JPS60166696A - 新規生理活性ポリペプチドのｄνａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 を有するポリデオキシリボ核酸（以下ＤＮＡと略する）
に関する。

本発明は又、該ＤＮＡを含む複製可能な組換ＤＮＡ及び
該複製可能な組換ＤＮＡで形質転換された微生物−また
は細胞に関し、更に又、該ＤＮＡが有する遺伝情報を発
現して得られる新規生理活性ポＩＪ　＜プチド及び−そ
の製造方法に関する。

史に詳しくｄ：、組換ＤＮＡ技術を用いてＴＮＦ（Ｔｕ
ｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔ．ｏｒ）のＤＮＡ
配列及びそれから演鐸されるＴＮＦのアミノ酸配列、寸
たこのＤＮＡを用いるＴＮＦの製造法、また、この製法
により得る産生される産生物の用途に関するものである
。

本明細書において、アミノ酸、被プチドはＴＵＰＡＣ−
ＴＵＢ生化学命名委員会（　ＣＢＮ　）で採用された略
記法により表示され、例えば下記の略号が使用される。

なお、アミノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は
、特に明示しなければＬ体を示すものとする。

Ｃｙｓ　：システィン残基 Ｇｉｎ　：グルタミン残基 Ａｓｐ　：アスノぐラギン酸残基 Ｐｒｏ　：ゾロリン残基 Ｔｙｒ　：チロシン残基 Ｖａｔ：バリン残基 Ｌｙｓ　：リジン残基 Ｇｌｕ　：グルタミン酸残基 Ａ／−ａ　：アラニン残基 Ａｓｎ　：アスノやラギン残基 Ｌｅｕ　：ロイシン残基 Ｐｈｅ　：フェニルアラニン残基 ａｔｙ　：ダリシン残基 Ｈｉｓ：ヒスチジン残基 Ｓｅｒ　：セリン残基 Ｔｈｒ　：スレオニン残基 Ｔｔｅ　：イソロイシン残基 Ｔｒｐ　：　トリゾトファン残基 Ａｒｇ　：アルギニン残基 Ｍｅｔ：メチオニン残基 （５） 才た、本明細書中においてＤＮＡのポリマーまたはオリ
ゴマーは下記の如き略号の配列により表記する。

Ａ：２７−デオキシアデニル酸 Ｃ：２′−デオキシシチジル酸 Ｇ：２′−デオキシグアニル酸 Ｔ：チミジル酸 特にことわらない限り、配列の左から右への方向は５リ
）ら３′への方向を示すものとする。

網内系賦活化作用を有する種々の物質、例えば、各種ダ
ラム陽性菌やエンドトキシンにより誘導され、抗腫瘍細
胞能力などの生理活性を有する物質の存在は多数報告さ
れている。例えばＣａｒｓｗｅｌｌらは、ＣＤ−Ｉ　Ｓ
ｗｉｓｓ　マウスにＢａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌｍｅｔｔ
ｅ−Ｇｕｅｒｉｎ　（ＢＣＧ）を投与し、その２週間後
にエンドトキシンを静脈内注射して得られる該マウスの
血清が、培養し細胞に対して殺細胞作用を有すること、
およびＭｅｔ．ｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａで担癌させた（
　ＢＡＬＢ／ｅ　ＸＣ５７ＢＬ／６　）　Ｆ１マウスの
腫瘍を出血性壊死に至らしめる現象を見出し、ＴＮＦ　
（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆ宮。、）（６） と名づけだ［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅ
ｔ、　ＵＳＡ　７２巻（扁９　）３６６６〜３６７０頁
（１９７５年）］。その後、３ｕｆｆら（Ｊ、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｌ、　１２５巻（ＪｒＩ４）　１６７１〜１６７
７頁（１９８０年）〕およびＭａ　ｔ、　ｔ　ｈ　ｅｗ
ｓら［Ｂｒ、Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ　４２巻４１６〜４２２頁（１，９８０年
）〕は、前記Ｃａｒｓｗｅｌｌらの方法に準じて調製し
たウサギ血清からＴＮＦの精製を試みて、それぞれ原血
清に比べて約２０００倍および約１０００倍精製された
ものを得ている。しかし、いずれの場合にも精製された
ものに関しては動物実験において抗腫瘍効果を確認して
いない。

特開昭５７−１４０７２５号は、網内系賦活化作用を有
する物質の１種−！たは２種以上を哺乳動物（マウス、
ウサギ、モルモット等）に投与し、次いでグラム陰性菌
由来のエンドトキシンを注射することによって、または
哺乳動物由来の活性化マクロファージを含む組織培養系
にグラム陰性菌由来のエンドトキシンを加えることによ
って誘発される制癌作用を有する蛋白性生理活性物質を
単離精製した、と開示している。更に、その物質の分子
ｍは、ケ９ル漣過法および８１）Ｓ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法では３９，０００±５，０００、等電
点けＰＨ３，９±０３（等電点電気泳動法）である、と
開示しているが、その詳細な構造は開示されていない。

一方Ｍａｔ、ｔ、ｈｅｗｓ　［Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ
　４４巻（３）４１８〜４２４頁（１９８１年）〕はＢ
ＣＧを投与し２週間を経過したウサギの各種組織から得
た単核寅食細胞がその細胞培養液へエンドトキシンを添
加することにＪ：すＬ細胞障害性物質を生産することを
示している。しかｌ〜、この物質の詳細な構造は示され
ておらず、また血清中に見出されるＴＮＦと同一の物質
であるという証拠も示されていない。

る物質を投与されたウサギから、細菌のエンドトキシン
による刺激にてＬ細胞障害活性を産生ずる細胞を取得し
、該り細胞障害活性が、ウサギ血清　□から得るＴＮＦ
と分子量的、血清学的に同一であることを証明すること
に成功した。

一方遺伝子操作技術の進歩に伴いアミノ酸配列が知られ
ていない蛋白であっても、その遺伝子を単離することが
できれば、その構造の解明から蛋白の構造を解明し、才
たこの遺伝子を用いることにより、微生物または細胞培
養で該蛋白を製造することが可能となった。

本発明者は、このような遺伝子操作技術を上記り細胞障
害活性産生細胞に応用して研究を続けた結果、ＴＮＦ遺
伝子の単離に成功し、その遺伝子構造及び蛋白構造を決
定するに至り、またこの遺伝子を用いるＴＮＦの製造に
成功し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明はＴＮＦが次の如きアミノ酸配列を有
するＩり被プチドであることを開示する。

Ｓｅｒ　Ａｔａ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｔａ　Ｌｅｕ　Ｓ
ｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　Ａｔａ　Ｉ（ｉｓ　Ｖａｌ　Ｖａｔ　Ａｔａ　
Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｔｎ　ＶａｌＧｔｕ　Ｇｔｙ　Ｇｔ
ｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｔｎ
　ＡｒｇＡｔａ　Ａｓｎ　Ａｔａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａ
ｒｇ　Ａｓｎ　ＧＬｙ　Ｍｅｔ、　ＬｙｓＬｅｕ　Ｔｈ
ｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｔｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｖａｔ
Ｐｒｏ　ＡｔａＡｓｐ　Ｇｔｙ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅ
ｕ　Ｉｔｅ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｔｎ　Ｖａｌ（９） Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇａｙ　Ｇｉｎ　Ｇｔｙ　Ｃ
ｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　ＴｙｒＶａｔＬｅｕ　Ｌｅｕ　
Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐ
ｈｅＡｈａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ
　Ｌｙｓ　Ｖａ２　Ａｓｎ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ａ
／：ａ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｈ
ｉｓ　ＡｒｇＧｉｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ
　Ａ／ｉａ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ、　ＡｔａＴｒｐ
　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｉｔｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　
Ｇａｙ　Ｇｔｙ　ＶａｌＰｈｅ　Ｇ４ｎ　Ｌｅｕ　Ｇｔ
ｕ　Ｌｙｓ　Ｇｔｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　５ｅｒ
Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　ＶａｔＡｓｎ　Ｇｔｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌ
ｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ＡｓｐＬｅｕ　Ａ４ａ　Ｇｌｕ　
Ｓｅｒ　Ｇｔｙ　Ｇｔｎ　Ｖａｔ’Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇ
ｌｙＴｌ−ｅ　Ｔｉｅ　Ａ／−ａ　Ｌｅｕ 上記ｙ４Ｆ！　リ＜プチドはまた成熟ＴＮＦ’とも称さ
れる。

