FR2629345A1 - Proteines qui inhibent l'activite due au facteur de necrose tumorale - Google Patents

Abstract

L'invention concerne de nouvelles protéines qui possèdent une activité inhibitrice du facteur de nécrose tumorale FNTalpha. L'invention concerne aussi des procédés de production d'une protéine de ce genre qui comprend les étapes de : a) concentration de l'urine de patients fiévreux; b) précipitation au sulfate d'ammonium; c) chromatographie par échange d'anions; d) chromatographie par échange de cations; e) filtration à travers gel; f) chromatographie d'affinité; et g) FPLC à phase inverse. Ces protéines sont intéressantes dans le domaine médical.

Description

La présente invention concerne une nouvelle protéine possédant un effet

inhibiteur contre l'activité due au facteur de nécrose tumorale a, à l'isolement et à la purification d'une protéine de ce genre au départ de sources naturelles, à sa préparation par manipulation d'ADN et à l'emploi d'une protéine de ce type pour le traitement d'états associés à une production excessive

ou non réglée de FNTa.

Le facteur de nécrose tumorale (FNT) est une activité déployée par une famille d'au moins deux protéines, a et B, qui sont cyctotoxiques pour les cellules tumorales et qui inhibent leur croissance en culture úE. Carswell et coll. "An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumours", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, p3666 (197517. Le facteur de nécrose tumorale a (FNTc), également appelé "cachectine", est principalement produit par des cellules de la lignée monocyte/macrophage en réponse à des signaux de "stress" qui accompagnent des stimuli invasifs, comme des

bactéries, des virus, des tumeurs et d'autres toxines.

Le FNTe, couramment appelé "lymphotoxine", est principalement produit par des cellules lympholdes. Le FNTO possède de nombreuses activités similaires à celles du FNTa, mais semble être moins puissant, bien que ceci pourrait résulter de difficultés rencontrées au cours de

la préparation du FNTe pur.

Le FNTa intervient dans des et participe à un large - éventail d'activités biologiques C. Beutler et coll., "Identité du facteur de nécrose -tumorale et du facteur, cachectine, sécrété par des macrophages", Nature, 316, p552 (1985)], partageant plusieurs d'entre elles avec

l'interleukine-l (IL-1) úJ. Le et coll;, "Tumour necro-

sis factor and interleukin 1: cytokines avec de

multiples activités biologigues chevauchantes", Labora-

tory Invest., 56, p234 i1987)/. Des taux élevés en FNTa induits, par exemple, par des cellules tumorales peuvent entraîner une perte de poids et une cachexie et on a également constaté que le FNTa intervenait également comme entremetteur principal, dans le choc endotoxique (choc septique) qui peut être fatal. D'autres effets biologiques du FNTa englobent l'hypotension, la fièvre

(induite par la stimulation de la synthèse de prosta-

glandine E2 hypothalamique (PGE2)), la coagulopathie (provoquée par la stimulation des cellules endothéliales

vasculaires qui libèrent, par exemple le facteur tissu-

laire) et la destruction de tissus (induite, par exem-

ple, par la stimulation d'une série de protéinases, y

compris la collagénase engendrée par des cellules syno-

viales et des fibroblastes dermiques) 'C. Dinarello et coll., "Le facteur de nécrose tumorale (cachectine) est

un pyrogène endogène et induit la production d'interleu-

kine-l", J. Exp. Med., 163, pl433 (1986); J. Dayer et coll., "La cachectine/le facteur de nécrose tumorale

stimule la production de collagénase et de la prosta-

glandine E2 par les cellules synoviales et les fibro-

blastes dermiques humains", J. Exp. Med., 162, p2163

(1985L7.

Par conséquent, il existe un besoin de développement d'un inhibiteur de cachectine/FNTa qui prévient le choc endotoxique, la cachexie et les autres effets délétères décrits plus haut. On a montré que l'immunisation passive d'animaux contre la cachectine pouvait empêcher la mort induite à l'endotoxine, due & l'intervention d'anticorps du FNTa aB. Beutler et coll.,

Nature, 316, suprç7.

La demanderesse a identifié à présent une nouvelle protéine qui possède un puissant effet inhibiteur contre les activités dues à l'entremise du FNTa sans inhibition concomittante notable de l'activité due a l'IL-1. Cette protéine sera identifiée dans la suite du présent mémoire sous l'appellation d'inhibiteur du facteur de

nécrose tumorale " (FNTa INH).

Par conséquent, conformément à l'une de ses caractéristiques, la présente invention a pour objet une protéine qui inhibe sélectivement l'activité due au facteur de nécrose tumorale a. Comme on l'utilise dans le présent mémoire, l'expression "inhibition sélective", telle que présentée par l'inhibiteur conforme à la présente invention, s'identifie à l'aptitude à bloquer l'activité due au FNT, en l'absence d'aptitude à bloquer d'autres protéines qui ont ep commun avec le FNT, certaines, mais pas toutes les activités biologiques du

FNT, comme l'IL-1.

De préférence, l'inhibiteur du facteur de nécrose tumorale a conforme à la présente invention se présente sous une forme sensiblement homogène, essentiellement exempte de substances contaminantes majeures et/ou essentiellement exempte de toute autre matière

protéinique ou protéique.

On a constaté que l'inhibiteur du facteur de nécrose tumorale a conforme à la présente invention possédait une ou plusieurs des caractéristiques suivantes: (a) poids moléculaire variant de 40 à 60 kDa, comme déterminé par chromatographie sur tamis moléculaires, (b) point isoélectrique (pI). variant de 5,5 à 6,1, comme déterminé par chromatofocalisation, (c) inhibition du titre en FNT standard de cytotoxicité différentielle pour des cellules murines L929, traitées à l'actinomycine D,. comme décrit par G. Nedwin et coll. "Effets de l'interleukine-2, de l'interféron-y et de mitogènes sur la production de facteurs de nécrose tumorale a et À", J. Immunol., 135, p2492 (1985), on peut surmonter cette inhibition par une addition complémentaire de FNTa, indiquant que l'inhibition est compétitive. L'inhibiteur est également un inhibiteur de l'activité du FNTO, bien que l'inhibition du FNTa au cours de ce titrage soit plus efficiente que celle du FNTe, (d) inhibition de la libération de PGE2 induite au FNT à partir de cellules synoviales et de fibroblastes humains, (e) l'inhibiteur provoque une interférence avec la liaison du FNTa aux cellules U937 (une lignée tumorale monocytique", comme on peut le mettre en évidence par

l'inhibition de la liaison du FNTa radïomarqué ( 125I-

FNTa); (f) la dissociation d'un compiexe de cellules U937 : FNTc préformé est favorisée par l'inhibiteur d'une façon qui dépend de la température, (g) l'inhibiteur ne provoque pas de dégradation du FNT par scission protéolytique, (h) l'inhibiteur n'inhibe pas l'activité de liaison du récepteur IL-1, par exemple la liaison de l'IL-l radiomarqué (125 I-IL-la) à la sub-lignée de thymome

murin EL-4-6.1.

La demanderesse a découvert que la protéine conforme à l'invention, lorsqu'on la purifiait davantage, possédait un- poids moléculaire d'environ 33000 daltons, comme déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium (SDS

PAGE).

Par conséquent, selon une autre de..ses caractéristiques, l'invention a également pour objet une protéine qui inhibe sélectivement l'activité due au FNTa, qui possède une ou plusieurs des caractéristiques suivantes: (a) un poids moléculaire d'environ 33 kDa, comme déterminé par SDS PAGE, (b) un point isoélectrique (pI) qui varie de 5,5 à 6,1, comme déterminé par chromatofocalisation, (c) une inhibition du titre en FNT standard de cytotoxicité différentielle pour des cellules murines EL929, traitées par de l'actinomycine D, comme décrit par G. Nedwin et coll; "Effets de l'interleukine-2, de l'interféron-y et de mitogènes sur la production de facteurs de nécrose tumorale a et e", J. Immunol., 135, p2492 (1985). Cette inhibition peut être surmontée par une addition complémentaire de FNTa, indiquant que l'inhibition est compétitive. L'inhibiteur est également un inhibiteur de l'activité due au FNTO, bien que l'inhibition du FNTa au cours de ce titrage soit plus efficace que celle du FNTe, (d) une inhibition de la libération de PGE2 induite au FNT à partir de cellules synoviales et de fibroblastes humains, (e) l'inhibiteur vient interférer avec la liaison du FNTa à des cellules U937 (une lignée tumorale monocytique), comme on a pu le mettre en évidence par

l'inhibition de la liaison du FNTa radiomarqué (125 I-

FNTa), (f) la dissolution d'un complexe de cellules U937: FNTa préformé est favorisée par l'inhibiteur, d'une manière qui dépend de la température, (g) l'inhibiteur n'altère ni ne dégrade le FNT par scission protéolytique, (h) l'inhibiteur n'inhibe pas l'activité de liaison du récepteur IL-1, par exemple la liaison d'IL-1 radiomarqué (125 I-IL-) à la sub-ligne de tymome

- murin EL4-6,1.

