JP3068026B2 - Ｂ細胞分化因子の製造方法 - Google Patents
Ｂ細胞分化因子の製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｂ細胞分化因子の
製造方法に関する。さらに詳しくは、マウスのＴ細胞株
が産生するＢ細胞分化因子をコードするＤＮＡ配列を用
いてＢ細胞分化因子を製造する方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】Ｂ細胞分化因子（ＴＲＦ：Ｔ ｃｅｌｌ
Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒとも呼ばれる）
は、血液中のＴ細胞系列から産生されＢ細胞に直接作用
し、これを抗体産生細胞に分化・誘導するポリペプチド
からなる因子である。 【０００３】抗体は、生体に侵入する細菌、ウイルスあ
るいは癌細胞などの生体異物と反応し、これらを不活性
化したり排除したりする機能をもっている。Ｂ細胞分化
因子（以下ＴＲＦと略す）は、特定抗原（生体異物）に
特異的なＢ細胞クローン即ち特定抗原に感作されたＢ細
胞クローンを抗体産生細胞に誘導して、該抗原に対する
抗体を産生させることから、ＴＲＦは、種々の感染症お
よび癌の治療の面から有用な物質である。即ち、ＴＲＦ
は、この因子の生体内での過少によってひきおこされる
と考えられる自己免疫疾患や免疫不全症等の診断、治療
のみならず種々の感染症や癌の治療に利用できることが
期待される。 【０００４】ＴＲＦに関してはこれまでいくつかの研究
がなされている。例えば、ＴＲＦ産生細胞として知られ
ているＴ細胞ハイブリドーマＢ１５１Ｋ１２株の培養液
からＴＲＦ活性を有する物質の精製が試みられ、温度お
よび酸性ｐＨで比較安定な、単量体の分子量が１８，０
００乃至１９，０００の糖蛋白質であろうと推定されて
いる〔Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１３４，３８２，１９８５，Ｈａｒａｄａ，
Ｎ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４，３９
４４，１９８５および特開昭６０−２３７０２２な
ど〕。しかしながら、培養液中のＴＲＦ含量は少なく、
多段の精製過程（硫安沈澱、陰イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過、ＨＰＬＣ、スラブ電気泳動、逆相Ｈ
ＰＬＣ、レクチンアフィニティーカラムクロマトグラフ
ィーなど）を経て分取できる物質は極微量であるため、
その構造（アミノ酸配列）も物理化学的性質も明確にさ
れるには至っていない。また、ＴＲＦの生産に関与する
遺伝子（ＤＮＡ配列）も知られていない。なお、上述先
行技術の精製ＴＲＦは、ＢＣＧＦ（Ｂ ｃｅｌｌ Ｇｒ
ｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：Ｂ細胞増殖因子）IIの活性も
有することが示されている。また、複数のＴＲＦの存在
も示唆されている。 【０００５】このように、従来Ｂ細胞を分化・誘導する
因子（ＴＲＦ）の構造は明らかでなく、それを大量に生
産して実用に供することは不可能であった。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】即ち、本発明は、ＴＲ
Ｆ高生産細胞からＴＲＦｍＲＮＡを単離し、ＴＲＦ生産
を支配するＴＲＦ遺伝子（即ちＤＮＡ配列）を明らかに
すると共に、ＴＲＦ分子の構造（アミノ酸配列）を明ら
かにすることにより、組換えＤＮＡ技術でＴＲＦの大量
生産および医薬等への応用の可能性を提供しようとする
ものである。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、既にＳｉ
ｄｅｒａｓ，Ｐ．らによって樹立されているＩｇＧ1誘
導因子ＢＣＤＦγ産生細胞であるＴ細胞ライン２．１９
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５，５８６〜５９
３，１９８５）が、従来用いられているＴ細胞ハイブリ
ドーマＢ１５１Ｋ１２株よりもＴＲＦを約１００倍量生
産することを見出した。そこでこのＴ細胞ライン２．１
９を用いて上記の問題点を解決すべく鋭意研究の結果本
発明を完成するに至った。 【０００８】本発明のＤＮＡを調製するには、まずＴ細
胞ライン２．１９からｍＲＮＡ画分を常法により調製
し、ｐｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡを用いて既に開発されてい
る方法（Ｎｏｍａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３
１９，６４０〜６４６，１９８６）に従いｃＤＮＡライ
ブラリーを作製する。このライブラリーから得られる各
ｃＤＮＡクローンのプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｓａｌ
Ｉで直線化した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏの系でＳＰ６
ＲＮＡポリメラーゼで転写させてｍＲＮＡを得る。この
ようにして作製されたｍＲＮＡをアフリカツメガエル
（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞（ｏｏｃｙｔｅ）に注射
して培養し、培養上清に分泌されてくるｍＲＮＡからの
翻訳産物（蛋白質）のＴＲＦ活性およびＢＣＧＦII活性
の有無を測定する〔Ｇｒｏｎｏｗｉｃｚ，Ｅ．ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５８８〜５９
０，１９７６およびＴａｋａｔａｕ，Ｋ．ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５，２６４６〜２６５
３，１９８０〕。尚、ここで述べるＴＲＦ活性およびＢ
ＣＧＦII活性は、各々下記の活性を有することによって
定義される。 【０００９】Ａ） ＴＲＦ活性： １） マウス慢性Ｂ白血病細胞（ＢＣＬ1 ）をＩｇＭ抗
体産生細胞に分化させる活性、 ２） 抗原（ＤＮＰ−ＫＬＨ）感作させたマウス脾臓内
Ｂ細胞を抗原（ＤＮＰ−オボアルブミン）で刺激し、特
異的抗体（抗ＤＮＰ−ＩｇＧ）産生細胞に分化させる活
性、または ３） ｉｎ ｖｉｖｏで活性化したＢ細胞ブラストのＩ
ｇＭ合成誘導活性。 【００１０】Ｂ） ＢＣＧＦII活性： １） ＢＣＬ1 細胞の分裂促進、または ２） デキストラン硫酸刺激休止Ｂ細胞の分裂促進。 【００１１】上記の活性測定法の内、特にＡ）−１）お
よびＢ）−１）の活性を指標にして、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
で転写されるｍＲＮＡのＴＲＦ活性およびＢＣＧＦII活
性の測定を行ない、ＴＲＦのｃＤＮＡを有するクローン
を前記ｃＤＮＡライブラリーから選択するのが便利であ
る。次に選択されたクローン（ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２
３）のプラスミドＤＮＡに挿入されているｃＤＮＡ断片
の塩基配列は公知の方法（後記実施例に記載するジデオ
キシ法およびユニディレクショナルディリーション法）
により決定し（図１参照）、意味のあるオープンリーデ
ィングフレーム（ポリペプチドをコードする塩基配列）
を探しＴＲＦのアミノ酸配列を定めることができる。こ
の際、選択されたクローンｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３の
挿入ＤＮＡ領域には、１３３個と６２個のアミノ酸から
なるポリペプチドをコードする二種のオープンリーディ
ングフレームが見出されるが、後者（図１中５４４番目
から７２９番目の塩基配列に相当）のポリペプチドは、
分子量が約６，５００であって、この値は２．１９細
