NL8900779A - Eiwit dat de werking van tumor necrose factor tegengaat, dna dat voor zulk eiwit codeert, een vector die zulk dna bevat, een met die vector getransformeerde gastheercel en een farmaceutisch preparaat dat dat eiwit bevat. - Google Patents

Description

- 1- *>

Eiwit dat de werking van tumor necrose factor tegengaat, DNA dat voor zulk eiwit codeert, een vector die zulk DNA bevat, een met die vector getransformeerde gastheercel en een farmaceutisch preparaat dat dat eiwit bevat.

Deze uitvinding betreft een nieuw eiwit met een remmend effect op de via tumor-necrose-factor α verlopende werkingen, op het isoleren en het zuiveren van zo’n eiwit uit natuurlijke bronnen, op zijn bereiding door DNA-manipulatie en het gebruik van 5 zulk eiwit bij het behandelen van toestanden die met overmatige of onbeheerste TNFa-vorming gepaard gaan.

Tumor-necrosefactor (TNF) is een werking uitgeoefend door een groep van ten minste twee eiwitten, o en 3, die cyto-toxisch voor tumorcellen zijn en hun groei bij het kweken remmen 10 (E. Carswell c.s. in "An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) p3666. Tumor-necrosefactor (TNFa) ookwel "cachectine" genoemd wordt voornamelijk gemaakt door van de monocyt/macrofagen afgeleide cellen in respons op "stress-signalen" die de invasie van bacteriën, 15 virussen, tumoren en andere toxinen vergezellen. TNF8, gewoonlijk "lymfotoxine" genoemd wordt voornamelijk door lymfecellen gemaakt.

TNF3 heeft veelal dezelfde werkingen als TNFa, maar het schijnt minder sterk te zijn, hoewel dat ook het gevolg kan zijn van moeilijkheden bij het bereiden van zuiver TNF6.

20 TNFa bemiddelt en doet mee aan een grote verscheiden heid van biologische werkingen J_ B. Beutler c.s. in "Identity of tumor necrosis factor and the macrophage-screted factor cachetin", Nature 316 (1985) 552J\ verschillende daarvan heeft het gemeen met interleukine 1 (IL-1) [j. Le c.s. in "Tumor necrosis 25 factor and interleukin 1 : cytokines with multiple overlapping biological activities", Laboratory Invest. 5i6 (1987) 234_f. Verhoogde gehalten aan TNFa, bijvoorbeeld veroorzaakt door tumorcellen, kan leiden tot gewichtsverlies en cachexie, en men heeft wel verondersteld dat TNFa de voornaamste overbrenger van endo-30 toxine-schok (septemie) is, welke fataal kan zijn. Andere biolo gische effecten van TNFa zijn te hoge boeddruk, koorts (uitgelokt door stimulering van de hypothalamus), vorming van prosta-glandien (PGE^), coagulopathie (uitgelokt door stimulering van 8900779 .^ /, - 2 - 9 cellen van het vaat-endothelium, welke bijvoorbeeld weefselfactor afscheiden) en vernietiging van weefsel (bijvoorbeeld door stimulering van de vorming van een serie proteïnasen, waaronder collagenase, de vorming van huidfibroblasten en synoviale cellen 5 (~C> Dinarello c.s. in "Tumor necrosis factor (cachectin) is an endogenous pyrogen and induces production of interkeulin 1", J. Exp. Med. 163 (1986), 1433 en J. Dayer c.s. in "Cachectin/ tumor necrosis factor stimulate collagenase and prostaglandin E£ production by human dermal fibroblasts and synovial cells", 10 J. Exp. Med. 162 (1985) 2163^7-

Er bestaat dus behoefte aan de ontwikkeling van een cachectine/TNFa-remmer die endotixine-schok, cachexie en de andere hierboven beschreven schadelijke effecten voorkomt. Aangetoond is dat passieve immunisering van dieren tegen cachectine via TNFa-15 antilichamen de door endotoxine veroorzaakte dood kan voorkomen (B. Beutler c.s. in Nature 316, zie boven).

Er is nu een eiwit geïdentificeerd dat een sterke remmende werking heeft op de via TNFa uitgeoefende werkingen, maar zonder noemenswaardige remming van de door IL-1 uitgeoefende 20 werking. Dit eiwit wordt hierna aangeduid als Tumor-Necrose-

Factor α-remstof (TNFaR).

Eén aspect van de uitvinding is dus een eiwit dat selectief de via tumor necrose factor α uitgeoefende werkingen remt.

25 Hier wordt als selectieve remming, zoals het eiwit volgens de uitvinding die vertoont, het vermogen aangemerkt om de via TNF uitgeoefende werkingen te remmen bij afwezigheid van het vermogen andere eiwitten te remmen die met TNF bepaalde maar niet alle biologische werkingen gemeen hebben, zoals IL-1.

30 Bij voorkeur verkeert de remmer van de tumor-necrose- factor α volgens de uitvinding in een in hoofdzaak homogene vorm, in hoofdzaak vrij van onzuiverheden en/of in hoofdzaak vrij van ander eiwitmateriaal.

De remmer van de tumor-necrose-factor α volgens de 35 uitvinding is gebleken één of meer van de volgende kenmerken te vertonen: (a) een molecuulgewicht tussen 40 en 60 kDa, bepaald door chroma-tögrafie over een molecuulzeef, (b) een isoëlektrisch punt tussen 5,5 en 6,1, bepaald door chroma- 8900779.

» - 3 - * grafisch focusseren, (c) remming van de standaard TNF-bepaling van de differentiële cytotoxiciteit van met actinomycine D behandelde muizencellen L929, zoals beschreven door G. Nedwin c.s. in "Effects of 5 interleukin 2, interferon-γ and mitogens on the production of tumour necrosis factors a and 3", J. Immunol. 135 (1985) 2492. Deze remming kan overwonnen worden door nog meer TNFa toe te voegen, wat aangeeft dat de remming competitief is. De remstof remt ook de werking van TNF3, hoewel de remming van TNFa bij deze proef effi-10 ciënter verloopt dan die van TNFB, (d) remming van de door TNF uitgelokte afgifte van PGE^ uit menselijke fibroblasten en synoviale cellen, (e) verstoring van de binding van TNFa aan D937-cellen (een kweek van eencellig kankerweefsel) wat blijkt uit de remming van het 125 15 binden van radioactief gemerkt TNFa ( I-TNFa), (f) een van de temperatuur afhankelijke bevordering van de dissociatie van vooraf gevormd complex van TNFa met U937-cellen, (g) geen afbraak van TNF door proteolytische splitsing, en (h) geen remming van de binding van IL-1 aan zijn receptor, 125 20 blijkende uit de binding van I-IL-Ια aan de thymoom-sublijn EL-4-6.1. uit de muis.

Gevonden is dat het eiwit volgens de uitvinding bij verdere zuivering een molecuulgewicht van ongeveer 33.000 dalton heeft, zoals bepaald door elektroforese over een natriumdodecyl-25 sulfaat-polyacrylamide-gel.

Deze uitvinding verschaft dus ook een eiwit dat selectief de via TNFa uitgeoefende werkingen werkt, dat één of meer van de volgende eigenschappen heeft: (a) een molecuulgewicht van ongeveer 33 kDa, bepaald door SDS-PAGE, 30 (b) een isoëlektrisch punt tussen 5,5 en 6,1, bepaald door chroma- tografisch focusseren, (c) remming van de standaard TNF-bepaling van de differentiële cytotoxiciteit voor met actinomycine D behandelde muizencellen L929, zoals beschreven door G. Nedwin c.s. in " Effects of inter-35 leukin 2, interferon-γ and mitogens of the production of tumour necrosis factors a and β", J. Immunol. 135 (1985) 2492. Deze remming kan overwonnen worden door nog meer TNFa toe te voegen, wat aangeeft dat ze competitief is. De remstof remt ook de werking van TNFB, hoewel de remming van TNFa in deze proef veel efficiënter is dan die van TNFB, 89 00771. .

4 - 4 - (d) remming van de door TNF uitgelokte afgifte van PGE^ uit menselijke fibroblasten en synoviale cellen, (e) remming van de binding van TNFa aan U937-cellen, hetgeen 125 blijkt uit de remming van de binding van I-TNFa, 5 (f) een temperatuur afhankelijke dissociatie van een vooraf ge vormd complex uit TNFa en U937-cellett, (g) geen afbraak van TNF door proteolytische splitsing, en (h) geen remming van de binding van IL-1 aan zijn receptor, zoals 125 blijkt uit de binding van L-IL-Ια aan de thymoom-sublijn 10 EL4-6.1 uit de muis.

