JP2642103B2

JP2642103B2 - ヒトｂ組胞分化因子

Info

Publication number: JP2642103B2
Application number: JP62236842A
Authority: JP
Inventors: 佑本庶; 聖志高津; エバ・セベリンソン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-09-20
Filing date: 1987-09-21
Publication date: 1997-08-20
Anticipated expiration: 2012-08-20
Also published as: AU604055B2; EP0261625B1; CA1340689C; ATE60359T1; US5324640A; ES2039390T3; JPS63185387A; EP0261625A2; AU7880987A; US5530098A; EP0261625A3; DE3767629D1

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の移用分野）本発明は、ヒトＢ細胞分化活性因子およびその製造法
に関する。

（従来技術）Ｂ細胞分化因子（Ｂ cell differentiation Facto
r:BCDF:特にマウスではＴ cell Replacing Factor
（TRF）ともよばれ、また最近はIL−５とも呼ばれてい
る）は、Ｔ細胞系列から産生され、Ｂ細胞に直接作用
し、これを抗体産生細胞に分化・誘導するポリペプチド
からなる因子である。

抗体は、生体に侵入する細菌、ウイルスあるいは癌細
胞などの生体異物と反応し、これらを不活性化したり排
除したりする機能をもっている。Ｂ細胞分化因子は、特
定抗原（生体異物）に特異的なＢ細胞クローン即ち特定
抗原に感作されたＢ細胞クローンを抗体産生細胞に誘導
して、該抗原に対する抗体を産生させることから、BCDF
は、種々の感染症および癌の治療の面から有用な物質で
ある。即ち、BCDFは、この因子の生体内での過少によっ
てひきおこされると考えられる自己免疫疾患や免疫不全
症等の診断、治療のみならず種々の感染症や癌の治療に
利用できることが期待される。

BCDFの活性には、種特異性があるといわれている。従
って本因子をヒトにおける上記のような疾患、感染症、
癌などの診断あるいは治療に用いるためには、ヒト由来
のBCDFを使用することが望まれる。

これまで、BCDFあるいはTRFに関していくつかの研究
がなされている。まず、マウスのBCDF（もしくはTRF）
については、R.W.Duttonら（Prog.ImmunoI.,１,335（19
71））およびA.SchimplおよびE.Wecker（Nature,237,15
（1972））によって報告された。その後、ヒトにおいて
もマウスのBCDF（もしくはTRF）に相当する物質の存在
がGeha,R.S.ら（J.Exp.Med.,138,1230（1973））,Fauc
i,A.S.ら（J.Immunol.,117,2100（1976））およびHiran
o,T.ら（J.Immunol.,119,1235（1977））によって報告
されているが、以下に述べるように構造についても不明
な点が多く、また、関与する遺伝子も不明のため、混沌
とした状態である（Kishimoto,T.,Ann.Rev.Immunol.,
３,133（1985））。

従来、ヒトBCDFを得るには、ヒト末梢血より分離した
正常ヒトＴ−細胞９をマイトゲン刺激して培養すること
により、その培養上清から得る方法がとられている（Hi
rano,T.ら,J.Immunol.,126,517（1981）およびRalph,P,
ら,J.Immunol.132,1858（1984））。上記のRalph,P.ら
は、マイトゲン刺激した正常ヒトＴ細胞の３の培養上
清から、硫安沈澱、DEAEセルロースカラムクロマトグラ
フィー（DE−52）、ウルトロゲルカラムクロマトグラフ
ィー（AcA44）、ブリーアガロースおよびレッドアガロ
ースによるアフィニティークロマトグラフィー、逆相高
速液体クロマトグラフィーなどにより約11,000倍まで精
製し、ゲル濾過法による分子量が約20,000であることを
測定したが、純粋なBCDFを得るまでには至っておらず、
また得られた量も極微量（３の培養上清から4.2μ
ｇ）であった。また、Okada,M.ら（J.Exp.Med.,157,583
（1983））は、正常ヒトＴ細胞とヒトＴ細胞株CEM−AG^R
とを融合して得たヒトＴ細胞融合株の培養液からヒトBC
DFを得る方法を報告しているが、一般にヒト融合細胞に
は、継代培養中に物質の産性能が低下する傾向があり、
実用面での物質生産には不向きと考えられる。

ヒトBCDFには、BCDF IとBCDF IIの二種類があり、各
々の性質は下記の様に報告されている（Teranishi,T.ら
J.Immunol.,128,1903（1982）およびHirano,T.ら,J.Imm
unol.132,229（1984））。即ち、 BCDF I: 分子量:20,000（ゲル濾過法） PI:6.5〜8.0 作用：スタフィロコッカスアウレウスコワンＩ（Stap
hylococcus aureus Cowan I（SAC））刺激Ｂ細胞（ブ
ラスト化Ｂ細胞）を免疫グロブリン（Ig）産生細胞に分
化・誘導する。

DCDF II: 分子量:22,000、36,000（ゲル濾過法） PI:5〜６作用１）EBウイルスでトランスフォームさせたＢリン
パ芽球様細胞（Ｂ−LCL）にIgG産生を誘導する。

２）BCDF I存在下にSACで刺激されたＢ細胞のIg産生細
胞への分化を増強する（BCDF II単独ではこの作用はな
い）。

最近、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV）によりトラ
ンスフォームされたヒトＴ細胞の１株VT−１を用いたヒ
トBCDFの生産方法が報告されている（岸本忠三、平野俊
夫、特開昭61−115024および特開昭61−115025号）。こ
れらの出願の発明者らは、VT−１細胞の無血清培養上清
10より、限外濾過、AcA−34ゲル濾過カラムクロマト
グラフィー、クロマトフォカシング、逆相クロマトグラ
フィーを用いて、1042倍まで精製し（収率1.8％）、ヒ
トBCDFの分子量は3.5±0.5×10⁴ダルトン（ゲル濾過
法）または2.2±0.2×10⁴ダルトン（SDSポリアクリルア
ミド電気泳動法）。等電点は4.9〜5.1、またＮ末端部分
のアミノ酸配列は、Pro−Val−Pro−Pro−Gly−Glu−As
p− Ser−Lys−Asp−Val−Ala−Ala−であると報告し
ている。この精製BCDFは、その活性をEBウイルスでトラ
ンスフォームさせた細胞であるCESSのＩgG生産量を指標
にして精製している点および分子量やPI値などからBCDF
IIと考えられる。一方、前記のRalph,P.らが報告した
ヒトBCDFの分子量はゲル濾過法で20,000ダルトンであ
る。これはBCDF Iと考えらえるが、その構造やその他の
物理化学的性質は明らかにされていない。また、上記の
VT−１細胞を用いたBCDFの生産方法は、既述のヒト末梢
血からの細胞やヒトＴ融合細胞を用いた方法に比べ改善
はされているが、多量の培養上清から得られるBCDF量は
極微量であり、またHTLV感染細胞を出発原料としている
点からも医薬を目的とする工業的生産には向いていな
い。

