ITRM960650A1 - Adenovirus difettivi ricombinati che codificano per mutanti di inter= leuchina 6 umana (hil-6) con attivita' antagonista o superantagonista - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE INDUSTRIALE dal titolo: "ADENOVIRUS DIFETTIVI RICOMBINANTI CHE CODIFICANO PER MUTANTI DI INTERLEUCHINA 6 UMANA (hIL-6) CON ATTIVITÀ' ANTAGONISTA 0 SUPERANTAGONISTA NEI CONFRONTI DI hIL-6, E LORO USO PER PREPARARE COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE PER LA CURA E/0 LA PREVENZIONE DI MALATTIE COLLEGATE A hIL-6"
La presente invenzione si riferisce ad adenovirus difettivi ricombinanti contenenti una sequenza di DNA che codifica per antagonisti e/oppure superantagonisti di interleuchina 6 umana (hIL-6). Questi adenovirus ricombinanti vengono usati per la preparazione di composizioni farmaceutiche, in particolare nella terapia genica per la cura e/oppure la prevenzione di malattie causate da una sovrapproduzione di hIL-6.
Livelli alterati di hIL-6 nel siero sono stati descritti in diverse patologie, quali mieloma multiplo (1), morbo di Castleman (2), glomerulonefrite mesangiale (3), osteoporosi (4), linfoma positivo a EBV (5), artrite reumatoide (6) e lupus eritematoso sistemico (7) (8).
E' noto da WO 95/26409 e W 95/25508, a nome Rhone Poulenc Rorer S.A., l'uso di adenovirus difettivi ricombinanti per ottenere una espressione stabile della proteina di interesse (in particolare una citochina come nel caso di WO 95/26409), la cui sequenza codificante è inserita nel genoma dell 'adenovirus difettivo sotto il controllo di un promotore forte. E' anche noto che, nel caso di terapia genica mediata da adenovirus, l'infiammazione rappresenta uno degli ostacoli principali, dato che provoca danni ai tessuti come pure, almeno in parte, l'arresto dell'espressione genica (9) (10). I risultati di alcune ricerche indicano che h.IL-6 è la principale citochina infiammatoria prodotta dopo l'iniezione di adenovirus (11·) (12).
Ora, è stato inaspettatamente trovato che mutanti di hIL-6 con attività antagonista o superantagonista nei confronti della citochina naturale (descritti in WO/00852 a nome dell'Istituto di Ricerche di Bilogia Molecolare P. Angeletti S.p.A.) prodotti da cellule infettate sia in vitro che in vivo con un adenovirus difettivo ricombinante, contenente una sequenza di DNA che codifica per detti antagonisti o superantagonisti sotto il controllo di un promotore forte, inibiscono l'attività di hIL-6 su una varietà di cellule umane. Pertanto, detti adenovirus ricombinanti possono essere usati per prolungare in vivo l'espressione di un gene d'interesse che codifica per una proteina terapeutica mediata da adenovirus .
Oggetto della presente invenzione è un adenovirus difettivo ricombinante comprendente una sequenza di DNA o di cDNA che codifica per un mutante di Interleuchina 6 umana, un suo frammento o un suo derivato, con attività antagonista o superantagonista nei confronti della citochina naturale .
In forme di realizzazione preferite dell'invenzione i mutanti di hIL-6 con attività superantagonista nei suoi confronti sono Tyr31Asp, Gly35Phe , Serll8Arg, Vall21Asp, Glnl75Ile, Serl76 Arg, Glnl83Ala e Tyr31Asp, Gly35Phe, Leu57Asp, Glu59 Phe, Asn60Trp, Gln75Tyr, Ser76Lys, Serll8Arg, Val 121Asp, Glnl75Ile, Serl76Arg, Glnl83Ala (nel seguito indicati anche come Santi e Sant7 rispettivamente) .
Il DNA che codifica per un mutante di hIL-6 nell 'adenovirus difettivo ricombinante dell'invenzione può essere posto sotto il controllo di segnali che permettono l'espressione in differenti tipi di cellule umane specifiche. I segnali di espressione possono essere selezionati tra i promotori virali. Il promotore virale può essere Rous Sarcoma Virus (RSV).