De préférence, le TNFa INH selon la présente invention possède les deux caractéristiques (a) et (b)

et une ou plusieurs des caractéristiques (c) à (h).

De façon plus particulière, le FNTa INH conforme à la présente invention, possède toutes les

caractéristiques (a) à (h).

La protéine conforme à l'invention possède une séquence d'aminoacides à terminaison amino, comme suit:

Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-

Pro-Gln-Cys-Asn-Ser-Ile On suppose également que les trois aminoacides qui suivent fournissent un site de glycosylation et que la séquence se poursuit ainsi: Asn-Ser-Thr-Lys. Il faut comprendre qu'un inhibiteur de FNTa conforme à la présente invention comprendra également une séquence d'aminoacides correspondant sensiblement à la séquence du FNTa INH naturel et contenant une séquence à amino terminaison sensiblement indentique à celle décrite plus haut. La séquence de l'inhibiteur de FNTx conforme à la présente invention sera, par conséquent, identique à la séquence du FNTc INH naturel, ou contiendra une ou plusieurs omissions, substitutions, insertions, inversions ou additions d'origine allélique, ou, d'une autre manière, la séquence résultante comportera au moins 80% et, de préférence, 90%, d'homologie avec la séquence du FNTa INH naturel et conservera essentiellement les mêmes propriétés

biologiques que celles de la protéine en question.

On a démontré que l'inhibiteur de FNTx conforme à la présente invention était de nature protéique, en ce sens qu'il était inactivé par chauffage d'une manière dépendant du temps et de la température et qu'il était détruit par traitement par de la trypsine ou de la pronase. On a également montré que le FNTa INH conforme à la présente invention était une glycoprotéine, étant donné que le traitement par l'enzyme qu'est l'endoglycosidase

F réduisait le poids moléculaire de 7 à 8 kDa.

Selon encore une autre de ses caractéristiques, la présente invention a par conséquent pour objet un inhibiteur de FNTa tel que défini dans le présent mémoire, mais qui se trouve dans un état sensiblement aglycosylé. Les inhibiteurs conformes à la présente invention présentent un intérêt pour le traitement d'états dans lesquels il est souhaitable d'inhiber l'activité du FNTa, par exemple, ceux qui surviennent à la suite des effets du FNTc, comme une perte de poids, un choc, une cachexie et une inflammation locale chronique, la polyarthrite chronique évolutive, 'la coagulation

intravasculaire disséminée et la néphrite.

Selon encore une de ses caractéristiques, la présente invention a également pour objet un inhibiteur de FNTa, tel que défini dans le présent mémoire, ou un dérivé pharmaceutiquement acceptable de cet inhibiteur, en vue de l'utiliser à titre d'agent thérapeutiquement actif, plus particulièrement, pour le traitement d'états associés à une production excessive ou non régulée de

FNTa.

Selon encore une de ses caractéristiques, l'invention a aussi pour objet un procédé de traitement

d'états associés à une production excessive ou non-

régulée de FNTa chez un mammifère, y compris l'homme,

caractérisé en ce que l'on administre à ce mammifère,.

une quantité efficace d'un inhibiteur de FNTa tel que défini dans le présent mémoire, ou un dérivé

pharmaceutiquement acceptable de cet inhibiteur.

Selon encore une de ses caractéristiques, l'invention a également pour objet l'emploi de l'inhibiteur de FNTa tel que défini dans le présent mémoire ou d'un dérivé pharmaceutiquement acceptable de cet inhibiteur, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'états associés à une production excessive ou non régulée de FNTa. Les spécialistes de la technique comprendront que la référence que l'on fait dans le présent mémoire au traitement s'étend aussi bien à la prophylaxie qu'au

traitement de symptomes ou d'états établis.

Il faut encore apprécier que la quantité d'inhibiteur de FNTc conforme à la présente invention, qu'il est nécessaire d'utiliser pour le traitement variera, non seulement avec le mode d'administration, mais également avec la nature de l'état à traiter et avec l'âge et la condition du patient et que cette quantité ressort finalement de la décision du vétérinaire ou du médecin traitant. Cependant, en général, une dose appropriée variera habituellement d'environ 5,0 à 500 pg par kilogramme de poids corporel et par jour, par exemple, de 30 à 300 pg/kg/jour, de

préférence de 50 à 150 pg/kg/jour.

La dose souhaitée peut commodément être présentée sous forme de dose unique, ou sous forme de doses subdivisées, que l'on administre à des intervalles appropriés, par exemple, sous forme de deux, trois,

quatre et plus de quatre doses subdivisées, par jour.

Bien qu'il puisse être possible que, pour l'usage dans le domaine thérapeutique, on administre un inhibiteur de FNTa conforme à l'invention sous forme de la protéine brute, il est préférable de présenter la protéine active. sous forme de composition pharmaceutique. Par conséquent, la présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur de FNTa, tel que défini dans le présent mémoire, ou un dérivé pharmaceutiquement acceptable de cet inhibiteur, en même temps qu'un ou plusieurs véhicules ou excipients pharmaceutiquement acceptables et, facultativement,

d'autres ingrédients thérapeutiques et/ou prophylacti-

ques. Le ou les véhicules ou excipients doivent être "acceptables" dans le sens d'être compatibles avec les ingrédients de la composition et d'une parfaite

innocuité pour le malade ou le patient.

On peut par conséquent présenter les inhibiteurs conformes à la présente invention en vue de leur administration par la voie parentérale (par injection, par exemple perfusion continue ou injection de bols) et on peut également les présenter sous la forme de doses unitaires dans des ampoules, des seringues remplies au préalable, des perfusions de petit volume, ou dans des récipients qui en contiennent des doses multiples avec conservateur additionnel. Les compositions peuvent adopter des formes comme des suspensions ou des solutions dans des véhicules aqueux et peuvent contenir des agents de mise en composition,. comme des agents de

mise en suspension, de stabilisation et/de dispersion.

En alternative, l'ingrédient actif peut aussi se présenter sous la forme d'une poudre que l'on obtient par isolement aseptique du solide stérile ou par lyophilisation à partir d'une solution, en vue de la reconstitution d'une composition utilisable à l'aide d'un véhicule convenable, par exemple de l'eau

apyrogène, stérile, avant l'emploi du médicament.

On peut également employer l'inhibiteur de FNTa conforme à la présente invention en combinaison avec d'autres agents thérapeutiques, par exemple d'autres

cytokines ou inhibiteurs de FNTa.

L'invention a par conséquent aussi pour objet, selon une autre de ses caractéristiques, une combinaison comprenant un inhibiteur de FNTa, tel que défini dans le présent mémoire, ou un dérivé pharmaceutiquement acceptable de cet inhibiteur, en même temps qu'un autre agent thérapeutiquement actif, par exemple d'autres

cytokines ou inhibiteurs de FNTa.

Les protéines conformes à la présente invention peuvent se préparer par la purification au départ de sources naturelles et, lorsque cela se révtle être approprié, cette opération peut être suivie d'une modification chimique, ou bien on peut les préparer par des procédés classiques bien connus des spécialistes de la technique qui s'occupent de la préparation de protéines, par exemple en ayant recours à des techniques

à ADN recombinant.

Selon une autre encore de ses caractéristiques, la présente invention a aussi pour objet- un procédé de production d'un inhibiteur de facteur de nécrose tumorale a, conforme à la présente invention, par purification au départ de sources naturelles, plus

particulièrement l'urine de patients fiévreux humains.

Une purification de ce genre comprend, par exemple, les étapes de concentration de l'urine brute de patients fiévreux humains, la précipitation du FNTa INH brut de l'urine et le fractionnement du FNTa INH d'autres protéines de ce précipité, par une ou plusieurs voies constituées, par exemple, par la chromatographie d'échange ionique sur colonne, la chromatographie à filtration à travers gel, la chromatographie d'hydrophobicité, la chromatographie d'immuno-absorption

et d'affinité sur du-FNTa immobilisé.

L'inhibiteur de facteur de nécrose tumorale a selon la présente invention s'obtient également à partir de tissu humain contenant des-macrophages, par exemple les résidus de lavages pulmonaires et les extraits de foie humain, à partir desquels on peut l'obtenir par des techniques purification standard, comme celles décrites

plus haut.

Le FNTa INH naturel et recombinant, que l'on produit par mise en oeuvre des procédés décrits dans le présent mémoire, peuvent être purifiés par toute une série d'étapes telles qu'énumérées plus haut. Apres chacune des étapes de purification, la présence et la pureté du FNTa INH peuvent être déterminées et mesurées par un titrage de la cytotoxicité, en présence d'actinomycine D (acti D) en utilisant une lignée de cellules L929 sensibles au FNT, comme décrit par G.