胞から産生されるＴＲＦの単量体分子量（約１８，００
０）に比べたとえ糖鎖が付与されているとしても小さす
ぎること、およびこのオープンリーディングフレーム
中に存在するＡＣＣ Ｉ切断部位を当該制限酵素で切断
して作製されたクローンから調製されるｍＲＮＡが、ア
フリカツメガエルの卵母細胞でＴＲＦ産生能を失わない
ことから、ＴＲＦポリペプチドではない。従って、２．
１９細胞がその生体内でまず産生するＴＲＦは、１３３
個のアミノ酸からなるポリペプチドであると決定される
（図１参照）。尚、このポリペプチドのＮ末端にあるＭ
ｅｔ（メチオニン）は、翻訳後修飾過程（ｐｏｓｔ ｔ
ｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｐｒｏｃｅｓｓ）で、フォルミル化やアセチル化され
ることがあり、またＭｅｔが取り除かれたりすることも
ある。 【００１２】このように決定されるポリペプチドのＮ末
端領域には、分泌蛋白質に特有のリーダー配列（図１
中、Ｎ末端から約２０番目までのアミノ酸配列に相当す
る疎水性の強いペプチド領域）が存在している。このこ
とは２．１９細胞培養上清にＴＲＦが分泌される事実と
合致する。通常、リーダー配列は、生体内でプロセシン
グ（シグナルぺプチダーゼによる切断など）を受け、そ
の領域が取り除かれた成熟ポリペプチドになることが知
られている。これまで知られているリーダー配列の切断
部位〔一般にアラニン（Ａｌａ）やグリシン（Ｇｌｙ）
などのアミノ酸のＣ末端側；Ｗａｔｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．
Ｅ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，５１４５〜
５１６４，１９８４参照〕から、本発明で用いた２．１
９細胞が分泌するＴＲＦ活性（或いはＢＣＧＦII活性）
をもつ約１８，０００分子量の蛋白質（糖蛋白質）は、
図１に示すアミノ酸配列中の各々１９番目、２１番目或
いは２２番目から１３３番目までのポリペプチドを含む
分子であると考えられる。このことは、ＴＲＦが糖蛋白
質であることから考え、これらのポリペプチドの分子量
（およそ１２，３００〜１２，７００）の添架からも妥
当である。即ち、このポリペプチドから計算される分子
量（約１２，３００）は、オープンリーディングフレー
ム（図１中４４番目から４４２番目までの塩基配列）に
対応するアミノ酸配列中に存在する３ケ所のＮ−グリコ
シル化可能部位（図１中の下線を引いたアミノ酸配列）
から考え矛盾はない。尚、上記のようなプロセシングを
受けて生じたポリペプチドのＮ末端のアミノ酸残基は、
さらにアセチル化されたり、またそれがＧｌｕ（グルタ
ミン酸）の場合はピロル化されたりすることがある。 【００１３】さらに、生体内で産生されるポリペプチド
は、そのＣ末端が生体内でのプロセシングの過程で欠失
されることがあることが知られており、図１で示したポ
リペプチドのＣ末端のアミノ酸あるいはぺプチドの一部
が欠失していることもあると考えられる。 【００１４】これらのポリペプチドは、図１に示すＤＮ
Ａ、特に翻訳終止コドン（ＴＧＡ）を含む１〜１３３ま
でのアミノ酸配列に対応する塩基配列、あるいはこれと
実質的に同等な塩基配列を有するＤＮＡを適当な発現ベ
クターに挿入し、これを適当な微生物や動物宿主細胞に
導入（形質転換）して、その形質転換体を培養すること
により、これるでの細胞培養に比べ効率的且つ大量に生
産することができる。 【００１５】以下、実施例でもって本発明をさらに詳し
く説明する。 【００１６】 【実施例】 （１） ＴＲＦｍＲＮＡの調製 ＴＲＦ産生細胞としては、Ｔ細胞ライン２．１９を用い
た。本細胞ラインはＳｉｄｅｒａｓ，Ｐ．らによって既
に樹立されているものである（Ｓｉｄｅｒａｓ，Ｐ．ｅ
ｔ．ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５，５８
６〜５９３，１９８５）。 【００１７】まず、ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）で活
性化した２．１９Ｔ細胞からＮｏｍａ，Ｙ．らの方法
（Ｎａｔｕｒｅ，３１９，６４０〜６４６，１９８６）
に従いｐｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ画分）を抽出
し，５〜２２％の濃度勾配を用いた蔗糖密度勾配遠心法
（３６，０００ｒｐｍ、１５時間）によりｐｏｌｙ
（Ａ）+ ＲＮＡ抽出液を１６の画分に分画分取した。次
に、各分画の適当量をアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐ
ｕｓ）の卵母細胞（ｏｏｃｙｔｅ）に注射し、２０℃で
３６時間培養後その培養液についてＴＲＦ活性およびＢ
ＣＧＦII活性を測定した。 【００１８】ＴＲＦ活性の測定は、卵母細胞培養上清サ
ンプルを、１．５×１０5 個のＢＣＬ1 細胞を含む０．
２ｍｌのＲＩＴＣ培地（血清フリーで５ｍｇ／ｍｌの牛
血清アルブミン、５０μＭの２−メルカプトエタノー
ル、抗生物質を含む）で培養した培地に加え、２日後、
Ｇｒｏｎｏｗｉｃｚ，Ｅ．らのプロティンＡプラーク測
定法〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５８８〜５９
０，１９７６〕により、ＩｇＭ分泌産生細胞数を測定す
ることにより行った。一方、ＢＣＧＦII活性の測定は、
上記ＢＣＬ1 細胞の増殖度を２日培養の最後の６時間に
3Ｈチミジンを加えて上記ＢＣＬ1 細胞に取り込まれる
3Ｈチミジン量で測定することにより行った。 【００１９】その結果、図２に示す如く、ＢＣＧＦII活
性（図中の黒棒）は、９Ｓおよび１６ＳのｍＲＮＡ画分
にみられ、ＴＲＦ活性（図中の白棒）は、１６ＳのｍＲ
ＮＡ画分のみにみられた。なお、同図中、Ｐは、ＴＲＦ
産生株の１つであるＴ細胞ハイブリドーマＢ１５１Ｋ１
２株の培養上清を５０％の濃度で上記ＢＣＬ1 培養培地
に加えたポジティブコントロールを示し、Ｎは、ｍＲＮ
Ａ画分の代りにリン酸バッファーを卵母細胞に注入して
培養したネガティブコントロールを各々示す。 【００２０】９Ｓ ｍＲＮＡの分子サイズはインターロ
イキン（ＩＬ）−４のｍＲＮＡサイズに相当すること
〔Ｎｏｍａ．Ｙ．ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３１９，
６４０〜６４６，１９８６〕、および９Ｓ ｍＲＮＡ画
分にはＢＣＬ1 増殖促進活性はあるが、ＢＣＬ1 細胞の
ＩｇＭ分泌産生細胞への分化活性がみられないことか
ら、本発明者らは、２．１９Ｔ細胞の１６Ｓ ｍＲＮＡ
画分にＴＲＦ ｍＲＮＡが存在すると判断し、次にｃＤ
ＮＡライブラリーの作製を試みた。 【００２１】（２） ｃＤＮＡライブラリー調製とＴＲ
ＦｃＤＮＡクローンの選択 ＣｏｎＡで活性化した２．１９Ｔ細胞の全ｐｏｌｙ
（Ａ）+ ＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーは、ＳＰ６プロ
モーターを含むプラスミドを用いたＮｏｍａ，Ｙ．らの
方法〔Ｎａｔｕｒｅ，３１９，６４０〜６４９，１９８
６〕に準じて調製し、約５×１０4 個のｃＤＮＡクロー
ン（ｐＳＰ６ＫｃＤＮＡ ライブラリー）を得た。 【００２２】次に、これらのクローンのプラスミドＤＮ
Ａの混合物を、Ｓａｃ ＩとＳａｌＩで各々消化してプ
ラスミドを直線化させた後、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ）でＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを合
成させた。このように調製したｍＲＮＡ溶液をアフリカ
ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞（ｏｏｃｙｔ
ｅ）に注射し、２０℃で３６時間培養後培養液中に分泌
された生成物を集め、実施例（１）で示した測定法によ