このように、ヒトＢ細胞分化因子（BCDF）に関して
は、その構造が明らかにされていないばかりか、物理化
学的性質ならびに機能について不明な点が多い。また、
それを大量に生産し実用に供することは従来の技術では
不可能であった。

（発明が解決しようとする問題点）本発明は、遺伝子組み換え技術を駆使し、これらの問
題を解決しようとするものである。

即ち、本発明はヒトBCDF高生産細胞からBCDF mRNAを
単離し、BCDF生産を支配するBCDF遺伝子（即ちDNA配
列）、あるいはまた染色体由来のBCDF遺伝子を明らかに
すると共に、BCDF分子の構造（アミノ酸配列）を明らか
にすることにより、組み換えDNA技術でBCDFの大量生産
および医薬などへの応用の可能性を提供しようとするも
のである。

尚、本発明におけるヒトＢ細胞分化因子はBCDF Iに相
当するものであるが、本発明と同様な手法により他のBC
DFの構造も明らかにすることも出来よう。

（問題点を解決するための手段）ヒトBCDF遺伝子の調製と塩基配列の決定本発明のヒトBCDFcDNAは、既に本発明者らによって調
製されたマウスのＢ細胞分化因子の遺伝子（cDNA）がク
ローニングされたプラスミドpSP6K−mTRF23（特願昭61
−157227号明細書）のBamH I−Acc I断片（マウスのＢ
細胞分化因子の遺伝子の全コーディング領域を含んでい
る）をプローブとして以下に述べるようにして得ること
ができる。尚、プラスミドpSP6K−mTRF23が導入されて
いる大腸菌（HB101/pSP6K−mTRF23）は、SBM285と命名
され、微工研にFERM Ｐ−8828の受託番号を得て寄託さ
れている。

先ず、ヒト染色体DNAに、マウスのＢ細胞分化因子遺
伝子とハイブリダイズする配列が存在するかどうかを確
かめるため、例えば正常ヒト胎盤細胞より抽出したDNA
をPvu IIあるいはPst Iで消化し、上記のプラスミドpSP
6K−mTRF23のBamH I−Acc I断片をニックトランスレイ
ション法により³²pでラベル後、これをプローブとして
サザーンブロットハイブリダイゼイション（Southern
blot hybridization）を行う。ヒト胎盤からのDNAをPv
u IIで消化した場合は3.0kbのDNA断片が、またPst Iで
消化した場合は4.1kbのDNA断片が上記プローブとハイブ
リダイズすることが認められ、ヒト染色体にマウスのＢ
細胞分化因子遺伝子と類似の配列をもつDNAが存在する
ことが確認される。この結果は、上記のプローブを用い
てヒトのBCDFcDNAをクローニングできることを示すもの
である。

次に上記知見をもとにヒトBCDFのcDNAライブラリーを
調製する。先ず、Maeda,M.ら（J.Exp.Med.,162,2169（1
985））によって確立されているヒトＴ細胞株ATL−２の
培養細胞から常法（Nikaido,T.ら,Nature,311,631（198
4））に従い、ポリ（Ａ）⁺RNAを調製し、pCDベクターを
用いるOkayama−Berg法（Okayama,H.及びBerg,P.,Mol.c
ell.Biol.,３,280（1983））に準じ、cDNAライブラリー
を調製する。次にこのcDNAライブラリーをいくつかの群
に分け、それらからプラスミドDNAを分離し、Sal Iまた
はBamH Iで消化したのち、上記のプローブ（³²Pでラベ
ルされたBamH I−Acc I DNA断片）とサザーンブロット
ハイブリダイゼイション（Southern,E.M.,J.Mol.Biol.,
98,503（1975））を行い、マウスのＢ細胞分化因子の遺
伝子とハイブリダイズするDNA断片をもつ群を選択す
る。続いて、ポジティブとなった群の各クローンについ
て，上記のプローブを用いて同様にサザーンブロットハ
イブリダイゼイションを行うことにより、上記プローブ
とハイブリダイズするクローンを選択する。このポジテ
ィブなクローンには、ヒトBCDFのcDNA遺伝子をもつプラ
スミドが含まれていると考えられる。このようにして得
られるポジティブなクローンの一つ（ph・IL−５−30）
がもつプラスミドはpCDVTRFと命名され、またそのプラ
スミドを大腸菌HB101株へ導入した形質転換体（HB101/p
CDVSRF）はTBM286と命名され、微工研にFERM BP−1171
の受託番号を得て寄託されている。

次にポジティブなクローンのプラスミドについて、制
限酵素解析および上記プローブとのハイブリダイゼーシ
ョンにより、確かにマウスＢ細胞分岐因子遺伝子と類似
したヒトBCDF cDNAがクローン化されていることを確認
し、以下に記すようにそのDNAの塩基配列を決定すると
ともに、そのDANがヒトBCDF活性を有する蛋白質（ポリ
ペプチド）を生産する遺伝子であるかを調べる。

先ず、常法に従いそのクローンのプラスミド（例え
ば、ph・IL−５−30）の制限酵素切断マップを調べた
後、ph−IL−５に挿入されているcDNA（ヒトBCDF cDNA
遺伝子を含む）を一旦pUC18等の適当なプラスミドのBam
H Iサイトにクローニングしなおし、ジデオキシ法（San
ger,F.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463（1977））
に従って、上記cDNAの塩基配列をきめる。本発明者らの
実験によれば、上記方法によって、ヒトBCDFのcDNAを含
む第１図のcDNA塩基配列が得られた。

ヒトＢ細胞分化因子をコードする領域の決定上記で得られたcDNA塩基配列にヒトＢ細胞分化因子を
コードする領域が含まれることは、次のようにして決定
した。

即ち、この塩基配列のオープンリーディングフレーム
を探すとともに、既に本発明者らによって決定されてい
るマウスＢ細胞分化因子遺伝子の塩基配列と比較するこ
とにより、ヒトＢ細胞分化因子（ヒトBCDF）ポリペプチ
ドをコードする領域とアミノ酸配列を決定する（第２
図）。そして，そのコーディング領域のアミノ酸配列お
よびヒトBCDFが細胞外に分泌される蛋白質であることか
ら、ヒトBCDFの前駆体ポリペプチドは、Ｎ末端側に19個
のアミノ酸からなるシグナルペプチド（リーダー配列）
を含む134個のアミノ酸からなるポリペプチドであるこ
とが分かった（第３図参照）。即ち、第３図のアミノ酸
配列のうち20〜134番目が成熟ヒトBCDFポリペプチドで
ある。前駆体のアミノ酸配列中には、２ヶ所Ｎ−グリコ
シル化可能部位（47番および90番のAsn）および後述す
るとおり少なくとも１ケ所のＯ−グリコシル化可能部位
（22番のThr）があり、ここに糖鎖が付加されることを
考えると、上記の成熟ヒトBCDFポリペプチドの計算分子
量（13,149）は、既に報告されているヒトBCDF I（糖鎖
が付加されている）の分子量（約20,000）と矛盾は無
い。尚、第３図に示すポリペプチドのＮ末端のMet（メ
チオニン）は、翻訳後の修理過程（post translationa
l modification process）で、フォルミル化やアセチ
ル化されることがあり、また、Metが取り除かれたりす
ることもある。また、上記の成熟ヒトBCDFポリペプチド
のＮ末端のアミノ酸も同様な過程でアセチル化されるこ
とがある。