本発明は寸た、前記ポＩＪ　ＳゾチドのＮ末端にメチオ
ニン残基がペプチド結合しているポリペプチドをも包含
する。

本発明はまた、ＡＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＧＡ、ＧＴＡＴ
ＧＡＴＣＣＧＧＧＡＣＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧ
ＧＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＡＧＧＧＧ
ＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＡＧＣＧＴＴＧＣＣＴ
ＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧ
ＣＴＣＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＴＣＴ
ＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡ、ＧＧＧＴＧＡ
ＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＣ
ＣＣＣ’ＡＡＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡ、ＴＣＴＡＧＴＣＡ
ＡＣＣＣＴＧＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＧＧＴＣＡＣＣＣＴ
ＣＡＧＡの塩基配列で示されるＤＮＡから導かれるアミ
ノ酸配列で示されるベノチ］・ゝのＣ−末端を含む一部
また全部のペプチドが前記成熟ＴＮＦのＮ−末端側に結
合している中間体をも包含する。

自然の変異により捷たは人工的変異により、主たる活性
に変化を与えることなく、蛋白質の構造の一部を変異せ
しめることが可能であるが、本発明は、前記すべてのポ
リペプチドの相同変故に相当する構造を有するポリ被ゾ
チドをも包含する。

更に本発明はＴＮＦ遺伝子が５′より次の如き塩基配列
を有するものであることを開示する。

ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＧＧ　ＧＣＣＣＴＧ　ＡＧ
Ｔ　ＧＡＣＡＡＧ　ＣＣＴＣＴＡ　ＧＣＣＣＡＣＧＴＡ
　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＡＡＣＣＣＧ　ＣＡＡ　ＧＴＧＧＡ
Ｇ　ＧＧＣＣＡＧ　ＣＴＣＣＡＧ　ＴＧＧ　ＣＴＧ　Ａ
ＧＣＣＡＧ　ＣＧＴＧＣＧ　ＡＡＣＧＣＣＣＴＧ　ＣＴ
Ｇ　ＣＧＣＡＡＣＧＧＣＡＴＧ　ＡＡＧＣＴＣＡＣＧ　
ＧＡＣＡＡＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＣＣＧ
　ＧＣＣＧＡＣＧＧＧ　ＣＴＧ　ＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴ
ＡＣＴＣＣＣＡＧ　ＧＴＴＣＴＣＴＴＣＡＧＣＧＧＴ　
ＣＡＡ　ＧＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＣＴＡＣＧＴＧ　ＣＴ
ＣＣ’Ｉ’ＣＡＣＴ　ＣＡＣＡＣＴ　ＧＴＣＡＧＣＣＧ
ＣＴＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＣＧ　ＡＡＣＡＡ
Ｇ　ＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴ　ＧＣＣＡＴＣＡ
ＡＧ　ＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＧＧＧＡＧ　ＡＣＣ
ＣＣＣＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＧＡ、Ｇ　ＣＣＣＡＴ
Ｇ　ＧＣＣＴＧＧ　ＴＡ、ＣＧＡ、Ｇ　ＣＣＣＡＴＣＴ
ＡＣＣＴＧ　ＧＧＣＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧ　ＴＴＧ
　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＧＡＣＣＧＧ　ＣＴＣＡＧ
ＣＡＣＣＧＡＧ　ＧＴＣＡＡＣＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＡＧ
　ＴＡＣＣＴＧ　ＧＡＣＣＴＴ　ＧＣＣＧＡＧ　ＴＣＣ
ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＧＴＣＴＡＣＴＴＴ　ＧＧＧＡＴＣＡ
、ＴＴ　ＧＣＣＣＴＧ 本発明は成熟ＴＮＦ’を微生物もしくは細胞の培養によ
り産生せしめるために、前記塩基配列の５′端にＡＴＧ
を付加した構造を有する塩基配列をも包含する。

本発明は捷た、ＡＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＧＡＧＴＡＴＧ
ＡＴＣＣＧＧＧＡＣＧＴＣＧＡ、ＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧ
ＧＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＡＧＧＧＧ
ＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＡＧＣＧＴＴＧＣＣＴ
ＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧ
ＣＴＣＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＴＣＴ
ＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＴ
ＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＣＣ
ＣＣＡＡＡＣＡＡ、ＣＣＴＣＣＡＴＣＴＡＧＴＣＡＡＣ
ＣＣＴＧＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＧＧＴＣＡＣＣＣＴＣＡ
ＧＡ　の塩基配列で示されるＤＮＡの３７−末端を含む
一部または全部のＤＮＡが前記ＴＮＦ遺伝子の５′−末
端側に結合している遺伝子も包含する。

自然の変異によりまたは人工的変異により、主たる活性
に変化を与えることなく、ポリ梨ゾチド構造の一部を変
異せしめることが可能であるが、本発明は前記したポＩ
Ｊ　、、（ゾチドの相同変異に相当する構造を有するポ
リベゾチｒをコードするＤＮＡ配列をも包含する。

更に本発明は形質転換された微生物又は細胞中テ、ＴＮ
Ｆのアミノ酸配列を含む；Ｊ？　リ”’Ｅ’プチドを発
現し得る複製可能な組換ＤＮＡに係る。

このような組換Ｔ）ＮＡとしては、例えばｐＴＮＦ−１
ａｃ−１１、ｐＴＮＦ−ｔａｃＵＶ５−１１からなるグ
ループから選択される組換ＤＮＡが挙げられる。

更に本発明は、ＴＮＦのアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドを発現し得る複製可能々組換］）ＮＡで形質転換され
た微生物または細胞に係る。

このような微生物または細胞と１−て、大腸菌、枯草菌
、酵母、高等動物細胞が挙げられる。

更に本発明は、ＴＮＦ遺伝子をコードする遺伝子を、微
生物又は細胞中で発現させることからなるＴＮＦの製造
方法に係る。

ｒ１３） 詳しくは複製可能な組換ＤＮＡで形質転換された微生物
又は細胞を増殖させ、ＴＮＦのアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドを産生させ、該ポリ被プチドを回収することか
らなる該ポリにプチドの製造方法に係る。即ち、本発明
の他の態様によれば、前述の本発明の４？リゾオキシリ
ボ核酸を複製可能なベクターに組入れて該ポリデオキシ
リポ核酸を有する複製可能な組換ＤＮＡを得、得られた
該組換ＤＮＡで微生物または細胞を形質転換させて該組
換ＤＮＡを含有する形質転換体を得、得られた該形質転
換体を培養して該ポリデオキシリポ核酸の有する遺伝情
報を発現させることからなる新規生理活性ポリペプチド
の製造方法が提供される。

更に本発明は直接発現産物として成熟形で宿主細胞から
分泌されるＴＮＦの製造に係る。このような方法として
、例えば、シグナル−′−２；７″チドと１−て知られ
る１５〜３０アミノ酸よりなる微生物または高等生物由
来のアミノ酸配列を、成熟ＴＮＦのアミン端に結合する
べく遺伝子配列を構成することにより達成される。

（１４） ＴＮＴ’は次のようにして得られた。

＾串 １　ウサギを網　活作用を有する物質によシ刺激した。

２　前記ウサギを５〜１５日間飼育した後、グラム陰性
菌のエンドトキシンで処理し、その血清を取得した。こ
の血清はＬ細胞障害活性及び抗腫瘍活性を示した（この
活性を示す物質を血清ＴＮＦたウサギを５〜１５日間飼
育した後、気管切開により肺胞洗浄細胞を得た。

４４　肺胞洗浄細胞を、グラム陰性菌より得たエンドト
キシンと共に培養した。

５、前記細胞培養の上清中にＬ細胞障害活性を認めた。

この活性は、血清ＴＮＦをマウスに処理して得られる抗
血清（以４Ｆ抗体と称する）により消去された。エンド
トキシンを共存させない細胞培養上清中にＬ細胞障害活
性は認められなかった０ ６、　前記細胞培養中に放射性メチオニンを共存させて
得られる上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分析することにより、分子量１７５００±２０００の
蛋白の生成を認めた。エンドトキシンを共存させない細
胞培養上清にはこの蛋白の生成は、認められ寿かった。

７、　前記細胞培養の上清をＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分画したととろ、分子量１７５００
±２０００の位置にＬ細胞障害活性を認めた。

