FR2623400A1 - Facteur d'activation des neutrophiles - Google Patents

Abstract

Un facteur d'activation des neutrophiles (NAF) pur, biologiquement actif, est isolé de monocytes humains ou après expression d'un gène de NAF synthétique dans E. Coli. Il possède la séquence d'acides aminés suivante :Ser-Ala-Lys-Glu- Leu-Arg-Cys-Gln-Cys- Ile-Lys-Thr-Tyr-Ser- Lys-Pro-Phe-His-Pro- Lys-Phe-Ile-His-Glu- Leu-Arg-Val-Ile-Glu- Ser-Gly-Pro-His-Cys- Ala-Asn-Thr-Glu-Ile-Ile- Val-Lys-Leu-Ser-Asp-Gly- Arg-Glu-Leu-Cys-Leu-Asp- Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val- Gln-Arg-Val-Val-Glu-Lys-Phe- Leu-Lys-Arg-Ala-Glu-Asn-Ser. Il existe trois autres variants mineurs avec des séquences plus longues et plus courtes. Le NAF naturel et le NAF synthétique ont des structures identiques et des propriétés biologiques identiques.

Description

FACTEUR D'ACTIVATION DES NEUTROPHILES

La présente invention concerne une substance immunomo-

dulatrice.

Elle concerne plus particulièrement un facteur immuno-

stimulant capable d'activer les leucocytes neutrophiles hu- mains, désigné dans la suite par facteur d'activation des

neutrophiles (NAF).

1. ARRIERE-PLAN

Les leucocytes neutrophiles (neutrophiles) sont les leucocytes les plus courants et représentent environ 2/3 des globules blancs dans le sang humain. Ils ont une fonction principale, qui est de progéger l'organisme hôte contre les infections microbiennes. Les neutrophiles sont mobiles, sont sensibles aux stimulations chimiotactiques produites par une infection et sont capables d'entrer dans des tissus infectés pour tuer les microorganismes. Cette capacité à tuer dépend

de l'aptitude des neutrophiles à englober les microorga-

nismes et à libérer des radicaux oxygène et des enzymes mi-

crobicides (B.M. Babior, New Engl. J. Med. 298 [1978] 659-

668, et M. Baggiolini, Experientia 40 [1984] 906-909). La

libération de ces produits dépend de l'activation des neu-

trophiles. On pourrait ainsi employer des substances, comme le facteur d'activation des neutrophiles décrit ici, pour améliorer l'activation des neutrophiles et donc le mécanisme

de défense anti-microbienne du corps humain.

On a maintenant découvert que les monocytes humains se-

crètent un facteur qui induit l'exocytose et l'éclatement respiratoire (formation de radicaux oxygène et libération d'enzymes) dans les neutrophiles humains et présente ainsi des propriétés d'activation des neutrophiles qui sont impor-

tantes dans l'activité anti-microbienne.

Le facteur peut être obtenu à partir du fluide de cul-

ture de monocytes humains stimulés et a une masse molécu-

laire apparente d'environ 6000, plus précisément d'environ

6500 en électrophorèse sur SDS-gel.

Les monocytes sont des cellules phagocytaires analogues aux neutrophiles. Toutefois, contrairement aux neutrophiles, les monocytes ont une durée de vie prolongée. Ils migrent depuis le sang dans tous les sites tissulaires possibles o ils se transforment en macrophages. La transformation des monocytes en macrophages peut également s'observer dans des expériences en culture cellulaire. Les macrophages dans les

tissus ont une variété de fonctions, principalement la pha-

gocytose des matières indésirables et la production d'une

grande variété de peptides et de protéines qui sont secré-

tés. Les macrophages se rassemblent au site de l'infection persistante et c'est en ces lieux que la production de NAF

par ces cellules pourrait améliorer les possibilités de dé-

fense de l'hôte des neutrophiles et avoir ainsi un rôle ap-

plicable en pathophysiologie.

Le NAF est caractérisé par ses propriétés d'activation des neutrophiles, c'est-à-dire l'induction de ce que l'on

appelle l'éclatement respiratoire avec production de ra-

dicaux oxygène et induction de la libération d'enzymes. En

termes moléculaires, le NAF est caractérisé par les proprié-

tés suivantes: une masse moléculaire apparente d'environ 6500 en électrophorèse sur SDS-gel, un point isoélectrique d'environ 8,6, une résistance à la chaleur jusqu'à 80 C et à

un nombre d'agents dénaturants mais une sensibilité aux pro-

téases, ce qui suggère que le NAF est un polypeptide. L'ac-

tion du NAF sur les neutrophiles humain est analogue à celle de deux stimuli chimiotactiques connus, l'anaphylatoxine C5a

et le peptide bactérien N-formyl-L-méthionyl-L-leucyl-L-phé-

nyl-alanine (fMLP), mais a pour médiation un récepteur de surface auquel se lie le NAF et qui diffère des récepteurs

de n'importe quel agoniste connu des neutrophiles humains.

Le NAF est produit en culture par des monocytes humains mais pas par des lymphocytes humains. La production dépend de la présence d'un stimulus comme un lipopolysaccharide bactérien (LPS), une phytohémagglutinine (PHA) ou la concanavaline A (ConA) et de la concentration du stimulus et de la durée d'incubation. Elle est inhibée par la cycloheximide, ce qui indique une fois encore que la synthèse protéiniqueest mise

en jeu.

Comme on l'a déjà indiqué, les monocytes et les macro-

phages sont des sources abondantes d'une variété de peptides bioactifs et de protéines (C.F. Nathan, J. Clin. Invest. 79

7] 319-326). Ils ont été identifiés comme étant les pro-

ducteurs de trois cytocines distinctes: l'interleukine 1

(IL-1), le facteur de nécrose tumorale (TNF) et l'interfé-

ron-alpha (IFN-a). Un certain nombre de rapports ont été pu-

bliés qui montrent que les monocytes et les macrophages pro-

duisent aussi des facteurs agissant sur les neutrophiles qui sont différents de ceux mentionnés ci-dessus. Comme ils sont actifs sur les neutrophiles, ces facteurs sont présentés dans la suite en détail. Diverses publications ont rapporté que les macrophages alvéolaires libèrent des facteurs qui sont chimiotactiques pour les neutrophiles (J. A. Kazmierowski et coll. J. Clin. Invest. 59 [1977] 273-281; W.W. Merrill et coll., J. Clin. Invest. 65 [1980] 268-270 et

G.W. Hunninghake et coll., J. Clin. Invest. 66 [1980] 473-

483) et qui peuvent améliorer la défense anti-microbienne dans le poumon. Il a été ensuite montré que ces facteurs

améliorent l'activité microbicide des neutrophiles (J.E.

Pennington et coll., J. Infect. Dis. 148 [1983] 101-109 et J. Clin. Invest. 75 [1985] 1230-1237). Une purification par filtration sur gel et chromatofocalisation a conduit à l'identification d'un facteur sensible aux protéases (nommé NAF) produit par des macrophages alvéolaires, d'une masse moléculaire de 6000 et d'un poids isoélectrique de 7,6. On a rapporté que ce facteur était faiblement chimiotactique et améliorait l'aptitude des neutrophiles à tuer les bactéries

phagocytosées sans toutefois induire en lui-même la produc-

tion de radicaux oxygène ni la libération d'enzymes. Un mé-

canisme similaire d'activité anti-microbienne améliorée a été décrit par d'autres chercheurs (A. Ferrante et coll., Clin. Exp. Immunol. 56 [1984] 559-566), qui ont montré que les neutrophiles humains nécessitent l'addition de milieux

de culture provenant de monocytes et de macrophages pour in-

duire l'aptitude à tuer Neigleria fowleri. Les médiateurs de

l'activation des granulocytes (GRAM) produits par des mono-

cytes humains stimulés par LPS ont été décrits par d'autres laboratoires (A. Kapp et coll., J. Invest. Dermatol. 86 [1986] 523-528 et F.E. Maly et coll., Lymphokine Res. 5 [1986] 21-33). Deux espèces de GRAM ont été décrites, une espèce majeure ayant une masse moléculaire apparente de

000 et une espèce mineure ayant une masse moléculaire ap-

parente de 10 000 qui induisaient une réponse d'éclatement respiratoire retardé dans les neutrophiles humains, mise en évidence par chimioluminescence. Ces facteurs sont sensibles à la chaleur et la trypsine et leur production dépend de la

stimulation des monocytes avec LPS et, apparemment, à nou-

veau de la synthèse protéinique.

Plusieurs rapports décrivent des facteurs dérivés de

monocytes et/ou de macrophages ayant une activité chimiotac-

tique vis-à-vis des neutrophiles. Un facteur nommé "chimio-

taxine dérivée de cellules mononucléaires" (MOC), qui est

apparemment un peptide de masse moléculaire 10 000, qui dif-

fère d'un GRAM, a été rapporté (E. Kownatzki et coll., Clin. Exp. Immunol. 64 [1986] 214-222). Un facteur chimiotactique

neutrophile produit par les monocytes de sang humain stimu-

lés avec LPS, de masse moléculaire environ 10 000 et de

point isoélectrique 8-8,5, a également été indiqué (T.

Yoshimura et coll., J. Immunol. 139 [1987] 788-793). Enfin, on a également rapporté que des macrophages péritonéaux de

rats stimulés en culture avec LPS libèrent un facteur chi-

miotactique neutrophile sélectif (F.Q. Cunha et coll., J. Med. Biol. Res. 19 [1986] 775-777 et Eur. J. Pharmacol. 129

65-76).

Du fait de la nature préliminaire de l'information bio-

chimique contenue dans ces rapports, il est impossible de spéculer sur des similarités et des différences de structure

parmi les divers facteurs décrits.

Après la (les) date(s) de priorité qui est (sont) re-

vendiquée(s) pour la présente invention, la purification d'un peptide correspondant probablement au NAF a été décrite par van Damme et coll. (J. Van Damme et coll., J. Exp. Med. 167 [1988] 1364-1376) et une séquence identique à celle du NAF a été rapportée par Gregory et coll., (H. Gregory et coll., Biochem. Biophys. Res. Commun. 151 [1988] 893-890) pour un peptide ayant été purifié à partir de surnageants de lymphocytes humains stimulés à la lectine. L'ADNc codant pour MDNCF (T. Yoshimura et coll., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84 [1987] 9233-9237) a été récemment cloné (K. Matsushima et coll., J. Exp. Med. 167 [1988] 1883-1893) et s'est révélé correspondre à l'ADNc 3-10C (J. Schmid et C. Weissmann, J. Immunol. 139 [1987] 250-256). Schmid et Weissmann ont montré que le peptide codé par l'ADNc 3-1OC a une homologie de

structure avec le facteur plaquettaire 4, la g-thromboglobu-

line, le peptide III activateur de tissu conjonctif (CTAP-

III) et le peptide inductible par l'interféron-gamma (gamma-

IP-10). Ces molécules sont également homologues à un peptide à 73 résidus (MGSA) ayant des propriétés de stimulation de la croissance des mélanomes (A. Richmond et coll., EMBO J. 7 [1988] 2025-2033), dont la séquence ressemble étroitement à

celle déduite de l'ADNc-gro isolé des fibroblastes (A. Ani-

sowicz et coll., Proc. Nat. Acad. USA 84 [1987] 7188-7192).