一方、前記のプラスミドph・IL−５−30に挿入されて
いるcDNA、即ち上記の如く同定したDNAがヒトBCDF活性
を有する蛋白質（ポリペプチド）を生産する遺伝子であ
ることは当該遺伝子を組み込んだ発現ベクターによって
形質転換された宿主細胞が産生する蛋白質の活性を測定
することによって知ることができるが、また以下のよう
にしても調べられる。

即ち、先ずプラスミドph・IL−５−30に挿入されてい
るヒトBCDF cDNA全部を含むBamH I DNA断片をpSP64ベ
クターに再クローンする。pSP64は、挿入された外来遺
伝子がSP6プロモーター支配下にのみ発現されうるよう
に改良されたベクターであり、in vitroでSP6RNAポリ
メラーゼ存在下に挿入された外来遺伝子のmRNAを合成す
ることができる（Krieg,P.A.およびMelton,D.A.,Nucl.A
cid.Res.,12,7057（1984），およびKonarska.M.M.ら,Ce
ll,38,731（1984））。次にこのようにして、上記のcDN
Aからin vitroで調製されるmRNA溶液を、アフリカツメ
ガエル（Xenopus）の卵母細胞（oocyte）に注射して培
養し、培養上清に分泌されてくるmRNAからの翻訳産物
（蛋白質）のBCDF活性を測定する。ヒトBCDF（特にヒト
BCDF I）活性は、既に記載したように、Staphylococcus
aureus Cowan Ｉ（SAC）で刺激したヒトＢ細胞のIg
M産生誘導能をコントロールと比較して調べることによ
り測定される。このようにして上記のcDNAが、ヒトBCDF
活性を有する蛋白質（ポリペプチド）を生産する遺伝子
であることが確かめられるとともに、本発明のDNAによ
る特許請求の範囲に示すようなヒトBCDFポリペプチドの
大量生産の可能性を示す。

ヒトBCDFの発現本発明によれば、上記のようにして調製された、遺伝
子配列を使用することにより、ヒトBCDFを製造すること
が可能である。

例えば、ヒトBCDFをコードする遺伝子としてcDNAを使
用する場合には、cDNAの５′側上流に適当な他のプロモ
ーター（例えばSV40由来のプロモーター）を挿入した発
現ベクターを造成し、適当な細胞（例えば、酵母細胞、
大腸菌細胞、或いはCOS−Ｉ細胞やCHO細胞等の動物細
胞）でヒトＢ細胞を分化させる蛋白質をつくることもで
きる。この場合、前駆体蛋白質をコードするDNA領域を
用いることが好ましいが、成熟形蛋白質（ボリペフチ
ド）をコードするcDNA領域を用いてもよい。また、当該
蛋白質をコードするDNAの直近の５′上流に、適当な制
限酵素（例えばHind III）切断部位を適当な方法、例え
ば部位特異的ミュータジェネシス（site directed mu
tagenesis）法を用いて設けておくと外来プロモーター
の導入が容易である。

本発明によれば、cDNAを用いる代わりに、ヒト染色体
からイントロンを含むヒトBCDF遺伝子を調製し、これを
用いて、上記と同様にしてヒトＢ細胞を分化する蛋白質
を製造することもできる。

即ち、ヒトBCDF遺伝子を含むDNA断片を上記cDNAをプ
ローブとして、適当なヒト遺伝子ライブラリー（例え
ば、マニアティス（Maniatis）のヒト遺伝子ライブラリ
ー）から分離し、次にcDNAの場合と同様、ヒトBCDFをコ
ードするDNA領域の５′上流に適当なプロモーターを挿
入した発現ベクターを造成し、この発現ベクターによっ
て形質転換あるいはトランスフェクションされた細胞を
培養することにより、ヒトBCDFを効率よく製造すること
ができる。この場合の宿主細胞は、好ましくはスプライ
ス能力のある細胞が使用される。特に動物細胞が好まし
い。なお、ヒト染色体由来のBCDF遺伝子が組み込まれた
発現ベクター（pdKCR−hIL−5gene）が導入されている
大腸菌（HB101/pdKCR−hIL−5gene）は、SBM293と命名
され、微工研に国際寄託番号FERM BP−1477を得て寄託
されている。

組換えヒトBCDFの精製上記のようにして造成された動物細胞が産生する組換
えヒトBCDFは、適当な方法、例えばモノクローナル抗体
を用いたアフィニティークロマトグラフィーやゲル濾
過、逆相高速液体クロマトグラフィーなどによって精製
することができる。

本発明者らは、このようにして精製・純化された組換
えヒトBCDFを、アミノ酸配列分析や電気泳動分析にか
け、このアミノ酸配列分析の結果およびヒトBCDFをコー
ドする遺伝子の塩基配列からの推定（例えば第２図参
照）に基づいて、成熟型ヒトBCDFのボリペフチド部分の
構造は、前記のとおり第３図の第20番のIleから第134番
のSerまでの配列を有することを明らかにすると共に、
その２次元的配列の推定も行った（第12図）。

以下、実施例をもって本発明を説明する。

実施例（１）ヒトBCDF遺伝子の確認先に、本発明者らは、マウスBCDF（TRF）の産生を司
る遺伝子、即ちDNA配列を同定した（特願昭61−157227
号明細書）。そしてこの遺伝子によって産生されるマウ
スTRFは、TRF活性〔１）マウス慢性Ｂ白血病細胞（BC
L₁）をIgM抗体産生細胞に分化させる活性、２）抗原（D
NP−KLH）感作させたマウス脾臓内Ｂ細胞を抗原（DNP−
オバルブミン）で刺激し、特異的抗体（抗DNP−IgG）産
生細胞に分化させる活性、３）in vivoで活性化したＢ
細胞ブラストのIgM合成誘導活性〕およびBCGF II活性
〔１）BCL₁細胞の分裂促進、２）デキストラン硫酸刺激
休止Ｂ細胞の分裂促進〕をもっていることを明らかにし
た。マウスTRF mRNAに相補するcDNAを含むプラスミドp
SP6K−mTRF23をBamH IおよびAcc Iで消化して、654bpよ
りなるBamH I−Acc Iフラグメントを分離した。マウスB
CDF（TRF）の全コーディング領域を含んでいる、このフ
ラグゲントをニックトランスレイションによっ³²Pでラ
ベルしたものをプローブにしてヒト染色体DANのサザン
ブロットハイブリダイゼーションを常法（Southern,E.
M.,J.Mol.Biol.,98,503（1975））に従って行った。ヒ
ト染色体DNAは正常ヒト胎盤よりYaoita,Y.およびHonjo,
T.（Biomed.Res.,１,164（1980））に準じて抽出したの
ち、各々２μｇをPvu IIまたはPst Iで消化してサザン
ブロットハイブリダイゼーションのために0.6％アガロ
ースゲルで電気泳動した。泳動後、ゲル中のDNAはニト
ロセルロースフィルター（Schleicher ＆ Schuel（Da
ssel））に移し上記のプローブとハイブリダイズさせ
た。洗浄条件を0.1％SDSを含む２×SSC（SSC:0.15M Na
Cl−0.015M クエン酸ナトリウム）、50℃、45分で行う
と、Puv IIで消化した場合には3.0kbのDNAフラグメント
が、そしてPst Iで消化した場合には4.1kbのDNAフラグ
メントがマウスBCDFプローブとハイブリダイズすること
が判明した。このプローブは、マウス染色体DNAのフラ
グメントには、よりストリンジェント（stringent）な
条件でもハイブリダイズすることより、ヒト染色体DNA
中にマウスBCDF（TRF）cDNAと全く同一ではないが相同
性の高い配列があることが判明し、このプローブを用い
てヒトBCDFのcDNAクローンのスクリーニングが可能であ
ると判断した。