Nedwin et coll., J. Immunol., 135, loc. cit.

Selon une forme de réalisation préférée du procédé, le FNTa INH est initialement isolé de l'urine non traitée, recueillie de patients fiévreux humains ( 38,5 C), dépourvus d'infections urinaires, en utilisant une technique de concentration standard, par exemple l'ultrafiltration. On peut ensuite précipiter une fraction brute à partir de l'urine brute, en utilisant du sulfate d'ammonium, par exemple par l'addition de sulfate d'ammonium en une concentration de 80% (p/v), à 4 C, sous agitation. De préférence, on peut ajouter le sulfate d'ammonium d'une manière échelonnée et écarter la matière précipitée a des concentrations inférieures (par exemple à 40% (p/v). On peut éliminer le sulfate d'ammonium par dialyse et on peut purifier la fraction résultante pour séparer le FNr INH d'autre protéines

par toute une série de procédés chromatographiques.

Ainsi, on peut purifier le concentré de FNTa INH par chromatographie à échange ionique, qui sépare les protéines selon leurs différences en charge électrique, qui constitue le reflet des propriétés acide/base des protéines. Des matières convenables pour la chromatographie d'échange d'anions comprennent des dérivés de l'aminoéthylcellulose, par exemple l'aminoéthylcellulose quaterniare (QAE-cellulose) ou la diéthylaminoéthylcellulose (DEAE-cellulose) qui sont très répandues dans le commerce. Il faut équilibrer la colonne d'échange d'anions avant d'appliquer le concentré, en-se servant d'un tampon convenable, comme le tris-HCl, contenant éventuellement un agent chélateur, tel que 1'EDTA. La matière liée peut être éluée de la colonne en utilisant une solution de sel (par exemple du chlorure de sodium 0,8M, que l'on

complète avec le tampon d'équilibrage).

On rassemble les fractions actives provenant de la chromatographie d'échange d'anions. Les matières appropriées à la chromatographie d'échange de cations comprennent des dérivés de la cellulose, comme la carboxyméthyl(CM)cellulose, ou la sulfopropylsépharose (Pharmacia, Uppsala, Suède). La colonne doit être équilibrée avec un tampon convenable, comme l'acétate de sodium et la matière liée peut être éluëe avec le tampon d'équilibrage contenant, par exemple, du chlorure de

sodium 0,5M.

On purifie davantage les fractions actives rassemblées par chromatographie d'affinité sur du FNTL humain recombinant lié (rhFNTa), lié à une matrice appropriée, par exemple du mini-leak agarose (Kem En Tec, Biotechnology Corp., Danemark). La colonne doit être tamponnée en utilisant, par exemple un tampon au phosphate (par exemple phosphate de potassium 0,8M de pH 8,6). Les groupes actifs non liés au rhFNTa doivent être bloqués en utilisant un tampon à l'éthanolamine-HCl de pH 8,5. La colonne doit être équilibrée avec un tampon approprié, par exemple. le tris-HCl, contenant éventuellement du chlorure de sodium et le FNTa INH doit être élué avec un tampon à la glycine acide (pH de 3,5), Les fractions éluées doivent être immédiatement équilibrées jusqu'à un pH de 7,0 par l'addition, par

exemple, de Tris base.

Les fractions actives rassemblées sont, de préférence, lyophilisées avant l'étape de purification finale de FPLC à phase inverse (FPLC = chromatographie en phase liquide de protéines rapide). Avant son application à la colonne de FPLC, la fraction de FNTa INH lyophilisée doit être tamponnée avec un tampon convenable, comme l'acide trifluoracétique (TFA) (Fulka, Buchs, Suisse), l'acide heptafluorobutyrique (HFBA) ou l'acide acétique. L'élution du FNTa INH de la colonne de FPLC peut s'effectuer en recourant à des techniques classiques, par exemple, en complétant avec un tampon approprié, tel que précédemment décrit, contenant

éventuellement un alcool, par exemple le N-propanol.

La fraction éluée doit être immédiatement tamponnée avec, par exemple, du bicarbonate d'ammonium et lyophilisée. Le FNTa INH se présente à présent sous une forme sensiblement homogène qui convient à un titrage

supplémentaire de l'activité biologique et à la -

préparation sous une forme convenant à l'emploi dans le

domaine thérapeutique.

Par conséquent, selon l'une de ses caractéristiques supplémentaires ou alternatives, la présente invention a aussi pour objet une protéine qui inhibe sélectivement l'activité due au FNTa, qui est sensiblement identique à

celle obtenue dans le procédé décrit plus haut.

L'aptitude à purifier le FNTe INH conforme à la présente invention jusqu'à l'homogénéité a permis le séquençage de la fraction N-términale de cette molécule de protéine. Cette séquence facilitera le clonage d'un gène codant pour le FNTa INH permettant de cette manière la production d'importantes quantités de FNTa INH sous forme pure à partir d'un examen biologique complémentaire et éventuellement pour l'essai et

l'utilisation thérapeutique.

On peut séquencer des échantillons du FNTa INH homogène conforme à la présente invention par mise en oeuvre de techniques classiques, par exemple en utilisant un séquenceur automatisé disponible dans le commerce, faisant appel à une détection en phase gazeuse ou à la ninhydrine. Les 17 premiers résidus de la partie à terminaison amino du FNTa INH humain tel que défini dans le présent mémoire, comprennent la séquence suivante:

Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Cys-

Asn-Ser-Ile (identifiée en utilisant un séquenceur

automatisé, modèle 477A, de Appled Biosystems).

On suppose également que les trois aminoacides suivants fournissent un site de glycosylation et que la séquence se poursuit ainsi: Asn-Ser-ThrLys. Il faut comprendre qu'un procédé potentiel de fourniture d'importantes quantités de FNTa INH sous forme pure s'effectue par des techniques à l'ADN recombinant, bien connues des spécialistes. Cependant, l'utilisation couronnée de succès. de techniques de ce genre n'exige non seulement la mesure précise du FNTa INH naturel et recombinant ou de son activité, mais également que le produit tant naturel que recombinant

soit purifiable jusqu'à l'homogénéité.

Suivant encore une autre de ses caractéristiques, la présente invention a également pour objet un procédé de production d'un inhibiteur du facteur de nécrose tumorale selon l'invention ou d'un dérivé de celui-ci, par l'expression d'une séquence d'ADN encodant pour un tel inhibiteur dans un hôte.transformé de façon * 30 convenable. Un tel procédé implique la culture d'un hôte transformé avec des molécules d'ADN recombinant comprenant des séquences d'ADN encodant l'inhibiteur qui

a été inséré dans un vecteur convenable.

Des hôtes appropriés, eucaryotes et procaryotes, peuvent être, par exemple des souches de bactéries, des levures, d'autres champignons et des cellules animales (y compris les cellules d'insectes) et des cellules de plantes dans le tissu. Des cellules hôtes particulièrement préférées sont des cellules de levure, des cellules d'E. coli et des cellules animales. L'expression d'une protéine possédant une abtivité inhibitrice du facteur de nécrose tumorale s'obtient par la culture des cellules hôtes transformées dans un milieu de croissance approprié. Normalement, un tel milieu contient une source d'azote, comme le sulfate d'ammonium, une source de carbone et d'énergie, comme le glucose ou le glycérol, desoligo-éléments et des facteurs essentiels pour la croissances des cellules hôtes particulières. Les conditions précises de la culture dépendent de l'hôte choisi; ainsi, par exemple, dans le cas de E. coli, on préfère une fermentation

aérobie submergée, de préférence à environ 37 C.

En outre, l'expression peut être provoquée, par exemple, par l'addition d'un inducteur ou par l'emploi de conditions d'induction pour le système promoteur

utilisé dans le vecteur d'expression.

En fonction de l'hôte, l'inhibiteur de FNTa peut être produit sous forme de corps d'inclusion granulaires que l'on peut récupérer, après la lyse des cellules, par centrifugation différentielle; ces corps peuvent être solubilisés par des procédés classiques et purifiés par les méthodes décrites dans le présent mémoire de purification du FNTa INH urinaire. En alternative, l'inhibiteur de FNTa peut se trouver en solution dans le cytosol, sécrété dans l'espace périplasmique, ou

commodément sécrété dans le milieu de culture.

- Les cellules hôtes sont transformées par des molécules d'ADN recombinant qui comprennent une séquence d'ADN encodant pour l'inhibiteur de FNTa, qui a subi

l'insertion dans un vecteur d'expression.