On a aussi rapporté une protéine inflammatoire dérivée des macrophages murins (MIP), peut-être apparentée aux protéines décrites ci-dessus (G. Davatelis et coll., J. Exp. Med. 167 [1988] 1939-1944), cette protéine semblant être un membre d'une famille de peptides incluant RANTES, produit à 8 kd d'un ADNc isolé de clones de cellules T humaines à conduite antigénique, dépendants de IL-2 (T.J. Schall et coll., J.

Immunol. 141 [1988] 1018-1029). Les fonctions de ces pep-

tides sont largement inconnues. On a rapporté que MGSA et CTAP-III (C.W. Castor et coll., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80 [1983] 765-769) sont mitogènes et on a montré que le facteur plaquettaire 4 a des effets immunomodulateurs (A.D. Barone

et coll., J. Biol. Chem. 263 [1988] 8710-8715).

Les résultats obtenus suggèrent que le NAF active sé-

lectivement les neutrophiles par un procédé à médiation par

récepteur analogue à celui initié par les agonistes chimio-

tactiques.

2. RESUME DE L'INVENTION

On a découvert que le NAF de cette invention induit la formation de radicaux oxygène et la libération d'enzymes

dans les neutrophiles humains en agissant par l'intermédiai-

re d'un récepteur sélectif, différent de tous les récepteurs

décrits jusqu'à présent.

La séquence totale d'acides aminés du NAF purifié pro-

venant de monocytes humains stimulés par LPS a été détermi-

née et un gène codant pour l'espèce de NAF principale a été synthétisé et exprimé sous forme d'un peptide-recombinant ayant les mêmes propriétés d'activation des neutrophiles que

son homologue naturel.

L'invention concerne donc le NAF et son isolement de

sources naturelles comme les monocytes humains.

Elle concerne également un NAF synthétique, en particu-

lier recombinant, et sa préparation et son expression.

3. DESCRIPTION DETAILLEE

La séquence complète des acides aminés du NAF a été dé-

terminée par des méthodes de séquençage connues:

Ser-Ala-Lys-Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-Ser-Lys-Pro-

Phe-His-Pro-Lys-Phe-Ile-Lys-Glu-Leu-Arg-Val-Ile-Glu-Ser-Gly-Pro-

- His-Cys-Ala-Asn-Thr-Glu-Ile-Ile-Val-Lys-Leu-Ser-Asp-Gly-Arg-Glu-

Leu-Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-Val-Glu-Lys-

Phe-Leu-Lys-Arg-Ala-Glu-Asn-Ser. La dégradation d'Edman de la protéine entière et des

fragments typtiques T 7-26 et T 27-47 obtenus après élimina-

tion de NAF SH-méthylé et amino-succinylé a donné la sé-

quence jusqu'à la position 47. Par hydrolyse avec de l'acide

formique à 75% et dégradation d'Edman, on a obtenu deux sé-

quences approximativement équimolaires de 20 acides aminés,

suivies d'un simple motif correspondant à la séquence amino-

terminale de NAF au-delà de la position 20. La séquence du

peptide carboxyterminal A 53-72 a été déterminée par sous-

traction et confirmée par l'analyse du peptide typtique T

61-72. Les carboxypeptidases A et B ne donnent pas de pro-

duit de segmentation décelable mais, après traitement de 1

nmole de NAF avec la carboxypeptidase Y, on constate la li-

bération de 120 pmoles de sérine, ce qui indique que la sé-

rine est carboxyterminale.

L'analyse de divers lots de NAF a révélé une certaine hétérogénéité aminoterminale. La séquence ci-dessus concerne

le constituant majeur (environ 70%) que l'on pense être lar-

gement responsable des activités biologiques. On pourrait identifier trois autres variants: Séquence 1 (environ 17%): Ala-Val-Leu-Pro-Arg-SerAla-Lys-Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Ly! Thr-Tyr-Ser-Lys-Pro-Phe-His-ProLys-Phe-Ile-Lys-Glu-Leu-Arg-Va]

Ile-Glu-Ser-Gly-Pro-

c'est-à-dire la séquence entière ci-dessus prolongée encore,

à l'extrémité N. par Ala-Val-Leu-Pro-Arg- (la protéine en-

tière a ainsi 77 acides aminés).

Séquence 2 (environ 8%): Lys-Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-SerLys-Pro-Phe-His-

Pro-Lys-Phe-Ile-Lys-Glu-Leu-Arg-Val-Ile-Glu-Ser-Gly-Pro-

c'est-à-dire la séquence entière ci-dessus raccourcie, à l'extrémité N, de Ser-Ala- (la protéine entière a ainsi 70

acides aminés).

Séquence 3 (environ 5%): Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-Ser-Ly s -Pro-PheHisPro Lys-Phe-Ile-Lys-Glu-Leu-Arg-Val-Ile-Glu-Ser-Gly-Pro-. c'est-à-dire la séquence entière ci-dessus raccourcie, à l'extrémité N, de Ser-Ala-Lys- (la protéine entière a ainsi

69 acides aminés).

Toutes ces séquences peuvent être alignées pour former la séquence prévue à partir de l'ADNc 3-1OC, constitué par 99 acides aminés (J. Schmid et C. Weissmann, J. Immunol. 139

7] 250-254). Le peptide NAF majeur correspond aux posi-

tions 28 à 99 de la séquence d'acides aminés 3-10C, tandis que les trois variants ci-dessus commencent aux positions 23

(séquence 1), 30 (séquence 2) et 31 (séquence 3) de celui-

ci. La comparaison de la séquence dérivée d'ADNc 3-1OC avec

les données de la séquence ci-dessus suggère que les phago-

cytes mononucléaires synthétisent un précurseur de NAF qui est traité au sein de la cellule. Le peptide à 77 résidus pourrait représenter la forme secrétée la plus grande de NAF

car il correspond à la séquence dérivée d'ADNc moins le pep-

tide de signal prévu de 22 acides aminés. L'espèce princi-

pale de NAFAà 72 résidus et les analogues à 70 et 69 résidus

peuvent résulter d'autres modifications post-translation-

nelles.

Toutes les formes de NAF possèdent quatre résidus cys-

téine que l'on s'attend à voir former des ponts disulfure entre chaînes qui semblent importants pour l'activité car on constate que le mercaptoéthanol est inhibiteur (P. Peveri et coll., J. EXP. Med. 167 [1988] 1547-1560). Il est probable que les ponts disulfure relient les positions 7-34 et 9-50 comme dans la P-thromboglobuline et le facteur plaquettaire

4 qui sont partiellement homologues de NAF.

Selon l'homologie à la 3-thromboglobuline, le NAF a deux ponts disulfure intramoléculaires. Par conséquent, la

masse moléculaire calculée est de 8384,7, nettement supé-

rieure à la masse moléculaire apparente trouvée par électro-

phorèse sur SDS-gel.

La production de NAF à partir de sources naturelles, comme les monocytes humains, conduit à de faibles rendements

et nécessite des étapes de purification importantes et com-

pliquées. Afin de produire du NAF en grandes quantités et avec des procédés de synthèse à meilleur rendement, on indique par exemple une synthèse chimique totale ou des procédés à l'ADN recombinant. La production de NAF de synthèse, par exemple par des méthodes à l'ADN recombinant, comprenant

l'expression dans un système d'expression procaryote ou eu-

caryote, par exemple dans E. coli, font également partie de l'invention. Un NAF de synthèse, c'est-à-dire un NAF produit

par des procédés de synthèse comme des procédés à l'ADN re-

combinant, fait également partie de l'invention. Un NAF de synthèse, par exemple le NAF recombinant isolé, par exemple, à partir de bactéries, a la ou les mêmes séquences d'acides

aminés que le NAF naturel et les mêmes propriétés et activi-

tés biologiques. L'expression "NAF recombinant" signifie un

NAF obtenu par des procédés à l'ADN recombinant.

La préparation de NAF par des procédés à l'ADN recombi-

nant s'effectue selon des techniques connues, à savoir par

synthèse, purification et ligature des oligonucléotides cor-

respondants, clonage du gène de NAF synthétique, expression

dans E. coli par exemple et enfin récupération et purifica-

tion du NAF recombinant. Par exemple, un gène codant pour le NAF à 72 acides aminés est synthétisé, de préférence avec

optimisation du codon, puis cloné et exprimé dans E. coli.

L'analyse par "western blot" des extraits bactériens

bruts, au moyen d'un anti-sérum sensibilisé à un NAF natu-

rel, révèle une seule bande qui migre en même temps que le

NAF naturel. Le NAF recombinant purifié jusqu'à l'homogénéi-

té possède des séquences aminoterminales et carboxytermi-

nales identiques à celles du NAF naturel à 72 acides aminés.

Si on le teste sur des neutrophiles humains, on constate qu'il a la même activité et la même efficacité que le NAF naturel pour induire le chimiotactisme, une élévation rapide

de Ca2+ libre cytosolique, l'activation de l'éclatement res-

piratoire et la libération des granulations spécifiques et azurophiles.

La figure 13 représente le dessin d'un gène de NAF syn-

thétique. Des changements sont apparents sur la séance co-

dante de l'ADNc 3-10C pour faciliter l'expression dans E. coli. A l'extrémité 3', la séquence de terminaison naturelle TAA est remplacée par une triple séquence de terminaison

TAATAATGA et un site BamHI est ajouté immédiatement en aval.

A l'extrémité 5', les sites SphI et ClaI sont ajoutés pour permettre l'insertion dans le clonage et dans le vecteur d'expression, respectivement. A la base 34, est créé un site de restriction TaqI pour des manipulations ultérieures sur

l'extrémité 5' par changement du codon Arg de AGA en CGA.

Le recuit en blocs (oligonucléotides 1-2, 3-4 et 5-6)

ne présente aucun avantage par rapport à la ligature simul-

tanée des six oligonucléotides. La 5'-phosphorylation de tous les oligonucléotides donne naissance à des produits de ligature plus grands que la taille attendue mais, lorsque

les oligonucléotides terminaux (1 et 6) ne sont pas phospho-

rylés, le produit ayant la masse moléculaire la plus élevée est le gène complet avec 248/240 bases. Le gène est ligaturé dans pBS M13 coupé par SphI/BamHI et transformé dans E. coli. L'ADN plasmide isolé de 6 des colonies résistantes à

l'ampicilline résultantes est découpé avec ClaI/BamHI, don-

nant dans tous les cas une bande de 237 bp sur un gel d'agarose à 1,4%. Le séquençage de l'ADN montre les clones

contenant la séquence correcte. La bande ClaI/BamHI prove-

nant d'un clone correct est retirée du gène et clonée dans

le vecteur promoteur de Trp pIL402 (Term). Comme moyen pos-

sible d'augmenter l'expression, on peut incorporer une sé-

quence de terminaison de transcription synthétique (voir exemple 17) dans ce vecteur, fixée à l'extrémité 3' du gène GM-CSF humain au site BamHI. Le gène de NAF est donc inséré

entre ce site BamHI et le site ClaI en aval du site d'ini-

tiation de la transcription dans le promoteur, pour rempla-

cer le gène GM-CSF. Le plasmide d'expression de NAF résul-

tant, p(NAF)-6T3, est représenté sur la figure 14.