りＴＲＦ活性およびＢＣＧＦII活性を測定した。その結
果、Ｓａｌ Ｉで消化したＤＮＡ断片から調製したｍＲ
ＮＡには両活性が観察されたが、Ｓａｃ Ｉで消化した
ＤＮＡ断片からのｍＲＮＡにはいずれの活性も認められ
なかった。 【００２３】次に、上記２．１９ Ｔ細胞ラインのｍＲ
ＮＡから調製されたｐＳＰ６ＫｃＤＮＡライブラリーを
１８のプールに分け、（１プール約３，０００クロー
ン）、各々について上記の方法に従いＴＲＦ活性および
ＢＣＧＦII活性を測定した。その結果、１つのプール
（Ｎｏ．１７）のみが両活性を示した。そこで、このプ
ールをさらにサブグループに分け、同様な方法でＴＲＦ
およびＢＣＧＦII活性を測定し、６０個のクローンから
なるポジティブな活性を持つ一つのグループを得た。続
いて、これらのクローンのプラスミドＤＮＡに挿入され
たＤＮＡ断片（ｃＤＮＡ）が、１Ｋｂ以上でその塩基配
列中Ｓａｃ Ｉ切断部位がありＳａｌ Ｉ切断部位がな
いことを確かめ、上記６０クローンから７クローン（ク
ローンＮｏ．１６，１８，２３，２７，４２，５１およ
び５３）を得た。これら７クローンのＴＲＦ活性（Ｉｇ
Ｍプラーク形成細胞数）およびＢＣＧＦII活性（ 3Ｈチ
ミジン取込み量）については表１に示した。これらの７
クローンの内、Ｎｏ．２３のクローンが最も強い活性を
示したのでこのクローンのプラスミドをｐＳＰ６Ｋ−ｍ
ＴＲＦ２３（図３参照）と名付け以後の解析を行った。
尚、このプラスミドによって形質転換された大腸菌ＨＢ
１０１／ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３は、Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＢＭ ２８５と命名し、微工研
にＦＥＲＭ Ｐ−８８２８の受託番号を得て寄託されて
いる。 【００２４】 【表１】 表 １ 細胞培養上清又はmRNA注入卵母細胞培養上清のTRF およびBCGFII活性 -------------------------------------------------------------- 細胞培養上清又は サンプル IgM プラーク 3H-チミジン 卵母細胞に注入さ 添加量＊ 形成細胞 取込み れるmRNA鋳型 (％） ／培養 (cpm/培養) -------------------------------------------------------------- 1)細胞培養上清： B51K12 ハイブリドーマ 25 1834 7069 10 903 4222 2.19 Ｔ細胞ライン 1.0 3134 13726 0.25 1716 6847 コントロール 0 211 1289 2)mRNA鋳型： Sac I消化ライブラリー 5 500 8396 Sal I消化ライブラリー 5 799 14342 リン酸バッファー 5 563 6732 cDNA クローン No.16 5 199 1728 〃 18 5 233 1969 〃 23 5 3132 17970 〃 27 5 366 2001 〃 42 5 215 1650 〃 51 5 201 1862 〃 53 5 180 1883 コントロール（蒸留水） 5 150 1654 pSP6K-mTRF23 1 3229 10824 〃 0.25 1662 6615 〃 0.06 772 3037 〃 0.015 232 1625 〃 0.008 213 1497 -------------------------------------------------------------- ＊ 活性測定用培地量に対するサンプル量の割合を示す。 【００２５】（３） ｃＤＮＡ塩基配列の解析とＴＲＦ
ポリペプチド ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３に挿入されたｃＤＮＡは、一
旦ｐＵＣ１８プラスミドのＢａｍＨＩサイトにサブクロ
ーニングし、ジデオキシ法〔Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ．
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７４，５４６３〜５４６９，１９７７〕およびユニ
ディレクショナル ディリーション法〔ｕｎｉｄｉｒｅ
ｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ 法、Ｙａｎｉｓｃ
ｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３
３，１０３〜１１９，１９８５〕とを組合わせ、の塩基
配列を決定した。塩基配列決定のストラテジーを図４に
示した。その結果、図１に示すようにｐｏｌｙＡテール
領域を除く１５３３の塩基対からなる配列を得た。 【００２６】この塩基配列を詳細に解析した結果、１３
３個のアミノ酸残基（図１中、４４番目から４４２番目
までの塩基配列）と６２個のアミノ酸残基（図１中、５
４４番目から７２９番目の塩基配列）からなる２つのオ
ープンリーディングフレームが見出されたが、（ｉ）Ｔ
ＲＦポリペプチド（糖蛋白質）は、２．１９Ｔ細胞ライ
ンおよび当該ｍＲＮＡが注射された卵母細胞から分泌産
生され、その単量体（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動による解析）は、約１８，０００の分子量を有す
ること、（ii）６２個のアミノ酸残基からなるオープン
リーディングフレーム中に存在するＡｃｃ Ｉ切断部位
（図１中６２４〜６２９の塩基配列）を当該酵素で切断
して直線化したＤＮＡからのｍＲＮＡが卵母細胞におい
てＴＲＦおよびＢＣＧＦ産生能があること（iii)６２個
のアミノ酸残基からなるポリペプチドの分子量（約６，
５００）は、ＴＲＦ単量体の推定分子量約１８，０００
に比べ、たとえ糖鎖が付加されたとしても（当該配列中
１個のＮ−グリコシル化のシグナル配列あり）、小さ過
ぎることなどから、２．１９Ｔ細胞ラインでまず産生さ
れるＴＲＦまたはＢＣＧＦII活性を有するポリペプチド
（ＴＲＦポリペプチドと略す）は、図１に示す１３３個
のアミノ酸配列からなると判断された。但し、このポリ
ペプチドのＮ末端にあるＭｅｔ（メチオニン）は、翻訳
後修飾過程（ｐｏｓｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ
ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）により、
フォルミル化されたりアセチル化されたり或いはＭｅｔ
残基が取り除かれたりすることが、これまで報告されて
いる生体内ポリペプチドの修飾過程から考えられる。 【００２７】図１に示す１３３個のアミノ酸残基からな
るポリペプチドのＮ末端には、２０個前後のアミノ酸残
基からなる疎水性の強いぺプチドが存在している。この
配列（リーダー配列）は、分泌蛋白質がもつ特有のもの
であり、蛋白質が細胞内から分泌される際、この配列が
除去されることが知られている。一般にアラニン（Ａｌ
ａ）やグリシン（Ｇｌｙ）などのアミノ酸残基のＣ末端
が切断されることが多いこと（Ｗａｔｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．
Ｅ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，５１４５〜
５１６４，１９８４）、またリーダー配列は通常２０個
前後のぺプチドであることなどから、本発明におけるＴ
ＲＦまたはＢＣＧＦII活性を有するポリペプチドは、図
１中に示すアミノ酸配列中の１９番目、２１番目或いは
２２番目から１３３番目までのポリペプチドを含む分子
であると考えられる。これらのポリペプチドの分子量
（およそ１２，３００〜１２，７００）は、ＴＲＦの単
量体が分子量約１８，０００の糖蛋白であることとほぼ
一致する。 【００２８】また、上記のようにリーダー配列が除去さ
れて生じたポリペプチドのＮ末端のアミノ酸は、さらに
生体内でアセチル化されたり、またそれがグルタミン酸
