PT667872E - Interleucina-6 mutante com actividade biologica melhorada em relacao a da interleucina 6 selvagem - Google Patents
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Description
1
DESCRIÇÃO “INTERLEUCINA-6 MUTANTE COM ACTIVIDADE BIOLÓGICA MELHORADA EM RELAÇÃO À DA INTERLEUCINA 6 SELVAGEM” A presente invenção diz respeito à interleucina 6 mutante com actividade biológica sobre células humanas que é significativamente superior à que é apresentada pela interleucina 6 selvagem.
Como se sabe, a interleucina 6 (no seguimento também indicada como IL-6) é um polipeptido de aminoácido 184 postulado como pertencendo à classe de citocinas helicoidais. A IL-6 é uma citocina multifuncional produzida por uma variedade de tipos de células. Ela actua como um factor de diferenciação e de crescimento sobre células de diversos tipos, por exemplo células do sistema imune, hepatócitos, células dos rins, células da coluna hematopoiética, ceratinócitos e neurónios (Akira, S., Hirano, T. Taga, T. e Kishimoto, T. (1990) FASEB J. 4, 2861-2867; Hirano, T. (1991) International J. of Cell Cloning 9, 166-186; Hirano, T. Akira, S. Taga, T. e Kishimoto, T. (1990) Immunol. Today 11, 443-449; Van Snick, J., Cayphas, S., Vink, A., Uyttenhove C., Coulie, P.G. e Simpson, R.J. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83, 9679-9683). O modelo tridimensional de interleucina 6 humana (hIL-6) baseia-se na semelhança do seu padrão de hidrofobicidade com o de outras citrocinas e sobre a determinação de raio-x da estrutura de proteínas tais como, por exemplo, a hormona do crescimento, a interleucina-2, a interleucina-4, o interferon-beta e o Granulocyte 2
Macrophage Colony Stimulating Factor (Factor de Estimulação de Colónia de Granulócitos Macrófagos). O modelo resultante, ou seja, um feixe de quatro alfa-hélices (A, B, C e D) de topologia acima-acima-abaixo-abaixo ligadas por meio de três lacetes, sugere que podiam ser adoptados nove aminoácidos de terminal carbóxi que podiam ser dobrados em uma alfa-hélice ou uma conformação não helicoidal que interactua com os resíduos no lacete A-B. As experiências realizadas durante a presente invenção favorecem esta segunda conformação não-helicoidal. Nesta região, outros sublinharam já a importância de um ponto de vista de actividade biológica da arginina em posição 182 e da metionina em posição 184.
Descobriu-se agora, inesperadamente, que a interleucina 6 mutante, objecto da presente invenção, com o amino-ácido arginina em posição 176, em vez do amino-ácido cerina, como acontece com a interleucina 6 selvagem, apresenta uma actividade biológica significativamente maior do que a da interleucina 6 selvagem.
Isto constitui um resultado extremamente importante devido aos seus efeitos no campo da medicina. A actividade biológica aumentada da interleucina 6 mutante de acordo com a presente invenção toma possível a utilização de doses terapêuticas compreendidas entre 2 e 4 vezes mais baixas do que as requeridas quando se utiliza a interleucina-6 selvagem no tratamento de um certo número de doenças graves. De facto, a interleucina 6 tem aplicações importantes e promissoras no tratamento do cancro da mama, da leucemia, de doenças infecciosas e de doenças associadas com perturbações ligadas às células da coluna da medula óssea. O objecto da presente invenção é, portanto, a interleucina 6 mutante, caracterizada pelo facto de ter, em posição 176, o amino-ácido arginina em vez do aminoácido serina como acontece na interleucina 6 selvagem, e de apresentar uma actividade biológica sobre células humanas superior à da interleucina 6 selvagem. Em particular, a actividade biológica da interleucina 6 mutante de acordo com a presente invenção pode encontrar-se compreendida entre 3 e 5 vezes maior do que a da interleucina 6 do tipo selvagem. A presente invenção diz também respeito a um polipeptido não glicosilado que compreende á sequência de aminoácidos de interleucina 6 mutante por substituição Ser 176 Arg. A invenção refere-se também a vectores recombinantes que compreendem uma sequência de ADN que codifica para o referido polipeptido e aos microrganismos transformados que a contém. A invenção diz também respeito a um processo para a preparação do referido polipeptido não glicosilado mediante cultura dos referidos microrganismos transformados e o isolamento subsequente do polipeptido.
Finalmente, a invenção refere-se também a composições farmacêuticas - para o tratamento do cancro da mama, da leucemia, de doenças infecciosas relacionadas com perturbações das células da coluna da medula óssea, e trombocitopema - que contêm, como princípio activo, interleucina 6 mutante com o aminoácido arginina em posição 176. Tais compostos podem ser administrados por via I.V. A actividade biológica aumentada da interleucina 6 mutante de acordo com a presente invenção deve ser relacionada com a afinidade aumentada para o
receptor da interleucina 6 humana, na região do carbono terminal, devido à substituição, como resíduo 176, da serinapela arginina. A figura única anexa representa um mapa genético do plasmídeo pBKS IL-6 Ser 176 Arg que contém a sequência nucleotílica que codifica para a interleucina 6 mutante de acordo com a invenção, não glicosilada. Este plamídeo foi depositado em E.coli Kl 2 na The National collection of Industrial and Marine Bactéria Ltd. em 02/11/1992, sob o número de admissão NCIMB 40526.
Até este ponto deu-se uma descrição geral da presente invenção. Com o recurso aos exemplos seguintes, dar-se-á agora uma descrição mais pormenorizada das suas formas de realização, para se obter uma compreensão mais clara dos seus objectos, características, vantagens e métodos de aplicação. EXEMPLO 1
Preparação de interleucina 6 mutante por substituição Ser 176 Arg
Gerou-se a substituição Ser 176 Arg de interleucina 6 utilizando a estratégia PCR (conforme ilustrado em Fontaine, V., Savino, R., Arcone, R., Brakenhoff, J.P.J., Content, J. e Ciliberto, G. (1992) Eur. J. Biochem; veja-se em particular a figura 1) e o oligonucleotido representado na SEQ ID NO:2, que corresponde, a partir do nucleotido 11 até ao fim, às posições 506 a 555 (cordão anti-sentido) de IL-6 ADN (considerando + 1 como o primeiro nucleotido do primeiro códão da sequência que codifica para o polipeptido maduro). A sequência nucleotídica que codifica para o polipeptido maduro e a sequência de ammoácido do polipeptido maduro encontram-se representadas na listagem de sequências anexa como SEQ ID NO: 1. A purificação dos fragmentos ampliados, a ligação no vector pBKS IL-6, a despistagem e a caracterização dos plasmídeos mutantes foram realizadas conforme se descreveu no trabalho anteriormente mencionado de Fontaine et al.
Alguns dos ADNcs mutantes foram sub-clonados no vector de expressão E. coli pT7,7 (Studier, F.W. e Moffatt, B.A., (1986) J. Mol. Biol. 189, 113-130), isto foi conseguido mediante excisão dos ADNcs escolhidos com Spel e Xhol e ligação dos mesmos em corte de pT7,7 com Xbal (compatível com Spel) e Sall (compatível com Xhol).
Exprimiu-se a proteína mutante de duas maneiras diferentes, as quais serão indicadas com a) e b) no seguimento. a) Transcrição e translação ín vitro.
Linearizaram-se todos os plasmídeos mutantes e pBKS IL-6 utilizando Asp 718. Transcreveu-se aproximadamente um pg de templato de ADN utilizando um estojo de fecho mCAP ARN (Stratagene, La Jolla, Ca) de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Traduziu-se os ARNs transcritos com lisado de reticolocistos de coelho (Promega) durante 90 minutos à temperatura de 30°C na presença de 35S-metionina (Amersham); analisaram-se 3 μΐ do cocktail de translação mediante electroforese em SDS-PAGE a 15% (conforme descrito em Fiorillo, M.T. Cabibbo, A., lacopetti, P, Fattori E. e Ciliberto, G. (1992) Eur. J. 22, 2609-2615). Após exposição, cortaram-se as bandas que correspondem ao tipo selvagem e à hIL-6 mutante a partir do gel de poliacrilamida e determinou-se a sua radioactividade. Normalizaram-se os valores tomando em consideração o número de metioninas presente. 6
Ο b) Produção em E. coli.
Exprimiu-se hIL-6 de tipo selvagem e mutante em E. coli e purificou-se exactamente conforme descrito em Arcone, R., Pucci, P., Zappatosta, F., Fontaine, V., Malomi, A., Marino, G. e Ciliberto, G. (1991) Eur. J. Biochem 198, 541-547; e em Fiorillo, M.T., Cabibbo, A., lacopetti, P., Fattori, E. e Ciliberto, G. (992) Eur. J. Immunol. 22, 2609-2615. Verificou-se a pureza das proteínas mediante electroforese em SDS-PAGE a 15% e manchou-se com azul de Comassie Brilliant (azul brilhante de Comassie) R-250. Quantificou-se a sua quantidade mediante ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad). EXEMPLO 2
Ensaios biológicos
Determinou-se a actividade biológica do mutante de interesse em primeiro lugar sobre células de origem humana. Determinou-se a actividade de hIL-6 de células humanas quanto à sua capacidade para melhorar a transcrição de promotores de gene de fase aguda em células de origem hepática (Morrone, G., Ciliberto, G., Oliviero, S., Arcone, R., Dente, L., Content, J. e Cortese, R. (1988) J. Biol. Chem. 263, 12554-12558). Ensaiou-se em seguida o mutante quanto à sua capacidade para induzir a actividade CAT (cloranfenicol-acetiltransferase) a partir de uma fusão de promotor de proteína reactivo-C (CRP) e CAT transfectado na linha de células do hepatoma humano Hep3B (Arcone, R., Gualandi, G. e Ciliberto, G. (1988) Nucleic Acids Res., 16, 3195-3207, Fiorillo, Μ. T., Cabibbo, A., lacopetti, P., Fattori, E., Ciliberto, G. (1992) Eur. J. Immunol. 22, 2609-2615). Os resultados obtidos utilizando este sistema são de particular importância, já que eles dependem 7
da eficácia da interacção da citocina com o sistema receptor homólogo.
Em particular, transfectaram-se células humanas Hep3B com 45-50 pg do plasmídeo-219 CRP-CAT que contém o elemento de resposta IL-6 do gene promotor de CRP Realizou-se a transfecção em 20 ml de Dulbecco’s Modified Eagle Médium (DMEM; Gibco) complementado com soro fetal de vitela a 10% e L-gluttamina 2 mM utilizando a técnica de precipitação do fosfato de cálcio (Graham, I.F.L. e Van der Eb, A.J. (1973) Virology 52, 456-467). Decorridas 16-18 horas, removeram-se os precipitados, tnptinizaram-se as células, juntaram-se, contaram-se e plaquearam-se em número igual (10' a 3x10') em placas de petri com 5 cm de diâmetro; 7 a 9 horas após o plaqueamento, induziram-se as células durante 36 a 40h com quantidades crescentes de mutante ou hIL-6 de tipo selvagem. Realizaram-se os ensaios com extractos de célula e CAT conforme descrito por Gorman, C. (1985) em “DNA cloning; a practical approach'’ (Glover, M.D., ed.) págs. 143-190, IRL Press, Oxford.
Realizou-se um ensaio em duplicado (em triplicado no caso de hIL-6 de tipo selvagem) com diluições em série de duas a quatro preparações independentes de mutante. Calculou-se a actividade do mutante, expressa como uma percentagem de hIL-6 de tipo selvagem, como sendo a razão entre a quantidade de hIL-6 de tipo selvagem e a quantidade do mutante em exame necessária para se obter uma estimulação semi-máxima.