Bij voorkeur heeft het TNFaR kenmerken (a) en (b) en sommige van de kenmerken (c) t/m (h). Met bijzondere voorkeur vertoont de TNFaR volgens deze uitvinding alle kenmerken (a) t/m (h).

15 Het eiwit volgens de uitvinding heeft aan het amino- uiteinde de volgende volgorde:

Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Cys-Asn-Ser-Ile 20 Verder gelooft men dat de volgende drie aminozuren een glycosyleringsplaats verschaffen en dat de reeks dus verder gaat met Asn-Ser-Thr-Lys.

Men zal inzien dat de remstof volgens de uitvinding aan zijn amino-uiteinde een aminozuur-volgorde heeft in hoofd-25 zaak iedentiek aan wat zojuist genoemd is. Als er al weglatingen, invoegingen, vervangingen, omkeringen of toevoegen van allele of andere herkomst in zitten dan zal de volgorde toch voor ten minste 80 % en bij voorkeur voor ten minste 90 % homoloog zijn met de volgorde in natief TNFaR, onder behoud van de wezenlijke 30 biologische eigenschappen van dat eiwit.

Aangetoond is dat de TNFa-remmer volgens de uitvinding eiwitachtig is doordat het op een Van tijd en temperatuur afhankelijke wijze door verhitting geïnactiveerd wordt en doordat het door behandeling met trypsine of pronase vernietigd wordt.

35 Ook is aangetoond dat de TNFaR volgens de uitvinding * een glycoproteïne is daar behandeling met het enzym endoglycosi-dase F het molecuulgewicht daarvan met 7 tot 8 kDa vermindert.

De uitvinding betreft dus ook een TNFa-remmer zoals hierboven beschreven, echter in een in hoofdzaak ongeglycosideerde 89 00778 . .

« - 5 - toestand.

De remmers volgens de uitvinding zijn van belang bij de behandeling van toestanden waarin het wenselijk is de TNFa-remming te onderdrukken, bijvoorbeeld gewichtsverlies, shock, 5 cachexie en chronische plaatselijke ontsteking, rheumatoïde arthritis, uitgezaaide intravasculaire coagulatie en nephritis, voor zover door TNFa veroorzaakt.

Een ander aspect van de uitvinding is dus het gebruik van de hierboven beschreven TNFa-remmer of een farmaceutisch 10 aanvaardbaar derivaat daarvan als therapeutisch werkzaam middel bij het behandelen van toestanden die met overmatige of ongecontroleerde TNFa-vorming gepaard gaan. Voor deze behandeling dient men een effectieve hoeveelheid TNFa-remmer of farmaceutisch aanvaardbaar derivaat daarvan toe.

15 De uitvinding betreft ook het bereiden van een genees middel voor de behandeling van aandoeningen die met overmatige of ongecontroleerde TNFa-vorming gepaard gaan.

De vakmensen zullen inzien dat "behandeling" hier zowel voorkomen als genezen betreft. Men zal verder inzien dat de 20 bij een behandeling benodigde hoeveelheid TNFa-remmer niet alleen met de wijze van toedienen zal variëren maar ook met de aard van de behandelde aandoening en met de leeftijd en de toestand van de patiënt, en dat ligt geheel ter beoordeling van de behandelende geneesheer of dierenarts. In het algemeen zal een geschikte dosis 25 echter tussen 5,0 en 500 jig per kg lichaamsgewicht per dag liggen, bijvoorbeeld tussen 30 en 300 jig/kg per dag, bij voorkeur tussen 50 en 150 jigfkg per dag. De gewenste dosis kan in één keer toegediend worden, maar ook verdeeld over twee, drie, vier of meer subdoses per dag.

30 Hoewel het mogelijk is bij een therapie de TNFa- remmer volgens de uitvinding als ruw eiwit toe te dienen gebeurt dat bij voorkeur als farmaceutisch preparaat.

De uitvinding betreft verder een farmaceutisch preparaat dat een TNFa-remmer zoals hierboven gedefinieerd of een farma-35 ceutisch aanvaardbaar derivaat daarvan bevat samen met één of meer farmaceutisch aanvaardbare dragers daarvoor, en eventueel andere therapeutische en/of profylactische bestanddelen. De drager(s) moet(en) "aanvaardbaar" zijn in die zin dat ze verenigbaar zijn met bestanddelen van de formulering en niet schadelijk voor wie 8900779.

<. - 6 - * dat ontvangt.

De remstoffen volgens de uitvinding kunnen daarom geformuleerd worden voor parenterale toediening (bijv. door injectie in één keer, door injectie van een bolus of door continue 5 infusie) en kunnen aangeboden worden in de vorm van eenheids- doses, in ampullen, vooraf gevulde injectiespuiten, kleine infusie-partijtjes en verpakkingen met meerdere doses en toegevoegd conserveringsmiddel. De preparaten mogen vormen als suspensies en oplossingen in waterige dragers aannemen, en mogen formulerings-10 hulpstoffen zoals suspensie-, dispersie- en/of stabiliserende middelen bevatten. Alternatief kan het werkzame bestanddeel de vorm van een poeder hebben, verkregen door aseptisch isoleren of door vriesdrogen van een oplossing, welke vlak voor gebruik met een geschikte drager, bijvoorbeeld steriel pyrogeenvrij water, 15 aangemaakt wordt.

De TNFa-remmer volgens de uitvinding kan ook in combinatie met andere therapeutische middelen gebruikt worden, bijvoorbeeld met andere cytokinen of remmers daarvan.

De uitvinding verschaft dus ook een combinatie van 20 de hierboven gedefinieerde TNFa-remmer of farmaceutisch aanvaard baar derivaat daarvan met een ander therapeutisch werkzame stof, bijvoorbeeld met een ander cytokine of remmer daarvan.

De eiwitten volgens de uitvinding kunnen bereid worden door isoleren uit natuurlijke bronnen en zuiveren en, waar dat 25 gelegen komt, gevolgd door chemische modificatie, maar ook kunnen ze bereid worden met in het gebied van de eiwitsynthese bekende methoden, of met recombinant-DNA-technieken.

Een ander aspect van deze uitvinding is dus een werkwijze voor het bereiden van de tumor necrose factor α-remmer vol-30 gens de uitvinding door zuivering van materiaal van natuurlijke herkomst, in het bijzonder uit urine van patiënten met koorts.

Een dergelijke zuivering omvat bijvoorbeeld de stappen van het concentreren van de ruwe urine, het neerslaan van ruw TNFaR uit die urine en het door fractioneren scheiden van de TNFaR van 35 andere eiwitten in dit neerslag, bijvoorbeeld door ionenwisse- lingschromatografie, gelfiltratiechromatografie, hydrofobiciteits-chromatografie, immunoabsorptie en affiniteitschromatografie over geïmmobiliseerd TNFa.

De TNFa-remmer volgens de uitvinding kan men ook ver- 8900779.

.-7- krijgen uit menselijk weefsel dat macrofagen bevat, bijvoorbeeld uit longspoelingen en extracten van de menselijke lever, uit welke het verkregen kan worden met de standaard zuiveringstechnieken die hierboven al genoemd zijn.

5 De uit de natuur geïsoleerde of met recombinant- technieken gemaakte TNFaR volgens de uitvinding kan in een serie stappen gezuiverd worden, zoals hierboven al genoemd. Na elke zuivering kan de aanwezigheid en zuiverheid van de TNFaR gemeten worden met een cytotoxiciteitsproef in aanwezigheid van actino-10 mycine D met een voor TNF gevoelige cellijn L929, zoals beschreven door G. Nedwin c.s. (loc.cit.).

Bij een bevoorkeurde uitvoeringsvorm van de bereidingswijze wordt de TNFaR eerst geïsoleerd uit onbehandelde urinen van patiënten met koorts (>38,5°C) die vrij van urineweginfecties zijn, 15 onder toepassing van een standaardtechniek voor het concentreren, bijvoorbeeld ultrafiltratie. Een ruwe fractie kan dan uit de ruwe urine neergeslagen worden door bij 4°C en onder roeren ammoniumsul-faat toe te voegen tot een concentratie van 80 %. Bij voorkeur wordt het ammoniumsulfaat stapsgewijs toegevoegd en wordt het bij lagere 20 concentraties (bijv. 40 %) neergeslagen materiaal weggedaan. Het ammoniumsulfaat kan door dialyse verwijderd worden en de dan verkregen fractie met een verscheidenheid van chromatografische technieken gezuiverd ter verwijdering van andere eiwitten.

Zo kan het TNFaR-concentraat gezuiverd worden door 25 ionenwisselingschromatografie welke de eiwitten naar verschillen in elektrische beladingen scheidt, hetgeen een afspiegeling van de zuur/'base-eigenschappen van die eiwitten is. Geschikte materialen voor anionuitwisselingschromatografie zijn aminoethylcellulose-derivaten, bijvoorbeeld kwaternair aminoethylcellulose (QAE-30 cellulose) of diethylaminoethylcellulose (DEAE-cellulose) die in de handel ruimschoots verkrijgbaar zijn. De anionenwisselings-kolom moet van te voren met een geschikte buffer zoals Tris.HCl (die eventueel nog een metaalwegvanger zoals EDTA bevat) in evenwicht gebracht zijn. Vastgehouden materiaal kan met een zout-35 oplossing uit de kolom verwijderd worden (bijvoorbeeld met de evenwichtsbuffer waaraan 0,8 M NaCl toegevoegd is).

Geschikte materialen voor kationenwisselingschromato-grafie zijn cellulose-derivaten zoals carboxymethyl-(CM)-cellulose of Sulphopropyl-Sepharose (van Pharmacia te Uppsala, Zweden). De 8900779.

- 8 - kolom moet met een geschikte "buffer zoals natriumacetaat in evenwicht gebracht worden en gebonden materiaal kan geëlueerd worden met deze evenwichtsbuffer die bijvoorbeeld 0,5 M NaCl bevat.

De werkzame fracties worden verder gezuiverd door af-5 finiteitschromatografie over menselijk TNFa dat aan een geschikte matrix gekoppeld is, bijvoorbeeld aan Mini-Leak Agarose (Kem En Tec van de Biotechnology Corp. in Denemarken). De kolom moet gebufferd zijn, bijvoorbeeld met een 0,8 M fosfaat-buffer met pH = 8,6. Actieve groepen die niet aan het TNFa binden moeten geblok-10 keerd worden, met een ethanolamine.HCl-buffer met pH = 8,5. Ook die kolom moet met een geschikte buffer in evenwicht gebracht zijn, bijvoorbeeld met Tris.HCl dat NaCl bevat en de TNFaR wordt ge-elueerd met een zure glycine-buffer (pH = 3,5). De geëlueerde fracties moeten direct op een pH = 7,0 gebracht worden, bijvoor-15 beeld door de vrije base Tris toe te voegen.

De bij elkaar gevoegde actieve fracties worden bij voorkeur gevriesdroogd voordat ze de uiteindelijke zuivering door snelle vloeistofchromatografie over omgekeerde fase (FPLC) ondergaan. Voordat ze op de FPLC-kolom gebracht wordt moet de gevries-20 droogde TNFaR-fractie met een geschikte buffer zoals trifluor- azijnzuur, heptafluorboterzuur of azijnzuur gebufferd worden.

Elutie van de TNFaR uit de FPLC-kolom kan met gebruikelijke technieken gebeuren, bijvoorbeeld met de eerder genoemde geschikte buffers, waaraan eventueel een alkohol zoals n-propanol toegevoegd 25 is.

De geëlueerde fracties moeten direct gebufferd worden, bijvoorbeeld met ammoniumdicarbonaat, en dan gevriesdroogd. De TNFaR verkeert dan in een in hoofdzaak homogene vorm, geschikt voor het bepalen van de biologische werkzaamheid en voor een geschikte 30 formulering voor therapeutisch gebruik.

Als alternatief betreft de uitvinding dus ook een eiwit dat selectief de via TNFa uitgeoefende werkingen remt en dat op de zo juist beschreven wijze verkregen is of aan een der-gelijk preparaat identiek is.

35 De mogelijkheid de TNFaR volgens deze uitvinding tot homogeen te zuiveren heeft het mogelijk gemaakt de aminozuur-volgorde daarvan vast te stellen, althans aan het N-uiteinde. Deze kennis van de volgorde is een steun bij het klonen van een gen dat voor de TNFaR codeert, wat de produktie van grote hoeveelheden 89 00773 .

- 9 - TNFaR in zuivere vorm voor verder biologisch onderzoek en uiteindelijk voor therapeutisch gebruik mogelijk maakt. In de homogene TNFaR volgens deze uitvinding kan de aminozuur-volgorde met gebruikelijke technieken vastgesteld worden, bijvoorbeeld met het 5 daarvoor in de handel verkrijgbare automatische apparaat met detectie in de gasfase of met ninhydrine. De eerste 17 aminozuren vanaf het N-uiteinde zijn:

Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Cys-Asn-Ser-Ile (vastgesteld met een automatische sequencer, model 477A van Applied 10 Biosystems).

Verder gelooft men dat de volgende drie aminozuren een glycosylideringsplaats verschaffen en dat de keten dus verder gaat met Asn-Ser-Thr-Lys.

Men zal inzien dat een mogelijke methode voor het ver-15 krijgen van grote hoeveelheden TNFaR in zuivere vorm met de in dit vak bekende recombinant-DNA-technieken is. Maar de succesvolle toepassing van zulke technieken vereist niet alleen dat de recombinant-TNFaR of zijn werking nauwkeurig gemeten wordt, maar ook dat zowel het natuurlijke als het recombinant-produkt tot 20 homogeen te zuiveren is.

Nog een ander aspect van deze uitvinding betreft een werkwijze voor het maken van de tumor necrose factor-remmer volgens de uitvinding of een derivaat daarvan door dat een DNA-reeks die voor deze remstof codeert in een geschikt getransfor-25 meerde gastheer tot expressie komt. Zo'n werkwijze houdt het kwe ken van die gastheer in getransformeerd met recombinant-DNA-moleculen die DNA-reeksen bevatten welke voor deze remstof coderen en in een geschikte vector ingebouwd zijn.

Geschikte eukaryotische en prokaryotische gastheren 30 kunnen bijvoorbeeld stammen van bacteriën, gisten, schimmels en dierlijke cellen zijn (waaronder insectencellen) en ook planten-cellen in weefsel. Bijzonder bevoorkeurde gastheercellen zijn die van gisten, van E.coli en die van dieren.

Expressie tot een eiwit met remmende werking op de 35 tumor-necrose-factor wordt bereikt door het kweken van de getrans formeerde gastheer in een geschikt medium. Normaliter zal zo'n medium een stikstofbron zoals ammoniumsulfaat, een bron van koolstof en energie zoals glucose of glycerol, sporenelementen en de voor groei van die speciale gastheercellen benodigde fac- 8900779.

- 10 - toren bevatten. De precieze kweekomstandigheden zullen afhankelijk zijn van de gekozen gastheer; voor E. coli bijvoorbeeld verdient aerobe submerse fermentatie bij ongeveer 37°C de voorkeur.

Bovendien kan expressie uitgelokt worden, bijvoorbeeld 5 door één of andere stof toe te voegen of door omstandigheden in te stellen waarbij het promotorsysteem van deze vector in werking komt.

Afhankelijk van de gastheer kan de TNFa-remmer gevormd worden in korrelvormige insluitlichaampjes 10 die, na lysis van de cellen, door gedifferentieerd centrifugeren gewonnen kunnen worden; ze kunnen dan op gebruikelijke wijze tot oplossing gebracht en met de hier voor het zuiveren van TNFaR uit urine beschreven methoden gezuiverd worden. Maar ook kan de TNFa-remmer in oplossing in het cytosol verkeren, uitgescheiden in de 15 periplasmatische ruimte of heel gewoon in het kweekmedium.

De gastheercellen worden getransformeerd door recombi-nat-DNA-moleculen die een DNA-reeks bevatten welke voor een TNFa-remmer codeert, welke in een expressievector ingevoegd is. Zulke expressievectoren kunnen uit segmenten van chromosomale, niet-20 chromosomale en synthetische DNA-reeksen bestaan, zoals de diverse . bekende derivaten van SV-40 en bekende bacteriele plasmiden, bijvoorbeeld de "natuurlijke" plasmiden zoals ColEl, pSCIOI of pRSF2124 en faag-DNA, of "kunstmatige" plasmiden (in vitro opgebouwd) zoals pBR322, pMB9 en pAT153. Tot het faag-DNA behoren 25 bijvoorbeeld de talrijke derivaten van faag λ en andere DNA- fagen, bijvoorbeeld M13 en andere draadvormige enkelstrengige DNA-fagen. Tot de in gisten nuttige vectoren behoort het 2 ƒ1-plasmide en tot de in eukaryotische cellen zoals diercellen nuttige behoren die die het adenovirus SV-40 en retrovirus bevatten.

30 Zulke expressievectoren kunnen ook gekenmerkt worden door ten minste één reeks die de expressie beheerst, welke werkzaam aan de DNA-reeks voor de TNF-remmer verbonden kan zijn zodat deze de expressie van de gekloonde DNA-reeks regelt. Voorbeélden van nuttige reeksen voor het regelen van de expressie zijn de 35 lac-, trp-, tac- en trc-systemen, de voornaamste operator- en promotor-gebieden van faag λ (zoals de P -promotor die onder

Li controle van de thermolabiele ts cl857-repressor staat), het con-trolegebied van het fd-manteleiwit, de glycolytische promotoren van gist (bijv. de promotor van 3-fosfoglyceraat-kinase), de 40 promotoren van zure fosfatase uit gist (bijv. Pho 5), de promotoren 8800773.

- 11 - van de α-factoren die het paren van gist regelen, en de promotoren afgeleid van polyoom, adenovirus, retrovirus en apenvirus.

Bovendien kunnen zulke expressievectoren diverse plaatsen voor het invoegen van DNA-reeksen voor de TNFa-remmer 5 volgens deze uitvinding bevatten. Deze plaatsen worden gekenmerkt door het specifieke restrictie-endonuclease dat ze daar splitst. Zulke splitsingsplaatsen worden door de vakmensen onderkend. De expressievector, en in het bijzonder de voor het invoegen van het gekozen DNA-fragment gekozen plaats en het werkzame koppelen aan 10 een reeks die de expressie beheerst, wordt bepaald door een ver scheidenheid van factoren waaronder het aantal voor een bepaald restrictie-enzym gevoelige plaatsen, de grootte van het verlangde eiwit, besmetting of binden van het verlangde eiwit door de gastheerceleiwitten die bij het zuiveren moeilijk te verwijderen 15 kunnen zijn, de plaats van start- en stopcodonen, en andere factoren die de vakmensen wel kennen. De keuze van een vector en invoegplaats voor een DNA-reeks wordt dus bepaald door een afweging van al deze factoren, die in een gegeven geval niet alle even zwaar mee tellen.

20 Evenzo zullen niet alle gastheer/vector-combinaties even efficiënt werken bij het tot expressie brengen van de DNA-reeksen volgens deze uitvinding. De keuze wordt gemaakt afhankelijk van een reeks factoren, waaronder de verenigbaarheid van gastheer en vector, het gemak waarmee het gewenste eiwit gewonnen wordt, 25 expressie-eigenschappen van de DNA-reeksen en de werkzaam daarmee gekoppelde controle-reeksen, en van eventueel nodige modificaties van het eiwit na die expressie.

De DNA-reeksen volgens de uitvinding die voor eiwitten met TNFa-remmende werking coderen kunnen geïsoleerd worden door 30 diverse DNA-bibliotheken met behulp van een serie DNA-sondes op dergelijke DNA-reeksen af te zoeken. De DNA-sondes kunnen gemaakt worden uit het gezuiverde natuurlijke eiwit dat voor het opstellen van de aminozuur-volgorde gebruikt werd. Het gezuiverde natuurlijke eiwit kan bijvoorbeeld bereid worden uit urine van koorts-35 patiënten, zoals hierboven al aangegeven. Gedegenereerde DNA- reeksen die voor diverse delen en fragmenten van de aminozuur-reeksen coderen, bijv. in combinatie met afspanende sondes, worden gebruikt om de DNA-sondes te ontwerpen.

Diverse DNA-bibliotheken worden dus afgezocht op DNA- «900779.

- 12 - reeksen die voor de TNFa-remmers volgens de uitvinding coderen.

Zulke bibliotheken omvatten de chromosomale genenbanken en de DNA- en cDNA-bibliotheken aangemaakt uit cellijnen of weefsels waarvan aangetoond is dat ze TNFa-remmers maken, zoals alveolaire 5 macrofagen en leverweefsel. Het afzoeken kan gebeuren door directe immuunexpressie, bijvoorbeeld in Xgtll- of dergelijke systemen, of, in het geval dat de TNFaR-makende cel geïdentificeerd is, door identificatie van het voor de TNFaR specifieke mRNA door directe expressie in Xenopus-oocyten.

10 Een verscheidenheid van gebruikelijke klonings- en selectietechnieken kan gebruikt worden om DNA-reeksen op te sporen en te identificeren die bij expressie in een geschikt eukaryo-tische of prokaryotische gastheercel voor de TNFa-remmers van deze uitvinding coderen. Deze uitgelezen DNA-reeksen kunnen zelf als 15 sondes dienen voor het uitzoeken van andere DNA-reeksen die voor TNFa- remmers coderen ei ze kunnen in geëigende recombinant-DNA-moleculen gebruikt worden om geëigende eukaryotische of prokaryotische gastheercellen te transformeren zodat ze dan de gecodeerde TNFaR gaan produceren.

20 Een aspect van de uitvinding betreft ook de enkel voudige en dubbelstrengige DNA-reeksen die voor TNFaR coderen, vectoren die zulke reeksen bevatten en voor transformatie in een gastheer geschikt zijn, en met zulke DNA-reeksen getransformeerde gastheercellen.

25 Binnen het kader van deze uitvinding valt ook elk eiwit met selectieve TNFa remmende werking dat gemaakt wordt door door expressie van een DNA-reeks die voor zo'n eiwit codeert in een daarmee getransformeerde gastheer. TNF-remmers volgens de uitvinding die aldus gemaakt zijn zullen dus identiek zijn aan de 30 natieve TNFaR of ëén of meer weglatingen, vervangingen, invoe gingen, omkeringen of toevoegingen van allele of andere herkomst bevatten, maar voor ten minste 80 % en bij voorkeur voor ten minste 90 % homoloog zijn met de natieve TNFaR en in wezen dezelfde biologische eigenschappen hebben. In het bijzonder kan een 35 TNF-remmer volgens de uitvinding een N-eindstandig methionine hebben. Ook kan bijvoorbeeld de DNA-reeks volgens de uitvinding die voor TNFaR codeert in een expressievector versmolten worden met een deel van een DNA-reeks die voor een eukaryotisch of prokaryotisch polypeptide codeert, zulks ter ondersteuning van de expressie van 6900779.

- 13 - de voor TNFaR coderende DNA-reeks of voor de afscheiding, rijping of zuivering daarvan; het versmolten polypeptide kan met bekende technieken intra- of extracellulair verwijderd worden of men kan de TNFaR samen met het gesmolten polypeptide gebruiken.

5 De TNFaR gemaakt door het kweken van eukaryotische of prokaryotische gastheercellen die met voor TNFaR coderende DNA-reeksen getransformeerd zijn kunnen dan, na zuivering, in farmaceutische preparaten volgens de uitvinding gebruikt worden.

Men zal inzien dat de TNFaR volgens de uitvinding bij 10 produktie door dierlijke cellen een glycoproteïne zal zijn. Pro karyotische expressiesystemen zullen echter een eiwit in niet ge-glycosideerde toestand geven. Bovendien kan het geglycosideerde eiwit met in dit vak bekende technieken in hoofdzaak volledig ont-glycosideerd worden, bijvoorbeeld met behulp van endoglycosidasen. 15 De uitvinding wordt nader toegelicht door de volgende, niet beperkende voorbeelden. Alle temperaturen zijn in °C en alle concentratiepercentages hebben betrekking op gewicht op volume.

Bepaling van de remming van TNFa Het percentage TNFaR-werking in de in de voorbeelden 20 beschreven fracties werd bepaald onder aanname dat de extinctie van door actinomycine D (afgekort tot "act D") gestimuleerde muizencellen L929 overeenkomt met 100 % remming, terwijl de extinctie van met actinomycine D en TNFa gekweekte cellen overeenkomt met een maximale mortaliteit, dus met 0 % remming door 25 TNFa. Het in deze proeven gebruikte TNFa was recombinant-menselijk TNF (rhTNF ), gemaakt in E.coli zoals beschreven door A. Marmenout c.s. in "Molecular cloning and expression of human tumour necrosis factor and comparison with mouse tumour necrosis factor", Eur. J. Biochem. 152 81985), 515. Het percentage TNFa-30 remming werd bij de bepaling van de cytotoxiciteit dus berekend volgens de formule (I) (ext, met act. D + rhTNFa + TNFaR) χ - (ext, met act D + rhTNFa)_ (ext. met act D) - (ext. met act D + rhTNFa) 35

Voorbeeld 1

Bereiding van TNFaR uit urine a) Concentreren van het eiwit uit menselijke urine *900779.

- 14 -

Van een groep van vijf patiënten die nog geen enkele behandeling ondergaan hadden werd 15 liter urine verkregen. Twee patiënten leden aan kleine cellen-carcinoom, éën aan kwaadaardige histocytose, ëén aan polymyocitis en één aan sepsis. Alle hadden 5 hoge koorts (>38,5°C) maar waren vrij van urineweginfecties. De urine werd bij 4°C geconcentreerd in een holle vezel ultrafil-tratie-apparaat van Amicon met een retentiedrempel van ongeveer 5 kDa.

b) Neerslaan van het eiwit uit de geconcentreerde urine 10 Aan de geconcentreerde partij urine werd bij 4°C onder voortdurend roeren vast ammoniumsulfaat toegevoegd tot een ver-zadigingsgraad van 40 %. Het ontstane neerslag werd door centrifugeren verwijderd en weggedaan en in de bovenstaande vloeistof werd door toevoegen van nog meer ammoniumsulfaat de verzadigingsgraad 15 op 80 % gebracht. Door centrifugeren werd een sediment verkregen dat weer gesuspendeerd werd in 150 ml 20 mM natriumfosfaat (pH = 7,2) en 150 mM NaCl. Het ammoniumsulfaat werd verwijderd door dialyse bij 4°C tegen 10 mM Tris.HCl dat 2 mM EDTA en 5 mM benzami-dine.HCl bevatte (pH = 7,4).

20 c) Identificatie van de TNFaR-werking.

Het half gezuiverde concentraat van 1(b) werd op cytotoxiciteit beproefd met de voor TNF gevoelige cellijn L929 in aanwezigheid van actinomycine D. Met een 1:20 verdunning van de half gezuiverde oplossing werd een totale remming van het 25 cytotoxische effect van rhTNFa vastgesteld; de extinctie bij 570 nm was gelijk aan die gemeten in aanwezigheid van alleen actinomycine D, te weten 1,5.

Verder werd een remmende werking gevonden bij verdunningen tot 1:160 toe (E^q = 0,83), terwijl de blanco waarde 30 met rhTNFa in een eindeoncentratie van 0,2 ng/ml in aanwezigheid van actinomycine D lager was (E57q = 0,73), zodat 50 % remming waargenomen werd bij een verdunning van ongeveer 1:100 (E^q = 1,10). De TNFaR had bij beproeven zonder actinomycine D geen effect op de levensvatbaarheid der cellen.

35 d) Vergelijking van het effect van TNFaR op de door TNFa en β veroorzaakte cytotoxiciteit

Een cytotoxiciteitsproef werd uitgevoerd met de voor TNF gevoelige cellijn L929 in aanwezigheid van actinomycine D met een reeks van TNFa- en TNFB-concentraties. De half gezuiverde op- 89 0077 9 - 15 - lossing van 1(b) werd in verdunningen 1:20, 1:50 en 1:80 beproefd. Blanco proeven werden uitgevoerd door bij afwezigheid van de remstof TNFa en TNF8 weg te laten. De uitkomsten staan in tabel 1 en laten zien dat de remmer volgens de uitvinding op de 5 via TNF8 werkende cytotoxiciteit heeft, gaande van ongeveer 50 % tot slechts 2 % remming van het TNFa bij toenemende TNFB-concentra-tie.

Tabel 1

Eindconcentratie aan TNF Vorm van Es7n van L929-cellen 10 (a of 8) (pg/ml) cytokine

Toegevoegd aan met actinomy- dat aan de Eindverdunning_ cine D behandelde L929-cellen cellen toe- _gevoegd werd 1/1 1/20 1/50 1/80 0 0 >1,90 >1,90 >1,90 >1,90

15 10 α NB NB NB NB

8 1,16 1,66 1,46 1,39 20 α 1,30 >1,90 1,72 1,68 β 1,02 1,51 1,21 1,22 50 α 1,02 >1,90 1,72 1,68 20 0 0,65 1,03 0,84 0,68 100 α 0,73 1,78 1,69 1,51 β 0,37 0,71 0,59 0,52 250 α 0,38 1,70 1,70 1,33 0 0,24 0,44 0,31 0,24 25 500 α 0,30 1,52 1,49 1,11 8 0,17 0,30 0,26 0,18 1250 α 0,19 1,09 1,10 0,76 8 0,11 0,13 0,19 0,13 2500 α 0,06 1,03 0,80 0,47 30 _._8_NB NB NB ΝΒ

Voorbeeld 2

Gelfiltratie van TNFaR uit urine

De half gezuiverde TNFaR van voorbeeld 1(b) werd ge-35 zuiverd door gelfiltratiechromatografie bij 4° over een kolom

Sephacryl S-200 (van Pharmacia de Uppsala, Zweden) van 0,9 x 60 cm, welke in evenwicht gebracht was met 50 mM Tris.HCl-buffer (pH = 7,4) die 100 mM NaCl bevatte. Van deze fractie werd 0,8 ml (20 1¾ eiwit) op de kolom gebracht en dat werd met dezelfde 40 buffer met een debiet van 5,4 ml/uur geëlueerd. Er werden frac ties van 1,35 ml opgevangen die op TNFaR-werking onderzocht werden. Deze remmende werking verscheen in één enkele piek. De remmende werking had een schijnbaar molecuulgewicht van 40 tot 60 kDa (zie figuur 1).

8800779 .

- 16 -

Voorbeeld 3

Chromatograflsch focusseren van TNFaR uit urine

De half gezuiverde TNFaR van voorbeeld 1(b) werd bij 4° chromatografisch gefocusseerd over een vooraf gepakte kolom 5 Mono-P (HR 5/20, 5 x 200 mm) (van Pharmacia te Uppsala, Zweden) die met een 25 mM Bis-Tris-buffer, waarvan de pH met imino-diazijnzuur (van Fluka te Buchs, Zwitserland) op 7,1 gesteld was) in evenwicht gebracht was. Er werd op de kolom een monster met 30 mg eiwit gebracht en dat Werd geëlueerd met "polybuffer 74" 10 die iminodiazijnzuur bevatte (pH = 4,0). Fracties van 1 ml werden na verdunning 1:10 op hun effect op de cytotoxiciteit van 0,2 ng/ml rhTNFa in aanwezigheid van 1 ^xg/ml actinomycine D beproefd. De feitelijke pH van iedere fractie uit de kolom werd met een pH-meter gemeten; de grootste hoeveelheid van de TNFaR-werking 15 zat in de fracties die met pH tussen 5,5 en 6,1 vrijkwamen (zie figuur 2). Dat komt dus overeen met het isoëlektrische punt van het eiwit TNFaR.

Voorbeeld 4

Ionuitwisselingschromatografie van TNFaR uit urine 20 De half gezuiverde TNFaR van voorbeeld 1(b) werd ge zuiverd door anionenuitwisselingschromatografie bij 4° over een kolom DEAE-Sephadex van 2,6 x 20 cm (van Pharmacia te Uppsala, Zweden) die in evenwicht gebracht was met een 10 mM Tris.HCl-buffer (pH = 8,0) welke 2 mM EDTA bevatte. Gebonden materiaal werd 25 uit de kolom geëlueerd met dezelfde buffer die 0,8 M NaCl bevatte.

Er werden fracties van 8,0 ml opgevangen die op TNFaR-werking onderzocht werden en de remmende fracties werden bij elkaar gedaan (160 ml) en tegen 4x2 liter 10 mM natriumacetaat-buffer met pH = 5,0 gedialyseerd.

30 De TNFaR werd verder gezuiverd door kationuitwisse lingschromatografie bij 4° over een kolom Sulphopropyl-Sephadex van 0,8 x 15 cm (ook van Pharmacia te Uppsala, Zweden) die in evenwicht gebracht was met een 10 mM natriumacetaat-buffer met pH = 5,0. Gebonden materiaal werd uit de kolom geëlueerd met de 35 zelfde buffer die 0,5 M NaCl bevatte. Er werden fracties van 7,5 ml opgevangen die op TNFaR-werking onderzocht werden en de remmende fracties werden bij elkaar gedaan en 20-voudig geconcentreerd in een ultrafiltratie-apparaat van Amicon met een scheidings-drempel van ongeveer 10 kDa.

8306779 .

- 17 -

Voorbeeld 5

Gelfiltratie van de TNFaR uit urine

Het TNFaR-concentraat van voorbeeld 4 werd verder gezuiverd door gelfiltratiechromatografie bij 4° over een kolom 5 Sephacryl S-200 van 2,6 x 100 cm (ook van Pharmacia te Uppsala,

Zweden) die in evenwicht gebracht was met een 50 mN Tris.HCl-buffer met pH = 7,4. Van het produkt van voorbeeld 4 werd 200 mg op de kolom gebracht en dat werd geëlueerd met de evenwichtsbuffer met een debiet van 27 ml/uur. Er werden fracties van 9,0 ml op-10 gevangen die op TNFaR-werking onderzocht werden, en de remmende fracties werden bij elkaar gedaan. Zoals figuur 4 laat zien was de kolom geijkt met dextraanblauw (DB) van 2000 kDa, runderserum-albumine (BSA) van 67 kDa, ovalbumine (OA) van 43 kDa, a-chymo-trypsinogeen-A (aCT) van 25 kDa en rubonuclease A (RNase) van 15 13,5 kDa.