血清ＴＮＦのＳＤＳ　、ｆｆリアクリルアミドケ８ル電
気泳動分析もこれに一致した。

８、　前記細胞培養から細胞を集め、リボヌクレアーゼ
阻害剤の存在下に、細胞質ＲＮＡ　（以下、リボヌクレ
イン酸をＲＮＡと略す）を抽出した。

９　細胞質ＲＮＡから、オリゴｄＴカラムに対する吸着
性画分〔以下ｍＲＮＡ　（メツセンジャーＲＮＡ　）と
略す〕を得た。

１０、上記ｍＲＮＡをショ糖密度勾配遠心により分画し
た。

１１、上記分画をアフリカッメガエル卵母細胞に注入し
、培養し、培地および卵母細胞中にＬ細胞障害活性を示
す分画を集めた。

１２、上記アフリカッメガエル卵母細胞中に生成する■
７細胞障害活性は、抗ＴＮＦ抗体により消去された。

１３６　分画されたｍＲＮＡを、これに相補的な一重鎖
ＤＮＡに転換し、これから更に二重鎖ＤＮＡを調製した
。この３′末端にデオキシシチジル酸のオリゴマーを付
加せしめ、１つ又は複数の表現型マーカーを有するグラ
スミドのようなベクターの中に挿入した。

１４、とのように調製されたベクターを使用して大腸菌
細胞を形質転換して、ｍＲＮＡに相補的なりＮＡを含有
する１２０００個の大腸菌１２０００株を得た。

１５、血清ＴＮＦを精製し、そのアミノ酸配列を定めた
。

１６、血清ＴＮＦのアミノ酸配列に基きオリゴヌクレオ
チドを合成し、これを放射線標識した。

１７、　１．４で調製したＤＮＡを移しとった口紙と、
１６で得た放射線標識されたＤＮＡをノ・イブリダイズ
させ、Ｘ線フィルムを強く感光させる株９個を（１７） 選択した。

１８．１７で選択された９個の菌株からシラスミドを単
離し、制限酵素で切断し、共通の大きさの断片を有する
シラスミドを有する菌株を得た。このうち２株はＬ細胞
障害活性を有する物質を生産することが判明した。

１９、この菌株からプラスミドを単離し、塩基配列を決
定した。この塩基配列から演緯されるアミノ酸配列の１
つは、１６で得られたＴＮＦのアミノ酸配列と一致した
。

２０、ＴＮＦのアミノ酸配列を与えるＤＮＡ配列を発現
ベヒクルの下流に接続し、この発現ベヒクルを適当な宿
主細胞を形質転換するために用い、この宿主細胞を培地
中で増殖させ、所望のＴＮＦを発現させた。

２１、ここに得られたＴＮＦ活性は、抗ＴＮＦ抗体によ
シ消去された。

（１８） 以上により、本発明者が、ＴＮＦの遺伝子を取得し、こ
の構造を解明し、この遺伝子を用いるＴＮＦの製造方法
を完成させた過程が示されたが、本発明は以」二に限定
されるものではない。

ＴＮＦの遺伝情報を直接的に示しているｍＲＮＡ　を含
有する細胞質ＲＮＡは、上記の如くエンドトキシン処理
された肺胞洗浄細胞から取得されたが、ウサギの他の細
胞例えば末梢血中のプラスチック吸着性細胞、また末梢
血や肝臓、肝臓等のエンドトキシン感受性細胞をエンド
トキシン処理することにＪ：す、得ることができる。

寸プζ、仙の動物、例えばマウス、ハムスター、モルモ
ット、ヒト等の同様な細胞をも、　ｍＲＮＡの取得源と
して用いることができる。壕だ、単球系の株化細胞や、
エンドトキシン感受性もしくはＬ細胞障害活性産生細胞
を用いることができる。この様な細胞としては例えばＲ
ＰＭＩ　１．７８　Ｂ、ＴＨＰ　等の細胞を挙げること
ができる。

ｍＲＮＡは捷た、染色体ＤＮＡを適当なベクターに接続
して動物細胞に導入することにより、得るととができる
。このような系として、Ｓ　Ｖ　４　（１をベクターと
し、ＣＯＳ細胞をホストとする組換にＪ：る方法がよく
知られている（例えばＭａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒａ２
８１巻４０頁、１９７９年、Ｍｅｌｌｏｎら、Ｃｅ１ｌ
、２７巻２７９頁、１９８１年など）。

かくして得られたｍＲＮＡ　ｆ　ｃＤＮＡに変換し、プ
ローブを用いるハイブリダイゼーションによって選択さ
れたＤＮＡは、種々の１］的に応じて糾換えられる。

各アミノ酸に対応するコドン（遺伝暗号）の使用頻度が
異る等の理由により、アミノ酸配列を変えることなく、
塩基配列の一部または全部を、有機化学的に合成された
人工のＤＮＡに置換えることも可能である。

ＴＮＦはまた、細胞内で未成熟形態（プレまたｄロプレ
グロペゾチド）で産生され成熟過程（７″口セシング）
により中間体を経由して成熟ＴＮＦとなることが推定さ
れる。ＴＮＦのこのような未成熟形態は、ＴＮＦ遺伝子
の塩基配列から推定することができる。未成熟形り及び
中間体のＴＮＦをコードする遺伝子を含むＴＮＦ遺伝子
も捷だ、天然のまたは人工的ＤＮＡを用いて組換を行う
ことができる。

これらの方法の応用形態の１つは、メチオニンコドン（
ＡＴＧ）を成熟あるいは未成熟あるいは中間体ＴＮＦ遺
伝子の５′端に導入することである。このようにするこ
とにより、適当なプロモータによって合成されるｍＲＮ
Ａから成熟あるいは未成熟あるいは中間体ＴＮＦが産生
される。この様にＮ末端に付加されたメチオニン残基は
宿生によっては自然に除去される。

′！また別の形態としては、シグナル配列と呼ばれる疎
水性に富んだ配列を付加することにより、宿主細胞の外
またはグラム陰性細菌においては、ペリプラズムと呼ば
れる部分へ、分泌させることも可能である。

寸だ、開始コドンを組込んであるベクターの場合は、ベ
クターから由来するベゾチドとＴＮＦとの融合波ゾチド
を形成するが、この場合は化学的または酵素的に切断す
るか、もしくはＴＮＦの主たる活性に変化がなければ、
そのまま用いることができる。

（２１） このように得られたＴＮＦ遺伝子を、正Ｌ　＜転写、翻
訳が行われるような配列においてプロモーター等の５′
領域の遺伝子配列に接続し、細菌または高等生物細胞中
で複製可能なベクターと接続した組換遺伝子を得、この
組換遺伝子によって細菌または高等生物細胞を形質転換
し、この形質転換体を増殖せしめ、ＴＮＦ遺伝子を発現
せしめるととによりＴＮＦを得ることができる。

宿主として大腸菌を用いる場合は好適にはＥ、　ｃｏｌ
ｔ　Ｋｌ　２株の種々の変異株、例えばＨＢ　１０　］
　（ＡＴＣＣ３３６９４）、Ｃ６００Ｋ（ＡＴＣＣ３３
９５５）、Ｔ）１２１０．　ＲＲＴ（ＡＴＣＣ３１３４
３）、ＭＣ］０６］、ＬＥ　３９２　（ＡＴＣＣ３３５
７２）、ＪＭ　１０１　（ＡＴＣＣ３３８７６）、Ｘ１
７７６（ＡＴＣＣ３１２４４）などが用いられる。

大腸菌を宿主とする場合のベクターとしては、ｐＢＲ３
２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ
９、ｐＭＢ　９（ＡＴＣＣ３７０１９）、ｐＪＢ　８　
（ＡＴＣＣ３７０７４）、ｐＫＣ７（ＡＴＴＣ３７０８
４）等のシラばストあるいはλｇｔ１λＢ、シャロン４
Ａのようなλファージ、Ｍ１３ファージなどが用いられ
る。

（２２） 大腸菌の菌体中Ｋ　ＴＮＦ’を産生させるために、大腸
菌の遺伝子またはファージの遺伝子のプロモーターが使
用される。このようなプロモーターとして、好適にはラ
クトース分解酵素（Ｔ、ＡＣ）　／）プロモーター及び
そのＵ　Ｖ　５変異、ベニシリナーゼ（ＢＬＡ）、１−
　ＩＪブトファン合成酵素（ＴＲＰ）のプロモーター、
λファージのＰｌ、プロモーターあるいはトリプトファ
ン合成酵素と、ラクトース分解酵素の融合プロモーター
であるＴＡＣプロモーター等が用いられる。

枯草菌を宿主とする場合にはＢＤ　１．７０株（ＡＴＣ
Ｃ株 ３３６０８）、ＢＲ］　５５１株ＡＴＣＣ３３６７７）
、ＭＩ　］　］旨≦ＴＣＣ３３７］２）などが用いられ
、ベクターとしてはｐｃ１９４（ＡＴＣＣ３７０３／ｌ
）、ｐＵＢ　］　１０（ＡＴＣＣ３７０１５）、ｐｓＡ
２１００（ＡＴＣＣ３７０目）、ｐＥ１９４　などのプ
ラスミドなどが用いられる。

