JPH0740943B2 - 新規なポリペプチドをコードするｄｎａ及びその製造方法 - Google Patents
新規なポリペプチドをコードするｄｎａ及びその製造方法Info
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- JPH0740943B2 JPH0740943B2 JP60214870A JP21487085A JPH0740943B2 JP H0740943 B2 JPH0740943 B2 JP H0740943B2 JP 60214870 A JP60214870 A JP 60214870A JP 21487085 A JP21487085 A JP 21487085A JP H0740943 B2 JPH0740943 B2 JP H0740943B2
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5406—IL-4
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は新規なポリペプチドをコードするDNA及びその
製造方法に関する。より詳しくは、哺乳動物の生体内に
おける免疫応答の調節制御に重要な役割を担っているＴ
細胞液性因子の１つであるインターロイキン４（以下、
IL4と略記する。）をコードするDNA及びその製造方法に
関する。
製造方法に関する。より詳しくは、哺乳動物の生体内に
おける免疫応答の調節制御に重要な役割を担っているＴ
細胞液性因子の１つであるインターロイキン４（以下、
IL4と略記する。）をコードするDNA及びその製造方法に
関する。
哺乳動物の生体内免疫反応系を詳細にみてみると、いず
れの哺乳動物も等しく、免疫組織（胸腺、リンパ節、脾
蔵等）と免疫応答細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、マイクロファ
ージ等）を有していることがわかる。さらに最近の研究
では、免疫応答が抗体産生によるところの免疫（液性免
疫という。）と感作リンパ球の生成によるところの免疫
（細胞性免疫）の２通りの免疫応答が存在することが明
らかとなった。そして液性免疫の主役を演ずるのがＢ細
胞であり、Ｂ細胞が抗体産生細胞へ分化するのを助ける
種々の因子（液性因子）がＴ細胞から産生されることが
わかってきた。
れの哺乳動物も等しく、免疫組織（胸腺、リンパ節、脾
蔵等）と免疫応答細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、マイクロファ
ージ等）を有していることがわかる。さらに最近の研究
では、免疫応答が抗体産生によるところの免疫（液性免
疫という。）と感作リンパ球の生成によるところの免疫
（細胞性免疫）の２通りの免疫応答が存在することが明
らかとなった。そして液性免疫の主役を演ずるのがＢ細
胞であり、Ｂ細胞が抗体産生細胞へ分化するのを助ける
種々の因子（液性因子）がＴ細胞から産生されることが
わかってきた。
Ｂ細胞は、造血幹細胞より分化し、膜面にIgM,IgDを抗
原レセプターとして持つ成熟Ｂ細胞となる。成熟Ｂ細胞
は、特異抗原の刺激で細胞増殖を起こし、その後抗体産
生細胞へと分化する。この抗原刺激後のＢ細胞の増殖分
化には、Ｔ細胞由来の液性因子の作用が必要である事が
知られている。現在Ｔ細胞液性因子は、多くの研究室
で、種々のＴ細胞由来のセルライン（cellline），ハイ
ブリドーマ（hybridoma），クローン（clone）を用いて
研究が進められている。
原レセプターとして持つ成熟Ｂ細胞となる。成熟Ｂ細胞
は、特異抗原の刺激で細胞増殖を起こし、その後抗体産
生細胞へと分化する。この抗原刺激後のＢ細胞の増殖分
化には、Ｔ細胞由来の液性因子の作用が必要である事が
知られている。現在Ｔ細胞液性因子は、多くの研究室
で、種々のＴ細胞由来のセルライン（cellline），ハイ
ブリドーマ（hybridoma），クローン（clone）を用いて
研究が進められている。
抗原刺激後のＢ細胞の増殖分化に関するＴ細胞液性因子