Voorbeeld 6

Affiniteitschromatografie van TNFaR uit urine

Een affiniteitskolom voor TNFa werd aangemaakt door 1,0 mg recombinant-menselijk TNFa in 0,8 M kaliumfosfaat-buffer 20 met pH = 8,6 te koppelen aan agarose "Mini Leak" (van Kern En Tec

Biotechnology Corp. in Denemarken). De overblijvende actieve groepen werden geblokkeerd door incuberen in 0,1 M ethanolamine. HCl-buffer van pH = 8,5. Het gel werd uitgewassen met 3 x 50 ml 50 mM Tris.HCl-buffer met pH = 7,4 die 100 mM NaCl bevatte.

25 Op deze kolom werd 15 ml TNFaR-fractie van voorbeeld 5 gebracht en dat werd met een 0,2 M glycine.HCl-buffer van pH = 3,5 geëlueerd.

Er werden fracties van 1,0 ml opgevangen waarvan de pH direct met 1 M Tris op 7,0 gebracht werden (5 tot 40 jxl) en daarna beproefd op TNFaR-werking.

30 Voorbeeld 7

Chromatografie met omgekeerde fasen van TNFaR uit urine

De TNFaR-fracties van voorbeeld 6 werden gevriesdroogd, in 2,0 ml 0,1 % trifluorazijnzuur opgenomen en op een 5 x 20 cm kolom ProRPC voor chromatografie met omgekeerde fasen 35 (ook van Pharmacia te Uppsala, Zweden) gebracht, welke met 0,1 % trifluorazijnzuur in evenwicht gebracht was. Gebonden materiaal werd geëlueerd met een gradiënt van 0 tot 100 % acetonitril in 0,1 % trifluorazijnzuur-oplossing, met een debiet van 0,3 ml/min. Aan elke fractie van 0,75 ml werd 10 jil 0,5 M ammoniumbicarbonaat 8900778.

- 18 - toegevoegd en daarna werd gevriesdroogd.

Bij de vloeistofchromatografie met omgekeerde fasen verscheen maar één belangrijke piek die met de TNFaR-werking overeen kwam. De gevriesdroogde fracties die deze werking bevat-5 ten werden samen opgelost in 10 mM Tris.HCl-buffer met pH = 7,4 die 2 mM EDTA bevatte en door elektroforese over natriumdodecyl-sulfaat-polyacrylamide-gel volgens de door U. Laemmli c.s. in Nature 277 (1970) 680 beschreven methode. De TNFaR bleek te elueren met een molecuulgewicht van 33 kDa (zie figuur 4). Onder 10 niet-reducerende omstandigheden gelopen monsters werden in een verdunning van 1:10 in aanwezigheid van 0,15 mg/ml rhTNFa op TNFaR-werking voor L929-cellen beproefd. De werking tegen het rhTNFa liep met een schijnbaar molecuulgewicht gelijk aan dat van de 33 kDa-band onder reducerende omstandigheden.

15 Voorbeeld 8

Opstellen van de aminozuurvolgorde in TNFaR

De bij chromatografie met omgekeerde fasen geïsoleerde TNFaR-fractie werd onder vacuum geconcentreerd en op een geconditioneerd volgordefilter gebracht. Het eiwit werd met een 20 volgordebepaler Model 477A van Applied Biosysterns onderzocht.

Fracties van de volgorde-cycli werden drooggedampt en in Ν,Ν-diisopropylethylammöniumacetaat/acetonitril gesuspendeerd voor dat ze ter identificatie in een HPLC-kolom geïnjiceerd werden.

De eerste 17 aminozuur-resten vanaf het N-uiteinde 25 werden geïdentificeerd; dit waren: Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-

Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Cys-Asn-Ser-Ile. Verder gelooft men dat de volgende drie aminozuren een glycosyleringsplaats vormen en dat de reeks dus verder gaat met Asn-Ser-Thr-Lys. Deze volgorde is niet noemenswaard homoloog met enige aminozuur-volgorde in de 30 aminozuur-volgorde-database van de NBRF (november 1988).

Voorbeeld 9

Aantonen dat de TNFaR een eiwit is (a) Van tijd en temperatuur afhankelijke denaturering

De over Sephacryl S-200 gezuiverde TNFaR van voor-35 beeld 2, verkregen door de buizen met werkzame fractie bij elkaar te doen, werd tot 56°, 75° en 95° verhit. De TNFaR-werking werd na 10, 20 en 60 minuten gemeten en vergeleken met die van onbehandelde monsters. Het percentage werking werd volgens formule I berekend. De uitkomsten die in tabel 2 hieronder staan laten zien 8900779.

- 19 - dat de werking van de TNFaR in een van tijd en temperatuur afhankelijke wijze afneemt.

Tabel 2

Inactivering door verhitting 5 Temperatuur (°C) Tijd (min) Percentage TNFaR-werking 56 10 100 20 100 60 93 75 10 60 10 20 26 60 15 95 10 27 20 10 __60_ 13_ 15 (b) Gevoeligheid voor trypsine

Aan de bij elkaar gebrachte fracties van over Sephacryl S-200 gezuiverd TNFaR van voorbeeld 2 werd 500 jig trypsine (van Sigma te St. Louis, MO) in 0,2 M Tris.HCl-buffer (pH = 8,0) gebracht. Na 4 uur incuberen op 37°C werd nog eens 500 jig trypsine 20 toegevoegd en werd de filtrering nog 20 uur voortgezet. Nu werd de reactie afgebroken door 2 mg trypsine-remmer uit sojabonen (ook van Sigma te St. Louis, MO) toe te voegen. De TNFaR-werking van deze door trypsine verteerde partij en van een blanco partij werden in een eindverdunning van 1:20 op rhTNFa in aanwezigheid 25 van actinomycine D op L929-cellen bepaald; de uitkomst werd vol gens formule I berekend. De uitkomsten staan in tabel 3 hieronder.

Tabel 3

Inactivering door trypsine

Omstandigheden Percentage E_7_ 30 _TNFaR-werking_

Buffer alleen 0 0,71

Trypsine + trypsine-remmer 0 0,70 uit sojabonen in buffer

Gedeeltelijk over 61 1,46 35 Sephadex S-200 gezuiverd

Gedeeltelijk over 23 1,03

Sephadex S-200 gezuiverd en met trypsine verteerd 40 (c) Behandeling met ureum

De oplossing van de over S-200 gezuiverde TNFaR van voorbeeld 2 werd 2 M aan ureum gemaakt en vervolgens uitgebreid bij 4° gedialyseerd tegen met fosfaat gebufferde zout-oplossing 8900779.

- 20 - die ook 2 M aan ureum was. Vlak voor de biologische bepaling werd deze dialyse herhaald. De TNFaR-werking bleek er niet door beïnvloed te worden, hetgeen aangeeft dat er bij deze remming geen aan het eiwit gebonden laag moleculaire stof in het spel is.

5 Voorbeeld 10

Aantonen van competitieve remming

De over Sephacryl S-200 gezuiverde TNFaR van voorbeeld 2 werd in een 1:10 verdunning tegen toenemende hoeveelheden rhTNFa met L929-cellen ingezet. Er was een omgekeerd verband tus-10 sen de bij de proef aanwezige hoeveelheid rhTNFa en de mate van remming (zie fig. 3). De remmende werking wordt dus competitief overwonnen door de hoeveelheid rhTNFa te verhogen.

Voorbeeld 11

Remming van de door TKFa versterkte PGE^-vorming door huid-15 fibroblasten

Menselijke huidfibroblasten werden in een concentratie 4 van 2,0 x 10 cellen per putje uitgezaaid en 48 uur gekweekt. Als blanco werden er toen cellen gestimuleerd met DMEM-buffer waaraan 10 % FCS toegevoegd was. Ook werden er cellen gestimuleerd met 20 rhTNFa in concentraties van 0,5 tot 5 mg/ml, en het effect van de TNFaR van voorbeeld 5 werd in drie verdunningen (1:20, 1:50 en 1:80) in die buffer bestudeerd. Na 72 uur incuberen werd de vorming in de bovenstaande vloeistoffen gemeten door radio-immunoessaai m.b.v. een serum tegen PGE^ (zie J.M. Dayer c.s. in 25 J. Clin. Invest. 67 (1979) 1386).

De hieronder in tabel 4 opgegeven uitkomsten laten zien dat het vermogen van rhTNFa om de PGE^-vorming door huidfibroblasten te stimuleren in alle drie verdunningen door TNFaR geremd werd. Bij de verdunning van 1:80 werd de remming door 30 TNFaR gedeeltelijk overwonnen door de concentratie aan rhTNFa te verhogen.

35 $900779.

- 21 -

Tabel 4

Concentratie aan Vorming van PGE^ door menselijke fibro- rhTNF op mense- blasten (ng/ml)_ lijke fibroblasten „ , . , (pg/ml) Verdunning van de TNFR_ 5 _niet_1:80_1^50_1:20 0 50,6 ± 7,4 88,8 ± 5,6 103,0± 8,9 111,0+ 9,4 500 160,0 ± 14,1 126,0 ± 9,3 115,9± 6,6 113,9± 7,1 2000 331,7 ± 28,4 217,2 ± 10,7 156,7+10,7 115,3+21,3 5000 381,7 ± 19,6 257,2 ± 13,7 253,1±21,2 221,6±16,0 10

Met dezelfde fibroblastenstam werden er drie verschillende proeven uitgevoerd. Buffer of buffer met TNFaR werden met verschillende concentraties aan rhTNFa geïncubeerd. De FGE^-vorming door de gekweekte huidfibroblasten werd na 3 dagen gemeten, De opge-15 geven cijfers zijn de gemiddelden van drie kweken ± SFGem (n = 3).

Voorbeeld 12

Bepaling van de mate van remming van de binding van rhTNFa

Reeombinant-menselijk TNFa werd gejodeerd met de jodogeen-methode van Fraker en Speck jr., Biochem. Biophys. Res. Comm.

20 80 (1978) 849. De specifieke activiteit van het /-TNFa

was 2,2 x 10^ tpm/ng en het gaf bij elektroforese over SDS-PAGE

ëën enkele band met een molecuulgewicht van 17 kDa. De menselijke 6 macrofagen-cellijn U937 werd in porties van 10 cellen 2 uur bij 4°C geïncubeerd in 200 jil medium dat RPMI 1640 (van Gibco te 25 Paisley, Schotland) bevatte, aangevuld met 100 ^ig/ml streptomycine (100 E/ml penicilline), 1,0 % glutamine en 10 % foetaal kalver- 125 — serum, en dat bovendien 0,04 % natriumazide en 0,5 ng I_J~ TNFa bevatte. Het remmen van de binding gebeurde door TNFaR in diverse verdunningen (1:20, 1:200 en 1:2000) toe te voegen.

30 Niet-specifieke binding werd gemeten in aanwezigheid van een 100-voudige overmaat ongemerkt rhTNFa, en de vrije radio- 125 activiteit werd van het gebonden Ι-TNFa gescheiden door centrifugeren door een oliemengsel, zoals beschreven door Robb c.s. in J. Exp. Med. 154 (1981) 1455. Aan cellen gebonden I_/-TNFa 35 werd gemeten in een γ-teller (van de LKB te Bromma, Zweden) en het percentage bindingsremming werd berekend volgens formule II.

6900779 .

- 22 -

Percentage van de bindingsremming = "tpm met TNFaR - tpm door niet-speci- 100 x 1 - -—-,-^leke binding- (II) tpm van totale - tpm door met speci-5 binding fieke binding

Voorbeeld 13 * 125

Effect van TNFaR op het binden van I-TNFa aan U937-cellen U937-cellen werden vooraf 1 uur bij 20°C geïncubeerd 125 10 in het kweekmedium van voorbeeld 12, hetzij met alleen I-TNFa 125 hetzij met I TNFa en een 100-voudige overmaat niet gemerkt rhTNFa. De U937-cellen werden dan bij 4°C afgecentrifugeerd en driemaal met 50 ml met fosfaat gebufferde zout-oplossing uitge- 125 wassen, De alleen met I-TNFa geïncubeerde cellen werden over 15 vier porties verdeeld en of alleen met buffer of met drie ver schillende verdunningen (1:20, 1:200 en 1:2000) van de TNFaR van voorbeeld 5 geïncubeerd.

Met deze drie verdunningen bleek de specifieke binding 125 van I-TNFa aan U937-cellen bij 4°C voor respectievelijk 100 %, 20 80 % en 35 % onderdrukt te worden. De blanco portie, waarin hele maal geen TNFaR zat vertoonde geen remming. De bindingsremming door de twee zwakkere oplossingen bleek tot respectievelijk 125 90 % en 60 % verhoogd te worden toen I-TNFa vooraf in verdunningen van 1:200 en 1:2000 met de TNFaR geïncubeerd werd, voor-25 dat er cellen aan toegevoegd werden.

Deze proef werd herhaald met cellen die vooraf ge-125 incubeerd waren met I-TNFa en een 100-voudige overmaat niet gemerkt TNFa, zodat het percentage bindingsremming gecorrigeerd kon worden voor de niet-specifieke binding.

30 Voorbeeld 14

Dissociatie van een vooraf gevormd complex van TNFa met U937 125 U937-cellen werden 1 uur voorgeïncubeerd met I-TNFa, zoals in voorbeeld 12 beschreven. De cellen werden afgecentrifugeerd en uitgewassen en of bij 4° of bij 37°C geïncubeerd, 35 al dan niet in aanwezigheid van de TNFaR van voorbeeld 5, Het aan 125 celoppervlak gebonden I-TNFa bleek sneller te dissociëren in aanwezigheid van TNFaR dan bij afwezigheid daarvan, en dit bleek in een van tijd en temperatuur afhankelijke wijze te gebeuren (zie figuur 6).

8900773 - 23 - *

Voorbeeld 15 TNFaR is niet proteolytisch voor TNFa 125 Ι-TNFa werd 1 uur bij 20° met drie verschillende verdunningen (1:20, 1:200 en 1:2000) met TNFaR geïncubeerd, en 5 ook met alleen buffer. Bij elektroforese over SDS-PAGE en auto- 125 radiografie bleek het I-TNFct als ëén enkele band te lopen, zowel bij afwezigheid als bij aanwezigheid van TNFaR, hetgeen laat zien dat de remstof geen proteolyse veroorzaakt.

Voorbeeld 16 10 Effect van de TNFaR op de binding van IL-1 aan zijn receptor

De invloed van de TNFaR van voorbeeld 5 werd nagegaan op de binding van IL-1 aan LAF (lymfocyten activerende factor) , met inductie door zowel IL-Ια als door IL-18. (Deze proef is beschreven door P. Seckinger c.s. in J. Immunol. 139 (1987) 15 1541 voor een eiwit dat IL-1 remt.) Zowel met IL-Ια als met IL-18 3 werd er een van de dosis afhankelijk inbouwen van H-thymïdine waargenomen (wat een vermenigvuldiging der thymocyten betekent) in concentraties tot 200 pg/ml toe. Toevoegen van TNFaR in gehalten die het rhTNFa afremden had geen significant effect op de 20 door IL-1 veroorzaakte vermeerdering der thymocyten, wat laat zien dat de remming specifiek voor TNFa is.

De verkregen uitkomsten zijn toegelicht door de hierbij behorende tekeningen, waarvan 25 Figuur 1 het werkzaamheidsprofiel van het gelfiltraat over Sephacryl S-200 van ruwe TNFaR uit urine geeft. Fracties van 1 ml werden in een verdunning van 1:10 in aanwezigheid van 1,0 jsg/ml actinomycine D op de invloed op cytotoxiciteit van 1,0 ng/rnl rhTNFa beproefd (o-o). De lijn ( - ) stelt de extinctie 30 bij 280 nm van de fracties voor. De blokken ter linkerzijde stellen de lysis der cellen voor, gemeten door opname van kleurstof in respons op actinomycine D (0 ) en op actinomycine D plus hrTNFa ( E2 ) zonder urine. De molecuulgewichtsmerken zijn dextraanblauw (DB), runderserumalbumine (BSA), ovalbumine (OA), a-chymotrypsino-35 geen (aCT), ribunuclease A (RNase) en fenolrood (J-red).

Figuur 2 het werkzaamheidsprofiel van het chromatogra-fisch focusseren over een Mono-P-kolom van ruwe TNFaR uit urine geeft. Fracties van 1 ml werden in een verdunning van 1:10 beproefd op invloed op de cytotoxiciteit van 0,2 ng/ml rhTNFa in 8900778.

- 24 - aanwezigheid van 1,0 ^ig/ml actinomycine D (o-—o). De lijn ( -— ) geeft de extinctie bij 280 nm van de fracties weer en ( —-—- ) stelt hun pH voor. De staven zijn als aangegeven voor figuur 1.