（Ｇｌｕ）の場合はピロル化されたりすることがあるこ
とは、これまで生体内から見出されているぺプチドの構
造からみて当然考えられる。 【００２９】（４） ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３プラス
ミドのＴＲＦ活性 ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３プラスミドＤＮＡからＳＰ６
ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたｍＲＮＡが、注
入され、培養された卵母細胞の培養上清のＴＲＦ活性
（ＢＣＬ1 細胞のＩｇＭ分泌産生細胞への分化活性）と
ＢＣＧＦII活性（ＢＣＬ1 細胞への 3Ｈチミジンの取込
み量）は表１に示した。 【００３０】さらに、Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．ら〔Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１２５，２６４６〜２６５３，１９８
０〕の方法に従い、上記卵母細胞生産物（γＴＲＦと略
す）の抗ＤＮＰ−ＩｇＧ抗体産生応答反応の促進効果に
ついて調べた。まずＢＡＬＢ／ｃマウスをＤＮＰ−キイ
ホールリンペットヘモシアニン〔Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉ
ｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ〕で感作し、
６〜８週間後、脾臓細胞を集め抗Ｔｈｙ１．２抗体と補
体処理によりＢ細胞をエンリッチし、γＴＲＦの抗ＤＮ
Ｐ−ＩｇＧプラーク形成細胞促進能を調べた。その結
果、γＴＲＦは抗原（ＤＮＰ−オボアルブミン：ＤＮＰ
−ＯＡ）存在下、ＤＮＰ感作されたＢ細胞を刺激し、明
らかに抗ＤＮＰ−ＩｇＧ産生細胞へ分化させる活性を示
した（表２）。さらにデータは示さないが、γＴＲＦ
は、ｉｎ ｖｉｖｏで活性化されたＢ細胞ブラストのＩ
ｇＭ合成誘導活性をも示した。尚、ＩＬ−１，ＩＬ−
２，ＩＬ−３およびＢＳＦ−１の活性はいずれも示さな
かった。これらの結果から、本発明においてｐＳＰ６Ｋ
−ｍＴＲＦ２３にクローン化されたｃＤＮＡ（図１参
照）がＴＲＦポリペプチドの産生を支配していることが
確認できた。 【００３１】尚、ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３クローンは
ＢＣＬ1 細胞のＩｇＭプラーク形成細胞促進活性とＢＣ
Ｌ1 増殖促進活性とを常に有していること（表１参照）
から、ＴＲＦとＢＣＧＦIIは同じ分子であることが示唆
された。 【００３２】 【表２】 表 ２ γTRF による抗 DNP-IgGプラーク形成の促進効果 ----------------------------------------------------------- 抗Thy1.2抗体＋補体 γTRF 量 抗 DNPIgG プラーク 抗 原 ＊ 前 処 理 (％） 形成細胞／培養 ----------------------------------------------------------- − な し 0 127 − DNP-KLH 0 1792 ＋ な し 0 127 ＋ DNP-KLH 0 199 ＋ DNP-OA 0 92 ＋ DNP-OA 1 695 ＋ DNP-OA 0.5 884 ＋ DNP-OA 0.25 555 ＋ DNP-OA 0.125 382 ----------------------------------------------------------- ＊ 培養量に対するγTRF の添加割合を示す。
製造方法に関する。さらに詳しくは、マウスのＴ細胞株
が産生するＢ細胞分化因子をコードするＤＮＡ配列を用
いてＢ細胞分化因子を製造する方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】Ｂ細胞分化因子（ＴＲＦ：Ｔ ｃｅｌｌ
Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒとも呼ばれる）
は、血液中のＴ細胞系列から産生されＢ細胞に直接作用
し、これを抗体産生細胞に分化・誘導するポリペプチド
からなる因子である。 【０００３】抗体は、生体に侵入する細菌、ウイルスあ
るいは癌細胞などの生体異物と反応し、これらを不活性
化したり排除したりする機能をもっている。Ｂ細胞分化
因子（以下ＴＲＦと略す）は、特定抗原（生体異物）に
特異的なＢ細胞クローン即ち特定抗原に感作されたＢ細
胞クローンを抗体産生細胞に誘導して、該抗原に対する
抗体を産生させることから、ＴＲＦは、種々の感染症お
よび癌の治療の面から有用な物質である。即ち、ＴＲＦ
は、この因子の生体内での過少によってひきおこされる
と考えられる自己免疫疾患や免疫不全症等の診断、治療
のみならず種々の感染症や癌の治療に利用できることが
期待される。 【０００４】ＴＲＦに関してはこれまでいくつかの研究
がなされている。例えば、ＴＲＦ産生細胞として知られ
ているＴ細胞ハイブリドーマＢ１５１Ｋ１２株の培養液
からＴＲＦ活性を有する物質の精製が試みられ、温度お
よび酸性ｐＨで比較安定な、単量体の分子量が１８，０
００乃至１９，０００の糖蛋白質であろうと推定されて
いる〔Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１３４，３８２，１９８５，Ｈａｒａｄａ，
Ｎ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４，３９
４４，１９８５および特開昭６０−２３７０２２な
ど〕。しかしながら、培養液中のＴＲＦ含量は少なく、
多段の精製過程（硫安沈澱、陰イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過、ＨＰＬＣ、スラブ電気泳動、逆相Ｈ
ＰＬＣ、レクチンアフィニティーカラムクロマトグラフ
ィーなど）を経て分取できる物質は極微量であるため、
その構造（アミノ酸配列）も物理化学的性質も明確にさ
れるには至っていない。また、ＴＲＦの生産に関与する
遺伝子（ＤＮＡ配列）も知られていない。なお、上述先
行技術の精製ＴＲＦは、ＢＣＧＦ（Ｂ ｃｅｌｌ Ｇｒ
ｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：Ｂ細胞増殖因子）IIの活性も
有することが示されている。また、複数のＴＲＦの存在
も示唆されている。 【０００５】このように、従来Ｂ細胞を分化・誘導する
因子（ＴＲＦ）の構造は明らかでなく、それを大量に生
産して実用に供することは不可能であった。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】即ち、本発明は、ＴＲ
Ｆ高生産細胞からＴＲＦｍＲＮＡを単離し、ＴＲＦ生産
を支配するＴＲＦ遺伝子（即ちＤＮＡ配列）を明らかに
すると共に、ＴＲＦ分子の構造（アミノ酸配列）を明ら
かにすることにより、組換えＤＮＡ技術でＴＲＦの大量
生産および医薬等への応用の可能性を提供しようとする
ものである。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、既にＳｉ
ｄｅｒａｓ，Ｐ．らによって樹立されているＩｇＧ1誘
導因子ＢＣＤＦγ産生細胞であるＴ細胞ライン２．１９
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５，５８６〜５９
３，１９８５）が、従来用いられているＴ細胞ハイブリ
ドーマＢ１５１Ｋ１２株よりもＴＲＦを約１００倍量生
産することを見出した。そこでこのＴ細胞ライン２．１
９を用いて上記の問題点を解決すべく鋭意研究の結果本
発明を完成するに至った。 【０００８】本発明のＤＮＡを調製するには、まずＴ細
胞ライン２．１９からｍＲＮＡ画分を常法により調製