Dado a actividade biológica da interleucina 6 de tipo selvagem ser igual a 100% neste ensaio, a actividade biológica da interleucina 6 mutante de acordo com a presente invenção, com a substituição Ser 176 Arg (S176R), mostra, conforme se indica no quadro seguinte 1, um valor de 370 ± 90%, que é deste modo um valor igual a três a quatro vezes o da proteína de tipo selvagem. QUADRO 1
Comparação da ligação do receptor e da actividade biológica Mutação Actividade biológica (% em peso de hIL-6) Ligação de hIL-6R (% em peso de hIL-6) S176R 370 ±90% 320 ± 87% Afinidade para o receptor c comparada com a actividade e hIL-6 solúvel de hIL-6 mutante produzida em E. coli biológica observada
Ensaiou-se igualmente a interleucina 6 mutante de acordo com a presente invenção utilizando o ensaio clássico de HGF (Hybridoma Growth Factor) quanto à sua capacidade para estimular o crescimento da linha das células do hibridoma murino dependente de hIL-6 7TD1 (Van Snick, J., Cayphas, S., Vink, A., Uyttenhove, C., Coulie, P.G. e Simpson, RJ. (1986) Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 83, 9679-9683). Realizou-se o ensaio tendo em consideração as indicações de Fiorillo, M.T., Cabibbo, A., lacopetti, P., Fattori, E. e Ciliberto, G. (1992) Eur. J. Immunol. 22, 2609-2615. Neste caso, verifícou-se também um aumento significativo da actividade biológica na interleucina 6 mutante relativamente ao tipo selvagem.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA (1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Istituto di Ricerche di Biologia Molecolarè P. Angeletti S. p. A.
(11) TÍTULO DA INVENÇÃO: INTERLEUCINA 6 MUTANTE COM ACTIVIDADE BIOLÓGICA MELHORADA EM RELAÇÃO À INTERLEUCINA 6 SELVAGEM (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) REMETENTE: Società Italiana Brevetti S. p. A. (B) RUA. 39 Piazza di Pietra (C) CIDADE: Roma (D) ESTADO: Itália (E) CÓDIGO POSTAL: 1-00186
(v) FORMA DE LEITURA DO COMPUTADOR
(A) TIPO DE MEIO: Floppy disk 3.5” 1.44 MBYTES (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS Ver. 5.0 (D) PROGRAMA: Microsoft Wordstar 4.0 (vi) ELEMENTOS CORRENTES DO PEDIDO:
(A) NÚMERO DO PEDIDO
(B) DATA DO PEDIDO (C) CLASSIFICAÇÃO: 10 10
(vii) ELEMENTOS CORRENTES DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: IT RM92A000809 (B) DATA DO PEDIDO: 06 de Novembro de 1992 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE O MANDATÁRIO: (A) NOME: Dl CERBO, Mario (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (39) 6 6785941 (B) TELEFAX: (39) 6 6794692
(C) TELEX: 612287 ROPAT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1 . (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 555 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (n) TIPO MOLECULAR: ADNc (Ui) HIPOTÉTICO: não (ív) ANTISENTIDO: não (vi) FONTE DE ORIGEM: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (B) ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO: Adulto (C) TIPO DE CÉLULA: monócitos (vii) FONTE IMEDIATA:
11 (A) COLECÇAO: ANDc (B) CLONE: pB.B2.21 (Xl) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: CCA GTA CCC CCA GGA GAA GAT TCC AAA GAT GTA GCC GCC CCA CAC AGA 48 Pro Vai Pro Pro Glv Glu Asp Ser Lys Asp Vai Ala Ala Pro His .Arg 1 5 10 15 CAG CCA CTC ACC TCT TCA GAA CGA ATT GAC •AAA CAA ATT CGG TAC ATC 96 Gin Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gin Ile •Arg Tyr Ile 20 25 30 ATG TGT G.AA AGC AGC AAA GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG .AAC CTT 192 Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu .Asn Asn Leu Asn Leu 50 55 60 CCA AAG ATG GCT G.AA AAA GAT GGA TGC TTC CAA TCT GGA TTC AAT GAG 240 Pro Lys Met .Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gin Ser Gly Phe .Asn Glu 65 70 75 80 GAG ACT TGC CTG GTG .AAA ATC ATC ACT GGT CTT TTG GAG TTT GAG GTA 288 Glu Thr Cys Leu Vai Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Vai 85 90 95 TAC CTA GAG TAC CTC CAG AAC AGA TTT GAG AGT AGT GAG G.AA CAA GCC 336 Tyr Leu Glu Tyr Leu Gin .Asn Afg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gin .Ala 100 105 110 AGA GCT GTC CAG ATG AGT ACA AAA GTC CTG ATC CAG TTC CTG CAG AAA 384 Arg .Ala Vai Gin Met Ser Thr Lys Vai Leu Ile Gin Phe Leu Gin Lys 115 120 125 AAG GCA •AAG AAT CTA GAT GCA ATA ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACA AAT 432 Lys Ala Lys .Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro .Asp Pro Thr Thr .Asn 130 135 140 12 12 GCC AGC CTG CTG ACG AAG CTG CAG GCA CAG AAC CAG TGG CTG CAG GAC 480 Ala Ser Leu Leu Thr Lvs Leu Gin Ala Gin Asn Gin Tip Leu Gin Asp 145 150 155 160 ATG AC A ACT CAT CTC ATT CTG CGG AGC TTT AAG GAG TTC CTG CAG TCC 528 Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gin Ser 165 170 175 AGC CTG AGG GCT CTT CGG C.AA ATG TAG 555 Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gin Met 180 (3) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO. 60 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (n) TIPO MOLECULAR: Oligonucleotido (iii) HIPOTÉTICO: não
(iv) ANTISENTIDO: sim (vii) FONTE IMEDIATA
(A) Sintetizador de ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: GGTGCTCGAG CTACATTTGC CGAAGAGCCC TCAGGCTNNN CTGCAGGAAC TCCTTAAAGC 60
Claims (9)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Interleucina 6 mutante, caracterizada pelo facto de ter, na posição 176, o aminoácido arginina, em vez do aminoácido serina, como acontece na interleucina 6 selvagem, e de apresentar actividade biológica sobre células humanas superior à da interleucina 6 de tipo selvagem .
2. Interleucina 6 mutante de acordo com reivindicação 1, que exibe uma actividade biológica sobre células humanas compreendida entre três e cinco vezes superior à da interleucina 6 de tipo selvagem.
3. Polipeptido não-glicosilado que compreende a sequência de amino-ácidos de interleucina 6 mutante de acordo com as reivindicações 1 e 2.
4. Vector recombinante que compreende uma sequência de ADN que codifica para o polipeptido de acordo com a reivindicação 3.
5. Vector recombinante de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de consistir no plasmídeo pBKS IL-6 Serl76Arg depositado em E. coli Kl 2 na The National Collection of Industrial and Marine Bactéria Ltd. em 02/11/1992 sob o número de admissão NCIMB 40526.
6. Microrganismo transformado, caracterizado pelo facto de conter o vector recombinante de acordo com a reivindicação 4 ou 5.
7. Microrganismo transformado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de ser E. coli, em particular E. coli Kl2.
8. Composições farmacêuticas, apropriadas para o tratamento do cancro da mama, da leucemia, de doenças infecciosas e de doenças associadas com 2 perturbações das células da coluna da medula óssea e trombocitopenia, caracterizadas pelo facto de conterem, como princípio activo, interleucina 6 mutante de acordo com as reivindicações 1 a 3, e caracterizadas pelo facto de serem administradas por via I V.
9. Processo para a preparação do polipeptido não-glicosilado, que compreende a sequência de aminoácidos de interleucina 6 mutante, de acordo com a reivindicação 3, mediante cultura dos microrganismos transformados de acordo com as reivindicações 6 e 7 e o isolamento subsequente do polipeptido. Lisboa, 1 de Junho de 2000
1250 LISSOA
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