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protéines qui inhibent l'activité due au facteur de necrose tumorale La présente invention concerne une nouvelle protéine possédant un effet inhibiteur contre l'activité due au facteur de nécrose tumorale a, ä l'isolement et ä la purification d'une protéine de ce genre au départ de sources naturelles, à sa préparation par manipulation d'ADN et ä l'emploi d'une protéine de ce type pour le traitement d'états associés à une production excessive ou non réglée de FNTa.
Le facteur de nécrose tumorale (FNT) est une activité déployée par une famille d'au moins deux protéines, a et ss, qui sont cyctotoxiques pour les cellules tumorales et qui inhibent leur croissance en culture . Carswell et coll."An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumours", Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 72, p3666 (197517.
Le facteur de necrose tumorale α(FNTα), également appelé "cachectine", est principalement produit par des cellules de la lignée monocyte/macrophage en réponse ä des signaux de "stress" qui accompagnent des stimuli invasifs, comme des bactéries, des virus, des tumeurs et d'autres toxines.
Le FNTss, couramment appel6"lymphotoxine", est principalement produit par des-cellules lympholdes. Le
FNTss possède de nombreuses activités similaires ä celles du FNTa, mais semble etre moins puissant, bien que ceci pourrait résulter de difficultés rencontrées au cours de la préparation du FNTss pur.
Le FNTa intervient dans des et participe ä un large éventail d'activités biologiques ce. Beutler et coll., "Identité du facteur de nécrose tumorale et du facteur, cachectine, sécrété par des macrophages", Nature, 316, p552 (1985) J, partageant plusieurs d'entre elles avec l'interleukine-l (IL-1) #J. Le et coll ;,"Tumour necro-
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sis factor and interleukin 1 :
cytokines avec de multiples activités biologiques chevauchantes", Laboratory Invest., 56, p234 l198 ?)/. Des taux élevés en FNTa induits, par exemple, par des cellules tumorales peuvent entraîner une perte de poids et une cachexie et on a également constat6 que le FNTa intervenait également comme entremetteur principal, dans le choc endotoxique (choc septique) qui peut etre fatal.
D'autres effets biologiques du FNTa englobent l'hypotension, la fievre (induite par la stimulation de la synthèse de prostaglandine E2 hypothalamique (PGE2)), la coagulopathie (provoquée par la stimulation des cellules endotheliales vasculaires qui libèrent, par exemple le facteur tissulaire) et la destruction de tissus (induite, par exemple, par la stimulation d'une serie de protéinases, y compris la collagenase engendree par des cellules synoviales et des fibroblastes dermiques) Z'C. Dinarello et coll., "Le facteur de nécrose tumorale (cachectine) est
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un pyrogène endogène et induit la production d'interleukine-l", J. Exp. Med., 163, p1433 (1986) ; J.
Dayer et coll., "La cachectine/le facteur de necrose tumorale stimule la production de collagenase et de la prostaglandine E2 par les cellules synoviales et les fibroblastes dermiques humains", J. Exp. Med., 162, p2163 (198511.
Par conséquent, il existe un besoin de développement d'un inhibiteur de cachectine/FNTa qui prévient le choc endotoxique, la cachexie et les autres effets délètères décrits plus haut. On a montra que l'immunisation passive d'animaux contre la cachectine pouvait empêcher la mort induite ä l'endotoxine, due à l'Intervention d'anticorps du FNTa ±B. Beutler et coll., Nature, 316, supra7.
La demanderesse a identifié à présent une nouvelle proteine qui possède un puissant effet inhibiteur contre les activités dues ä l'entremise du FNTα sans inhibition
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concomittante notable de l'activité due ä l'IL-l. Cette proteine sera identifiée dans la suite du présent memoir sous l'appellation d'inhibiteur du facteur de nécrose tumorale α(FNTα INH).
Par consequent, conformement ä l'une de ses caractéristiques, la presente invention a pour objet une proteine qui inhibe sélectivement l'activit6 due au facteur de nécrose tumorale a. Comme on l'utilise dans le présent mémoire. l'expression "inhibition sélective", telle que présentée par l'inhibiteur conforme ä la presente invention, s'identifie ä l'aptitude ä bloquer l'activité due au FNT, en l'absence d'aptitude ä bloquer d'autres protéines qui ont en commun avec le FNT, certaines, mais pas toutes les activités biologiques du FNT, comme l'IL-1.
De preference, l'inhibiteur du facteur de necrose tumorale a conforme ä la présente invention se présente sous une forme sensiblement homogene, essentiellement exempte de substances contaminantes majeures et/ou essentiellement exempte de toute autre matière
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protéinique ou proteique.
On a constaté que l'inhibiteur du facteur de nécrose tumorale a conforme ä la présente invention possédait une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : (a) poids moleculaire variant de 40 a 60 kDa, comme déterminé par chromatographie sur tamis moléculaires,
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(b) point isoelectrique (pl) variant de 5, 5 6, 1, comme determine par chromatofocalisation, (c) inhibition du titre en FNT standard de cytotoxicite differentielle pour des cellules murines L929, traitées ä l'actinomycine D, comme décrit par G.
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Nedwin et coll."Effets de l'interleukine-2, de interferon-y et de mitogenes sur la production de
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facteurs de nécrose tumorale a et ss", J.
Immunol., 135, p2492 (1985), on peut surmonter cette inhibition par une addition complementaire de FNTa, indiquant que l'inhibition est competitive. L'inhibiteur est également un inhibiteur de l'activité du FNTss, bien que l'inhibition du FNTa au cours de ce titrage soit plus efficiente que celle du FNTss, (d) inhibition de la libération de PGE2 induite au FNT ä partir de cellules synoviales et de fibroblastes humains, (e) l'inhibiteur provoque une interférence avec la liaison du FNTa aux cellules U937 (une 1ignée tumorale monocytique", comme on peut le mettre en évidence par
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125 l'inhibition de la liaison du FNTa radiomarque (125 1- FNTa) ; (f) la dissociation d'un complexe de cellules U937 :
FNTα préformé est favorisée par l'inhibiteur d'une façon qui dépend de la temperature, (g) l'inhibiteur ne provoque pas de dégradation du FNT par scission protéolytique, (h) l'inhibiteur n'inhibe pas l'activité de liaison du récepteur IL-1, par exemple la liaison de l'IL-1
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125 radiomarqué (125 I-IL-la) à la sub-lignee de thymome murin EL-4-6. 1.
La demanderesse a découvert que la protéine conforme ä l'invention, lorsqu'on la purifiait davantage, possédait un poids moléculaire d'environ 33000 daltons, comme determine par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium (SDS PAGE).
Par consequent, selon une autre de ses caractéristiques, l'invention a également pour objet une proteine qui inhibe sélectivement l'activité due au FNTa, qui possède une ou plusieurs des caractéristiques suivantes :
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(a) un poids moléculaire d'environ 33 kDa, comme déterminé par SDS PAGE, (b) un point isoélectrique (pI) qui varie de 5, 5 ä 6,1, comme déterminé par chromatofocalisation, (c) une inhibition du titre en FNT standard de cytotoxicité différentielle pour des cellules murines EL929, traitées par de l'actinomycine D, comme decrit par G. Nedwin et coll ; "Effets de l'interleukine-2, de l'interferon-Y et de mitogènes sur la production de facteurs de nécrose tumorale a et ss", J. Immunol., 135, p2492 (1985).
Cette inhibition peut être surmontée par une addition complémentaire de FNTA, indiquant que l'inhibition est competitive. L'inhibiteur est egalement un inhibiteur de l'activité due au FNTss, bien que l'inhibition du FNTa au cours de ce titrage soit plus efficace que celle du FNTss, (d) une inhibition de la libération de PGE2 induite au FNT ä partir de cellules synoviales et de fibroblastes humains, (e) l'inhibiteur vient interférer avec la liaison du FNTa a des cellules U937 (une lignée tumorale monocytique), comme on a pu le mettre en évidence par l'inhibition de la liaison du FNTa radiomarqu6 (125 1FNTa), (f) la dissolution d'un complexe de cellules U937 :
FNTa préformé est favorisée par l'inhibiteur, d'une manière qui depend de la température, (g) l'inhibiteur n'altère ni ne degrade le FNT par scission protéolytique, (h) l'inhibiteur n'inhibe pas l'activité de liaison du récepteur IL-1, par exemple la liaison d'IL-1 radiomarqué (125 I-IL-1α) à la sub-lignée de tymome murin EL4-6, 1.
De préférence, le TNFa INH selon la presente invention possede les deux caractéristiques (a) et (b)
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et une ou plusieurs des caractéristiques (c) à (h).