（２）ヒトBCDF cDNAクローンの分離ヒトBCDFのcDNAライブラリーは下記の如く作成した。
M.Maedaら（J.Exp.Med.,162,2169（1985））が成人性Ｔ
細胞白血病患者の血液より樹立したヒトＴ細胞株ATL−
２をRPMI 1640＋10％牛胎児血清の培地中、37℃、５％
CO₂中で培養して細胞を集めた。この細胞より常法（Nik
aido,T.ら,Nature,311,631（1984））に従い、ポリ
（Ａ）⁺RNAを調製した。このポリ（Ａ）⁺RNA ３μｇを
用いてcDNAライブラリーを作成したが、方法はpCDベク
ターを用いるOkayama−Berg法（Okayama,H.およびBerg,
P.,Mol.Cell.Biol.,３,280（1983））に準じて、大腸菌
（E.coli HB101株）の形質転換体として２×10⁵個の独
立のcDNAクローンを得た。

この２×10⁵個のcDNAクローン中にヒトBCDF遺伝子に
相当するcDNAが存在するかどうかを調べるため、全形質
転換体の混合物からプラスミドDNAを調製し、各々２μ
ｇのDNAをSal IまたはBamH Iで消化し、上記の方法によ
りサザンブロットハイブリダイゼーションを行った。そ
の結果、pCDベクターに１カットを入れるSal I消化では
4.1kbのDNAフラグメントがハイブリダイズし、これに対
してインサートされたcDNAのほぼ両端の位置で切断する
BamH I消化では1.0kbのDNAフラグメントがハイブリダイ
ズすることが判った。

これらの結果からcDNAライブラリー中にヒトBCDF遺伝
子に相当するDNA配列を持つクローンが含まれているこ
が示唆された、そこで前記マウスのプローブを用いて上
記の２×10⁵個のcDNAクローンを常法のコロニーハイブ
リダイゼイション（Hanahan,D.およびMeserlson M.,Ge
ne,10,63（1980））に準じてスクリーニングした。スク
リーニングの結果29クローンがマウスBCDF（TRF）cDNA
プローブとハイブリダイズし、この29クローンのプラス
ミドDNAのエンドヌクレアーゼ切断マップおよびエンド
ヌクレアーゼで消化したDNAフラグメントの上記プロー
ブを用いたサザンハイブリダイゼーションの結果、この
29クローンは全て同一と判断された。

（３）ヒトBCDF cDNAの塩基配列決定およびヒトBCDF
cDNAのポリペプチドのアミノ酸配列上記の29クローンのうちの一つph−IL−５−30を更に
詳細に調べた。制限エンドヌクレアーゼ切断マップを常
法に従い調べた後、ph−IL−５−30に挿入されたcDNAを
一旦pUC18プラスミドのBamHIサイトにサブクローニング
し、cDNAのDNA配列を常法に従いジデオキシ法（Sanger,
F.ら， Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463（1977））に
よって決定した。その結果、挿入されたcDNAはポリＡテ
ールを除く816の塩基対よりなることが判った。

この結果とマウスのBCDF（TRF）のDNA配列を比較する
ことによってヒトBCDFのコーディング領域を決定し、ヒ
トBCDFの前駆体が134個のアミノ酸からなると決定され
た。ヒトBCDFはＴ細胞外に分泌されるためにこの134個
のアミノ酸配列中、Ｎ末端配列にシグナル配列を含むこ
とが予想され、成熟したヒトBCDFは上記134個のアミノ
酸配列中20番目のアミノ酸から134番目までのアミノ酸
よりなるポリペプチドを含む分子であると考えられる。
このアミノ酸配列中には、２ヶ所のＮ−グリコシル化可
能部位（第３図中、47番および90番のAsn）および少な
くとも１ケ所のＯ−グリコシル化可能部位（第３図中、
22番目のThr）があり、この付加の可能性のある糖の分
子量とポリペプチドの分子量（20番〜134番のポリペプ
チドで13,149）を加算すると、BCDF Iの分子量として報
告されている20,000に矛盾しない。

マウスBCDF（TRF）と比較すると、前駆体ではヒトBCD
Fのアミノ酸数は一つ多い。ヒトBCDFの二個所のＮ−グ
リコシル化の可能サイトはマウスBCDFの１番目と３番目
のＮ−グリコシル化可能サイトと一致する。マウスBCDF
（TRF）中の三つのシステイン残基のうち、Ｃ末端側の
二つのシステイン残基はヒトBCDFにおいても保存されて
いる。マウスおよびヒトのBCDFのコーディング領域のヌ
クレオチドおよびアミノ酸配列は各々78％および70％の
相同性を持つ。ph−IL−５−30のPst Iフラグメント（5
15bp）をニックトランスレイションによって³²Pでラベ
ルしたものをプローブに用いて前記ヒト染色体DNAのPVu
IIまたはPst Iで消化したDNAフラグメントについて前
記のとおりサザンブロットハイブリダイゼーションを行
った結果、マウスBCDFプローブを用いた時と同様、それ
ぞれ4.1kbおよび3.0kbのフラグメントとハイブリダイズ
した。ヒトのプローブを用いた場合、洗浄条件を0.1×S
SC−0.1％SDS,65℃,45分というストリンジェントな条件
にしても充分なハイブリダイズがなされた。また、この
ヒトのプローブを用いてATL−２ポリ（Ａ）⁺RNAを常法
に従い（Thomas,D.D.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,5201
（1980））、ノーザンブロットハイブリダイゼーション
を行った結果1.0kbのただ１本のバンドを認めた。この
ことは、本発明者らが同定したヒトBCDF遺伝子がヒト染
色体DNA配列中、マウスBCDF（TRF）遺伝子に特異的な相
同遺伝子であること、またこのヒトBCDF遺伝子からはた
だ一種類のmRNAのみしか翻訳されていないことを示して
いる。