L'invenzione si riferisce anche all'uso dell'adenovirus difettivo ricombinante, che comprende almeno una sequenza di DNA o di cDNA codificante per un mutante di un suo frammento o un suo derivato, con attività antagonista o superantagonista nei confronti della citochina naturale, per la cura e/oppure la prevenzione di malattie quali mieloma multiplo, morbo di Castleman, glomerulonefrite mesangiale, osteoporosi, linfoma positivo di EBV, artrite reumatoide, e lupus eritematoso sistemico.
Sono anche oggetto della presente invenzione composizioni farmaceutiche che comprendono almeno uno degli adenovirus difettivi ricombinanti sopra menzionati. Le composizioni farmaceutiche possono essere in forma iniettabile. Esse possono contenere 1'adenovirus difettivo ricombinante nell'intervallo da IO4 a IO14 pfu/ml (plaque forming unit/ml) , preferibilmente da 10s a IO10 pfu/ mi.
Ulteriore oggetto della presente invenzione sono cellule di mammifero, in particolare cellule umane, infettate da almeno uno degli adenovirus ricombinanti sopra menzionati. Queste cellule possono essere ulteriormente infettate con almeno un virus che esprime una proteina terapeutica.
Le cellule umane infettate possono essere selezionate dal gruppo comprendente fibroblasti, mioblasti, epatociti, cellule endoteliali, cellule gliali e cheratinociti.
E' anche oggetto della presente invenzione un impianto comprendente le cellule infettate da almeno uno degli adenovirus difettivi ricombinanti sopra menzionati ed una matrice extracellulare. La matrice extracellulare può essere un composto gelificante che può essere scelto dal gruppo consistente di collagene, gelatina, glucosoamminoglicani, fibronectine, e lectine. La matrice extracellulare può comprendere un supporto per ancorare le cellule infettate. Il supporto può essere fatto preferibilmente di fibre di politetraf luoroetilene .
Si è data finora della presente invenzione una descrizione di carattere generale. Con l'aiuto dei seguenti esempi verrà ora fornita una descrizione più dettagliata di sue forme di realizzazione finalizzate a far meglio comprendere i suoi scopi, le sue caratteristiche ed i suoi vantaggi.
E.SEMEIQ__l·
Costruii Qua. _ di _ un _ .adenovirus- ricombinante . denominatP__AdRS.YhIL-6a. _ contenente _ la . sequenza _ che .gffldifica _ par _ il _ mutanta _ _aantJL_ -di· - IL-6 e cara-t-terizaatQ _ dall .avare _ la _ mutazioni Tyr3iAsp. gly.15gii.e-. _ SexHSAxg, _ VAU^IASP.^ _ Glnl?SUe·, 5.ar3-7-6Arg-3⁄4-Glnl33Ala
Per la costruzione di AdRSVhIL-6a, il cDNA codificante per Santi descritto in W095/00852, a nome dell'Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P. Angeletti S.p.A., e caratterizzato dall'avere le sette sostituzioni amminoacidiche Tyr31Asp, Gly35Phe, Serll8Arg, Vall21Asp, Glnl75Ile, Serl76Arg e Glnl83Ala nei confronti di hIL-6 di tipo selvatico) è stata subclonata insieme alla sequenza codificante per il segnale di secrezione di hIL-6 nel vettore adenovirale pAdRSVpgal (13), tagliato con gli enzimi di restrizione Sali e EcoRV. Il plasmide ricombinante è stato cotrasfettato insieme al genoma di AdRSVPgal tagliato con Clal nelle cellule 293 di rene di embrione umano (ECACC). Placche ricombinanti sono state isolate ed amplificate come descritto in (14) (15). Il pattern di DNA di AdRSVhIL-6a ricombinante è stato controllato mediante analisi di restrizione multipla.
Tutti gli stock virali sono stati preparati in cellule 293 e purificati due volte con gradiente di CsCl isopicnico. La desalinizzazione è stata eseguita usando colonne Pharmacia G50. I virus sono stati frazionati e tenuti in PBS-15% glicerolo a -80°C. I titoli, calcolati mediante analisi di placca su cellule 293, variano da 1 a 2 x IO11 pfu/ml .
