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protéines qui inhibent l'activité due au facteur de necrose tumorale La présente invention concerne une nouvelle protéine possédant un effet inhibiteur contre l'activité due au facteur de nécrose tumorale a, ä l'isolement et ä la purification d'une protéine de ce genre au départ de sources naturelles, à sa préparation par manipulation d'ADN et ä l'emploi d'une protéine de ce type pour le traitement d'états associés à une production excessive ou non réglée de FNTa.
Le facteur de nécrose tumorale (FNT) est une activité déployée par une famille d'au moins deux protéines, a et ss, qui sont cyctotoxiques pour les cellules tumorales et qui inhibent leur croissance en culture . Carswell et coll."An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumours", Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 72, p3666 (197517.
Le facteur de necrose tumorale α(FNTα), également appelé "cachectine", est principalement produit par des cellules de la lignée monocyte/macrophage en réponse ä des signaux de "stress" qui accompagnent des stimuli invasifs, comme des bactéries, des virus, des tumeurs et d'autres toxines.
Le FNTss, couramment appel6"lymphotoxine", est principalement produit par des-cellules lympholdes. Le
FNTss possède de nombreuses activités similaires ä celles du FNTa, mais semble etre moins puissant, bien que ceci pourrait résulter de difficultés rencontrées au cours de la préparation du FNTss pur.
Le FNTa intervient dans des et participe ä un large éventail d'activités biologiques ce. Beutler et coll., "Identité du facteur de nécrose tumorale et du facteur, cachectine, sécrété par des macrophages", Nature, 316, p552 (1985) J, partageant plusieurs d'entre elles avec l'interleukine-l (IL-1) #J. Le et coll ;,"Tumour necro-
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sis factor and interleukin 1 :
cytokines avec de multiples activités biologiques chevauchantes", Laboratory Invest., 56, p234 l198 ?)/. Des taux élevés en FNTa induits, par exemple, par des cellules tumorales peuvent entraîner une perte de poids et une cachexie et on a également constat6 que le FNTa intervenait également comme entremetteur principal, dans le choc endotoxique (choc septique) qui peut etre fatal.
D'autres effets biologiques du FNTa englobent l'hypotension, la fievre (induite par la stimulation de la synthèse de prostaglandine E2 hypothalamique (PGE2)), la coagulopathie (provoquée par la stimulation des cellules endotheliales vasculaires qui libèrent, par exemple le facteur tissulaire) et la destruction de tissus (induite, par exemple, par la stimulation d'une serie de protéinases, y compris la collagenase engendree par des cellules synoviales et des fibroblastes dermiques) Z'C. Dinarello et coll., "Le facteur de nécrose tumorale (cachectine) est
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un pyrogène endogène et induit la production d'interleukine-l", J. Exp. Med., 163, p1433 (1986) ; J.
Dayer et coll., "La cachectine/le facteur de necrose tumorale stimule la production de collagenase et de la prostaglandine E2 par les cellules synoviales et les fibroblastes dermiques humains", J. Exp. Med., 162, p2163 (198511.
Par conséquent, il existe un besoin de développement d'un inhibiteur de cachectine/FNTa qui prévient le choc endotoxique, la cachexie et les autres effets délètères décrits plus haut. On a montra que l'immunisation passive d'animaux contre la cachectine pouvait empêcher la mort induite ä l'endotoxine, due à l'Intervention d'anticorps du FNTa ±B. Beutler et coll., Nature, 316, supra7.
La demanderesse a identifié à présent une nouvelle proteine qui possède un puissant effet inhibiteur contre les activités dues ä l'entremise du FNTα sans inhibition
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concomittante notable de l'activité due ä l'IL-l. Cette proteine sera identifiée dans la suite du présent memoir sous l'appellation d'inhibiteur du facteur de nécrose tumorale α(FNTα INH).
Par consequent, conformement ä l'une de ses caractéristiques, la presente invention a pour objet une proteine qui inhibe sélectivement l'activit6 due au facteur de nécrose tumorale a. Comme on l'utilise dans le présent mémoire. l'expression "inhibition sélective", telle que présentée par l'inhibiteur conforme ä la presente invention, s'identifie ä l'aptitude ä bloquer l'activité due au FNT, en l'absence d'aptitude ä bloquer d'autres protéines qui ont en commun avec le FNT, certaines, mais pas toutes les activités biologiques du FNT, comme l'IL-1.
De preference, l'inhibiteur du facteur de necrose tumorale a conforme ä la présente invention se présente sous une forme sensiblement homogene, essentiellement exempte de substances contaminantes majeures et/ou essentiellement exempte de toute autre matière
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protéinique ou proteique.
On a constaté que l'inhibiteur du facteur de nécrose tumorale a conforme ä la présente invention possédait une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : (a) poids moleculaire variant de 40 a 60 kDa, comme déterminé par chromatographie sur tamis moléculaires,
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(b) point isoelectrique (pl) variant de 5, 5 6, 1, comme determine par chromatofocalisation, (c) inhibition du titre en FNT standard de cytotoxicite differentielle pour des cellules murines L929, traitées ä l'actinomycine D, comme décrit par G.
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Nedwin et coll."Effets de l'interleukine-2, de interferon-y et de mitogenes sur la production de
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facteurs de nécrose tumorale a et ss", J.
Immunol., 135, p2492 (1985), on peut surmonter cette inhibition par une addition complementaire de FNTa, indiquant que l'inhibition est competitive. L'inhibiteur est également un inhibiteur de l'activité du FNTss, bien que l'inhibition du FNTa au cours de ce titrage soit plus efficiente que celle du FNTss, (d) inhibition de la libération de PGE2 induite au FNT ä partir de cellules synoviales et de fibroblastes humains, (e) l'inhibiteur provoque une interférence avec la liaison du FNTa aux cellules U937 (une 1ignée tumorale monocytique", comme on peut le mettre en évidence par
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125 l'inhibition de la liaison du FNTa radiomarque (125 1- FNTa) ; (f) la dissociation d'un complexe de cellules U937 :
FNTα préformé est favorisée par l'inhibiteur d'une façon qui dépend de la temperature, (g) l'inhibiteur ne provoque pas de dégradation du FNT par scission protéolytique, (h) l'inhibiteur n'inhibe pas l'activité de liaison du récepteur IL-1, par exemple la liaison de l'IL-1
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125 radiomarqué (125 I-IL-la) à la sub-lignee de thymome murin EL-4-6. 1.
La demanderesse a découvert que la protéine conforme ä l'invention, lorsqu'on la purifiait davantage, possédait un poids moléculaire d'environ 33000 daltons, comme determine par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium (SDS PAGE).
Par consequent, selon une autre de ses caractéristiques, l'invention a également pour objet une proteine qui inhibe sélectivement l'activité due au FNTa, qui possède une ou plusieurs des caractéristiques suivantes :
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(a) un poids moléculaire d'environ 33 kDa, comme déterminé par SDS PAGE, (b) un point isoélectrique (pI) qui varie de 5, 5 ä 6,1, comme déterminé par chromatofocalisation, (c) une inhibition du titre en FNT standard de cytotoxicité différentielle pour des cellules murines EL929, traitées par de l'actinomycine D, comme decrit par G. Nedwin et coll ; "Effets de l'interleukine-2, de l'interferon-Y et de mitogènes sur la production de facteurs de nécrose tumorale a et ss", J. Immunol., 135, p2492 (1985).
Cette inhibition peut être surmontée par une addition complémentaire de FNTA, indiquant que l'inhibition est competitive. L'inhibiteur est egalement un inhibiteur de l'activité due au FNTss, bien que l'inhibition du FNTa au cours de ce titrage soit plus efficace que celle du FNTss, (d) une inhibition de la libération de PGE2 induite au FNT ä partir de cellules synoviales et de fibroblastes humains, (e) l'inhibiteur vient interférer avec la liaison du FNTa a des cellules U937 (une lignée tumorale monocytique), comme on a pu le mettre en évidence par l'inhibition de la liaison du FNTa radiomarqu6 (125 1FNTa), (f) la dissolution d'un complexe de cellules U937 :
FNTa préformé est favorisée par l'inhibiteur, d'une manière qui depend de la température, (g) l'inhibiteur n'altère ni ne degrade le FNT par scission protéolytique, (h) l'inhibiteur n'inhibe pas l'activité de liaison du récepteur IL-1, par exemple la liaison d'IL-1 radiomarqué (125 I-IL-1α) à la sub-lignée de tymome murin EL4-6, 1.
De préférence, le TNFa INH selon la presente invention possede les deux caractéristiques (a) et (b)
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et une ou plusieurs des caractéristiques (c) à (h).
De façon plus particuliere, le FNTa INH conforme ä la presente invention, possède toutes les caractéristiques (a) à (h).
La protéine conforme à l'invention possède une séquence d'aminoacides A terminaison amino, comme suit :
Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-
Pro-Gln-Cys-Asn-Ser-Ile
On suppose egalement que les trois aminoacides qui suivent fournissent un site de glycosylation et que la sequence se poursuit ainsi : Asn-Ser-Thr-Lys.
11 faut comprendre qu'un inhibiteur de FNTα conforme à la présente invention comprendra également une sequence d'aminoacides correspondant sensiblement a la séquence du FNTa INH, naturel et contenant une séquence ä amino terminaison sensiblement indentique ä celle decrite plus haut.
La sequence de l'inhibiteur de FNTa conforme à la presente invention sera, par conséquent, identique à la séquence du FNTa INH naturel, ou contiendra une ou plusieurs omissions, substitutions, insertions, inversions ou additions d'origine allélique, ou, d'une autre manière, la sequence resultante comportera au moins 80% et, de preference, 90%, d'homologie avec la séquence du FNTa INH naturel et conservera essentiellement les mêmes propriétés biologiques que celles de la protéine en question.
On a démontré que l'inhibiteur de FNTa conforme ä la presente invention était de nature protéique, en ce sens qu'il était inactive par chauffage d'une maniere dépendant du temps et de la temperature et qu'il était détruit par traitement par de la trypsine ou de la pronase.
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On a également montré que le FNTa INH conforme à la présente invention était une glycoprotéine, étant donné
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que le traitement par l'enzyme qu'est l'endoglycosidase F réduisait le poids moleculaire de 7 ä 8 kDa.
Selon encore une autre de ses caractéristiques, la presente invention a par conséquent pour objet un inhibiteur de FNTa tel que défini dans le présent mémoire, mais qui se trouve dans un état sensiblement ag1ycosylé.
Les inhibiteurs conformes ä la présente invention présentent un intérêt pour le traitement d'états dans lesquels il est souhaitable d'inhiber l'activité du FNTa, par exemple, ceux qui surviennent à la suite des effets du FNTa, comme une perte de poids, un choc, une cÅachexie et une inflammation locale chronique, la polyarthrite chronique evolutive, la coagulation intravasculaire disséminée et- 1a néphrite.
Selon encore une de ses caractéristiques, la presente invention a également pour objet un inhibiteur de FNTa, tel que défini dans le présent mémoire, ou un dérivé pharmaceutiquement acceptable de cet inhibiteur, en vue de l'utiliser à titre d'agent thérapeutiquement actif, plus particulièrement, pour le traitement d'états associés ä une production excessive ou non régulée de FNTa.
Selon encore une de ses caractéristiques, l'invention a aussi pour objet un procédé de traitement d'états associés à une production excessive ou non régulée de FNTa chez un mammifere, y compris l'homme, caractérisé en ce que l'on administre ä ce mammifère. une quantité efficace d'un inhibiteur de FNTa tel que defini dans le present memoire, ou un derive pharmaceutiquement acceptable de cet inhibiteur.
Selon encore une de ses caractéristiques, l'invention a également pour objet l'emploi de
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l'inhibiteur de FNTa tel que défini dans le präsent mémoire ou d'un dérivé pharmaceutiquement acceptable de cet inhibiteur, pour la fabrication d'un medicament destina au traitement d'états associés à une production excessive ou non régulée de FNTa.
Les spécialistes de la technique comprendront que la référence que l'on fait dans le présent mémoire au
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traitement s'etend aussi bien à la prophylaxie qu'au traitement de symptomes ou d'états établis.
11 faut encore apprécier que la quantité d'inhibiteur de FNTa conforme ä la présente invention, qu'il est nécessaire d'utiliser pour le traitement variera, non seulement avec le mode d'administration, mais également avec la nature de l'état ä traiter et avec l'agie et la condition du patient et que cette quantité ressort finalement de la décision du vétérinaire ou du médecin traitant. Cependant, en general, une dose appropriée variera habituellement d'environ 5, 0 ä 500 tig par kilogramme de poids corporel et par jour, par exemple, de 30 ä 300 pg/kg/jour, de préférence de 50 z 150 g/kg/jour.
La dose souhaitée peut commodément etre présentée sous forme de dose unique, ou sous forme de doses subdivisees, que l'on administre ä des intervalles. appropries, par exemple, sous forme de deux, trois, quatre et plus de quatre doses subdivisées, par jour.
Bien qu'il puisse etre possible que, pour l'usage dans le domaine thérapeutique, on administre un inhibiteur de FNTa conforme ä l'invention sous forme de la protéine brute, il est préférable de presenter la protéine active sous forme de composition pharmaceutique. Par conséquent, la presente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur de FNTα, tel que défini dans le présent mémoire, ou un dérivé pharmaceutiquement acceptable de cet inhibiteur,
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en même temps qu'un ou plusieurs vehicules ou excipients pharmaceutiquement acceptables et, facultativement, d'autres ingrédients therapeutiques et/ou prophylactiques.
Le ou les véhicules ou excipients doivent être "acceptables" dans le sens d'être compatibles avec les ingredients de la composition et d'une parfaite innocuité pour le malade ou le patient.
On peut par conséquent présenter les inhibiteurs conformes ä la presente invention en vue de leur administration par la voie parenterale (par injection, par exemple perfusion continue ou injection de bols) et on peut également les presenter sous la forme de doses unitaires dans des ampoules, des seringues remplies au préalable, des perfusions de petit volume, ou dans des recipients qui en contiennent des doses multiples avec conservateur additionnel. Les compositions peuvent adopter des formes comme des suspensions ou des solutions dans des véhicules aqueux et peuvent contenir des agents de mise en composition, comme des agents de mise en suspension, de stabilisation et/de dispersion.
En alternative, l'ingredient actif peut aussi se presenter sous la forme d'une poudre que l'on obtient par isolement aseptique du solide sterile ou par lyophilisation ä partir d'une solution, en vue de la reconstitution d'une composition utilisable a l'aide d'un véhicule convenable, par exemple de l'eau apyrogène, sterile, avant l'emploi du médicament.
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On peut également employer l'inhibiteur de FNTa conforme ä 1a présente invention en combinaison avec d'autres agents therapeutiques, par exemple d'autres cytokines ou inhibiteurs de FNTa.
L'invention a par consequent aussi pour objet, selon une autre de ses caractéristiques, une combinaison comprenant un inhibiteur de FNTa, tel que défini dans le présent memoire, ou un derive pharmaceutiquement
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acceptable de cet inhibiteur, en même temps qu'un autre agent thérapeutiquement actif, par exemple d'autres cytokines ou inhibiteurs de FNTa.
Les protéines conformes ä la présente invention peuvent se préparer par la purification au depart de sources naturelles et, lorsque cela se révèle être approprie, cette opération peut etre suivie d'une modification chimique, ou bien on peut les préparer par des procédées classiques bien connus des specialistes de la technique qui s'occupent de la préparation de proteines, par exemple en ayant recours ä des techniques ä ADN recombinant.