し、ｐｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡを用いて既に開発されてい
る方法（Ｎｏｍａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３
１９，６４０〜６４６，１９８６）に従いｃＤＮＡライ
ブラリーを作製する。このライブラリーから得られる各
ｃＤＮＡクローンのプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｓａｌ
Ｉで直線化した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏの系でＳＰ６
ＲＮＡポリメラーゼで転写させてｍＲＮＡを得る。この
ようにして作製されたｍＲＮＡをアフリカツメガエル
（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞（ｏｏｃｙｔｅ）に注射
して培養し、培養上清に分泌されてくるｍＲＮＡからの
翻訳産物（蛋白質）のＴＲＦ活性およびＢＣＧＦII活性
の有無を測定する〔Ｇｒｏｎｏｗｉｃｚ，Ｅ．ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５８８〜５９
０，１９７６およびＴａｋａｔａｕ，Ｋ．ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５，２６４６〜２６５
３，１９８０〕。尚、ここで述べるＴＲＦ活性およびＢ
ＣＧＦII活性は、各々下記の活性を有することによって
定義される。 【０００９】Ａ） ＴＲＦ活性： １） マウス慢性Ｂ白血病細胞（ＢＣＬ1 ）をＩｇＭ抗
体産生細胞に分化させる活性、 ２） 抗原（ＤＮＰ−ＫＬＨ）感作させたマウス脾臓内
Ｂ細胞を抗原（ＤＮＰ−オボアルブミン）で刺激し、特
異的抗体（抗ＤＮＰ−ＩｇＧ）産生細胞に分化させる活
性、または ３） ｉｎ ｖｉｖｏで活性化したＢ細胞ブラストのＩ
ｇＭ合成誘導活性。 【００１０】Ｂ） ＢＣＧＦII活性： １） ＢＣＬ1 細胞の分裂促進、または ２） デキストラン硫酸刺激休止Ｂ細胞の分裂促進。 【００１１】上記の活性測定法の内、特にＡ）−１）お
よびＢ）−１）の活性を指標にして、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
で転写されるｍＲＮＡのＴＲＦ活性およびＢＣＧＦII活
性の測定を行ない、ＴＲＦのｃＤＮＡを有するクローン
を前記ｃＤＮＡライブラリーから選択するのが便利であ
る。次に選択されたクローン（ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２
３）のプラスミドＤＮＡに挿入されているｃＤＮＡ断片
の塩基配列は公知の方法（後記実施例に記載するジデオ
キシ法およびユニディレクショナルディリーション法）
により決定し（図１参照）、意味のあるオープンリーデ
ィングフレーム（ポリペプチドをコードする塩基配列）
を探しＴＲＦのアミノ酸配列を定めることができる。こ
の際、選択されたクローンｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３の
挿入ＤＮＡ領域には、１３３個と６２個のアミノ酸から
なるポリペプチドをコードする二種のオープンリーディ
ングフレームが見出されるが、後者（図１中５４４番目
から７２９番目の塩基配列に相当）のポリペプチドは、
分子量が約６，５００であって、この値は２．１９細
胞から産生されるＴＲＦの単量体分子量（約１８，００
０）に比べたとえ糖鎖が付与されているとしても小さす
ぎること、およびこのオープンリーディングフレーム
中に存在するＡＣＣ Ｉ切断部位を当該制限酵素で切断
して作製されたクローンから調製されるｍＲＮＡが、ア
フリカツメガエルの卵母細胞でＴＲＦ産生能を失わない
ことから、ＴＲＦポリペプチドではない。従って、２．
１９細胞がその生体内でまず産生するＴＲＦは、１３３
個のアミノ酸からなるポリペプチドであると決定される
（図１参照）。尚、このポリペプチドのＮ末端にあるＭ
ｅｔ（メチオニン）は、翻訳後修飾過程（ｐｏｓｔ ｔ
ｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｐｒｏｃｅｓｓ）で、フォルミル化やアセチル化され
ることがあり、またＭｅｔが取り除かれたりすることも
ある。 【００１２】このように決定されるポリペプチドのＮ末
端領域には、分泌蛋白質に特有のリーダー配列（図１
中、Ｎ末端から約２０番目までのアミノ酸配列に相当す
る疎水性の強いペプチド領域）が存在している。このこ
とは２．１９細胞培養上清にＴＲＦが分泌される事実と
合致する。通常、リーダー配列は、生体内でプロセシン
グ（シグナルぺプチダーゼによる切断など）を受け、そ
の領域が取り除かれた成熟ポリペプチドになることが知
られている。これまで知られているリーダー配列の切断
部位〔一般にアラニン（Ａｌａ）やグリシン（Ｇｌｙ）
などのアミノ酸のＣ末端側；Ｗａｔｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．
Ｅ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，５１４５〜
５１６４，１９８４参照〕から、本発明で用いた２．１
９細胞が分泌するＴＲＦ活性（或いはＢＣＧＦII活性）
をもつ約１８，０００分子量の蛋白質（糖蛋白質）は、
図１に示すアミノ酸配列中の各々１９番目、２１番目或
いは２２番目から１３３番目までのポリペプチドを含む
分子であると考えられる。このことは、ＴＲＦが糖蛋白
質であることから考え、これらのポリペプチドの分子量
（およそ１２，３００〜１２，７００）の添架からも妥
当である。即ち、このポリペプチドから計算される分子
量（約１２，３００）は、オープンリーディングフレー
ム（図１中４４番目から４４２番目までの塩基配列）に
対応するアミノ酸配列中に存在する３ケ所のＮ−グリコ
シル化可能部位（図１中の下線を引いたアミノ酸配列）
から考え矛盾はない。尚、上記のようなプロセシングを
受けて生じたポリペプチドのＮ末端のアミノ酸残基は、
さらにアセチル化されたり、またそれがＧｌｕ（グルタ
ミン酸）の場合はピロル化されたりすることがある。 【００１３】さらに、生体内で産生されるポリペプチド
は、そのＣ末端が生体内でのプロセシングの過程で欠失
されることがあることが知られており、図１で示したポ
リペプチドのＣ末端のアミノ酸あるいはぺプチドの一部
が欠失していることもあると考えられる。 【００１４】これらのポリペプチドは、図１に示すＤＮ
Ａ、特に翻訳終止コドン（ＴＧＡ）を含む１〜１３３ま
でのアミノ酸配列に対応する塩基配列、あるいはこれと
実質的に同等な塩基配列を有するＤＮＡを適当な発現ベ
クターに挿入し、これを適当な微生物や動物宿主細胞に
導入（形質転換）して、その形質転換体を培養すること
により、これるでの細胞培養に比べ効率的且つ大量に生
産することができる。 【００１５】以下、実施例でもって本発明をさらに詳し
く説明する。 【００１６】 【実施例】 （１） ＴＲＦｍＲＮＡの調製 ＴＲＦ産生細胞としては、Ｔ細胞ライン２．１９を用い
た。本細胞ラインはＳｉｄｅｒａｓ，Ｐ．らによって既
に樹立されているものである（Ｓｉｄｅｒａｓ，Ｐ．ｅ
ｔ．ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５，５８
６〜５９３，１９８５）。 【００１７】まず、ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）で活
性化した２．１９Ｔ細胞からＮｏｍａ，Ｙ．らの方法
（Ｎａｔｕｒｅ，３１９，６４０〜６４６，１９８６）
に従いｐｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ画分）を抽出
し，５〜２２％の濃度勾配を用いた蔗糖密度勾配遠心法
（３６，０００ｒｐｍ、１５時間）によりｐｏｌｙ
（Ａ）+ ＲＮＡ抽出液を１６の画分に分画分取した。次