ESEMPIO 2
Cellule infettate_ is_ Yitro_ son_ l'adenovirus ricombinante_ AdRSVhJCL-St_ producono_ Sani_ 1_ nel soyranatante della coltura cellulare
Per testare l'espressione dell'antagonista -mediante l'adenovirus ricombinante AdRSVhIL-6a, costruito come descritto nell'esempio precedente, piastre di coltura falcon da 35 mm di cellule 293 di rene embrionale umano in coltura subconfluente sono state infettate in 3 mi di mezzo di coltura con 10 plaque forming unit (pfu)/cellula di uno stock purificato di AdRSVhIL-6a, preparato come descritto nell'esempio 1. 24 ore dopo l'infezione, i sovranatanti sono stati raccolti e concentrati cinque volte con tubi centricon 3 (Amicon). 25 μΐ di sovranatanti concentrati vengono caricati su gel di acrilammide. Il gel viene trasferito elettricamene (elerctroblotted) e la membrana di microcellulosa viene bloccata per una notte in TBS-5% latte-0,05% Tween 20. Dopo lavaggio in TBS-0,05% Tween 20, la membrana viene incubata per due ore con anticorpi policlonali anti-hIL6 (R&D, hIL6 ELISA kit), accoppiati con perossidasi di rafano, diluita 1:2, v/v, in TBS-5% latte-0,05% Tween 20. Dopo lavaggio con TBS-0,05% Tween 20, la membrana viene sviluppata con kit di bioluminescenza ECL (Amersham) seguendo le istruzioni fornite dal produttore. Una banda singola, di massa molecolare attesa, viene rivelata nei sovranatanti di cellule infettate con AdRSVhIL-6a, ma non nei sovranatanti di cellule infettate con AdRSVPgal, oppure nei sovranatanti di cellule infettate di controllo.
Pertanto, cellule infettate con AdRSVhIL-6a esprimono e secernono nel sovranatante di cellule in coltura una proteina delle stesse dimensioni di hIL-6 e di Santi (che è la forma mutante della stessa hIL-6) e che è riconosciuta mediante anticorpi diretti contro hIL-6.
ESEMPI0-^3-Santl espresso_ in vitro da cellule_ infettate con AdRSVhlL- Set inibisce l'attività biologica di hIL-6 su cellule di epatoma umano
E' ben noto nello stato della tecnica che IL-6 stimola la trascrizione di una serie di geni (noti come geni di fase acuta) nelle cellule di fegato oppure in linee cellulari di epatoma fegatoderivato in coltura. In particolare IL-6 stimola la trascrizione da parte del promotore del gene della proteina C-reattiva in cellule di epatoma umano Hep3B ((16) ed i riferimenti là menzionati).
Per verificare se il Santi prodotto mediante il virus ricombinante è capace di inibire l'attività biologica di IL-6 sopra descritta, piastre di coltura falcon da 35 mm di cellule 293 di rene di embrione umano in coltura subconfluente vengono infettate con AdRSVhIL-6a oppure AdRSVPgal (in 3 mi di mezzo di coltura con 10 plaque forming unit (pfu)/cellula di uno stock purificato). 24 ore dopo l'infezione i sovranatanti vengono raccolti e testati per l'inibizione dell'attività biologica di hIL-6 su cellule di epatoma umano Hep3B. L'efficacia della stimolazione trascrizionale è stata misurata in conformità allo stato della tecnica (16). Le cellule di epatoma umano Hep3B sono state stimolate con 4 ng/ml di hIL-6, e questa entità di stimolazione è stata presa come 100%, oppure con 4 ng/ml di hIL-6 in presenza di diluizioni seriali di sovranatanti di coltura cellulare ottenuta da cellule 293 infettate con AdRSVhIL6oc; nell'ultimo caso l'entità della stimolazione trascrizionale è stata espressa come percento della stimolazione ottenuta in cellule incubate con 4 ng/ml della sola hIL-6. I risultati dell'esperimento sono riportati nella sottostante tabella 1.
TABELLA λ
Inibizione dell'attività biologica di hIL-6 -su cellule di epatoma umano Hep3B da parte di diluizioni seriali di sovranatante di coltura cellulare ottenute da cellule 293 infettate con AdRSVhIL-6a.
Attività biologica Diluizione del siero (% del controllo)
1:2916 85,8%
1 :972 87,7%
1 : 324 72,3%
1 :108 57,0%
1:36 28,1%
1 .12 23,8%
1:4 8,1%
Si può vedere che il sovranatante di coltura cellulare ottenuto da cellule 293 infettate con AdRSVhIL-6(x diluito 1:4 inibisce completamente la bioattività di 4 ng/ml di hIL-6 su cellule di epatoma umano Hep3B . L'inibizione non è stata dovuta a tossicità, perchè in presenza di eccesso molare di hIL-6 (1000 ng/ml) l'attività del promotore del gene della proteina C-reattiva è stata riportata fino al 100% (risultato non mostrato) . I dati riportati nella tabella 1 possono essere usati per tracciare una curva doseinibizione, da cui si può interpolare che ad una diluizione di siero di 1:60 si ottiene il 50% dell'inibizione dell'attività di IL-6. In un esperimento parallelo di inibizione eseguito non con sovranatante di cellule 293 infettate con AdRSVhIL-6a, ma con Santi ricombinante, prodotto in E. coli, si ottiene 50% di inibizione dell'attività di IL-6 ad una concentrazione di proteina di 10 ng/ml. Pertanto, la concentrazione di Sant 1 in sovranatante di cellule 293 infettate con AdRSVhIL-6a non diluito si può calcolare moltiplicando la concentrazione di Sant 1 necessaria per raggiungere il 50% di inibizione dell'attività di IL-6 su cellule di epatoma Hep3B (10 ng/ml) per il fattore di diluizione del sovranatante delle cellule 293 infettate con AdRSVhIL-6a (60) che dà il 50% di inibizione dell'attività di IL-6.
Il calcolo dà:
Concentrazione di Santi in sovranatante di cellule 293 infettate con AdRSVhIL-6a non diluito =
= 10 ng/ml x 60 = 600 ng/ml.
Santi espresso in vitro da_ cellule_ infettati—con AdRSVhIL -6a inibisce l'attività biologica_djL_hII^6 su ce]luie di mieiorna umano
Nell'esempio precedente si è mostrato che il sovranatante di coltura cellulare ottenuto da cellule 293 infettate con AdRSVhIL-6a è capace di inibire l'attività biologica di interluchina 6 (stimolazione di trascrizione da parte di un promotore inducibile da IL-6 ) su cellule di epatoma umano. Nella parte introduttiva di questa descrizione, si è detto che i livelli alterati di IL-6 nel siero sono stati descritti in svariate patologie, come varie forme di mieloma multiplo/plasmacitoma . In questo esempio si dimostra che il sovranatante di coltura cellulare ottenuto da cellule 293 infettate con AdRSVhIL-6a inibisce completamente la crescita interluchina 6-dipendente di una linea cellulare di mieloma umano, denominata XG-1, derivata da cellule primarie di mieloma isolate da un paziente con la malattia in fase terminale. La crescita della linea cellulare di mieloma XG-1 è strettamente dipendente da IL-6 aggiunta in modo esogeno, allo stesso modo di quanto si è visto per cellule primarie di mieloma; pertanto, questa linea cellulare può essere considerata un eccellente modello in vitro per il mieloma multiplo (17).
Per verificare l'antagonismo dei mutanti rispetto all'interluchina 6 naturale, cellule di mieloma XG-1 sono state messe in coltura in micropiastre da 96 pozzetti a 6000 cellule/pozzetto con hIL-6 a 0,1 ng/ml di mezzo di coltura, in presenza di diluizioni seriali di sovranatante ottenuto da colture di cellule 293 infettate con AdRSVhIL-6a come descritto nel 'esempio precedente. Dopo sei giorni di coltura, il numero delle cellule è stato calcolato mediante determinazione colorimetrica dei livelli di esaminidasi (18) . La tabella 2 seguente mostra l'inibizione dell'attivitià di hIL-6 in funzione delle diluizioni del sovranatante di colture di cellule 293 infettate con AdRSVhlL-6α .