群は、活性からみて少なくとも３つのグループに分類さ
れると考えられる。最初のグループは、抗原刺激の前後
に働いて、成熟Ｂ細胞を細胞の増殖サイクルに誘導した
り、又、クラススイッチ（成熟Ｂ細胞の膜面に結合した
IgM,IgDが他のクラスのイムノグロブリン、例えばIgG1,
IgE,IgAなどに変わること）等を含むＢ細胞の活性化を
誘導する因子を含む。次のグループは、活性化された細
胞の増殖を誘導する因子を含む。最後は抗原刺激と、第
１、第２のグループの因子により増殖したＢ細胞を抗体
産生細胞へ分化させる因子を含むグループである。
群は、活性からみて少なくとも３つのグループに分類さ
れると考えられる。最初のグループは、抗原刺激の前後
に働いて、成熟Ｂ細胞を細胞の増殖サイクルに誘導した
り、又、クラススイッチ（成熟Ｂ細胞の膜面に結合した
IgM,IgDが他のクラスのイムノグロブリン、例えばIgG1,
IgE,IgAなどに変わること）等を含むＢ細胞の活性化を
誘導する因子を含む。次のグループは、活性化された細
胞の増殖を誘導する因子を含む。最後は抗原刺激と、第
１、第２のグループの因子により増殖したＢ細胞を抗体
産生細胞へ分化させる因子を含むグループである。
これら因子の遺伝子をクローニングし、その遺伝子を発
現させ、該因子を分離して研究する事は、一つの因子の
生理機能を特定するためにも、又、これらを医薬品に有
効利用するためにも、強力な方法である。
現させ、該因子を分離して研究する事は、一つの因子の
生理機能を特定するためにも、又、これらを医薬品に有
効利用するためにも、強力な方法である。
本発明の目的は、哺乳動物の免疫系に共通的に存在し、
上記の最初のグループ（すなわち、Ｂ細胞の活性化を誘
導する因子）に属すると考えられているIL4を解明する
ことにある。
上記の最初のグループ（すなわち、Ｂ細胞の活性化を誘
導する因子）に属すると考えられているIL4を解明する
ことにある。
より詳細には、IL4の遺伝子をクローニングし、その塩
基配列やアミノ酸配列を決定してIL4の本質を解明する
ことである。
基配列やアミノ酸配列を決定してIL4の本質を解明する
ことである。
一般に、生体内活性蛋白（酵素、活性因子等）の塩基配
列やアミノ酸配列は、各哺乳動物間で高い類似性を有し
ている。従って、ある種の哺乳動物でその本質が解明さ
れれば、その知見はその他の哺乳動物にも大概当てはま
るものである。
列やアミノ酸配列は、各哺乳動物間で高い類似性を有し
ている。従って、ある種の哺乳動物でその本質が解明さ
れれば、その知見はその他の哺乳動物にも大概当てはま
るものである。
本発明者らは、上記の目的を達成するため哺乳動物のな
かからマウスを選び、マウスIL4の遺伝子をバイオテク
ノロジーを利用してクローニングし、マウスIL4をコー
ドするDNA及び該因子のアミノ酸配列を確認して本発明
を完成した。
かからマウスを選び、マウスIL4の遺伝子をバイオテク
ノロジーを利用してクローニングし、マウスIL4をコー
ドするDNA及び該因子のアミノ酸配列を確認して本発明
を完成した。
IL4の存在は、マウスIL4の部分精製（Eur.J.Immunol.,1
5,586（1985）及び同誌，15,593（1985）参照のこと）
によって確認されているものの、その本質については全
く解明がなされていない。これは対象となるIL4を解明
に必要な量取得することが非常に困難だからである。す
なわち、通常の方法、例えば該因子を産生する細胞を培
養する方法では培養液中に含まれる該因子が非常に微量
であり他の多くの不純物の存在のために該因子を単離取
得することが困難であり、また該因子を産生する細胞か
ら伝令RNA（mRNA）を分離して遺伝子をクローニングす
る方法では該因子のmRNAが非常に微量であり、他の多く
のmRNAの存在のために該因子の遺伝子をクローニングす
ることが困難であり、従って該因子もまた単離取得する
ことが困難である。これらの理由からマウスをはじめと
する哺乳動物のIL4のアミノ酸配列は全く知られていな
い。さらにそれをコードするDNAもまた全く知られてい