枯草菌を宿主とする場合のプロモーターとしてハ、クロ
ラムフェニコールアセチル化酵素（ＣＡＴ）やペニシリ
ナーゼ、エリスロマイシン耐性等の遺伝子のプロモータ
ーが用いられる。

酵旬を宿主とする場合は、サツカロマイセス・セレビシ
ェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｅａ
ｅ）のＲＨ２１８株（ＡＴＣＣ４，４０７６）、５Ｔｆ
ｆ１株（ＡＴＣＣ４４７６９）、５ＨＴ２株（ＡＴＣＣ
４４７７１）、Ｄ］３ＬＡ株、４８３株、８３０株など
が用いられ、そのベクターとしてはＹＥｐ　１３（ＡＴ
Ｃ’Ｃ３７１１５）、ｙｇｐ　６、ＹＲｐ７、ＹＴｐ　
５カどのシラスミドが用いられる。

酵母を宿主とするＷ１合、プロモーターとしては酸性ホ
スファターゼ、アルコールデヒドロヶゝナーゼ（ＡＤＨ
Ｉ　）、トリシトファン ホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、チトクロームＢ（
ＣＯＢ）　、アクチン等の遺伝子のプロモーターが用い
られる。

高等生物の培養細胞を宿主とする場合は、ザル腎細胞、
ＣＯＳ　Ｍ胞、マウスＣ１２７細胞（ＡＴＣＣ１６１６
）などが用いられ、そのベクターとしてはＳＶ４０、ウ
シ月？リオーマウィルス等を用いることができる。

本発明の新規生理活性ポリベゾチドは生体の正常組織は
傷つけず、腫瘍だけを殺す生体物質である。実際に生体
に適用するにあたっては注射液に調剤して有効量を注射
投与することができる。注射液の調剤にあたっては一般
に用いられる添加剤を加えることができる。本発明で用
いられる添加剤の例を列挙すれば、アルブミン、ゼラチ
ン、グロブリン、ゾロタミン，ゾロタミン塩々どの安定
化剤，　シヨ糖，グリ七リン、メチルセルロース。

カルポギシメチルセルロース々どの増粘剤、各種無機塩
の，Ｈ調整剤などである。また注射投与する代りに、錠
剤として有効量を経口投与することもできる。錠剤の調
製にあたっても、一般に用いられる添加剤を加えること
ができる。錠剤の調製にあたって用いられる添加剤の例
としては上述の安定化剤，デンプン、乳糖などの賦形剤
を挙げることができる。具体的には、動物実験の結果、
マウスの腫瘍も大半が一，二回の注射投与で完治するこ
とが分った。たとえば、マウスの皮膚に人工の腫瘍（メ
スＡ）を移植、直径６〜７ミリになった（２５） 段階で本発明の新規生理活性月？す梨ゾチドをわずか２
，０マイクログラム注射したところ、−週間後にかさぶ
た状にカリ、二週間後には再び毛が生え始めて完治、そ
の後で妊娠、出産にも成功することが分った。

υ下に実施例に」：って本発明を詳細に記す。

本発明の実施にあたり、組換ＤＮＡの作製、組換体の微
生物への導入は、特に断わら力い限り下記の実験書に従
って実施した。

（１）高木座敷編著　遺伝子操作マニュアル。

講談社 （２）高木座敷編著　遺伝子操作実験法，講談社（３）
　Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．　Ｅ−Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，
　Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ，　Ｃｏ］ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ刊（米国） （４）　Ｒａｙ　Ｗｕら、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｇｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ　］　０　１巻Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ　（米国）刊参考例Ｉ　Ｌ細胞障害活性評価 り細胞を用いる活性評価は、Ｒｕｆｆ［Ｌｙｍｐｈｏｋ
ｉｎｅＲｅｐｏｒｔｓ　２巻Ｅ．Ｐｉ　ｃｋ編集，　Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　２３５（２６） 頁（１９８０年）〕あるいは［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ１．１
２６巻２３５頁（１９８１年）〕の方法に準じ、本発明
による生理活性物質がＬ９２９細胞（アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション、　ＣＣＬ　１　）を殺
す効果を測定するものである。すなわち、順次培地で希
釈した試料Ｑ、　ｌ　ｍｌと１ｏ５コ／ｍｌの濃度のし
細胞の培地懸濁液Ｑ、　ｌ　ｍｌを９６穴の組織培養用
マイクロプレート（フロー・ラボラトリ−社、米国）に
加えた。培地は１　ｖ／ｖ％のウシ胎児血清及び最終濃
度５μ９７ｍｅのアクチノマイシンＤを含むイーグルの
ミニマム・エラ士ンシャル培、ｌｔ　（−ｔの組成は、
たとえば、「組織培養」中井準之助他編集、朝倉書店、
１９６７年に記載されている）を用いた。マイクロプレ
ートを５％の炭酸ガスを含む空気中、３７℃で２１時間
培養した。培養終了後、グルタルアルデヒド２０μｌを
加え細胞を固定した。固定後、マイクロプレートを洗浄
、乾燥して、０．０５％メチレンブルー溶液をＱ、　ｌ
　ｍｅ加え、生き残った細胞を染色した。余分なメチレ
ンブルーを洗い流１〜乾燥した後、残ったメチレンブル
ー’ｉｏ、３６Ｎ塩酸溶液で抽出し、その６６５　ｎｍ
における吸光度をタイターチック・マルチスキャン（フ
ロー・ラポラトり一社、米国）で測定した。

この吸光度は、生き残った細胞数に比例する。

Ｌ９２９細胞の５０係を殺すために必要々生理活性量を
１単位／　ｍｅと定義１−１試刺を加え々い対照の吸光
度の５０％の値に相当する試料の希釈率を、グラフある
いは計算によってめ、その希釈率の逆数を試料の生理活
性量（、ｉｌｉ位７ｍｌで表記する）とした。

一方、蛋白質量は、Ｂｒａｎｆｏｒｄらの方法〔Ａｎａ
ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２巻２４８〜２５４頁（１９７６
年〕〕により、クーマシー・ブリリアント・ブルー０２
５０を用いる色素結合法から算出した。

実施例１（ウサギ血清ＴＮＦの取得） 雌ウサギ（体重２．５〜３．　Ｏｋｇ）にポルマリンに
て死菌処理したＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｊｏｍ　
ａｃｎｅｓ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｊｕｍ　ｐａｒ
ｖｕｍ＋ウェルカム社、英国）５０■を耳静脈より注射
した。該ウサギに８日後再度１００μｇのエンドトキシ
ン（大腸菌０２６二８６山来のりポポリサッカライド、
ディフコ社。

米国）をｆ４静脈よシ注射し、２時間後に心臓より全採
血した。採取した血液に１００ｍ／！当り］−００単位
のヘパリンナトリウムを加えた後、５．００Ｏｒｐｍで
３０分間冷却遠心操作を行ない、血球および不溶固型物
を除去した。４０羽のウサギより、面消ＴＮＦ〒３Ｘ１
０’単位／　ｍｌの力価を有する血漿２、／Ｉｌｌが得
られた。

実施例２（血清ＴＮＦの部分精製） 実施例１で得た血漿２．４１にセライト２４ｇを加え、
１時間攪拌した後沖過した。ろ液に１．２１の０．０４
Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）を加えた後、０．
］、Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０４Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７，８）で充分に平衡化したＤＥＡＥセファ
ロースＣＬ−６Ｂ　（ファルマシア社、スウェーデン）
のカラムに添加した。０．０４Ｍ）リス−塩酸緩衝液で
洗滌後、０．１８Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０４Ｍ）
リス−塩酸緩衝液（ｐ＋１７．２　）を用いて流出した
。Ｌ細胞障害活性を示す画分を、限外濾過によシ濃縮し
た。次いで０．１５Ｍ塩化す（２９） トリウムを含む５　ｍＭ　’）ン酸緩衝液（ｔＪ−１７
，４）で平衡化シた七フアクリルＳ−２００（ファルマ
シア社、スウェーデン）のカラムに該濃縮液を添加し、
同緩衝液にてグル涙過を行った。活性区分は限外涙過に
より濃縮し３．５Ｘ１０６単位を回収した。蛋白定量に
基く比活性は］、　８　Ｘ　１０６単位／　ｍ９であっ
た。