TABELLA 2
Inibizione dell'attività biologica di hIL-6 su cellule di mieloma umano XG-1 da parte di diluizioni seriali di sovranatante di coltura cellulare ottenuto da cellule 293 infettate con AdRSVhlL -6a
Attività biologica Diluizione del siero (3⁄4 del controllo)
1:2916 84,7%
1:972 83,1%
1:324 80,5%
1:108 61,0%
1:36 46,1%
1:12 28,2%
1 :4 7,0%
Si può vedere che il sovranatante di coltura cellulare ottenuto da cellule 293 infettate con AdRSVhIL-6a diluito 1:4 inibisce completamente l'effetto di stimolazione della crescita di 0,1 ng/ml di hIL-6 su cellule di mieloma umano XG-1. Come nel precedente esempio, l'inibizione non è dovuta a tossicità, perchè in presenza di eccesso molare hIL-6 (100 ng/ml) la crescita di cellule XG-1 è stata recuperata fino al 100% (risultato non mostrato) . I dati riportati in tabella 2 possono essere usati per tracciare una curva doseinibizione da cui si può interpolare che il 50% di inibizione dell'attività di IL-6 viene ottenuto ad una diluizione del siero di 1:40. In un esperimento di inibizione parallelo eseguito non con sovranatante di cellule 293 infettate con AdRSVhlL-6α., ma con Santi ricombinante, prodotto in E. coli, il 50% di inibizione dell'attività di IL-6 viene ottenuto ad una concentrazione di proteina di 20 ng/ml. Pertanto, la concentrazione di Santi in sovranatante _non diluito di cellule 293 infettate con AdRSVhIL-6a ρμό essere calcolato moltiplicando la concentrazione di Santi necessaria a raggiungere il 50% di inibizione dell'attività . di IL-6 su cellule di mieloma XG-1 (20 ng/ml) per il fattore di diluizione del sovranatante di cellule 293 infettate con AdRSVhIL-6a (40) che dà il 50% di inibizione dell'attività di IL-6. Il calcolo dà: Concentrazione di Santi in sovranatante non diluito di cellule 293 infettate con AdRSVh∑L-6a =
= 20 ng/ml x 40 = 800 ng/ml
che è in accordo molto buono con la stima della concentrazione di Santi in sovranatante non diluito di cellule 293 infettate con AdRSVhIL-6a ottenuta nell'esempio precedente (600 ng/ml).
ESEMPIO 5
Animali iniettati_ con_ 1'adenovjrus_ ricombinante AdRSVhlL-6a producono Santi
Per verificare in vivo l'espressione dell'antagonista da parte di AdRSVhIL-6a, costruito come descritto nell'esempio 1, topi dell'età di 6-8 settimane (forniti da IFFACREDO, Francia) vengono iniettati nella vena orbitale con la dose standard di 2 x IO<9 >pfu/topo, diluita in 100 μΐ di PBS. Il sangue viene raccolto a tempi diversi dopo l'iniezione mediante puntura nella vena, orbitale dopo aver trattato l'animale con etere. I sieri vengono preparati secondo lo stato dell'arte e la concentrazione dell'antagonista nel siero viene misurata in modo convenzionale per mezzo di un test ELISA a "sandwich", usando un kit disponibile in commercio prodotto dalla società "R&D Systems" , e seguendo scrupolamente le istruzioni del produttore. L'esperimento dimostra che l'iniezione endovenosa di 2xl0<9 >pfu di AdRSVhIL-6a in topi di età tra le 6 e le 8 settimane permette l'espressione di Santi ad una concentrazione 5 di ng/ml, per due mesi.
ESEMPIO 6
Santi prodotto_ in_ VJLSLQ_ in topi_ infettati_ con AdRSVhlL- 6a inibisce l'attivazione di APRF indotta da hIL-6 in cellule di mieloma umano
E' ben noto nello stato dell'arte che uno dei primi stati nell'attivazione cellulare indotta da IL-6 è la fosforilazione in tirosina del "fattore di trascrizione di fase acuta" ( APRF). Al momento della fosforilazione, APRF acquisisce l'abilità di legare sequenze specifiche di DNA (elementi di risposta di fase acuta: APREs), e migra verso il nucleo (19).