（４）ヒトBCDF活性の測定上記のようにして同定したヒトBCDF遺伝子がその生産
を支配しているポリペプチドあるいはそのポリペプチド
よりなる物質にヒトBCDF I活性があることを以下の方法
で確認した。プラスミドph−IL−５−30のヒトBCDF cD
NAインサート全部と小部分のベクターDNAを含むBamH I
DNAフラグメントをpSP64ベクターに再クローンした。
このプラスミドをSal Iで消化した後、SP6RNAポリメラ
ーゼを用いてin vitroでmRNAを合成させた（Krieg,P.
A.およびMelton,D.A.,Nucleic Acid Res.,12,7057（1
984）；およびKonarska,M.M.ら,Cell,38,731（198
4））。このようにして調製したmRNA溶液をアフリカツ
メガエル（Xenopus）の卵母細胞（oocyte）に注射し、2
0℃48時間培養後、培養液中に分泌された生成物を集め
て遠心分離して、その上清を濃縮装置（Centricon 10;
Amicon社製）で４倍に濃縮したものをヒト．リコンビナ
ントBCDFとして、以下の実験に用いた。このヒト・リコ
ンビナントBCDFがBCDF I活性を持つか否かをSACで刺激
したヒトＢ細胞のIgM産生誘導能で調べた。

ヒトＢ細胞に富むフラクションを正常ヒト血液からSa
iki,O.およびRalph,P.,Eur.J.Immunol.,13,31（198
4））に準じて調製し、１×10⁵細胞/100μの細胞をSA
C（0.001〜0.0025％）で刺激した。次いで上記ヒト・リ
コンビナントBCDFを15％濃度になるよう添加し、37℃,5
％CO₂下,6日間培養した。培養上清中のIgM量をエンザイ
ムイムノアッセイキットで測定したところ、110ng/ウェ
ルの値が認められ、コントロールが約50ng/ウェルであ
ったのに対して、有意にIgM産生が誘導された。この誘
導はIL−２（50u/ml）添加によって135ng/ウェルまで増
強された。コントロールにもIgM産生が認められたの
は、完全にＴ細胞を含まないＢ細胞フラクションを得る
ことが困難なためと考えられる。

（５）ヒトBCDF染色体遺伝子の単離・同定既に、実施例（１）で正常ヒト胎盤細胞の染色体にヒ
トBCDF遺伝子の存在を認めていたが、ここでは別の供給
源からヒトBCDF染色体遺伝子を単離した。

即ち、その供給源として、ヒト胎児肝臓DNAのAlu I−
Hae III部分消化断片を持つシャロン4Aファージライブ
ラリー（Maniatis,T.ら,Cell,15,687−702（1978））、
ヒト胎盤DNAのEcoR I部分消化断片をもつシャロン4Aフ
ァージライブラリー（Yaoita,Y.およびHonjo,T.,Biome
d.Res.１,164（1980）に準じて作製）およびヒトIgE産
生ミエローマ細胞株266B1のDNAのEcoR I部分消化断片を
持つシャロン4Aファージライブラリー（Nishida,Y.ら,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA,79,3833−3837（1982））を選
んだ。

次に、この３種のライブラリーを用いて、既述のヒト
BCDF cDNAのPst I−Pst I断片（515bp）をプローブと
してファージのスクリーニングを、ベクトンおよびデー
ビス（Becton,W.D.およびDavis,R.W.,Science,196,180
−182（1977））の方法に準じて行った。胎児肝臓、胎
盤及びミエローマの各々のライブラリーより各５×10⁵
個のファージプラークをスクリーニングしてプローブと
ハイブリダイズする３個のクローンλ12（胎児肝臓ライ
ブラリーより）、λ22（胎盤ライブラリーより）および
λ38（ミエローマライブラリーより）を得た。

続いて、この３個のクローンの制限エンドヌクレアー
ゼ切断地図を常法に従い作製し、ヒトBCDF cDNAのPst
I−Pst I断片をプローブとして用いたサザンブロットハ
イプリダイゼーション（Southern blot hybridizatio
n）分析した。分析のストラテジーおよびヒトBCDF遺伝
子の構成を第４図に示すが、図中Ｅ、ＨおよびＢは各々
EcoR I、Hind IIIおよびBamH Iによる切断部位を示し、
黒ボックス部はエクソン領域を示す。この分析の結果に
よれば、これら３個のクローンのインサートは互いにオ
ーバーラップしており、第４図に示す各クローンに共通
の3.2kb BamH I断片のみが上記のプローブとハイブリダ
イズした。従ってこの3.2kb BamH I断片にヒトBCDFをコ
ードする全てのエクソンが含まれていると考え、この3.
2kb BamH I断片を分離し、Hind IIIで消化後２つになっ
た1.6kb断片の各々をpUC18ベクターにサブクローニング
した。次いで、Yanisch−Perron,C.ら（Gene,33,103−1
19（1985））に従い、上で得られた２個の1.6kb断片を
クローンしたプラスミドの各々を両端からエクソヌクレ
アーゼIII及びVIIで消化して、ユニディレクショナルデ
ィリーション（unidirectional deletion）ミュータン
トクローンのシリーズを作製した。このミュータントプ
ラスミドのインサートのヌクレオチド配列は、常法（Sa
nger,F.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463−5469（19
77）に従い、ジデオキシチェインターミネーション（di
deoxy chain−termination）法によって決定した。ヒ
トBCDF染色体遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ地図及び
４個のエクソンと３個のイントロンの配置（organizati
on）も、ヌクレオチド配列分析のストラテジーと共に第
４図に示す。また、実際のヒトBCDF遺伝子を含むBamH I
3.2kb断片のヌクレオチド配列を第５図に示す。ここで
明らかになったヒトBCDF染色体遺伝子上のエクソン部分
のヌクレオチド配列は、先に明らかにしたヒトBCDF cD
NAのヌクレオチド配列と完全に一致した。

上記の結果から、染色体遺伝子において、第１エクソ
ンは、ヒトBCDF前駆体ポリペプチド鎖のＮ末端側の第１
アミノ酸（Met）から第48アミノ酸（Glu）迄を、第２エ
クソンは第49アミノ酸（Thr）から第59アミノ酸（Asn）
迄を、第３エクソンは第60アミノ酸（His）から第102ア
ミノ酸（Lys）迄を、そして第４エクソンは第103アミノ
酸（Lys）から第134アミノ酸（Ser）迄をそれぞれコー
ドしていることが分かった。

（６）ヒトBCDF発現ベクターの造成実施例（２）で取得したヒトBCDF cDNAおよび実施例
（５）で取得したヒトBCDF染色体遺伝子を用いて、次の
４種類の動物細胞発現ベクターを作製した。

pdKCR−hIL−5cDNA pdKCR−hIL−5cDNA−dhfr pdKCR−hIL−5gene pdKCR−hIL−5gene−dhfr Ａ）pdKCR−hIL−5cDNAおよびpdKCR−hIL−5cDNA−dhfr
の作製（第６図）実施例（２）で、オカヤマ−ベルグ法（Okayama,H.お
よびBerg,P.,Mol.Cell Biol.,３,280（1983））に従
い、pCDベクターにcDNAをクローニングし、E.coli HB10
1形質転換クローンph・IL−５−30を得た。このクロー
ンよりプラスミドを分離し、BamH I消化およびPst Iで
の部分消化を行い、ヒトBCDFの全コーディンク領域を含
むcDNAであるBamH I−Pst I断片を得た。この断片をフ
ァージM13mp19DNAのBamH I、Pst Iサイト間にクローニ
ングし、M13mp19−hIL−5cDNAを得た。