Des vecteurs d'expression de ce genre peuvent être constitués de segments de séquences d'ADN chromosomiques, non chromosomiques et de synthèse, comme divers dérivés connus de.SV-40 et de plasmides bactériens connus, par exemple des plasmides "naturels", tels que ColE1, pSCIOI ou pRSF2124 et des ADN de phages, ou des plasmides "artificiels" (construits in vitro) , tels que pBR322, pMB9'ou pAT153. Les ADN de phages comprennent, par exemple les nombreux dérivés de phage lambda et d'autres phages d'ADN, par exemple M13 et d'autres phages d'ADN à brin unique filamenteux. Des vecteurs intéressants dans des levures comprennent le plasmide 2 V et ceux utiles dans des cellules eucaryotes, comme des cellules animales, comprennent

ceux contenant le rétrovirus et l'adénovirus SV-40.

On peut également caractériser de tels vecteurs d'expression par au moins une séquence de commande de l'expression, qui peut être opérativement liée à la séquence d'ADN de l'inhibiteur de FNT, en manière telle qu'elle commande et règle ou régule l'expression de la séquence d'ADN clonée. Enexemples de séquence de commande de l'expression intéressantes, on peut citer les systèmes lac, trp, tac et trc, des régions majeures, opératrices et promotrices, de phage lambda (tel que le promoteur PL sous la commande répresseur ts c1857 thermolabile), la région de commande de la protéine de revêtement fd, les promoteurs glycolytiques de la levure

(par exemple le promoteur pour la 3-

phosphoglycérate kinase), les promoteurs de la phosphatase acide de levure (par exemple Pho 5), les promoteurs d'appariement à la levure a et des promoteurs provenant de polyomes, d'adénovirus, de

rétrovirus et de virus simiens.

Au surplus, des vecteurs d'expression de ce genre, peuvent -posséder divers sites pour l'insertion des

séquences d'ADN d'inhibiteur de FNTa selon l'invention.

Ces sites se caractérisent par l'endonucléase de restriction spécifique qui les clive ou scinde. De tels sites de clivage ou de scission sont bien connus des spécialistes de la technique. Le vecteur d'expression et, en particulier, le site qui y est choisi pour l'insertion d'un fragment d'ADN choisi et sa liaison opérative à une séquence de commande d'expression, se déterminent par une série de facteurs comprenant le nombre de sites sensibles à une enzyme de restriction donnée, le calibre de la protéine à exprimer, la contamination ou la liaison de la protéine à exprimer par des protéines de cellules hôtes, qui peuvent être difficiles à éliminer au cours de la purification, la position de codons départ/arrêt et d'autres facteurs bien connus des spécialistes de la technique. Ainsi, le choix d'un vecteur et du site d'insertion pour une séquence d'ADN est déterminé par un équilibre de ces facteurs, toutes les sélections n'étant pas d'efficacité

égale pour un cas donné.

De même, toutes les combinaisons hôte/vecteur ne fonctionnent pas avec une efficience égale pour l'expression des séquences d'ADN selon l'invention. On procède au choix en tenant compte d'une variété de facteurs comprenant la compatibilité de l'hôte et du vecteur, la facilité de la récupération de la protéine souhaitée, les caractéristiques d'expression des séquences d'ADN et les séquences de commande de l'expression qui y sont opérativement liées, ou n'importe quelles modifications post-expression

nécessaires de la protéine souhaitée.

Les séquences d'ADN conformes à l'invention qui, par expression, codent pour des protéines avec une activité d'inhibiteur de FNTa, peuvent être isolées par criblage de diverses réserves d'ADN ou ADNthèques pour de telles séquences d'ADN, en utilisant une série d'échantillons d'ADN. On peut préparer les échantillons d'ADN à partir de la protéine naturelle purifiée que l'on utilise à titre de source de données de séquences d'aminoacides. On peut préparer la protéine naturelle purifiée, par exemple, à partir d'urine d'êtres humains fiévreux, comme décrit plus haut. On utilise des séquences d'ADN dégénérées, codant pour diverses parties et fragments de la séquence d'aminoacides, par exemple en combinaison avec des échantillons de Lathe, pour

modeler les échantillons d'ADN.

Ainsi, diverses ADNthèques sont criblées quant aux séquences d'ADN codant pour les inhibiteurs de FNT" conformes à la présente invention. Des ADNthèques de ce genre comprennent des banques de

gènes chromosomiques et des cADNthèques ou des ADNthè-

ques, que l'on prépare à partir de lignées de cellules ou de tissus, dont on a démontré qu'ils produisaient des inhibiteurs de FNTa, comme des macrophages alvéolaires ou le tissu hépatique. Le criblage peut s'effectuer par expression immune directe, par exemple dans Xgtll ou des systèmes similaires, ou bien, dans le cas o l'on identifie une cellule produisant du FNTa INH, par l'identification du mARN spécifique du FNTc INH par

l'expression directe dans des oocytes de Xenopus.

On peut avoir recours à toute une série de techniques de clonage et de sélection classiques pour localiser et identifier- des séquences d'ADN qui encodent, par expression dans un hôte procaryote ou eucaryote approprié, les inhibiteurs de FNTa selon l'invention. Ces séquences d'ADN choisies ou sélectionnées peuvent, elles mêmes, être utilisées comme échantillons pour choisir d'autres séquences d'ADN codant pour les inhibiteurs de FNTa, ou bien on peut les utiliser dans des molécules d'ADN recombinant convenables pour transformer des hôtes eucaryotes ou procaryotes appropriés en vue de la production du

FNTa INH qu'elles encodent.

La portée de la présente invention s'étend également aux séquences d'ADN à brin unique et à double brin encodant pour des FNTa INH, des vecteurs contenant des séquences de ce genre, appropriées à la transformation d'un organisme hôte et de cellules hôtes

transformées par de telles séquences d'ADN.

Selon encore une autre de ses caractéristiques, l'invention a également pour objet une protéine avec une activité inhibitrice ou d'inhibiteur de FNTa sélective, produite par l'expression d'un hôte transformé avec une séquence d'ADN encodant pour une telle protéine inhibitrice de FNTc. Les inhibiteurs de FNT selon l'invention que l'on prépare par l'expression d'une séquence d'ADN encodant de tels inhibiteurs dans un hôte transformé seront par conséquent identiques à la séquence de FNTa INH naturel ou contiendront une ou plusieurs omissions, substitutions, insertions, inversions ou additions d'origine allélique ou autre, la séquence ainsi obtenue aura au moins 80% et, de préférence 90%, d'homologie avec la séquence du FNTc INH naturel et conservera essentiellement les mêmes propriétés biologiques. De manière plus particulière, un inhibiteur de FNTc selon l'invention peut comprendre une méthionine à N-terminal. De même, par exemple, la séquence d'ADN selon l'invention codant pour le. FNTa INH peut être fusionnée dans un vecteur d'expression à une partie d'une séquence d'ADN codant pour un poLypeptide eucaryote ou procaryote, afin de faciliter l'expression de la séquence d'ADN encodant le FNTa INH, ou d'aider -à la sécrétion, la maturation, la -purification du FNTa INH à partir de l'hôte; le

polypeptide fusionné peut être enlevé inter- ou extra-

cellulairement par des techniques connues, ou bien le FNTa INH peut être utilisé en même temps que le

polypeptide fusionné.

Les FNTc INH produits par la culture d'hôtes eucaryotes ou procaryotes, transformés par des séquences d'ADN encodant le FNTa INH, peuvent ensuite être employés, après purification, dans les compositions

pharmaceutiques conformes à l'invention.

Il faut comprendre que lorsqu'il est produit par des cellules animales, le FNTa INH selon l'invention sera une glycoprotéine. Cependant, des systèmes d'expression procaryotes produiront la protéine à l'état aglycosylé. En outre, la protéine glycosylée peut être sensiblement déglycosylée par des techniques bien connues des spécialistes, par exemple, par

l'addition d'enzymes du type endoglycosidase.

Les exemples non limitatifs qui suivent illustrent la présente invention. Toutes les températures sont indiquées en OC et toutes les concentrations en

pourcentage sont en p/v.

Titrage de l'inhibition du FNT.

Le pourcentage d'activité du FNTa INH dans les fractions décrites dans les exemples a été déterminé en présumant que les valeurs de la densité optique (DO) de cellules murines L929, stimulées à l'actinomycine D (acti S), correspondait à une inhibition de 100%, tandis que la DO de cellules cultivées avec de l'actinomycine D et du FNTa correspondait à une mortalité cellulaire maximale de 0% d'inhibition de FNTa. Le FNTU utilisé pour le titrage était du FNTa humain recombinant (rhFNTa) produit dans E. coli comme décrit par A. Marmenout et coll., "Clonage moléculaire et expression du facteur de nécrose tumorale humain et comparaison de celuici au facteur de nécrose tumorale de la souris", Eur. J. Biochem., 152, p515 (1985). Ainsi, le pourcentage de l'inhibition du FNTa au cours du titrage de la cytotoxicité fut calculé conformément à la formule (I): Pourcentage de l'activité de FNTa INH = (DO avec acti D + rhFNTa + FNTa INH) -.(DO avec acti D + rhFNTa) x (I) "0 (DO avec acti D) - (DO avec acti D + rhFNTa)

Exemple 1

Purification du FNTa INH urinaire a) Concentration des protéines provenant de l'urine humaine On a rassemblé les urines humaines (15 litres) fraîchement obtenues d'un pool de cinq patients avant de procéder à un quelconque traitement. Deux des patients souffraient d'un carcinome à petites cellules, un autre d'histiocytose maligne, un autre encore de polymyosite et le dernier d'un état septique. Tous les patients étaient extrêmement fiévreux et étaient dépourvus d'infections urinaires. On a concentré l'urine à 4 sur un appareil d'ultrafiltration à fibres creuses Amicon,

avec une coupe d'un calibre moléculaire d'environ 5 kDa.

b) Préparation des protéines à partir de l'urine humaine On a saturé l'urine rassemblée, concentrée, de sulfate d'ammonium solide en ajoutant lentement le sulfate, sous agitation-constante et à 4 , jusqu'à'ce que la concentration en sulfate d'ammonium eût atteint 40%. On a enlevé le précipité par centrifugation, on l'a écarté et on a ajusté la couche surnageante jusqu'à -une saturation de 80% par l'addition de sulfate d'ammonium complémentaire. On a obtenu une pastille par centrifugation que l'on a remise en suspension dans 150 ml de phosphate de sodium 20 mM (pH de 7,2) et de chlorure de sodium 150 mM; On a éliminé le sulfate d'ammonium par dialyse à 4 C en se servant de tris-HCl mM (pH de 7,4) de 1'EDTA 2 mM et de benzamidine-HCl 5 mM. c) Identification de l'activité FNTa INH On a testé la fraction semi-purifiée de l'exemple l(b) dans un titrage de cytotoxicité avec une lignée de cellules L929 sensibles au FNT, en présence d'actinomycine D. A une dilution de 1:20 de la fraction semipurifiée, on a observé une inhibition totale de l'effet cytotoxique induit par le rhFNTa, si bien que la valeur DO570nm était identique à celle mesurée en 570n

présence d'actinomycine D seule (DO)570nm = 1,5).

En outre, on a observé l'activité inhibitrice, en dilutions' de la fraction allant jusqu'à 1:160 sur des cellules (DO570nm = 0,83), cependant que la veleur témoin de rhFNTa, à une concentration finale de 0, 2 ng/ml, mesurée en présence d'actinomycine D, était inférieure (DO570nm = 0,73), si bien que l'on a observé % de l'inhibition à une dilution d'approximativement 1:100 (DO570nm = 1,10). Le FNTa INH n'eut pas d'effet sur la viabilité des cellules lorsqu'on le testa sans actinomycine D. d) Comparaison de l'effet de FNTc INH sur la cytotoxicité induite par le FNTa et le FNTe On a effectué un titrage de cytotoxicité en utilisant la lignée de cellules L929 sensibles au FNT, en présence d'actinomycine D, en utilisant une gamme de concentrations en FNTa ou FNTe pour induire l'effet cytotoxique. On a testé la fraction semi-purifiée de l'exemple l(b) à des dilutions de 1:20, 1:50 et 1:80. On a réalisé des tests témoins en l'absence de FNTa ou FNT3 cytokine et en l'absence d'inhibiteur. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 qui suit et démontrent que l'inhibiteur conforme à l'invention n'exerce pas d'effet inhibiteur sur la cytotoxicité due au FNTe, variant depuis approximativement 50% en descendant jusqu'à 2% de l'inhibition de FNTa avec

l'élévation de la concentration en FNTe.

ON (N ON ON

LilO 08-0 ú0IT 90'0 OOD Z úT'O 6T'0 úT0 TO El

9L'0 OT'I 601 6T0 OSZ T

8T'0 9ZO0 0O0o LI'O OZ

T'TI 6'T Z5I 0ú-0 D> 005

ZVO Tú 0 bt O 7Z'O

úú'T OL'I OL'T 8ú' 0 D OSZ

Z5O 6O TL'O. Lú'0 O

T5'T 691' 8LI úL'O D OOs l

89-0 18O ú0-T 59'0

89'T ZL'I 06'1< ZO'T 0 5

ZZ'I TZI- 15'T ZO'I T

89'T L'T 06'T< OúT D Oz

6úET 917' 99'1 9T1T 01

ON ON UN ON OT

06'1< 6< 6< 06-T< 06T< 0

08/T 05/1 OZ/T _lueN sainTl -1 e WuOL -IaD xne 6Z6I sawnTlTasep (tUU0L oC) 6Z6q saInIIaD sap mns @;9no.Ce gnoCe (Tw/Bd) ( OOZ-S TÀLMPqdas mgs ao0T2-4qiUT aupjO&zo no.) INI np aEiu uoTqDeag e ap aGTur;t uoTqnyT ap su Zod -7 uoTqP$luaouoo I nealqvl

Exemple 2

Filtration sur gei de FNT INH urinaire On a purifié le FNT INH semipurifié de l'exemple 1l(b) par chromatographie à filtration à travers gel à 4 sur une colonne de Sephacryl S200 (0,9 x 60 cm) (Pharmacia, Uppsala, Suède) équilibrée dans un tampon tris-HC1 50 mM (pH de 7,4) contenant du chlorure de sodium 100 mM. On a appliqué un échantillon de la fraction protéinique (20 mg, 0,8 ml) & la colonne et on l'a élué avec le même tampon, à un débit de 5,4 ml/h. On a rassemblé les fractions (1,35 ml) et on les a testées quant à leur activité de FNTa INH. L'activité de FNTa INH s'élua à partir du gel sous forme d'un pic ou pointe unique. Le produit à activité de FNTa INH s'élua du gel sous forme d'un pic ou pointe unique. Le produit à activité inhibitrice manifesta un poids moléculaire

apparent de 40 à 60 kDa (voir figure 1).

Exemple 3

Chromatofocalisation du FNTc INH urinaire On a chromatofocalisé le FNa INH semi-purifié de

l'exemple l(b), à 4 , sur une colonne prégarnie de mono-

P (HR 5/20, 5 x 200 mm) (Pharmacia, Uppsala, Suède) équilibrée dans un tampon bis-tris 25 mM, ajusté à un pH de 7,1 à l'aide d'acide imidodiacétique (Fluka, Buchs, Suisse). On a appliqué un échantillon de la fraction protéinique de l'exemple 1(b) (30 mg) à une colonne et on l'a élué avec un-polytampon 74/acide iminodiacétique à un pH de 4,0. On a testé des fractions de colonne (1

ml) à une dilution de 1:10 quant à leur effet au cours-

du titrage de cytotoxicité induit au rhFNTa (0,2 ng/ml), en présence d'actinomycine D (1 pg/ml). On a déterminé là pH réel de chaque fraction de colonne à l'aide d'un pHmètre, la majeure partie de l'activité de FNTc INH se trouvant dans les fractions éluées entre un pH de 5,5 et de 6,1 (voir figure 2). Ceci est équivalent au pI de la

protéine de FNTa INH.

Exemple 4

Chromatographie par échange d'ions du FNTa INH urinaire On a purifié le FNTa INH semi-purifié de l'exemple l(b) par une chromatographie d'échange d'anions, à 4 , sur une colonne de Sephadex DEAE (2,6 x 20 cm) (Pharmacia, Uppsala, Suède), équilibrée dans un tampon tris-HCl 10 mM de pH 8,0, contenant 2 mM d'EDTA. On a élué la matière liée de la colonne avec le tampon d'équilibrage contenant du chlorure de sodium 0,8 mM. On a recueilli les fractions (8,0,ml), on les a testées quant à leur activité de FNTa INH et on a rassemblé les fractions inhibitrices (160 ml) et on les a dialysées vis-à-vis d'un tampon à l'acétate de sodium 10 mM de pH , 0 (4 x 2 litres). On a davantage purifié le FNTa INH par une chromatographie d'échange de cations, à 4 , sur une colonne de sulfopropyl-sephadex (0,8 x 15 cm) -(Pharmacia, Uppsala, Suède) équilibrée dans un tampon à l'acétate de sodium 10 mM de pH 5,0. On a élué la matière liée de la colonne avec le tampon d'équilibrage contenant du chlorure de sodium 0,5 M. On a recueilli des fractions (7,5 ml), on en a testé l'activité de FNTa INH et on a rassemblé les fractions inhibitrices et on les a concentrées 20 fois sur un appareil d'ultrafiltration Amicon avec une coupe d'un calibre

moléculaire d'environ 10 kDa.

Exemple 5

Filtration à travers gel du FNTa INH urinaire On a purifié le concentré de FNTa INH de l'exemple 4 par chromatographie à filtration à travers gel à 4 sur une colonne de Sephacryl S-200 (2,6 x 100 cm) (Pharmacia, Uppsala, Suede), équilibrée avec un tampon tris-HCl 50 mM de pH 7,4 contenant du chlorure de sodium mM. On a appliqué un échantillon de la fraction protéinique de l'exemple 4 (2000 mg) à la colonne et on l'a élué avec le tampon d'équilibrage à un débit de 27 ml/heure. On a recueilli des fractions (9,0 ml), on en a testé l'activité de FNTa INH et on a rassemblé les fractions inhibitrices. On a calibré la colonne avec du bleu de dextrane (BD), 2000 kDa, de l'albumine de sérum bovin (ASB), 67 kDa, de l'ovalbumine (OA), 43 kDa, de l'a-cymotrypsinogène-A (oCT), 25 kDa et de la ribonucléase A (RNase), 13,5 kDa, comme la figure 4 le montre.

Exemple 6

Chromatographie d'affinité du FNTc INH urinaire On a préparé la colonne d'affinité de FNTc en couplant du FNTc humain recombinant (1,0 mg) à de la gélose Mini Leak (Kem En Tec, Biotechnology Corp., Danemark) dans un tampon au phosphate de potassium 0,8 M de pH 8,6. On a bloqué les radicaux actifs résiduels par incubation dans un tampon d'éthanolamine- HCl 0,1 M d'un pH de 8,5. On a lavé le gel avec un tampon au tris-HCl mM d'un pH de 7,4, contenant du chlorure de sodium mM (3 x 50 ml). On a appliqué un-échantillon des

fractions de FNTa INH de l'exemple 5 (15 ml) à la colon-

ne et on a procédé à l'élution avec un tampon à la

glycine-HCl 0,2 M de pH 3,5. On a rassemblé les frac-

tions (1,0 ml), on les immédiatement ajustées à un pH de 7,0 par l'addition de tris 1M (5 à 40 pl) et on les a

testées quant à leur activité de FNTc INH.

Exemple 7

Chromatographie FPLC à phase inverse du FNTa INH urinaire On a lyophilisé les fractions de FNTla INH de l'exemple 6, on les a dissoutes dans de l'acide trifluoracétique à 0,1% (2,0 ml) et on les a chargées sur une colonne de FPLC a phase inverse ProRPC (5 x 20 cm) (Pharmacia, Uppsala, Suede), équilibrée dans de l'acide trifluoracétique à 0,1%. On a élué la matière liée avec un gradient d'acétonitrile de 0 à 100t dans de l'acide trifluoracétique à 0,1%, au débit de 0,3 ml/minute. On a ajouté du bicarbonate d'ammonium 0,5M (10 p1) a chaque fraction (0,75 ml) et on a lyophilisé la matière éluée. La chromatographie FPLC & phase inverse révéla un pic majeur correspondant & l'activité de FNTa INH. On a dissous les fractions lyophilisées contenant cette activité dans un tampoh au tris-HCl 10 mM de pH 7,4, contenant de 1'EDTA 2 mM et on les a

analysées par électrophorèse sur gel de polyamide-

dodécylsulfate de sodium (SDS PAGE) en se servant du procédé décrit par U. Laemmli et coll., Nature, 277, p680 (1970). On a constaté que le FNTa INH s'éluait avec un poids moléculaire de 33 kDa (voir figure 4). Les échantillons obtenus dans des conditions non réductrices furent testés quant à leur activité de FNTa INH à une dilution de 1:10 sur des cellules L929, en présence de 0,15 mg/ml de rhFNTa. L'activité dirigée contre rhFNTa migra avec le poids moléculaire apparent identique à la bande 33 kDa sur l'essai sur gel dans des conditions réductrices.

Exemple 8

Séquençage protéinique du FNTa INH urinaire On a concentré la fraction de FNTa INH, isolée à partir de la chromatographie de FPLC à phase inverse, sous vide et on l'a portée sous forme de taches sur un filtre séquenceur conditionné. On a analysé la protéine par un séquenceur de protéines Applied Byosystems Modèle 477A. On a évaporé les fractions des cycles séquenceurs jusqu'à siccité et on les a remises en suspension dans de l'acétate de N,N-diisopropyléthylamine et de l'acétonitrile, préalablement à l'injection dans une colonne de chromatographie en phase liquide à pression élevée ou haute performance, en vue de l'identification

du résidu.

On a identifié les premiers 17 restes d'aminoacides du N-terminal et ceuxci répondaient à la séquence:

Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His--Pro-Gln-Cys-

Asn-Ser-Ile. On suppose également que les trois aminoacides suivants fournissent un site de glycosylation et que la séquence se poursuit ainsi: Asn-Ser-Thr-Lys. Cette séquence n'est pas notablement

homogène vis-à-vis de n'importe quelle séquence pro-

téinique contenue dans une base de données de séquences

protéiniquesNBRF (novembre 1988).

Exemple 9

Démonstration que le FNTa INH est une protéine a) Dépendance de la durée et de la température

On a chauffé le FNTa INH purifié sur Sephacryl S-

de l'exemple 2, obtenu en rassemblant les tubes des fractions actives, à 56 , 75 et 95 . On a mesuré l'activité de FNTc INH après 10, 20 et 60 minutes et, par comparaison à des échantillons non traités, on a calculé le pourcentage d'activité de FNTa INH suivant la formule (I). Les résultats présentés dans le tableau 2 qui suit démontrent que l'activité du FNTc INH diminue

d'une manière qui dépend du temps et de la température.

Inactivation à la chaleur Pourcentage d'activité de Temrpérature ( C) Temps (min) FNTa INH

100

56 20 100

93

60

20 26

15

27

95 20 10

13

b) Sensibilité à la digestion par la trypsine On a ajouté de la trypsine (500 pg) (Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.) dans un tampon tris 0,2M (pH de 8, 0) contenant du chlorure de calcium lmM aux fractions réunies de FNTa INH urinaire purifié sur Sephacryl S-200 de l'exemple 2 et on a incubé le tout à 37 C pendant 4 heures. On a ajouté une autre proportion de trypsine (500 pg) et on a poursuivi la digestion pendant 20 heures supplémentaires, période au bout de laquelle on a terminé la réaction par l'addition d'inhibiteur de

trypsine de soja (2 mg) (Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.).

On a déterminé le pourcentage d'activité inhibitrice de FNTa INH du produit digéré à la trypsine et du témoin, à une dilution finale 1:20 de l'ensemble des fractions réunies, sur des cellules L929 stimulées par du rhFNTa, en présence d'actinomycine D, suivant la formule (I).Les

* résultats apparaissent dans le tableau 3 qui suit.

Inactivation trypsinique Pourcentage d'activité Conditions de FNTa NINI DO 570nm Tampon seul O 0.71 Trypsine+inhibiteur de trypsine de soja dans tampon 0 0.70 Urine, purification

partielle sur Sepha-

dex S-200 61 1.46 Urine, purification

partielle sur Sepha-

dex S-200 avec diges-

tion par trypsine 23 1.03 c) Traitement par l'urée On a ajusté le FNTa INH purifié sur Sephacryl S-200 de l'exemple 2 jusqu'à 2M d'urée et on l'a intensivement dialysé à 4 vis-à-vis d'une solution saline tamponnée au phosphate (STP) contenant de l'urée 2M. On a répété

la dialyse vis-à-vis de STP préalablement au biotitrage.

On a constaté que l'activité de FNTc INH n'était pas affectée, ce qui indique que l'activité inhibitrice n'est pas provoquée par une molécule de faible poids

moléculaire liée à une protéine.

Exemple 10

Démonstration de l'inhibition compétitive On a testé le FNTa INH purifié sur Sephacryl S-200 de l'exemple 2, à une dilution de 1:10, vis-à-vis de quantités croissantes de rhFNTa sur cellules L929. On a observé une corrélation inverse entre la quantité de rhFNTa présente dans le titrage. et le degré d'inhibition (voir figure 3). Par conséquent, l'activité inhibitrice est compétitivement palliée par des concentrations

croissantes de rhFNTa.

Exemple 11

Inhibition de la production de PG2 due au FNT" par des fibroblastes dermiques On a ensemencé des fibroblastes dermiques humains à une concentration de 2,0 x 104 cellules/puits et on les a cultivées pendant 48 heures. On a ensuite stimulé les cellules avec un tampon DMEM complété de 10% de SVF à titre de témoin. On a également stimulé les cellules avec du rhFNTa en concentrations variant de 0,5 à 5 mg/ml et on a étudié l'effet du FNTa INH de l'exemple 5 à trois dilutions (1:20,1:50 et 1:80) dans le tampon susmentionné. après une incubation de 72 heures, on a mesuré la production de PGE2 dans les couches surnageantes, par un radioimmunotitrage, en utilisant de l'antisérum de PGE2 [voir J M.Dayer et coll., J.

Clin. Invest., 67, p1386 (1979)].

Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-

dessous et démontrent que le pouvoir du rhFNTa à stimuler la- production de PGE2 par des fibroblastes dermiques fut inhibé par l'addition de FNTa INH dans les trois dilutions précitées. A la dilution de 1:80 du FNT -INH, l'activité inhibitrice fut partiellement

palliée par l'élévation des Concentrations en rhFNTa.

Concentration de Production de PGE2par des fibroblastes dermiques Concentration de rhFNT sur des fi humains (ng/ml) broblastes humains Dilution de FNTa INH sur fibroblastes (pg/mr) néant 1:80 1:50 1:20 "

0 50.6 +7.4 88.8 +5.6 103.0 +8.9 111.0 +9.4

500 160.0 + 14.1126.0 +9.3 115.9 +6.6 113.9 +7.1

2,000 331.7 + 28.4217.2 + 10.7156.7 + 10.7115.3 + 21.3

,000 381.7 + 19.6257.2 + 13.7253.1 * 21.2221.6 4 16.0

On a réalisé trois expériences différentes avec la même souche de fibroblastes. On a incubé le tampon ou le FNTa INH à diverses dilutions, en présence ou en l'absence de diverses concentrations de rhFNTa. La production de PGE2 par des fibroblastes dermiques humains cultivés fut mesurée au bout de trois jours. Les valeurs obtenues représentent les moyennes de triples

essais des trois cultures ESM (N=3).

Exemple 12

Titrage de l'inhibition de liaison du rhFNTa On a iodé du FNTa humain recombinant en utilisant le procédé à l'iodogène de Fraker et Speck jr., Biochem. Biophys. Res. Comm., 80, p849 (1978). L'activité spécifique du [12517-FNTa fut de 2,2 x 104 cpm/ng et produisit une bande unique avec un poids moléculaire de 10 kDa lorsque soumis à l'analyse par SDS-PAGE. On a cultivé la lignée de cellules macrophages humaines U937 en fractions aliquotes de 10 cellules, à 4 C, pendant deux heures, dans un milieu de culture (200 pl) comprenant du RPMI 1640 (Gibco, Paisley, Ecosse) complété de streptomycine (100 mg/ml), de pénicilline (100 U/ml), 1,0% de glutamine et 10% de sérum de veau foetal et contenant, de surcroît, 0,04% d'azoture de sodium et 0,5 ng de ?251J-FNTa.. On a réalisé l'inhibition de liaison par l'addition de diverses

dilutions de FNT1 INH (1:20, 1:200 et 1:2000).

On a mesuré la liaison aspécifique en présence d'un excès centuple de rhFNTa non marqué et on a séparé la radioactivité libre du [25 IJ-FNTa lié par

centrifugation par l'intermédiaire d'un mélange.

d'huiles, comme l'ont décrite Robb et coll., J. Exp.

Med., 154, p1455 (1981). On a mesuré le [125 I7-FNTa lié aux cellules dans un compteur gamma (LKB, Bromma, Suède) et on a déterminé le pourcentage d'inhibition de liaison selon la formule (II) Pourcentage d'inhibition de la liaison = cpm avec FNTT INH - cpm de liaison spécifique xl1- - (II) x 1 cpm de liaison totale - cpm de liaison spécifique ()

Exemple 13

Effet du FNTa INH sur la liaison du [125 I-FNTa aux cellules U937 On a pré-incubé des cellules U937 pendant une heure à 20 dans le milieu de culture de l'exemple 12, en présence soit de [125 I7-FNT' seul, soit de (125 I1-FNT avec un excès centuple de rhFNTa non marqué.. On a ensuite lavé les cellules U937 avec une solution saline tamponnée au phosphate (3 x 50 ml) à 4 . On a divisé les cellules incubées dans du -125 I7-FNTa seul en quatre lots que l'on a incubés avec du.FNTa INH de l'exemple 5 (dilutions 1:20, 1:200 et 2:2000) et avec un tampon seul respectivement.

On a constaté que la liaison spécifique de 125 17-

FNTa aux cellules U937 était inhibée à 4 , à 100%, 80% et 35%, par les trois dilutions du FNTa INH 1:20, 1:200 et 1:200 respectivement (voir figure 5). Le lot témoin qui ne comprenait pas de FNTc INH ne manifesta pas d'activité inhibitrice. L'inhibition de la liaison des deux dilutions les plus faibles se trouva être augmentée

jusqu'à 90% et 60% lorsque l'on pré-incuba le L125 I7-

FNT" avec du FNTa INH à des dilutions de 1:200 et 1:2000

respectivement, préalablement à l'addition des cellules.

On a répété l'expérience en utilisant les cellules pré-incubées en présence de -25L7-FNTa et un excès centuple de FNTa non marqué, de façon àce que le pourcentage d'inhibition de liaison pût être corrigé

pour la liaison aspécifique.

Exemple 14

Dissociation d'un complexe FNTa:U937 préformé On a pré-incubé des cellules U937 pendant une heure -125

en présence de 25 IJ-FNTa comme décrit à l'exemple 12.

On a lavé les cellules et on les a incubées à 4 ou à 37 en présence ou en l'absence de FNTa INH de l'exemple 5. On a constaté que le ê25V7-FNTa lié à la surface des cellules se dissociait plus rapidement en présence de FNTa INH qu'en son absence et on a constaté que ceci se produisait d'une manière dépendant de la durée et de la température (voir figure 6);

exemple 15

Démonstration que le FNTa INH n'est pas. protéolytique pour le rhFNTa On a incubé du L25I7-FNT" à 20 pendant une heure, en présence de trois dilutions différentes de FNTa INH

(1:20, 1:200 et 1:2000) et en présence d'un tampon seul.

Lorsqu'analysé par SDS PAGE et autoradiographie, on constata que le C25I1FNTa migra sous forme de bande unique, tant en l'absence qu'en présence de FNTa INH, montrant que l'inhibiteur n'avait pas d'effet protéolytique.

Exemple 16

Effet du FNTa INH sur l'activité de liaison du récepteur IL-1 On a testé l'activité du FNTa INH de l'exemple 5 au cours du titrage du IL-1/FAL (facteur d'activation des lymphocytes) après induction par IL-la ou IL10i ce titrage est décrit par P. Seckinger et coll., J. Immunol., 139, p1541 (1987) pour une protéine d'inhibiteur IL-1]. On a observé une réponse à la dose d'incorporation de f HJ-thymidine (correspondant à une prolifération de thymocytes) dans des concentrations

allant jusqu'à 200 pg/ml des deux formes IL-la et IL-ae.

L'addition de FNTa INH à des taux dont on avait observé l'inhibition du rhFNTa n'eut aucun effet notable sur la prolifération des thymocytes induites au IL-1, prouvant ainsi que l'inhibition était spécifique pour le FNTa seulement. Les résultats obtenus sont illustrés en référence aux dessins ci-annexés, dans lesquels: La figure 1 représente le profii de l'activité du

FNTa INH urinaire par filtration sur gel de Sephacryl S-

200. On a testé des fractions de colonne (1 ml) à une dilution de 1:10 pour réaliser le titrage de la cytotoxicité du rhFNTa (1,0 ng/ml), en présence d'actinomycine D (o --o). La ligne ( -) représente la DO280nm des fractions. Les barres représentent la lyse de cellules mesurée par prise de colorant en réponse à l'actinomycine D (E) et à l'actinomycine D plus rhFNTc (E) sans urine. Les marqueurs du poids moléculaire sont le bleu de dextrane (BD), l'albumine de sérum bovin (ASB), l'ovalbumine (OA), l'a-chymotrypsinogène ("CT), -la ribonucléase A (RNase) et le rouge de phénol (i - rouge). La figure 2 représente le profil de l'activité du FNTa INH urinaire de la chromatofocalisation sur une colonne de Mono-P. On a testé des fractions de colonne (1 ml), à une dilution de 1:10, en vue de déterminer leur effet au cours du titrage de la cytotoxicité de rhFNTc (0,2 ng/ml) en présence d'actinomycine D (1,0 pg/ml) (o -o). La ligne () représente la DO280nm 280nm des fractions et (----) représente leur pH. Les barres ont la même signification que celle indiquée & propos de

la figure 1.

La figure 3 représente la reversibilité de l'activité du FNTa INH. Les cercles ouverts (o - o) représentent la DO570nm' mesurée en présence d'actinomycine D, de rhFNTa et de FNTc INH; les cercles fermés (O -) représentent la DO570nm, mesurée en présence d'actinomycine et de rhFNTa seulement et la barre ( [) représente la DO570nM en présence

d'actinomycine D (1,0 pg/ml) seule.

La figure 4 représente le profil d'élution par filtration à travers gel de Sephacryl S-200 avec du FNTa INH purifié de l'exemple 5. On a stérilisé des fractions de colonne (9 ml) et on les a testées, & une dilution de' 1:50, vis-a-vis de rhFNTa (1,0 mg/ml) en présence d'actinomycine D (1,0 pg/ml), en présence d'actinomycine D (1,0 lg/ml) au cours du titrage de la cytotoxicité avec L929 (o o). La ligne () représente la DO280nm des fractions. Les barres ont les mêmes 280nm significations que celles indiquées à propos de la

figure 1.

La figure 5 montre l'analyse par SDS PAGE du FNTc INH purifié de l'exemple 7. On a réalisé la SDS PAGE de la manière décrite par U. Laemmli et coll., Nature, 277, loc. cit. On a chargé des échantillons sur un gel de polyacrylamide & 15% avec un gel de chargement et on a coloré les gels à l'argent de la manière décrite par C. Merril et coll.., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, p4335 (1979). Des échantillons issus de conditions non réductrices ont été testé quant à l'activité biologique en découpant des tranches de 2mM du gel et en éluant les protéines par incubation jusqu'au lendemain dans du tris-HC1 10 mM de pH 7,4 contenant 2 mM d'EDTA (volume total: 200 pl). On a testé les fractions, à une dilution de 1:10, sur. des cellules L929, en présence de

rhFNTa (0,15 ng/ml).

La figure 6 montre l'effet du FNTa INH sur la liaison du _25I7-FNTa à des cellules U937. On a incubé le FNTa INH, à trois dilutions différentes, en présence de ?25I.7-FNTa avec la lignée de cellules U937, telle que décrite à l'exemple 13. Les carrés ouverts -----) représentent l'incubation en présence de FNTa INH et les triangles ouverts (A à) représentent le témoin. Les mêmes symboles fermés se rapportent à une pré- incubation du FNTa INH, à 20 et pendant 30 minutes, avec du t25'7-FNTa dans le milieu de culture, avant de procéder

à l'addition des cellules.

La figure 7 représente la dissociation d'un complexe FNTa: U937 préformé. On a pré-incubé des cellules U937 avec du [ 125I-FNTa, on les a lavées et incubées avec du FNTa INH, de la même manière que celle décrite à l'exemple 14, soit a 4 (---), soit à 37 (O}_-C 0). Au moment indiqué, on a mesuré la radioactivité associée aux cellules et on a déterminé le pourcentage de liaison spécifique. Sur le graphique, la valeur obtenue avec le témoin sans l'inhibiteur a été soustraite des valeurs obtenues aux deux températures, par conséquent 100% correspond à la valeur obtenue sans

addition de FNTa INH.

Claims (22)

R e v e n d i c a t i o n s

1. Protéine qui inhibe l'activité due au facteur de nécrose tumorale FNTa mais ne bloque pas d'autres protéines qui possèdent certaines des, mais pas toutes les activités biologiques du FNT. 2. Protéine qui inhibe sélectivement l'activité due au facteur de nécrose tumorale a et qui possède une ou plusieurs des caractéristiques suivantes: (a) un poids moléculaire qui fluctue de 40 à 60 kDa, déterminé par chromatographie sur tamis moléculaires; (b) un point-iso-électrique (pI) qui varie de 5,5 à 6, 1, déterminé par chromatofocalisation; (c) l'inhibition du titre de FNT standard de cytotoxicité différentielle pour des cellules murines L929 traitées par l'actinomycine D; (d) l'inhibition de la libération de PGE2 induite au FNT à partir de cellules synoviales et de fibroblastes haumains; (e) l'inhibiteur interfère avec la liaison du FNTa à des cellules U937 (une lignée tumorale monocytique), comme mis en évidence par l'inhibition de la liaison du FNTa radiomarqué (125I-FNTa); (f) la dissociation d'un complexe FNT: cellules U937 est favorisée par l'inhibiteur d'une manière qui dépend de la température;

(g) l'inhibiteur n'altère pas le FNT par scission.

protéolytique; (h) l'inhibiteur n'inhibe pas l'activité de

liaison du récepteur IL-1, par exemple la liaison du IL-

l radiomarqué (125I-IL-lc) à la sous-lignée de thyome

mirin EL4-61.

3. Protéine qui inhibe sélectivement l'activité due au facteur de nécrose tumorale a et qui possède une ou plusieurs des caractéristiques suivantes: (a) un poids moléculaire d'environ 33 kDa, comme déterminé par SDS PAGE; (b) un point iso-électrique (pI) qui varie de 5,5 & 6,1, comme déterminé par chromatofocalisation; (c) l'inhibition du titre de FNT standard de cytotoxicité différentielle pour des cellules murines L929, traitées & l'actinomycine D; (d) l'inhibition de la libération de PGE2 induite au FNT à partir de cellules synoviales et de fibroblastes humains; (e) l'inhibiteur interfère avec la liaison du FNTa aux cellules U937 (une lignée tumorale monocytique), comme on a pu le mettre en évidence par l'inhibition de la liaison du FNTa radiomarqué (125I-FNTa); (f) la dissociation d'un complexe FNTa: cellules U937 préformé est favorisée par l'inhibiteur d'une manière qui dépend de la température; (g) l'inhibiteur n'altère pas le FNT par scission protéolytique; (h) l'inhibiteur n'inhibe l'activité de liaison du récepteur IL-1, par exemple la liaison de l'IL-1 radiomarqué ( 125I-IL-l) à la sous-lignée de thyome

murin EL4-6,1.

4. Protéine suivant l'une quelconque des

revendications 2 et 3, possédant les propriétés (a) et

(b) ainsi qu'une ou plusieurs des propriétés (c) à (h).

5. Protéine suivant l'une quelconque des

revendications 2 et 3 possédant toutes les propriétés

(a) à (h).

6. Protéine suivant l'une quelconque des

revendications 1 & 5, qui correspond & un inhibiteur de

FNTa naturel.

7. protéine suivant - l'une quelconque des

revendications 1 & 6, possédant une séquence

d'aminoacides à terminaison amino, comme suit:

Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Cys-Asn-

Ser-Ile. 8. Protéine suivant la revendication 7, possédant une séquence d'aminoacides & aminoterminal, comme suit:

Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Cys-

Asn-Ser-Ile-Asn-Ser-Thr-Lys. 9. Protéine suivant l'une quelconque des

revendications 1 à 8 et dans laquelle la séquence

d'aminoacides contient une ou plusieurs omissions, substitutions, insertions, inversions ou additions d'origine allélique ou autre, la séquence résultante possédant au moins 80% d'homologie avec la protéine apparentée et conservant essentiellement les mêmes

propriétés biologiques que la protéine apparentée.

10. Protéine suivant la revendication 9, possédant

au moins 90% d'homologie avec la protéine apparentée.

11. Protéine suivant l'une quelconque des

revendications 1 à 10, sous une forme sensiblement

homogène.

12. Protéine suivant l'une quelconque des

revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle est

une protéine recombinante.

13. Protéine suivant l'une quelconque des

revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle est

une protéine glycosylée.

14. Protéine suivant l'une quelconque des

revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle est à

l'état sensiblement à l'état aglycosylé.

15. ADN exogène comprenant une séquence de nucléotides codant pour une protéine telle que définie

dans l'une quelconque des revendications 1 à 11.

16. cADN comprenant une séquence de nucléotides codant pour une protéine suivant l'une quelconque des

revendications 1 à 11.

17. Vecteur d'expression recombinant comprenant de

l'ADN suivant l'une quelconque des revendications 15 et

16. 18. Cellule h6te transformée par un vecteur

d'expression suivant la revendication 17.

19. Procédé de production d'une protéine de FNTa INH, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'une cellule suivant la revendication 18 et l'isolement de la

protéine de FNTa INH.

20. Protéine recombinante produite par mise en

oeuvre du procédé suivant la revendication 19.

21. Procédé de préparation d'une protéine de FNTa INH, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: (a) concentration de l'urine de patients fiévreux; (b) précipitation au sulfate d'ammonium; (c) chromatographie par échange d'anions; (d) chromatographie par échange de cations; (e) filtration à travers gel; (f) chromatographie d'affinité; et

(g) FPLC à phase inverse.

22. Protéine caractérisée en ce qu'elle est sensiblement identique à la protéine obtenue par mise en

- oeuvre du procédé suivant la revendication 21.

23. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un inhibiteur de FNTa suivant. l'une

3.0 quelconque des revendications 1 à 14 et 22, ou un dérivé

pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, ainsi qu'un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable approprié. 24. Protéine suivant l'une quelconque des

revendications 1 à 14 et 22 pour l'utilisation dans le

domaine thérapeutique.

25. Composition pharmaceutique à utiliser pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'états associés avec une production excessive ou non régulée de FNTa, caractérisée en ce que cette composition comprend un inhibiteur de FNTh tel que

défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 14

et 15, ou un dérivé pharmaceutiquement acceptable de celui-ci.