Per verificare se il Santi prodotto in vivo dall'adenovirus ricombinante è capace di inibire l'attività biologica di IL-6 sopra descritta, sieri di topi iniettati con 2xl0<9 >pfu di AdRSVhIL-6oc oppure di adenovirus di controllo vengono raccolti al 40° giorno dopo l'inizione come descritto nell'esempio precedente, concentrati e testati su cellule di mieloma umano XG-1 per quanto riguarda l'inibizione dell'attività biologica di hIL-6 sopra descritta. Dopo 4 ore di deprivazione di IL-6, le cellule XG-1 vengono incubate per 15 minuti a 37°C con un mezzo di coltura senza IL-6, con 0,2 ng/ml di IL-6 in presenza di 50% di siero di topi non sottoposti a iniezione, con 0,2 ng/ml di IL-6 in presenza di 50% di siero di topi iniettati con AdRSVhIL-6a e con 0,2 ng/ml di IL-6 in presenza di 50% di siero di topi iniettati con virus controllo. Gli estratti cellulari totali sono stati stati preparati e l'attivazione di APRF è stata monitorata mediante tecnica di ritardo su gel (gel redardation) come descritto nello stato della tecnica (19) . L'attivazione di APRF per i vari campioni è stata quantificata al phosphoimager e l'entità di attivazione nei vari campioni è stata espressa come percento dell'attivazione ottenuta in cellule stimolate con 0,2 ng/ml di IL-6 in presenza di 50% di siero di topi non sottoposti a iniezione. I risultati dell'esperimento sono riportati nella seguente tabella 3.
TABELLA.3.
Inibizione dell'attivazione di APRF indotta da hlL-6 in cellule di mieloma umano XG-1 da parte di siero di topi iniettati con AdRSVhIL-6a oppure con adenovirus di controllo
Attivazione di APRF Campione (percentuale del controllo) no IL-6 0%
0,2 ng/ml IL-6, 50% siero di
topi non sottoposti a iniezione 100%
0,2 ng/ml IL-6, 50% di siero di
topi iniettati con AdRSVhIL-6ct 5%
0,2 ng/ml IL-6, 50% di siero di
topi iniettati con adenovirus
di controllo 75%
Come si può vedere dalla tabella, il siero di topi sottoposti a iniezione con adenovirus ricombinante AdRSVhIL-6a e contenente Santi espresso in vivo come determinato nell'esempio precedente inibisce in modo molto efficace l'attivazione di APRF indotta da 0,2 ng/ml di IL-6 in cellule XG-1. Ancora una volta, l'inibizione non è dovuta a tossicità, perchè in presenza di eccesso molare di hIL-6 (100 ng/ml) l'attivazione di APRF indotta da IL-6 è stata del tutto recuperata (dato non mostrato). Inoltre, la tabella 3 mostra anche che il siero di topi iniettati con adenovirus ricombinante di controllo non inibisce in modo significativo l'attivazione di APRF indotta da 0,2 ng/ml di IL-6 in cellule XG-1.
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
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Claims (28)
- Rivendicazioni 1. Adenovirus difettivo ricombinante, caratterizzato dal fatto di comprendere almeno una sequenza di DNA codificante per un mutante di interluchina 6 umana (hIL-6), un suo frammento o un suo derivato, con attività antagonista o superantagonista nei confronti di hIL-6.
- 2. Adenovirus difettivo ricombinante come da rivendicazione 1, in cui la sequenza di DNA è un cDNA.
- 3. Adenovirus difettivo ricombinante come da rivendicazione 1 o 2, in cui il mutante di hIL-6 con attività superantagonista è Tyr31Asp, Gly35 Phe , Serll8Arg, Vall21Asp, Glnl75Ile, Serl76Arg, Glnl83Ala.
- 4. Adenovirus difettivo ricombinante come da rivendicazione 1 o 2, in cui il mutante di hIL-6 con attività superantagonista è Tyr31Asp, Gly35Phe, Leu57Asp, Glu59Phe, Asn60Trp, Gln75Tyr, Ser76Lys, Serll8Arg, Vall21Asp, Glnl75Ile, Serl76Arg, Glnl83Ala .
