JP2000504592A - ヒトインターロイキン６（ｈＩＬ―６）に対するアンタゴニスト活性を有する、ｈＩＬ―６の突然変異体のアデノウイルスベクター、これを有する薬剤組成物およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の主題は、ヒトインターロイキン６（ｈＩＬ−６）アンタゴニストまたはスーパーアンタゴニストの活性を有するムテインをコードする異種ＤＮＡ配列を含む組換え欠陥アデノウイルスである。さらに本発明は、その治療的使用、特にｈＩＬ−６の過剰産生により引き起こされる疾患の治療および／または予防のための薬剤組成物を製造するための使用に関する。本発明の主題は、ヒトインターロイキン６（ｈＩＬ−６）アンタゴニストまたはスーパーアンタゴニストの活性を有するムテインをコードする異種ＤＮＡ配列を含む組換え欠陥アデノウイルスである。さらに本発明は、その治療的使用、特にｈＩＬ−６の過剰産生により引き起こされる疾患の治療および／または予防のための薬剤組成物を製造するための使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトインターロイキン６（ｈＩＬ−６）に対するアンタゴニスト活性を有する、 ｈＩＬ−６の突然変異体のアデノウイルスベクター、これを有する薬剤組成物お よびその使用説明 本発明は、ｈＩＬ−６（ヒトインターロイキン６）アンタゴニストおよび／ま たはスーパーアンタゴニストをコードするＤＮＡ配列を含有する組換え欠陥アデ ノウイルスに関する。このような組換えアデノウイルスは、特にｈＩＬ−６過剰 産生により引き起こされる疾患の治療および／または予防のための遺伝子治療に おける、薬剤組成物を製造するために使用される。 多発性骨髄腫（１）、カストルマン病（２）、メサンギウム糸球体腎炎（３） 、骨粗鬆症（４）、ＥＢＶ陽性リンパ腫（５）、リウマチ様関節炎（６）、およ び全身性エリテマトーデス（７）のようないくつかの疾患において、ｈＩＬ−６ の血清レベルが変化していることが報告されている。多発性骨髄腫では、ＩＬ− ６は悪性腫瘍細胞の増殖に明確にオートクリン（autocrine）およびパラクリン （paracrine）的役割を果たしている。 ローヌープーランローラー社（Rhone-Poulenc Rorer S.A.）のＷＯ９５／２６ ４０９号およびＷＯ９５／２５５０８号から、そのコード配列が、強いプロモー ターの制御下の欠陥アデノウイルスゲノム中に挿入された、目的のタンパク質（ 特に、ＷＯ９５／２６４０９号の場合のようなサイトカイン）を安定に発現する ための、組換え欠陥アデノウイルスの使用が知られている。また、アデノウイル ス介在遺伝子治療の場合に、炎症は大きな障害であり、組織障害の原因であると ともに、少なくとも一部は遺伝子発現の停止の原因であることも知られている（ ９）（１０）。ＩＬ−６は、アデノウイルス注射後に産生される主要な炎症性サ イトカインであることが示されている（１１）（１２）。 予想外にも、組換え欠陥アデノウイルスでインビトロおよびインビボで感染し た細胞により産生され、強いプロモーターの制御下でアンタゴニストまたはスー パーアンタゴニストをコードするＤＮＡ配列を含有する、ｈＩＬ−６に対してア ンタゴニストまたはスーパーアンタゴニスト活性を有するｈＩＬ−６の突然変異 体（本出願人のＷＯ／００８５２号に開示されている）は、多様なヒト細胞でｈ ＩＬ−６活性を阻害することが発見された。従って、この組換えアデノウイルス は、インビボでの目的のアデノウイルス介在遺伝子発現を延長するのに使用する ことができる。 本発明の主題は、ｈＩＬ−６に対してアンタゴニストまたはスーパーアンタゴ ニスト活性を有する、ヒトインターロイキン６の突然変異体、その断片またはそ の誘導体をコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列を含む組換え欠陥アデノウイル スである。 本発明の好適な実施態様において、ｈＩＬ−６に対してスーパーアンタゴニス トを有するｈＩＬ−６突然変異体は、Ｔｙｒ３１Ａｓｐ、Ｇｌｙ３５Ｐｈｅ、Ｓ ｅｒ１１８Ａｒｇ、Ｖａｌ１２１Ａｓｐ、Ｇｌｎ１７５Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１７６Ａ ｒｇ、Ｇｌｎ１８３Ａｌａ、およびＴｙｒ３１Ａｓｐ、Ｇｌｙ３５Ｐｈｅ、Ｌｅ ｕ５７Ａｓｐ、Ｇｌｕ５９Ｐｈｅ、Ａｓｎ６０Ｔｒｐ、Ｇｌｎ７５Ｔｙｒ、Ｓｅ ｒ７６Ｌｙｓ、Ｓｅｒ１１８Ａｒｇ、Ｖａｌ１２１Ａｓｐ、Ｇｌｎ１７５Ｉｌｅ 、Ｓｅｒ１７６Ａｒｇ、Ｇ１ｎ１８３Ａｌａ（以後、それぞれＳａｎｔ１および Ｓａｎｔ７と呼ぶ）である。 本発明の組換え欠陥アデノウイルスは、異なる種類のヒト特異的細胞中での発 現を可能にするシグナルの制御下に置くことができる。発現シグナルは、ウイル スプロモーターから選択することができる。ウイルスプロモーターは、ラウス肉 腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus）（ＲＳＶ）でもよい。 本発明はまた、多発性骨髄腫、カストルマン病、メサンギウム糸球体腎炎、骨 粗鬆症、ＥＢＶ陽性リンパ腫、リウマチ様関節炎、および全身性エリテマトーデ スのような疾患を治療および／または予防するための、ｈＩＬ−６に対してアン タゴニストまたはスーパーアンタゴニスト活性を有する、ヒトインターロイキン ６の突然変異体、その断片またはその誘導体をコードする、少なくともＤＮＡま たはｃＤＮＡ配列を含む、組換え欠陥アデノウイルスの使用に関する。 少なくとも１つの上記組換え欠陥アデノウイルスを含む薬剤組成物はまた、本 発明の主題である。この薬剤組成物は注射可能な型でもよい。薬剤組成物は、１ ０４〜１０１４pfu/ml（プラーク形成単位／ｍｌ）、好ましくは１０６〜１０１ ０pfu/mlの範囲の組換え欠陥アデノウイルスを含有してもよい。少なくとも１つ の上記組換えアデノウイルスが感染した哺乳動物細胞（特に、ヒト細胞）は、本 発明のさらなる主題である。これらの細胞は、治療用タンパク質をコードする目 的の遺伝子をさらに発現することができる。これらの細胞は、治療用遺伝子を発 現する少なくとも１つのウイルスで、さらに感染されてもよい。 感染したヒト細胞は、繊維芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、内皮細胞、グリア細胞 およびケラチン細胞よりなる群から選択される。 本発明の別の主題は、少なくとも１つの上記組換え欠陥アデノウイルスおよび 細胞外マトリックスにより感染した細胞を含むインプラントである。細胞外マト リックスは、コラーゲン、ゼラチン、グルコサミノグリカン、フィブロネクチン およびレクチンよりなる群から選択されるゲル化化合物でもよい。細胞外マトリ ックスは、感染細胞を固定するための支持体を含むことができる。この支持体は 、好ましくはポリテトラフルオロエチレン繊維から作成することができる。 本発明の目的、特徴および利点を、その実施態様に関する以下の例により非限 定的にさらに例示する。例１ Ｓａｎｔ１と呼ばれる突然変異ＩＬ−６型をコードする配列を含有し、突然変異 Ｔｙｒ３１Ａｓｐ、Ｇｌｙ３５Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１１８Ａｒｇ、Ｖａｌ１２１Ａｓ ｐ、Ｇｌｎ１７５Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１７６Ａｒｇ、およびＧｌｎ１８３Ａｌａを有 することを特徴とする、ＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（と呼ばれる組換えアデノウイル スの構築 ＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（の構築のために、Ｓａｎｔ１（本出願人のＷＯ９５／ ００８５２号に記載され、ｗｔ ｈＩＬ−６と比較して、７つのアミノ酸の置換 、Ｔｙｒ３１Ａｓｐ、Ｇｌｙ３５Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１１８Ａｒｇ、Ｖａｌ１２１Ａ ｓｐ、Ｇｌｎ１７５Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１７６Ａｒｇ、およびＧｌｎ１８３Ａｌａを 有することを特徴とする）をコードするｃＤＮＡを、アデノウイルスベクターｐ ＡｄＲＳＶβｇａｌ（２０）中でｈＩＬ−６リーダー配列とともにサブクローニ ン グし、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩとＥｃｏＲＶで切断した。組換えプラス ミドを、ＣｌａＩで制限切断したＡｄＲＳＶβｇａｌゲノム（２０）とともに、 ヒト胚腎２９３細胞（ＥＣＡＣＣ）中に同時トランスフェクションした。組換え プラークを単離し、（１４）（１５）に記載のように増幅した。組換えＡｄＲＳ ＶｈＩＬ−６（のＤＮＡパターンを、多重制限解析（multiple restriction ana lysis）により制御した。 すべてのウイルスストックを２９３細胞中で調製し、等張ＣｓＣｌ勾配で２回 精製した。ファルマシア（Pharmacia）Ｇ５０カラムを使用して脱塩を行なった 。ウイルスをアリコートし、ＰＢＳ−１５％グリセロール中で−８０℃で維持し た。２９３細胞上のプラーク分析により算出した力価は、１〜２×１０１１pfu/ mlで変動した。例２ 組換えアデノウイルスＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（でインビトロで感染した細胞は、 細胞培養上清中にＳａｎｔ１を産生する 上記例に記載のように作成したＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（によるアンタゴニスト 発現を試験するために、コンフルエンス近辺のヒト胚腎２９３細胞の３５mmファ ルコンプレートを、例１に記載のように調製した精製ＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（ス トックの１０プラーク形成単位（pfu）／細胞で３mlの培地中で感染させた。感 染の２４時間後、上清を集め、セントリコン（centricon）３チューブ（アミコ ン（Amicon））で５倍濃縮した。濃縮上清２５μlを、アクリルアミドゲルにの せた。ゲルを電気ブロットし、ニトロセルロース膜をＴＢＳ−５％ミルク−０． ０５％ツイーン２０中で一晩ブロッキングした。ＴＢＳ−０．０５％ツイーン２ ０中で洗浄後、膜を、ＴＢＳ−５％ミルク−０．０５％ツイーン２０中で１：２ （ｖ／ｖ）希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したポリクローナル抗ｈ ＩＬ−６抗体（アールアンドディー（R & D）、ｈＩＬ−６ ＥＬＩＳＡキット ）で２時間インキュベートした。ＴＢＳ−０．０５％ツイーン２０中で洗浄後、 ＥＣＬバイオルミネセンスキット（アマシャム（Amersham））で、製造業者の説 明書に従って膜を現像した。ＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染した細胞の上清中に 、予測される分子量の単一のバンドを検出したが、ＡｄＲＳＶβｇａｌで感染し た 細胞の上清または擬感染した細胞の上清中には検出されなかった。従ってＡｄＲ ＳＶｈＩＬ−６（で感染した細胞は、細胞培養上清中に、ｈＩＬ−６およびＳａ ｎｔ１（これはｈＩＬ−６自身の突然変異型）と同じサイズで、ｈＩＬ−６に対 する抗体により認識されるタンパク質を発現し分泌する。例３ ＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染された細胞によりインビトロで発現されるＳａｎ ｔ１はヒト肝癌細胞に対するｈＩＬ−６生物活性を阻害する ＩＬ−６は、培養した肝細胞または肝由来の培養肝癌細胞株中の一組の遺伝子 （急性相遺伝子として知られている）の転写を刺激することが、当該分野で公知 である。特にＩＬ−６は、ヒトＨｅｐ３Ｂ肝癌細胞中でＣ−反応性遺伝子プロモ ーターにより転写を刺激する（（１３）およびその中の文献）。 組換えウイルスにより産生されるＳａｎｔ１が上記のＩＬ−６生物活性を阻害 することができるかどうかを試験するために、コンフルエンス近辺のヒト胚腎２ ９３細胞の３５mmファルコンプレートを、ＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（またはＡｄＲ ＳＶβｇａｌで感染させ（１０プラーク形成単位（pfu）／細胞の精製ストック を有する培地３ml中）、感染の２４時間後、上清を集め、ヒトＨｅｐ３Ｂ肝癌細 胞に対するｈＩＬ−６生物活性の阻害について試験した。転写刺激の有効性は、 当該分野の技術に従って測定した（１３）。ヒトＨｅｐ３Ｂ肝癌細胞を４ng／ml のｈＩＬ−６で刺激し、この刺激の程度を１００％とするか、またはＡｄＲＳＶ ｈＩＬ−６（で感染した２９３細胞から得られた細胞培養上清の連続希釈物の存 在下で４ng／mlのｈＩＬ−６で刺激した。後者の場合に転写刺激の程度を、４ng ／mlのｈＩＬ−６のみとインキュベートした細胞で得られた刺激のパーセントと して表した。実験の結果を以下の表１に示す。 表１ ＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染した２９３細胞から得られた細胞培養上清の連続 希釈物によるヒトＨｅｐ３Ｂ肝癌細胞に対するｈＩＬ−６生物活性の阻害 血清希釈 生物活性（対照の％） １：２９１６ ８５．８％ １：９７２ ８７．７％ １：３２４ ７２．３％ １：１０８ ５７．０％ １：３６ ２８．１％ １：１２ ２３．８％ １：４ ８．１％ １：４希釈したＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染した２９３細胞から得られた細 胞培養上清は、ヒトＨｅｐ３Ｂ肝癌細胞に対する４ng／mlのｈＩＬ−６の生物活 性を完全に阻害することがわかる。モル過剰のｈＩＬ−６（１０００ng／ml）の 存在下ではＣ−反応性タンパク質遺伝子プロモーター活性は１００％までレスキ ューされた（データは示していない）ため、阻害は毒性が原因ではなかった。上 記表１に示すデータは、用量阻害曲線をプロットするのに使用することができ、 そこから、血清希釈１：６０でＩＬ−６活性の阻害の５０％が得られると内挿す ることができる。ＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染した２９３細胞上清ではなく組 換え大腸菌（E．coli）で産生したＳａｎｔ１で行なった平行阻害実験では、１ ０ng／mlのタンパク質濃度でＩＬ−６活性の５０％の阻害が得られる。従って未 希釈のＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染した２９３細胞上清中のＳａｎｔ１濃度は 、Ｈｅｐ３Ｂ肝癌細胞に対するＩＬ−６活性の５０％阻害に達するのに必要なＳ ａｎｔ１の濃度（１０ng／ml）と、ＩＬ−６活性の５０％阻害を与えるＡｄＲＳ ＶｈＩＬ−６（で感染した２９３細胞上清の希釈率（６０）とを乗ずることによ り算出することができる。計算は： 未希釈のＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染した２９３細胞上清中のＳａｎｔ１濃度 ＝ ＝１０ng／ml×６０＝６００ng／ml。例４ ＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染した細胞によりインビトロで発現されるＳａｎｔ １はヒト骨髄腫細胞に対するｈＩＬ−６生物活性を阻害する 前記例において、ＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染した２９３細胞から得られる 細胞培養上清は、ヒト肝癌細胞に対するインターロイキン６生物活性（ＩＬ−６ 誘導性プロモーターによる転写の刺激）を阻害することができた。前記説明の最 初の部分で、多発性骨髄腫／形質細胞腫の種々の型のようないくつかの病状でＩ Ｌ−６血清レベルが変化していると記載されている。ここでさらなる例を示して 、ＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染した２９３から得られた細胞培養上清は、終末 的疾患の患者から得られた新たに単離された骨髄腫細胞由来のヒト骨髄腫細胞株 （ＸＧ−１と呼ぶ）細胞のインターロイキン６依存性増殖を充分に阻害すること を証明する。ＸＧ−１骨髄腫細胞株の増殖は、新鮮な骨髄腫細胞について証明さ れているように、外から加えたＩＬ−６に厳密に依存し、従ってこの細胞株は、 多発性骨髄腫の優れたインビトロモデルであると考えることができる（１６）。 野生型インターロイキン６に対する突然変異の拮抗作用を試験するために、９ ６マイクロタイタープレート中で６０００細胞／マイクロウェルのＸＧ−１骨髄 腫細胞を、培地１mlあたり０．１ナノグラム（ng／ml）のｈＩＬ−６とともに、 前記例に記載のＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染した２９３細胞から得られた細胞 培養上清の連続希釈物の存在下で培養した。７日間の培養後、ヘキサミニダーゼ レベルを比色測定して細胞数を評価した（１７）。以下の表２は、ＡｄＲＳＶｈ ＩＬ−６（で感染した２９３細胞から得られた細胞培養上清の希釈の関数として 、ｈＩＬ−６活性の阻害を示す。 表２ ＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染した２９３細胞から得られた細胞培養上清の連続 希釈によるヒトＸＧ−１骨髄腫細胞に対するｈＩＬ−６生物活性の阻害 血清希釈 生物活性（対照の％） １：２９１６ ８４．７％ １：９７２ ８３．１％ １：３２４ ８０．５％ １：１０８ ６１．０％ １：３６ ４６．１％ １：１２ ２８．２％ １：４ ７．０％ １：４希釈したＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染した２９３細胞から得られた 細胞培養上清は、ヒトＸＧ−１骨髄腫細胞に対する０．１ng／mlのｈＩＬ−６の 増殖刺激作用を完全に阻害することがわかる。前記例と同様に、モル過剰のｈＩ Ｌ−６（１００ng／ml）の存在下ではＸＧ−１細胞増殖は１００％までレスキュ ーされた（データは示していない）ため、阻害は毒性が原因ではなかった。上記 表２に示すデータは、用量阻害曲線をプロットするのに使用することができ、そ こから、血清希釈１：４０でＩＬ−６活性の阻害の５０％が得られると内挿する ことができる。ＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染した２９３細胞上清ではなく組換 え大腸菌（E．coli）で産生したＳａｎｔ１で行なった平行阻害実験では、２０n g／mlのタンパク質濃度でＩＬ−６活性の５０％の阻害が得られる。従って未希 釈のＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染した２９３細胞上清中のＳａｎｔ１濃度は、 ＸＧ−１骨髄腫細胞に対するＩＬ−６活性の５０％阻害に達するのに必要なＳａ ｎｔ１の濃度（２０ng／ml）と、ＩＬ−６活性の５０％阻害を与えるＡｄＲＳＶ ｈＩＬ−６（で感染した２９３細胞上清の希釈率（４０）とを乗ずることにより 算出することができる。計算は： 未希釈のＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染した２９３細胞上清中のＳａｎｔ１濃度 ＝ ＝２０ng／ml×４０＝８００ng／ml、 これは、前例で得られた未希釈のＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染した２９３細胞 上清中のＳａｎｔ１濃度の予測値（６００ng／ml）と非常によく一致する。例５ 組換えアデノウイルスＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染した動物はＳａｎｔ１を産 生する 例１に記載のように作成したＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（によるインビボの拮抗作 用発現を試験するために、６〜８週令のマウス（イファクレド（IFFACREDO）（ フランス）から購入した）を、１００μｌのＰＢＳで希釈した標準用量の２×１ ０９pfu/マウスで眼窩静脈中に注射した。マウスをエーテルで処理した後、眼窩 静脈中に穿刺注射して、異なる時期に血液を採取した。現状の技術に従って血清 を調製し、血清中のアンタゴニスト濃度を、「アールアンドディーシステムズ（ R & D Systems）」社が製造した市販のキットを使用し、正確に製造業者の説明 書に従って、「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡ試験を用いて測定した。実験は、６〜 ８８週令のマウスに２×１０９pfuのＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（を静脈内（ｉｖ） 注射すると、少なくとも２ヶ月間、５ng／mlの濃度のＳａｎｔ１が発現されたこ とを示す。例６ ＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（で感染したマウス中でインビボで産生されたＳａｎｔ１ はヒト骨髄腫細胞中でのＡＰＲＦ活性化を誘導する ＩＬ−６誘導性の細胞活性化の最初の工程の１つは、急性相転写因子（ＡＰＲ Ｆ）のチロシンのリン酸化であることは当該分野で公知である。リン酸化により 、ＡＰＲＦは、特異的ＤＮＡ配列（急性相応答成分：ＡＰＲＦｓ）に結合し、核 に移動する能力を獲得する（１８）。 組換えアデノウイルスによりインビボで産生されたＳａｎｔ１が上記のＩＬー ６生物活性を阻害することができるかどうかを試験するために、２×１０９pfu のＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（または対照アデノウイルスを注射したマウスの血清を 、前例で記載したように注射後４０日目に採取し、濃縮し、ＸＧ−１骨髄腫細胞 で前記ｈＩＬ−６生物活性の阻害について試験した。ＩＬ−６枯渇後４時間目に Ｘ Ｇ−１細胞を、ＩＬ−６無しで、注射しなかったマウスの５０％血清の存在下で ０．２ng／mlのＩＬ−６で、ＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（を注射したマウスの５０％ 血清の存在下で０．２ng／mlのＩＬ−６で、および対照ウイルスを注射したマウ スの５０％血清の存在下で０．２ng／mlのＩＬ−６で、３７℃で１５分間インキ ュベートした。全細胞抽出物を調製し、当該分野で公知のゲル遅延によりＡＰＲ Ｆ活性化を追跡した（１８）。種々の試料のＡＰＲＦ活性化を、ホスホイメージ ャー（phosphoimager）で定量し、種々の試料中の活性化の程度は、注射しなか ったマウスの５０％血清の存在下で０．２ng／mlのＩＬ−６で刺激した細胞で得 られた活性化のパーセントとして表した。実験の結果を以下の表３に示す。 表３ ＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（または対照アデノウイルスを注射したマウスの血液によ るヒトＸＧ−１骨髄腫細胞中のｈＩＬ−６誘導性ＡＰＲＦ活性化の阻害 試料 APRF活性化(対照の%) IL-6無し 0% 0.2ng／ml IL-6、注射しなかったマウスの50%血清 100% 0.2ng／ml IL-6、AdRSVhIL-6(を注射したマウスの50%血清 5% 0.2ng／ml IL-6、対照アデノウイルスを注射したマウスの50%血清 75% 明らかなように、ＡｄＲＳＶｈＩＬ−６（組換えアデノウイルスを注射したマ ウスから得られ、前例で測定したようにインビボで表したＳａｎｔ１を含有する 血清は、ＸＧ−１細胞中の０．２ng／mlのＩＬ−６により誘導されるＡＰＲＦ活 性化を非常に有効に阻害する。モル過剰のｈＩＬ−６（１００ng／ml）の存在下 ではＩＬ−６誘導性のＡＰＲＦ活性化は充分にレスキューされた（データは示し ていない）ため、再度、阻害は毒性が原因ではなかった。さらに、表３はまた、 対照の組換えアデノウイルスを注射したマウスの血清は、ＸＧ−１細胞中の０． ２ng／mlのＩＬ−６により誘導されるＡＰＲＦ活性化を有意に阻害しなかったこ とを示す。

【手続補正書】 【提出日】１９９９年９月１３日（１９９９．９．１３） 【補正内容】 1. 請求の範囲を別紙の通り補正する。 2. 明細書を次の通り補正する。 (イ) 明細書第3頁第1行から第3行の「薬剤組成物は、104〜1014pfu/ml（プラー ク形成単位／ｍｌ）、好ましくは106〜1010pfu/mlの範囲」を『薬剤組成物 は、10⁴〜10¹⁴pfu/ml（プラーク形成単位／ｍｌ）、好ましくは10⁶〜10¹⁰pf u/mlの範囲』に補正する。 (ロ) 明細書第4頁第10行の「293細胞上のプラーク分析により算出した力価は、 1〜2×1011pfu/mlで」を『293細胞上のプラーク分析により算出した力価は 、1〜2×10¹¹pfu/mlで』に補正する。 (ハ) 明細書第9頁第10行の「109pfu/マウス」を『10⁹pfu/マウス』に補正する 。 (ニ) 明細書第9頁第15行の「〜88週令のマウスに2×109pfuの」を『〜8週令の マウスに2×10⁹pfuの』に補正する。 (ホ) 明細書第9頁第26行の「2×109pfu」を『2×10⁹pfu』に補正する。 請求の範囲 １．ｈＩＬ−６に対してアンタゴニストまたはスーパーアンタゴニスト活性を 有する、少なくとも、ヒトインターロイキン６（ｈＩＬ−６）の突然変異体、そ の断片またはその誘導体をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、組換 え欠陥アデノウイルス。 ２．ＤＮＡ配列はｃＤＮＡである、請求の範囲第１項記載の組換え欠陥アデノ ウイルス。 ３．スーパーアンタゴニスト活性を有するｈＩＬ−６突然変異体は、Ｔｙｒ３ １Ａｓｐ、Ｇｌｙ３５Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１１８Ａｒｇ、Ｖａｌ１２１Ａｓｐ、Ｇｌ ｎ１７５Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１７６Ａｒｇ、Ｇｌｎ１８３Ａｌａである、請求の範囲 第１項記載の組換え欠陥アデノウイルス。 ４．スーパーアンタゴニスト活性を有するｈＩＬ−６突然変異体は、Ｔｙｒ３ １Ａｓｐ、Ｇｌｙ３５Ｐｈｅ、Ｌｅｕ５７Ａｓｐ、Ｇｌｕ５９Ｐｈｅ、Ａｓｎ６ ０Ｔｒｐ、Ｇｌｎ７５Ｔｙｒ、Ｓｅｒ７６Ｌｙｓ、Ｓｅｒ１１８Ａｒｇ、Ｖａｌ １２１Ａｓｐ、Ｇｌｎ１７５Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１７６Ａｒｇ、Ｇｌｎ１８３Ａｌａ である、請求の範囲第１項記載の組換え欠陥アデノウイルス。 ５．ＤＮＡ配列は、異なる種類のヒト特異的細胞中での発現を可能にするシグ ナルの制御下に置くことができる、請求の範囲第１項〜第４項までのいずれか１ 項に記載の組換え欠陥アデノウイルス。 ６．発現シグナルはウイルスプロモーターの中から選択される、請求の範囲第 １項〜第４項までのいずれか１項に記載の組換え欠陥アデノウイルス。 ７．ウイルスプロモーターはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）である、請求の範 囲第６項記載の組換え欠陥アデノウイルス。 ８．多発性骨髄腫を治療および／または予防するための薬剤組成物の製造のた めの、請求の範囲第１項〜第７項までのいずれか１項に記載の組換えアデノウイ ルスの使用。 ９．