実施例３（抗ＴＮＦ抗体） 血清より得たＴＮＦ　ｉ実施例２の如く部分精製しフロ
イントの完全アジ−バンドをに１で混合し１２週令の雄
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの背部皮下に注射した。２週後、及
び４週後にこの操作を繰返し、更に１週後に全採血し、
その血清を取得した。

この血清をＬ細胞障害活性を測定する培地中に終濃度５
００倍希釈となるように添加し、ウサギ血清から得たＴ
ＮＦのＬ細胞障害活性を測定したところ、Ｌ細胞障害活
性は認められ々かった。ここに得たマウス血清は、ウサ
ギ血清ＴＮＦに対する抗体（抗ＴＮＦ抗体と称する）を
含むものと結論できた。

ｒ３０） 実施例４　（ＴＮＦ産生細胞取得） 雌ウサギにホルマリンにて死菌処理したＰｒｏｐｉｏｎ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｎｅｓ　（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒＶＬ１ｍｌウェルカム社、英
国）を静脈内膜力し、７日後に気管（：ＩＪ聞し、肺を
生理食塩水で洗滌することにより浮遊性細胞を得た。こ
の細胞を生理食塩水で洗滌後、１０係牛脂児血清〔フロ
ー・う？ラトロー社、米国）を含むＲＰＭｌｌ、６４０
（フロー・ラボラトリ−社、米国）を培地とし、炭酸ガ
ス５％含有空気を雰囲気とする炭酸ガスインキュベータ
ーにて、３７℃で培養した。培養器を２コに分け、一方
には大腸菌由来のエンドトキシン（大腸菌０２６：Ｂ６
由来のりポポリサッカライド、ディフコ社。

米国）を１０μ９７ｍ１となるように添加し、一方には
同量の滅菌水を添加した。エンドトキシンを添加した培
養」二清にＬ細胞障害活性が出現し７時間で最高値に達
した。乙の活性は、抗ＴＮＦ抗体で消去されたが、正常
マウス血清では消去されなかっｃＯ 一方、エンドトキシン全添加しなかった細胞培養上清に
はＬ細胞障害活性は認められなかった。

実施例５　（ＴＮＦの分子量） 実施例４における細胞培養においてエンドトキシント八
に放射性Ｌ〜〔５５Ｓ〕メチオニン（１３００Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌ、アマージャム社、英国）　ｔ　］　ｍｃＡ／ｍ
ｅとなるように添加して培養を行った。培養」−清をｌ
ａｅｍｍｌｉの方法ＣＬａｅｍｍ目、　Ｕ、に、　（：
１．９７０年）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ　）　２２
７巻６８０〜６８５頁〕に従ってＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によシ解析した。グル濃度は１２．５
％となるように調製した。

泳動後エンハンスにュー・イングランド・ヌクレアー社
、米国）によシ処理し、乾燥後、Ｘ線フィルム（フジＲ
Ｘ、富士写真フィルム）に密着露光せしめた。エンドト
キシン存在下に培養した培養上清に、分子量約１．７５
００の物質の生成が認められた。

また実施例４における細胞培養の上清を、上記と同様に
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した後、２
．５１ＮＰ４０（カルビオケム社、米国）で１時間、水
中で２時間振とう後、各泳動し一ンを切断分離し、泳動
方向に直角に２閣巾にスライスした。各スライス断片を
Ｌ細胞と共に培養することにより、Ｌ細胞障害性を調べ
た。エントドキシ／存在下に培養上清全展開したレーン
の分子量約１．７５００の位置にＬ細胞障害性が認めら
れ、その他の位置には活性は認められなかった。

実施例６　（ｍＲＮＡの取得） 実施例４と同様な細胞培養においてエンドトキ質ＲＮＡ
およびその中からのｍＲＮＡの抽出は下記の如（Ｃｈｉ
ｒｇｗｉｎらの条件［Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、Ｊ、Ｍ、ｅｔ
　ａｌ、。

１３ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８巻５２９４頁（１９
７９年）〕に従って行った。細胞３×１０８個に対し、
４１ｎｌの４Ｍグアニジ／チオシアネート溶液ヲ加え、
ホモジナイザー（ＡＭ−７，日本精機製作所）にて破砕
した。残渣を遠心除去後、２．４ｇの塩化セシウム全溶
解し、あらかじめ２．５　ｍｌの５．７Ｍ塩化セシウム
、Ｏ，］　Ｍ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７，５）蓄噛を入れ
てあ（３３） るポリアロマ−チー−ブヘ静かに重層した。

ペックマンＳＷ４　］ローター（ヘックマン社。

米国）を用いて２０℃３００００回転にて１２時間、超
遠心分離を行った後、上清を除き、ベレットを１０ｍＭ
トリヌー塩酸緩衝液（５ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　１　Ｓ　
ＳＤＳを含有する）１ｍｅにて溶解〔また。この溶液％
：　Ｉ　ｍ（！のクロロホルム−１−ブタノール（４二
１）混１で抽出し、水層に０．０５容積の２Ｍ酢酸ナト
リウムと、２．５容積のエタノールを加え、−２０℃で
２時間以上放置してＲＮＡ　’ｉ沈澱させた。遠心にて
沈澱を集め、乾燥させたのち滅菌水５００μｌに溶解し
て、細胞質ＲＮＡ溶液を得た。

上記細胞質ＲＮＡ溶液を６８℃、２分間加熱後急冷し、
５００　ｔｔｌＪの２倍濃度の１０ｍＭトリスＥＤＴＡ
緩衝液ｐＨ７，４（］　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１．　
％　ＳＤＳ及び０．５Ｍ塩化リチウムを含む）を加え、
２００ｍ９のオリゴ（ａＴ）−セルロース（ペセスダ・
リサーチ・ラボラドリース・インク社、米国、以下ＢＲ
Ｌ社と略す）カラムに展開、１倍濃度の上記バッファー
１０ｖｔｌで洗浄、溶出緩衝液（１０ｍＭｔ・リス−塩
酸ｐＨ７，４、１、　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　Ｏ，１，％　
ＳＤＳ　’５ｃ含む）２ｍＪで溶出した。

溶出液に０．０５容積の酢酸す）　ＩＪウム、２．５容
積のエタノールを加えて一２０℃冷却にて沈澱せしめた
。沈澱を遠心にて集め、再度同様にオリコ゛（ｄＴ）セ
ルロースカラムに吸着する両分を集めた。

紫外吸収スペク］・ル分析により、８５μｇのｍＲＮＡ
を回収した。

実施例７　（ｍＲＮＡのザイズ分画） 実施例６と同様にして得たｍＲＮＡ　８８０μｍｌを２
５０μでの水に溶解し、５−２５％直線シヨ糖密度勾配
置０ｍｌに重層した。ショ糖密度勾配は、５および２５
係のショ糖を各々含むトリス緩衝液（２５ｍＭトリス塩
酸、、１１７．２．２　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　１％ＳＤ
Ｓ　ｉ含有する）を用い、ｌ５ＣＯ５７０グラツエンタ
ー（イスコ社、米国）により作製した。

ベックマン５Ｗ４１Ｔｉを用い、４℃４００００回転、
１２時間の超遠心を行ったのち、分画回収装置（ベック
マン社、米国）によシ各４００μｌの分画を回収１ツた
。各分画はエタノール沈澱し、遠ノら後滅菌水に溶解し
た。

実施例８（ｍＲＮＡの翻訳実験） アフリカッメガエル卵母細胞によるｍＲＮＡの翻訳は、
実験書（例えば寺岡宏、五木幹男、国中兼太部、蛋白質
、核酸、酵素、臨時増刊、遺伝子操作、６０２頁１９８
１年）に依った。アフリカッメガエルは、浜松生物教材
より得た。実施例５で得た分画ｍＲＮＡを・１μｌｌ／
μｌになるように滅菌水に溶解し、卵母細胞１個あたり
、５０　ｎｌずつを微量注入し、１ｍｇ／ｍｅの牛血清
アルブミンを含有するＲａｒｔｈ溶液（７，５ｍＭトリ
ス塩酸ＰＨ７，６，８８ｍＭ食塩、１蔵塩化カリ、０．
３３　ｍＭ硝酸カルシウム、０．４１ｍＭ塩化カルシウ
ム、０．８２ｍＭ硫酸マグネシウム、２．４ｍＭ重炭酸
ナトリウム、１８　Ｕ／ｍｅペニシリンＧ、１８μｍ７
ｍ１ヌトレゾトマイシンを含有する）中で２４時間培養
した。培養液のまま卵母細胞をつぶし、遠心後、上清の
し細胞障害性を測定した。