に、各分画の適当量をアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐ
ｕｓ）の卵母細胞（ｏｏｃｙｔｅ）に注射し、２０℃で
３６時間培養後その培養液についてＴＲＦ活性およびＢ
ＣＧＦII活性を測定した。 【００１８】ＴＲＦ活性の測定は、卵母細胞培養上清サ
ンプルを、１．５×１０5 個のＢＣＬ1 細胞を含む０．
２ｍｌのＲＩＴＣ培地（血清フリーで５ｍｇ／ｍｌの牛
血清アルブミン、５０μＭの２−メルカプトエタノー
ル、抗生物質を含む）で培養した培地に加え、２日後、
Ｇｒｏｎｏｗｉｃｚ，Ｅ．らのプロティンＡプラーク測
定法〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５８８〜５９
０，１９７６〕により、ＩｇＭ分泌産生細胞数を測定す
ることにより行った。一方、ＢＣＧＦII活性の測定は、
上記ＢＣＬ1 細胞の増殖度を２日培養の最後の６時間に
3Ｈチミジンを加えて上記ＢＣＬ1 細胞に取り込まれる
3Ｈチミジン量で測定することにより行った。 【００１９】その結果、図２に示す如く、ＢＣＧＦII活
性（図中の黒棒）は、９Ｓおよび１６ＳのｍＲＮＡ画分
にみられ、ＴＲＦ活性（図中の白棒）は、１６ＳのｍＲ
ＮＡ画分のみにみられた。なお、同図中、Ｐは、ＴＲＦ
産生株の１つであるＴ細胞ハイブリドーマＢ１５１Ｋ１
２株の培養上清を５０％の濃度で上記ＢＣＬ1 培養培地
に加えたポジティブコントロールを示し、Ｎは、ｍＲＮ
Ａ画分の代りにリン酸バッファーを卵母細胞に注入して
培養したネガティブコントロールを各々示す。 【００２０】９Ｓ ｍＲＮＡの分子サイズはインターロ
イキン（ＩＬ）−４のｍＲＮＡサイズに相当すること
〔Ｎｏｍａ．Ｙ．ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３１９，
６４０〜６４６，１９８６〕、および９Ｓ ｍＲＮＡ画
分にはＢＣＬ1 増殖促進活性はあるが、ＢＣＬ1 細胞の
ＩｇＭ分泌産生細胞への分化活性がみられないことか
ら、本発明者らは、２．１９Ｔ細胞の１６Ｓ ｍＲＮＡ
画分にＴＲＦ ｍＲＮＡが存在すると判断し、次にｃＤ
ＮＡライブラリーの作製を試みた。 【００２１】（２） ｃＤＮＡライブラリー調製とＴＲ
ＦｃＤＮＡクローンの選択 ＣｏｎＡで活性化した２．１９Ｔ細胞の全ｐｏｌｙ
（Ａ）+ ＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーは、ＳＰ６プロ
モーターを含むプラスミドを用いたＮｏｍａ，Ｙ．らの
方法〔Ｎａｔｕｒｅ，３１９，６４０〜６４９，１９８
６〕に準じて調製し、約５×１０4 個のｃＤＮＡクロー
ン（ｐＳＰ６ＫｃＤＮＡ ライブラリー）を得た。 【００２２】次に、これらのクローンのプラスミドＤＮ
Ａの混合物を、Ｓａｃ ＩとＳａｌＩで各々消化してプ
ラスミドを直線化させた後、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ）でＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを合
成させた。このように調製したｍＲＮＡ溶液をアフリカ
ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞（ｏｏｃｙｔ
ｅ）に注射し、２０℃で３６時間培養後培養液中に分泌
された生成物を集め、実施例（１）で示した測定法によ
りＴＲＦ活性およびＢＣＧＦII活性を測定した。その結
果、Ｓａｌ Ｉで消化したＤＮＡ断片から調製したｍＲ
ＮＡには両活性が観察されたが、Ｓａｃ Ｉで消化した
ＤＮＡ断片からのｍＲＮＡにはいずれの活性も認められ
なかった。 【００２３】次に、上記２．１９ Ｔ細胞ラインのｍＲ
ＮＡから調製されたｐＳＰ６ＫｃＤＮＡライブラリーを
１８のプールに分け、（１プール約３，０００クロー
ン）、各々について上記の方法に従いＴＲＦ活性および
ＢＣＧＦII活性を測定した。その結果、１つのプール
（Ｎｏ．１７）のみが両活性を示した。そこで、このプ
ールをさらにサブグループに分け、同様な方法でＴＲＦ
およびＢＣＧＦII活性を測定し、６０個のクローンから
なるポジティブな活性を持つ一つのグループを得た。続
いて、これらのクローンのプラスミドＤＮＡに挿入され
たＤＮＡ断片（ｃＤＮＡ）が、１Ｋｂ以上でその塩基配
列中Ｓａｃ Ｉ切断部位がありＳａｌ Ｉ切断部位がな
いことを確かめ、上記６０クローンから７クローン（ク
ローンＮｏ．１６，１８，２３，２７，４２，５１およ
び５３）を得た。これら７クローンのＴＲＦ活性（Ｉｇ
Ｍプラーク形成細胞数）およびＢＣＧＦII活性（ 3Ｈチ
ミジン取込み量）については表１に示した。これらの７
クローンの内、Ｎｏ．２３のクローンが最も強い活性を
示したのでこのクローンのプラスミドをｐＳＰ６Ｋ−ｍ
ＴＲＦ２３（図３参照）と名付け以後の解析を行った。
尚、このプラスミドによって形質転換された大腸菌ＨＢ
１０１／ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３は、Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＢＭ ２８５と命名し、微工研
にＦＥＲＭ Ｐ−８８２８の受託番号を得て寄託されて
いる。 【００２４】 【表１】 表 １ 細胞培養上清又はmRNA注入卵母細胞培養上清のTRF およびBCGFII活性 -------------------------------------------------------------- 細胞培養上清又は サンプル IgM プラーク 3H-チミジン 卵母細胞に注入さ 添加量＊ 形成細胞 取込み れるmRNA鋳型 (％） ／培養 (cpm/培養) -------------------------------------------------------------- 1)細胞培養上清： B51K12 ハイブリドーマ 25 1834 7069 10 903 4222 2.19 Ｔ細胞ライン 1.0 3134 13726 0.25 1716 6847 コントロール 0 211 1289 2)mRNA鋳型： Sac I消化ライブラリー 5 500 8396 Sal I消化ライブラリー 5 799 14342 リン酸バッファー 5 563 6732 cDNA クローン No.16 5 199 1728 〃 18 5 233 1969 〃 23 5 3132 17970 〃 27 5 366 2001 〃 42 5 215 1650 〃 51 5 201 1862 〃 53 5 180 1883 コントロール（蒸留水） 5 150 1654 pSP6K-mTRF23 1 3229 10824 〃 0.25 1662 6615 〃 0.06 772 3037 〃 0.015 232 1625 〃 0.008 213 1497 -------------------------------------------------------------- ＊ 活性測定用培地量に対するサンプル量の割合を示す。 【００２５】（３） ｃＤＮＡ塩基配列の解析とＴＲＦ
ポリペプチド ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３に挿入されたｃＤＮＡは、一
旦ｐＵＣ１８プラスミドのＢａｍＨＩサイトにサブクロ
ーニングし、ジデオキシ法〔Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ．
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７４，５４６３〜５４６９，１９７７〕およびユニ
ディレクショナル ディリーション法〔ｕｎｉｄｉｒｅ
ｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ 法、Ｙａｎｉｓｃ
ｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３