次いで、ヒトBCDFコーディング領域の直近の５′上流
にHimd IIIサイトを導入する目的で、第７図に示すヒト
BCDF cDNAのDNA配列中の２重下線を引いた部位で、同
図に示す配列と逆方向のDNAストランドとハイブリダイ
ズする30merのオリゴヌクレオチド：５′−GCAGAACGTTTCAAGCTTATGAGGATGCTT−３′ （下線部のAAGCTTはHind III切断配列を示す）を用いて常法（Messing,J.in Methods in Enzymolog
y,vol.101 Part C,pp62−65（Academic Press,Ed.W
u,R.））に従い、部位特異的ミュータジェネシスを行
い、クローンM13mp19−hIL−5cDNA（Hind III）を得
た。このファージDNAをHind IIIで消化し、ヒトBCDFの
全コーディング領域に相当するcDNAを含むHind III断片
をベクターpdKCR（Nikaido,T.ら,Nature,311,631−635
（1984）:pdKCRベクターはpKCRベクターのpBR322部分が
pBR327に置換したベクターである）のHind IIIサイトに
正しい方向に導入し、発現ベクターpdKCR−hIL−５−cD
NAを作製した。

次に、この発現ベクターpdKCR−hIL−5cDNAのSal Iサ
イトにジヒドロ葉酸レダクターゼ（dihydrofolate red
uctase:dhfr）遺伝子発現ユニットを導入する目的で、p
dKCR−hIL−5cDNAプラスミドをSal Iで消化後、T4DNAポ
リメラーゼで切断部位を粘着末端とした。dhfr遺伝子発
現ユニットは、pSV₂dhfr（BRL Inc.）のPvu IIサイト
にBamH Iリンカーを付加したプラスミドpSV₂dhfr−BLを
作製し、これをBamH Iで消化後、T4DNAポリメラーゼで
切断部位を粘着末端として、dhfr遺伝子発現ユニット断
片を分離した。この断片を先に得た１カットの入ったpd
KCR−hIL−5cDNAに連結して、pdKCR−hIL−５−dhfrを
作製した。

Ｂ）pdKCR−hIL−5gene及びpdKCR−hIL−５−gene−dhf
rの作製（第８図）実施例（５）で得たヒトBCDF遺伝子を有するファージ
クローンλ12から、ヒトBCDFをコードする全遺伝子領域
を含む3.2kb BamH I断片を分離してpUC18ベクターにサ
ブクローニングし、形質転換体pUC18−hIL−5geneを得
た。この形質転換体のプラスミドをBamH IおよびPst I
で消化し、ヒトBCDFをコードする全遺伝子領域を含むBa
mH I−Pst I断片（2.2kb）を得た。この断片をファージ
M13mp19DNAのBamH I、Pst Iサイト間にクローニング
し、M13mp19−hIL−5geneを得た。次いで、前記Ａ）と
同様に、部位特異的ミュータジェネシスを行い、ヒトBC
DFコーディング領域の直近の５′上流にHind IIIサイト
が導入されたクローンM13mp19−hIL−5gene（Hind II
I）を得た。このファージDNAをBamH IとPst Iで消化
し、ヒトBCDF遺伝子をpUC19にサブクローニングして得
たプラスミドpUC19−hIL−5gene（Hind III）を更にHin
d IIIで部分的に消化して、ヒトBCDFをコードする全遺
伝子領域をベクターpdKCRのHind IIIサイトに正しい方
向で導入して、発現ベクターpdKCR−hIL−5geneを作製
した。次いでこの発現ベクターのNru Iサイトにdhfr遺
伝子発現ユニットを導入する目的でpdKCR−hIL−5gene
プラスミドをNru Iで消化し、生成した粘着末端に前記
Ａ）で得られたdhfr遺伝子発現ユニット断片を連結させ
て、pdKCR−hIL−5gene−dhfrを作製した。

以上で作製した４種の発現ベクターは、SV40（Simian
virus 40）アーリープロモーターによりヒトBCDFお
よびdhfrの発現が司られており、また、SV40の複製オリ
ジンを含んでいる。さらに、発現量を増強させるため、
ヒトBCDF cDNA及びヒトBCDF遺伝子共に５′および３′
非翻訳領域の不必要な部分が除去されている。

（７）動物細胞によるヒトBCDFの発現実施例（６）で作製されたヒトBCDF発現ベクターを用
いて、COS−Ｉ細胞およびCHO細胞でヒトBCDFの発現を行
わせた。

動物細胞COS−Ｉ（サル腎臓細胞）は、10％の牛胎児
血清を含むダルベッコの修正エッセンシャル培地で継代
を行い、50〜70％コンフルエントの状態の細胞を用い
て、Graham,F.L.およびvan der Eb,A.J.（Virology,5
2,456−457（1973））に準じて、リン酸カルシウム法で
トランスフェクションを行った。直径10cmの培養シャー
レの細胞当たり各々10μｇの、実施例（６）で得られた
４種類の発現ベクターを使用した。３日間、37℃、５％
CO₂下で培養を行い、上清のBCDF活性を調べると共に、
細胞からFreemanら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,4094
（1983））に従ってRNAを抽出した。得られたRNAを用い
て、Nambu,J.R.ら（Cell,35,47−56（1983））に従いノ
ーザンブロット分析を行い（20μgRNA/レーン）、ヒトB
CDFmRNAの発現量を調べた。用いたプローブは、ヒトBCD
Fの全コーディング領域を含むM13mp19−hIL−5cDNA（Hi
nd III）の、Hind III−Pst I断片である。

CHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞での発現はC
HOdhfr^-株を用いて行った。細胞は10％の牛胎児血清を
含むMEMα^＋（GIBCO）で継代をし、上記と同様にトラン
スフェクションを行った。用いた発現ベクターはpdKCR
−hIL−5cDNA−dhfrおよびpdKCR−hIL−5gene−dhfrで
ある。トランスフェクション後48時間培養を行い、Weis
sman,C.（Nucleic Acids Res.11,687（1983））に従
い、10％透析牛胎児血清を含むMEMα⁻（GIBCO）で培養
選別後、培養液にメトトレキセート0.1μＭを添加し、
更に数日培養を行ってメトトレキセートに耐性のコロニ
ーを分離し、継代後その上清のBCDF活性を調べた。高発
現細胞株を得る目的で、Simonsen,C.C.およびLevinson,
A.D.（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,2495−2499（198
3））に従い、継代培養液に更に高濃度のメトトレキセ
ートを段階的に1mMまで添加し、ヒトBCDF産生細胞株を
樹立した。

