iにより切断し、前述の3MMペーパ
ーへの溶出により、237bpフラグメントをアガロース・
ゲルから分離する。次いで、このフラグメントを、左か
ら右に向かって、 −BamH I制限エンドヌクレアーゼ部位、 −合成転写ターミネーター（CCCGGGCGATGAATCGCCCGGGま
たはCCCGGGCGATTCATCGCCCGGG）、 −ヌクレオチド651番のSal I部位から複製開始点および
アンピシリン耐性遺伝子を通り、ヌクレオチド０番のEc
oR I部位までのプラスミドpAT153の部分、 −エシェリヒア・コリ・トリプトファン・プロモータ
ー、 −プロモーターにおけるリボソーム結合部位の約５塩基
対下流に位置するCla I部位 を含む線状DNAフラグメントにライゲーションする。

作成されたアンピシリン耐性発現プラスミド、すなわ
ちｐ（NAF）−6T3（第14図）をHB101株のエシェリヒア
・コリ細胞に形質転換する。

転写ターミネーターは、エシェリヒア・コリにおける
NAFの発現に不可欠ではない。それはエシェリヒア・コ
リ・ポリメラーゼにより生成されたNAF−mRNAを有効に
終結させるため、発現の収量を高める。しかしながら、
NAFはまた、転写ターミネーターをもたない同じベクタ
ーにおいて発現され得るが、その場合、収率は30〜50％
未満である。

また、NAFをコードするこの合成遺伝子および同じ塩
基性ペプチド配列をコードするが異なるヌクレオチド配
列を有するかまたは様々な長さのペプチドをコードする
他の遺伝子は、他のプロモーター、例えばラムダPLまた
はエシェリヒア・コリLacもしくはTacプロモーターを用
いてエシェリヒア・コリにおいて発現され得る。またこ
れらの遺伝子は他のベクターを用いて導入され、他の生
物、例えば酵母、真菌、動物細胞、細菌セルライン、植
物およびトランスジェニック高等生物において発現され
得る。

ｃ）発現 エシェリヒア・コリHB101におけるｐ（NAF）−6T3の
発現は、次の要領で行なわれる。

前培養1:−20゜に保たれたセルラインのグリセリン培
養50μを、100μg/mlアンピシリン含有無菌LB培地（1
0g/トリプトン、5g/酵母抽出物、10g/NaCl）10ml
に加える。この培養を、インキュベーター中37゜で８時
間200rpmで振り混ぜる。

前培養2:前培養１の培地から得た8mlを、0.2％グルコ
ース、0.5％カサミノ酸（ディフコ）、25mg/トリプト
ファンおよび100μg/mlアンピシリンを含むM9培地（J.
H.ミラー、「エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・
ジェネティックス」［1972］コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、431−433頁）１
中に接種する。この培養をインキュベーター中37゜で
15−16時間200rpmで振り混ぜる。

発酵:70の発酵槽中35の作業体積で主発酵を行
う。前培養２の場合と同じ培地を使用するが、例外とし
て5mg/のみのトリプトファンを加える。前培養２をこ
の培地に接種し、37゜で600nm（OD₆₀₀）での光学密度が
2.8に達するまで発酵を続行する。OD₆₀₀が2.8に達する
と、エタノール中インドールアクリル酸を加えて最終濃
度20mg/とする。４時間後、OD₆₀₀は13.5に増加する。
遠心分離により516gの沈澱物が得られる。

ｄ）組換えNAFの精製 組換え体NAF含有エシェリヒア・コリ細胞を−20゜で
貯蔵する。100gのバッチを、50ミリモルNaClを含む20ミ
リモルのトリス−HCl、pH8.0、100mlにより洗浄し、同
緩衝液250mlに再懸濁し、フレンチ・プレス（アミン
コ）中2500psiで崩壊させる。40分間47000gでの遠心分
離後、沈澱物を同緩衝液に再懸濁し、再遠心分離し、−
20゜で貯蔵する。10g分量を100mlの50ミリモルMES−NaO
H、pH6.5、6Mグアニジン−HClに懸濁し、１時間撹はん
し、0.5％酢酸に対して透析する。透析物を遠心分離に
より透明にし、アリコートに分けてモノ−Ｓカラム（HR
5/5、ファルマシア）に仕込む。0.2モルNaClを含む50ミ
リモルMES−NaOH、pH6.5によりカラムを洗浄し、同緩衝
液中一次勾配により（0.2〜0.5モルNaCl）0.5ml/分の速
度で溶離する。最高のNAF含有量を有するフラクション
をプールし、1ml/分の流速で20〜60％アセトニトリル勾
配により0.1％トリフルオロ酢酸中、広孔逆相HPLCカラ
ム（0.46×125mmバイダックC4TP）によるクロマトグラ
フィーを行う。

第５部：天然および組換えNAFの同定 実施例20 物理化学的同定。

HPLCから回収されたNAF（実施例19参照）は、２つの
基準に基づき純粋であると考えられる。銀染色SDS−ポ
リアクリルアミドゲルは、天然NAFと一致する単一バン
ドを示し（レーン２におけるHPLCピーク・フラクション
から得た組換えNAF1μｇ対レーン３における天然NAF1μ
ｇ、分子量標準はレーン１におけるチトクロムｃ［12.5
kd］およびアプロチニン［6.5kd］）、ぎ酸（開裂した
ペプチドはアミノを生ずる）およびカルボキシ末端配列
のエドマン分解法は、72−アミノ酸天然NAFの場合と一
致する。アミノ酸分析は配列から予想される組成と一致
している。メチオニンは見出されず、この残基が恐らく
は細菌により除去されることを示している。

実施例21 生化学的同定。

天然および組換えNAFをヒト好中球において平行して
試験する。それらは細胞質ゾル遊離Ca²＋において事実
上同一の変化を引き出し、３ナノモル程度の低濃度で最
大上昇をもたらす（第15図）。化学発光による評価によ
ると、ほぼ同一の濃度依存性呼吸バースト応答が１〜30
ナノモルの範囲で両調製物により得られる。天然および
組換えNAF間の均等性はまた、走化性およびエキソサイ
トーシス測定により表される。走化性移動は0.1ないし1
0ナノモルの間で観察され、最大効果は１ナノモルで得
られる（第６表）。いずれかのぺプチドにより、0.3ナ
ノモルで特異か粒からのビタミンB₁₂−結合蛋白質およ
び１ナノモルでアズール好性か粒からのベータ−グルク
ロニダーゼの顕著な放出が観察される。この効果は、第
７表に示された刺激物質濃度により増加する。

第６表 NAF誘発好中球走化性 NAF（nM） nat rec 0.1 98±６ 88±６ 1.0 123±６ 124±３ 10.0 127±３ 126±４ 値は、リーディング・フロント移動の平均±標準偏差
（μｍ）を表す（ｎ＝３）。走化性刺激物質の非存在下
におけるランダム移動は61±５μｍである。nat＝天然N
AF、rec＝組換えNAF。

天然（nat）または組換え（rec）NAFにより10分間刺
激されたサイトカラシンＢ前処理好中球（４×10⁶細胞/
ml）からの放出パーセント。対応する非刺激対照からの
放出が誘引される。平均±標準偏差（ｎ＝３）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ８８２５２５８ (32)優先日 昭和63年10月28日(1988．10．28) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (72)発明者 リンドレイ、イワン・ジェイムズ・ダル トン オーストリア国アー‐2345 ブルン／ゲ ビルゲ、アントン‐ザイドルガッセ 23 番 (72)発明者 ペベリ、パオラ スイス国ツェハー‐3012 ベルン、ツェ ーリンゲルストラッセ 32番 (72)発明者 ワルツ、アルフレート スイス国ツェハー‐3098 ケニツ、フェ ルトラインストラッセ ７番 (56)参考文献 特表 平２−502097（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｕｌ ｙ，1987）Ｖｏｌ．139，Ｎｏ．１，ｐ. 250−256 Ｃｌｉｎ．ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ. （1986）Ｖｏｌ．64，ｐ．214−222 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ａｕｇ, 1987）Ｖｏｌ．139，Ｎｏ．３，ｐ．788 −793 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ（Ｄｅｃ，1987）Ｖｏｌ. 84，ｐ．9233−9237 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｄｅｃ，1987) Ｖｏｌ．149，Ｎｏ．２，ｐ．755−761 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/00 - 14/825 A61K 38/00 A61P 29/00 C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/00 - 21/02 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次のアミノ酸配列を有する好中球活性化因
   子（NAF）：
2. 【請求項２】次のアミノ酸配列により延長されたアミノ
   末端を有する、請求項１に記載のNAF:Ala−Val−Leu−P
   ro−Arg−。
3. 【請求項３】２つのアミノ酸、すなわちSer−Ala−を欠
   くことにより短縮されたアミノ末端を有する、請求項１
   に記載のNAF。
4. 【請求項４】３つのアミノ酸、すなわちSer−Ala−Lys
   −を欠くことにより短縮されたアミノ末端を有する、請
   求項１に記載のNAF。
5. 【請求項５】ヒト単核白血球培養の上清からクロマトグ
   ラフィーにより精製し、回収することを含む、請求項１
   〜４のいずれかに記載のNAFの製造法。
6. 【請求項６】対応するオリゴヌクレオチドの合成、精製
   およびライゲーション、生成した合成NAF遺伝子のクロ
   ーニング、発現並びに回収および精製を含む、請求項１
   〜４のいずれかに記載のNAFの製造法。
7. 【請求項７】請求項１〜４のいずれかに記載のNAFのエ
   シェリヒア・コリにおける発現に適した、第13図に示す
   ヌクレオチド配列を有するcDNA。
8. 【請求項８】請求項１〜４のいずれかに記載のNAFを有
   効成分として含む、炎症関連好中球活性化調節用薬剤。