３，１０３〜１１９，１９８５〕とを組合わせ、の塩基
配列を決定した。塩基配列決定のストラテジーを図４に
示した。その結果、図１に示すようにｐｏｌｙＡテール
領域を除く１５３３の塩基対からなる配列を得た。 【００２６】この塩基配列を詳細に解析した結果、１３
３個のアミノ酸残基（図１中、４４番目から４４２番目
までの塩基配列）と６２個のアミノ酸残基（図１中、５
４４番目から７２９番目の塩基配列）からなる２つのオ
ープンリーディングフレームが見出されたが、（ｉ）Ｔ
ＲＦポリペプチド（糖蛋白質）は、２．１９Ｔ細胞ライ
ンおよび当該ｍＲＮＡが注射された卵母細胞から分泌産
生され、その単量体（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動による解析）は、約１８，０００の分子量を有す
ること、（ii）６２個のアミノ酸残基からなるオープン
リーディングフレーム中に存在するＡｃｃ Ｉ切断部位
（図１中６２４〜６２９の塩基配列）を当該酵素で切断
して直線化したＤＮＡからのｍＲＮＡが卵母細胞におい
てＴＲＦおよびＢＣＧＦ産生能があること（iii)６２個
のアミノ酸残基からなるポリペプチドの分子量（約６，
５００）は、ＴＲＦ単量体の推定分子量約１８，０００
に比べ、たとえ糖鎖が付加されたとしても（当該配列中
１個のＮ−グリコシル化のシグナル配列あり）、小さ過
ぎることなどから、２．１９Ｔ細胞ラインでまず産生さ
れるＴＲＦまたはＢＣＧＦII活性を有するポリペプチド
（ＴＲＦポリペプチドと略す）は、図１に示す１３３個
のアミノ酸配列からなると判断された。但し、このポリ
ペプチドのＮ末端にあるＭｅｔ（メチオニン）は、翻訳
後修飾過程（ｐｏｓｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ
ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）により、
フォルミル化されたりアセチル化されたり或いはＭｅｔ
残基が取り除かれたりすることが、これまで報告されて
いる生体内ポリペプチドの修飾過程から考えられる。 【００２７】図１に示す１３３個のアミノ酸残基からな
るポリペプチドのＮ末端には、２０個前後のアミノ酸残
基からなる疎水性の強いぺプチドが存在している。この
配列（リーダー配列）は、分泌蛋白質がもつ特有のもの
であり、蛋白質が細胞内から分泌される際、この配列が
除去されることが知られている。一般にアラニン（Ａｌ
ａ）やグリシン（Ｇｌｙ）などのアミノ酸残基のＣ末端
が切断されることが多いこと（Ｗａｔｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．
Ｅ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，５１４５〜
５１６４，１９８４）、またリーダー配列は通常２０個
前後のぺプチドであることなどから、本発明におけるＴ
ＲＦまたはＢＣＧＦII活性を有するポリペプチドは、図
１中に示すアミノ酸配列中の１９番目、２１番目或いは
２２番目から１３３番目までのポリペプチドを含む分子
であると考えられる。これらのポリペプチドの分子量
（およそ１２，３００〜１２，７００）は、ＴＲＦの単
量体が分子量約１８，０００の糖蛋白であることとほぼ
一致する。 【００２８】また、上記のようにリーダー配列が除去さ
れて生じたポリペプチドのＮ末端のアミノ酸は、さらに
生体内でアセチル化されたり、またそれがグルタミン酸
（Ｇｌｕ）の場合はピロル化されたりすることがあるこ
とは、これまで生体内から見出されているぺプチドの構
造からみて当然考えられる。 【００２９】（４） ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３プラス
ミドのＴＲＦ活性 ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３プラスミドＤＮＡからＳＰ６
ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたｍＲＮＡが、注
入され、培養された卵母細胞の培養上清のＴＲＦ活性
（ＢＣＬ1 細胞のＩｇＭ分泌産生細胞への分化活性）と
ＢＣＧＦII活性（ＢＣＬ1 細胞への 3Ｈチミジンの取込
み量）は表１に示した。 【００３０】さらに、Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．ら〔Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１２５，２６４６〜２６５３，１９８
０〕の方法に従い、上記卵母細胞生産物（γＴＲＦと略
す）の抗ＤＮＰ−ＩｇＧ抗体産生応答反応の促進効果に
ついて調べた。まずＢＡＬＢ／ｃマウスをＤＮＰ−キイ
ホールリンペットヘモシアニン〔Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉ
ｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ〕で感作し、
６〜８週間後、脾臓細胞を集め抗Ｔｈｙ１．２抗体と補
体処理によりＢ細胞をエンリッチし、γＴＲＦの抗ＤＮ
Ｐ−ＩｇＧプラーク形成細胞促進能を調べた。その結
果、γＴＲＦは抗原（ＤＮＰ−オボアルブミン：ＤＮＰ
−ＯＡ）存在下、ＤＮＰ感作されたＢ細胞を刺激し、明
らかに抗ＤＮＰ−ＩｇＧ産生細胞へ分化させる活性を示
した（表２）。さらにデータは示さないが、γＴＲＦ
は、ｉｎ ｖｉｖｏで活性化されたＢ細胞ブラストのＩ
ｇＭ合成誘導活性をも示した。尚、ＩＬ−１，ＩＬ−
２，ＩＬ−３およびＢＳＦ−１の活性はいずれも示さな
かった。これらの結果から、本発明においてｐＳＰ６Ｋ
−ｍＴＲＦ２３にクローン化されたｃＤＮＡ（図１参
照）がＴＲＦポリペプチドの産生を支配していることが
確認できた。 【００３１】尚、ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３クローンは
ＢＣＬ1 細胞のＩｇＭプラーク形成細胞促進活性とＢＣ
Ｌ1 増殖促進活性とを常に有していること（表１参照）
から、ＴＲＦとＢＣＧＦIIは同じ分子であることが示唆
された。 【００３２】 【表２】 表 ２ γTRF による抗 DNP-IgGプラーク形成の促進効果 ----------------------------------------------------------- 抗Thy1.2抗体＋補体 γTRF 量 抗 DNPIgG プラーク 抗 原 ＊ 前 処 理 (％） 形成細胞／培養 ----------------------------------------------------------- − な し 0 127 − DNP-KLH 0 1792 ＋ な し 0 127 ＋ DNP-KLH 0 199 ＋ DNP-OA 0 92 ＋ DNP-OA 1 695 ＋ DNP-OA 0.5 884 ＋ DNP-OA 0.25 555 ＋ DNP-OA 0.125 382 ----------------------------------------------------------- ＊ 培養量に対するγTRF の添加割合を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３に挿入されたｃＤＮ
Ａの塩基配列とＴＲＦポリペプチド領域のアミノ酸配列
を示す図である。 【図２】ｍＲＮＡ画分のＴＲＦ活性（プラーク形成細
胞：ＰＦＣ）とＢＣＧＦII活性（3Ｈチミジンの取込
み）を示すグラフである。 【図３】（Ａ）は、ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３クローン
のプラスミドの概略図であり、（Ｂ）は（Ａ）のインサ
ートｃＤＮＡ周辺の概略図である。 【図４】ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３に挿入されたｃＤＮ