ない。
5,586（1985）及び同誌，15,593（1985）参照のこと）
によって確認されているものの、その本質については全
く解明がなされていない。これは対象となるIL4を解明
に必要な量取得することが非常に困難だからである。す
なわち、通常の方法、例えば該因子を産生する細胞を培
養する方法では培養液中に含まれる該因子が非常に微量
であり他の多くの不純物の存在のために該因子を単離取
得することが困難であり、また該因子を産生する細胞か
ら伝令RNA（mRNA）を分離して遺伝子をクローニングす
る方法では該因子のmRNAが非常に微量であり、他の多く
のmRNAの存在のために該因子の遺伝子をクローニングす
ることが困難であり、従って該因子もまた単離取得する
ことが困難である。これらの理由からマウスをはじめと
する哺乳動物のIL4のアミノ酸配列は全く知られていな
い。さらにそれをコードするDNAもまた全く知られてい
ない。
本発明者らはマウスIL4構造及び機能の解明とその有効
利用のために鋭意研究を重ねた結果、全く新しい遺伝子
クローニングの方法（特開昭62−74291号）を用いるこ
とにより本発明を可能にした。
利用のために鋭意研究を重ねた結果、全く新しい遺伝子
クローニングの方法（特開昭62−74291号）を用いるこ
とにより本発明を可能にした。
本発明に含まれる方法を用いて、マウスIL4の遺伝子を
クローニングし、該因子をコードするmRNAやDNA及び該
因子を得ることができる。以下に具体的方法を示す。
クローニングし、該因子をコードするmRNAやDNA及び該
因子を得ることができる。以下に具体的方法を示す。
抗原とコンカナバリンＡ（ConA）で刺激したB6.C−Ｈ−
2bm122.19T細胞109個からmRNAを分離し、蔗糖勾配法に
より分画し、各分画をアフリカツメガエル卵母細胞内で
翻訳して、翻訳産物のIgG1誘導活性（IL4の主要生理活
性のひとつ）を測定する事によりIL4をコードするmRNA
を含む分画を得る（図−１）。この分画を鋳型にして合
成した、cDNAをSP6プロモーターの下流に持つプラスミ
ド（図−２）で、cDNAライブラリーを作製する。このcD
NAライブラリーを制限酵素で処理した後、SP6RNAポリメ
ラーゼで試験管内転写を行いmRNAを合成する。アフリカ
ツメガエル卵母細胞に合成mRNAを注入し、その産物のIg
G1誘導活性を測定するという方法で、cDNAライブラリー
よりIL4の遺伝子をクローニングする。このようにして
得られるクローンからIL4をコードするDNAを得、さらに
SP6RNAポリメラーゼで試験管内転写してmRNAを得る。こ
のDNAまたはmRNAを用いて公知の方法、例えば適当な真
該細胞プロモーターの下流にIL4遺伝子を持ったプラス
ミドを作製し、真該細胞に形質導入して、または適当な
原核細胞プロモーターの下流にIL4遺伝子を持ったプラ
スミドを作製し、原該細胞に形質導入して、または合成
mRNAを真該細胞、例えばアフリカツメガエルの卵母細胞
に注入して、IL4蛋白質を産生させる事ができる。
2bm122.19T細胞109個からmRNAを分離し、蔗糖勾配法に
より分画し、各分画をアフリカツメガエル卵母細胞内で
翻訳して、翻訳産物のIgG1誘導活性（IL4の主要生理活
性のひとつ）を測定する事によりIL4をコードするmRNA
を含む分画を得る（図−１）。この分画を鋳型にして合
成した、cDNAをSP6プロモーターの下流に持つプラスミ
ド（図−２）で、cDNAライブラリーを作製する。このcD
NAライブラリーを制限酵素で処理した後、SP6RNAポリメ
ラーゼで試験管内転写を行いmRNAを合成する。アフリカ
ツメガエル卵母細胞に合成mRNAを注入し、その産物のIg
G1誘導活性を測定するという方法で、cDNAライブラリー
よりIL4の遺伝子をクローニングする。このようにして
得られるクローンからIL4をコードするDNAを得、さらに
SP6RNAポリメラーゼで試験管内転写してmRNAを得る。こ
のDNAまたはmRNAを用いて公知の方法、例えば適当な真
該細胞プロモーターの下流にIL4遺伝子を持ったプラス
ミドを作製し、真該細胞に形質導入して、または適当な
原核細胞プロモーターの下流にIL4遺伝子を持ったプラ
スミドを作製し、原該細胞に形質導入して、または合成
mRNAを真該細胞、例えばアフリカツメガエルの卵母細胞
に注入して、IL4蛋白質を産生させる事ができる。
遺伝子DNAの塩基配列は、ファージM13を用いたジデオキ
シヌクレオチド合成鎖停止法により決定される。
シヌクレオチド合成鎖停止法により決定される。
マウス以外の哺乳動物のIL4及び該因子をコードするmRN
AやDNAは、相当する哺乳動物から単離された、IL4を分
泌する細胞（例えば、ConAで刺激されたヒトＴ細胞）を
用いて前記した本発明の一連の遺伝子操作技術と同様の
操作に付すことにより得ることができる。さらに、前記
方法によって得られるマウスIL4をコードするDNAをプロ
ーブとして、マウス以外の哺乳動物のIL4を分離するこ
とが可能である。
AやDNAは、相当する哺乳動物から単離された、IL4を分
泌する細胞（例えば、ConAで刺激されたヒトＴ細胞）を
用いて前記した本発明の一連の遺伝子操作技術と同様の
操作に付すことにより得ることができる。さらに、前記
方法によって得られるマウスIL4をコードするDNAをプロ
ーブとして、マウス以外の哺乳動物のIL4を分離するこ
とが可能である。
IL4は、生体の免疫応答を改善するため、そのような改
善が望まれるような疾患、例えば感染症、エイズ、機能
的免疫不全症などの治療や予防のために用いることがで
きる。また術後患者に対する薬剤としても用いることが
できる。このような場合症状や年令や体重などによって
投与量は異なるが、0.1μｇから1mgの範囲で静脈内投与
することができる。
善が望まれるような疾患、例えば感染症、エイズ、機能
的免疫不全症などの治療や予防のために用いることがで
きる。また術後患者に対する薬剤としても用いることが
できる。このような場合症状や年令や体重などによって
投与量は異なるが、0.1μｇから1mgの範囲で静脈内投与
することができる。
さらにIL4は、それを抗原としてまたはその一部アミノ
酸配列を合成してこれを抗原としてIL4に対する抗体を
作成することができる。さらに該因子をモデルとしてポ
リペプチドを合成してIL4様化合物を得ることができ
る。また該因子をリガンドとしてIL4のレセプターを分
離精製することができる、など種々の目的のために利用
することができる。
酸配列を合成してこれを抗原としてIL4に対する抗体を
作成することができる。さらに該因子をモデルとしてポ
リペプチドを合成してIL4様化合物を得ることができ
る。また該因子をリガンドとしてIL4のレセプターを分
離精製することができる、など種々の目的のために利用
することができる。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する
が、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
が、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１ IL4産生Ｔ細胞の調整 Ｔ細胞（B6.C−Ｈ−2bm122.19T細胞，カロリンスカ研究
所）を培地［５％FCS,5×10-5M ２−メルカプトエタノ
ール,15％のコンカナバリンＡ刺激したラット脾臓細胞
培養上清（ラットConA上清）を含むRPMI−1640］中で、
Ｘ線照射（2000R）したマウスB10脾臓細胞と混合培養し
て、アロ抗原刺激を行った。
所）を培地［５％FCS,5×10-5M ２−メルカプトエタノ
ール,15％のコンカナバリンＡ刺激したラット脾臓細胞
培養上清（ラットConA上清）を含むRPMI−1640］中で、
Ｘ線照射（2000R）したマウスB10脾臓細胞と混合培養し
て、アロ抗原刺激を行った。
アロ抗原刺激された2.19T細胞を１×106個/mlの濃度で
培地［５％FCS,5×10-5M ２−メルカプトエタノール,1
0％ラットConA上清を含むRPMI−1640］に懸濁し、３μg
/mlのConAを加えて、37℃５％CO2存在下で６時間培養
後、細胞を集めて、細胞ペレットを液体窒素中で凍結保
存した。こうして109個の細胞を集めた。
培地［５％FCS,5×10-5M ２−メルカプトエタノール,1
0％ラットConA上清を含むRPMI−1640］に懸濁し、３μg
/mlのConAを加えて、37℃５％CO2存在下で６時間培養
後、細胞を集めて、細胞ペレットを液体窒素中で凍結保
存した。こうして109個の細胞を集めた。
実施例２ IL4をコードするmRNAの分離 実施例１で得たＴ細胞（109個）を、グアニジウムチオ
シアネート溶液［5Mグアニジウムチオシアネート,25mM
クエン酸ナトリウム,0.5％ N−ラウロイルザルコシン酸
ナトリウム,0.1M ２−メルカプトエタノール］中で、
テフロンホモジナイザーによって破壊変性した後、5.7M
CsCl−0.1M EDTA溶液上に重層して、RPS 28Aロータ
ー（日立製）を用いて15℃で28000rpm 20時間遠心し
て、RNA沈澱を得た。
シアネート溶液［5Mグアニジウムチオシアネート,25mM
クエン酸ナトリウム,0.5％ N−ラウロイルザルコシン酸
ナトリウム,0.1M ２−メルカプトエタノール］中で、
テフロンホモジナイザーによって破壊変性した後、5.7M
CsCl−0.1M EDTA溶液上に重層して、RPS 28Aロータ
ー（日立製）を用いて15℃で28000rpm 20時間遠心し
て、RNA沈澱を得た。
このRNAを高温溶液［0.5M KCl,10mM Tris・HCl（pH7.
4）,0.1mM EDTA］中で、オリゴ（dT）セルロースカラ
ムに吸着させ、polyA+RNAを低温溶液［10mM Tris・HCl
（pH7.4）,0.1mM EDTA］で溶出させることにより、pol
yA+RNA300μｇを分取した。
4）,0.1mM EDTA］中で、オリゴ（dT）セルロースカラ
ムに吸着させ、polyA+RNAを低温溶液［10mM Tris・HCl
（pH7.4）,0.1mM EDTA］で溶出させることにより、pol
yA+RNA300μｇを分取した。
このpolyA+RNA5〜22％の蔗糖密度勾配遠心距離［RPS40
ローター（日立製）を用いて、15℃36Krpm 15時間遠
心］して、16の分画に分画した。各分画のmRNAをエタノ
ール沈澱させた後、蒸溜水に溶かし、１μg/μｌの濃度
に調整した。
ローター（日立製）を用いて、15℃36Krpm 15時間遠
心］して、16の分画に分画した。各分画のmRNAをエタノ
ール沈澱させた後、蒸溜水に溶かし、１μg/μｌの濃度
に調整した。
成熟したメスのアフリカツメガエル（Xenopuslaevis）
を解剖して卵母細胞を取り出し、修正バース（Barth′
ｓ）培養液（Colman,A.,Transcription and Translatio
n−a practical approachpp.291編者Hames,B.D.,及びHi
ggins,S.J.,IRLPress,1984）中で１個ずつに分離した。
を解剖して卵母細胞を取り出し、修正バース（Barth′
ｓ）培養液（Colman,A.,Transcription and Translatio
n−a practical approachpp.291編者Hames,B.D.,及びHi
ggins,S.J.,IRLPress,1984）中で１個ずつに分離した。
mRNAの各分画試料を70ngずつ個々の卵母細胞に、キャピ
ラリーとマイクロマニピュレーターを用いて実体顕微鏡
下に注入した。各試料につき20個の卵母細胞を使用し、
10μｌ修正バース培養液／卵母細胞で20℃、36時間培養
した。この後培養上清をエッペンドルフ遠心機で12000r
pm 4℃20分間遠心して、その上清を回収し、ガス滅菌し
たミリポアフィルターを通した。
ラリーとマイクロマニピュレーターを用いて実体顕微鏡
下に注入した。各試料につき20個の卵母細胞を使用し、
10μｌ修正バース培養液／卵母細胞で20℃、36時間培養
した。この後培養上清をエッペンドルフ遠心機で12000r
pm 4℃20分間遠心して、その上清を回収し、ガス滅菌し
たミリポアフィルターを通した。
マウス（C57BL 雌６週令〜10週令）の脾臓を取り出し
常法によりリンパ球を採取した。RPMI−1640−２％FCS
で２回洗浄し、４×105個/mlで培地［RPMI 1640,15％FC
S,5×10-5M ２−メルカプトエタノール］に懸濁してLP
S（Lipopolysaccharide E.coli.0111:B4,ディフコ（Dif
co）社製）を50μg/mlの濃度で培地に加えた。96穴のマ
イクロタイタープレートに細胞懸濁液を一穴に200μｌ
ずつ入れ、24時間後、先に得たmRNAの各分画を注入した
卵母細胞の培養上清を、20μｌそれぞれ加え、４〜５日
培養した。培養後、穴ごとに、IgG1産生細胞数とIgG3産
生細胞数を、リバース プラーク アッセイ（reverse
plaque assay）（Gronowicz,E.,らEur.J.Immunol.,６,5
88,1976）で測定した。分画8,9（7.5−11s付近）に強い
IgG1誘導活性（IL4の主要生理活性のひとつ）を認めた
（図−１）。
常法によりリンパ球を採取した。RPMI−1640−２％FCS
で２回洗浄し、４×105個/mlで培地［RPMI 1640,15％FC
S,5×10-5M ２−メルカプトエタノール］に懸濁してLP
S（Lipopolysaccharide E.coli.0111:B4,ディフコ（Dif
co）社製）を50μg/mlの濃度で培地に加えた。96穴のマ
イクロタイタープレートに細胞懸濁液を一穴に200μｌ
ずつ入れ、24時間後、先に得たmRNAの各分画を注入した
卵母細胞の培養上清を、20μｌそれぞれ加え、４〜５日
培養した。培養後、穴ごとに、IgG1産生細胞数とIgG3産
生細胞数を、リバース プラーク アッセイ（reverse
plaque assay）（Gronowicz,E.,らEur.J.Immunol.,６,5
88,1976）で測定した。分画8,9（7.5−11s付近）に強い
IgG1誘導活性（IL4の主要生理活性のひとつ）を認めた
（図−１）。
実施例３ cDNAライブラリーの作製 （ｉ）ベクター・プライマーDNAの作製 プラスミドDNA pSP65［プロメガ バイオテク（Promeg
a Biotec）社製品］より制限酵素EcoRI,HindIIIでポリ
リンカーDNAを切り出し、ポリリンカーDNAをクレノー断
片で処理後、両端に５′末端をリン酸化したBamHIリン
カーDNAをT4DNAリガーゼを用いて結合し、その後BamHI
で切断してポリリンカーDNAを得た。両端にBamHI断端を
持つポリリンカーDNAは合成ヌクレオチドを使用しても
よい。
a Biotec）社製品］より制限酵素EcoRI,HindIIIでポリ
リンカーDNAを切り出し、ポリリンカーDNAをクレノー断
片で処理後、両端に５′末端をリン酸化したBamHIリン
カーDNAをT4DNAリガーゼを用いて結合し、その後BamHI
で切断してポリリンカーDNAを得た。両端にBamHI断端を
持つポリリンカーDNAは合成ヌクレオチドを使用しても
よい。
プラスミドDNA pcDV1（Okayama,H.,ら,Mol.Cell.Biol.,
３,280,1983）に制限酵素BamHIを37℃、１時間作用させ
て、pcDV1を切断した。反応液30μｌ［２μg pcDV1,10m
M Tris・HCl（pH8.0）,7mM MgCl2,100mM NaCl,2mM
２−メルカプトエタノール,0.01％ウシ血清アルブミン
（BSA）,BamHI ６ユニット］をフェノール・クロロホ
ルムで抽出後、エタノールでDNAを沈澱させた。エタノ
ール洗浄後乾燥させ、100μｌの10mM Tris・HCl（pH）
8.0に溶かし、0.4ユニットのアルカリフオスフアターゼ
を加え、60℃で１時間反応させた。反応後をフェノール
・クロロホルムで抽出後、エタノールでDNAを沈澱させ
た。得られたDNAの１μｇと先に得たポリリンカーDNA0.
5μｇを、10μｌのライゲーション（ligation）反応液
［50mM Tris・HCl（pH7.4）,10mM MgCl2,10mMDTT,1mM
ATP］中で、５ユニットのT4DNAリガーゼと、15℃で６
時間反応させてポリリンカーDNAが挿入されたpcDV1（pc
DV1−PL）を得た。得られたpcDV1−PLを用いて、大腸菌
HB101を常法（Mandlら,J.MOl.Biol.,53,154,1970）で形
質転換した。形質転換株のうちpcDV1−PLを持つ株を選
択し、該プラスミドDNAを常法により分離した。
３,280,1983）に制限酵素BamHIを37℃、１時間作用させ
て、pcDV1を切断した。反応液30μｌ［２μg pcDV1,10m
M Tris・HCl（pH8.0）,7mM MgCl2,100mM NaCl,2mM
２−メルカプトエタノール,0.01％ウシ血清アルブミン
（BSA）,BamHI ６ユニット］をフェノール・クロロホ
ルムで抽出後、エタノールでDNAを沈澱させた。エタノ
ール洗浄後乾燥させ、100μｌの10mM Tris・HCl（pH）
8.0に溶かし、0.4ユニットのアルカリフオスフアターゼ
を加え、60℃で１時間反応させた。反応後をフェノール
・クロロホルムで抽出後、エタノールでDNAを沈澱させ
た。得られたDNAの１μｇと先に得たポリリンカーDNA0.
5μｇを、10μｌのライゲーション（ligation）反応液
［50mM Tris・HCl（pH7.4）,10mM MgCl2,10mMDTT,1mM
ATP］中で、５ユニットのT4DNAリガーゼと、15℃で６
時間反応させてポリリンカーDNAが挿入されたpcDV1（pc
DV1−PL）を得た。得られたpcDV1−PLを用いて、大腸菌
HB101を常法（Mandlら,J.MOl.Biol.,53,154,1970）で形
質転換した。形質転換株のうちpcDV1−PLを持つ株を選
択し、該プラスミドDNAを常法により分離した。
pcDV1−PL200μｇに350ユニットの制限酵素Kpn Iを反応
液400μｌ［6mM Tris・HCl（pH7.5）,6mM MgCl2,6mM
２−メルカプトエタノール,0.02％BSA］で作用させ
て、37℃、５時間反応させた。反応液をフェノール・ク
ロロホルムで抽出後、エタノール沈澱（２回）及び70％
エタノール洗浄を行ってDNAを回収した。
液400μｌ［6mM Tris・HCl（pH7.5）,6mM MgCl2,6mM
２−メルカプトエタノール,0.02％BSA］で作用させ
て、37℃、５時間反応させた。反応液をフェノール・ク
ロロホルムで抽出後、エタノール沈澱（２回）及び70％
エタノール洗浄を行ってDNAを回収した。
DNAのKpn I断端にターミナルトランスフェラーゼ（TTas
e）を反応液200μｌ［140mMカコジル酸ナトリウム,30mM
Tris・HCl（pH6.8）,1mM CoCl2,0.1mMジチオスレイ
トール（DTT）,0.2mM dTT（3H−dTTP ４μCi含有）,T
Tase108ユニット］中で作用させて、10分おきに、3H−d
TTPの取りこみを測定して、dT鎖伸長をモニターしなが
ら、平均長45塩基のdT鎖を付加した。0.2M EDTA20μｌ
と10％SDS 10μｌを加えて反応をとめ、フェノール・
クロロホルムで抽出、エタノール沈澱及びエタノール洗
浄してDNAを回収した。
e）を反応液200μｌ［140mMカコジル酸ナトリウム,30mM
Tris・HCl（pH6.8）,1mM CoCl2,0.1mMジチオスレイ
トール（DTT）,0.2mM dTT（3H−dTTP ４μCi含有）,T
Tase108ユニット］中で作用させて、10分おきに、3H−d
TTPの取りこみを測定して、dT鎖伸長をモニターしなが
ら、平均長45塩基のdT鎖を付加した。0.2M EDTA20μｌ
と10％SDS 10μｌを加えて反応をとめ、フェノール・
クロロホルムで抽出、エタノール沈澱及びエタノール洗
浄してDNAを回収した。