. Selon une autre encore de ses caractéristiques, la présente invention a aussi pour objet un procédé de production d'un inhibiteur de facteur de necrose tumorale a, conforme à la presente invention, par purification au depart de sources naturelles, plus particulièrement l'urine de patients fiévreux humains.
Une purification de ce genre comprend, par exemple, les étapes de concentration de l'urine brute de patients fievreux humains, la precipitation du FNTa INH brut de l'urine et le fractionnement du FNTa INH d'autres protéines de ce précipité, par une ou plusieurs voies constituees, par exemple, par la chromatographie d'échange ionique sur colonne, la chromatographie a filtration ä travers gel, la chromatographie d'hydrophobicite, la chromatographie d'immuno-absorption et d'affinité sur du FNTa immobilise.
L'inhibiteur de facteur de nécrose tumorale a selon la presente invention s'obtient egalement ä partir de tissu humain contenant des macrophages, par exemple les résidus de lavages pulmonaires et les extraits de foie humain, ä partir desquels on peut l'obtenir par des techniques purification standard, comme celles décrites plus haut.
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Le FNT INH naturel et recombinant, que l'on produit par mise en oeuvre des procédés décrits dans le present mémoire, peuvent etre purifiés par toute une serie d'étapes telles qu'énumérées plus haut. Après chacune des étapes de purification, la presence et la pureté du FNT INH peuvent être déterminées et mesurées par un titrage de la cytotoxicite, en présence d'actinomycine D (acti D) en utilisant une 1ignée de cellules L929 sensibles au FNT, comme decrit par G.
Nedwin et coll., J. Immunol., 135, loc. cit.
Selon une forme de realisation préférée du procédé. le FNTa INH est initialement isolé de l'urine non traitee, recueillie de patients fiévreux humains te 38,5 C), dépourvus d'infections urinaires, en utilisant une technique de concentration standard, par exemple l'ultrafiltration. On peut ensuite précipiter une fraction brute A partir de l'urine brute, en utilisant du sulfate d'ammonium, par exemple par l'addition de sulfate d'ammonium en une concentration de 80% (p/v), ä 4OC, sous agitation. De preference, on peut ajouter le sulfate d'ammonium d'une maniere échelonnée et écarter la matiere précipitée à des concentrations inférieures (par exemple ä 40% (p/v).
On peut éliminer le sulfate d'ammonium par dialyse et on peut purifier la fraction
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resultante pour séparer le FNJINH d'autre proteines dt par toute une serie de procédés chromatographiques.
Ainsi, on peut purifier le concentré de FNTα INH par chromatographie ä échange ionique, qui sépare les protéines selon leurs différences en charge électrique, qui. constitue le reflet des propriétés acide/base des protéines. Des matières convenables pour la chromatographie d'échange d'anions comprennent des dérivés de l'aminoethylcellulose, par exemple l'aminoéthylcellulose quaterniare (QAE-cellulose) ou la diethylaminoethylcellulose (DEAE-cellu10se) qui sont
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très repandues dans le commerce. 11 faut équilibrer la colonne d'behänge d'anions avant d'appliquer le concentré, en se servant d'un tampon convenable, comme le tris-HCl, contenant éventuellement un agent chélateur, tel que l'EDTA.
La matière liée peut être éluée de la colonne en utilisant une solution de sel (par exemple du chlorure de sodium 0, 8M, que l'on complète avec le tampon d'équilibrage).
On rassemble les fractions actives provenant de la chromatographie d'échange d'anions. Les matières appropriées ä la chromatographie d'echange de cations comprennent des dérivés de la cellulose, comme la carboxymethyl (CM) cellulose, ou la sulfopropylsépharose (Pharmacia, Uppsala, Suede). La colonne doit etre équilibrée avec un tampon convenable, comme l'acetate de sodium et la matiere liane peut être éluée avec le tampon d'équilibrage contenant, par exemple, du chlorure de sodium 0, 5M.
On purifie davantage les fractions actives rassemblées par chromatographie d'affinité sur du FNTa humain recombinant lié (rhFNTa), lie à une matrice appropriée, par exemple du mini-leak agarose (Kern En
Tee, Biotechnology Corp., Danemark). La colonne doit être tamponnée en utilisant, par exemple un tampon au phosphate (par exemple phosphate de potassium 0,8M de pH
8, 6). Les groupes actifs non liés au rhFNTa doivent être bloqués en utilisant un tampon ä l'éthano1amine-HC1 de pH 8, 5. La colonne doit être équilibrée avec un tampon approprié, par exemple le tris-HCl, contenant eventuellement du chlorure de sodium et le FNTa INH doit
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être é1ué avec un tampon ä la glycine acide (pH de 3, 5).
Les fractions é1uées doivent être immédiatement équilibrées jusqu'à un pH de 7, 0 par l'addition, par exemple, de Tris base.
Les fractions actives rassemblées sont, de
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preference, lyophilisees avant l'étampe de purification finale de FPLC a phase inverse (FPLC ; chromatographie en phase liquide de protéines rapide). Avant son application ä la colonne de FPLC, la fraction de FNTa INH lyophilisée doit être tamponnée avec un tampon convenable, comme l'acide trifluoracetique (TFA) (Fulka, Buchs, Suisse), l'acide heptafluorobutyrique (HFBA) ou l'acide acetique. L'élution du FNTa INH de la colonne de FPLC peut s'effectuer en recourant à des techniques classiques, par exemple, en complétant avec un tampon approprié, tel que précédemment décrit, contenant éventuellement un alcool, par exemple le N-propanol.
La fraction éludée doit être immédiatement tamponnée avec, par exemple, du bicarbonate d'ammonium et lyophilisée. Le FNTa INH se présente ä present sous une forme sensiblement homogène qui convient à un titrage supplémentaire de l'activite biologique et ä la préparation sous une forme convenant ä l'emploi dans le domaine therapeutique.
Par consequent, selon l'une de ses caractéristiques supplémentaires ou alternatives, la présente invention a aussi pour objet une protéine qui inhibe sélectivement l'activité due au FNTa, qui est sensiblement identique ä celle obtenue dans le procédé decrit plus haut.
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L'aptitude ä purifier le FNTa INH conforme b la presente invention jusqu'à 1'homogénéité a permis le sequencage de la fraction N-terminale de cette molécule de proteine. Cette séquence facilitera le clonage dtun gène codant pour le FNTa INH permettant de cette maniere la production d'importantes quantites de FNTa INH sous forme pure ä partir d'un examen biologique complémentaire et éventuellement pour l'essai et l'utilisationthérapeutique.
On peut séquencer des échantillons du FNTa INH homogene conforme ä la presente invention par mise en
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oeuvre de techniques classiques, par exemple en utilisant un sequenceur automatisé disponible dans le commerce, faisant appel ä une detection en phase gazeuse ou ä la ninhydrine. Les 17 premiers résidus de la partie ä terminaison amino du FNTa INH humain tel que défini dans le présent memoir, comprennent la séquence suivante :
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Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-CysAsn-Ser-Ile (identifiee en utilisant un séquenceur automatisé, modele 477A, de Appled Biosystems).
On suppose également que les trois aminoacides suivants fournissent un site de glycosylation et que la sequence se poursuit ainsi : Asn-Ser-Thr-Lys.
11 faut comprendre qu'un procédé potentiel de fourniture d'importantes quantités de FNTa INH sous forme pure s'effectue par des techniques à l'ADN recombinant, bien connues des specialistes. Cependant, l'utilisation couronnee de succes de techniques de ce genre n'exige non seulement la mesure précise du FNTa INH naturel et recombinant ou de son activite, mais également que le produit tant naturel que recombinant
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seit purifiable jusqu'a l'homogeneite.
Suivant encore une autre de ses caractéristiques, la présente invention a également pour objet un procédé de production d'un inhibiteur du facteur de nécrose tumorale selon l'invention ou d'un derive de celui-ci, par l'expression d'une sequence d'ADN encodant pour un tel inhibiteur dans un hôte transformé de façon convenable. Un tel procédé implique la culture d'un hôte transforme avec des molécules d'ADN recombinant comprenant des sequences d'ADN encodant l'inhibiteur qui a été inseré dans un vecteur convenable.
Des hötes appropries, eucaryotes et procaryotes, peuvent etre, par exemple des souches
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de bactéries, des levures, d'autres champignons et des cellules animales (y compris les cellules d'insectes) et des cellules de plantes dans le tissu. Des cellules hotes particulièrement préférées sont des cellules de levure, des cellules d'E. coli et des cellules animales.
L'expression d'une proteine possédant une activité inhibitrice du facteur de necrose tumorale s'obtient par la culture des cellules hottes transformées dans un milieu de croissance approprie. Normalement, un tel milieu contient une source d'azote, comme le sulfate d'ammonium, une source de carbone et d'energie, comme le glucose ou le glycerol, des oligo-elements et des facteurs essentiels pour la croissances des cellules hôtes particulieres. Les conditions précises de la culture dependent de l'hôte choisi ; ainsi, par exemple, dans le cas de E. coli, On préfère une fermentation aérobie submergée, de preference ä environ 37OC.
En outre, l'expression peut etre provoquée, par exemple, par l'addition d'un inducteur ou par l'emploi de conditions d'induction pour le systeme promoteur utilisé dans le vecteur d'expression.
En fonction de l'hôte, l'inhibiteur de FNTa peut etre produit sous forme de corps d'inclusion granulaires que l'on peut récupérer, apres la lyse des cellules, par centrifugation differentielle ; ces corps peuvent être solubilisés par des procédés classiques et purifies par les methodes décrites dans le present mémoire de purification du FNTa INH urinaire. En alternative, l'inhibiteur de FNTa peut se trouver en solution dans le cytosol, sécrété dans l'espace périplasmique, ou commodément sécrété dans le milieu de culture.
Les cellules hôtes sont transformées par des molecules d'ADN recombinant qui comprennent une sequence d'ADN encodant pour l'inhibiteur de FNTa, qui a subi
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l'insertion dans un vecteur d'expression.
Des vecteurs d'expression de ce genre peuvent etre constitués de segments de séquences d'ADN chromosomiques, non chromosomiques et de synthese, comme divers dérivés connus de SV-40 et de plasmides bactériens connus, par exemple des plasmides "naturels", tels que ColEl, pSC10I ou pRSF2124 et des ADN de phages,
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ou des plasmides"artificiels" (construits in vitro), tels que pBR322, pMB9 ou pAT153. Les ADN de phages comprennent, par exemple les nombreux derives de phage lambda et d'autres phages d'ADN, par exemple M13 et d'autres phages d'ADN ä brin unique filamenteux. Des vecteurs interessants dans des levures comprennent le plasmide 2 et ceux utiles dans des cellules eucaryotes, comme des cellules animales, comprennent ceux contenant le retrovirus et l'adénovirus SV-40.
On peut également caractériser de tels vecteurs d'expression par au moins une séquence de commande de
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l'expression, qui peut être opérativement liee à la sequence d'ADN de l'inhibiteur de FNT, en manière telle qu'elle commande et règle ou régule l'expression de la sequence d'ADN clonee. En exemples de séquence de commande de l'expression intéressantes, on peut citer les systemes lac, trp, tac et trc, des regions majeures,
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opératrices et promotrices, de phage lambda (tel que le promoteur PL sous la commande represseur ts c1857 thermolabile), 1a région de commande de la proteine de revetement fd, les promoteurs glycolytiques de la levure (par exemple le promoteur pour la 3- phosphoglycerate kinase), les promoteurs de la phosphatase acide de levure (par exemple Pho 5),
les promoteurs d'appariement ä la levure a et des promoteurs provenant de polyomes, d'adénovirus, de retrovirus et de virus simiens.
Au surplus, des vecteurs d'expression de ce genre,
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peuvent posséder divers sites pour l'insertion des séquences d'ADN d'inhibiteur de FNTA selon l'invention. Ces sites se caractérisent par l'endonuclease de restriction spécifique qui les clive ou scinde. De tels sites de clivage ou de scission sont bien connus des spécialistes de la technique.
Le vecteur d'expression et, en particulier, le site qui y est choisi pour l'insertion d'un fragment d'ADN choisi et sa liaison operative à une séquence de commande d'expression, se determinent par une Serie de facteurs comprenant le nombre de sites sensibles ä une enzyme de restriction donnée, le calibre de la proteine à exprimer, la contamination ou la liaison de la protéine ä exprimer par des protéines de cellules hôtes, qui peuvent être difficiles à éliminer au cours de la purification, la position de codons départ {arrêt et d'autres facteurs bien connus des spEcialistes de la technique.
Ainsi, le choix d'un vecteur et du site d'insertion pour une sequence d'ADN est déterminé par un équilibre de ces facteurs, toutes les selections n'etant pas d'efficacit egale pour un cas donne.
De meme, toutes les combinaisons hôte/vecteur ne fonctionnent pas avec une efficience egale pour l'expression des sequences d'ADN selon l'invention. On procede au choix en tenant compte d'une variété de facteurs comprenant la compatibilité de l'hotte et du vecteur, la facilité de la récupération de la protéine souhaitee, les caractéristiques d'expression des séquences d'ADN et les séquences de commande de l'expression qui y sont opérativement liees, ou n'importe quelles modifications post-expression necessaires de la protéine souhaitée.
Les séquences d'ADN conformes ä l'invention qui, par expression, codent pour des protéines avec une activité d'inhibiteur de FNTa, peuvent être isolees par
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criblage de diverses reserves d'ADN ou ADNtheques pour de telles sequences d'ADN, en utilisant une serie d'échantillons d'ADN. On peut préparer les échantillons d'ADN ä partir de la protéine naturelle purifiée que l'on utilise Åa titre de source de donnees de sequences d'aminoacides. On peut préparer la proteine naturelle purifiée, par exemple, ä partir d'urine d'etres humains fiévreux, comme décrit plus haut.
On utilise des séquences d'ADN dégénérées, codant pour diverses parties et fragments de la séquence d'aminoacides, par exemple en combinaison avec des échantillons de Lathe, pour modeler les échantillons d'ADN.
Ainsi, diverses ADNtheques sont criblées quant aux séquences d'ADN codant pour les inhibiteurs de FNTa conformes ä la présente invention. Des ADNthèques de ce genre comprennent des banques de gênes chromosomiques et des cADNtheques ou des ADNthe- ques, que l'on prepare Åa partir de 1ignées de cellules ou de tissus, dont on a démontré qu'ils produisaient des inhibiteurs de FNTα, comme des macrophages alveolaires ou le tissu hepatique.
Le criblage peut s'effectuer par expression immune directe, par exemple dans Àgtll ou des systemes similaires, ou bien, le cas oü l'on identifie une cellule produisant du FNTα INH, par l'identification du mARN spécifique du FNTA INH par l'expression directe dans des oocytes de Xenopus.
On peut avoir recours à toute une serie de techniques de clonage et de sélection classiques pour localiser et identifier des séquences d'ADN qui encodent, par expression dans un hôte procaryote ou eucaryote approprie, les inhibiteurs de FNT selon l'invention. Ces séquences d'ADN choisies ou sélectionnées peuvent, elles memes, être utilisées comme échantillons pour choisir d'autres sequences d'ADN codant pour les inhibiteurs de FNTa, ou bien on peut les
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utiliser dans des molecules d'ADN recombinant convenables pour transformer des h8tes eucaryotes ou procaryotes appropries en vue de la production du FNTa INH qu'elles encodent.