Ａの塩基配列決定のストラテジーを示す図である。
Ａの塩基配列とＴＲＦポリペプチド領域のアミノ酸配列
を示す図である。 【図２】ｍＲＮＡ画分のＴＲＦ活性（プラーク形成細
胞：ＰＦＣ）とＢＣＧＦII活性（3Ｈチミジンの取込
み）を示すグラフである。 【図３】（Ａ）は、ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３クローン
のプラスミドの概略図であり、（Ｂ）は（Ａ）のインサ
ートｃＤＮＡ周辺の概略図である。 【図４】ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３に挿入されたｃＤＮ
Ａの塩基配列決定のストラテジーを示す図である。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ０７Ｋ 14/52 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳ
Ｃ１２Ｎ 1/21 ＡＤＵ
Ｃ１２Ｐ 21/02
(72)発明者 エバ・セベリンソン
スウェーデン国エス−11648，ストック
ホルム，ベントエキルムスガータン 13
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 ZNA A
C12N 1/21
A61K 37/02 ABB
A61K 37/02 ADS
A61K 37/02 ADU
C07K 14/52
C12P 21/02 K
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．次式Ｉ： 1 ATG AGA AGG ATG CTT CTG CAC TTG AGT GTT 31 CTG ACT CTC AGC TGT GTC TGG GCC ACT GCC 61 ATG GAG ATT CCC ATG AGC ACA GTG GTG AAA 91 GAG ACC TTG ACA CAG CTG TCC GCT CAC CGA 121 GCT CTG TTG ACA AGC AAT GAG ACG ATG AGG 151 CTT CCT GTC CCT ACT CAT AAA AAT CAC CAG 181 CTA TGC ATT GGA GAA ATC TTT CAG GGG CTA 211 GAC ATA CTG AAG AAT CAA ACT GTC CGT GGG 241 GGT ACT GTG GAA ATG CTA TTC CAA AAC CTG 271 TCA TTA ATA AAG AAA TAC ATT GAC CGC CAA 301 AAA GAG AAG TGT GGC GAG GAG AGA CGG AGG 331 ACG AGG CAG TTC CTG GAT TAC CTG CAA GAG 361 TTC CTT GGT GTG ATG AGT ACA GAG TGG GCA 391 ATG GAA GGC STP (I) 〔式中、STPは翻訳終止コドンを表わす。〕で表される
塩基配列またはその５’末端が５４番のＣまで、６０番
のＣまで若しくは６３番のＧまで欠失した塩基配列を有
するＢ細胞分化活性因子をコードするＤＮＡを含むプラ
スミドが導入された形質転換細胞を培養し、ポリペプチ
ドをポリペプチド成分として有するＢ細胞分化活性因子
を製造する方法。 ２．製造される因子がＢＣＧＦII活性も有する請求項１
の方法。 ３．プラスミドがpSP6K-mTRF23である請求項１の方法。 ４．次式II： 〔式中、ＸはＨ（水素原子）、fMet（フォルミルメチオ
ニン）、AcMet（アセチルメチオニン）またはMet（メチ
オニン）を表わす。〕で表わされるポリペプチド、また
はそのＮ末端から１８番のAlaまで、２０番のAlaまで、
または２１番のMetまでのアミノ酸残基が欠失したポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドが導入さ
れた形質転換細胞を培養し、Ｂ細胞分化活性を有する因
子を製造する方法。 ５．製造される因子がＢＣＧＦII活性も有する請求項４
の方法。 ６．ポリペプチド成分としてのポリペプチドが式II： 〔式中、ＸはＨ（水素原子）、fMet（フォルミルメチオ
ニン）、AcMet（アセチルメチオニン）またはMet（メチ
オニン）を表わす。〕で表わされるポリペプチド、また
はそのＮ末端から１８番のAlaまで、２０番のAlaまで、
または２１番のMetまでのアミノ酸残基が欠失したポリ
ペプチドであるか、または、 式III：Y -Glu-Ile-Pro-Met-Ser-Thr-Val-Val-Lys- Glu-Thr-Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-His-Arg- Ala-Leu-Leu-Thr-Ser-Asn-Glu-Thr-Met-Arg- Leu-Pro-Val-Pro-Thr-His-Lys-Asn-His-Gln- Leu-Cys-Ile-Gly-Glu-Ile-Phe-Gln-Gly-Leu- Asp-Ile-Leu-Lys-Asn-Gln-Thr-Val-Arg-Gly- Gly-Thr-Val-Glu-Met-Leu-Phe-Gln-Asn-Leu- Ser-Leu-Ile-Lys-Lys-Tyr-Ile-Asp-Arg-Gln- Lys-Glu-Lys-Cys-Gly-Glu-Glu-Arg-Arg-Arg- Thr-Arg-Gln-Phe-Leu-Asp-Tyr-Leu-Gln-Glu- Phe-Leu-Gly-Val-Met-Ser-Thr-Glu-Trp-Ala- Met-Glu-Gly (III) 〔式中、Ｙは、Ｈ（水素原子）、MetまたはThr-Ala-Met
を表わすが、但し、Ｎ末端のアミノ酸はアセチル化さ
れていても良く、或いはＹがＨの場合のＮ末端のGluは
ピロル化されていても良い。〕で表されるポリペプチド
である請求項４の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9055274A JP3068026B2 (ja) | 1997-03-10 | 1997-03-10 | Ｂ細胞分化因子の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9055274A JP3068026B2 (ja) | 1997-03-10 | 1997-03-10 | Ｂ細胞分化因子の製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7195345A Division JP3022950B2 (ja) | 1995-07-31 | 1995-07-31 | Ｂ細胞分化因子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10262673A JPH10262673A (ja) | 1998-10-06 |
| JP3068026B2 true JP3068026B2 (ja) | 2000-07-24 |
Family
ID=12994029
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9055274A Expired - Fee Related JP3068026B2 (ja) | 1997-03-10 | 1997-03-10 | Ｂ細胞分化因子の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3068026B2 (ja) |
-
1997
- 1997-03-10 JP JP9055274A patent/JP3068026B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH10262673A (ja) | 1998-10-06 |
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |