JPH07501947A - 野生インターロイキン６より改良された生物学的活性を有する突然変異インターロイキン６ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 野生インターロイキン６より改良され１−＋物学的活性を有する突然変異インタ ーロイキン６ 本発明は、ヒト細胞上で、インターロイキン６が示すよりも著しく優れた生物学 的活性を有する突然変異インターロイキン６に関する。

知られているように、インターロイキン６（以下、ＩＬ−６とも言う）は、らせ ん状サイトカインの鼾に属すると仮定された！８４アミ、／酸ポリペプチドであ る。

ｌ　Ｌ　−６は、種々の細胞型により生産される多機能サイトカインである。そ れは、例えは、免疫系細胞、肝細胞、腎細胞、血液生成幹細胞、ケラチン生成細 胞及びニューロンのような種々のタイプの細胞上での、分化及び生長因子として 作用する（アキラ、Ｓ８、ヒラ人Ｔ１、タガ、Ｔ、及びキシモト、Ｔ、（１９９ ０）、ＦＡＳＥＢＪ、４．２８６　＋−２８６７：ヒラメ、Ｔ、（１９９１）、 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊ、　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　９．１ ６Ｇ−＋８６；ヒラ人Ｔ９、アキラ、Ｓｏ、タガ、Ｔ、及びキシモｈ−Ｔ、（＋ 　９９０）　、ｌｎｗｎｕｎｏｌ、Ｔｏｄａｙ　１１．４４３−４４９．パンス ニソク、Ｊ３、ケイファス、Ｓ３、ピンク、Ａ９、ウイテンホーブ、Ｃ１、クー リー、Ｐ、Ｇ、及びシンプソン、Ｒ，Ｊ、（１９８６）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、υＳＡ、８３．９６７９−９６８３）。

ヒトインターロイキン６（＋１１Ｌ−６）の３次元モデルは、その他のサイトキ ンの類似性を有するその疎水性パターンの類似性、及び例えば、生長ホルモン、 インターロイキン２、インターロイキン４、インターフェロン−β及び顆粒球マ クロファージコロニー刺ｒＩＩｉ因子のような蛋白質の構造のＸ線による決定に 基づいている。得られるモデルは、所謂、３つのループにより接続された上−上 一下一丁を存する４つのα−ヘリックス（Ａ、　Ｂ、　Ｃ及びＤ）の束であり、 ９のカルボキシ末端アミノ酸がα−ヘリックス中に折り曲げられることができ、 または、Ａ−Ｂループ中の残基と相互作用する非らせん形状を採用することがで きることを示唆している。本発明において実施された実験は、この第２の非らせ ん形状を支持するものであった。この領域において、位置１８２におけるアルギ ニン及び位置１８４におけるメチオニンの生物学的活性の観点から、その重要性 か既に明らかに示されている。

野生型インターロイキン６における場合のアミノ酸セリンの代りに、位置１７６ にアミノ酸アルギニンを有する本発明の主題である突然変異インターロイキン６ が、野生インターロイギン６よりも著しく高い生物学的活性を示すことを、予想 外に発見した。

このことは、薬学の分野にお（＋る有効性を考慮すると極めて重要な結果である 。

本発明による突然変異インターロイキン６の改良された生物学的活性により、多 くの重篤な病気の治療において、〒Ｔ生インターロイキン６を使用する場合に要 求される投与量よりも２〜４倍少なく投与することが可能になる。事実、インタ ーロイキン６は、胸部ガン、白血病、感染性疾患及びｆ髄幹細胞の障害に関連す る疾患における重要でｌ′７来ず１望な利用分野を有する。

従って、本発明のサブジエクトは、位ｒａ、１７６に、野生インターロイキン６ におけるアミノ酸セリンの代りにアミノ酸アルギニンを有し、ヒト細胞上で、野 生インターロイキン６よりも優れた生物学的活性を示すことを特徴とする突然変 異インターロイキン６である。特に、本発明による突然変異インターロイキン６ の生物学的活性は、野生型インターロイキン６よりも２〜３倍高い値であり得る 。