La portée de la présente invention s'étend également aux séquences d'ADN ä brin unique et ä double brin encodant pour des FNTa INH, des vecteurs contenant des séquences de ce genre, appropriées ä la transformation d'un organisme höte et de cellules hôtes transformées par de telles sequences d'ADN.
Selon encore une autre de ses caractéristiques, l'invention a également pour objet une protéine avec une activite inhibitrice ou d'inhibiteur de FNTa sélective, produite par l'expression d'un hôte transformé avec une sequence d'ADN encodant pour une telle protéine inhibitrice de FNTa. Les inhibiteurs de FNT selon l'invention que l'on prépare par l'expression d'une séquence d'ADN encodant de tels inhibiteurs dans un hole transformé seront par consequent identiques à la séquence de FNTa INH naturel ou contiendront une ou plusieurs omissions, substitutions, insertions, inversions ou additions d'origine allylique ou autre, la sequence ainsi obtenue aura au moins 80% et, de préférence 90%, d'homologie avec la séquence du FNTa INH naturel et conservera essentiellement les mêmes propriétés biologiques.
De manière plus particuliere, un inhibiteur de FNTa selon l'invention peut comprendre une méthionine à N-terminal. De même, par exemple, la séquence d'ADN selon l'invention codant pour le FNTa INH peut etre fusionnee dans-un vecteur d'expression ä une partie d'une séquence d'ADN codant pour un polypeptide eucaryote ou procaryote, afin de faciliter l'expression de la sequence d'ADN encodant le FNTa INH, ou d'aider a la secretion, la maturation, la purification du FNTa INH a partir de l'hÏte ; 1e
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polypeptide fusionné peut être enlevé inter-ou extracellulairement par des techniques connues, ou bien le FNTa INH peut être utilise en meme temps que le polypeptide fusionné.
Les FNTa INH produits par la culture d'hotes eucaryotes ou procaryotes, transformes par des séquences d'ADN encodant le FNTa INH, peuvent ensuite etre employés, après purification, dans les compositions pharmaceutiques conformes à l'invention.
11 faut comprendre que lorsqu'il est produit par des cellules animales, le FNTa INH selon l'invention sera une glycoprotéine. Cependant, des systemes d'expression procaryotes produiront la protéine ä l'etat aglycosyle. En outre, la proteine glycosylee peut etre sensiblement déglycosylée par des techniques bien connues des spécialistes, par exemple, par l'addition d'enzymes du type endoglycosidase.
Les exemples non limitatifs qui suivent illustrent la présente invention. Toutes les temperatures sont indiquees en OC et toutes les concentrations en pourcentage sont en p/v.
Titrage de l'inhibition du FNTa
Le pourcentage d'activité du FNTa INH dans les fractions decries dans les exemples a été déterminé en présumant que les valeurs de la densité optique (DO) de cellules murines L929, stimulées ä l'actinomycine D (acti S), correspondait ä une inhibition de 100%, tandis que la DO de cellules cultivees avec de l'actinomycine D et du FNTa correspondait ä une mortalité cellulaire maximale de 0% d'inhibition de FNTa. Le FNTa utilisé pour le titrage était du FNTa humain recombinant (rhFNTa) produit dans E. coli comme décrit par A.
Marmenout et col1., "Clonage moléculaire et expression du facteur de necrose tumorale humain et comparaison de
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celui-ci au facteur de nécrose tumorale de la souris", Eur. J. Biochem., 152, p515 (1985). Ainsi, le pourcentage de l'inhibition du FNT (I au cours du titrage de la cytotoxicité fut calculé conformément ä la formule (I) :
Pourcentage de l'activiste de FNTa INH =
EMI21.2
(DO avec acti D + rhFNTa + FNTa INH) - (DO avec acti D + rhFNTa) 100 x (I) (DO avec acti D)- (DO avec acti D + rhFNTa) L
EMI21.3
Exemple l Purification du FNTa INH urinaire a) Concentration des protéines provenant de l'urine humaine
On a rassemblé les urines humaines (15 litres) fralchement obtenues d'un pool de cinq patients avant de procéder à un quelconque traitement. Deux des patients souffraient d'un carcinome à petites cellules, un autre d'histiocytose maligne, un autre encore de polymyosite et le dernier d'un etat septique. Tous les patients etaient extremement fievreux et étaient dépourvus d'infections urinaires.
On a concentré l'urine à 40 sur un appareil d'ultrafiltration à fibers creuses Amicon, avec une coupe d'un calibre moleculaire d'environ 5 kDa. b) Preparation des protéines à partir de l'urine humaine
On a saturé l'urine rassemblée, concentrée, de sulfate d'ammonium solide en ajoutant lentement le sulfate, sous agitation constante et ä 4 , jusqu'à ce que la concentration en sulfate d'ammonium eût atteint 40%.
On a enlevé le précipité par centrifugation, on l'a écarté et on a ajusté la couche surnageante jusqu'à une
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saturation de 80% par l'addition de sulfate d'ammonium complémentaire. on a obtenu une pastille par centrifugation que l'on a remise en suspension dans 150 ml de phosphate de sodium 20 mM (pH de 7, 2) et de chlorure de sodium 150 mM.
On a éliminé le sulfate d'ammonium par dialyse ä 4 C en se servant de tris-HCl 10 mM (pH de 7, 4) de l'EDTA 2 mM et de benzamidine-HCl 5
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mM. c) Identification de l'activité FNTa INH
On a testé la fraction semi-purifiee de l'exemple l (b) dans un titrage de cytotoxicité avec une lignee de cellules L929 sensibles au FNT, en présence d'actinomycine D. A une dilution de 1 : 20 de la fraction semi-purifiée, on a observé une inhibition totale de l'effet cytotoxique induit par le rhFNTa, si bien que la valeur DO570nm était identique ä celle mesurée en presence d'actinomycine D seule (DO)570nm = 1,5).
En outre, on a observé l'activité inhibitrice, en dilutions de la fraction allant jusqu'à 1 : 160 sur des cellules (DO570nm = 0,83), cependant que la veleur témoin de rhFNTa, ä une concentration finale de 0, 2 ng/ml, mesurée en presence d'actinomycine D, était inferieure (DO570nm = 0,73), si bien que l'on a observe 50% de l'Inhibition a une dilution d'approximativement 1:
100(DO70nm = 1, 10). Le FNTa INH n'eut pas d'effet sur la viabilité des cellules lorsqu'on le testa sans actinomycine D.
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d) Comparaison de 1'effet de FNTA INH sur la cytotoxicité induite par le FNTa et le FNTss On a effectué un titrage de cytotoxicité en utilisant la lignée de cellules L929 sensibles au FNT, en presence d'actinomycine D, en utilisant une gamme de concentrations en FNTa ou FNTss pour induire l'effet
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cytotoxique. On a testé la fraction semai-purifiée de l'exemple l (b) ä des dilutions de 1 : 20, 1 : 50 et 1 : 80. On a réalisé des tests témoins en l'absence de FNTa ou FNTss cytokine et en l'absence d'inhibiteur.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 qui suit et demontrent que l'inhibiteur conforme ä l'invention n'exerce pas d'effet inhibiteur sur la cytotoxicité due au FNTss, variant depuis approximativement 50% en descendant jusqu'a 2% de l'inhibition de FNTa avec l'elevation de la concentration en FNTss.
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<tb>
<tb>
Tableau <SEP> 1
<tb> Concentration <SEP> fi- <SEP> Forme <SEP> de <SEP> Dilution <SEP> finale <SEP> de <SEP> la <SEP> fraction
<tb> nale <SEP> du <SEP> FNT <SEP> (α <SEP> ou <SEP> cytokine <SEP> inhibitrice <SEP> sur <SEP> Sephacryl <SEP> S-200
<tb> ss) <SEP> (pg/ml) <SEP> ajouté <SEP> ajoutée <SEP> sur <SEP> des <SEP> cellules <SEP> L929 <SEP> (DO570nm)
<tb> à <SEP> des <SEP> cellules <SEP> L929 <SEP> aux <SEP> celtraitées <SEP> à <SEP> l'acti- <SEP> lules <SEP> Néant <SEP> 1/20 <SEP> 1/50 <SEP> 1/80
<tb> nomycine-D
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> > 1. <SEP> 90 <SEP> > 1. <SEP> 90 <SEP> > 1. <SEP> 90 <SEP> > 1. <SEP> 90
<tb> 10 <SEP> a <SEP> ND <SEP> ND <SEP> ND <SEP> ND
<tb> ss <SEP> 1. <SEP> 16 <SEP> 1. <SEP> 66 <SEP> 1. <SEP> 46 <SEP> 1. <SEP> 39
<tb> 20 <SEP> a <SEP> 1. <SEP> 30 <SEP> > 1. <SEP> 90 <SEP> 1. <SEP> 72 <SEP> 1. <SEP> 68
<tb> ss <SEP> 1. <SEP> 02 <SEP> 1.
<SEP> 51 <SEP> 1. <SEP> 21 <SEP> 1. <SEP> 22
<tb> 50 <SEP> a <SEP> 1.02 <SEP> > <SEP> 1.90 <SEP> 1.72 <SEP> 1.68
<tb> ss <SEP> 0.65 <SEP> 1.03 <SEP> 0.84 <SEP> 0.68
<tb> 100 <SEP> 0. <SEP> 73 <SEP> 1. <SEP> 78 <SEP> 1. <SEP> 69 <SEP> 1. <SEP> 51
<tb> ss <SEP> 0. <SEP> 37 <SEP> 0. <SEP> 71 <SEP> 0. <SEP> 59 <SEP> 0. <SEP> 52
<tb> 250 <SEP> a <SEP> 0. <SEP> 38 <SEP> 1. <SEP> 70 <SEP> 1. <SEP> 70 <SEP> 1. <SEP> 33
<tb> ss <SEP> 0. <SEP> 24 <SEP> 0. <SEP> 44 <SEP> 0. <SEP> 31 <SEP> 0. <SEP> 24
<tb> 500 <SEP> a <SEP> 0. <SEP> 30 <SEP> 1. <SEP> 52 <SEP> 1. <SEP> 49 <SEP> 1. <SEP> 11
<tb> ss <SEP> 0. <SEP> 17 <SEP> 0. <SEP> 30 <SEP> 0. <SEP> 26 <SEP> 0. <SEP> 18
<tb> 1 <SEP> 250 <SEP> α0.19 <SEP> 1.09 <SEP> 1.10 <SEP> 0.76
<tb> ss <SEP> 0. <SEP> 11 <SEP> 0. <SEP> 13 <SEP> 0. <SEP> 19 <SEP> 0. <SEP> 13
<tb> 2 <SEP> 500 <SEP> a <SEP> :
<SEP> 0. <SEP> 06 <SEP> 1. <SEP> 03 <SEP> 0. <SEP> 80 <SEP> 0. <SEP> 47
<tb> ss <SEP> ND <SEP> ND <SEP> ND <SEP> ND
<tb>
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Exemple 2 Filtration sur gel de FNTα INH urinaire
On a purifi6 le FNT INH semi-purifie de l'exemple l (b) par Chromatographie ä filtration ä travers gel à 40 sur une colonne de Sephacryl S200 (0, 9 x 60 cm) (Pharmacia, Uppsala, Suede) équilibrée dans un tampon tris-HCl 50 mM (pH de 7, 4) contenant du chlorure de sodium 100 mM. On a appliqué un échantillon de la
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fraction proteinique (20 mg, 0, 8 ml) ä la colonne et on l'a élué avec le même tampon, a un debit de 5,4 ml/h. On a rassemble les fractions (1, 35 ml) et on les a testees quant ä leur activité de FNTa INH.
L'activité de FNTA
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INH s'elua ä partir du gel sous forme d'un pic ou pointe unique. Le produit ä activité de FNTA INH s'elua du gel sous forme d'un pic ou pointe unique. Le produit à activité inhibitrice manifesta un poids moleculaire apparent de 40 à 60 kDa (voir figure 1).
Exemple 3 Chromatofocalisation du FNTα INH urinaire
On a chromatofocalisd le FNa INH semi-purifié de l'exemple leb), à 40, sur une colonne prégarnie de monoP (HR 5/20,5 x 200 mm) (Pharmacia, Uppsala, Suède) équilibrée dans un tampon bis-tris 25 mM, ajusté ä un pH de 7, 1 à l'aide d'acide imidodiacétique (Fluka, Buchs, Suisse).
On a appliqué un échantillon de la fraction protéinique de l'exemple l (b) (30 mg) ä une colonne et on l'a élué avec un polytampon 74/acide iminodiacetique ä un pH de 4, 0. On a test & des fractions de colonne (1 ml) ä une dilution de 1 : 10 quant à leur effet au cours du titrage de cytotoxicit6 induit au rhFNTa (0, 2 ng/ml), en présence d'actinomycine D (1 g/ml). On a déterminé le pH reel de chaque fraction de colonne ä l'aide d'un pHmètre, la majeure partie de l'activit6 de FNTα INH se trouvant dans les fractions éluées entre un pH de 5,5 et
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de 6, 1 (voir figure 2). Ceci est équivalent au pI de la proteine de FNTa INH.
Exemple 4 Chromatographie par échange d'ions du FNTα INH urinaire
On a purifié le FNTa INH semi-purifié de l'exemple l (b) par une chromatographie d'échange d'anions, à 40, sur une colonne de Sephadex, DEAE (2, 6 x 20 cm) (Pharmacia, Uppsala, Suède), équilibrée dans un tampon tris-HCl 10. mM de pH 8, 0, contenant 2 mM d'EDTA. On a
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é1ué la matière 1iée de la colonne avec le tampon d'équi1ibrage eontenant du chlorure de sodium 0, 8 mM. On a recueilli les fractions (8, 0 ml), on les a testées quant ä leur activite de FNTa INH et on a rassemble les
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fractions inhibitrices (160 ml) et on les a dialysées vis-ä-vis d'un tampon ä l'acetate de sodium 10 mM de pH 5, 0 (4 x 2 litres).
On a davantage purifié le FNTa INH par une chromatographie d'échange de cations, à 4 , sur une colonne de sulfopropyl-sephadex (0, 8 x 15 cm) (Pharmacia, Uppsala, Suède) équilibrée dans un tampon ä l'acétate de sodium 10 mM de pH 5, 0. On a elue la matiere liée de la colonne avec le tampon d'equilibrage contenant du chlorure de sodium 0, 5 M. On a recueilli des fractions (7, 5 ml), on en a teste l'activité de FNTa INH et on a rassemblé les fractions inhibitrices et on
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les a concentrées 20 fois sur un appareil d'ultrafiltration Amicon avec une coupe d'un calibre moleculaire d'environ 10 kDa.
Exemple 5 Filtration à travers gel du FNTa INH urinaire
On a purifié le concentra de FNTa INH de l'exemple 4 par chromatographie ä filtration A travers gel à 40 sur une colonne de Sephacryl S-200 (2, 6 x 100 cm)
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(Pharmacia, Uppsala, Suède), équilibrée avec un tampon tris-HCl 50 mM de pH 7, 4 contenant du chlorure de sodium 10 mM. On a appliqué un échantillon de la fraction proteinique de l'exemple 4 (2000 mg) à la colonne et on l'a élué avec le tampon d'equilibrage a un debit de 27 ml/heure. On a recueilli des fractions (9, 0 ml), on en a test l'activite de FNTa INH et on a rassemble les fractions inhibitrices.