L'analyse par coloration à l'argent et "western blot"

d'extraits de E. coli contenant p(NAF)-6T3 induit par l'aci-

de indole-acrylique démontre la chronoproduction d'un pep-

tide qui migre en même temps qu'un NAF naturel et réagit

avec un anti-sérum contre le NAF naturel.

Le système d'expression ci-dessus peut également être

utilisé pour préparer les variants de NAF mentionnés ci-des-

sus ou d'autres fragments de NAF biologiquement actifs comme

des fragments de NAF ayant perdu le groupe amino.

Les propriétés biologiques du NAF sont spécifiques à

une espèce. L'activité chez le lapin reflète très étroite-

ment l'activité chez l'homme. Des essais préliminaires chez la souris, le rat et le cobaye n'ont pas montré d'activité

claire.

L'utilisation du NAF est indiquée dans le traitement des troubles qui sont accompagnés ou provoqués, localement ou systémiquement, par une modification du nombre ou de

l'état d'activation des PMN (cellules polymorphonucléaires-

neutrophiles). Le NAF modifie de manière importante ces pa-

ramètres PMN et son utilisation est donc indiquée dans le traitement des troubles dans lesquels une élévation du

nombre ou de l'état d'activation des PMN conduit à une amé-

lioration clinique, par exemple dans les infections bacté-

riennes, mycoplasmiques, par les levures et les champignons et dans les infections virales. En outre, l'utilisation du NAF est indiquée dans les maladies inflammatoires comme la psoriasis, les affections arthritiques et l'asthme, ou dans les troubles présentant une numération des neutrophiles

anormalement faible et/ou un faible taux généralisé des neu-

trophiles, et dans la préparation d'antagonistes utilisables

dans ces indications.

3. DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1: production de NAF induite par LPS: Des cellules mononucléaires séparées comme le décrit l'exemple 1 ont été ensemencées dans des plaques de culture à 24 puits (5x106 cellules dans 1 ml) et stimulées avec LPS aux concentrations indiquées. A différents intervalles de

temps, les milieux ont été recueillis, éclaircis par centri-

fugation (20 000 t/min pendant 20 min à 4 C) et on a mesuré l'activité du NAF. Les cellules utilisées provenaient d'un seul donneur; on a rapporté les moyennes de cultures faites en double exemplaire. Ces résultats sont représentatifs de 4 expériences analogues utilisant des cellules de donneurs

différents.

Figure 2: production de NAF par des phagocytes mononu-

cléaires mais pas par des lymphocytes: a) La fraction totale de cellules mononucléaires

(<,N,5x106 cellules/ml) et les cellules adhérentes en déri-

vant (o,a) sont cultivées en présence (.,o) et en l'absence

(t,M) de 100 ng de LPS pendant 24 heures.

* b) Des monocytes (o, 106 cellules/ml) et des lympho-

cytes (&, 4x106 cellules/ml) purifiés par élutriation sont

cultivés en présence de 100 ng de LPS.

Les graphiques représentent les valeurs moyennes rela-

tives pour la libération de l'élastase de 5 (a) et 6 (b) ex-

périences séparées menées toutes en double exemplaire. Les résultats sont normalisés par le choix de la valeur 1,0 pour la valeur à 24 h de * dans le groupe a et de o dans le groupe b et le calcul des autres valeurs (moyenne écart type) par rapport à celle-ci. Ce type de représentation est choisi afin de tenir compte des variations individuelles de la production de NAF d'une part et du taux de sensibilité

des neutrophiles utilisés pour tester le NAF d'autre part.

Figure 3: purification partielle du NAF par chromatographie sur phosphocellulose: On y voit la distribution des protéines (absorbance à

280 nm, ---), de NAF (o) et de IL-1 (A). Les fractions pré-

sentant les activités de NAF les plus élevées sont regrou-

pées comme il est indiqué.

Fiqure 4: purification du NAF par filtration sur gel en CLHP: a) Distribution des protéines (absorbance à 280 nm) et temps d'élution des marqueurs de masse moléculaire (MM) (flèches: 1 = MM 66200; 2 = MM 42700; 3 = MM 21500; 4 = MM

6500 et 5 = MM 1255).

b) Profil d'activité du NAF.

Figure 5: purification de NAF par chromatographie sur hy-

droxylapatite: Du NAF partiellement purifié est chargé sur la colonne à une faible concentration saline, puis élué par un tampon

contenant NaCl 1M. Les blocs montrent l'activité du NAF.

Figure 6: purification du NAF par chromatographie sur hépa-

rine-Sepharose: Du NAF partiellement purifié est chargé sur la colonne à une faible concentration saline, puis élué avec un tampon

contenant NaCl 1,5M. Les blocs montrent l'activité du NAF.

Figure 7: purification du NAF par CLHP en phase inverse sur colonne de C4: a) Du NAF purifié est chargé sur une colonne en phase inverse dans de l'acide trifluoroacétique à 0,1%. La colonne est développée avec un gradient linéaire d'acétonitrile dans

de l'acide trifluoroacétique à 0,1%.

b) Les blocs montrent l'activité du NAF.

Figure 8: purification du NAF par CLHP en phase inverse sur colonne de CNpropyle:

a) Du NAF purifié est chargé sur une colonne de CN-pro-

pyle Bakerbond dans de l'acide trifluoroacétique à 0,1%. La

colonne est développée avec un gradient linéaire de n-propa-

nol dans de l'acide trifluoroacétique à 0,1%.

b) Les blocs montrent l'activité du NAF.

Figure 9: purification du NAF par chromatofocalisation: Du NAF partiellement purifié est chargé sur une colonne de chromatofocalisation. La colonne est développée avec du

polytampon 96-HCl, pH 7,0. On teste les fractions pour dé-

terminer l'activité du NAF ( m) et le pH (--S--)

Figure 10: réponse de l'éclatement respiratoire au NAF par-

tiellement purifié: a) Production de superoxyde: des neutrophiles (3x106/ml) sont préincubés à 37 avec ou sans 1 im de PAF,

pendant 2 minutes, puis stimulés avec des quantités crois-

santes de NAF. La figure montre les enregistrements de la

réduction des cytochromes c après l'addition de NAF.

b) Chimioluminescence dépendant de H202: les courbes

d'évolution après stimulation avec un NAF partiellement pu-

rifié et des concentrations quasiéquiactives de C5a et fMLP

sont indiquées sur la gauche. La phase initiale de la ré-

ponse est détaillée sur la droite. Les stimulants sont ajou-

tés dans 50 il de PBS-BSA.

Figure 11: distinction entre NAF et C5a:

C5a et NAF sont incubés pendant 15 minutes avec du sé-

rum humain frais ou avec du PBS et l'activité des prépara-

tions est déterminée (production de superoxyde). a) C5a dans PBS, b) C5a dans sérum, c) sérum seul, d) NAF dans PBS,

e) NAF dans sérum.

Figure 12: formation de superoxyde en réponse à une stimu-

lation séquentielle avec un NAF partiellement purifié, C5a et fMLP: a) Des neutrophiles (3x106/ml) sont préincubés à 37 C pendant 5 minutes, puis stimulés avec différents agonistes

comme il est indiqué (flèches).

b) Stimulation séquentielle ou répétée avec NAF et C5a.

Les conditions sont les mêmes qu'en a).

Les flèches représentent l'addition des agonistes selon les indications. La concentration de C5a et de 0,5 nM en a) est de 0,2 nM en b), celle de fMLP est de 20 nM dans les deux expériences. Les agonistes sont ajoutés dans 50 il de

PBS-BSA.

Figure 13: séquence nucléotidique d'un gène de NAF synthé-

tique: Les oligonucléotides simples, ON-1 à ON-6, utilisés

pour construire le gène, sont indiqués en traits pointillés.

Les numéros (soulignés) des nucléotides apparaissent du côté

droit au-dessus du double brin. La séquence peptidique cor-

respondante de la forme majeure est numérotée en partant de l'extrémité aminoterminale (Ser). Les sites de restriction ClaI et BamHI sont indiqués au-dessus du double brin. Le site TaqI créé en remplaçant le A par un C dans le codon

d'arginine est également indiqué.

Figure 14: vecteur d'expression p(NAF)-6T3: AR = gène de résistance à l'ampicilline

Trp P/O = promoteur de tryptophane -

T = terminaison de transcription synthétique Figure 15: identité du NAF naturel et du NAF recombinant

Graphiques du haut: changements de Ca2+ libre cyto-

solique induits par un NAF naturel (à gauche) et recombinant

(à droite). Les neutrophiles (4x106 cellules/ml) sont char-

gés avec 0,1 nmole de quin-2/AM, puis stimulés avec 3 nM de NAF (marque). Les changements de saturation de guin-2 sont étalonnés comme le décrivent V. Von Tscharner et coll., J.

Biol. Chem. 261 (1986) 10163-10168.

Graphiques du bas: éclatement respiratoire induit par

un NAF naturel (gauche) et recombinant (droite). Les neutro-

philes (106 cellules/ml) sont stimulés avec 3, 10 et 30nM de NAF à l'instant 0 et la production de peroxyde d'hydrogène est mesurée par chimioluminescence (M. P. Wymann et coll.,

Anal. Biochem. 165 [1987] 371-378).

Figure 16: fuite de plasma dans les sites cutanés: Après injection intradermique de NAF ou d'endotoxine; Durée: 4 heures;

Moyenne erreurs types de la réponse moyenne sur 3 lapins.

Figure 17: accumulation des neutrophiles dans les sites cutanés: Mesures faites simultanément aux réponses tracées sur

la figure 16.

Figure 18: Effet de la polymixine B sur l'accumulation des neutrophiles: Après injection intradermique de NAF (10-9 moles/site),

de fMLP (10-9 moles/site) ou d'endotoxine (10-13 moles/si-

te); Polymixine B: 40 lg/site; Durée: 2 heures;

Moyenne erreurs types des réponses moyennes sur 3 la-

pins. Figure 19: effet de l'actinomycine D sur l'accumulation des neutrophiles:

Après stimulation des sites cutanés avec NAF (10-9 mo-

les/site), fMLP (10-9 moles/site) ou de l'endotoxine (10-13 moles/site); Durée: 2 heures;

Moyenne erreurs types des réponses moyennes sur 3 la-

pins.