沈降定数１６８付近において、Ｌ細胞障害活性が最高値
を与えた。またこの活性は実施例３で得た抗ＴＮＦ抗体
により消去されたが正常マウス血清では消去されなかっ
た。

実施例０（形質転換体の取得） 実施例５で得た分画ｍＲＮＡを５μｇ用い、実験書（］
）９７頁以隆に従って、二重鎖ＤＮＡを調整した。

逆転写酵素はライフザイエンス社（米国）のものを使用
した。二重鎖ＤＮＡを、３．５係ケ゛ル濃度のポリアク
リルアミドケ゛ル電気泳動にて分画し、長さ約１０００
〜２０００塩基対（以下塩基対をｂｐと略す）の画分３
３０　＋Ｊを得た。この画分７ｎＩを用イ同」二の実験
書に従い、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランス
フェラーゼ（ＢＲＬ社）を用いてデオキシＣ鎖をつ々ぎ
、同様にＰｓｔ　１部位にデオギシＧ鎖をつないだシラ
スミドＩ）ＢＲ３２２５６ｎＪとアニールせしめた。ア
ニール後の混合物を用いて大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉＫ−１２
株（）（Ｂ１０１．ＡＴＣＣ３３６９４）を形質転換ｌ
、、１２０００株の形質転換体を得た。

実施例１０（ＴＮＦの部分アミノ酸配列）実施例２で部
分精製したＴＮＦを、実施例５におけると同様にＳＤＳ
ポリアクリルアミドケ中ル電気泳動により精製した。一
部をクマシー・ブリリアント・ブルー染色し、分子量約
１７０００の位置にあｒ３７） るバンドをケ８ルから切出し、１ｑり重炭酸アンモニウ
ムにより抽出した。５　ｘ　１０’　、０１位のＴＮＦ
を使用し、■白として約１８０μｇを回収した。

このうち１５０μｇを１％重炭酸アンモニウム７５μｇ
に溶解、ＴＰＣＫトリプシン（ワーシントン・バイオケ
ミカル社、米国）を３μｇを添加し、３７℃、４時間イ
ンキュベートした。反応液をコスモシール５０８（平井
化学）を担体とする高速液体クロマトグラフィーにより
分画し、トリプシン消化断片を得た。

上記の如く高純度に精製したＴＮＦおよびそのトリプシ
ン消化断片は、次に、セファデックスＧ２５のカラムで
膝、塩し、凍結乾燥後、アミノ酸シークエンスアナライ
ザー・モデル４７ＯＡ（アプライドバイオシステム社、
米国）ヲ用いＲ−Ｍ　−Ｈｅｗ　ｉ　ｃ　ｋらの方法（
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５６巻７９９０−７９９
７頁、１９８１年）に準じて、Ｎ末端よりエドマン分解
を行った。各ステップにおいて遊離してくるフェニルチ
オヒダントインアミノ酸は、高速液体クロマトグラフィ
ーモデルＳＰ８］００（スベク］・ラフイ（３８） ソ、り゛ス礼、米国）を用い、ゾルパックス０ＤＳ（デ
ュ・ボン社、米国）をカラムとして、常法により分析し
た。この結果、ＴＮＦのＮ末端側からのアミノ酸配列は
下記の通りであった。

Ｓｅｒ　ＡＡａ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　ＡＬａ　Ｌｅｕ　Ｓ
ｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ｌｅａ　Ａｔａ　Ｈｉ　ｓ　ＶａＡ　ＶａｔＡＡａ　Ａ
ｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｔｎ　ＶａｔＧｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇ、！
ｎ　Ｌｅａ　ＧＬｏ寸だトリプシン消化断片のうちの１
つは、そのＮ末端より下記のアミノ酸配列であった。

ＧＬｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｔｕ　ＧＡｕ　Ａｔａ　Ｇ
Ａｕ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ａｈａ実施例１１（オリゴＤＮ
Ａプローブの合成）実施例１・０で得たＴＮＦのアミノ
酸配列から推定されるｍＲＮＡの塩基配列に対し、相補
的な、オリゴＤＮＡを合成した。合成方法は、本発明者
が既に発表している改良リン酸トリエステル法（Ｈ，Ｉ
ｔ。

ｅｔ　ａｌ、Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
１０巻１７５５〜１７６９員、１９８２年）により行っ
た。

アミノ酸配列から推定される１　３２　セｌｉ類のオリ
ゴＴ）ＮＡを５グループに別け、各々１６．１６゜３２
．３２．３２種類の混合物として合成した。

表１に本発明の新規生理活性物質のアミノ酸配列の一部
と、これに基く５種類の合成オリゴＤＮＡのプローブの
塩基配列を示す。各々を常法に従って脱保護し、Ｇ−５
０（ファルマシア社、スウェーデン）を用いるカラムク
ロマトグラフィー、７Ｍ尿素を含む２０係ポリアクリル
アミドケ８ル電気泳動及び、ＤＥ５２（ワットマン社、
米国）カラムクロマトグラフィーにより精製し、０１．
　ｍＭ　Ｉ・リスＥＤＴＡ緩衝液に対し、透析した。

各々の精製オリゴＤＮＡを常法によりＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（バイオラッドラがラドリース社、米国）
およびγ−３２Ｐ−アデノシントリリン酸を用いて放射
性ラベルし、ＤＥ５２カラムによシ精製した。各々、約
３　Ｘ　］　Ｏｃｐｍ／μｇの放射能が導入された。

実施例１２（オリゴヌクレオチドの検定）実施例６に従
って得たＴＮＦ産生細胞のｍＲＮＡをグリオキザール及
びジメチルスルフオキシドの存在下に５０℃６０分間処
理したのち、１．１％アガロースゲル電気泳動により分
画した。分画された（４１） ｍＲＮＡ　ｋ、ｋ気泳動式トラ／スファーブロッテリン
グ装置（バイオラッドラがラドリーズ社、米国）を用い
て、メーカーのマニュアルに従い、移動せしめた。次い
で、この膜上のｍＲＮＡと、５×ＳＳＣ及び１５０μ！
！／ｍｌの変性ザケ精子ＤＮＡを含む５×デンハルト溶
液で６５℃、２時間処理したのち、放射性標識したオリ
ゴＤＮＡ　ｆ　Ｉ　Ｘ　１０’　ｅｐｍ／ｍｌ　、　５
　Ｘ　８８Ｃ溶液を含む５×デンハルト溶液で５０℃、
２時間処理した。次いでこの膜上６　Ｘ　ＳＳＣで室温
、４０℃、５０℃、６０℃で順次洗滌し、Ｘ線フィルム
ＸＡＲ−５（コダック社、米国）に対し露光せしめた。

この結果、ｍＲＮＡと最も強くノ・イブリダイズするオ
リゴＤＮＡは、ＭＪであって、ＭＪ混合物中にｍＲＮＡ
と完全に相補的な配列ヲ有するオリがＤＮＡが含まれて
いることが判明した。

実施例１３　（ＴＮＦ遺伝子のクローニング）実施例０
で得た形質転換体を実験書（２１１６２頁の方法に従っ
てニトロセルロースフィルター上に移し、そのＤＮＡと
、実施例１２で選択された放射性標識オリゴＤＮＡ（Ｍ
Ｊ）とを実施例１２と同様の（４２） 条件でハイブリダイズせしめた（コロニー・）・イブリ
ダイゼーション）。強くハイブリダイズする株４９個を
選び更にフィルター」二に固定して再度コロニーハイブ
リダイゼーションを実施し、９個を選んだ。

この９個の株から、実験書（１）６頁の迅速プラスミド
分離法に従って各々約５μｇのシラスミドを取得Ｉ７た
。このシラスミドを制限酵素Ｐｓｔｌ、Ｔａ可Ｉ。

Ｒｓａ　Ｔ＋　Ｐｖｕ　Ｈ（いずれもＢＲＴ、社）を用
い、メーカーのマニュアルに従って切断し、１％アがロ
ースグル電気泳動で、各々の酵素による切断片の長さを
比較した。

この結果、９株すべてが、約５０ｂｐのＰｖｕｒｌとＲ
ｓａｌによる断片を有し、８株がＲｓａｌによる約２０
０ｂｐの断片を有し、共通の配列を有することが示唆さ
れた。第１図に制限酵素による解析結果を図示する。

また、このうち７株を１０μｇ／ｍｅのテトラサイクリ
ンを含む２ｍｌのＬ培地中で培養し、遠心にて集めた菌
体＠２ｍｌの生理食塩水中で超音波によシ破砕し、遠心
上清のＬ細胞障害活性を測定したところ、表２に示す如
く、Ｌ細胞障害活性を示した。