カストルマン病を治療および／または予防するための薬剤組成物の製造の ための、請求の範囲第１項〜第７項までのいずれか１項に記載の組換えアデノウ イルスの使用。 １０．メサンギウム糸球体腎炎を治療および／または予防するための薬剤組成 物の製造のための、請求の範囲第１項〜第７項までのいずれか１項に記載の組換 えアデノウイルスの使用。 １１．骨粗鬆症を治療および／または予防するための薬剤組成物の製造のため の、請求の範囲第１項〜第７項までのいずれか１項に記載の組換えアデノウイル スの使用。 １２．ＥＢＶ陽性リンパ腫を治療および／または予防するための薬剤組成物の 製造のための、請求の範囲第１項〜第７項までのいずれか１項に記載の組換えア デノウイルスの使用。 １３．リウマチ様関節炎を治療および／または予防するための薬剤組成物の製 造のための、請求の範囲第１項〜第７項までのいずれか１項に記載の組換えアデ ノウイルスの使用。 １４．全身性エリテマトーデスを治療および／または予防するための薬剤組成 物の製造のための、請求の範囲第１項〜第７項までのいずれか１項に記載の組換 えアデノウイルスの使用。 １５．請求の範囲第１項〜第７項に記載の組換え欠陥アデノウイルスの少なく とも１つを含むことを特徴とする、薬剤組成物。 １６．注射可能な型である、請求の範囲第１５項記載の薬剤組成物。 １７．１０⁴〜１０¹⁴pfu/ml（プラーク形成単位／ｍｌ）の範囲の組換え欠陥 アデノウイルスを含有する、請求の範囲第１５項または第１６項に記載の薬剤組 成物。 １８．１０⁶〜１０¹⁰pfu/mlの範囲の組換え欠陥アデノウイルスを含有する、 請求の範囲第１７項記載の薬剤組成物。 １９．請求の範囲第１項〜第７項に記載の組換え欠陥アデノウイルスの少なく とも１つを含むことを特徴とする、哺乳動物細胞。 ２０．ヒト細胞である、請求の範囲第１９項記載の細胞。 ２１．繊維芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、内皮細胞、グリア細胞およびケラチン 細胞よりなる群から選択される、請求の範囲第２０項記載の細胞。 ２２．請求の範囲第１９〜２１項記載の感染細胞と細胞外マトリックスを含む ことを特徴とするインプラント。 ２３．細胞外マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、グルコサミノグリカン 、フィブロネクチンおよびレクチンよりなる群から選択されるゲル化化合物であ る、請求の範囲第２２項記載のインプラント。 ２４．細胞外マトリックスは感染細胞を固定するための支持体を含む、請求の 範囲第２２項または第２３項記載のインプラント。 ２５．支持体はポリテトラフルオロエチレン繊維から作成される、請求の範囲 第２４項記載のインプラント。 ２６．インビボでの目的のアデノウイルス介在遺伝子発現を延長するための薬 剤組成物の製造のための、請求の範囲第１項〜第７項に記載の組換えアデノウイ ルスの使用。 ２７．治療用タンパク質をコードする目的の遺伝子をさらに発現することを特 徴とする、請求の範囲第１９項〜第２１項に記載の細胞。 ２８．治療用遺伝子を発現する少なくとも１つのウイルスで形質転換されるこ とをさらに特徴とする、請求の範囲第１９項〜第２１項に記載の細胞。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 シリベルト，ジェンナロ イタリア国 アイ―00151 ローマ，ビア レ コリ ポルツエンシ，242，パル．６ (72)発明者 サッジオ，イザベラ イタリア国 アイ―00186 ローマ，ビア デイ カルタリ，５ (72)発明者 サビノ，ロッコ イタリア国 アイ―00040 ポメジア，ビ ア デラ テクニカ，76 (72)発明者 ペリコド，ミシェル フランス国 エフ―28320 エクロスヌ, リュ ド シャルトル，31

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ｈＩＬ−６に対してアンタゴニストまたはスーパーアンタゴニスト活性を 有する、少なくとも、ヒトインターロイキン６（ｈＩＬ−６）の突然変異体、そ の断片またはその誘導体をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、組換 え欠陥アデノウイルス。 ２．ＤＮＡ配列はｃＤＮＡである、請求の範囲第１項記載の組換え欠陥アデノ ウイルス。 ３．スーパーアンタゴニスト活性を有するｈＩＬ−６突然変異体は、Ｔｙｒ３ １Ａｓｐ、Ｇｌｙ３５Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１１８Ａｒｇ、Ｖａｌ１２１Ａｓｐ、Ｇｌ ｎ１７５Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１７６Ａｒｇ、Ｇｌｎ１８３Ａｌａである、請求の範囲 第１項記載の組換え欠陥アデノウイルス。 ４．スーパーアンタゴニスト活性を有するｈＩＬ−６突然変異体は、Ｔｙｒ３ １Ａｓｐ、Ｇｌｙ３５Ｐｈｅ、Ｌｅｕ５７Ａｓｐ、Ｇｌｕ５９Ｐｈｅ、Ａｓｎ６ ０Ｔｒｐ、Ｇｌｎ７５Ｔｙｒ、Ｓｅｒ７６Ｌｙｓ、Ｓｅｒ１１８Ａｒｇ、Ｖａｌ １２１Ａｓｐ、Ｇｌｎ１７５Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１７６Ａｒｇ、Ｇｌｎ１８３Ａｌａ である、請求の範囲第１項記載の組換え欠陥アデノウイルス。 ５．ＤＮＡ配列は、異なる種類のヒト特異的細胞中での発現を可能にするシグ ナルの制御下に置くことができる、請求の範囲第１項〜第４項までのいずれか１ 項に記載の組換え欠陥アデノウイルス。 ６．発現シグナルはウイルスプロモーターの中から選択される、請求の範囲第 １項〜第４項までのいずれか１項に記載の組換え欠陥アデノウイルス。 ７．ウイルスプロモーターはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）である、請求の範 囲第６項記載の組換え欠陥アデノウイルス。 ８．多発性骨髄腫を治療および／または予防するための薬剤組成物の製造のた めの、請求の範囲第１項〜第７項までのいずれか１項に記載の組換えアデノウイ ルスの使用。 ９．カストルマン病を治療および／または予防するための薬剤組成物の製造の ための、請求の範囲第１項〜第７項までのいずれか１項に記載の組換えアデノウ イルスの使用。 １０．メサンギウム糸球体腎炎を治療および／または予防するための薬剤組成 物の製造のための、請求の範囲第１項〜第７項までのいずれか１項に記載の組換 えアデノウイルスの使用。 １１．骨粗鬆症を治療および／または予防するための薬剤組成物の製造のため の、請求の範囲第１項〜第７項までのいずれか１項に記載の組換えアデノウイル スの使用。 １２．ＥＢＶ陽性リンパ腫を治療および／または予防するための薬剤組成物の 製造のための、請求の範囲第１項〜第７項までのいずれか１項に記載の組換えア デノウイルスの使用。 １３．リウマチ様関節炎を治療および／または予防するための薬剤組成物の製 造のための、請求の範囲第１項〜第７項までのいずれか１項に記載の組換えアデ ノウイルスの使用。 １４．全身性エリテマトーデスを治療および／または予防するための薬剤組成 物の製造のための、請求の範囲第１項〜第７項までのいずれか１項に記載の組換 えアデノウイルスの使用。 １５．請求の範囲第１項〜第７項に記載の組換え欠陥アデノウイルスの少なく とも１つを含むことを特徴とする、薬剤組成物。 １６．注射可能な型である、請求の範囲第１５項記載の薬剤組成物。 １７．１０４〜１０１４pfu/ml（プラーク形成単位／ｍｌ）の範囲の組換え欠 陥アデノウイルスを含有する、請求の範囲第１５項または第１６項に記載の薬剤 組成物。 １８．１０６〜１０１０pfu/mlの範囲の組換え欠陥アデノウイルスを含有する 、請求の範囲第１７項記載の薬剤組成物。 １９．請求の範囲第１項〜第７項に記載の組換え欠陥アデノウイルスの少なく とも１つを含むことを特徴とする、哺乳動物細胞。 ２０．ヒト細胞である、請求の範囲第１９項記載の細胞。 ２１．繊維芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、内皮細胞、グリア細胞およびケラチン 細胞よりなる群から選択される、請求の範囲第２０項記載の細胞。 ２２．請求の範囲第１９〜２１項記載の感染細胞と細胞外マトリックスを含む ことを特徴とするインプラント。 ２３．細胞外マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、グルコサミノグリカン 、フィブロネクチンおよびレクチンよりなる群から選択されるゲル化化合物であ る、請求の範囲第２２項記載のインプラント。 ２４．細胞外マトリックスは感染細胞を固定するための支持体を含む、請求の 範囲第２２項または第２３項記載のインプラント。 ２５．支持体はポリテトラフルオロエチレン繊維から作成される、請求の範囲 第２４項記載のインプラント。 ２６．インビボでの目的のアデノウイルス介在遺伝子発現を延長するための薬 剤組成物の製造のための、請求の範囲第１項〜第７項に記載の組換えアデノウイ ルスの使用。 ２７．治療用タンパク質をコードする目的の遺伝子をさらに発現することを特 徴とする、請求の範囲第１９項〜第２１項に記載の細胞。 ２８．治療用遺伝子を発現する少なくとも１つのウイルスで形質転換されるこ とをさらに特徴とする、請求の範囲第１９項〜第２１項に記載の細胞。