5 Figuur 3 de omkeerbaarheid van de TNFaR-werking laat zien. De lijn (o-o) geeft de in aanwezigheid van actinomycine D, rhTNFa en TNFaR gemeten extincties bij 570 nm weer, de lijn (·-·) geeft de alleen in aanwezigheid van actinomycine en

rhTNFa gemeten extincties bij 570 nm weer; de staaf ( Θ ) stelt 10 de extinctie bij 570 nm in aanwezigheid van alleen actinomycine D

(l,0^ig/ml) voor.

Figuur 4 het werkzaamheidsprofiel van een gelfiltraat over Sephacryl S-200 van gezuiverde TNFaR van voorbeeld 5 geeft. Fracties van 9 ml werden gesteriliseerd en in een verdunning van 15 1:50 tegen 1,0 mg/ml rhTNFa beproefd, in aanwezigheid van 1,0 yig/ml actinomycine D, waarbij de cytotoxiciteit op L929 het krite- rium was (o-o). De lijn ( - ) stelt de extinctie bij 280 nm van de fracties voor. De staven zijn als gedefinieerd voor figuur 1.

20 Figuur 5 de elektroforese over SDS-PAGE van gezuiverde TNFaR van voorbeeld 7 weergeeft. Deze chromatografie gebeurde zoals beschreven door U. Laemmli c.s. (loc. cit.). Monsters werden gebracht op een 15 % polyacrylamide-gel met in de kop een 3 % gel, en deze gelen werden met zilver gekleurd, zoals beschreven door 25 C. Merril c.s. in Proc, Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4335.

Onder niet-reducerende omstandigheden gelopen monsters werden op biologische werking beproefd door uit het gel schijfjes van 2 mm te snijden en de eiwitten er overnacht uit te elueren met 200 jil 10 mM Tris.HCl-buffer van pH = 7,4 die 2 mM EDTA bevatte. De 30 fracties werden in een verdunning van 1:10 in aanwezigheid van 0,15 ng/ml rhTNFa op L929-cellen beproefd.

Figuur 6 het effect van TNFaR op de binding van 125 I-TNFa aan U937-cellen geeft. De TNFaR werd in drie verschil- 125 lende verdunningen in aanwezigheid van I-TNFa met de U937-35 cellen geïncubeerd, zoals beschreven in voorbeeld 13. De open vierkantjes (D - □) stellen de incubatie in aanwezigheid van TNFaR voor en de open driehoekjes (Δ-Δ) stellen de blanco's voor.

Gesloten symbolen betreffen een 30 minuten voorincuberen van de 125 TNFaR bij 20° met I-TNFa voordat de cellen toegevoegd werden.

8900779.

- 25 -

Figuur 7 de dissociatie van een vooraf gevormd complex van TNFa met U937 voorstelt. De U937-cellen werden vooraf 125 met Ι-TNFa geïncubeerd, uitgewassen en dan met TNFaR zoals in voorbeeld 14 beschreven» hetzij bij 4° (Q-0) hetzij bij 5 37°C (I-— ). Bij de aangegeven tijden werden de hg de cel len behorende radioactiviteiten gemeten en werden de percentages specifieke binding vastgesteld. In de grafiek is de voor de blanco zonder remstof verkregen waarde afgetrokken van de bij de twee temperaturen verkregen uitkomsten; 100 % komt dus overeen met de 10 uitkomst zonder dat TNFaR toegevoegd was.

8900779.

Claims (23)

1. Een eiwit dat de door tumor necrose factor α (TNFa) uitgeoefende werkingen remt maar geen andere eiwitten remt 5 die met TNFa sommige maar niet alle biologische werkingen gemeen hebben.

2. Eiwit dat selectief de door tumor necrose factor α uitgeoefende werking remt en één of meer der volgende kenmerken vertoont: 10 (a) een molecuulgewicht tussen 40 en 60 kDa, bepaald door chroma- tografie over een molecuulzeef, (b) een isoëlektrisch punt tussen 5,5 en 6,1, bepaald door chromatografisch focusseren, (c) remming van de standaard TNF-bepaling van de differentiële 15 cytotoxiciteit voor muizencellen L929 die met actinomycine D behandeld zijn, (d) remming van de door TNF veroorzaakte afgifte van PGE^ uit menselijke fibroblasten en synoviale cellen, (e) de remming van de binding van TNFa aan Ü937-cellen, zoals 20 blijkt uit het onderdrukken van het inbouwen van radioactief 125 gemerkt TNFa ( I-TNFa), (f) het op een van de temperatuur afhankelijke bevorderen van de dissociatie van een vooraf uit TNFa en U937-cellen gevormd complex, 25 (g) het niet afbreken van TNF door proteolytische splitsing, (h) het niet remmen van de binding van IL-1 en zijn receptor, 125 blijkende uit de opname van radioactief IL-1 ( I-IL-Ια) door de muizen-thymoom-sublijn EL4-6.1.

3. Eiwit volgens conclusie 2, echter met een molecuul- 30 gewicht van ongeveer 33 kDa, zoals bepaald door elektroforese over SDS-PAGE.

4. Eiwit volgens conclusie 2 of 3, met in ieder geval de kenmerken (a) en (b) en met één of meer der kenmerken (c) t/m (h).

5 Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Cys-Asn-Ser-Ile- Asn-Ser-Thr-Lys.

5. Eiwit volgens conclusie 2 of 3 met alle kenmerken (a) t/m (h).

6. Eiwit volgens een der conclusies 1 t/m 5 dat met een in de natuur voorkomende TNFa-remmer overeenkomt.

7. Eiwit volgens een der conclusies 1 t/m 6 met aan 8900779. -ψ het amino-uiteinde de volgende aminozuur-volgorde: Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Cys-Asn-Ser-Ile.

8. Eiwit volgens conclusie 7 met aan het amino-uiteinde de volgende aminozuur-volgorde:

9. Eiwit volgens een der conclusies 1 t/m 8 met in de reeks aminozuren één of meer weglatingen, vervangingen, invoegingen, omkeringen of toevoegingen van allele of andere 10 herkomst, welke echter voor ten minste 80 % homoloog met het moedereiwit is en in wezen dezelfde biologische eigenschappen als dat moedereiwit heeft.

10. Eiwit volgens conclusie 9 dat voor ten minste 90 % homoloog met het moedereiwit is.

11. Eiwit volgens een der voorafgaande conclusies in een in hoofdzaak homogene vorm.

12. Eiwit volgens een der voorafgaande conclusies dat een recombinant-eiwit is.

13. Eiwit volgens een der conclusies 1 t/m 12 dat een 20 geglycosyleerd eiwit is.

14. Eiwit volgens een der conclusies 1 t/m 12 dat in een in hoofdzaak ongeglycolyseerde toestand verkeert.

15. Exogeen DNA dat een nucleotiden-reeks bevat dat voor een eiwit volgens een der conclusies 1 t/m 11 codeert.

16. Een cDNA dat een nucleotiden-reeks bevat dat voor een eiwit volgens een der conclusies 1 t/m 11 codeert.

17. Een recombinant-expressievector dat DNA volgens conclusie 15 of 16 bevat.

18. Een gastheercel die met een expressievector vol- 30 gens conclusie 17 getransformeerd is.

19. Werkwijze voor het bereiden van een TNFa-remmer, waartoe men een cel volgens conclusie 18 kweekt en men het TNFaR eiwit isoleert.

20. Recombinant-eiwit bereid met de werkwijze vol- 35 gens conclusie 19.

21. Werkwijze voor het bereiden van een TNFaR-eiwit, bestaande uit: (a) het concentreren van urine uit patiënten met koorts, (b) het neerslaan met ammoniumsulfaat, (c) anionuitwisselingschromatografie, 8900779. -58 - (d) kationuitwisselingschromatografie, (e) gelfiltratie, (f) affiniteitschromatografie en (g) vloeistofchromatografie met omgekeerde fasen.

22. Eiwit hierdoor gekenmerkt dat het in hoofdzaak identiek is aan het eiwit verkregen met de werkwijze van eonclusie 21.

23. Farmaceutisch preparaat dat een TNFa-remmer volgens een der conclusies 1 t/m 14 of 22 of een farmaceutisch aanvaard-10 baar derivaat daarvan en een farmaceutisch aanvaardbare drager daarvoor bevat. -o-o-o-o-o- 8300779.’ -23" Verbetering van errata in de beschrijving behorende bij de octrooiaanvrage no. 89.00779 Ned. voorgesteld door aanvrager dd. 1 mei 1989.________________________ Voeg in de derde regel van conclusie 7 (tweede regel van die bladzijde) tussen "Gin" en "Lys" in "-Gly-". Deze verbetering vindt o.m. zijn basis in blz. 18 van blz. 4 en regel 8 van blz. 9. JKr/JvdB 8900779?