On a calibré la colonne avec du bleu de dextrane (BD), 2000 kDa, de l'albumine de sérum bovin (ASB), 67 kDa, de l'ovalbumine (OA), 43 kDa, de l'α-cymotrypsinogène-A (αCT), 25 kDa et de la ribonucléase A (RNase), 13, 5 kDa, comme la figure 4 le montre.
Exemple 6 Chromatographie d'affinité du FNTa INH urinaire
On a prepare la colonne d'affinité de FNTα en
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couplant du FNTa humain recombinant (1, 0 mg) à de la gélose Mini Leak (Kern En Tee, Biotechnology Corp., Danemark) dans un tampon au phosphate de potassium 0, 8 M de pH 8,6. On a bloqué les radicaux actifs résiduels par incubation dans un tampon d'ethanolamine-HCl 0, 1 M d'un pH de 8,5.
On a lavé le gel avec un tampon au tris-HCl 50 mM d'un pH de 7,4, contenant du chlorure de sodium 100 mM (3 x 50 ml). On a appliqué un échantillon des fractions de FNTa INH de l'exemple 5 (15 ml) a la colonne et on a procédé ä l'elution avec un tampon à la glycine-HCl 0, 2 M de pH 3, 5. On a rassemblé les fractions (1, 0 ml), on les immediatement ajustées à un pH de 7, 0 par l'addition de tris 1M (5 ä 40 l) et on les a testées quant à leur activite de FNTα INH.
Exemple 7 Chromatographie FPLC à phase inverse du FNTα INH urinaire
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On a lyophilisé les fractions de FNTIa INH de l'exemple 6, on les a dissoutes dans de l'acide trifluoracétique à 0,1% (2,0 ml) et on les a chargées sur une colonne de FPLC à phase inverse ProRPC (5 x 20 cm) (Pharmacia, Uppsala, Suede), équilibrée dans de
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l'acide trifluoracetique ä 0, 1%. On a éluE la matiere liée avec un gradient d'acetonitril de 0 ä 100% dans de l'acide trifluoracétique à 0,1%, au debit de 0, 3 ml/minute. On a ajouta du bicarbonate d'ammonium 0, 5M (10 pl) à chaque fraction (0, 75 ml) et on a lyophilise la matière éluée.
La chromatographie FPLC à phase inverse révéla un pic majeur correspondant à l['activité de FNT INH. On a dissous les fractions lyophilises contenant cette activité dans un tampon au tris-HCl 10 mM de pH 7,4, contenant de l'EDTA 2 mM et on les a analysées par électrophorèse sur gel de polyamide- dodecylsulfat de sodium (SDS PAGE) en se servant du procédé décrit par U. Laemmli et coll., Nature, 227, p680 (1970). On a constaté que le FNTa INH s'fluait avec un poids moléculaire de 33 kDa (voir figure 4).
Les échantillons obtenus dans des conditions non réductrices furent testés quant a leur activité de FNTa INH à une dilution de 1 : 10 sur des cellules L929, en presence de
0, 15 mg/ml de rhFNTa. L'activité dirigée contre rhFNTa migra avec le poids moleculaire apparent identique à la bande 33 kDa sur l'essai sur gel dans des conditions reductrices.
Exemple 8 Séquençage proteinique du FNTa INH urinaire
On a concentre la fraction de FNTa INH, isolee ä partir de la chromatographie de FPLC à phase inverse, sous vide et on l'a portee sous forme de taches sur un filtre sequenceur conditionne. On a analys6 la proteine par un séquenceur de proteinen Applied Byosystems Modele
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477A. On a évaporé les fractions des cycles séquenceurs jusqu'à siccité et on les a remises en suspension dans de l'acetate de N, N-diisopropyléthylamine et de l'acétonitrile, préalablement à l'injection dans une colonne de chromatographie en phase liquide à pression élevée ou haute performance, en vue de l'identification du residu.
On a identifié les premiers 17 restes d'aminoacides du N-terminal et ceux-ci répondaient ä la séquence : Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Cys- Asn-Ser-11e. On suppose également que les trois aminoacides suivants fournissent un site de glycosylation et que la séquence se poursuit ainsi : Asn-Ser-Thr-Lys. Cette séquence niest pas notablement homogène vis-ä-vis de n'importe quelle séquence pro- téinique contenue dans une base de donnees de sequences protéiniques NBRF (nouvembre 1988).
Exemple 9 Démonstration que le FNTα INH est une Démonstration que le FNTα INH est une protéine a) Dependance de la duree et de la temperature
On a chauffe le FNTA INH purifie sur Sephacryl S- 200 de l'exemple 2, obtenu en rassemblant les tubes des fractions actives, ä 56 , 75 et 95 . On a mesure 1'activité de FNTα INH apres 10,20 et 60 minutes et, par comparaison ä des échantillons non traités, on a calculé le pourcentage d'activité de FNTα INH suivant la formule (I). Les résultants présentés dans le tableau 2 qui suit démontrent que l'activité du FNTa INH diminue d'une manière qui dépend du temps et de la temperature.
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<tb>
<tb>
Inactivation <SEP> ä <SEP> la <SEP> chaleur
<tb> Pourcentage <SEP> d'activité <SEP> de
<tb> Température <SEP> ("C) <SEP> Temps <SEP> (min) <SEP> FNT* <SEP> INH
<tb> 10 <SEP> 100
<tb> 56 <SEP> 20 <SEP> 100
<tb> 60 <SEP> 93
<tb> 10 <SEP> 60
<tb> 75 <SEP> 20 <SEP> 26
<tb> 60 <SEP> 15
<tb> 10 <SEP> 27
<tb> 95 <SEP> 20 <SEP> 10
<tb> 60 <SEP> 13
<tb>
b) Sensibilité ä la digestion par 1a trypsine
On a ajouté de la trypsine (500 pg) (Sigma, St.
Louis, MO, E. U. A.) dans un tampon tris 0, 2M (pH de 8, 0) contenant du chlorure de calcium ImM aux fractions réunies de FNTa INH urinaire purifié sur Sephacryl S-200 de l'exemple 2 et on a incubé le tout ä 37 C pendant 4 heures. On a ajout6 une autre proportion de trypsine (500 pg) et on a poursuivi la digestion pendant 20 heures supplémentaires, periode au bout de laquelle on a terminé la réaction par l'addition d'inhibiteur de trypsine de soja (2 mg) (Sigma, St. Louis, MO, E. U. A.).
On a déterminé le pourcentage d'activité inhibitrice de FNTa INH du produit digéré ä la trypsine et du témoin, à une dilution finale 1 : 20 de l'ensemble des fractions réunies, sur des cellules L929 stimulées par du rhFNTa, en présence d'actinomycine D, suivant la formule (I). Les résultats apparaissent dans le tableau 3 qui suit.
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<tb>
<tb>
Inactivation <SEP> trypsinique
<tb> pourcentage <SEP> d'activitê
<tb> Conditions <SEP> de <SEP> FNTα <SEP> NINH <SEP> DO <SEP> zo
<tb> Tampon <SEP> seul <SEP> 0 <SEP> 0. <SEP> 71
<tb> Trypsine+inhibiteur <SEP> de
<tb> trypsine <SEP> de <SEP> soja <SEP> dans
<tb> tampon <SEP> 0 <SEP> 0. <SEP> 70
<tb> Urine, <SEP> purification
<tb> partielle <SEP> sur <SEP> Sephadex <SEP> S-200 <SEP> 61 <SEP> 1. <SEP> 46
<tb> Urine, <SEP> purification
<tb> partielle <SEP> sur <SEP> Sephadex <SEP> S-200 <SEP> avec <SEP> digestion <SEP> par <SEP> trypsine <SEP> 23 <SEP> 1. <SEP> 03
<tb>
EMI31.2
c) Traitement par l'urgée
On a ajusté le FNT INH purifié sur Sephacryl S-200 de l'exemple 2 jusqu'à 2M d'uree et on l'a intensivement dialyse ä 4 vis-à-vis d'une solution saline tamponnée au phosphate (STP) contenant de l'urée 2M.
On a répété la dialyse vis-ä-vis de STP préalablement au biotitrage.
On a constaté que l'activiste de FNTa INH n'était pas affectée, ce qui indique que l'activité inhibitrice n'est pas provoquée par une molécule de faible poids moléculaire 1iée a une proteine.
Exemple 10 Démonstration de l'inhibition competitive
On a testé le FNTa INH purifié sur Sephacryl S-200
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de 1.' exemple 2, a une dilution de 1 : 10, vis-a-vis de quantites croissantes de rhFNTa sur cellules L929. On a observé une correlation inverse entre la quantité de rhFNTa presente dans le titrage et le degré d'inhibition
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(voir figure 3). Par consequent, l'activité inhibitrice est competitivement palliée par des concentrations croissantes de rhFNTa.
Exemple 11
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Inhibition de la production de PG, due au FNTa par des fibroblastesdermiques
On a ensemence des fibroblastes dermiques humains à une concentration de 2, 0 x 10 cellules/puits et on les a cultivées pendant 48 heures. On a ensuite stimule les cellules avec un tampon DMEM complété de 10% de SVF ä titre de témoin.
On a également stimulé les cellules avec du rhFNTa en concentrations variant de 0,5 à 5 mg/ml et on a étudié l'effet du FNTa INH de l'exemple 5 a trois dilutions (1 : 20, 1 : 50 et 1 : 80) dans le tampon susmentionne. après une incubation de 72 heures, on a mesuré la production de PGE2 dans les couches surnageantes, par un radio-immunotitrage, en utilisant de l'antiserum de PGE2 [voir J M Dayer et coll., J.
Clin. Invest., 64, p1386 (1979) J.
Les résultats sont présentés dans le tableau 4 cidessous et démontrent que le pouvoir du rhFNTa à stimuler la production de PGE2 par des fibroblastes dermiques fut inhibé par l'addition de FNTα INH dans les trois dilutions précitées. A la dilution de 1 : 80 du FNTa INH, l'activité inhibitrice fut partiellement palliée par l'elevation des concentrations en rhFNTa.
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<tb>
<tb>
Concentration <SEP> de <SEP> Production <SEP> de <SEP> PGF2par <SEP> des <SEP> fibroblastes <SEP> dermiques
<tb> rhFNT <SEP> sur <SEP> des <SEP> fi <SEP> humains <SEP> (ng/ml)
<tb> broblastes <SEP> humains <SEP> Dilution <SEP> de <SEP> FNTα <SEP> INH <SEP> sur <SEP> fibroblastes
<tb> (P9/ml)
<tb> néant <SEP> : <SEP> 80 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 50 <SEP> 1 <SEP> :
<SEP> 20
<tb> 5 <SEP> 0 <SEP> 50.6 <SEP> ¯ <SEP> 7.4 <SEP> 88.8 <SEP> ¯ <SEP> 5.6 <SEP> 103.0 <SEP> ¯ <SEP> 8.9 <SEP> 111.0 <SEP> ¯ <SEP> 9.4
<tb> 500 <SEP> 60.0 <SEP> ¯ <SEP> 14.1 <SEP> 126.0 <SEP> ¯ <SEP> 9.3 <SEP> 115.9 <SEP> ¯ <SEP> 6.6 <SEP> 113.9 <SEP> ¯ <SEP> 7.1
<tb> 2.000 <SEP> 331.7 <SEP> ¯ <SEP> 28.4 <SEP> 217.2 <SEP> ¯ <SEP> 10.7 <SEP> 156.7 <SEP> ¯ <SEP> 10.7 <SEP> 115.3 <SEP> ¯ <SEP> 21.3
<tb> 5.000 <SEP> 381.7 <SEP> ¯ <SEP> 19.7 <SEP> 257.2 <SEP> ¯ <SEP> 13.7 <SEP> 253.1 <SEP> ¯ <SEP> 21.2 <SEP> 221.6 <SEP> ¯ <SEP> 16.0
<tb>
On a réalisé trois expériences différentes avec la même souche de fibroblastes. On a incubé le tampon ou le FNTα INH ä diverses dilutions, en presence ou en l'absence de diverses concentrations de rhFNTa.
La production de PGE2 par des fibroblastes dermiques humains cultivés fut mesurée au bout de trois jours. Les valeurs obtenues représentent les moyennes de triples essais des trois cultures ESM (N=3).
Exemple 12 Titrage de l'inhibition de liaison du rhFNTa
On a iodé du FNTa humain recombinant en utilisant le procédé ä 1'iodogène de Fraker et Speck jr., Biochem.
Biophys. Res. Comm., 80, p849 (1978). L'activité spécifique du -U-FNTa fut de 2,2 x 104 cpm/ng et produisit une bande unique avec un poids moleculaire de 10 kDa lorsque soumis ä l'analyse par SDS-PAGE. On a cultivé la lignée de cellules macrophages humaines U937 en fractions aliquotes de 106 cellules, à 4OC, pendant deux heures, dans un milieu de culture (200 pl) comprenant du RPMI 1640 (Gibco, Paisley, Ecosse)
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complété de streptomycine (100 mg/mI), de pénicilline (100 U/ml), 1, 0% de glutamine et 10% de serum de veau foetal et contenant, de surcrolt, 0, 04% d'azoture de sodium et 0, 5 ng de [125I]-FNTα
.. On a réalisé l'inhibition de liaison par l'addition de diverses dilutions de FNT1 INH (1 : 20, 1 : 200 et 1 : 2000).
On a mesuré la liaison aspécifique en presence d'un exces centuple de rhFNTa non marqué et on a séparé la radioactivité libre du [125 17-FNTa lié par centrifugation par l'intermédiaire d'un melange d'huiles, comme l'ont décrite Robb et coll., J. Exp.
EMI34.1
Med., 154, p1455 (1981).
On a mesuré le Z 17-FNTa lié aux cellules dans un compteur gamma (LKB, Bromma, Suede) et on a déterminé le pourcentage d'inhibition de liaison selon la formule (II) Pourcentage d'inhibition de la liaison = cpm avec FNTα INH - cpm de liaison spécifique 100 x 1 - cpm de liaison totale - cpm de liaison spécifique (11) Exemple 13
EMI34.2
125 Effet du FNTA INH sur la liaison du C-125 Ll-FNTn aux cellules U937
On a pre-incubé des cellules U937 pendant une heure ä 200 dans 1e milieu de culture de l'exemple 12, en présence soit de cl FNT seul, soit de [125 I]-FNTα avec un exces centuple de rhFNTa non marque. On a ensuite lavé les cellules U937 avec une solution saline tamponnee au phosphate (3 x 50 ml) ä 40.
On a divisé les
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.-125 cellules incubees dans du ze FONT seul en quatre lots que l'on a incubés avec du ENTA INH de l'exemple 5
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(dilutions 1 : 20, 1 : 200 et 2 : 2000) et avec un tampon seul respectivement.
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.-125 On a constaté que la liaison spécifique de 25 t7 FNTa aux cellules U937 était inhibée ä 4 , a 100%, 80% et 35%, par les trois dilutions du FNTα INH 1 : 20, 1 : 200 et 1 : 200 respectivement (voir figure 5). Le lot témoin qui ne comprenait pas de FNTa INH ne manifesta pas d'activité inhibitrice. Llinhibition de la liaison des deux dilutions les plus faibles se trouva etre augmentée
EMI35.2
J. 25 jusqu'ä 90% et 60% lorsque l'on pre-incuba le U- FNTa avec du FNTa INH ä des dilutions de 1 : 200 et 1 : 2000 respectivement, prealablement ä l'addition des cellules.