De façon plus particuliere, le FNTa INH conforme ä la presente invention, possède toutes les caractéristiques (a) à (h).
La protéine conforme à l'invention possède une séquence d'aminoacides A terminaison amino, comme suit :
Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-
Pro-Gln-Cys-Asn-Ser-Ile
On suppose egalement que les trois aminoacides qui suivent fournissent un site de glycosylation et que la sequence se poursuit ainsi : Asn-Ser-Thr-Lys.
11 faut comprendre qu'un inhibiteur de FNTα conforme à la présente invention comprendra également une sequence d'aminoacides correspondant sensiblement a la séquence du FNTa INH, naturel et contenant une séquence ä amino terminaison sensiblement indentique ä celle decrite plus haut.
La sequence de l'inhibiteur de FNTa conforme à la presente invention sera, par conséquent, identique à la séquence du FNTa INH naturel, ou contiendra une ou plusieurs omissions, substitutions, insertions, inversions ou additions d'origine allélique, ou, d'une autre manière, la sequence resultante comportera au moins 80% et, de preference, 90%, d'homologie avec la séquence du FNTa INH naturel et conservera essentiellement les mêmes propriétés biologiques que celles de la protéine en question.
On a démontré que l'inhibiteur de FNTa conforme ä la presente invention était de nature protéique, en ce sens qu'il était inactive par chauffage d'une maniere dépendant du temps et de la temperature et qu'il était détruit par traitement par de la trypsine ou de la pronase.
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On a également montré que le FNTa INH conforme à la présente invention était une glycoprotéine, étant donné
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que le traitement par l'enzyme qu'est l'endoglycosidase F réduisait le poids moleculaire de 7 ä 8 kDa.
Selon encore une autre de ses caractéristiques, la presente invention a par conséquent pour objet un inhibiteur de FNTa tel que défini dans le présent mémoire, mais qui se trouve dans un état sensiblement ag1ycosylé.
Les inhibiteurs conformes ä la présente invention présentent un intérêt pour le traitement d'états dans lesquels il est souhaitable d'inhiber l'activité du FNTa, par exemple, ceux qui surviennent à la suite des effets du FNTa, comme une perte de poids, un choc, une cÅachexie et une inflammation locale chronique, la polyarthrite chronique evolutive, la coagulation intravasculaire disséminée et- 1a néphrite.
Selon encore une de ses caractéristiques, la presente invention a également pour objet un inhibiteur de FNTa, tel que défini dans le présent mémoire, ou un dérivé pharmaceutiquement acceptable de cet inhibiteur, en vue de l'utiliser à titre d'agent thérapeutiquement actif, plus particulièrement, pour le traitement d'états associés ä une production excessive ou non régulée de FNTa.
Selon encore une de ses caractéristiques, l'invention a aussi pour objet un procédé de traitement d'états associés à une production excessive ou non régulée de FNTa chez un mammifere, y compris l'homme, caractérisé en ce que l'on administre ä ce mammifère. une quantité efficace d'un inhibiteur de FNTa tel que defini dans le present memoire, ou un derive pharmaceutiquement acceptable de cet inhibiteur.
Selon encore une de ses caractéristiques, l'invention a également pour objet l'emploi de
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l'inhibiteur de FNTa tel que défini dans le präsent mémoire ou d'un dérivé pharmaceutiquement acceptable de cet inhibiteur, pour la fabrication d'un medicament destina au traitement d'états associés à une production excessive ou non régulée de FNTa.
Les spécialistes de la technique comprendront que la référence que l'on fait dans le présent mémoire au
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traitement s'etend aussi bien à la prophylaxie qu'au traitement de symptomes ou d'états établis.
11 faut encore apprécier que la quantité d'inhibiteur de FNTa conforme ä la présente invention, qu'il est nécessaire d'utiliser pour le traitement variera, non seulement avec le mode d'administration, mais également avec la nature de l'état ä traiter et avec l'agie et la condition du patient et que cette quantité ressort finalement de la décision du vétérinaire ou du médecin traitant. Cependant, en general, une dose appropriée variera habituellement d'environ 5, 0 ä 500 tig par kilogramme de poids corporel et par jour, par exemple, de 30 ä 300 pg/kg/jour, de préférence de 50 z 150 g/kg/jour.
La dose souhaitée peut commodément etre présentée sous forme de dose unique, ou sous forme de doses subdivisees, que l'on administre ä des intervalles. appropries, par exemple, sous forme de deux, trois, quatre et plus de quatre doses subdivisées, par jour.
Bien qu'il puisse etre possible que, pour l'usage dans le domaine thérapeutique, on administre un inhibiteur de FNTa conforme ä l'invention sous forme de la protéine brute, il est préférable de presenter la protéine active sous forme de composition pharmaceutique. Par conséquent, la presente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur de FNTα, tel que défini dans le présent mémoire, ou un dérivé pharmaceutiquement acceptable de cet inhibiteur,
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en même temps qu'un ou plusieurs vehicules ou excipients pharmaceutiquement acceptables et, facultativement, d'autres ingrédients therapeutiques et/ou prophylactiques.
Le ou les véhicules ou excipients doivent être "acceptables" dans le sens d'être compatibles avec les ingredients de la composition et d'une parfaite innocuité pour le malade ou le patient.
On peut par conséquent présenter les inhibiteurs conformes ä la presente invention en vue de leur administration par la voie parenterale (par injection, par exemple perfusion continue ou injection de bols) et on peut également les presenter sous la forme de doses unitaires dans des ampoules, des seringues remplies au préalable, des perfusions de petit volume, ou dans des recipients qui en contiennent des doses multiples avec conservateur additionnel. Les compositions peuvent adopter des formes comme des suspensions ou des solutions dans des véhicules aqueux et peuvent contenir des agents de mise en composition, comme des agents de mise en suspension, de stabilisation et/de dispersion.
En alternative, l'ingredient actif peut aussi se presenter sous la forme d'une poudre que l'on obtient par isolement aseptique du solide sterile ou par lyophilisation ä partir d'une solution, en vue de la reconstitution d'une composition utilisable a l'aide d'un véhicule convenable, par exemple de l'eau apyrogène, sterile, avant l'emploi du médicament.
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On peut également employer l'inhibiteur de FNTa conforme ä 1a présente invention en combinaison avec d'autres agents therapeutiques, par exemple d'autres cytokines ou inhibiteurs de FNTa.
L'invention a par consequent aussi pour objet, selon une autre de ses caractéristiques, une combinaison comprenant un inhibiteur de FNTa, tel que défini dans le présent memoire, ou un derive pharmaceutiquement
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acceptable de cet inhibiteur, en même temps qu'un autre agent thérapeutiquement actif, par exemple d'autres cytokines ou inhibiteurs de FNTa.
Les protéines conformes ä la présente invention peuvent se préparer par la purification au depart de sources naturelles et, lorsque cela se révèle être approprie, cette opération peut etre suivie d'une modification chimique, ou bien on peut les préparer par des procédées classiques bien connus des specialistes de la technique qui s'occupent de la préparation de proteines, par exemple en ayant recours ä des techniques ä ADN recombinant.
. Selon une autre encore de ses caractéristiques, la présente invention a aussi pour objet un procédé de production d'un inhibiteur de facteur de necrose tumorale a, conforme à la presente invention, par purification au depart de sources naturelles, plus particulièrement l'urine de patients fiévreux humains.
Une purification de ce genre comprend, par exemple, les étapes de concentration de l'urine brute de patients fievreux humains, la precipitation du FNTa INH brut de l'urine et le fractionnement du FNTa INH d'autres protéines de ce précipité, par une ou plusieurs voies constituees, par exemple, par la chromatographie d'échange ionique sur colonne, la chromatographie a filtration ä travers gel, la chromatographie d'hydrophobicite, la chromatographie d'immuno-absorption et d'affinité sur du FNTa immobilise.
L'inhibiteur de facteur de nécrose tumorale a selon la presente invention s'obtient egalement ä partir de tissu humain contenant des macrophages, par exemple les résidus de lavages pulmonaires et les extraits de foie humain, ä partir desquels on peut l'obtenir par des techniques purification standard, comme celles décrites plus haut.
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Le FNT INH naturel et recombinant, que l'on produit par mise en oeuvre des procédés décrits dans le present mémoire, peuvent etre purifiés par toute une serie d'étapes telles qu'énumérées plus haut. Après chacune des étapes de purification, la presence et la pureté du FNT INH peuvent être déterminées et mesurées par un titrage de la cytotoxicite, en présence d'actinomycine D (acti D) en utilisant une 1ignée de cellules L929 sensibles au FNT, comme decrit par G.
Nedwin et coll., J. Immunol., 135, loc. cit.