- 5. Adenovirus difettivo ricombinante come da una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui la sequenza di DNA è posta sotto il controllo di segnali che permettono la sua espressione in differenti tipi di cellule umane specifiche.
- 6. Adenovirus difettivo ricombinante come da una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui i segnali di espressione sono selezionati tra i promotori virali.
- 7. Adenovirus difettivo ricombinante come da rivendicazione 6, in cui il promotore virale è Rous Sarcoma Virus (RSV).
- 8. Uso di un adenovirus ricombinante, come da rivendicazioni da 1 a 7, per la preparazione di una composizione farmaceutica per la cura e/o la prevenzione di mieloma multiplo.
- 9. Uso di un adenovirus ricombinante, come da rivendicazioni da 1 a 7, per la preparazione di una composizione farmaceutica per la cura e/o la prevenzione di morbo di Castleman.
- 10. Uso di un adenovirus ricombinante come da rivendicazioni da 1 a 7 per la preparazione di una composizione farmaceutica per la cura e/o la prevenzione di glomerulonefrite mesangiale.
- 11. Uso di un adenovirus ricombinante, come da rivendicazioni da 1 a 7, per la preparazione di una composizione farmaceutica per la cura e/o la prevenzione di osteoporosi.
- 12. Uso di un adenovirus ricombinante, come da rivendicazioni da 1 a 7, per la preparazione di una composizione farmaceutica per la cura e/o la prevenzione di linfoma positivo a EBV.
- 13. Uso di un adenovirus ricombinante, come da rivendicazioni da 1 a 7, per la preparazione di una composizione farmaceutica per curare e/o prevenire artrite reumatoide.
- 14. uso di un adenovirus ricombinante, come da rivendicazioni da 1 a 7, per la preparazione di una composizione farmaceutica per la cura o la prevenzione di lupus eritematoso sistemico.
- 15. Composizione farmaceutica, caratterizzata dal fatto di comprendere almeno uno degli adenovirus difettivi ricombinanti delle rivendicazioni da 1 a 7.
- 16. Composizione farmaceutica come da rivendicazione 15, in forma iniettabile.
- 17. Composizione farmaceutica come da rivendicazione 15 o 16, contenente 1'adenovirus ricombinante nell'intervallo da IO<4 >a IO<14 >pfu/ml (plaque forming unit/ml).
- 18. Composizione farmaceutica come da rivendicazione 17 contenente l'adenovirus difettivo ricombinante nell'intervallo da IO<6 >a IO<10 >pfu/ml .
- 19. Cellula di mammifero, caratterizzata dal fatto di essere infettata da almeno uno degli adenovirus difettivi ricombinanti delle rivendicazioni da 1 a 7.
- 20. Cellula come da rivendicazione 20, che è una cellula umana.
- 21. Cellula come da rivendicazione 20 selezionata dal gruppo comprendente fibroblasti, mioblasti, epatociti, cellule endoteliali, cellule gliali e cheratinociti.
- 22. Impianto, caratterizzato dal fatto di comprendere le cellule infettate di rivendicazioni da 19 a 21 ed una matrice extracellulare.
- 23. Impianto come da rivendicazione 22, in cui la matrice extracellulare è un composto gelificante selezionato dal gruppo comprendente collagene, gelatina, glucosamminoglicani , fibronectine e lectine .
- 24. Impianto come da rivendicazione 22 o 23, in cui la matrice extracellulare comprende un supporto per ancorare le cellule infettate.
- 25. Impianto come da rivendicazione 24, in cui il supporto è fatto di fibre di politetrafluoroetilene .'
- 26. Uso di un adenovirus ricombinante, come da una delle rivendicazioni da 1 a 7, per la preparazione di una composizione farmaceutica per prolungare in vivo l'espressione di un gene di interesse da parte di adenovirus.
- 27. Cellula come da una delle rivendicazioni da 19 a 21, caratterizzata dall'ulteriore espressione di un gene d'interesse che codifica per una proteina terapeutica.
- 28. Cellula come da una delle rivendicazioni da 19 a 21, caratterizzata ulterioremente dall'essere trasformata con almeno un virus che esprime un gene terapeutico.
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