On a répété l'expérience en utilisant les cellules
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- 125 pré-incubées en présence de 17-FNTa et un exces centuple de FNTa non marque, de façon à ce que le pourcentage d'inhibition de liaison pût être corrigé pour la liaison aspecifique.
Exemple 14
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Dissociation d'un complexe FNTa : U937 préformé On a pré-incubé des cellules U937 pendant une heure 125 en presence de/* 17-FNTa comme decrit ä l'exemple 12. On a lava les cellules et on les a incubas à 40 ou ä 37 en presence ou en l'absence de FNTa INH de l'exemple 125 5.
On a constaté que le 2 17-FNTa li6 a la surface des cellules se dissociait plus rapidement en présence de FNTa INH qu'en son absence et on a constaté que ceci se produisait d'une maniere dependant de la durée et de la température (voir figure 6). exemple 15 Demonstration que le FNTa INH n'est pas proteolytique
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pour le rhFNTa On a incube du 2517-FNTa & 20* pendant une heure, en presence de trois dilutions differentes de FNTa INH
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(1 : 20, 1 : 200 et 1 : 2000) et en présence d'un tampon seul. Lorsqu'analysé par SDS PAGE et autoradiographie, on constata que le 17-FNTa migra sous forme de bande unique, tant en l'absence qu'en présence de FNTα INH, montrant que l'inhibiteur n'avait pas d'effet protéolytique.
Exemple 16 Effet du FNTa INH sur l'activité de liaison du récepteur IL-1
On a testé l'activité du FNTa INH de l'exemple 5 au cours du titrage du IL-1/FAL (facteur d'activation des lymphocytes) apres induction par IL-la ou IL-1ss [ce titrage est décrit par P. Seckinger et coll., J.
Immunol., 139, p1541 (1987) pour une proteine d'inhibiteur IL-U. On a observé une reponse ä la dose
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d'incorporation de H/-thymidine (correspondant ä une proliferation de thymocytes) dans des concentrations allant jusqu'ä 200 pg/ml des deux formes IL-la et IL-ass.
L'addition de FNTa INH ä des taux dont on avait observé l'inhibition du rhFNTa n'eut aucun effet notable sur la prolifération des thymocytes induites au IL-1, prouvant
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ainsi que l'inhibition etait spécifique pour le FNTa seulement.
Les résultants obtenus sont illustres en référence aux dessins ci-annexés, dans lesquels :
La figure l represente le profil de l'activité du FNTa INH urinaire par filtration sur gel de Sephacryl S- 200. On a testé des fractions de colonne (l ml) ä une dilution de 1 : 10 pour réaliser le titrage de la cytotoxicité du rhFNTa (1, 0 ng/ml), en presence d'actinomycine D (oxo). La ligne ( ) représente la DO0nm des fractions. Les barres représentent la lyse de cellules mesurée par prise de colorant en réponse ä
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l'actinomycin D () et ä l'actinomycine D plus rhFNTa (t) sans urine.
Les marqueurs du poids moleculaire sont le bleu de dextrane (BD), l'albumine de serum bovin (ASB), l'ovalbumine (OA), l'a-chymotrypsinogene (aCT), la ribonucléase A (RNase) et le rouge de phénol (+ - rouge).
La figure 2 représente le profil de l'activité du FNTa INH urinaire de la chromatofocalisation sur une colonne de Mono-P. On a testé des fractions de colonne (1 ml), à une dilution de 1:10, en vue de déterminer leur effet au cours du titrage de la cytotoxicité de
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rhFNTa (0, 2 ng/ml) en présence d'actinomycin D (1, 0 pg/ml) (0----0). La ligne ( ) représente la DOdes fractions et (----) represente leur pH. Les barres ont la même signification que celle indiquée ä propos de la figure l.
La figure 3 représente la reversibilité de l'activité du FNTa. INH. Les cercles ouverts (o-o) représentent la DO570nm, mesurée en présence d'actinomycine D, de rhFNTa et de FNTa INH ; les cercles
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fermes (0.) représentent la DOe, mesuree en presence d'actinomycine et de rhFNTa seulement et la barre (S) represente la D570nM en présence d'actinomycine D (1, 0 ng/ml) seule.
La figure 4 représente le profil d'élution par filtration ä travers gel de Sephacryl S-200 avec du FNTa INH purifié de l'exemple 5. On a stérilisé des fractions de colonne (9 ml) et on les a testées, ä une dilution de 1 : 50, vis-ä-vis de rhFNTa (1, 0 mg/ml) en présence d'actinomycine D (1, 0 pg/ml), en présence d'actinomycine D (1, 0 pg/ml) au cours du titrage de la cytotoxicité
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avec L929 (0----0). La 1igne () représente la DOnn des fractions. Les barres ont les memes 280nm
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significations que celles indiquées ä propos de la figure l.
La figure 5 montre l'analyse par SDS PAGE du FNTa INH purifiE de l'exemple 7. On a réalisé la SDS PAGE de la manière décrite par U. Laemmli et coll., Nature, 227, loc. cit. On a chargé des echantillons sur un gel de polyacrylamide ä 15% avec un gel de chargement et on a colore les gels ä l'argent de la maniere décrite par C.
Merril et coll., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, p4335 (1979). Des échantillons issus de conditions non
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réductrices ont été test quant & l'activit6 biologique en decoupant des tranches de 2mM du gel et en éluant les proteines par incubation jusqu'au lendemain dans du tris-HCl 10 mM de pH 7, 4 contenant 2 mM d'EDTA (volume total : 200 1). On a testé les fractions, à une dilution de 1 : 10, sur des cellules L929, en présence de rhFNTa (0, 15 ng/ml).
La figure 6 montre l'effet du FNTα INH sur la liaison du 25l7-FNTa à des cellules U937. On a incubé le FNTa INH, à trois dilutions differentes, en présence de 25tl-FNTa avec la lignée de cellules U937, telle que décrite à l'exemple 13. Les carrés ouverts (@-@) représentent l'incubation en presence de FNTa INH et les triangles ouverts (^ ^) représentent le témoin. Les mêmes symboles fermes se rapportent à une pré-incubation du FNTa INH, ä 20 et pendant 30 minutes, avec du [125I]-FNTα dans le milieu de culture, avant de procéder àl'additiondescellules.
La figure 7 représente la dissociation d'un complexe FNTa : U937 préformé. On a pré-incubé des 125 cellules U937 avec du [125I]-FNTα, on les a lavées et incubees avec du FNTa INH, de la même manière que celle
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décrite ä l'exemple 14, soit ä 4 (@-@), soit à 37 - Au moment indique, on a mesure la radioactivité associée aux cellules et on a déterminé le pourcentage de liaison spécifique. Sur le graphique, la valeur. obtenue avec le t6moin sans l'inhibiteur a été soustraite des valeurs obtenues aux deux températures, par conséquent 100% correspond ä la valeur obtenue sans addition de FNTa INH.
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The present invention relates to a novel protein having an inhibitory effect against the activity due to tumor necrosis factor a, the isolation and purification of a protein of this kind. from natural sources, to its preparation by manipulation of DNA and to the use of a protein of this type for the treatment of conditions associated with excessive or unregulated production of FNTa.
Tumor necrosis factor (FNT) is an activity carried out by a family of at least two proteins, a and ss, which are cytotoxic to tumor cells and which inhibit their growth in culture. Carswell et al. "An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors", Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 72, p3666 (197517.
Tumor necrosis factor α (FNT α), also called "cachectin", is primarily produced by cells of the monocyte / macrophage line in response to "stress" signals that accompany invasive stimuli, such as bacteria, viruses, tumors and other toxins.
FNTss, commonly called "lymphotoxin", is mainly produced by lymphoid cells. The
FNTss has many activities similar to those of FNTss, but appears to be less potent, although this could result from difficulties encountered during the preparation of pure FNTss.
The FNTa is involved in and participates in a wide range of biological activities. Beutler et al., "Identity of tumor necrosis factor and factor, cachectin, secreted by macrophages", Nature, 316, p552 (1985) J, sharing several of them with interleukin-1 (IL-1 ) #J. Le et al;, "Tumor necro-
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sis factor and interleukin 1:
cytokines with multiple overlapping biological activities ", Laboratory Invest., 56, p234 l198?) /. High levels of FNTa induced, for example, by tumor cells can lead to weight loss and cachexia, and it has also been found that FNTa also intervened as the main intermediary, in endotoxic shock (septic shock) which can be fatal.
Other biological effects of FNTa include hypotension, fever (induced by stimulation of the synthesis of hypothalamic prostaglandin E2 (PGE2)), coagulopathy (caused by stimulation of vascular endothelial cells which release, for example tissue factor ) and tissue destruction (induced, for example, by stimulation of a series of proteinases, including collagenase generated by synovial cells and dermal fibroblasts) Z'C. Dinarello et al., "The tumor necrosis factor (cachectin) is
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an endogenous pyrogen and induces the production of interleukin-1 ", J. Exp. Med., 163, p1433 (1986); J.
Dayer et al., "Cachectin / tumor necrosis factor stimulates the production of collagenase and prostaglandin E2 by synovial cells and human dermal fibroblasts", J. Exp. Med., 162, p2163 (198511.
Therefore, there is a need for the development of a cachectin / FNTa inhibitor which prevents endotoxic shock, cachexia and the other deleterious effects described above. It has been shown that passive immunization of animals against cachectin can prevent endotoxin-induced death due to the intervention of FNTa ± B antibodies. Beutler et al., Nature, 316, supra7.
The Applicant has now identified a new protein which has a potent inhibitory effect against activities due to the intervention of FNT α without inhibition
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significant concomitant of the activity due to IL-1. This protein will be identified in the remainder of this document under the name of inhibitor of tumor necrosis factor α (FNT α INH).
Consequently, in accordance with one of its characteristics, the present invention relates to a protein which selectively inhibits activity due to the tumor necrosis factor a. As used in this memo. the expression "selective inhibition", as presented by the inhibitor in accordance with the present invention, identifies with the ability to block the activity due to FNT, in the absence of the ability to block other proteins which have in common with the FNT, some, but not all of the biological activities of the FNT, such as IL-1.
Preferably, the inhibitor of tumor necrosis factor a in accordance with the present invention is in a substantially homogeneous form, essentially free of major contaminating substances and / or essentially free of any other material.
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protein or protein.
It has been found that the inhibitor of tumor necrosis factor a according to the present invention has one or more of the following characteristics: (a) molecular weight varying from 40 to 60 kDa, as determined by chromatography on molecular sieves,
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(b) isoelectric point (pl) varying from 5.5 to 6.1, as determined by chromatofocusing, (c) inhibition of the standard FNT titer of differential cytotoxicity for murine L929 cells treated with actinomycin D, as described by G.
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Nedwin et al. "Effects of interleukin-2, interferon-y, and mitogens on the production of
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tumor necrosis factors a and ss ", J.
Immunol., 135, p2492 (1985), this inhibition can be overcome by additional addition of FNTa, indicating that the inhibition is competitive. The inhibitor is also an inhibitor of FNTss activity, although inhibition of FNTa during this titration is more efficient than that of FNTss, (d) inhibition of FNT-induced release of PGE2 induced by FNT from cells synovials and human fibroblasts, (e) the inhibitor causes interference with the binding of FNTa to U937 cells (a monocytic tumor line ", as can be demonstrated by
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125 inhibition of binding of the radiolabelled FNTa (125 1-FNTa); (f) dissociation of a complex of U937 cells:
FNT α preformed is favored by the inhibitor in a temperature-dependent manner, (g) the inhibitor does not cause degradation of FNT by proteolytic cleavage, (h) the inhibitor does not inhibit the binding activity of IL-1 receptor, for example the binding of IL-1
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125 radiolabelled (125 I-IL-la) at the murine thymoma EL-4-6 sub-line. 1.
The Applicant has discovered that the protein according to the invention, when it was further purified, had a molecular weight of approximately 33,000 daltons, as determined by polyacrylamide-sodium dodecylsulfate gel electrophoresis (SDS PAGE).
Consequently, according to another of its characteristics, the invention also relates to a protein which selectively inhibits the activity due to FNTa, which has one or more of the following characteristics:
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(a) a molecular weight of approximately 33 kDa, as determined by SDS PAGE, (b) an isoelectric point (pI) which varies from 5.5 to 6.1, as determined by chromatofocusing, (c) an inhibition of the titer in standard FNT of differential cytotoxicity for murine cells EL929, treated with actinomycin D, as described by G. Nedwin et al; "Effects of interleukin-2, interferon-Y and mitogens on the production of tumor necrosis factors a and ss", J. Immunol., 135, p2492 (1985).
This inhibition can be overcome by additional addition of FNTA, indicating that the inhibition is competitive. The inhibitor is also an inhibitor of activity due to FNTss, although the inhibition of FNTa during this titration is more effective than that of FNTss, (d) an inhibition of the release of PGE2 induced by FNT from synovial cells and human fibroblasts, (e) the inhibitor interferes with the binding of FNTa to U937 cells (a monocytic tumor line), as demonstrated by inhibition of the binding of radiolabelled FNTa (125 1FNTa), (f) the dissolution of a complex of U937 cells:
Preformed FNTa is favored by the inhibitor, in a temperature-dependent manner, (g) the inhibitor neither alters nor degrades FNT by proteolytic cleavage, (h) the inhibitor does not inhibit activity binding of the IL-1 receptor, for example the binding of radiolabeled IL-1 (125 I-IL-1 α) to the murine tymoma subline EL4-6, 1.
Preferably, the TNFa INH according to the present invention possesses the two characteristics (a) and (b)
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and one or more of the characteristics (c) to (h).
More particularly, the FNTa INH according to the present invention has all the characteristics (a) to (h).
The protein according to the invention has an amino-terminated amino acid sequence, as follows:
Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-
Pro-Gln-Cys-Asn-Ser-Ile
It is also assumed that the following three amino acids provide a glycosylation site and that the sequence continues as follows: Asn-Ser-Thr-Lys.
It should be understood that an FNT & alpha inhibitor; in accordance with the present invention will also comprise an amino acid sequence corresponding substantially to the sequence of the FNTa INH, natural and containing an amino terminus sequence substantially identical to that described above.
The sequence of the FNTa inhibitor in accordance with the present invention will therefore be identical to the sequence of the natural FNTa INH, or will contain one or more omissions, substitutions, insertions, inversions or additions of allelic origin, or, in another way, the resulting sequence will comprise at least 80% and, preferably, 90%, of homology with the sequence of the natural FNTa INH and will preserve essentially the same biological properties as those of the protein in question.
The FNTa inhibitor according to the present invention has been shown to be protein in nature, in that it is inactive by heating in a time and temperature dependent manner and is destroyed by treatment with trypsin or pronase.
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The FNTa INH according to the present invention has also been shown to be a glycoprotein, since
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that treatment with the enzyme that is endoglycosidase F reduced the molecular weight by 7 to 8 kDa.
According to yet another of its characteristics, the present invention therefore relates to an FNTa inhibitor as defined in the present specification, but which is in a substantially aglycosylated state.