Selon une forme de realisation préférée du procédé. le FNTa INH est initialement isolé de l'urine non traitee, recueillie de patients fiévreux humains te 38,5 C), dépourvus d'infections urinaires, en utilisant une technique de concentration standard, par exemple l'ultrafiltration. On peut ensuite précipiter une fraction brute A partir de l'urine brute, en utilisant du sulfate d'ammonium, par exemple par l'addition de sulfate d'ammonium en une concentration de 80% (p/v), ä 4OC, sous agitation. De preference, on peut ajouter le sulfate d'ammonium d'une maniere échelonnée et écarter la matiere précipitée à des concentrations inférieures (par exemple ä 40% (p/v).
On peut éliminer le sulfate d'ammonium par dialyse et on peut purifier la fraction
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resultante pour séparer le FNJINH d'autre proteines dt par toute une serie de procédés chromatographiques.
Ainsi, on peut purifier le concentré de FNTα INH par chromatographie ä échange ionique, qui sépare les protéines selon leurs différences en charge électrique, qui. constitue le reflet des propriétés acide/base des protéines. Des matières convenables pour la chromatographie d'échange d'anions comprennent des dérivés de l'aminoethylcellulose, par exemple l'aminoéthylcellulose quaterniare (QAE-cellulose) ou la diethylaminoethylcellulose (DEAE-cellu10se) qui sont
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très repandues dans le commerce. 11 faut équilibrer la colonne d'behänge d'anions avant d'appliquer le concentré, en se servant d'un tampon convenable, comme le tris-HCl, contenant éventuellement un agent chélateur, tel que l'EDTA.
La matière liée peut être éluée de la colonne en utilisant une solution de sel (par exemple du chlorure de sodium 0, 8M, que l'on complète avec le tampon d'équilibrage).
On rassemble les fractions actives provenant de la chromatographie d'échange d'anions. Les matières appropriées ä la chromatographie d'echange de cations comprennent des dérivés de la cellulose, comme la carboxymethyl (CM) cellulose, ou la sulfopropylsépharose (Pharmacia, Uppsala, Suede). La colonne doit etre équilibrée avec un tampon convenable, comme l'acetate de sodium et la matiere liane peut être éluée avec le tampon d'équilibrage contenant, par exemple, du chlorure de sodium 0, 5M.
On purifie davantage les fractions actives rassemblées par chromatographie d'affinité sur du FNTa humain recombinant lié (rhFNTa), lie à une matrice appropriée, par exemple du mini-leak agarose (Kern En
Tee, Biotechnology Corp., Danemark). La colonne doit être tamponnée en utilisant, par exemple un tampon au phosphate (par exemple phosphate de potassium 0,8M de pH
8, 6). Les groupes actifs non liés au rhFNTa doivent être bloqués en utilisant un tampon ä l'éthano1amine-HC1 de pH 8, 5. La colonne doit être équilibrée avec un tampon approprié, par exemple le tris-HCl, contenant eventuellement du chlorure de sodium et le FNTa INH doit
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être é1ué avec un tampon ä la glycine acide (pH de 3, 5).
Les fractions é1uées doivent être immédiatement équilibrées jusqu'à un pH de 7, 0 par l'addition, par exemple, de Tris base.
Les fractions actives rassemblées sont, de
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preference, lyophilisees avant l'étampe de purification finale de FPLC a phase inverse (FPLC ; chromatographie en phase liquide de protéines rapide). Avant son application ä la colonne de FPLC, la fraction de FNTa INH lyophilisée doit être tamponnée avec un tampon convenable, comme l'acide trifluoracetique (TFA) (Fulka, Buchs, Suisse), l'acide heptafluorobutyrique (HFBA) ou l'acide acetique. L'élution du FNTa INH de la colonne de FPLC peut s'effectuer en recourant à des techniques classiques, par exemple, en complétant avec un tampon approprié, tel que précédemment décrit, contenant éventuellement un alcool, par exemple le N-propanol.
La fraction éludée doit être immédiatement tamponnée avec, par exemple, du bicarbonate d'ammonium et lyophilisée. Le FNTa INH se présente ä present sous une forme sensiblement homogène qui convient à un titrage supplémentaire de l'activite biologique et ä la préparation sous une forme convenant ä l'emploi dans le domaine therapeutique.
Par consequent, selon l'une de ses caractéristiques supplémentaires ou alternatives, la présente invention a aussi pour objet une protéine qui inhibe sélectivement l'activité due au FNTa, qui est sensiblement identique ä celle obtenue dans le procédé decrit plus haut.
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L'aptitude ä purifier le FNTa INH conforme b la presente invention jusqu'à 1'homogénéité a permis le sequencage de la fraction N-terminale de cette molécule de proteine. Cette séquence facilitera le clonage dtun gène codant pour le FNTa INH permettant de cette maniere la production d'importantes quantites de FNTa INH sous forme pure ä partir d'un examen biologique complémentaire et éventuellement pour l'essai et l'utilisationthérapeutique.
On peut séquencer des échantillons du FNTa INH homogene conforme ä la presente invention par mise en
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oeuvre de techniques classiques, par exemple en utilisant un sequenceur automatisé disponible dans le commerce, faisant appel ä une detection en phase gazeuse ou ä la ninhydrine. Les 17 premiers résidus de la partie ä terminaison amino du FNTa INH humain tel que défini dans le présent memoir, comprennent la séquence suivante :
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Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-CysAsn-Ser-Ile (identifiee en utilisant un séquenceur automatisé, modele 477A, de Appled Biosystems).
On suppose également que les trois aminoacides suivants fournissent un site de glycosylation et que la sequence se poursuit ainsi : Asn-Ser-Thr-Lys.
11 faut comprendre qu'un procédé potentiel de fourniture d'importantes quantités de FNTa INH sous forme pure s'effectue par des techniques à l'ADN recombinant, bien connues des specialistes. Cependant, l'utilisation couronnee de succes de techniques de ce genre n'exige non seulement la mesure précise du FNTa INH naturel et recombinant ou de son activite, mais également que le produit tant naturel que recombinant
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seit purifiable jusqu'a l'homogeneite.
Suivant encore une autre de ses caractéristiques, la présente invention a également pour objet un procédé de production d'un inhibiteur du facteur de nécrose tumorale selon l'invention ou d'un derive de celui-ci, par l'expression d'une sequence d'ADN encodant pour un tel inhibiteur dans un hôte transformé de façon convenable. Un tel procédé implique la culture d'un hôte transforme avec des molécules d'ADN recombinant comprenant des sequences d'ADN encodant l'inhibiteur qui a été inseré dans un vecteur convenable.
Des hötes appropries, eucaryotes et procaryotes, peuvent etre, par exemple des souches
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de bactéries, des levures, d'autres champignons et des cellules animales (y compris les cellules d'insectes) et des cellules de plantes dans le tissu. Des cellules hotes particulièrement préférées sont des cellules de levure, des cellules d'E. coli et des cellules animales.
L'expression d'une proteine possédant une activité inhibitrice du facteur de necrose tumorale s'obtient par la culture des cellules hottes transformées dans un milieu de croissance approprie. Normalement, un tel milieu contient une source d'azote, comme le sulfate d'ammonium, une source de carbone et d'energie, comme le glucose ou le glycerol, des oligo-elements et des facteurs essentiels pour la croissances des cellules hôtes particulieres. Les conditions précises de la culture dependent de l'hôte choisi ; ainsi, par exemple, dans le cas de E. coli, On préfère une fermentation aérobie submergée, de preference ä environ 37OC.
En outre, l'expression peut etre provoquée, par exemple, par l'addition d'un inducteur ou par l'emploi de conditions d'induction pour le systeme promoteur utilisé dans le vecteur d'expression.
En fonction de l'hôte, l'inhibiteur de FNTa peut etre produit sous forme de corps d'inclusion granulaires que l'on peut récupérer, apres la lyse des cellules, par centrifugation differentielle ; ces corps peuvent être solubilisés par des procédés classiques et purifies par les methodes décrites dans le present mémoire de purification du FNTa INH urinaire. En alternative, l'inhibiteur de FNTa peut se trouver en solution dans le cytosol, sécrété dans l'espace périplasmique, ou commodément sécrété dans le milieu de culture.
Les cellules hôtes sont transformées par des molecules d'ADN recombinant qui comprennent une sequence d'ADN encodant pour l'inhibiteur de FNTa, qui a subi
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l'insertion dans un vecteur d'expression.