5. EXEMPLES

Les exemples suivants illustrent l'invention. Toutes les températures sont en degrés centigrades. On emploie les abréviations suivantes: PHA: phytohémagglutinine ConA: concanavaline A LPS: lipopolysaccharide de E. coli BSA: sérum-albumine bovine fMLP: N-formyl-L-méthionyl-L-leucyl-Lphénylalanine

PAF: 1-O-hexadécyl-2-O-acétyl-sn-glycéro-3-phosphochô-

line (facteur d'activation plaquettaire) MEM: milieu essentiel minimal d'Eagle (Seromed GmbH,

Munich, RFA), complémenté avec 25 gg/ml de néomycine, tam-

ponné à pH 7,4 avec NaHCO3 25mM et HEPES 20mM MEM-PPL: comme ci-dessus, contenant en plus 1% de solution de protéine plasmatique pasteurisée (5% de PPL-SRK, Swiss

Red Cross Laboratory, Bern, Suisse) et 100 UI/ml de pénicil-

line et de streptomycine (Gibco A.G., Bâle, Suisse); PBS: solution saline tamponée au phosphate sans Ca2+ et Mg2+ (137mM NaCl, 2,7mM KCl, 8,1mM NaH2PO4 et 1,5mM KH2PO4, ajustée à pH 7,4) PBS-BSA: PBS complémenté par 0, 9mM de CaCl2, 0,49mM de

MgCl2 et 2,5 mg/ml de BSA.

HEPES: acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfo-

nique PPL-SRK: solution de protéine plasmatique (Swiss Red Cross) NAF: facteur ou protéine d'activation des neutrophiles CX: cycloheximide IL-1: interleukine-1 SOD: superoxyde C5a: anaphylatoxine CPC: verre poreux contrôlé PAGE: électrophorèse sur gel de polyacrylamide

GM-CSF: facteur stimulant les colonies de granulocytes-ma-

crophages CB: cytochalasine B (5 gg/ml) MES: acide 2-[N-morpholino] éthanesulfonique CLHP: chromatographie liquide haute pression SDS: dodécylsulfate de sodium PARTIE I: production de NAF par monocytes humains Exemple 1: production de NAF par monocytes humains stimulée avec LPS

Des monocytes humains sont isolés de la couche leucocy-

taire du sang de donneurs (Swiss Red Cross Laboratory, Bern,

Suisse) par centrifugation à travers un gradient de Ficoll-

Paque. Ce procédé sépare les neutrophiles d'avec ce que l'on appelle les cellules mononucléaires, qui sont un mélange de monocytes (environ 20%) et de lymphocytes (environ 80%). On utilise trois préparations de monocytes: (i) la fraction

totale des cellules monocluéaires, (ii) des monocytes enri-

chis à partir de la fraction de cellules mononucléaires par

adhérence et (iii) des monocytes purs à 90% séparés des lym-

phocites par centrifugation d'élutriation (G. Garotta et coll., Biochem. Biophys. Res. Comm. 140 [1986] 948-954 et

K.J. Clemetson et coll., J. Exp. Med. 161 [1985] 972-983).

Les cellules sont cultivées dans MEM-PPL et stimulées avec des concentrations croissantes (0,1 ng à 1 lg/ml) de LPS. A différents instants, on prélève des parties aliquotes des milieux de culture et on détermine l'activité de NAF en

terme de capacité à induire la libération d'élastase à par-

tir de neutrophiles humains prétraités avec de la cytochala-

sine B (B. Dewald et coll., Biochem. Pharmacol. 36 [1987]

2505-2510).

Des cultures de cellules mononucléaires (5x106 cel-

lules/ml) constituées de monocytes et de lymphocytes en un rapport d'environ 1:5 produisent du NAF lorsqu'elles sont

stimulées avec LPS (10 ng/ml). Le NAF s'accumule dans le mi-

lieu en 24 heures et la production se stabilise entre 24 heures et 48 heures. Il ne se forme pas de NAF en l'absence de stimulus. La figure 1 montre les effets, en fonction du temps et de la concentration, de LPS déjà actif entre 0:1

ng/ml et 1 ng/ml.

On étudie la source de NAF en utilisant différentes préparations de cellules mononucléaires. La figure 2a montre la production de NAF dépendant de LPS par la fraction totale

des cellules mononucléaires et par les monocytes sélection-

nés à partir de celle-ci par adhérence. Ces résultats

confirment que la production de NAF dépend de LPS et indi-

quent que le NAF est produit par les monocytes. La présence

de lymphocytes ne semble pas influencer la quantité de pro-

duction de NAF. On obtient des résultats analogues avec des monocytes et des lymphocytes purifiés par élutriation. Comme l'indique la figure 2b, le NAF est produit par les monocytes

mais pas par les lymphocytes.

Exemple 2: production du NAF par des monocytes humains sti-

mulés par PHA ou ConA La fraction de cellules mononucléaires provenant de la couche leucocytaire du sang humain, séparée comme le décrit l'exemple 1, est cultivée dans les conditions indiquées dans l'exemple 1 et stimulée avec PHA (5 lg/ml) ou ConA (10

gg/ml). La production de NAF en fonction du temps est ana-

logue à celle observée avec les cellules mononucléaires sti-

mulées par 100 ng/ml de LPS. Un maximum est atteint au bout

de 24 heures.

Exemple 3: inhibition de la production de NAF par le cyclo-

heximide Le fait que le NAF ne soit pas libéré immédiatement par

stimulation des monocytes, mais au contraire après une pé-

riode de plusieurs heures, suivant la concentration du sti-

mulus, suggère qu'une fois encore la synthèse protéinique

est nécessaire et que la production du NAF est en fait in-

duite par le stimulus. La nécessité d'une synthèse protéi-

nique est démontrée par les expériences dans lesquelles la

production de NAF est inhibée par l'addition de cyclohexi-

mide. Les résultats d'une expérience représentative sont in-

diqués sur le tableau 1.

Tableau 1

Inhibition de la production de NAF par le cycloheximide Traitement Production moyenne de NAF après 4 h 8h 24h Aucun 0 0 0

LPS 726 2042 2633

LPS+CX 0 0 0

LPS+CX à 4 h 774 966 639 LPS+CX à 8 h 752 1884 1854 Le cycloheximide (CX, 10 lg/ml) est ajouté 4 ou 8 heures après le LPS (100 ng/ml). L'activité est présentée en

unités de fluorescence, exprimant la libération d'élastase.

PARTIE II: purification du NAF

Exemple 4: séparation du NAF et de la IL-1 par chromatogra-

phie sur phosphocellulose Des cellules mononucléaires obtenues à partir de la couche leucocytaire du sang d'un donneur, comme le décrit l'exemple 1, sont cultivées dans MEM-PPL pendant 48 heures,

en présence de 100 ng/ml de LPS dans des bouteilles de cul-

ture agitées (1,5 litres, 5x106 cellules/ml). Les surna-

geants de culture sont ensuite recuillis, centrifugés à

000 t/min pendant 20 minutes à 4 pour éliminer le maté-

riau particulaire, et chargés sur une colonne de 10 ml de phosphocellulose (Whatman Pll, 1,4x6 cm), équilibrée avec du tampon phosphate de potassium 20mM, pH 7,2, contenant 20mM de NaCl et 5% de glycérol. La colonne est lavée avec 30 ml

du tampon ci-dessus, puis éluée avec 90 ml d'un gradient li-

néaire de concentration de NaCl (0,02M à 1,5M) dans le même

tampon. Des fractions de 2 ml sont recueillies dans du poly-

éthylène-glycol à 0,1% et testées pour déterminer l'activité de NAF et de IL-1. L'absorbance à 280 nm est surveillée en

continu et constitue une mesure des protéines.

La figure 3 montre les profils de distribution des pro-

téines (absorbance à 280 nm) et deux activités biologiques, la libération de l'élastase mesurant l'activité de NAF et la prolifération des thymocytes mesurant l'activité de IL-1. La

plupart des protéines, ainsi que l'activité de IL-1, se re-

trouvent dans le volume écoulé total. L'élution avec un gra-

dient linéaire de NaCl donne une certaine activité de IL-1, à une force ionique faible, suivie d'un pic d'activité de libération d'élastase correspondant au NAF, qui commence à éluer à 0,5M et atteint son maximum à 0,8M de NaCl. Le pic est symétrique et est précédé d'un petit épaulement. Une certaine matière absorbant les UV est éluée par le gradient

salin; son profil ne coïncide toutefois pas avec les activi-

tés biologiques déterminées. Comme l'indique la figure 3, IL-1 et NAF peuvent être complètement résolus. 1 n'y a pas d'activité de libération de l'élastase associée à IL-1 et

pas d'activité produisant la prolifération des tymocytes as-

sociée à NAF. La récupération du NAF par fractionnement est

proche de 100%, ce qui suggère que les milieux ne contien-

nent pas d'inhibiteurs ni d'activateurs.

Exemple 5: purification de NAF par filtration sur gel Un échantillon de 200 1l de NAF partiellement purifié

par chromatographie sur phosphocellulose (exemple 4) est ap-

pliqué sur une colonne de CLHP TSK- G2000 SW (7,5x600 mm)

avec une précolonne de TSK-GSWP (7,5x75 mm). Dans la co-

lonne, circule NaHPO4 100mM, pH 7,0, contenant 100mM de NaCl, à un débit de 0,5 ml/min. On utilise comme standards d'étalonnage de la sérumalbumine bovine (masse moléculaire

66200), de l'ovalbumine (masse moléculaire 42700), un inhi-

biteur de trypsine de soja (masse moléculaire 21500), de l'aprotinine (masse moléculaire 6500) et de l'actinomycine D (masse moléculaire 1255). Le NAF élue avec un pic légèrement asymétrique juste après l'aprotinine et bien au-dessus de l'actinomycine D. La masse moléculaire apparente du NAF est donc environ de 6500. Aucune activité de NAF n'est éluée

avant ou après le pic décrit (figure 4).

Exemple 6: purification du NAF par l'hydroxylapatite

Un regroupement de fractions obtenues par chromatogra-

phie sur phosphocellulose (exemple 4), d'un volume total de

ml (correspondant à environ 800 ml de surnageant de cul-

ture non fractionné) est dilué au 1/10 avec du tampon de

charge (10mM de phosphate de sodium, pH 6,9, dans du poly-

éthylène-glycol 6000 à 0,1%) et chargé sur une colonne de 3 ml d'hydroxylapatite (Biogel HTP) équilibrée dans le tampon de charge. La colonne est lavée avec trois portions de 3 ml du tampon de charge, puis éluée avec le tampon de charge complémenté par NaCl 1M. Par cette opération, on récupère le NAF de la colonne. Une élution subséquente avec du tampon phosphate de sodium 0,5M, pH 6,9, ne donne pas d'activité de

NAF supplémentaire (figure 5).

Exemple 7: purification de NAF par héparine-Sepharose Un échantillon de 1 ml de NAF partiellement purifié par chromatographie sur phosphocellulose (exemple 4) est chargé sur une colonne de 0,5 ml d'héparine-Sepharose 4B équilibrée dans du phosphate de sodium 10mM, pH 7,3, complémenté par du polyéthylène-glycol 6000 à 0,1% et du NaCl 50 mM. La colonne est lavée avec le même tampon, puis éluée avec du phosphate

de sodium 10mM, pH 7,3, complémenté par NaCl 1,5M. Une quan-

tité mineure de NAF est décelée dans le fluide écoulé total, par lavage de la colonne, mais la plupart de l'activité liée

à la colonne est éluée avec le tampon de force ionique supé-

-rieure (figure 6).

Exemple 8: purification de NAF par chromatographie liquide haute pression en phase inverse sur colonne de C4 Un échantillon de NAF purifié par chromatographie sur

phosphocellulose (exemple 4), puis par purification sur hy-

droxylapatite (exemple 6), est appliqué à une colonne de C4 en phase inverse à large pores (Biorad RP 304). La colonne est éluée avec un gradient de 0 à 80% d'acétonitrile dans de l'acide trifluoroacétique à 0, 1%, avec un accroissement de 0,66%/min. Le débit est de 0,5 ml/min. Les fractions sont recueillies et séchées sous vide. Les résidus sont remis en

suspension dans 100 il de PBS contenant 0,1% de polyéthy-

lène-glycol 6000 et testés pour déterminer l'activité de

NAF. Le NAF élue avec un temps de rétention d'environ 60 mi-

nutes, ce qui correspond à environ 40% d'acétonitrile, sous

forme d'un seul pic pointu (figure 7).

Exemple 9: purification de NAF par chromatographie liquide haute pression en phase inverse sur colonne de CN-propyle Un échantillon de NAF purifié par chromatographie en phase inverse comme le décrit l'exemple 8, séché sous vide et remis en suspension dans 100 il de PBS contenant 0,1% de

polyéthylène-glycol, est dilué avec un volume d'acide tri-

fluoroacétique à 0,1% et appliqué sur une colonne de cya-

no(CN)-propyle à large pores Bakerbond (Baker Research Products, Phillipsburg, NJ, USA). La colonne est éluée avec un gradient allant de 0 à 50% de n-propanol dans de l'acide trifluoroacétique à 0,1%, avec un accroissement de 0,41%/

min. Le débit est de 0,5 ml/min. Les fractions sont recueil-

lies et séchées sous vide. Les résidus sont remis en suspen-

sion dans 100 il de solution saline tamponnée au phosphate contenant 0,1% de polyéthylène-glycol 6000 et testés pour

déterminer l'activité du NAF. Le NAF élue en deux pics poin-

tus, un pic majeur ayant un temps de rétention de 53 min,

correspondant à 22% de n-propanol, et uqn pic mineur repré-

sentant moins de 30% de l'activité totale, avec un temps de rétention de 66 min, correspondant à 27,5% de n-propanol

(figure 8).

Exemple 10: chromatofocalisation de NAF Un échantillon de 4 ml de NAF partiellement purifié par chromatographie sur phosphocellulose (exemple 4) est dialysé

contre un tampon de départ constitué de chlorhydrate d'étha-

nolamine 25mM, pH 9,4, et de 0,1% de polyéthylène-glycol 6000, et chargé sur une colonne de PBE 94 (0,7x19 cm, Pharmacia) équilibrée avec le même tampon. La colonne est ensuite éluée avec 200 ml de polytampon 96-HCl (dilué au

1/10 avec de l'eau), pH 7,0, contenant 0,1% de polyéthylène-

glycol 6000. Des fractions sont recueillies toutes les 10 minutes à un débit de 10-14 ml/h et dosées pour l'activité de NAF. La plupart de l'activité élue dans la région de pH 8,5 à pH 8,8 (figure 9). PARTIE III: Caractérisation physicochimique et biologique de NAF Exemple 11: propriétés physicochimiques de NAF Du NAF partiellement purifié obtenu par chromatographie

sur phosphocellulose (exemple 4) est utilisé dans ces expé-

riences. Après la chromatographie sur phosphocellulose, les fractions ayant la plus forte activité de NAF sont dialysées pendant une nuit à 4 contre PBS au moyen d'une membrane

présentant une coupure de masse moléculaire de 1000 daltons.

La préparation obtenue est ensuite soumise aux traitements

suivants: a) incubation à 37 avec et sans trypsine, chymo-

trypsine ou protéinase K (100 g/ml), suivie de l'addition d'un excès de BSA (2 mg/ml) pour stopper la protéolyse de NAF; b) chauffage à 56 , 80 ou 95 (comparé à 22 pour le témoin); c) exposition à pH 2 ou 10 (à 220), suivie d'un

ajustement du pH à 7,4 (en comparaison de pH 7,4 pour le té-

moin); d) exposition au chlorure de lithium 2M, au chlorure

de guanidinium 6M, au 2-mercaptoéthanol à 1% ou au dodécyl-

sulfate de sodium (SDS) à 0,5% pendant 3 h à 22 , suivie

d'une dialyse pendant 24 h à 4 contre PBS. Lorsqu'on effec-

tue les additions, on manipule les échantillons sans NAF de la même manière et on les teste pour étudier l'influence

possible sur le dosage du NAF.

Comme l'indique le tableau 2, le NAF est remarquable-

ment résistant à l'inactivation. Son activité est détruite par incubation avec différentes protéases, ce qui indique que le NAF est un polypeptide. En revanche, le NAF n'est pas facilement inactivé par des conditions de chaleur, de pH acide et alcalin ou par exposition au SDS. Une certaine

inactivation est obtenue avec le 2-mercaptoéthanol, le chlo-

rure de lithium et le chlorure de guanidinium.

Tableau 2

Propriétés physicochimiques de NAF Traitement Conditions Activité relative Température 22 , 3 h 100 56 , 1 h 82 , 15 min 80 , 5 min 66 pH 2,0 22 , 3 h 76 pH 10,0 220, 3 h 90 SDS 0,5% 22 , 3 h 100 2- mercaptoéthanol 1,0% 22 , 3 h 30 chlorure de lithium 2M 22 , 3 h 52 chlorure de guanidinium 6M 22 , 3 h 68 trypsine 100 gg/ml 37 , 4 h 100 37 , 12 h 8 a-chymotrypsine 100 gg/ml 37 , 4 h 80 37 , 12 h 1 protéinase K 100 ig/ml 37 , 12 h 0 Exemple 12: exocytose induite par le NAF (induction de la libération des granulations par le NAF dans les neutrophiles humains) Des neutrophiles (5x106/ml) en suspension dans PBS/BSA sont préincubés avec ou sans cytochalasine B (5.g/ml) à 37 pendant 5 min. La libération des granulations est ensuite amorcée par addition du stimulus, par exemple un NAF ou un stimulus étalon. La réaction est stoppée 15 minutes plus tard par refroidissement rapide dans de la glace, suivie d'une centrifugation pour sédimenter les cellules. Les taux de protéines liées à la vitamine B12, de g-glucoronidase et de lactate-déshydrogénase sont déterminés dans les milieux acellulaires et les culots cellulaires, et la libération de ces constituants est calculée en pourcentage de la teneur

cellulaire totale (B. Dewalt et M. Baggiolini, Methods Enzy-

mol. 132 [1986] 267).

Les effets du NAF sur la libération des protéines liées

à la vitamine B12 et de la P-glucoronidase - qui sont res-

pectivement les constituants des granulations spécifiques et

azurophiles - sont résumés sur le tableau 3.

*Tableau 3

Exocytose dépendant d'un stimulus des granulations des neu-

trophiles humains Pourcent de libération de Stimulus CB

Protéines liées P-glucu- lactate-

à la vitamine B12 ronidase déshydro-

_gnase aucun - 6.0 0.4 2.1 0.4 6.2 2.5 NAF 50 1l - 12.9 1.6 2.7 1.3 5.8 0.7 NAF 100 gl - 13.9 2.1 3.0 1.3 6.8 2.2 fMLP 0,1 iM 14.0 0.9 2.3 0.8 5.7 1.1 aucun + 10.0 + 1.1 2.4 0.2 7.0 3.2 NAF 50 ul + 25.6 3;4 7.9 2.0 6.7 1.6 NAF 100 1l + 26.8 4.9 8.5 1.7 7.3 2.1 fMLP 0,1 gM + 35.6 5.5 12.1 4.4 5.3 1.6 valeurs moyennes écart type

Dans les neutrophiles normaux, le NAF induit l'exocyto-

se des seules granulations spécifiques. Lorsque les cellules

sont prétraitées avec de la cytochalasine B, on obtient tou-

tefois une importante libération des deux types de granula-

tions. Dans ces dernières conditions, il y a un parallèle entre la libération de la P-glucoronidase et celle de l'élastase, marqueur utilisé pour tester l'activité du NAF (exemple 1). En termes quantitatifs, les propriétés du NAF induisant l'exocytose sont analogues à celles du peptide

chimiotactique fMLP. Aucun des stimuli ne provoque la libé-

ration de-l'enzyme cytosolique lactate-déshydrogénase, ce

qui indique que le dommage cellulaire est négligeable.

Exemple 13: éclatement respiratoire induit par le NAF (induction de la formation de superoxide par le NAF dans les neutrophiles humains)

La formation de superoxide est mesurée à 37 par la ré-

duction, sensible au SOD, du ferricytochrome c (M. Markert et coll., Methods Enzymol. 132 [1984] 267). Le mélange dosé (800 il) est constitué par 0,75x106 cellules/ml de PBS-BSA

contenant 85 iM de cytochrome c. Les changements d'absorban-

ce sont enregistrés sur un spectrophotomètre à rangées de

diodes Hewlett-Packard 8451A équipé d'un échangeur de cel-

lules thermostaté à sept places. Le tableau 4 illustre la capacité du NAF à provoquer l'éclatement respiratoire dans

les neutrophiles humains.

Tableau 4

Production de superoxyde dépendant de NAF par les neutrophiles humains Réduction du cytochrome c+ NAF Vitesse maximale Total en 3 min (Il) (nmole/min) (nmole)

0.81 0.89

1.45 0.63 1.45 0.50

2.32 0.56 2.16 0.39

2.51 0.50 2.30 0.55

3.51 0.69 3.10 0.55

3.69 3.39

+ toutes les valeurs sont exprimées pour 106 cellules valeurs moyennes écart type On obtient une augmentation progressive de la vitesse

maximale et de la quantité totale de production de super-

oxyde lorsque les quantités de NAF augmentent. Comme le mon-

trent les expériences comparatives, les quantités de NAF

provoquant les taux maximum de production de superoxyde cor-

respondent à celles qui induisent l'exocytose maximale.

Exemple 14: formation de H202 (comparaison de NAF avec fMLP et C5a comme stimuli de l'éclatement respiratoire dans les neutrophiles humains) Les propriétés de NAF, fMLP et C5a comme stimuli de

l'éclatement respiratoire sont comparées au moyen de l'éva-

luation de la production de superoxyde ou de peroxyde d'hy-

drogène par les cellules stimulées. La formation de super-

oxyde est déterminée comme le décrit l'exemple 13. La

formation de peroxyde d'hydrogène est déterminée par chimio-

luminescence (M.P. Wymann et coll., Anal. Biochem. 165 [1987] 371-378). Le mélange dosé, constitué de PBS-BSA contenant 0,1M d'azoture de sodium, 0,01mM de luminol, 9 U/ml de peroxidase de raifort et 106 neutrophiles, est préincubé pendant 10 min à 37 et la réaction est démarrée

par addition du stimulus à l'aide d'une microseringue.

La figure 10 montre la formation de superoxyde induite

par l'élévation des quantités de NAF. Du fait de son démar-

rage rapide, de sa vitesse élevée et de sa stabilisation précoce, la réponse au NAF ressemble étroitement à celle

produite par fMLP ou C5a. La réponse au NAF est remarquable-

ment améliorée par prétraitement des cellules avec un PAF

(figure 10), qui améliore également la production de super-

oxyde induite par fMLP ou C5a. Une comparaison directe des

réponses à NAF, fMLP et C5a est indiquée sur la figure 9.

Les enregistrements par chimioluminescence de la vitesse de formation de H202 en fonction du temps soulignent les similitudes des réponses. Ces mesures, ainsi que d'autres, montrent en outre que le temps entre l'addition du stimulus et le début de la production de H202 induite par NAF, fMLP et C5a a des valeurs identiques et est d'environ 2 s, comme il a été rapporté antérieurement pour fMLP, C5a, PAF et le leukotriène B4 (M. P. Wymann et coll., J. Biol. Chem. 262 [1987] 12048). Les analogies qualitatives et quantitatives

de la réponse des neutrophiles au NAF, au fMLP et au C5a in-

diquent que le NAF active les neutrophiles en se liant à un récepteur de surface et se comporte ainsi comme un agoniste récepteur. Exemple 15: distinction entre NAF et C5a Comme l'indique l'exemple 14, le profil d'activité du NAF vis-à-vis des neutrophiles humains est analogue à celui de la C5a. Les analogies entre ces deux peptides s'étendent aux propriétés physicochimiques discriminatoires comme la résistance à la chaleur et aux acides. Comme la C5a et le NAF ont des effets analogues sur les neutrophiles, il faut effectuer d'autres expériences pour distinguer entièrement

entre les deux. Des échantillons de NAF et de C5a sont expo-

sés à du sérum humain frais. On sait que ce traitement transforme la C5a en son dérivé désarginylique relativement inactif par clivage à travers une carboxypeptidase. Comme le

montre la figure 11, le traitement au sérum-abolit complète-

ment l'activité de la C5a mais n'affecte pas celle du NAF.

Cela montre que les deux agents ont des structures diffé-

rentes. Exemple 16: preuve que le NAF possède son propre récepteur spécifique sur les neutrophiles Lorsqu'on stimule des neutrophiles deux fois avec une même quantité du même agoniste récepteur (par exemple fMLP)

et que l'on enregistre la production de superoxyde comme me-

sure de la réponse des neutrophiles, la seconde stimulation est pratiquement inactive. En revanche, lorsqu'on utilise

l'un après l'autre des agonistes agissant sur différents ré-

cepteurs (par exemple la fMLP suivi de la C5a) ces stimula-

tions donnent une réponse normale. Des expériences de ce type sont donc utilisées pour déterminer si le NAF agit par son propre récepteur ou par un récepteur également utilisé

par d'autres agonistes.

La figure 12a montre que les neutrophiles répondent normalement à la fMLP après une première provocation avec le

NAF ou la C5a. Sur la figure 12b, sont indiqués les résul-

tats d'une stimulation répétée avec le NAF et la C5a. Les cellules sont stimulées d'abord avec le NAF et la C5a à des concentrations qui provoquent environ la même quantité de formation de superoxyde, puis une seconde fois avec le même stimulus ou l'autre stimulus. Lorsqu'on applique deux fois le même agoniste, les cellules ne répondent pas à la secondestimulation. En revanche, on obtient une réponse normale à la C5a dans les cellules provoquées d'abord avec le NAF et

au NAF dans les cellules provoquées d'abord avec la C5a.

Comme les neutrophiles présentent une désensibilisation com-

plète à l'un ou l'autre stimulus, mais pas de désensibilisa-

tion croisée, le NAF et la C5a semblent exercer leurs effets stimulants via des récepteurs non apparentés, ce qui indique qu'ils sont de structure différente. Des combinaisons du NAF avec le PAF, la fMLP et le leucotriène B4 ne donnent pas non

plus de désensibilisation croisée. NAF agit donc par l'in-

termédiaire d'un récepteur sélectif, inconnu jusqu'à pré-

sent.

Exemple 17: accumulation des neutrophiles et fuite plasma-

tique induites par le NAF chez le lapin On examine les réponses inflammatoires dans la peau de

lapins albinons néo-zélandais conscients de 2,0 à 2,5 kg.

Les érythrocytes dans le sang des lapins donneurs sont sédi-

mentés avec de l'hydroxyéthylcellulose (Polysciences, War-

rington, Pa.) et les neutrophiles contenus dans le plasma

résultant riche en leucocytes sont purifiés (>94% de neutro-

philes) par centrifugation à gradient de densité, sur Per-

coll (Pharmacia, Uppsala, Suède). Les cellules sont remises en suspension dans un solution de Tyrode exempte de Ca2+ et de Mg2+, contenant du plasma pauvre en plaquettes à 10% en concentration de 106 leucocytes/ml et marquée pendant 15 min à la température ambiante avec 40 iCi de 111indium-oxine

(Amersham) pour 106 cellules. Les cellules marquées sont la-

vées par centrifugation à travers un plasma pauvre en pla-

quettes à 10% et environ 106 cellules par récipient sont mé-

langées avec 10 gCi de sérum-albumine humaine marquée à l'iode 125 (Amersham) et injectées par voie intraveineuse dans la veine auriculaire latérale des lapins dont on étudie

les lésions inflammatoires. On effectue ensuite des injec-

tions intradermiques d'agents inflammatoires et on sacrifie

les animaux 2 h plus tard dans les études avec l'actinomyci-

ne D et la polymyxine B et 4 h plus tard dans les expé-

riences de relation dose-effet. Au milieu de la période pen-

dant laquelle les cellules radiomarquées sont en circula-

tion, on effectue un prélèvement de sang et on détermine les activités spécifiques des neutrophiles et du plasma dans le sang. La radioactivité dans les lésions inflammatoires, à la fin de chaque expérience, est déterminée dans un compteur gamma multicanaux, l'activité dans les sites cutanés témoins

est soustraite et le nombre absolu de neutrophiles et le vo-

lume de plasma accumulé dans les lésions inflammatoires sont

calculés pour les activités spécifiques. Les nombres de neu-

trophiles dans les lésions inflammatoires sont normalisés entre les animaux par expression des résultats en nombre de

cellules par 106 neutrophiles circulant par ml de sang péri-

phérique, selon la méthode de Cybulsky et coll., Am. J.

Pathol. 124 [1986] 367.

Le NAF recombinant obtenu comme le décrit l'exemple 19 est dissous à 400 ig/ml dans un milieu essentiel minimal (50mM) plus 0,45M de NaCl (pH 6,5). De l'endotoxine (E. coli sérotype 055:B5, Sigma, St. Louis, Mo.) est dissous dans du

sérum physiologique normal apyrogène. De la fMLP est dis-

soute dans du diméthylsulfoxyde à 10-2M et diluée jusqu'aux

concentrations de travail dans PFS. On dissout de la poly-

myxine B et de l'actinomycine D dans 1 ml d'éthanol et on dilue 20 fois en mélangeant avec le NAF, l'endotoxine ou la fMLP dans PFS. Dans les études sur l'inhibition des réponses inflammatoires, on injecte 40 gg de polymixine B et 10-7 moles d'actinomycine D par site cutané avec 10-6 moles d'endotoxine. Dans toutes les expériences, on injecte par voie intradermique 0,2 ml d'agents inflammatoires par site à

travers des aiguilles de diamètre 26, en faisant 5 injec-

tions de chaque traitement pour chaque animal.

Le NAF induit une augmentation, dépendante de la dose, de la fuite plasmatique (figure 16) et une accumulation des neutrophiles (figure 17) sur la gamme de doses testées

(10-11 à 10-9 moles par site). A titre comparatif, l'endo-

toxine provoque une fuite plasmatique (figure 16) et une ac-

cumulation des neutrophiles <figure 17) d'intensité compa-

rable, à 10-13 moles par site. Chez 5 lapins, le NAF est 3 à fois plus puissant que la fMLP, comme stimulus pour la

fuite plasmatique et l'accumulation des neutrophiles. L'ac-

cumulation des neutrophiles induite par dilution du tampon

utilisé pour dissoudre le NAF jusqu'à la concentration pré-

sente dans les solutions fournissant 10-9 moles par site ne diffère pas des réponses données par les sites ne recevant

que PSF seul. La possibilité que l'activité de la prépara-

tion du NAF puisse être due à une impureté endotoxine est examinée par injection de polymyxine B (40 gg/site) avec du NAF, de la fMLP ou de l'endotoxine. La polymyxine B provoque une inhibition de 84% de la réponse à l'endotoxine (10-13

moles) mais est sans effet sur l'accumulation des neutro-

philes induite par le NAF (10-9 moles) ou la fMLP (10-9

moles) (figure 18).

L'injection d'un inhibiteur non réversible de trans-

cription d'ARN, l'actinomycine D (10-7 moles/site), avec -13 moles d'endotoxine, provoque une inhibition de 90% de l'accumulation des neutrophiles (figure 19). En revanche,

l'actinomycine D n'a aucun effet sur l'accumulation des neu-

trophiles induite par le NAF (10-9 moles) ou par la fMLP

(10-9 moles) (figure 19).

Les résultats indiquent que le NAF est actif in vivo et

induit une accumulation, dépendante de la dose, des neutro-

philes et une fuite de plasma dans les lésions inflamma-

toires. L'activité molaire du NAF est comparable à celle classique de la chimiotactine C5a et LTB et 3 à 5 fois plus élevée que celle de la fMLP. L'accumulation des neutrophiles

induite par le NAF n'est pas inhibée par injection intrader-

mique simultanée d'un inhibiteur de synthèse protéinique (actinomycine D). Le NAF agit ainsi directement, comme un agoniste chimiotactique tel que fMLP et contrairement à l'endotoxine. Exemple 18: exocytose induite par le NAF (effet sur les neutrophiles du lapin):

Des neutrophiles de lapin sont isolés du sang périphé-

rique (obtenu de la veine auriculaire ou de l'artère auricu-

laire) par sédimentation dans du dextran, suivie d'une cen-

trifugation à gradient de densité de Hypaque-Ficoll. On uti-

lise un NAF naturel purifié.

Conditions d'exocytose: 0,6 x 106 cellules (dans un

volume total de 0,15 ml) prétraitées avec de la cytochala-

sine B pendant 5 minutes à 37 sont stimulées avec du NAF (0,1 - 100 nM) ou de la fMLP (100 mM) pendant 15 min. On

dose, dans le milieu acellulaire, la N-acétyl-g-glucosamini-

dase, qui est un marqueur de granulations azurophiles. Les

résultats sont indiqués sur le tableau 5.

Tableau 5

Exocytose induite par NAF Stimulus Concentration N-acétyl-pglucosaminidase (nM) (pmole/min) aucun 41

NAF 0.1 53

1.0 99

10.0 139

100.0 157

fMLP 100.0 181 PARTIE IV: NAF Recombinant Exemple 19: synthèse et expression de NAF dans E. coli a) Synthèse et purification des oligonucléotides Les oligonucléotides ON-1 à ON-6 (voir figure 13) sont synthétisés dans un synthétiseur d'ADN automatisé au moyen d'une chimie standard avec, comme monomères, des nucléosides de 3'-3-cyanoéthyl-N,Ndiisopropylphosphoamidite, sur un support solide comme du gel de silice Fractosil ou du verre poreux contrôlé (VPC) (S.L. Beaucage et M.H. Caruthers, Tetr. Letters 22 [1981] 1859; N.D. Sinha et coll., Nucleic

Acides Res. 12 [1984] 4539).

Les matières détritylées sont séparées du support par un traitement de 2 heures avec de l'ammoniaque à 25% à la

température ambiante, tous les groupes protecteurs sont éli-

minés par chauffage de la solution ammoniacale pendant 20 heures à 55 et les produits sont lyophilisés. La séparation des matières brutes s'effectue par électrophorèse sur gel de

polyacrylamide (PAGE) avec 12% d'acrylamide, 0,3% de bis-

acrylamide, 7M d'urée, 0,089M de tris-borate, 0,089M d'acide

borique, 0,002M d'EDTA à 20 V/cm. Les oligonucléotides en-

tiers sont localisés par image UV sur des plaques de gel de

silice fluorescent, les parties comportant les gels sont dé-

coupés et électro-éluées dans une chambre d'élution. Les so-

lutions concentrées sont dessalées sur une colonne de Biogel

P2 (30x0,9 cm), par élution avec de l'éthanol à 10%, et lyo-

philisées. Les échantillons de ON-1 à ON-6 sont marqués ra-

dioactivement avec 32P-_-ATP et de la polynucléotide-kinase.

L'analyse par PAGE et l'autoradiographie confirment qu'elles sont homogènes. Les séquences correctes sont confirmées par

séquençage de Maxam-Gilbert et les oligonucléotides sont im-

mobilisés sur un papier filtre modifié (A. Rosenthal et

coll., Nucleic Acids Res. 13 [1985] 1173-1184).

b) Recuit et ligature Pour le recuit et la ligature, des portions de 250 pmoles des oligonucléotides sont phosphorylées avec 4 iCi de

32P-ATP (5000 gCi/mmole) et 9 unités de polynucléotide-ki-

nase dans 20 41 de tampon kinase (T. Maniatis et coll., Mo-

lecular Cloning, A Laboratory Manual [1982], Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.) pendant 40 min à 37 , opération suivie d'une poursuite de 20 min avec 5 mmoles d'ATP non

marqué. La réaction est stoppée avec 1 g1 d'EDTA 0,5M à 70 .

Les oligonucléotides phosphorylés sont purifiés par adsorp-

tion sur des cartouches de NENSORB 20 (Du Pont) et élution avec de l'éthanol à 20% et le rendement est d'environ 90%. Le recuit et la ligature simultanés de quantités égales de à 100 pmoles de ON-2 à ON-5 5'phosphorylés et de ON-1 et ON-6 non phosphorylés s'effectue dans 25 l1 de tampon (125 mM Tris-HCl, pH 7,6) contenant 25nM de MgCl2. Le mélange est

chauffé à 90 pendant 4 min, refroidit à 14 en 3 h et in-

cubé pendant 14 h supplémentaires à 14 . Le volume est ajusté à 60 gl avec 50nM de Tris-HCl, pH 7,6, 10mM de MgCl2,

O10mM de dithiothréitol, lmM d'ATP, 0,1 mg/ml de sérum-albu-

mine bovine contenant 1600 à 2000 unités de T4-ligase. La

ligature est réalisée pendant 14 h à 14 et stoppée par ad-

dition de 1 l1 d'EDTA 0,5M et chauffage à 70 . Après extrac-

tion au phénol, la solution aqueuse est amenée à 0,3M d'acé-

tate de sodium, 0,01M d'acétate de magnésium, l'ADN est pré-

cipité avec de l'éthanol et les produits sont purifiés par PAGE (8% d'acrylamide, urée 7M) avec une charge maximale de pmoles d'ADN par fente de 1,5 cm d'un gel de 0,5 mm d'épaisseur. Le produit de longueur correcte est identifié par autoradiographie, le segment de gel est excisé et l'ADN est électroélué pendant 6 h à 200 V dans du Biotrap BT100 et précipité dans l'éthanol, pour donner un rendement final de à 8 pmoles d'ADN double brin purifié par 100 pmoles d'oli- gonucléotide. c) Clonage du gène synthétique Un échantillon de 110 ng du gène de NAF synthétique

isolé est ligaturé avec 260 ng d'ADN plasmide pBS M13 dé-

coupé par SpHI/BamHI purifié sur gel d'agarose (Stratagene).

Un dixième de ce mélange de ligature est utilisé pour trans-

former 200.l de cellules 5K de souche E. coli rendues com-

pétentes par la méthode de D. Hanahan, J. Mol. Biol. 166

3] 557-580 et environ 320 colonies résistantes à l'am-

picilline sont produites par ng d'ADN fourni. Six clones sont choisis et cultivés pendant une nuit dans un milieu

bouillon L/ampicilline. L'ADN plasmide est préparé (H.C.

Birnbolm et J. Doly, Nucleic Acids Res. 7 [1979] 1513-1523) et appliqué sur du gel d'agarose à 1%. De l'ADN pur enroulé en super-hélice est isolé par électrophorèse des bandes dans du papier 3MM (Whatman) et centrifugation dans des tubes d'Eppendorf. Après extraction au phénol et précipitation

dans l'éthanol, l'ADN est séquencé par la méthode de termi-

naison des chaînes plasmidiques dénaturées par une base, au

moyen d'amorces T3 et T7 (Stratagene) et de l'enzyme séqué-

nase (E.J. Chen et coll., DNA 4 [1985] 165-170).

Parmi les 6 clones, trois, à savoir les clones 1, 2 et 6, contiennent la séquence de NAF correcte. Les trois autres

clones comportent des erreurs: le clone 3 contient un ré-

sidu G supplémentaire inséré après le codon d'initiation ATG, ce qui fait que la totalité de la séquence de codage

est déphasée. Dans le clone 5, C est remplacé par T en posi-

tion 34, ce qui fait qu'un codon d'arrêt se forme après

l'acide aminé n 6. Enfin, le clone 4 n'a pas de G en posi-

tion 13. Cette position ne figure pas dans la séquence co-

dante mais dans la région entre le codon d'initiation et le

site de liaison au ribosome.

Le plasmide contenant la séquence correcte (clone 6) est découpé avec les enzymes de restriction ClaI et BamHI et le fragment à 237 bp est isolé du gel d'agarose par élution dans du papier 3 MM comme ci-dessus. Ce fragment est ensuite ligaturé à un fragment d'ADN linéaire contenant, de gauche à droite: - un site d'endonucléase de restriction BamHI; - une séquence de terminaison de transcription synthétique (CCCGGGCGATGAATCGCCCGGG ou CCCGGGCGATTCATCGCCCGGG);

- une section de plasmide pAT153, depuis le site SalI au nu-

cléotide n 651, en passant par l'origine de réplication et le gène de résistance à l'ampicilline, jusqu'au site EcoRI au nucléotide n 0; - le promoteur E. coli tryptophane; - un site ClaI situé approximativement à 5 paires de bases

en aval du site de liaison au ribosome dans le promoteur.

Le plasmide d'expression résistant à l'ampicilline ré- sultant, désigné par p(NAF)-6T3 (figure 14) est transformé

en cellules E. coli de souche HB101.

La séquence de terminaison de la transcription n'est pas essentielle pour l'expression de NAF dans E. coli. Elle permet une interruption efficace de l'ARNm-NAF produit par la E. coli-polymérase et accroît ainsi le rendement de l'expression. Le NAF peut cependant aussi être exprimé dans

le même vecteur sans la séquence de terminaison de la trans-

cription, mais le rendement est alors, cependant, 30 à 50%

plus faible.

Ce gène synthétique codant pour le NAF, ainsi que d'autres gènes codant pour la même séquence peptidique de base, mais ayant une séquence nucléotidique différente ou

codant pour des peptides de longueurs variables, peut égale-

ment être exprimé dans E. coli à l'aide d'autres promoteurs, par exemple les promoteurs lambda PL ou les promoteurs E. coli Lac ou Tac. Les gènes peuvent également être introduits

à l'aide d'autres vecteurs et exprimés dans d'autres orga-

nismes, par exemple dans des levures, des champignons,-des cellules animales, des lignées cellulaires bactériennes, des

végétaux et dans des organismes transgéniques supérieurs.

c) Expression

L'expression de p(NAF)-6T3 dans E. coli HB 101 est ef-

fectuée de la manière suivante.

Préculture 1: on ajoute 50 1 d'une culture dans le glycé-

rol de la lignée cellulaire maintenue à -20 à 10 ml de mi-

lieu LB stérile (10 g/1 de tryptone, 5 g/l d'extrait de le-

vure, 10 g/l de NaCl) contenant 10 ig/ml d'ampicilline. La culture est agitée dans un incubateur pendant 8 h à 37 et à

200 t/min.

Préculture 2: 8 ml du milieu de préculture 1 sont inoculés dans 1 1 de milieu M9 (J.H. Miller Experiments in Molecular Genetics [1972], Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., p. 431-433) contenant 0,2% de glucose, 0, 5% de casaminoacides (Difco), 25 mg/1 de tryptophane et 100 mg/ml d'ampicilline. Cette culture est agitée dans un incubateur pendant 15-16 h

à 37 et à 200 t/min.

Fermentation: la fermentation principale est effectuée dans un fermenteur de 70 1, à un volume de travail de 35 1. On utilise le même milieu que pour la préculture 2, sauf que

l'on n'ajoute que 5 mg/1 de triptophane. On inocule la pré-

culture 2 dans ce milieu et on poursuit la fermentation à 37 jusqu'à ce que l'on obtienne une densité optique de 2,8 à 600 nm (DO600). Lorsque la DO600 atteint 2,8, on ajoute de l'acide indole-acrylique dans de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 20 mg/l. Au bout de 4 h, la DO600 est passée à 13,5; la centrifugation donne un culot de 516 g. d) Purification du NAF recombinant Des cellules de E. coli contenant du NAF recombinant sont stockées à -20 . Des lots de 100 g sont lavés avec 100 ml de Tris-HCl 20mM, pH 8,0, contenant 50mM de NaCl, remis en suspension dans 250 ml du même tampon et rompus sous 2500 psi dans une presse française (Aminco). Après centrifugation à 47 000xg pendant 40 min, le culot est remis en suspension

dans le même tampon, recentrifugé et stocké à -20 . Des por-

tions de 10 g sont mises en suspension dans 100 ml de MES-

NaOH 50mM, pH 6,5, 6M de chlorhydrate de guanidine, agitées

pendant 1 h et dialysées contre de l'acide acétique à 0,5%.

Le dialysat est clarifié par centrifigation et chargé en

parties aliquotes sur une colonne de Mono-S (HR 5/5, Pharma-

cia). La colonne est lavée avec MES-NaOH 50mM, pH 6,5, contenant 0,2M de NaCl, et éluée à une vitesse de 0,5 ml/min avec un gradient linéaire dans le même tampon (0,2 à 0,5M de NaCl). Les fractions ayant la teneur en NAF la plus élevée sont regroupées et chromatographiées sur une colonne de CLHP en phase inverse à larges pores (Vydac.C4TP 0,46x125 mm) dans de l'acide trifluoroacétique à 0,1% et avec un gradient

* de 20 à 60% d'acétonitrile, à un débit de 1 ml/min.

PARTIE V: Identité du NAF naturel et du NAF recombinant Exemple 20: identité physicochimique

Le NAF récupéré par CLHP (voir exemple 19) est consi-

déré comme étant pur sur la base de deux critères: des gels de SDSpolyacrylamide colorés à l'argent présentent une

seule bande coïncidant avec le NAF naturel (1 gg de NAF re-

combinant provenant de la fraction du pic CLHP dans la-bande

2 contre 1 gg de NAF naturel dans la bande 3, avec les éta-

lons de masse moléculaire cytochrome c [12,5 kd] et aproti-

nine [6,5 kd] dans la bande 1), et la dégradation d'Edman du

peptide segmenté à l'acide formique donne des séquences ami-

noterminales et carboxyterminales correspondant à celles du NAF naturel à 72 acides aminés. L'analyse des acides aminés

est en accord avec la composition attendue de la séquence.

On ne trouve pas de méthionine, ce qui indique que ce résidu

est probablement éliminé par les bactéries.

Exemple 21: identité biochimique -

Du NAF naturel et du NAF recombinant sont testés en pa-

rallèle sur des neutrophiles humains. Ils provoquent des

changements pratiquement identiques de Ca2+ libre cytoso-

lique, donnant une élévation maximale à une concentration aussi faible que 3nM (figure 15). On obtient avec les deux

préparations une réponse à l'éclatement respiratoire dé-

pendant de la concentration presque identique dans l'inter-

valle de 1 à 3OnM évaluée par chimioluminescence. L'équiva-

lence entre le NAF naturel et le NAF recombinant est égale-

ment reflétée par des mesures de chimiotaxie et d'exocytose.

La migration chimiotactique s'observe entre 0,1 et 10nM,

avec un effet maximal à lnM (tableau 6). Avec l'un ou l'au-

tre peptide, on observe une libération significative de protéine liée à la vitamine B12 à partir des granulations spécifiques à 0,3nM et de la 5glucuronidase à partir des granulés azurophiles à lnM. Cet effet augmente avec la

concentration du stimulus, comme l'indique le tableau 7.

Tableau 6

Chimiotaxie des neutrophiles induite par le NAF NAF (nM) nat rec

0.1 98 6 88 6

1.0 123 6 124 3

10.0 127 3 126 4

Les valeurs représentent les moyennes écart type de migra-

tion du front d'attaque, en nm (n=3). La migration aléatoire

en l'absence d'un stimulus chimiotactique est de 61 5 m.

nat = NAF naturel rec = NAF recombinant

Tableau 7

Exocytose induite par le NAF Protéine liée à la vitamine B12 3glucuronidase NAF (nM) nat rec nat rec

0.3 7.8 3.6 5.4 2.0 1.1 0.8 0.8 0.6

3.0 21.9 4.2 20.2 + 3.7 8.2 1.9 7.1 1.7

30.0 28.4 3.7 28.1 3.8 14.2 2.1 12.9 2.9

Le pourcentage de libération à partir de neutrophiles

prétraités à la cytochalasine B (4x106 cellules/ml) est sti-

mulé pendant 10 min avec du NAF naturel (nat) oudu NAF recom-

binant (rec). La libération provenant des témoins non stimu-

lés correspondants est déduite. Moyennes écart type (n=3).

R E V E N D-I C A T I O N S

1.- Facteur d'activation des neutrophiles (NAF).

2.- NAF selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il

est dérivé de monocytes humains.

3.- NAF selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il possède la séquence d'acides aminés complète ci-dessous:

Ser-Ala-Lys-Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-Ser-Lys-Pro-

Phe-His-Pro-Lys-Phe-Ile-His-Glu--Leu-Arg-Val-Ile-Glu-Ser-Gly-Pro-

HHis-Cys-Ala-Asn-Thr-Glu-Ile-Ile-Val-Lys-Leu-Ser-Asp-Gly-Arg-Glu-

Leu-Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-Val-Glu-Lys-

Phe-Leu-Lys-Arg-Ala-Glu-Asn-Ser. 4.- NAF selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'extrémité aminoterminale est prolongée comme cidessous:

Ala-Val-Leu-Pro-Arg-Ser-Ala-Lys-Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-

Thr-Tyr-Ser-Lys-Pro-Phe-His-Pro-Lys-Phe-Ile-Lys-Glu-Leu-Arg-Val-

Ile-Glu-Ser-Gly-Pro-

5.- NAF selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'extrémité aminoterminale est raccourcie comme ci-dessous:

Lys-Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-Ser-Lys-Pro-Phe-His-

Pro-Lys-Phe-Ile-Lys-Glu-Leu-Arg-Val-Ile-Glu-Ser-Gly-Pro-

6.- NAF selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'extrémité aminoterminale est raccourcie comme ci-dessous:

Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-Ser-Lys-Pro-Phe-His-Pro-

Lys-Phe-IlelLys-Glu-Leu-Arg-Val-Ile-Glu-Ser-Gly-Pro-

7.- NAF selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un mélange de protéines possédant deux ou

plus des séquences indiquées dans les revendications 3 à 6.

8.- NAF selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un mélange d'environ 70% du NAF identifié dans la revendication 3, d'environ 17% du NAF identifié dans la revendication 4, d'environ 8% du NAF identifié dans la revendication 5, et d'environ 5% du NAF identifié dans la

revendication 6.

9.- NAF selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il

est synthétique.

10.- NAF selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il

est recombinant.

11.- NAF selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il

est biologiquement actif.

12.- NAF selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il possède l'une quelconque des séquences indiquées dans l'une

quelconque des revendications 3 à 6.

13.- NAF selon la revendication 2 ou 9, caractérisé en ce

qu'il a une masse moléculaire d'environ 8500, une masse mo-

léculaire apparente d'environ 6500 sur SDS-PAGE et un point

isoélectrique d'environ 8,6.

14.- Procédé de préparation du NAF de la revendication 1,ca-

ractériséencequ'ilcomprend la purification par chromatographie du

surnageant de cultures de monocytes humains et la récupéra-

tion. 15.- Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce

qu'il comprend une chromatographie sur phosphocellulose.

16.- Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce

qu'il comprend une chromatographie sur hydroxylapatite.

17.- Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce

qu'il comprend une chromatographie sur héparine-Sepharose.

18.- Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend une CLHP en phase inverse sur une colonne de C4. 19.- Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce

qu'il comprend une CLHP en phase inverse sur colonne de CN-

propyle. 20.- Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend une combinaison de deux ou plus des méthodes

chromatographiques des revendications 15 à 19.

21.- Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce

qu'il comprend la purification par chromatofocalisation.

22.- Procédé de préparation du NAF de la revendication 9,

caractérisé en ce qu'il comprend la synthèse, la purifica-

tion et la ligature des oligonucléotides correspondants, le clonage du gène de NAF synthétique résultant, son expression

et la récupération et la purification.

23.- Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce

qu'il comprend l'expression dans E. coli.

24.- Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce

qu'il comprend l'utilisation de l'un quelconque des oligonu-

cléotides ON-1 à ON-6.

25.- Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce

qu'il comprend l'utilisation du vecteur d'expression p(NAF)-

6T3. 26.- Vecteur d'expression p(NAF)-6T3 et ses équivalents

convenant pour l'expression dans E. coli du NAF de la reven-

dication 10.

27.- ADN possédant la séquence nucléotidique indiquée sur la figure 13 et ses équivalents convenant pour l'expression

dans E. coli du NAF de la revendication 10.

28.- ADN selon la revendication 27, caractérisé en ce qu'il

s'agit d'un ADNc.

29.- Lignée cellulaire transformée par un ADN codant pour le

NAF de l'une quelconque des revendications 3 à 6.

30.- NAF selon l'une quelconque des revendications 1 à 13,

caractérisé en ce qu'il est utilisable en thérapeutique.

31.- NAF selon l'une quelconque des revendications 1 à 13,

caractérisé en ce qu'il est utilisable dans le traitement

des troubles qui sont accompagnés ou provoqués par une modi-

fication du nombre ou de l'état d'activation des neutro-

philes-cellules polymorphonucléaires.

32.- NAF selon l'une quelconque des revendications 1 à 13,

caractérisé en ce qu'il est utilisable dans le traitement des troubles dans lesquels une élévation du nombre ou de

l'état d'activation des neutrophiles-cellules polymorphonu-

cléaires conduit à une amélioration clinique.

33.- NAF selon l'une quelconque des revendications 1 à 13,

caractérisé en ce qu'il est utilisable dans les infections

bactériennes, mycoplasmiques, par les levures et les champi-

gnons ou dans les infections virales.

34.- NAF selon l'une quelconque des revendications 1 à 13,

caractérisé en ce qu'il est utilisable dans les maladies in-

flammatoires.

35.- NAF selon l'une quelconque des revendications 1 à 13,

caractérisé en ce qu'il est utilisable dans le psoriasis,

les affections arthritiques ou l'asthme, ou dans les trou-

bles présentant une numération des neutrophiles anormalement faible et/ou un taux de neutrophiles anormalement faible, ou dans la préparation d'antagonistes utilisables dans ces

indications. 36.- NAF selon l'une quelconque des revendications 1 à 13,

caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé selon

l'une quelconque des revendications 14 à 25.

37.- Composition pharmaceutique caractérisé en ce que un NAF

selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, avec un

véhicule ou un diluant pharmaceutiquement acceptable.

38.- Procédé de traitement caractérisé en ce que l'adminis-

tration d'une quantité thérapeutiquement efficace-d'un NAF

selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 à un sujet

nécessitant un tel traitement.

39.- Etapes, caractéristiques, compositions et composés dé-

finis ou indiqués dans la description et/ou les revendica-

tions de cette demande, individuellement ou collectivement, et toutes combinaisons ou deux ou plusieurs desdites étapes

ou caractéristiques quelconques.