The inhibitors according to the present invention are of interest for the treatment of conditions in which it is desirable to inhibit the activity of FNTa, for example, those which arise as a result of the effects of FNTa, such as weight loss, shock, cÅachexia and chronic local inflammation, active chronic polyarthritis, disseminated intravascular coagulation and nephritis.
According to another of its characteristics, the present invention also relates to an FNTa inhibitor, as defined in the present specification, or a pharmaceutically acceptable derivative of this inhibitor, with a view to using it as a therapeutically active agent, more particularly, for the treatment of conditions associated with excessive or unregulated production of FNTa.
According to yet another of its characteristics, the invention also relates to a method for treating conditions associated with excessive or unregulated production of FNTa in a mammal, including humans, characterized in that one administers this mammal. an effective amount of an FNTa inhibitor as defined herein, or a pharmaceutically acceptable derivative of this inhibitor.
According to another of its characteristics, the invention also relates to the use of
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the inhibitor of FNTa as defined herein or of a pharmaceutically acceptable derivative of this inhibitor, for the manufacture of a medicament intended for the treatment of conditions associated with excessive or unregulated production of FNTa.
Those skilled in the art will understand that the reference made in this specification to
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treatment extends to both prophylaxis and the treatment of established symptoms or conditions.
It should also be appreciated that the amount of FNTa inhibitor according to the present invention which it is necessary to use for treatment will vary, not only with the mode of administration, but also with the nature of the condition. treat and with the agie and the condition of the patient and that this quantity ultimately results from the decision of the veterinarian or the attending physician. In general, however, an appropriate dose will usually vary from about 5.0 to 500 tig per kilogram of body weight per day, for example, from 30 to 300 pg / kg / day, preferably from 50 to 150 g / kg /day.
The desired dose can conveniently be presented as a single dose, or as subdivided doses, which are administered at intervals. suitable, for example, as two, three, four and more than four divided doses, per day.
Although it may be possible that, for use in the therapeutic field, an FNTa inhibitor according to the invention is administered in the form of the crude protein, it is preferable to present the active protein in the form of a pharmaceutical composition. Consequently, the subject of the present invention is also a pharmaceutical composition comprising an FNT α inhibitor, as defined herein, or a pharmaceutically acceptable derivative of this inhibitor,
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together with one or more pharmaceutically acceptable vehicles or excipients and, optionally, other therapeutic and / or prophylactic ingredients.
The vehicle (s) or excipients must be "acceptable" in the sense of being compatible with the ingredients of the composition and of perfect harmlessness for the patient or the patient.
The inhibitors according to the present invention can therefore be presented for administration by the parenteral route (by injection, for example continuous infusion or injection of bowls) and they can also be presented in the form of unit doses in ampoules, pre-filled syringes, small volume infusions, or in containers that contain multiple doses with additional preservative. The compositions may take forms such as suspensions or solutions in aqueous vehicles and may contain composing agents, such as suspending, stabilizing and / / dispersing agents.
Alternatively, the active ingredient can also be in the form of a powder which is obtained by aseptic isolation of the sterile solid or by lyophilization from a solution, with a view to reconstituting a composition which can be used using a suitable vehicle, for example pyrogen-free, sterile water, before using the medicine.
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The FNTa inhibitor according to the present invention can also be used in combination with other therapeutic agents, for example other cytokines or FNTa inhibitors.
The invention therefore also has as an object, according to another of its characteristics, a combination comprising an FNTa inhibitor, as defined in the present specification, or a pharmaceutical derivative.
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acceptable for this inhibitor, together with another therapeutically active agent, for example other cytokines or FNTa inhibitors.
The proteins according to the present invention can be prepared by purification from natural sources and, when it appears to be suitable, this operation can be followed by a chemical modification, or they can be prepared by well known conventional methods. technical specialists involved in the preparation of proteins, for example using recombinant DNA techniques.
. According to yet another of its characteristics, the present invention also relates to a process for the production of an inhibitor of tumor necrosis factor a, in accordance with the present invention, by purification from natural sources, more particularly urine from human fever patients.
Such purification includes, for example, the steps of concentrating crude urine from human fever patients, precipitation of crude FNTa INH from urine and fractionation of FNTa INH from other proteins in this precipitate, by or more pathways consisting, for example, of ion exchange column chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobicity chromatography, immuno-absorption and affinity chromatography on immobilized FNTa.
The tumor necrosis factor inhibitor a according to the present invention is also obtained from human tissue containing macrophages, for example the residues of pulmonary washes and extracts of human liver, from which it can be obtained by standard purification techniques, such as those described above.
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The natural and recombinant FNT INH, which is produced by implementing the methods described in this specification, can be purified by a whole series of steps as listed above. After each purification step, the presence and purity of the FNT INH can be determined and measured by a cytotoxicity assay, in the presence of actinomycin D (acti D) using a line of L929 cells sensitive to FNT, as described by G.
Nedwin et al., J. Immunol., 135, loc. cit.
According to a preferred embodiment of the method. FNTa INH is initially isolated from untreated urine, collected from human fever patients te 38.5 C), free of urinary tract infections, using a standard concentration technique, for example ultrafiltration. A crude fraction can then be precipitated from the crude urine, using ammonium sulphate, for example by adding ammonium sulphate in a concentration of 80% (w / v), at 4 ° C., under agitation. Preferably, the ammonium sulphate can be added in a staggered manner and the precipitated material can be removed at lower concentrations (for example 40% (w / v).
Ammonium sulfate can be removed by dialysis and the fraction can be purified
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resulting in separating FNJINH from other dt proteins by a variety of chromatographic procedures.
Thus, one can purify the concentrate of FNT α INH by ion exchange chromatography, which separates proteins according to their differences in electrical charge, which. is a reflection of the acid / base properties of proteins. Suitable materials for anion exchange chromatography include aminoethylcellulose derivatives, for example quaternary aminoethylcellulose (QAE-cellulose) or diethylaminoethylcellulose (DEAE-cellu10se) which are
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widely used commercially. The column of anion behänge must be balanced before applying the concentrate, using a suitable buffer, such as tris-HCl, possibly containing a chelating agent, such as EDTA.
The bound material can be eluted from the column using a salt solution (eg 0.8 M sodium chloride, which is completed with the equilibration buffer).
The active fractions from the anion exchange chromatography are collected. Materials suitable for cation exchange chromatography include cellulose derivatives, such as carboxymethyl (CM) cellulose, or sulfopropylsepharose (Pharmacia, Uppsala, Sweden). The column must be equilibrated with a suitable buffer, such as sodium acetate and the vine material can be eluted with the equilibration buffer containing, for example, 0.5 M sodium chloride.
The combined active fractions are further purified by affinity chromatography on bound recombinant human FNTa (rhFNTa), bound to an appropriate matrix, for example mini-leak agarose (Kern En
Tee, Biotechnology Corp., Denmark). The column should be buffered using, for example a phosphate buffer (e.g. 0.8M potassium phosphate pH
8, 6). The active groups not linked to rhFNTa must be blocked using an ethanolamine-HC1 buffer of pH 8.5. The column must be equilibrated with an appropriate buffer, for example tris-HCl, optionally containing sodium chloride and FNTa INH must
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be eluted with acid glycine buffer (pH 3.5).
The eluted fractions should be immediately equilibrated to a pH of 7.0 by the addition, for example, of Tris base.
The active fractions collected are, from
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preferably lyophilized before the final purification stage of reverse phase FPLC (FPLC; fast protein liquid chromatography). Before application to the FPLC column, the lyophilized FNTa INH fraction should be buffered with a suitable buffer, such as trifluoracetic acid (TFA) (Fulka, Buchs, Switzerland), heptafluorobutyric acid (HFBA) or acid acetic. Elution of FNTa INH from the FPLC column can be carried out using conventional techniques, for example, by supplementing with an appropriate buffer, as previously described, optionally containing an alcohol, for example N-propanol.
The eluded fraction should be immediately buffered with, for example, ammonium bicarbonate and lyophilized. The FNTa INH is now in a substantially homogeneous form suitable for additional titration of biological activity and for preparation in a form suitable for use in the therapeutic field.
Consequently, according to one of its additional or alternative characteristics, the present invention also relates to a protein which selectively inhibits the activity due to FNTa, which is substantially identical to that obtained in the method described above.
EMI13.2
The ability to purify the FNTa INH in accordance with the present invention to the point of homogeneity has allowed the sequencing of the N-terminal fraction of this protein molecule. This sequence will facilitate the cloning of a gene coding for FNTa INH thereby allowing the production of large quantities of FNTa INH in pure form from a complementary biological examination and possibly for testing and therapeutic use.
Homogeneous FNTa INH samples according to the present invention can be sequenced by implementing
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use of conventional techniques, for example using a commercially available automated sequencer, using gas phase detection or ninhydrin. The first 17 residues of the amino-terminated portion of human FNTa INH as defined herein, include the following sequence:
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Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-CysAsn-Ser-Ile (identified using an automated sequencer, model 477A, from Appled Biosystems).
It is also assumed that the following three amino acids provide a glycosylation site and that the sequence continues as: Asn-Ser-Thr-Lys.
It should be understood that a potential process for supplying large quantities of FNTa INH in pure form is carried out by recombinant DNA techniques, well known to specialists. However, the successful use of such techniques requires not only the precise measurement of the natural and recombinant FNTa INH or its activity, but also that the product, both natural and recombinant
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is purifiable to the point of homogeneity.
According to yet another of its characteristics, the present invention also relates to a process for producing an inhibitor of the tumor necrosis factor according to the invention or a derivative thereof, by the expression of a sequence of DNA encoding such an inhibitor in a suitably transformed host. One such method involves culturing a transformed host with recombinant DNA molecules comprising DNA sequences encoding the inhibitor which has been inserted into a suitable vector.
Appropriate hosts, eukaryotes and prokaryotes, can be, for example strains
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bacteria, yeast, other fungi and animal cells (including insect cells) and plant cells in the tissue. Particularly preferred host cells are yeast cells, E. cells. coli and animal cells.
The expression of a protein possessing an inhibitory activity of the tumor necrosis factor is obtained by the culture of transformed hood cells in an appropriate growth medium. Normally, such a medium contains a source of nitrogen, such as ammonium sulfate, a source of carbon and energy, such as glucose or glycerol, trace elements and factors essential for the growth of particular host cells. . The precise growing conditions depend on the host chosen; thus, for example, in the case of E. coli, aerobic submerged fermentation is preferred, preferably at about 37 ° C.
In addition, expression can be brought about, for example, by the addition of an inducer or by the use of induction conditions for the promoter system used in the expression vector.
Depending on the host, the FNTa inhibitor can be produced in the form of granular inclusion bodies which can be recovered, after cell lysis, by differential centrifugation; these bodies can be solubilized by conventional methods and purified by the methods described in the present specification for the purification of urinary FNTa INH. Alternatively, the FNTa inhibitor can be found in solution in the cytosol, secreted in the periplasmic space, or conveniently secreted in the culture medium.
Host cells are transformed by recombinant DNA molecules that include a DNA sequence encoding the inhibitor of FNTa, which has undergone
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insertion into an expression vector.
Expression vectors of this kind can consist of segments of chromosomal, non-chromosomal and synthetic DNA sequences, like various known derivatives of SV-40 and of known bacterial plasmids, for example "natural" plasmids, such as ColEl, pSC10I or pRSF2124 and phage DNA,
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or "artificial" plasmids (constructed in vitro), such as pBR322, pMB9 or pAT153. Phage DNAs include, for example, numerous lambda phage derivatives and other DNA phages, e.g., M13 and other filamentous single-stranded DNA phages. Vectors of interest in yeast include plasmid 2 and those useful in eukaryotic cells, such as animal cells, include those containing the retrovirus and adenovirus SV-40.
One can also characterize such expression vectors by at least one control sequence of
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expression, which can be operatively linked to the DNA sequence of the FNT inhibitor, in such a way that it controls and regulates or regulates the expression of the cloned DNA sequence. Examples of interesting expression control sequences include the lac, trp, tac and trc systems of major regions,
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operators and promoters, phage lambda (such as the PL promoter under the repressor control ts c1857 thermolabile), the control region of the fd coating protein, the glycolytic promoters of yeast (for example the promoter for 3-phosphoglycerate kinase ), the promoters of the yeast acid phosphatase (for example Pho 5),
yeast pairing promoters a and promoters from polyomes, adenoviruses, retroviruses and simian viruses.
In addition, vectors of expression of this kind,
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may have various sites for the insertion of the DNA sequences of the FNTA inhibitor according to the invention. These sites are characterized by the specific restriction endonuclease which cleaves or splits them. Such cleavage or scission sites are well known to those skilled in the art.
The expression vector and, in particular, the site which is chosen there for the insertion of a chosen DNA fragment and its operative binding to an expression control sequence, are determined by a series of factors including the number of sites sensitive to a given restriction enzyme, the size of the protein to be expressed, contamination or binding of the protein to be expressed by host cell proteins, which may be difficult to remove during purification, the position start and stop codons and other factors well known to those skilled in the art.
Thus, the choice of a vector and of the insertion site for a DNA sequence is determined by a balance of these factors, all the selections not being of equal effectiveness for a given case.
Likewise, not all host / vector combinations work with equal efficiency for the expression of DNA sequences according to the invention. The selection is made taking into account a variety of factors including host and vector compatibility, ease of recovery of the desired protein, expression characteristics of DNA sequences and control sequences. the expression operatively linked thereto, or any necessary post-expression modifications of the desired protein.
The DNA sequences according to the invention which, by expression, code for proteins with activity of inhibitor of FNTa, can be isolated by
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screening various DNA or DNA pools for such DNA sequences, using a series of DNA samples. DNA samples can be prepared from the purified natural protein which is used as an amino acid sequence data source. The purified natural protein can be prepared, for example, from the urine of feverish humans, as described above.
Degenerate DNA sequences encoding various parts and fragments of the amino acid sequence are used, for example in combination with Lathe samples, to model the DNA samples.
Thus, various DNAs are screened for DNA sequences encoding the FNTa inhibitors according to the present invention. DNA libraries of this kind include chromosomal gene banks and cDNA or DNA, which are prepared from cell or tissue lines which have been shown to produce FNT & alpha inhibitors, such as alveolar macrophages or hepatic tissue.
The screening can be carried out by direct immune expression, for example in λgtll or similar systems, or else, the case where a cell producing FNT α INH, by identifying the specific mRNA of FNTA INH by direct expression in Xenopus oocytes.
A whole series of conventional cloning and selection techniques can be used to locate and identify DNA sequences which encode, by expression in an appropriate prokaryotic or eukaryotic host, the FNT inhibitors according to the invention. These chosen or selected DNA sequences can themselves be used as samples to choose other DNA sequences coding for FNTa inhibitors, or they can be
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use in suitable recombinant DNA molecules to transform suitable eukaryotic or prokaryotic hosts for the production of FNTa INH which they encode.
The scope of the present invention also extends to single-stranded and double-stranded DNA sequences encoding FNTa INH, vectors containing sequences of this kind, suitable for the transformation of a host organism and host cells. transformed by such DNA sequences.
According to yet another of its characteristics, the invention also relates to a protein with a selective FNTα inhibitor or inhibitor activity, produced by the expression of a host transformed with a DNA sequence encoding such a protein FNTa inhibitor. The FNT inhibitors according to the invention which are prepared by the expression of a DNA sequence encoding such inhibitors in a transformed hole will therefore be identical to the sequence of natural FNTa INH or will contain one or more omissions, substitutions, insertions, inversions or additions of allylic or other origin, the sequence thus obtained will have at least 80% and, preferably 90%, of homology with the sequence of the natural INH FNTa and will retain essentially the same biological properties.