またこの活性は抗ＴＮＦ抗体によシ消去され、正常マウ
ス画情では消去されなかった。従ってこの９株すべてが
ＴＮＦ遺伝子を含むシラスミドを有していることが示さ
れた。

表２　各種形質転換体によるＬ細胞障害活性実施例１４
　（ＴＮＦ遺伝子の塩基配列の決定）プラスミドｐＲ１
１、およびｐＲ１７を含有する大腸菌株を、１０μ、！
９／１１１１４のテトラサイクリンを含有するＭ９培地
〔実験有（３）　４４０頁）１７中で培養した後、実ｍ
Ａ）９０頁の方法に従ってシラスミドを単離し、各々約
１５０μｇを得た。

各々の塩基配列をマキサム−ギルバート法（Ｍａｘａｍ
ｅｔ、　ａｌ、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ　、　５５巻４９０頁１９８０年ｒ　Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　）に従って決定した０また、この
塩基配列（微工研に寄託のため郵送した書留郵便番号第
　９５７号）と実施例９で決定された部分アミノ酸配列
の一致により、ＴＮＦ蛋白の全構造が解明された。

実施例１５ シラスミドｐＲ１７の組み変え体を用いてＥ。

ｃｏｌｉ内でＩａｃ−ＩＪ’ｆ’Ｆｙをゾロモーターと
してＴＮＦを直接発現させることを目的にプラスミドの
構築を行った。第２図に示す様に１０μｇのプラスミド
ｐＲ１２を１０　”−＝　ｙトのＡｐａｌ　（ＢＲＬ社
）で３７℃で２時間消化し、４ｔ１６のポリアクリルア
ミドゲル」＝（４５） の電気泳動で約６３０　ｂｐ断片を単離した。約１μｇ
の断片がケゝルから電気泳動溶出した。実施例１０と同
様の方法によって図示の２個のデオキシオリゴヌクレオ
チド即ち、５’　−ＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡ　ＧＣＴＴ
ＣＴＣＧＧＧＣＣ−３’と５’　−ＣＧＡＧＡＡＧＣＴ
ＧＡＣＡＴＧ−３’　（第２図）とを合成し、実験書（
３）　１２２頁に従って約１００ｐ１００ｐの各デオキ
シオリゴヌクレオチドの５′末端をＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いてリン酸化した。反応終了液をフェノ
ールを用いて抽出し、さらにクロロフォルム抽出した後
、オリゴマーを０．５μｇの６１０塩基対のＡｐａｌ断
片と合せてエタノール沈澱した。実験書（１）３７頁に
従がって１０ユニツトのＴ４ＤＮＡ　ＩＪガーゼで前記
の断片を４℃で１夜反応させ結合した。反応終了液をエ
タノール沈澱後、２０ユ＝ッｌ−のＢａｍＨＩで３７℃
３時間消化し、４チのポリアクリルアミド上の電気泳動
にかけ、約６７０　ｂｐの断片を電気泳動溶出により回
収した。市販のシラスミドｐｕｃ−ｓ　（Ｐ−Ｌバイオ
ケミカル社、カタログ番号４．９　］、　６　、米国）
１μｇをＢａｍＩ（Ｔで消化してフェノール抽出、クロ
ロフォル（４６） ム抽出、エタノール沈澱をして調製したベクター０５μ
、？に釣６・７０　ｂＰ　のＴＮＦ’の全構造遺伝子を
含む両端がＢａｍＨＩサイトを持った断片をＴ　４ｒＪ
ＮＡ　ＩＪガーゼを用いて結合した。実装置（’）、２
（１頁に従がって、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩ　（ＡＴ
ＣＣ３３８７６）を形質転換１、−ｃ　ＩＰＴＧ　（イ
ソゾロビルチオガラクトシド）及びｘ−ｇａ７（５−ジ
ブロモ−４−クロロ−３−インドリルがラクトシト）を
含む寒天培地が約２００個の透明ゾラークをイ！ｔた。

これらのトランスフォーｂｐのＢ　ａｍＴ（Ｉ断片を含
んでいた。さらに、挿入の方向を調べるために１．−１
−記１５個のシラスミドをそに認識部位がある）を用い
て消化し、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い
て調べたところ、７個のシラスミドから目的の約１４０
　ｈｐの断片が確認され、ｐＵＣ−８１の７．ａｃゾロ
モーターから順方向であることが判明した。

塩基配列の解析により、この７個のシラスミドは同一・
で、Ａａｃプロモーター、合成りＮＡ及びｃＤＮＡ間の
結合部に所望のヌクレオチド配列を有することが確認い
れた。

実施例１６ シラスミドｐＲ１，７を用いて、Ｅ　−ｃ　ｏ　Ｉ　ｌ
内でｔａｃＵＶ５プロモーターとしてＴＮＦを直接発現
させることを目的にプラスミドの構築を行った。第３図
に７１＜す様に１０μＪのシラスミドｐＲ１７ヲ１０ユ
ニットのＡ、ｐａ［（ＢＲＬ社）で３７℃２時間消化し
、４％のポリアクリルアミドケゝル電気泳動で約６３０
　ｂｐの断片を単離した。約１μｇの断片がケ゛ルから
電気泳動溶出１〜だ。実施例１０と同様の方法によって
図示の２個のデオキシオリゴヌクレオチド即ち、５’−
ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＧＧＧＣＣ−３
’と５’−ＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡ、ＴＧ　−３’
とを合成し、実装置（３）　１．２２頁に従って約１０
０　ｐｍｏｌｅの上記２種のデオキシオリゴ８ヌクレオ
チドの５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い
てリン酸化した。反応終了液をフェノールを用いて抽出
し、さらにクロロフォルム抽出した後、先に得たｐＲ１
７のＡｐａｌ消化断片（約６３０ｂｐ　）　０．５μｇ
と合わせてエタノール沈澱した。実装置（１）３７頁に
従って１０ユニツトのＴ４リガーゼで４℃１夜反応させ
、結合せしめた。反応後、反応液をエタノール沈澱し、
２０ユニツｌ□　（７）　ＥｃｏＲ）で３７℃３時間消
化し、／１％のポリアクリルアミドケ゛ル上の電気泳動
により約６７０　ｂｐの断片を電気泳動により回収した
。

シラスミドｐｏｐ　９５−１５は、フラーの方法（Ｆ。

Ｆｕｌｌｅｒ　、Ｇｅｎｅ　＋　１９巻４２頁〜５４頁
、１９８２年）に従って調製した。

ｐｏｐ　９５−１５の］　ｌｔ９をＥｃｏＲｌで消化し
てフェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈澱
をして調製したベクター０５μｇと、」１記の如く合成
デオキシオリゴヌクレオチドと、ＴＮＦ遺伝子を結合し
て得た約６７０　ｂｐの断片を、Ｔ４ＤＮＡ　ＩＪガー
ゼを用いて結合した。実装置（す、２０頁に従って、Ｅ
。

ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩ　（ＡＴＣＣ３３８７６）を形質
転換してＩＰＴＧ（イソゾロビルチオガラクトシド）及
びｘ−ｇａｔ（５−ジブロモ−４−クロロ−３−インド
リルガ（４９） ラクトシト）を含む寒天培地上に約１５０個の透明コロ
ニーを得た。

これらのコロニー１００イ固からプラスミドＤＮＡを調
製し、Ｅ（！ＯＲＴで消化したところ１２個が、目的の
約６７０　ｂｐのＥｃｏＲＩ断片を有していた。さらに
挿入の方向を調べるために上記１２個のプラスミドをＰ
　Ｖ　１１１１とＰｓｔ）を用いて消化し、１，５チア
ガロ−スケ゛ル電気泳動を用いて調べたところ、４個の
シラスミドから目的の約１２８０ｂｐ及び２６００ｈｐ
の断片が確認され、７ａｃ　ＵＶ５プロモーターから順
方向にＴＮＦ遺伝子が接続されていることが判明した。

塩基配列の解析により、この４個のプラスミドは同一で
、ＡａｃＵＶ５プロモーター、合成デオキシオリゴヌク
レオチド、及びｃＤＮＡが正しく結合されていることが
確認された（　ｐＴＮＦ−ｔａｃＵＶ５−１．１と命名
する）。

実施例１７（大腸菌の生産するＴＮＦの精製）実施例１
６で得られたシラスミドを含有する大腸菌株を１００μ
ｇ／ｍｌのアン−シリンを含有する（５０） Ｌ培地５０ｍ１で１夜培養し、５ｔの同上の培地に移し
て更に３時間培養した。イソプロピルβ−ローチオガラ
クトピラノシド（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ
。