ヒトBCDFのアッセイ方法は、Ｔ cell replacing f
actorの活性測定方法をとり、Kinashi,T.ら（Nature,32
4,70−73（1986））にしたがった。アッセイに用いた細
胞は、BCL₁マウス慢性Ｂ白血病細胞（in vivo継代株或
いはBCL₁クローン5B₁b（ATCC TIB197））であり、この
細胞をサンプル希釈系列と混和し、５×10^-3個/200μ
ずつ96穴平底プレート中で48時間５％CO₂、37℃で培養
した。培地は10％牛胎児血清を含むRPMI−1640であり、
５×10^-5Mの２−メルカプトエタノール、50U/mlのペニ
シリンＧ、50μg/mlのストレプトマイシンを含んでい
る。48時間後、細胞を遠心で集め、ハンクス液で洗浄
後、200μ／穴に懸濁し、その半量の100μの細胞を
用いてプロテインＡプラークアッセイをGronowicz,E.ら
（Eur.J.Immunol.,６,588−590（1976））に従って行
い、IgM産生細胞数を測定した。BCL₁細胞がマウス由来
であるため、上記アッセイ法ではヒトBCDFの測定感度は
マウスBCDFに比して劣る（精製標品を用いた結果では、
約1/100が、測定可能であった。

COS−Ｉ細胞をpdKCR−hIL−5cDNA及びpdKCR−hIL−5g
eneの発現ベクターでトランスフェクションし、３日後
の両細胞のヒトBCDF mRNAをノーザンブロット分析によ
り分析すると、両者共に1kbに相当する位置にハイブリ
ダイゼーションバンドを認めた。このことはCOS−Ｉ細
胞中でヒトBCDF遺伝子の転写物が正しくスプライスされ
ていることを示した。又ヒトBCDF mRNAの発現量は、驚
くべきことに、COS−I/pdKCR−hIL−5geneの方がCOS−I
/pdKCR−hIL−5cDNAに比して約20倍高かった。

また、BCDF活性を表すプロティンＡ・プラークアッセ
イ（PFC No.）でも、上記ノーザンブロット分析と同様
の傾向が観察された。即ち、両発現ベクターでトランス
フェクションし、３日間培養したCOS−Ｉ細胞の培養上
清の20％と共に培養したBCL₁細胞のプラーク形成数を調
べたところ第１表に示すように、コントロール（宿主細
胞COS−Ｉ）との差で比較すると、COS−I/pdKCR−hIL−
5geneの方が、COS−I/pdKCR−hIL−5cDNAより約17倍も
高いプラーク形成数を与えた。

このことは、pdKCR−hIL−5geneの方がpdKCR−hIL−5
cDNAによるよりトランスフェクション効率が高いことを
起因する可能性を否定は出来ないが、むしろヒトBCDF遺
伝子のイントロン部分にSV40プロモーターに働く未知の
増強機能が存在していることを示唆している。

（８）ヒトBCDFの精製と物性 COS−Ｉ細胞をpdKCR−hIL−5geneでトランスフェクシ
ョンし、３日間後の培養液640ml（直径10cmの培養シャ
ーレ64枚分）よりヒトBCDFの精製を行った。培養液を遠
心後、上清をラット抗マウスBCDF（IL−５）モノクロー
ナル抗体を担体セルロファイン（チッソ（株））に結合
させたアフィニティーカラム（3mlベッド容量）にか
け、ヒトBCDFをカラムに吸着させた（ヒトBCDFによるBC
L₁細胞のIgM産生細胞への変換は、抗マウスBCDF抗体に
より完全に抑制されたので、本アフィニティーカラムを
精製に使用した）。次いでこのカラムを次の順序に従っ
て洗浄した。

1M NaCl 50ml、 0.5％ NP−40,50ml PBS（pH7.2）,50ml H₂O,50ml。

次に、4mlの1M酢酸を使って吸着されたヒトBCDFを溶
出し、溶出液をスピードバックコンセントレーターによ
って100μまで濃縮した。この濃縮液をSuperose12カ
ラム（ファルマシア）を２連結したHPLCにかけ、ゲル濾
過による精製を行った。カラムは予め、PBS（pH7.2）で
平衡化を行い、同じ緩衝液で溶出した（流速0.3ml/
分）。溶出液をOD₂₁₀とバイオアッセイでモニターし、
活性画分を分子量40K付近に回収した。その溶出パター
ンを第９図に示す。図中、斜線部分はBCDF活性を有する
画分を示し、実線は蛋白質を、点線はBCDF活性を各々示
し、矢印は標準分子量蛋白質（分子量マーカー）の溶出
位置を示す。

この活性画分をセンシューパックVP−304−1251（セ
ンシュー科学、プロテインC₄に相当）による逆相HPLCに
かけた。吸着されたヒトBCDFを0.1％トリフルオロ酢酸
（TFA）存在下、溶出液のアセトニトリル濃度を０％か
ら80％に直線的に上昇させることにより溶出した（流速
0.5ml/分）。その溶出パターンを第10図に示す。図中、
斜線部分は、BCDF活性を有する画分を示し、点線はアセ
トニトリルの濃度を示す。精製されたヒトBCDFはアセト
ニトリル55％付近の溶出位置に回収された。収量は約３
μｇであった。

こうして、精製されたヒトBCDFについて、0.15μg/50
μ／レーンでSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分子量測定を行った。その泳動パターンを第11図
に示す。図中、４）は分子量マーカーのレーンであり、
１）〜３）のレーンには次の処理を行った精製ヒトBCDF
を泳動させた。

１）精製直後のサンプル、２−メルカプトエタノール
及び熱による処理をしていない、２）精製直後のサンプル、２−メルカプトエタノール
処理を行い、熱処理はしていない、３）精製後溶出液中で、４℃２週間保存したサンプ
ル、２−メルカプトエタノール及び熱による処理をして
いない、第11図に示すとおり、２−メルカプトエタノール処理
及び熱処理をしないヒトBCDFサンプルではゲル濾過の結
果と一致して約40Kの単一バンドを示したが、このサン
プルを２−メルカプトエタノール処理をすると（熱処理
はしない）、ゲル上の分子量は約20Kの単一バンドとな
った。また、溶出液（0.1％TFA、約55％アセトニトリ
ル）中、４℃で２週間保持した後にも酸化的条件にもか
かわらずゲル上の分子量は約20Kの単一バンドとなっ
た。このことは活性体のヒトBCDFが単量体の分子量約20
Kよりなる２量体（分子量約40K）であることを示す。

精製したヒトBCDFの２μｇ（単量体として約100pmol
e）を使い、Ｎ末端アミノ酸配列の決定をHewick,R.M.ら
（J.Biol.Chem.,256,7990−7997（1981））に準じて、
ガス−フェイズプロテインシークエンサーを用いて行っ
た。各サイクルで得られたフェニルチオヒダントイン
（PTH）アミノ酸を逆相系HPCで分析し、Ｎ末端より27番
目のアミノ酸迄の配列を第２表に示すとおり決定した。

この結果は、実施例（３）で示したヒトBCDF cDNAの
ヌクレオチド配列から予想した134個のアミノ酸からな
るヒトBCDF前駆体は、動物細胞からの分泌時にＮ末端よ
り19番目のアミノ酸であるアラニンのＣ末端でリーダー
配列が切断され（第３図）、COS−Ｉ細胞あるいはおそ
らくそのナチュラルなソースであるＴ細胞からは、イソ
ロイシンをＮ末端アミノ酸に持ち、単量体が115個のア
ミノ酸からなる２量体の糖蛋白質として分泌されること
を示すものである。