More particularly, an FNTα inhibitor according to the invention can comprise an N-terminal methionine. Likewise, for example, the DNA sequence according to the invention coding for the FNTa INH can be fused in an expression vector to a part of a DNA sequence coding for a eukaryotic or prokaryotic polypeptide, in order to facilitate expression of the DNA sequence encoding FNTa INH, or assist in the secretion, maturation, purification of FNTa INH from the host; 1st
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fused polypeptide can be removed inter- or extracellularly by known techniques, or the FNTa INH can be used in conjunction with the fused polypeptide.
The FNTa INH produced by the eukaryotic or prokaryotic host culture, transformed by DNA sequences encoding the FNTa INH, can then be used, after purification, in the pharmaceutical compositions in accordance with the invention.
It should be understood that when produced by animal cells, the FNTa INH according to the invention will be a glycoprotein. However, prokaryotic expression systems will produce the protein in the aglycosyl state. In addition, the glycosylated protein can be substantially deglycosylated by techniques well known to those skilled in the art, for example, by the addition of enzymes of the endoglycosidase type.
The following nonlimiting examples illustrate the present invention. All temperatures are given in OC and all percent concentrations are in w / v.
FNTa inhibition titration
The percentage of FNTa INH activity in the fractions described in the examples was determined by assuming that the values of the optical density (OD) of murine L929 cells, stimulated with actinomycin D (acti S), corresponded to an inhibition 100%, while the OD of cells cultured with actinomycin D and FNTa corresponded to a maximum cell mortality of 0% inhibition of FNTa. The FNTa used for the titration was recombinant human FNTa (rhFNTa) produced in E. coli as described by A.
Marmenout et al1., "Molecular cloning and expression of human tumor necrosis factor and comparison of
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this to the mouse tumor necrosis factor ", Eur. J. Biochem., 152, p515 (1985). Thus, the percentage of the inhibition of FNT (I during the cytotoxicity titration was calculated in accordance with formula (I):
Percentage of FNTa INH activist =
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(DO with acti D + rhFNTa + FNTa INH) - (DO with acti D + rhFNTa) 100 x (I) (DO with acti D) - (DO with acti D + rhFNTa) L
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EXAMPLE 1 Purification of Urinary FNTa INH a) Concentration of Proteins From Human Urine
Human urine (15 liters) was collected freshly from a pool of five patients prior to any treatment. Two of the patients suffered from small cell carcinoma, another from malignant histiocytosis, another from polymyositis and the last from septic condition. All the patients were extremely feverish and were free from urinary tract infections.
The urine was concentrated to 40 on an Amicon hollow fiber ultrafiltration apparatus, with a section with a molecular caliber of approximately 5 kDa. b) Preparation of proteins from human urine
The concentrated, concentrated urine was saturated with solid ammonium sulphate by slowly adding the sulphate, with constant stirring and at 4, until the concentration of ammonium sulphate had reached 40%.
The precipitate was removed by centrifugation, discarded and the supernatant was adjusted to a
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80% saturation by the addition of additional ammonium sulfate. a pellet was obtained by centrifugation which was resuspended in 150 ml of 20 mM sodium phosphate (pH 7.2) and 150 mM sodium chloride.
Ammonium sulfate was removed by dialysis at 4 ° C using 10 mM tris-HCl (pH 7.4), 2 mM EDTA and benzamidine-HCl 5
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mM. c) Identification of FNTa INH activity
The semi-purified fraction of Example 1 (b) was tested in a cytotoxicity assay with a line of L929 cells sensitive to FNT, in the presence of actinomycin D. At a 1:20 dilution of the semi-purified fraction purified, a total inhibition of the cytotoxic effect induced by rhFNTa was observed, so that the OD570nm value was identical to that measured in the presence of actinomycin D alone (OD 570nm = 1.5).
In addition, inhibitory activity was observed, in dilutions of the fraction up to 1: 160 on cells (OD570nm = 0.83), while the control velocity of rhFNTa, at a final concentration of 0.2 ng / ml, measured in the presence of actinomycin D, was lower (OD570nm = 0.73), so that 50% of the inhibition was observed at a dilution of approximately 1:
100 (DO70nm = 1.10). FNTa INH had no effect on cell viability when tested without actinomycin D.
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d) Comparison of the Effect of FNTA INH on the Cytotoxicity Induced by FNTa and FNTss Cytotoxicity titration was carried out using the L929 cell line sensitive to FNT, in the presence of actinomycin D, using a range of FNTa or FNTss concentrations to induce the effect
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cytotoxic. The semi-purified fraction of Example 1 (b) was tested at dilutions of 1:20, 1:50 and 1:80. Control tests were carried out in the absence of FNTα or FNTss cytokine and in l absence of inhibitor.
The results obtained are presented in Table 1 below and demonstrate that the inhibitor according to the invention does not exert an inhibitory effect on the cytotoxicity due to the FNTss, varying from approximately 50% down to 2%. the inhibition of FNTa with the increase in the concentration of FNTss.
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<tb>
<tb>
Board <SEP> 1
<tb> Concentration <SEP> fi- <SEP> Form <SEP> from <SEP> Dilution <SEP> final <SEP> from <SEP> the <SEP> fraction
<tb> nale <SEP> from <SEP> FNT <SEP> (α <SEP> or <SEP> cytokine Inhibitor <SEP> <SEP> on <SEP> Sephacryl <SEP> S-200
<tb> ss) <SEP> (pg / ml) <SEP> added <SEP> added <SEP> on <SEP> of <SEP> cells <SEP> L929 <SEP> (DO570nm)
<tb> to <SEP> of <SEP> cells <SEP> L929 <SEP> to <SEP> celtraitées <SEP> to <SEP> the acti- <SEP> lules <SEP> None <SEP> 1/20 <SEP> 1/50 <SEP> 1/80
<tb> nomycin-D
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP>> 1. <SEP> 90 <SEP>> 1. <SEP> 90 <SEP>> 1. <SEP> 90 <SEP>> 1. <SEP> 90
<tb> 10 <SEP> a <SEP> ND <SEP> ND <SEP> ND <SEP> ND
<tb> ss <SEP> 1. <SEP> 16 <SEP> 1. <SEP> 66 <SEP> 1. <SEP> 46 <SEP> 1. <SEP> 39
<tb> 20 <SEP> a <SEP> 1. <SEP> 30 <SEP>> 1. <SEP> 90 <SEP> 1. <SEP> 72 <SEP> 1. <SEP> 68
<tb> ss <SEP> 1. <SEP> 02 <SEP> 1.
<SEP> 51 <SEP> 1. <SEP> 21 <SEP> 1. <SEP> 22
<tb> 50 <SEP> a <SEP> 1.02 <SEP>> <SEP> 1.90 <SEP> 1.72 <SEP> 1.68
<tb> ss <SEP> 0.65 <SEP> 1.03 <SEP> 0.84 <SEP> 0.68
<tb> 100 <SEP> 0. <SEP> 73 <SEP> 1. <SEP> 78 <SEP> 1. <SEP> 69 <SEP> 1. <SEP> 51
<tb> ss <SEP> 0. <SEP> 37 <SEP> 0. <SEP> 71 <SEP> 0. <SEP> 59 <SEP> 0. <SEP> 52
<tb> 250 <SEP> a <SEP> 0. <SEP> 38 <SEP> 1. <SEP> 70 <SEP> 1. <SEP> 70 <SEP> 1. <SEP> 33
<tb> ss <SEP> 0. <SEP> 24 <SEP> 0. <SEP> 44 <SEP> 0. <SEP> 31 <SEP> 0. <SEP> 24
<tb> 500 <SEP> a <SEP> 0. <SEP> 30 <SEP> 1. <SEP> 52 <SEP> 1. <SEP> 49 <SEP> 1. <SEP> 11
<tb> ss <SEP> 0. <SEP> 17 <SEP> 0. <SEP> 30 <SEP> 0. <SEP> 26 <SEP> 0. <SEP> 18
<tb> 1 <SEP> 250 <SEP> α 0.19 <SEP> 1.09 <SEP> 1.10 <SEP> 0.76
<tb> ss <SEP> 0. <SEP> 11 <SEP> 0. <SEP> 13 <SEP> 0. <SEP> 19 <SEP> 0. <SEP> 13
<tb> 2 <SEP> 500 <SEP> a <SEP>:
<SEP> 0. <SEP> 06 <SEP> 1. <SEP> 03 <SEP> 0. <SEP> 80 <SEP> 0. <SEP> 47
<tb> ss <SEP> ND <SEP> ND <SEP> ND <SEP> ND
<tb>
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Example 2 Filtration on FNT & alpha gel; Urinary INH
The semi-purified FNT INH of Example 1 (b) was purified by 40 g gel filtration filtration chromatography on a column of Sephacryl S200 (0.9 x 60 cm) (Pharmacia, Uppsala, Sweden) equilibrated in a 50 mM tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 100 mM sodium chloride. We applied a sample of the
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protein fraction (20 mg, 0.8 ml) to the column and eluted with the same buffer, at a flow rate of 5.4 ml / h. The fractions (1.35 ml) were pooled and tested for their FNTa INH activity.
FNTA activity
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INH eluted from the gel as a single peak or point. The FNTA INH activity product eluted from the gel as a single peak or tip. The product with inhibitory activity manifested an apparent molecular weight of 40 to 60 kDa (see FIG. 1).
Example 3 Chromatofocusing of FNT α Urinary INH
The semi-purified FNa INH of example leb was chromatofocused, at 40, on a column pre-filled with monoP (HR 5 / 20.5 x 200 mm) (Pharmacia, Uppsala, Sweden) balanced in a bis-tris buffer 25 mM, adjusted to pH 7.1, using imidodiacetic acid (Fluka, Buchs, Switzerland).
A sample of the protein fraction from Example 1 (b) (30 mg) was applied to a column and eluted with polytampon 74 / iminodiacetic acid at pH 4.0. column fractions (1 ml) at a 1:10 dilution for their effect during titration of rhFNTa-induced cytotoxicity (0.2 ng / ml) in the presence of actinomycin D (1 g / ml). The actual pH of each column fraction was determined using a pH meter, most of the activity of FNT α INH found in the fractions eluted between a pH of 5.5 and
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of 6, 1 (see Figure 2). This is equivalent to the pI of the FNTa INH protein.
Example 4 FNT α Urinary INH
The semi-purified FNTa INH of Example 1 (b) was purified by anion exchange chromatography, at 40, on a column of Sephadex, DEAE (2.6 × 20 cm) (Pharmacia, Uppsala, Sweden), equilibrated in a 10 mM tris-HCl buffer of pH 8.0, containing 2 mM EDTA. We have
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elute the bound material from the column with the equilibration buffer containing 0.8 mM sodium chloride. The fractions (8.0 ml) were collected, tested for FNTa INH activity, and the
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inhibitory fractions (160 ml) and dialyzed against a 10 mM sodium acetate buffer pH 5.0 (4 x 2 liters).
FNTa INH was further purified by 4-way cation exchange chromatography on a sulfopropyl-sephadex column (0.8 x 15 cm) (Pharmacia, Uppsala, Sweden) equilibrated in acetate buffer. 10 mM sodium, pH 5.0. The bound material was eluted from the column with the balancing buffer containing sodium chloride 0.5 M. Fractions (7.5 ml) were collected and tested. FNTa INH activity and the inhibitory fractions were pooled and
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concentrated them 20 times on an Amicon ultrafiltration device with a section with a molecular caliber of approximately 10 kDa.
EXAMPLE 5 Filtration Through Gel of Urinary FNTa INH
The FNTa INH concentra of Example 4 was purified by gel filtration chromatography at 40 on a column of Sephacryl S-200 (2.6 x 100 cm)
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(Pharmacia, Uppsala, Sweden), equilibrated with a 50 mM tris-HCl buffer of pH 7, 4 containing 10 mM sodium chloride. A sample of the protein fraction from Example 4 (2000 mg) was applied to the column and eluted with the equilibration buffer at a flow rate of 27 ml / hour. Fractions were collected (9.0 ml), the activity of FNTa INH was tested and the inhibitory fractions were pooled.
The column was calibrated with dextran blue (BD), 2000 kDa, bovine serum albumin (ASB), 67 kDa, ovalbumin (OA), 43 kDa, α -cymotrypsinogen- A (α CT), 25 kDa and ribonuclease A (RNase), 13.5 kDa, as Figure 4 shows.
Example 6 Affinity Chromatography of Urinary FNTa INH
We prepared the affinity column of FNT α in
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coupling recombinant human FNTa (1.0 mg) to Mini Leak agar (Kern En Tee, Biotechnology Corp., Denmark) in 0.8 M potassium phosphate buffer pH 8.6. Residual active radicals were blocked by incubation in 0.1 M ethanolamine-HCl buffer pH 8.5.
The gel was washed with 50 mM tris-HCl buffer, pH 7.4, containing 100 mM sodium chloride (3 x 50 ml). A sample of the FNTa INH fractions of Example 5 (15 ml) was applied to the column and eluted with 0.2 M glycine-HCl buffer pH 3.5. pooled the fractions (1.0 ml), immediately adjusted them to a pH of 7.0 by adding 1 M tris (5 to 40 l) and tested them for their FNT & alpha activity; INH.
Example 7 Reverse phase FPLC chromatography of FNT α Urinary INH
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The FNTIa INH fractions of Example 6 were lyophilized, dissolved in 0.1% trifluoroacetic acid (2.0 ml) and loaded onto a ProRPC reverse phase FPLC column ( 5 x 20 cm) (Pharmacia, Uppsala, Suede), balanced in
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0.1% trifluoroacetic acid. The bound material was elected with an acetonitrile gradient from 0 to 100% in 0.1% trifluoroacetic acid, at a flow rate of 0.3 ml / minute. 0.5M ammonium bicarbonate (10 µl) was added to each fraction (0.75 ml) and the eluted material was lyophilized.
Reverse phase FPLC chromatography revealed a major peak corresponding to the activity of FNT INH. The lyophilized fractions containing this activity were dissolved in 10 mM tris-HCl buffer, pH 7.4, containing 2 mM EDTA and analyzed by sodium polyamide dodecylsulfate gel electrophoresis (SDS PAGE). using the method described by U. Laemmli et al., Nature, 227, p680 (1970). The FNTa INH was found to influence with a molecular weight of 33 kDa (see Figure 4).
The samples obtained under non-reducing conditions were tested for their activity of FNTa INH at a dilution of 1: 10 on L929 cells, in the presence of
0.15 mg / ml rhFNTa. The activity directed against rhFNTa migrated with the apparent molecular weight identical to the 33 kDa band on the gel test under reducing conditions.
EXAMPLE 8 Protein Sequencing of Urinary FNTa INH
The FNTa INH fraction, isolated from reverse phase FPLC chromatography, was concentrated in vacuo and plotted on a conditioned sequencer filter. The protein was analyzed by a protein sequencer Applied Byosystems Modele
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477A. The sequencing cycle fractions were evaporated to dryness and resuspended in N, N-diisopropylethylamine acetate and acetonitrile, prior to injection into a liquid chromatography column at high pressure or high performance, for identification of the residue.