米国）を終濃度］　ｍＭになる様に添加し、更に６時間
培養を続けたのち冷却し、遠心分離により菌株を集めた
。実施例１３におけると同様に菌体を０．０４Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）　５　を中で超音波破砕し
、菌体蛋白溶液を得た。この溶液は６．７　Ｘ　１．０
７単位／ｌの１７細胞障害活性を示１〜だ。

この溶液を実施例２と同様に精製を行った結果１．２×
１０６単位のＴＮＦを得た。このものの比活性は６．９
Ｘｉ０７単位／ｍ９であった。

実施例１．　ｆ３　（Ｍｅｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ担
癌マウスを用いる活性評価） ＢＡＬＢ　／　ｃマウスの腹部皮肉に２×１０　コのＭ
ｅ　ｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ細胞を移植し、７目抜移
植した腫瘍の大きさが直径７〜８關となり、出血性壊死
がなく良好な血行状態にある腫瘍を有するマウスを選び
、尾静脈より生理食塩水で希釈した０、　２　ｍｅの試
料を注射し、２４時間後に次の判定基準に則り壊死反応
の判定を行った。

（→：変化なし く→０：かすか々出血性壊死 （＋））　：中程度の出血性壊死 （移植癌表面の真中から５０％以上にわたって哄死） （刊）：顕著な出血性壊死 （移植癌の中央部が重度に壊死し、周囲の癌組織がわず
かに残った状態） 斗だ、試料投与後２０日日日癌が完全に退縮したかどう
かを観察し完治率をめた。

以上の方法により測定した、大腸菌の生産するＴＮＦの
活性を表３に示す。

対照 生理食塩水　５５００００１５ 完治率：完全に癌が退縮したマウス数／実験マウス数

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の新規生理活性ポＩＪ　Ｏプチドの遺
伝子を含有するプラスミドの制限酵素切断地図を示す。 第２図は、本発明の組換ＤＮＡであるｐＴＮＦ−６ａｃ
　−１１の調製方法を示すフローシートであり、第３図
は、ｐＴＮＦ　−ｔａｃ　ＵＶ５−１１の調製方法を示
す７０−シートである。 特許出願人　旭化成工業株式会社 第　１図 サイズ゛（ｂｐ）　誂か的の方向 ｐＢ２−７１０６０　Ｈ−１遁１→　ヨｐＢ２−２１４
００　ＪＬＬ−ゴ→　→彎−一一一争 手　続　補　正゛ンパ書　（自発） 昭和５９年５　月１０口 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示　昭和５９年特許願第１．９８５０号２
発明の名称 新規生理活性ポＩＪ　ｄゾチドのＤＮＡ３、補正をする
者 ４補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ５、補正の内容 明細書第４５頁第１０〜１１行の「（微工研に寄託のた
め郵送した書留郵便番号第９５７号）」を削除する。 ６添付書類 寄託受託拒否通知書１未 −ＱＲ５？−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　少くとも次の塩基配列 ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＧＧ　ＧＣＣＣＴＧ　ＡＧ
   Ｔ　ＧＡＣＡＡＧ　ＣＣＴＣＴＡ　ＧＣＣＣＡＣＧＴＡ
   　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＡＡＣＣＣＧ　ＣＡＡ　ＧＴＧ　Ｇ
   ＡＧＧＧＣＣＡＧ　ＣＴＣＣＡＧ　ＴＧＧ　ＣＴＧ　Ａ
   ＧＣＣＡＧ　ＣＧＴ　ＧＣＧ　ＡＡＣＧＣＣＣＴＧ　Ｃ
   ＴＧ　ＣＧＣＡＡＣＧＧＣＡＴＧ　ＡＡＧ　ＣＴＣＡＣ
   Ｇ　ＧＡＣＡＡＣＧＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　Ｃ
   ＣＧ　ＧＣＣＧＡＣＧＧＧ　ＣＴＧ　ＴＡＣＣＴＣＡＴ
   ＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧ　ＧＴＴ　ＣＴＣＴＴＣＡＧＣＧ
   ＧＴ　ＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＣＴＡＣＧＴＣＣ
   ＴＣＣＴＣＡＣＴ　ＣＡＣＡＣＴＧＴＣＡＧＣＣＧＣＴ
   ＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＣＧ　ＡＡＣＡＡＧＧ
   ＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴ　ＧＣＣ’　ＡＴＣＡＡ
   Ｇ　ＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡｅ　ＣＧＧ　ＧＡＧ　ＡＣ
   ＣＣＣＣＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＣＣＣＡＴ
   ＧＧＣＣＴＧＧ　ＴＡＣＧＡＧ　ＣＣＣＡＴＣＴＡＣＣ
   ＴＧ　ＧＧＣＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧ　ＴＴＧ　ＧＡ
   Ｇ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＧＡＣＣＧＧ　ＣＴＣＡＧＣＡＣ
   ＣＧＡＧ　ＧＴＣＡＡＣＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＡＧ　ＴＡ
   ＣＣＴＧ　ＧＡＣＣＴＴ　ＧＣＣＧＡＧ　ＴＣＣＧＧＧ
   　ＣＡＧ　ＧＴＣＴＡＣＴＴＴ　ＧＧＧ　ＡＴＣＡＴＴ
   　ＧＣＣＴＧ およびこれに相補的な配列を含むポリデオキシリが核酸
   。 （２、特許請求の範囲第（１）項に記載のｓ９　ｌ）デ
   オキシリボ核酸と、複製可能なベクターとからなる複製
   可能な組換ＤＮＡ０ （３）特許請求の範囲第（２）項に記載の複製可能な組
   換ＤＮＡで形質転換された微生物または細胞。 （４）　少くとも次のアミノ酸配列 Ｓｅｔ　Ａ／、ａ　Ｓｅｒ　ＡｒｇＡＡａ　Ｌｅｕ　Ｓ
   ｅｒ　Ａｓｐ　Ｔ４ｓ　Ｐｒ。 Ｌｅｕ　Ａｔａ　Ｈｉｓ　Ｖａｔ　Ｖａｔ　Ａｌａ　Ａ
   ｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇ／−ｎ　Ｖａｔ　ＧｔｕＧｔｙ　Ｇｔ
   ｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ＧＡｎ
   　Ａｒｇ　ＡＬａ　ＡＳｎＡｔａ　Ｌｅｕ　Ｌｅａ　Ａ
   ｒｇ　Ａｓｎ　Ｇｔｙ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈ
   ｒ　ＡｓｐＡｓｎ　Ｇｔｎ　Ｌｅｕ　ＶａｔＶａＡ　Ｐ
   ｒｏ　Ａｔａ　Ａｓｐ　Ｇｔｙ　ＬｅＩＩＴｙｒＬｅｕ
   　Ｉｔｅ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　ＶａｔＬｅｕ　Ｐ
   ｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ＧｉｎＧｌｙ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ
   　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　
   Ｈｉｓ　ＴｈｒＶａｔ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｔ
   ａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ
   ＶａｔＡｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｔａ　ＩＬ
   ｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＣｙｓＨ４ｓ　Ａｒｇ　
   Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｔｕ　Ｇｔｕ　Ａｔａ　Ｇ
   Ｌｕ　Ｐｒｏ　ＭｅｔＡｔａ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｔｕ
   　Ｐｒｏ　Ｉｉｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｔｙ　Ｇｌｙ　
   ＶａｌＰｈｅ　Ｇｔｎ　Ｌｅｕ　ＱｔｌＬｙ８　Ｇｔｙ
   　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ／Ｑ’１ Ｇｔｕ　Ｖａｔ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔ
   ｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　ＡｈａＧＬｕ　Ｓｅｒ
   　Ｇｔｙ　Ｇｔｎ　Ｖａｔ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｔｙ　
   Ｔｉｅ　Ｔｉｅ　Ａｈａｅｕ を含む特許請求の範囲第（１）項に記載の塩基配列由来
   の新規生理活性及ゾチド （５）特許請求の範囲第（１）項に記載のポリデオキシ
   リが核酸を複製可能なベクターに組入れて該ポリデオキ
   シリ号？核酸を含む複製可能な組換ｒ）ＮＡ　ｉイク　
   、 得られた該組換ＤＮＡで微生物または細１１１ｉ！を形
   質転換させて該組換ＤＮＡを含有する形質転換体を得、
   得られた該形質転換体を培養して該、Ｎ　ＩＪデオキシ
   ＩＪ　、ｇ核酸の有する遺伝情報を発現させることから
   なる特許請求の範囲（４）の新規生仰活性４０１Ｊ−！
   ！ゾチドの製造方法。 （誹メ丁余白）