本発明は、置換Ｓｅｒ１７６Ａｒｇによる突然変異インターロイギン６のアミ人 酸配列からなる非グリコジル化ポリペプチドに関する。

本発明はまた、１１前記ボリペプチドをコーｌ−するＤＮＡ配列からなる組換え ベクターおよびそれを含む形質転換微生物に関する。

本発明はまた、前記形質転換微生物の培養及びそれに続くポリペプチドの回収に よる前記非グリフノル化ポリペブチ１−の製造方法に関する。

１／Ｉｔ＋＆に、本発明はまた、活性本質物として、位置１７６にアミノ酸アル ギニンをイ１する突−変異インターロイキン６を含む、胸部ガン、白血病、骨髄 幹細胞の障害に関連する感染性疾患及び血小板減少症の治療のための薬学的組成 物に関する。このような化合物は、静脈内投与されることかできる。

本発明による突然変異インターロイキン６の増加生物学的活性は、アルギニンに よるセリンの残基１７６としての、置換によるＣ末端領域におけるＬｈインター ロイキン６レセブターに対する親和性の増加に１Ｓ１１連する。

添付の唯一の図面は、非グリコツル化された、本発明の突然変異インターロイキ ン６をコードするヌクレオチｌ−配列を含むプラスミドｐＢＫＳ　ＩＬ−６Ｓｅ ｒ１７６Δｒｇの遺伝子地図を示す。このプラスミドは、Ｅ、ｃｏｌｉ中に挿入 されアクセス番号ＮＣＩＭＢ　４０５２６ｒ１９９２年１１月２日に、Ｔｈｅ　 Ｎａｔｉｏｎａｌ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎ ｄ　Ｍａｒｌｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｌｔｄ、に■■■■ ている。

以上、本発明の詳細な説明を記載したか、本出願の目的、特徴、利点及び方法を より理解しやすくするために、下記の実施例により、本発明の具体例をより詳し く説明する。

実施例Ｉ Ｓｅｒ１７６Ａｒｇ置換による突然変異インターロイキン６の製造Ｓｅｒ１７６ Ａｒｇｆｆ換インターロイギン６全インターロイギンして生成しく）オンテイヌ 、■１、サヒノ、Ｒ１、アルコン、Ｒ１、ブラケンホフ、Ｊ、Ｐ。

Ｊｌ、フンテント、Ｊ、及びシリバート、Ｇ、（１９９２）　、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍに記載の方法により行った：特定図」参照）、ヌクしオチド１１が ら末端まで、Ｉ　Ｌ　−６ＤＮＡの位置５０６〜５５５（アンチセンス鎖）に対 応する５ＥＱＴＤＮ０・２に示す（＋１を成熟ポリペプチドをフートする配列の 第１コドンの第１ヌクレオチドであると仮定する）。

成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び成熟ポリペプチド゛のアミ ノ酸配列を、添付の配列表にＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１として示す。

増幅されたフラグメ〉１−の精製、ｐＢＫＳ　ＩＬ−６ベクターにおける連結反 し諒突然変異プラスミドのスクリーニング及び特性化を、フォンティヌらによる 上記の文献に記載された方法により行った。

いくらかの突然変異ｃＤＮＡを、Ｅ、ｃｏｌｉ表現ベクターｐ７７．７中にサブ クローン化しくストウディエル、Ｆ、　Ｗ、及びモファット、Ｂ、Ａ、（＋９８ ６）　Ｊ、Ａｌｏｌ、Ｂｉｏｌ、Ｉ　８９．１１３−１３０）：選択されたｃＤ ＮＡをＳｐｅ　Ｔ及びＸｈｏｌにより切り出し、Ｘｂａ　Ｉ　（Ｓｐｅ　Ｉと共 存可能）及びＳａｉｌ（Ｘｈｏｌと共存可能）により切断されたｐ７７．７中て それを連結した。

突然変異蛋白質は、下記ａ）及びｂ）に示す２つの異なる方法により発現させｌ こ。

ａ）インビトロの転写及び翻訳 全ての突然変異プラスミド及びｐＢＫＳ　ＩＬ−６を、Ａｓｐ７１８を使用して 線状化した。約１　／　ｕ　ｇのＤＮＡ鋳型を、ｍＣＡＰ　ＲＮＡキャップ形成 キット（カリフ十ルニア州、ラン９−太ストラータジーン製）を使用して、製造 者により与えられた指示に従って転写した。この転写されたＲＮＡを、２８３− メチオニン（アマージャム製）の存在下で、ラビットの網状赤血球溶解物を使用 して、３０°Ｃにおいて９０分間翻訳し、翻訳混合物３／μｌを、＋　５９６３ ＤＳ−ＰＡＧＥ中で電気泳動により分析した（フィオリロ、Ｍ、　Ｔ、　、カビ ツボ、Ａ１、イアコペソティ、Ｐｌ、ファノトリ、Ｅ、及びソリバー１−１Ｇ、 （１９９２）　Ｅｕｒ、Ｊ。

２２．２６０９−２６１５に記載された方法により行った）。暴露後に、野生型 及び突然変異ｈＴＬ−６に対応するバントを、ポリアクリルアミドゲルから切り 出し、その放射性活性を測定した。値は、存在するメチオニンの数を考虜に入れ て正規化した。

ｂ）Ｅ、ｃｏｌｉにおける生成 野生型及び突然変異ｈｌＬ−６を、アルコン、Ｒ１、プツチ、Ｐｌ、サソパトス タ、Ｒ９、フォンテイヌ、■１、マロ一二、Ａ１、マリン、Ｇ、及びシリバート 　Ｇ　（１９９１）　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９８．５４１−５４ ７．及びフィオリロ、ｈ、ｔ　Ｔ、　、カビツボ、Ａ１、イアコペソティ、Ｐｌ 、７７ノトす、Ｅ、及びシリバー１−１Ｇ、（１９９２）　Ｅｕｒ、、１．　Ｉ ｎｗｎｕｎｏｌ、　２２．２６０９−２６１５に記載の方法と全く同じ方法によ り、Ｅ、ｃｏｌｉ中で発現させ、精製した。蛋白質の純度を、＋　５９６３ＤＳ −ＰＡＧＥ中の電気泳動により、及びコマッシーブリリアントブルーＲ−２５０ により染色して調へた。それらの量を、バイオランドの蛋白質アッセイ（ハイオ ラソト製）により定量した。

実施例２ 生物学的アッセイ 対東突然変異体の生物学的活性を、最初に、ヒト起源の細胞上で調べた。ヒト細 胞上のｈｌＬ−６の活性を、その肝臓起源の細胞上の急性期遺伝子プロモーター から転写を促進する能力についてアッセイした（モロン、Ｇｏ、シリバート、Ｇ １、才りヴイエロ、Ｇ９、アルコン、Ｒ１、デンテ、Ｒ８、コンテント、Ｊ。

及びコーテセ、Ｒ，（１９８８）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６３．１２５ ５４−１２５５８）。従って、突然変異体を、Ｃ−反応性蛋白質プロモーター（ ＣＲＰ）及びヒト肝細胞ガン細胞系ＨｅｐａＢ中にトランフェクトされたされた ＣＡＴ融合体から、ＣＡＴ　（クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラ ーゼ）を誘起する活性に関して調へた（アルコン、Ｒ９、グアランディ、Ｇ、及 びシリバート、Ｇ。

（１９８８）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、Ｉ　６．３１９５−３ ２０７　；フィオリロ、Ｍ。

Ｔ３、カビツボ、Ａ１、イアコペノティ、Ｐｏ、ファットリ、Ｒ９、シリバート 、Ｇ、（＋　９９２）　Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ１．２２．２６０９−２６ １５）、この系を使用して得られた結果は、サイトカインと同一レセプター系の 相互作用の効率に依存しているので、特に重要である。

特に、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞を、ＣＲＰプロモーター遺伝子のＩＬ−６応答エレメ ントを含む４５−５０／μｇのプラスミド　−２＋　９ＣＲＰ−ＣＡＴによりト ランスフェクトさせた。トランスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿方法を 使用して、１０％ウシ胎児血清と２ｎ＃Ｌ−グルタミンを補給したダルベツコの 変性イーグル培地（ＤＭＥＭ、ギブコ）２０ｍｌ中で行った（グラハム、１．　 Ｆ、　Ｌ。

及びパンデルニブ、Ａ、Ｊ、（１９７３）　、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２．４５６− ４６７）。

１６〜１８時間後に、沈殿物を除去し、細胞をトリプシン処理し、集め、３１数 し、５ｃｍ径のペトリ皿中に等数（１０５〜３ＸＩＯＪ接種し；接種ｖｉ７〜９ 時間後に、細胞を、突然変異体または野生型ｈｌ−６を増殖させることにより３ ６〜４０時間誘発させた。細胞抽出物及びＣＡＴアッッセイを、ゴーマン、Ｃ， （１９８５）　−ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐ ｒｏａｃｈ”、　（グローバー、Ｍ、Ｄ、ら）＋４３−１９０、オックスフォー ド、ＩＲＬブレスに記載の方法により実施した。

このアッセイは、突然変異体の２〜４の独立した標本の連続的希釈物を用いて、 二連制で行った（野生型ｈｌＬ−６の場合には二連制で行った）。野生型ｈｌＬ −６の百分率として表現した突然変異体の活性を、半最大刺激を与えるために必 要な試験下における、野生型ｈｌＬ−６の量と突然変異の量との比率として算出 した。

野生型インターロイギン６の生物学的活性を本アッセイにおいて１００％とする 、Ｓｅｒ　Ｉ　７６Ａｒｇ　（Ｓｌ　７６Ｒ）ａ換を有する本発明の突然変異イ ンターロイキン６の生物学的活性は、下記表１中に報告されるように、３７０± ９０％の値を示し、野生型蛋白質の３〜４倍の値である。

表ル セブター結合及び生物的活性の比較 突然変異体　生物的活性　ｈｌＬ−６Ｒ結合（野生型ｈｌＬ−６に対する％）　 （野生型ｈｌＬ−６に対する％）Ｓ＋７６Ｒ３７０±９０％　３２０±８７％観 察された生物活性と比較したＥ、ｃｏｌｉにおいて生成された突然変異ｈｌＬ− ６の可溶性ｈｌＬ−（ｉレセプターについての親和性本発明の突然変異インター ロイキン６はまた、ｈｌＬ−６依存ハツカネズミハイブリト−マ細胞系７ＴＤｌ の生長を刺激する能力を調へるための古典的ＨＧＦ（ハイブリトーマ生長因子） を使用して試験した（パンスニソク、Ｊｌ、ケイファス、Ｇ９、ヒンク、Ａｏ、 ウイノテンホーブ、Ｇ３、クーリー、Ｐ、Ｇ、及びシンプソン、Ｒ，Ｊ、（１９ ８６）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３．９６７９−９ ６８３）。このアッセイは、フィオす口、Ｍ、　Ｔ、　、カヒボ、Ａ９、イアコ ペッティ、Ｐｌ、ファットリ、Ｅ、及びシリバート、Ｇ、（１９９２）　、Ｅｕ ｒ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏ、２２．２６０９−２６１５の指示を考廖に入れて行った。この場 合、生物的活性における著しい増ＤＩか、野生型との比較において突然変異イン ターロイキン６において見られた。

配列表 （１１一般的情報 （ｉ）　出願人、イスチチュ−１・　ディ　リセルシュ　ディ　バイオロジアモ レコラレ　ピー、アンジエレッティ　ソシエタ　アチオニ（ｉ　ｉ）　発明の名 称・野性インターロイキン　６に対し改良された生物的活性を有する突然変異イ ンターロイキン　６ （Ｒ１）配列の数：　２ （ｉｖ）対応住所： （Ａ’）　名称・　ソソエタ　イタリアーナ　ブレベラティ　エスビーア−（Ｂ ）　通り　、３９　ビアッツア　ディ　ビニトラ（Ｃ）　都市　ローマ （Ｄ）　国、イタリア （Ｅ）　ＺＩＰ・　ｌ−００１８６ （Ｖ）　コンピューターフオーム。

（Ａ）　媒体、　フロッピーディスク３．５”１．４４　ＭＢＹＴＥＳ（Ｂ）　 コンピューター：　Ｉ８！１１　ＰＣｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｃ）　作動システ ム　ＰＣ−００３／ＭＳ−ＤＯ３Ｒｅｖ、　５．０（Ｄ）　ソフト、マイクロソ フトワードスター４．０（ｖｉ）　最近の出願データ （Ａ’）　出願番号・ （Ｂ）　出願日 （Ｃ）　分類・ （ｖｉｉ）先の出願データ： （Ａ）　出願番号　ＩＴ　ＲＭ９２ＡＯＯＯ８０９、（Ｂ）出願日・１９９２年 １１月６日（ｖｉｉｉ）　代理人に関する１ｎ報：（Ａ）　氏名、ディ　セルポ 　マリネ （ｉｘ）　電気通信に関する情報： （＾）１話：　（３９）　６６７８５９４１（Ｂ）　ファックス＋　（３９）　 ６６７９４６９２（Ｃ）　テレックス：　６１２２８７　ＲＯＰＡＴ＋２１　Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　ｌに関する情報（ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ・５５５塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数・−木端 （Ｄ）トポロジー、直線状 （ＩＩ）　配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）　ハイボセテイカル３口０ （ｉｖ）　アンチセンス二〇〇 （ｖｌ）　起源 （Ａ）　生物名　ホモサピエンス （Ｂ）　分化の程度：成人 （Ｃ）　細胞の種類・単核細胞 （ｖｉｉ）　直接の起源： （Ａ）　ライブラリー名：　ｃＤＮＡ （Ｂ）　クローン名・ｐＢ、β２．２１（ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：　ｌ：ＣＣＡ　ＧＴＡ　ＣＣＣＣＣＡ　ＧＧＡ　ＧＭ　ＧＡＴ　ＴＣＣ ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＧＴＡ　ＧＣＣＧＣＣＣＣＡ　（ＪＣＡＣＡ　４８Ｐｒｏ　Ｖ ａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　入ｓｐ　Ｓｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｖ ａｌ　Ａｌａ　入１ａ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ａｒｇｌ　５　１０　１５ ＣＡＧ　ＣＣＡ　ＣＴＣＡＣＣＴＣＴ　ＴＣＡ　ＧＡＡ　ＣＧＡ　ＡＴｒ　ＧＡ ＣＡＡＡ　ＣＡＡ　ＡＴＴα；Ｇ　ＴＡＣＡＴＣ９６Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　ＴＡｕ　 ’ｒｈｒ　ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　ｋｒｑ工１ｅ　ＡＳＰ　［Ｉｌａ　Ｇｉｎ 工ｌｅ　ｈｒｑ　Ｔｙｒ工１ａＣＩ’ＣＧＡＣＧＧＣＡＴＣＴＣＡ　ＧＣＣＣＴ Ｇ　ＡＧＡ　、ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＡＣＡ　ＴＧＴ　ＭＣＡＡＧ　ＡＧＴ　ＡＡＣ １４４Ｉａｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｉｌａ　Ｓｉｒ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｌ ｙｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｇ　Ｓｅｒ　ＡｇｎＡＴＧ　ＴＧ Ｔ　ＧＭ　ＡＧＣＡＧＣＡＡＡ　ＧＡＧ　ＧＣＡ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　Ａ ＡＣＡＡＣＣＴＧ　ＡＡＣＣＴｒ　１９２Ｍｅセ　ＣＴ４　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓ ｅｔ：　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｓｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａ８ｎ　 Ｌａｕ　ｋｓｎ　ｔａ■ （：ＣＡ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＧＧＡ　ＴＧＣ ＴＴＣ（ＩＪＩＡ　ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＴＴＣ入ＡＴ　ＧＡＧ@２４０ Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔλｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｐ ｈｓ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　ＧｌｕＧＡＧ　ＡＣＴ　ＴＧ ＣＣＴＧ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　ＡＴＣＡＴＣＡＣＴ　ＧＧＴ　ＣｒＴ　ＴＴＧ　Ｇ ＡＧ　ＴＩＴ　ＧＡＧ　ＧＴＡ　２８P１ ｃｔｕ　Ｔｈｒ　ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌ＋Ｙ！ｉ工１ｅ工ｌｅ　Ｔｈｒ　 Ｇｌｙ　Ｉａｕ　Ｉａｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｖａ１ＴＡＣＣＴＡ　ＧＡ Ｇ　ＴＡＣＣＴＣＣＡＧ　ＡＡＣＡＧ入’ｒｒｒｃ＾Ｇ　ＡＧＴ　ＡＧＴ　ＧＡ Ｇ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＧＣＣ３３６Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　 Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　 Ｇｉｎ　Ａｌａｌｏｏ　１０５　１１０ ＡＧＡ　ＧＣ’ｌ”　ＧＴＣＣＡＧ　ＡＴＧ　ＡＧＴ　入ＣＡ　ｊＪｉＡ　ＧＴ ＣＣＴＧ　ＡＴＣＣＡＧ　ＴｒＣＣｒＧ　ＣＡＧ　入ＡＡ　R８４ Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　 Ｉａｕ工ｌｅ　Ｇｉｎ　Ｐｈｔａ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ２５ＣＡＧＧＣＡ　 ＡＡＧ　ＡＡＴ　ＣＴＡ　ＧＡＴ　ＧＣＡ　ＡＴＡ　ＡＣＣＡＣＣＣＣＴ　ＧＡ ＣＣＣＡ　ＡＣＣＡＣＡ　ＡＡＴ　４３Q ＬＹＳ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　ｋｓｐ　Ａｌａ　ＩＩｓ　Ｔｈｒ　 Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　’Ｉ’ｈｒ　Ａ唐■ １コ０　１３５　１４０ ＧＣＣＡＧＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＡＣＧ　ＡＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＧＣＡ　ＣＡ Ｇ　ＡＡＣＣＡＧ　ＴＧＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＧＡＣ４８０Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌ ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　入１ａ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｇ ｉｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ１コ０　１５０　１５５　１６０ ＾ＴＧ　ＡＣＡ　ＡＣｒ　ＣＡＴ　ＣＴＣＡＴｒ　ＣｒＧ　ＣＧＧ　ＡＧＣｆｆ ｌ　ｋｋＧ　（：ＡＧ　？ｆ’ＣＣＴＧ　ＣＡＧ　ＴＣＣ５Q８ Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｌａｕ工１ｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｉｒ　Ｐ ｈａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　５ｅｒＡＧＣＣＩ’Ｇ　ＡＧ Ｇ　ＧＣＴ　ＣＩＴ　ＣＧＧ　ＣＭ　ＡＴＧ　ＴＡＧ　５５５Ｓ＠ｒ　］Ｊｕ　 ｘｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ｋｒｑ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ（３１１Ｄ　Ｎｏ：　２　＋ ：関ｔルｔ＊報（ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ・６０　塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トボロノー、直線状 （１１）　配列の種類・すりゴヌクレオチド（ｉｉｉ）　ハイボセティカル：ｎ ０ （ｉｖ）　アンチセンス　ロ０ （ｖｌ）　直接の起源。

（Ａ）ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｊｉｚｅｒ（ｘｉ’）　配列の記、ａ：　ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ＋　２：ＧＧＴＧＣＴＧＡＧ　ＣＴＡＣＡＴＴＴＧＣＣＧＡＡＧＡＧ ＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＮＮＮ　ＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴＣＣＴＴＡＡＡＧＣ６０ 国際調査報告　ｏｒＴ／ＴＴ　ｏ、ｔｎｎ＋１ａ、−、、ＰＣＴ／ｒＴ　９１１ ００１１４フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　１／２１　 ７２３６−４８ １５１０９　ＺＮＡ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　１５１０９　ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ１：９１） Ｉ Ｃ１２Ｒ１：９１）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．位置１７６において、野生インターロイキン６におけるアミノ酸セリンの代 りに、アミノ酸アルギニンを有し、ヒト細胞上で、野生型インターロイキン６よ りも優れた生物学的活性を示すことを特徴とする突然変異インターロイキン６。
2. ２．ヒト細胞上で、野生型インターロイキン６よりも３〜５倍高い生物学的活性 を示す請求の範囲第１項に記載の突然変異インターロイキン６。
3. ３．請求の範囲第１及び２項に記載の突然変異インターロイキン６のアミノ酸配 列からなる非グリコシル化ポリペプチド。
4. ４．請求の範囲第３項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からなる組 換えベクター。
5. ５．アクセス番号ＮＣＩＭＢ４０５２６で１９９２年１１月２日に【配列があり ます】に、Ｅ． ｃｏｌｉ　Ｋ１２中に挿入されたプラスミドｐＢＫＳ　ＩＬ−６Ｓｅｒ１７６Ａ ｒｇからなることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の組換えベクター。
6. ６．請求の範囲第４項または５項に記載の組換えベクターを含むことを特徴とす る形質転換微生物。
7. ７．Ｅ．ｃｏｌｉ、特にＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２であることを特徴とする請求の範 囲第６項に記載の形質転換微生物。
8. ８．活性本質物として、請求の範囲第１〜３に記載の突然変異インターロイキン ６を含み、静脈内投与されることを特徴とする、胸部ガン、白血病、感染性疾患 、骨髄幹細胞の障害に関連する疾患及び血小板減少症の治療に適した薬学的組成 物。
9. ９．請求の範囲第６及び７に記載の形質転換微生物の培養及びその後のポリペプ チドの回復により、請求の範囲第３項に記載の突然変異インターロイキン６のア ミノ酸配列からなる非グリコシド化ポリペプチドの製造方法。