The first 17 N-terminal amino acid residues were identified and these responded to the sequence: Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Cys - Asn-Ser-11e. It is also assumed that the following three amino acids provide a glycosylation site and that the sequence continues as follows: Asn-Ser-Thr-Lys. This sequence is not significantly homogeneous vis-à-vis any protein sequence contained in a database of NBRF protein sequences (Nov. 1988).
Example 9 Demonstration that the FNT α INH is a Demonstration that the FNT α INH is a protein a) Dependence on duration and temperature
The purified FNTA INH was heated on Sephacryl S-200 of Example 2, obtained by collecting the tubes of the active fractions, at 56, 75 and 95. The activity of FNT α INH after 10.20 and 60 minutes and, by comparison with untreated samples, the percentage of activity of FNT α INH according to formula (I). The results presented in table 2 which follow demonstrate that the activity of FNTa INH decreases in a manner which depends on time and on temperature.
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<tb>
<tb>
Inactivation <SEP> ä <SEP> the <SEP> heat
<tb> Percentage <SEP> of activity <SEP> from
<tb> Temperature <SEP> ("C) <SEP> Time <SEP> (min) <SEP> FNT * <SEP> INH
<tb> 10 <SEP> 100
<tb> 56 <SEP> 20 <SEP> 100
<tb> 60 <SEP> 93
<tb> 10 <SEP> 60
<tb> 75 <SEP> 20 <SEP> 26
<tb> 60 <SEP> 15
<tb> 10 <SEP> 27
<tb> 95 <SEP> 20 <SEP> 10
<tb> 60 <SEP> 13
<tb>
b) Sensitivity to trypsin digestion
Trypsin (500 µg) was added (Sigma, St.
Louis, MO, EUA) in 0.2 M tris buffer (pH 8.0) containing ImM calcium chloride with the combined fractions of purified urinary FNTa INH on Sephacryl S-200 from Example 2 and the whole was incubated at 37 C for 4 hours. Another proportion of trypsin (500 μg) was added and digestion was continued for an additional 20 hours, after which the reaction was terminated by the addition of soybean trypsin inhibitor (2 mg) (Sigma , St. Louis, MO, USA).
The percentage of FNTa INH inhibitory activity of the trypsin digested product and of the control was determined at a final 1:20 dilution of all the combined fractions, on L929 cells stimulated with rhFNTa, in the presence of actinomycin D, according to formula (I). The results appear in Table 3 below.
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<tb>
<tb>
Inactivation <SEP> trypsinic
<tb> percentage <SEP> of activity
<tb> Conditions <SEP> from <SEP> FNT α <SEP> NINH <SEP> DO <SEP> zo
<tb> Buffer <SEP> alone <SEP> 0 <SEP> 0. <SEP> 71
<tb> Trypsin + inhibitor <SEP> from
<tb> trypsin <SEP> from <SEP> soy <SEP> in
<tb> buffer <SEP> 0 <SEP> 0. <SEP> 70
<tb> Urine, <SEP> purification
<tb> partial <SEP> on <SEP> Sephadex <SEP> S-200 <SEP> 61 <SEP> 1. <SEP> 46
<tb> Urine, <SEP> purification
<tb> partial <SEP> on <SEP> Sephadex <SEP> S-200 <SEP> with <SEP> digestion <SEP> by <SEP> trypsin <SEP> 23 <SEP> 1. <SEP> 03
<tb>
EMI31.2
c) Emergency treatment
The purified INH FNT on Sephacryl S-200 of Example 2 was adjusted to 2M of urea and was intensively dialyzed to 4 against a phosphate buffered saline solution (STP) containing 2M urea.
Dialysis against STP was repeated prior to biotitration.
The activator of FNTa INH has been found to be unaffected, indicating that the inhibitory activity is not caused by a low molecular weight molecule bound to a protein.
Example 10 Demonstration of Competitive Inhibition
Purified FNTa INH was tested on Sephacryl S-200
EMI31.3
from 1.' Example 2, at a dilution of 1:10, against increasing amounts of rhFNTa on L929 cells. An inverse correlation was observed between the amount of rhFNTa present in the titration and the degree of inhibition
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(see figure 3). Therefore, the inhibitory activity is competitively offset by increasing concentrations of rhFNTa.
Example 11
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Inhibition of PG production due to FNTa by dermal fibroblasts
Human dermal fibroblasts were seeded at a concentration of 2.0 x 10 cells / well and cultured for 48 hours. The cells were then stimulated with DMEM buffer supplemented with 10% FCS as a control.
The cells were also stimulated with rhFNTa in concentrations varying from 0.5 to 5 mg / ml and the effect of the FNTa INH of Example 5 was studied at three dilutions (1:20, 1:50 and 1: 80) in the above buffer. after a 72 hour incubation, the production of PGE2 in the supernatant layers was measured, by radioimmuno-titration, using PGE2 antiserum [see J M Dayer et al., J.
Clin. Invest., 64, p1386 (1979) J.
The results are presented in Table 4 below and demonstrate that the power of rhFNTa to stimulate the production of PGE2 by dermal fibroblasts was inhibited by the addition of FNT α INH in the three aforementioned dilutions. At a 1:80 dilution of FNTa INH, the inhibitory activity was partially offset by the elevation of rhFNTa concentrations.
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<tb>
<tb>
Concentration <SEP> from <SEP> Production <SEP> from <SEP> PGF2par <SEP> of <SEP> fibroblasts <SEP> dermics
<tb> rhFNT <SEP> on <SEP> of <SEP> fi <SEP> humans <SEP> (ng / ml)
<tb> broblasts <SEP> humans <SEP> Dilution <SEP> from <SEP> FNT α <SEP> INH <SEP> on <SEP> fibroblasts
<tb> (P9 / ml)
<tb> none <SEP>: <SEP> 80 <SEP> 1 <SEP>: <SEP> 50 <SEP> 1 <SEP>:
<SEP> 20
<tb> 5 <SEP> 0 <SEP> 50.6 <SEP> ¯ <SEP> 7.4 <SEP> 88.8 <SEP> ¯ <SEP> 5.6 <SEP> 103.0 <SEP> ¯ <SEP> 8.9 <SEP> 111.0 <SEP> ¯ <SEP> 9.4
<tb> 500 <SEP> 60.0 <SEP> ¯ <SEP> 14.1 <SEP> 126.0 <SEP> ¯ <SEP> 9.3 <SEP> 115.9 <SEP> ¯ <SEP> 6.6 <SEP> 113.9 <SEP> ¯ <SEP> 7.1
<tb> 2,000 <SEP> 331.7 <SEP> ¯ <SEP> 28.4 <SEP> 217.2 <SEP> ¯ <SEP> 10.7 <SEP> 156.7 <SEP> ¯ <SEP> 10.7 <SEP> 115.3 <SEP> ¯ <SEP> 21.3
<tb> 5,000 <SEP> 381.7 <SEP> ¯ <SEP> 19.7 <SEP> 257.2 <SEP> ¯ <SEP> 13.7 <SEP> 253.1 <SEP> ¯ <SEP> 21.2 <SEP> 221.6 <SEP> ¯ <SEP> 16.0
<tb>
Three different experiments were carried out with the same fibroblast strain. The buffer or FNT α INH at various dilutions, in the presence or absence of various concentrations of rhFNTa.
The production of PGE2 by cultured human dermal fibroblasts was measured after three days. The values obtained represent the means of triple trials of the three ESM cultures (N = 3).
Example 12 Titration of RhFNTa Binding Inhibition
Recombinant human FNTa was iodinated using the iodogen method of Fraker and Speck jr., Biochem.
Biophys. Res. Comm., 80, p849 (1978). The specific activity of -U-FNTa was 2.2 x 104 cpm / ng and produced a single band with a molecular weight of 10 kDa when subjected to analysis by SDS-PAGE. The human macrophage cell line U937 was cultured in aliquots of 106 cells, at 4OC, for two hours, in a culture medium (200 μl) comprising RPMI 1640 (Gibco, Paisley, Scotland)
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supplemented with streptomycin (100 mg / mI), penicillin (100 U / ml), 1.0% glutamine and 10% fetal calf serum and containing 0.04% sodium azide and 0 , 5 ng of [125I] -FNT α
.. Inhibition of binding was achieved by the addition of various dilutions of FNT1 INH (1:20, 1: 200 and 1: 2000).
The aspecific binding was measured in the presence of a hundredfold excess of unlabeled rhFNTa and the free radioactivity was separated from the [125 17-FNTa bound by centrifugation via an oil mixture, as described Robb et al., J. Exp.
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Med., 154, p1455 (1981).
The cell bound Z 17-FNTa was measured in a gamma counter (LKB, Bromma, Sweden) and the percentage of inhibition of binding was determined according to formula (II) Percentage of inhibition of binding = cpm with FNT α INH - specific binding cpm 100 x 1 - total binding cpm - specific binding cpm (11) Example 13
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125 Effect of FNTA INH on the binding of C-125 Ll-FNTn to U937 cells
U937 cells were preincubated for 1 hour at 200 in the culture medium of Example 12 in the presence of either FNT alone or [125 I] -FNT α with a hundredfold excess of unmarked rhFNTa. The U937 cells were then washed with 40% phosphate buffered saline (3 x 50 ml).
We divided the
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125 cells incubated in ze FONT alone in four batches which were incubated with ENTA INH of example 5
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(1: 20, 1: 200 and 2: 2000 dilutions) and with a buffer alone, respectively.
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.-125 It was found that the specific binding of 25 t7 FNTa to U937 cells was inhibited at 4, 100%, 80% and 35%, by the three dilutions of FNT α INH 1:20, 1: 200 and 1: 200 respectively (see Figure 5). The control group which did not include FNTa INH did not show any inhibitory activity. The inhibition of the binding of the two weakest dilutions was found to be increased
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J. 25 up to 90% and 60% when the U-FNTa is pre-incubated with FNTa INH at dilutions of 1: 200 and 1: 2000 respectively, before the addition of the cells.
The experiment was repeated using the cells
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125 pre-incubated in the presence of 17-FNTa and a hundredfold excess of unmarked FNTa, so that the percentage of inhibition of binding could be corrected for the specific binding.
Example 14
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Dissociation of a preformed FNTa: U937 complex U937 cells were pre-incubated for one hour 125 in the presence of / * 17-FNTa as described in Example 12. The cells were washed and incubated at 40 or ä 37 in the presence or absence of FNTa INH from Example 125 5.
It has been found that 2 17-FNTa bound to the cell surface dissociates more quickly in the presence of FNTa INH than in its absence and it has been found that this occurs in a time-dependent and temperature-dependent manner ( see figure 6). Example 15 Demonstration that the FNTa INH is not proteolytic
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for rhFNTa We incubated 2517-FNTa & 20 * for one hour, in the presence of three different dilutions of FNTa INH
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(1: 20, 1: 200 and 1: 2000) and in the presence of a single buffer. When analyzed by SDS PAGE and autoradiography, it was found that 17-FNTa migrated as a single band, both in the absence and in the presence of FNT α INH, showing that the inhibitor had no proteolytic effect.
Example 16 Effect of FNTa INH on the binding activity of the IL-1 receptor
The activity of the FNTa INH of Example 5 was tested during the titration of IL-1 / FAL (lymphocyte activation factor) after induction by IL-la or IL-1ss [this titration is described by P. Seckinger et al., J.
Immunol., 139, p1541 (1987) for an IL-U inhibitor protein. Dose response was observed
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incorporation of H / -thymidine (corresponding to a proliferation of thymocytes) in concentrations up to 200 pg / ml of the two forms IL-1a and IL-ass.
Addition of FNTa INH to levels observed for inhibition of rhFNTa had no significant effect on IL-1 induced thymocyte proliferation, proving
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as well as the inhibition was specific for FNTa only.
The results obtained are illustrated with reference to the attached drawings, in which:
Figure 1 shows the activity profile of urinary FNTa INH by filtration on Sephacryl S-200 gel. Column fractions (1 ml) were tested at a 1:10 dilution to carry out the cytotoxicity titration of rhFNTa (1.0 ng / ml), in the presence of actinomycin D (oxo). Line () represents the DO0nm of the fractions. Bars represent cell lysis measured by dye uptake in response to
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actinomycin D () and actinomycin D plus rhFNTa (t) without urine.
Molecular weight markers are dextran blue (BD), bovine serum albumin (ASB), ovalbumin (OA), α-chymotrypsinogen (aCT), ribonuclease A (RNase) and red of phenol (+ - red).
FIG. 2 represents the profile of the activity of the urinary FNTa INH of the chromatofocusing on a Mono-P column. Column fractions (1 ml) were tested, at a 1:10 dilution, to determine their effect during the cytotoxicity titration of
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rhFNTa (0.2 ng / ml) in the presence of actinomycin D (1.0 pg / ml) (0 ---- 0). Line () represents the DO of the fractions and (----) represents their pH. The bars have the same meaning as that shown in connection with Figure 1.
Figure 3 shows the reversibility of FNTa activity. INH. The open circles (o-o) represent the DO570nm, measured in the presence of actinomycin D, rhFNTa and FNTa INH; circles
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farms (0.) represent DOe, measured in the presence of actinomycin and rhFNTa only and the bar (S) represents D570nM in the presence of actinomycin D (1.0 ng / ml) alone.
Figure 4 shows the elution profile by gel filtration of Sephacryl S-200 with purified FNTa INH from Example 5. Column fractions (9 ml) were sterilized and tested at dilution 1:50, against rhFNTa (1.0 mg / ml) in the presence of actinomycin D (1.0 pg / ml), in the presence of actinomycin D (1.0 pg / ml) at cytotoxicity titration course
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with L929 (0 ---- 0). The line () represents the DOnn of the fractions. Bars have the same 280nm
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meanings as those indicated in connection with figure l.
FIG. 5 shows the SDS PAGE analysis of the purified FNTa INH of Example 7. The SDS PAGE was carried out as described by U. Laemmli et al., Nature, 227, loc. cit. Samples were loaded onto a 15% polyacrylamide gel with a loading gel and the silver gels were stained as described by C.
Merril et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, p4335 (1979). Samples from conditions not
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Reducers were tested for biological activity by cutting 2mM slices of the gel and eluting the proteins by overnight incubation in 10 mM tris-HCl pH 7, 4 containing 2 mM EDTA (total volume : 200 1). The fractions were tested, at a dilution of 1:10, on L929 cells, in the presence of rhFNTa (0.15 ng / ml).
Figure 6 shows the effect of FNT α INH on the binding of 2517-FNTa to U937 cells. The FNTa INH was incubated, at three different dilutions, in the presence of 25tl-FNTa with the cell line U937, as described in example 13. The open squares (@ - @) represent the incubation in the presence of FNTa INH and the open triangles (^ ^) represent the control. The same firm symbols relate to a pre-incubation of FNTa INH, at 20 and for 30 minutes, with [125I] -FNT α in the culture medium, before proceeding with the addition of cells.
FIG. 7 represents the dissociation of a preformed FNTa: U937 complex. 125 U937 cells were pre-incubated with [125I] -FNT α washed and incubated with FNTa INH, in the same manner as that
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described in Example 14, either at 4 (@ - @) or at 37 - At the indicated time, the radioactivity associated with the cells was measured and the percentage of specific binding was determined. On the graph, the value. obtained with the control without the inhibitor was subtracted from the values obtained at the two temperatures, therefore 100% corresponds to the value obtained without the addition of FNTa INH.