なお、７番目、14番目および20番目にスレオニン（Th
r）が検出されたにもかかわらず、塩基配列からスレオ
ニンと判断される３番目のアミノ酸が検出されなかった
ことは、この３番目のアミノ酸残基に糖鎖が付加されて
いることを強く示している。この糖鎖はＯ−グリコシド
結合で付加していると考えられる。

以上よりCOS−Ｉ細胞によって発現された成熟した組
換え（recombinant）ヒトBCDFの性質を次に示すが、単
量体のアミノ酸配列の推定された２次元的配列を第12図
に示す。

Ｎ末端アミノ酸配列がイソロイシンより始まる一種
類であること、自然状態での分子量は約40Kであり、２
−メルカプトエタノール処理又は0.1％TFA−55％アセト
ニトリルでの長時間処理後ではSDS−ポリアクリルアミ
ド電気泳動ゲル上で約20Kを示すことから、ヒトBCDFの
ペプチド部分はホモダイマーよりなる。

成熟したヒトBCDFのペプチド部分はイソロイシンか
ら始まる115個のアミノ酸よりなり、単量体のペプチド
部分の分子量は13,149である。

成熟したヒトBCDFは２量体性の糖蛋白質である。こ
のことは、成熟ヒトBCDFのアミノ酸配列中Ｎ末端から28
番目及び71番目のアスパラギンがＮ−グリコシド化を受
ける可能性のある配列であること、又３番目のスレオニ
ンがアミノ酸配列決定において検出出来なかったことに
より、Ｏ−グリコシド化を受けていると考えられるこ
と、単量体の分子量がSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動ゲル上で約20Kであり、ペプチド部分の分子量13,
149と開きがあることなどから推察される。従って、成
熟ヒトBCDF単量体には分子量の合計が約7,000弱の糖鎖
が結合していると考えられる。

成熟ヒトBCDFのアミノ酸配列中、Ｎ末端から44番目
及び86番目のシステインの状態は不明であるが、0.1％T
FA−55％アセトニトリルの長時間処理で酸化条件にもか
かわらず、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル
上で単量体に相当する分子量を示すことから、２量体の
形成は分子間のＳ−Ｓ架橋によるものではないと考えら
れる。しかし、２−メルカプトエタノール処理で速やか
にSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル上で単量体
に解離することにより、Ｓ−Ｓ架橋が単量体の分子内に
存在し、２量体形成に必要なコンフォメーション保持を
司っていることが考えられる。これらの観察より44番目
のシステインと86番目のシステインは分子内架橋を形成
しているのではないかと推察される。

ヒトBCDF遺伝子の解析から判ったエクソン−イント
ロン構造より、成熟ヒトBCDFの第１アミノ酸（Ile）か
ら第29アミノ酸（Glu）迄が第１エクソン、第30アミノ
酸（Thr）から第40アミノ酸（Asn）迄が第２エクソン、
第41アミノ酸（His）から第83アミノ酸（Lys）迄が第３
エクソン、第84アミノ酸（Lys）から第115アミノ酸（Se
r）が第４エクソンに由来している。

ヒトBCDFの精製は、COS−Ｉ細胞のトランジエント
・エクスプレッション（transient expression）によ
る培養液640mlから出発して、純粋なヒトBCDFを約３μ
ｇ得た。COS−Ｉ細胞のトランスフォーメーションの効
率が約10^-3であることを考えると、CHO/pdKCR−hIL−5g
ene−dhfr細胞株の発現量はヒトBCDFの医療等へのより
広範囲の利用を目的とした生産株となり得ると考えられ
る。

（発明の効果）本発明によればヒトBCDF I活性を示す物質をコードす
るDNA配列およびそのポリペプチド部分の構造が明らか
にされ、DNA組み換え技術を用いたヒトBCDFの大量生産
の可能性が提供された。

本発明の方法で得られる組換えヒトBCDFは、感染症や
免疫不全症などの治療に有用な薬剤として、そのまま或
いは薬学的に許容できる担体とともに薬剤組成物として
患者に投与することが可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、クローン化されたph・IL−５−30に挿入され
ているヒトBCDFのcDNA遺伝子を含むcDNAの塩基配列図で
あり、第２図は、第１図の塩基配列中のヒトBCDFポリペプチド
をコードする領域を、そのコードするアミノ酸配列とと
もに示す図であり、第３図は、第２図の下段に示したアミノ酸配列（ヒトBC
DF前駆体のアミノ酸配列）中における、成熟ヒトBCDFポ
リペプチド部分およびリーダー配列部分を説明するため
の図であり、第４図は、ヒトBCDF遺伝子の塩基配列解析のストラテジ
ーおよび当該遺伝子の構成を示す図であり、第５図（ａ）ないし（ｄ）は、ヒトBCDF染色体遺伝子
（BamH I3.2kb断片）の全塩基配列を示す一連の図であ
り、第６図は、cDNA発現ベクターpdKCR−hIL−5cDNAおよびp
dKCR−hIL−5cDNA−dhfr構築の過程を示す図であり、第７図は、ファージM13mp19DNAのBamH IとPst Iサイト
に挿入されるヒトBCDF cDNAの塩基配列を示す図であ
り、第８図は、ヒトBCDF発現ベクターpdKCR−hIL−5geneお
よびpdKCR−hIL−5gene−dhfr構築の過程を示す図であ
り、第９図は、組換えヒトBCDFのSuperose12HPLCカラムでの
ゲル濾過による溶出パターンを示すグラフであり、第10図は、組換えヒトBCDFのセンシューパックVP−304
−1251カラムでの逆相HPLCによる溶出パターンを示すグ
ラフであり、第11図は、精製された成熟組換えヒトBCDFのSDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動染色パターンを示す図であ
り、第12図は、成熟型組換えヒトBCDF単量体のポリペプチド
部分のアミノ酸配列の推定された２次元構造を示す図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献特開昭63−146798（ＪＰ，Ａ) Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，Ｖｏｌ．14，Ｎｏ．22（1986）Ｐ．9149− 9158

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次式II: で表されるアミノ酸配列を有するヒトＢ細胞分化活性因
子。
【請求項２】遺伝子組換え法で製造され、プロテインC₄
型の吸着剤を用いた高速液体クロマトグラフィーで単一
成分として溶出され、単量体の分子量が約２万の糖蛋白
質であり、かつSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より単一のバンドを示す程度に精製された特許請求の範
囲第１項記載のヒトＢ細胞分化活性因子。
【請求項３】少なくとも、アミノ末端の３番目のアミノ
酸残基（Thr）に糖鎖が結合していることを特徴とす
る、特許請求の範囲第１項又は第２項に記載のヒトＢ細
胞分化活性因子。
【請求項４】分子量約４万の２量体を形成している、特
許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載のヒ
トＢ細胞分化活性因子。