Des vecteurs d'expression de ce genre peuvent etre constitués de segments de séquences d'ADN chromosomiques, non chromosomiques et de synthese, comme divers dérivés connus de SV-40 et de plasmides bactériens connus, par exemple des plasmides "naturels", tels que ColEl, pSC10I ou pRSF2124 et des ADN de phages,
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ou des plasmides"artificiels" (construits in vitro), tels que pBR322, pMB9 ou pAT153. Les ADN de phages comprennent, par exemple les nombreux derives de phage lambda et d'autres phages d'ADN, par exemple M13 et d'autres phages d'ADN ä brin unique filamenteux. Des vecteurs interessants dans des levures comprennent le plasmide 2 et ceux utiles dans des cellules eucaryotes, comme des cellules animales, comprennent ceux contenant le retrovirus et l'adénovirus SV-40.
On peut également caractériser de tels vecteurs d'expression par au moins une séquence de commande de
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l'expression, qui peut être opérativement liee à la sequence d'ADN de l'inhibiteur de FNT, en manière telle qu'elle commande et règle ou régule l'expression de la sequence d'ADN clonee. En exemples de séquence de commande de l'expression intéressantes, on peut citer les systemes lac, trp, tac et trc, des regions majeures,
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opératrices et promotrices, de phage lambda (tel que le promoteur PL sous la commande represseur ts c1857 thermolabile), 1a région de commande de la proteine de revetement fd, les promoteurs glycolytiques de la levure (par exemple le promoteur pour la 3- phosphoglycerate kinase), les promoteurs de la phosphatase acide de levure (par exemple Pho 5),
les promoteurs d'appariement ä la levure a et des promoteurs provenant de polyomes, d'adénovirus, de retrovirus et de virus simiens.
Au surplus, des vecteurs d'expression de ce genre,
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peuvent posséder divers sites pour l'insertion des séquences d'ADN d'inhibiteur de FNTA selon l'invention. Ces sites se caractérisent par l'endonuclease de restriction spécifique qui les clive ou scinde. De tels sites de clivage ou de scission sont bien connus des spécialistes de la technique.
Le vecteur d'expression et, en particulier, le site qui y est choisi pour l'insertion d'un fragment d'ADN choisi et sa liaison operative à une séquence de commande d'expression, se determinent par une Serie de facteurs comprenant le nombre de sites sensibles ä une enzyme de restriction donnée, le calibre de la proteine à exprimer, la contamination ou la liaison de la protéine ä exprimer par des protéines de cellules hôtes, qui peuvent être difficiles à éliminer au cours de la purification, la position de codons départ {arrêt et d'autres facteurs bien connus des spEcialistes de la technique.
Ainsi, le choix d'un vecteur et du site d'insertion pour une sequence d'ADN est déterminé par un équilibre de ces facteurs, toutes les selections n'etant pas d'efficacit egale pour un cas donne.
De meme, toutes les combinaisons hôte/vecteur ne fonctionnent pas avec une efficience egale pour l'expression des sequences d'ADN selon l'invention. On procede au choix en tenant compte d'une variété de facteurs comprenant la compatibilité de l'hotte et du vecteur, la facilité de la récupération de la protéine souhaitee, les caractéristiques d'expression des séquences d'ADN et les séquences de commande de l'expression qui y sont opérativement liees, ou n'importe quelles modifications post-expression necessaires de la protéine souhaitée.
Les séquences d'ADN conformes ä l'invention qui, par expression, codent pour des protéines avec une activité d'inhibiteur de FNTa, peuvent être isolees par
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criblage de diverses reserves d'ADN ou ADNtheques pour de telles sequences d'ADN, en utilisant une serie d'échantillons d'ADN. On peut préparer les échantillons d'ADN ä partir de la protéine naturelle purifiée que l'on utilise Åa titre de source de donnees de sequences d'aminoacides. On peut préparer la proteine naturelle purifiée, par exemple, ä partir d'urine d'etres humains fiévreux, comme décrit plus haut.
On utilise des séquences d'ADN dégénérées, codant pour diverses parties et fragments de la séquence d'aminoacides, par exemple en combinaison avec des échantillons de Lathe, pour modeler les échantillons d'ADN.
Ainsi, diverses ADNtheques sont criblées quant aux séquences d'ADN codant pour les inhibiteurs de FNTa conformes ä la présente invention. Des ADNthèques de ce genre comprennent des banques de gênes chromosomiques et des cADNtheques ou des ADNthe- ques, que l'on prepare Åa partir de 1ignées de cellules ou de tissus, dont on a démontré qu'ils produisaient des inhibiteurs de FNTα, comme des macrophages alveolaires ou le tissu hepatique.
Le criblage peut s'effectuer par expression immune directe, par exemple dans Àgtll ou des systemes similaires, ou bien, le cas oü l'on identifie une cellule produisant du FNTα INH, par l'identification du mARN spécifique du FNTA INH par l'expression directe dans des oocytes de Xenopus.
On peut avoir recours à toute une serie de techniques de clonage et de sélection classiques pour localiser et identifier des séquences d'ADN qui encodent, par expression dans un hôte procaryote ou eucaryote approprie, les inhibiteurs de FNT selon l'invention. Ces séquences d'ADN choisies ou sélectionnées peuvent, elles memes, être utilisées comme échantillons pour choisir d'autres sequences d'ADN codant pour les inhibiteurs de FNTa, ou bien on peut les
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utiliser dans des molecules d'ADN recombinant convenables pour transformer des h8tes eucaryotes ou procaryotes appropries en vue de la production du FNTa INH qu'elles encodent.
La portée de la présente invention s'étend également aux séquences d'ADN ä brin unique et ä double brin encodant pour des FNTa INH, des vecteurs contenant des séquences de ce genre, appropriées ä la transformation d'un organisme höte et de cellules hôtes transformées par de telles sequences d'ADN.
Selon encore une autre de ses caractéristiques, l'invention a également pour objet une protéine avec une activite inhibitrice ou d'inhibiteur de FNTa sélective, produite par l'expression d'un hôte transformé avec une sequence d'ADN encodant pour une telle protéine inhibitrice de FNTa. Les inhibiteurs de FNT selon l'invention que l'on prépare par l'expression d'une séquence d'ADN encodant de tels inhibiteurs dans un hole transformé seront par consequent identiques à la séquence de FNTa INH naturel ou contiendront une ou plusieurs omissions, substitutions, insertions, inversions ou additions d'origine allylique ou autre, la sequence ainsi obtenue aura au moins 80% et, de préférence 90%, d'homologie avec la séquence du FNTa INH naturel et conservera essentiellement les mêmes propriétés biologiques.
De manière plus particuliere, un inhibiteur de FNTa selon l'invention peut comprendre une méthionine à N-terminal. De même, par exemple, la séquence d'ADN selon l'invention codant pour le FNTa INH peut etre fusionnee dans-un vecteur d'expression ä une partie d'une séquence d'ADN codant pour un polypeptide eucaryote ou procaryote, afin de faciliter l'expression de la sequence d'ADN encodant le FNTa INH, ou d'aider a la secretion, la maturation, la purification du FNTa INH a partir de l'hÏte ; 1e
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polypeptide fusionné peut être enlevé inter-ou extracellulairement par des techniques connues, ou bien le FNTa INH peut être utilise en meme temps que le polypeptide fusionné.
Les FNTa INH produits par la culture d'hotes eucaryotes ou procaryotes, transformes par des séquences d'ADN encodant le FNTa INH, peuvent ensuite etre employés, après purification, dans les compositions pharmaceutiques conformes à l'invention.
11 faut comprendre que lorsqu'il est produit par des cellules animales, le FNTa INH selon l'invention sera une glycoprotéine. Cependant, des systemes d'expression procaryotes produiront la protéine ä l'etat aglycosyle. En outre, la proteine glycosylee peut etre sensiblement déglycosylée par des techniques bien connues des spécialistes, par exemple, par l'addition d'enzymes du type endoglycosidase.
Les exemples non limitatifs qui suivent illustrent la présente invention. Toutes les temperatures sont indiquees en OC et toutes les concentrations en pourcentage sont en p/v.
Titrage de l'inhibition du FNTa
Le pourcentage d'activité du FNTa INH dans les fractions decries dans les exemples a été déterminé en présumant que les valeurs de la densité optique (DO) de cellules murines L929, stimulées ä l'actinomycine D (acti S), correspondait ä une inhibition de 100%, tandis que la DO de cellules cultivees avec de l'actinomycine D et du FNTa correspondait ä une mortalité cellulaire maximale de 0% d'inhibition de FNTa. Le FNTa utilisé pour le titrage était du FNTa humain recombinant (rhFNTa) produit dans E. coli comme décrit par A.
Marmenout et col1., "Clonage moléculaire et expression du facteur de necrose tumorale humain et comparaison de
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celui-ci au facteur de nécrose tumorale de la souris", Eur. J. Biochem., 152, p515 (1985). Ainsi, le pourcentage de l'inhibition du FNT (I au cours du titrage de la cytotoxicité fut calculé conformément ä la formule (I) :
Pourcentage de l'activiste de FNTa INH =
EMI21.2
(DO avec acti D + rhFNTa + FNTa INH) - (DO avec acti D + rhFNTa) 100 x (I) (DO avec acti D)- (DO avec acti D + rhFNTa) L
EMI21.3
Exemple l Purification du FNTa INH urinaire a) Concentration des protéines provenant de l'urine humaine
On a rassemblé les urines humaines (15 litres) fralchement obtenues d'un pool de cinq patients avant de procéder à un quelconque traitement. Deux des patients souffraient d'un carcinome à petites cellules, un autre d'histiocytose maligne, un autre encore de polymyosite et le dernier d'un etat septique. Tous les patients etaient extremement fievreux et étaient dépourvus d'infections urinaires.
On a concentré l'urine à 40 sur un appareil d'ultrafiltration à fibers creuses Amicon, avec une coupe d'un calibre moleculaire d'environ 5 kDa. b) Preparation des protéines à partir de l'urine humaine
On a saturé l'urine rassemblée, concentrée, de sulfate d'ammonium solide en ajoutant lentement le sulfate, sous agitation constante et ä 4 , jusqu'à ce que la concentration en sulfate d'ammonium eût atteint 40%.
On a enlevé le précipité par centrifugation, on l'a écarté et on a ajusté la couche surnageante jusqu'à une
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saturation de 80% par l'addition de sulfate d'ammonium complémentaire. on a obtenu une pastille par centrifugation que l'on a remise en suspension dans 150 ml de phosphate de sodium 20 mM (pH de 7, 2) et de chlorure de sodium 150 mM.
On a éliminé le sulfate d'ammonium par dialyse ä 4 C en se servant de tris-HCl 10 mM (pH de 7, 4) de l'EDTA 2 mM et de benzamidine-HCl 5
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mM. c) Identification de l'activité FNTa INH
On a testé la fraction semi-purifiee de l'exemple l (b) dans un titrage de cytotoxicité avec une lignee de cellules L929 sensibles au FNT, en présence d'actinomycine D. A une dilution de 1 : 20 de la fraction semi-purifiée, on a observé une inhibition totale de l'effet cytotoxique induit par le rhFNTa, si bien que la valeur DO570nm était identique ä celle mesurée en presence d'actinomycine D seule (DO)570nm = 1,5).
En outre, on a observé l'activité inhibitrice, en dilutions de la fraction allant jusqu'à 1 : 160 sur des cellules (DO570nm = 0,83), cependant que la veleur témoin de rhFNTa, ä une concentration finale de 0, 2 ng/ml, mesurée en presence d'actinomycine D, était inferieure (DO570nm = 0,73), si bien que l'on a observe 50% de l'Inhibition a une dilution d'approximativement 1:
100(DO70nm = 1, 10). Le FNTa INH n'eut pas d'effet sur la viabilité des cellules lorsqu'on le testa sans actinomycine D.
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d) Comparaison de 1'effet de FNTA INH sur la cytotoxicité induite par le FNTa et le FNTss On a effectué un titrage de cytotoxicité en utilisant la lignée de cellules L929 sensibles au FNT, en presence d'actinomycine D, en utilisant une gamme de concentrations en FNTa ou FNTss pour induire l'effet
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cytotoxique. On a testé la fraction semai-purifiée de l'exemple l (b) ä des dilutions de 1 : 20, 1 : 50 et 1 : 80. On a réalisé des tests témoins en l'absence de FNTa ou FNTss cytokine et en l'absence d'inhibiteur.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 qui suit et demontrent que l'inhibiteur conforme ä l'invention n'exerce pas d'effet inhibiteur sur la cytotoxicité due au FNTss, variant depuis approximativement 50% en descendant jusqu'a 2% de l'inhibition de FNTa avec l'elevation de la concentration en FNTss.
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<tb>
<tb>
Tableau <SEP> 1
<tb> Concentration <SEP> fi- <SEP> Forme <SEP> de <SEP> Dilution <SEP> finale <SEP> de <SEP> la <SEP> fraction
<tb> nale <SEP> du <SEP> FNT <SEP> (α <SEP> ou <SEP> cytokine <SEP> inhibitrice <SEP> sur <SEP> Sephacryl <SEP> S-200
<tb> ss) <SEP> (pg/ml) <SEP> ajouté <SEP> ajoutée <SEP> sur <SEP> des <SEP> cellules <SEP> L929 <SEP> (DO570nm)
<tb> à <SEP> des <SEP> cellules <SEP> L929 <SEP> aux <SEP> celtraitées <SEP> à <SEP> l'acti- <SEP> lules <SEP> Néant <SEP> 1/20 <SEP> 1/50 <SEP> 1/80
<tb> nomycine-D
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> > 1. <SEP> 90 <SEP> > 1. <SEP> 90 <SEP> > 1. <SEP> 90 <SEP> > 1. <SEP> 90
<tb> 10 <SEP> a <SEP> ND <SEP> ND <SEP> ND <SEP> ND
<tb> ss <SEP> 1. <SEP> 16 <SEP> 1. <SEP> 66 <SEP> 1. <SEP> 46 <SEP> 1. <SEP> 39
<tb> 20 <SEP> a <SEP> 1. <SEP> 30 <SEP> > 1. <SEP> 90 <SEP> 1. <SEP> 72 <SEP> 1. <SEP> 68
<tb> ss <SEP> 1. <SEP> 02 <SEP> 1.
<SEP> 51 <SEP> 1. <SEP> 21 <SEP> 1. <SEP> 22
<tb> 50 <SEP> a <SEP> 1.02 <SEP> > <SEP> 1.90 <SEP> 1.72 <SEP> 1.68
<tb> ss <SEP> 0.65 <SEP> 1.03 <SEP> 0.84 <SEP> 0.68
<tb> 100 <SEP> 0. <SEP> 73 <SEP> 1. <SEP> 78 <SEP> 1. <SEP> 69 <SEP> 1. <SEP> 51
<tb> ss <SEP> 0. <SEP> 37 <SEP> 0. <SEP> 71 <SEP> 0. <SEP> 59 <SEP> 0. <SEP> 52
<tb> 250 <SEP> a <SEP> 0. <SEP> 38 <SEP> 1. <SEP> 70 <SEP> 1. <SEP> 70 <SEP> 1. <SEP> 33
<tb> ss <SEP> 0. <SEP> 24 <SEP> 0. <SEP> 44 <SEP> 0. <SEP> 31 <SEP> 0. <SEP> 24
<tb> 500 <SEP> a <SEP> 0. <SEP> 30 <SEP> 1. <SEP> 52 <SEP> 1. <SEP> 49 <SEP> 1. <SEP> 11
<tb> ss <SEP> 0. <SEP> 17 <SEP> 0. <SEP> 30 <SEP> 0. <SEP> 26 <SEP> 0. <SEP> 18
<tb> 1 <SEP> 250 <SEP> α0.19 <SEP> 1.09 <SEP> 1.10 <SEP> 0.76
<tb> ss <SEP> 0. <SEP> 11 <SEP> 0. <SEP> 13 <SEP> 0. <SEP> 19 <SEP> 0. <SEP> 13
<tb> 2 <SEP> 500 <SEP> a <SEP> :
<SEP> 0. <SEP> 06 <SEP> 1. <SEP> 03 <SEP> 0. <SEP> 80 <SEP> 0. <SEP> 47
<tb> ss <SEP> ND <SEP> ND <SEP> ND <SEP> ND
<tb>
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Exemple 2 Filtration sur gel de FNTα INH urinaire
On a purifi6 le FNT INH semi-purifie de l'exemple l (b) par Chromatographie ä filtration ä travers gel à 40 sur une colonne de Sephacryl S200 (0, 9 x 60 cm) (Pharmacia, Uppsala, Suede) équilibrée dans un tampon tris-HCl 50 mM (pH de 7, 4) contenant du chlorure de sodium 100 mM. On a appliqué un échantillon de la
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fraction proteinique (20 mg, 0, 8 ml) ä la colonne et on l'a élué avec le même tampon, a un debit de 5,4 ml/h. On a rassemble les fractions (1, 35 ml) et on les a testees quant ä leur activité de FNTa INH.
L'activité de FNTA
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INH s'elua ä partir du gel sous forme d'un pic ou pointe unique. Le produit ä activité de FNTA INH s'elua du gel sous forme d'un pic ou pointe unique. Le produit à activité inhibitrice manifesta un poids moleculaire apparent de 40 à 60 kDa (voir figure 1).
Exemple 3 Chromatofocalisation du FNTα INH urinaire
On a chromatofocalisd le FNa INH semi-purifié de l'exemple leb), à 40, sur une colonne prégarnie de monoP (HR 5/20,5 x 200 mm) (Pharmacia, Uppsala, Suède) équilibrée dans un tampon bis-tris 25 mM, ajusté ä un pH de 7, 1 à l'aide d'acide imidodiacétique (Fluka, Buchs, Suisse).
On a appliqué un échantillon de la fraction protéinique de l'exemple l (b) (30 mg) ä une colonne et on l'a élué avec un polytampon 74/acide iminodiacetique ä un pH de 4, 0. On a test & des fractions de colonne (1 ml) ä une dilution de 1 : 10 quant à leur effet au cours du titrage de cytotoxicit6 induit au rhFNTa (0, 2 ng/ml), en présence d'actinomycine D (1 g/ml). On a déterminé le pH reel de chaque fraction de colonne ä l'aide d'un pHmètre, la majeure partie de l'activit6 de FNTα INH se trouvant dans les fractions éluées entre un pH de 5,5 et
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de 6, 1 (voir figure 2). Ceci est équivalent au pI de la proteine de FNTa INH.
Exemple 4 Chromatographie par échange d'ions du FNTα INH urinaire
On a purifié le FNTa INH semi-purifié de l'exemple l (b) par une chromatographie d'échange d'anions, à 40, sur une colonne de Sephadex, DEAE (2, 6 x 20 cm) (Pharmacia, Uppsala, Suède), équilibrée dans un tampon tris-HCl 10. mM de pH 8, 0, contenant 2 mM d'EDTA. On a
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é1ué la matière 1iée de la colonne avec le tampon d'équi1ibrage eontenant du chlorure de sodium 0, 8 mM. On a recueilli les fractions (8, 0 ml), on les a testées quant ä leur activite de FNTa INH et on a rassemble les
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fractions inhibitrices (160 ml) et on les a dialysées vis-ä-vis d'un tampon ä l'acetate de sodium 10 mM de pH 5, 0 (4 x 2 litres).
On a davantage purifié le FNTa INH par une chromatographie d'échange de cations, à 4 , sur une colonne de sulfopropyl-sephadex (0, 8 x 15 cm) (Pharmacia, Uppsala, Suède) équilibrée dans un tampon ä l'acétate de sodium 10 mM de pH 5, 0. On a elue la matiere liée de la colonne avec le tampon d'equilibrage contenant du chlorure de sodium 0, 5 M. On a recueilli des fractions (7, 5 ml), on en a teste l'activité de FNTa INH et on a rassemblé les fractions inhibitrices et on
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les a concentrées 20 fois sur un appareil d'ultrafiltration Amicon avec une coupe d'un calibre moleculaire d'environ 10 kDa.
Exemple 5 Filtration à travers gel du FNTa INH urinaire
On a purifié le concentra de FNTa INH de l'exemple 4 par chromatographie ä filtration A travers gel à 40 sur une colonne de Sephacryl S-200 (2, 6 x 100 cm)
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(Pharmacia, Uppsala, Suède), équilibrée avec un tampon tris-HCl 50 mM de pH 7, 4 contenant du chlorure de sodium 10 mM. On a appliqué un échantillon de la fraction proteinique de l'exemple 4 (2000 mg) à la colonne et on l'a élué avec le tampon d'equilibrage a un debit de 27 ml/heure. On a recueilli des fractions (9, 0 ml), on en a test l'activite de FNTa INH et on a rassemble les fractions inhibitrices.
On a calibré la colonne avec du bleu de dextrane (BD), 2000 kDa, de l'albumine de sérum bovin (ASB), 67 kDa, de l'ovalbumine (OA), 43 kDa, de l'α-cymotrypsinogène-A (αCT), 25 kDa et de la ribonucléase A (RNase), 13, 5 kDa, comme la figure 4 le montre.
Exemple 6 Chromatographie d'affinité du FNTa INH urinaire
On a prepare la colonne d'affinité de FNTα en
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couplant du FNTa humain recombinant (1, 0 mg) à de la gélose Mini Leak (Kern En Tee, Biotechnology Corp., Danemark) dans un tampon au phosphate de potassium 0, 8 M de pH 8,6. On a bloqué les radicaux actifs résiduels par incubation dans un tampon d'ethanolamine-HCl 0, 1 M d'un pH de 8,5.
On a lavé le gel avec un tampon au tris-HCl 50 mM d'un pH de 7,4, contenant du chlorure de sodium 100 mM (3 x 50 ml). On a appliqué un échantillon des fractions de FNTa INH de l'exemple 5 (15 ml) a la colonne et on a procédé ä l'elution avec un tampon à la glycine-HCl 0, 2 M de pH 3, 5. On a rassemblé les fractions (1, 0 ml), on les immediatement ajustées à un pH de 7, 0 par l'addition de tris 1M (5 ä 40 l) et on les a testées quant à leur activite de FNTα INH.
Exemple 7 Chromatographie FPLC à phase inverse du FNTα INH urinaire
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On a lyophilisé les fractions de FNTIa INH de l'exemple 6, on les a dissoutes dans de l'acide trifluoracétique à 0,1% (2,0 ml) et on les a chargées sur une colonne de FPLC à phase inverse ProRPC (5 x 20 cm) (Pharmacia, Uppsala, Suede), équilibrée dans de
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l'acide trifluoracetique ä 0, 1%. On a éluE la matiere liée avec un gradient d'acetonitril de 0 ä 100% dans de l'acide trifluoracétique à 0,1%, au debit de 0, 3 ml/minute. On a ajouta du bicarbonate d'ammonium 0, 5M (10 pl) à chaque fraction (0, 75 ml) et on a lyophilise la matière éluée.
La chromatographie FPLC à phase inverse révéla un pic majeur correspondant à l['activité de FNT INH. On a dissous les fractions lyophilises contenant cette activité dans un tampon au tris-HCl 10 mM de pH 7,4, contenant de l'EDTA 2 mM et on les a analysées par électrophorèse sur gel de polyamide- dodecylsulfat de sodium (SDS PAGE) en se servant du procédé décrit par U. Laemmli et coll., Nature, 227, p680 (1970). On a constaté que le FNTa INH s'fluait avec un poids moléculaire de 33 kDa (voir figure 4).
Les échantillons obtenus dans des conditions non réductrices furent testés quant a leur activité de FNTa INH à une dilution de 1 : 10 sur des cellules L929, en presence de
0, 15 mg/ml de rhFNTa. L'activité dirigée contre rhFNTa migra avec le poids moleculaire apparent identique à la bande 33 kDa sur l'essai sur gel dans des conditions reductrices.
Exemple 8 Séquençage proteinique du FNTa INH urinaire
On a concentre la fraction de FNTa INH, isolee ä partir de la chromatographie de FPLC à phase inverse, sous vide et on l'a portee sous forme de taches sur un filtre sequenceur conditionne. On a analys6 la proteine par un séquenceur de proteinen Applied Byosystems Modele
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477A. On a évaporé les fractions des cycles séquenceurs jusqu'à siccité et on les a remises en suspension dans de l'acetate de N, N-diisopropyléthylamine et de l'acétonitrile, préalablement à l'injection dans une colonne de chromatographie en phase liquide à pression élevée ou haute performance, en vue de l'identification du residu.
On a identifié les premiers 17 restes d'aminoacides du N-terminal et ceux-ci répondaient ä la séquence : Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Cys- Asn-Ser-11e. On suppose également que les trois aminoacides suivants fournissent un site de glycosylation et que la séquence se poursuit ainsi : Asn-Ser-Thr-Lys. Cette séquence niest pas notablement homogène vis-ä-vis de n'importe quelle séquence pro- téinique contenue dans une base de donnees de sequences protéiniques NBRF (nouvembre 1988).
Exemple 9 Démonstration que le FNTα INH est une Démonstration que le FNTα INH est une protéine a) Dependance de la duree et de la temperature
On a chauffe le FNTA INH purifie sur Sephacryl S- 200 de l'exemple 2, obtenu en rassemblant les tubes des fractions actives, ä 56 , 75 et 95 . On a mesure 1'activité de FNTα INH apres 10,20 et 60 minutes et, par comparaison ä des échantillons non traités, on a calculé le pourcentage d'activité de FNTα INH suivant la formule (I). Les résultants présentés dans le tableau 2 qui suit démontrent que l'activité du FNTa INH diminue d'une manière qui dépend du temps et de la temperature.
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<tb>
<tb>
Inactivation <SEP> ä <SEP> la <SEP> chaleur
<tb> Pourcentage <SEP> d'activité <SEP> de
<tb> Température <SEP> ("C) <SEP> Temps <SEP> (min) <SEP> FNT* <SEP> INH
<tb> 10 <SEP> 100
<tb> 56 <SEP> 20 <SEP> 100
<tb> 60 <SEP> 93
<tb> 10 <SEP> 60
<tb> 75 <SEP> 20 <SEP> 26
<tb> 60 <SEP> 15
<tb> 10 <SEP> 27
<tb> 95 <SEP> 20 <SEP> 10
<tb> 60 <SEP> 13
<tb>
b) Sensibilité ä la digestion par 1a trypsine
On a ajouté de la trypsine (500 pg) (Sigma, St.
Louis, MO, E. U. A.) dans un tampon tris 0, 2M (pH de 8, 0) contenant du chlorure de calcium ImM aux fractions réunies de FNTa INH urinaire purifié sur Sephacryl S-200 de l'exemple 2 et on a incubé le tout ä 37 C pendant 4 heures. On a ajout6 une autre proportion de trypsine (500 pg) et on a poursuivi la digestion pendant 20 heures supplémentaires, periode au bout de laquelle on a terminé la réaction par l'addition d'inhibiteur de trypsine de soja (2 mg) (Sigma, St. Louis, MO, E. U. A.).
On a déterminé le pourcentage d'activité inhibitrice de FNTa INH du produit digéré ä la trypsine et du témoin, à une dilution finale 1 : 20 de l'ensemble des fractions réunies, sur des cellules L929 stimulées par du rhFNTa, en présence d'actinomycine D, suivant la formule (I). Les résultats apparaissent dans le tableau 3 qui suit.
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<tb>
<tb>
Inactivation <SEP> trypsinique
<tb> pourcentage <SEP> d'activitê
<tb> Conditions <SEP> de <SEP> FNTα <SEP> NINH <SEP> DO <SEP> zo
<tb> Tampon <SEP> seul <SEP> 0 <SEP> 0. <SEP> 71
<tb> Trypsine+inhibiteur <SEP> de
<tb> trypsine <SEP> de <SEP> soja <SEP> dans
<tb> tampon <SEP> 0 <SEP> 0. <SEP> 70
<tb> Urine, <SEP> purification
<tb> partielle <SEP> sur <SEP> Sephadex <SEP> S-200 <SEP> 61 <SEP> 1. <SEP> 46
<tb> Urine, <SEP> purification
<tb> partielle <SEP> sur <SEP> Sephadex <SEP> S-200 <SEP> avec <SEP> digestion <SEP> par <SEP> trypsine <SEP> 23 <SEP> 1. <SEP> 03
<tb>
EMI31.2
c) Traitement par l'urgée
On a ajusté le FNT INH purifié sur Sephacryl S-200 de l'exemple 2 jusqu'à 2M d'uree et on l'a intensivement dialyse ä 4 vis-à-vis d'une solution saline tamponnée au phosphate (STP) contenant de l'urée 2M.
On a répété la dialyse vis-ä-vis de STP préalablement au biotitrage.
On a constaté que l'activiste de FNTa INH n'était pas affectée, ce qui indique que l'activité inhibitrice n'est pas provoquée par une molécule de faible poids moléculaire 1iée a une proteine.
Exemple 10 Démonstration de l'inhibition competitive
On a testé le FNTa INH purifié sur Sephacryl S-200
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de 1.' exemple 2, a une dilution de 1 : 10, vis-a-vis de quantites croissantes de rhFNTa sur cellules L929. On a observé une correlation inverse entre la quantité de rhFNTa presente dans le titrage et le degré d'inhibition
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(voir figure 3). Par consequent, l'activité inhibitrice est competitivement palliée par des concentrations croissantes de rhFNTa.
Exemple 11
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Inhibition de la production de PG, due au FNTa par des fibroblastesdermiques
On a ensemence des fibroblastes dermiques humains à une concentration de 2, 0 x 10 cellules/puits et on les a cultivées pendant 48 heures. On a ensuite stimule les cellules avec un tampon DMEM complété de 10% de SVF ä titre de témoin.
On a également stimulé les cellules avec du rhFNTa en concentrations variant de 0,5 à 5 mg/ml et on a étudié l'effet du FNTa INH de l'exemple 5 a trois dilutions (1 : 20, 1 : 50 et 1 : 80) dans le tampon susmentionne. après une incubation de 72 heures, on a mesuré la production de PGE2 dans les couches surnageantes, par un radio-immunotitrage, en utilisant de l'antiserum de PGE2 [voir J M Dayer et coll., J.
Clin. Invest., 64, p1386 (1979) J.
Les résultats sont présentés dans le tableau 4 cidessous et démontrent que le pouvoir du rhFNTa à stimuler la production de PGE2 par des fibroblastes dermiques fut inhibé par l'addition de FNTα INH dans les trois dilutions précitées. A la dilution de 1 : 80 du FNTa INH, l'activité inhibitrice fut partiellement palliée par l'elevation des concentrations en rhFNTa.
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<tb>
<tb>
Concentration <SEP> de <SEP> Production <SEP> de <SEP> PGF2par <SEP> des <SEP> fibroblastes <SEP> dermiques
<tb> rhFNT <SEP> sur <SEP> des <SEP> fi <SEP> humains <SEP> (ng/ml)
<tb> broblastes <SEP> humains <SEP> Dilution <SEP> de <SEP> FNTα <SEP> INH <SEP> sur <SEP> fibroblastes
<tb> (P9/ml)
<tb> néant <SEP> : <SEP> 80 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 50 <SEP> 1 <SEP> :
<SEP> 20
<tb> 5 <SEP> 0 <SEP> 50.6 <SEP> ¯ <SEP> 7.4 <SEP> 88.8 <SEP> ¯ <SEP> 5.6 <SEP> 103.0 <SEP> ¯ <SEP> 8.9 <SEP> 111.0 <SEP> ¯ <SEP> 9.4
<tb> 500 <SEP> 60.0 <SEP> ¯ <SEP> 14.1 <SEP> 126.0 <SEP> ¯ <SEP> 9.3 <SEP> 115.9 <SEP> ¯ <SEP> 6.6 <SEP> 113.9 <SEP> ¯ <SEP> 7.1
<tb> 2.000 <SEP> 331.7 <SEP> ¯ <SEP> 28.4 <SEP> 217.2 <SEP> ¯ <SEP> 10.7 <SEP> 156.7 <SEP> ¯ <SEP> 10.7 <SEP> 115.3 <SEP> ¯ <SEP> 21.3
<tb> 5.000 <SEP> 381.7 <SEP> ¯ <SEP> 19.7 <SEP> 257.2 <SEP> ¯ <SEP> 13.7 <SEP> 253.1 <SEP> ¯ <SEP> 21.2 <SEP> 221.6 <SEP> ¯ <SEP> 16.0
<tb>
On a réalisé trois expériences différentes avec la même souche de fibroblastes. On a incubé le tampon ou le FNTα INH ä diverses dilutions, en presence ou en l'absence de diverses concentrations de rhFNTa.
La production de PGE2 par des fibroblastes dermiques humains cultivés fut mesurée au bout de trois jours. Les valeurs obtenues représentent les moyennes de triples essais des trois cultures ESM (N=3).
Exemple 12 Titrage de l'inhibition de liaison du rhFNTa
On a iodé du FNTa humain recombinant en utilisant le procédé ä 1'iodogène de Fraker et Speck jr., Biochem.
Biophys. Res. Comm., 80, p849 (1978). L'activité spécifique du -U-FNTa fut de 2,2 x 104 cpm/ng et produisit une bande unique avec un poids moleculaire de 10 kDa lorsque soumis ä l'analyse par SDS-PAGE. On a cultivé la lignée de cellules macrophages humaines U937 en fractions aliquotes de 106 cellules, à 4OC, pendant deux heures, dans un milieu de culture (200 pl) comprenant du RPMI 1640 (Gibco, Paisley, Ecosse)
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complété de streptomycine (100 mg/mI), de pénicilline (100 U/ml), 1, 0% de glutamine et 10% de serum de veau foetal et contenant, de surcrolt, 0, 04% d'azoture de sodium et 0, 5 ng de [125I]-FNTα
.. On a réalisé l'inhibition de liaison par l'addition de diverses dilutions de FNT1 INH (1 : 20, 1 : 200 et 1 : 2000).
On a mesuré la liaison aspécifique en presence d'un exces centuple de rhFNTa non marqué et on a séparé la radioactivité libre du [125 17-FNTa lié par centrifugation par l'intermédiaire d'un melange d'huiles, comme l'ont décrite Robb et coll., J. Exp.
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Med., 154, p1455 (1981).
On a mesuré le Z 17-FNTa lié aux cellules dans un compteur gamma (LKB, Bromma, Suede) et on a déterminé le pourcentage d'inhibition de liaison selon la formule (II) Pourcentage d'inhibition de la liaison = cpm avec FNTα INH - cpm de liaison spécifique 100 x 1 - cpm de liaison totale - cpm de liaison spécifique (11) Exemple 13
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125 Effet du FNTA INH sur la liaison du C-125 Ll-FNTn aux cellules U937
On a pre-incubé des cellules U937 pendant une heure ä 200 dans 1e milieu de culture de l'exemple 12, en présence soit de cl FNT seul, soit de [125 I]-FNTα avec un exces centuple de rhFNTa non marque. On a ensuite lavé les cellules U937 avec une solution saline tamponnee au phosphate (3 x 50 ml) ä 40.
On a divisé les
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.-125 cellules incubees dans du ze FONT seul en quatre lots que l'on a incubés avec du ENTA INH de l'exemple 5
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(dilutions 1 : 20, 1 : 200 et 2 : 2000) et avec un tampon seul respectivement.
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.-125 On a constaté que la liaison spécifique de 25 t7 FNTa aux cellules U937 était inhibée ä 4 , a 100%, 80% et 35%, par les trois dilutions du FNTα INH 1 : 20, 1 : 200 et 1 : 200 respectivement (voir figure 5). Le lot témoin qui ne comprenait pas de FNTa INH ne manifesta pas d'activité inhibitrice. Llinhibition de la liaison des deux dilutions les plus faibles se trouva etre augmentée
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J. 25 jusqu'ä 90% et 60% lorsque l'on pre-incuba le U- FNTa avec du FNTa INH ä des dilutions de 1 : 200 et 1 : 2000 respectivement, prealablement ä l'addition des cellules.
On a répété l'expérience en utilisant les cellules
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- 125 pré-incubées en présence de 17-FNTa et un exces centuple de FNTa non marque, de façon à ce que le pourcentage d'inhibition de liaison pût être corrigé pour la liaison aspecifique.
Exemple 14
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Dissociation d'un complexe FNTa : U937 préformé On a pré-incubé des cellules U937 pendant une heure 125 en presence de/* 17-FNTa comme decrit ä l'exemple 12. On a lava les cellules et on les a incubas à 40 ou ä 37 en presence ou en l'absence de FNTa INH de l'exemple 125 5.
On a constaté que le 2 17-FNTa li6 a la surface des cellules se dissociait plus rapidement en présence de FNTa INH qu'en son absence et on a constaté que ceci se produisait d'une maniere dependant de la durée et de la température (voir figure 6). exemple 15 Demonstration que le FNTa INH n'est pas proteolytique
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pour le rhFNTa On a incube du 2517-FNTa & 20* pendant une heure, en presence de trois dilutions differentes de FNTa INH
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(1 : 20, 1 : 200 et 1 : 2000) et en présence d'un tampon seul. Lorsqu'analysé par SDS PAGE et autoradiographie, on constata que le 17-FNTa migra sous forme de bande unique, tant en l'absence qu'en présence de FNTα INH, montrant que l'inhibiteur n'avait pas d'effet protéolytique.
Exemple 16 Effet du FNTa INH sur l'activité de liaison du récepteur IL-1
On a testé l'activité du FNTa INH de l'exemple 5 au cours du titrage du IL-1/FAL (facteur d'activation des lymphocytes) apres induction par IL-la ou IL-1ss [ce titrage est décrit par P. Seckinger et coll., J.
Immunol., 139, p1541 (1987) pour une proteine d'inhibiteur IL-U. On a observé une reponse ä la dose
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d'incorporation de H/-thymidine (correspondant ä une proliferation de thymocytes) dans des concentrations allant jusqu'ä 200 pg/ml des deux formes IL-la et IL-ass.
L'addition de FNTa INH ä des taux dont on avait observé l'inhibition du rhFNTa n'eut aucun effet notable sur la prolifération des thymocytes induites au IL-1, prouvant
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ainsi que l'inhibition etait spécifique pour le FNTa seulement.
Les résultants obtenus sont illustres en référence aux dessins ci-annexés, dans lesquels :
La figure l represente le profil de l'activité du FNTa INH urinaire par filtration sur gel de Sephacryl S- 200. On a testé des fractions de colonne (l ml) ä une dilution de 1 : 10 pour réaliser le titrage de la cytotoxicité du rhFNTa (1, 0 ng/ml), en presence d'actinomycine D (oxo). La ligne ( ) représente la DO0nm des fractions. Les barres représentent la lyse de cellules mesurée par prise de colorant en réponse ä
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l'actinomycin D () et ä l'actinomycine D plus rhFNTa (t) sans urine.
Les marqueurs du poids moleculaire sont le bleu de dextrane (BD), l'albumine de serum bovin (ASB), l'ovalbumine (OA), l'a-chymotrypsinogene (aCT), la ribonucléase A (RNase) et le rouge de phénol (+ - rouge).
La figure 2 représente le profil de l'activité du FNTa INH urinaire de la chromatofocalisation sur une colonne de Mono-P. On a testé des fractions de colonne (1 ml), à une dilution de 1:10, en vue de déterminer leur effet au cours du titrage de la cytotoxicité de
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rhFNTa (0, 2 ng/ml) en présence d'actinomycin D (1, 0 pg/ml) (0----0). La ligne ( ) représente la DOdes fractions et (----) represente leur pH. Les barres ont la même signification que celle indiquée ä propos de la figure l.
La figure 3 représente la reversibilité de l'activité du FNTa. INH. Les cercles ouverts (o-o) représentent la DO570nm, mesurée en présence d'actinomycine D, de rhFNTa et de FNTa INH ; les cercles
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fermes (0.) représentent la DOe, mesuree en presence d'actinomycine et de rhFNTa seulement et la barre (S) represente la D570nM en présence d'actinomycine D (1, 0 ng/ml) seule.
La figure 4 représente le profil d'élution par filtration ä travers gel de Sephacryl S-200 avec du FNTa INH purifié de l'exemple 5. On a stérilisé des fractions de colonne (9 ml) et on les a testées, ä une dilution de 1 : 50, vis-ä-vis de rhFNTa (1, 0 mg/ml) en présence d'actinomycine D (1, 0 pg/ml), en présence d'actinomycine D (1, 0 pg/ml) au cours du titrage de la cytotoxicité
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avec L929 (0----0). La 1igne () représente la DOnn des fractions. Les barres ont les memes 280nm
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significations que celles indiquées ä propos de la figure l.
La figure 5 montre l'analyse par SDS PAGE du FNTa INH purifiE de l'exemple 7. On a réalisé la SDS PAGE de la manière décrite par U. Laemmli et coll., Nature, 227, loc. cit. On a chargé des echantillons sur un gel de polyacrylamide ä 15% avec un gel de chargement et on a colore les gels ä l'argent de la maniere décrite par C.
Merril et coll., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, p4335 (1979). Des échantillons issus de conditions non
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réductrices ont été test quant & l'activit6 biologique en decoupant des tranches de 2mM du gel et en éluant les proteines par incubation jusqu'au lendemain dans du tris-HCl 10 mM de pH 7, 4 contenant 2 mM d'EDTA (volume total : 200 1). On a testé les fractions, à une dilution de 1 : 10, sur des cellules L929, en présence de rhFNTa (0, 15 ng/ml).
La figure 6 montre l'effet du FNTα INH sur la liaison du 25l7-FNTa à des cellules U937. On a incubé le FNTa INH, à trois dilutions differentes, en présence de 25tl-FNTa avec la lignée de cellules U937, telle que décrite à l'exemple 13. Les carrés ouverts (@-@) représentent l'incubation en presence de FNTa INH et les triangles ouverts (^ ^) représentent le témoin. Les mêmes symboles fermes se rapportent à une pré-incubation du FNTa INH, ä 20 et pendant 30 minutes, avec du [125I]-FNTα dans le milieu de culture, avant de procéder àl'additiondescellules.
La figure 7 représente la dissociation d'un complexe FNTa : U937 préformé. On a pré-incubé des 125 cellules U937 avec du [125I]-FNTα, on les a lavées et incubees avec du FNTa INH, de la même manière que celle
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décrite ä l'exemple 14, soit ä 4 (@-@), soit à 37 - Au moment indique, on a mesure la radioactivité associée aux cellules et on a déterminé le pourcentage de liaison spécifique. Sur le graphique, la valeur. obtenue avec le t6moin sans l'inhibiteur a été soustraite des valeurs obtenues aux deux températures, par conséquent 100% correspond ä la valeur obtenue sans addition de FNTa INH.