次に、このDNAを200ユニットの制限酵素EcoRIで37℃、
５時間消化し、反応液［50mM Tris・HCl（pH7.5）,7mM
MgCl2,100mM NaCl,7mM2−メルカプトエタノール,0.0
1％ BSA］を１％アガロースゲル上で電気泳動し、大き
い方のフラグメントをDEAE−ペーパー法（Dretzen,G.,
らAnal.Biochem.,112,295,1981）で分取した。
５時間消化し、反応液［50mM Tris・HCl（pH7.5）,7mM
MgCl2,100mM NaCl,7mM2−メルカプトエタノール,0.0
1％ BSA］を１％アガロースゲル上で電気泳動し、大き
い方のフラグメントをDEAE−ペーパー法（Dretzen,G.,
らAnal.Biochem.,112,295,1981）で分取した。
得られたDNAフラグメントを400μｌの1MNaCl−10mM Tr
is・HCl（pH7.4）−1mM EDTAに溶かし、０℃に冷やし
た。
is・HCl（pH7.4）−1mM EDTAに溶かし、０℃に冷やし
た。
1M NaCl−10mM Tris・HCl（pH7.4）−1mM EDTAで平
衡化した0.5mlのオリゴdAカラムに吸着させ、1MNaCl−T
E溶液30mlで洗った後、室温にもどした。65℃の蒸溜水
で溶出させ、溶出液をフェノール・クロロホルムで抽出
して、エタノール沈澱を２回くり返し、エタノール洗浄
してベクター・プライマーDNAを得た。
衡化した0.5mlのオリゴdAカラムに吸着させ、1MNaCl−T
E溶液30mlで洗った後、室温にもどした。65℃の蒸溜水
で溶出させ、溶出液をフェノール・クロロホルムで抽出
して、エタノール沈澱を２回くり返し、エタノール洗浄
してベクター・プライマーDNAを得た。
（ii）リンカーDNAの作製 プラスミドDNA pSP−62−PL（NEN社の製品）に、制限
酵素、XbaI及びHindIIIを20μｌの反応液［３μｇ pSP
−62−PL,10mM Tris・HCl（pH7.5）,7mM MgCl2,100mM
NaCl,7mM2−メルカプトエタノール,0.01％ BSA,XbaI
40ユニット,HindIII ６ユニット］中で37℃、２時間作
用させて、pSP−62−PL DNA中のポリリンカー部分のXb
aI及びHindIII切断部位を切断した。このあと同反応液
に、dATP,dCTP,dGTP,dTTPの混合液（それぞれ2mM）を４
μｌ加え、クレノー断片を３ユニット加えて、20℃、30
分反応させた。反応液をフェノール・クロロホルムで抽
出後、エタノールでDNAを沈澱させた。このうち250ngの
DNAを10μｌのライゲーション溶液［50mM Tris・HCl
（pH7.4）,10mM MgCl2,10mM DTT,1mM ATP］中で、５
ユニットのT4DNAリガーゼと15℃で６時間反応させ環状
化した後、大腸菌HB101を形質転換した。アンピシリン
耐性をマーカーに選択された形質転換株のうち、pSP−6
5−PLのポリリンカ−（polylinker）中HindIII切断認識
部位からSal I切断認識部位までが欠失したDNAを持つ株
を選び、該DNAを常法により分離した。
酵素、XbaI及びHindIIIを20μｌの反応液［３μｇ pSP
−62−PL,10mM Tris・HCl（pH7.5）,7mM MgCl2,100mM
NaCl,7mM2−メルカプトエタノール,0.01％ BSA,XbaI
40ユニット,HindIII ６ユニット］中で37℃、２時間作
用させて、pSP−62−PL DNA中のポリリンカー部分のXb
aI及びHindIII切断部位を切断した。このあと同反応液
に、dATP,dCTP,dGTP,dTTPの混合液（それぞれ2mM）を４
μｌ加え、クレノー断片を３ユニット加えて、20℃、30
分反応させた。反応液をフェノール・クロロホルムで抽
出後、エタノールでDNAを沈澱させた。このうち250ngの
DNAを10μｌのライゲーション溶液［50mM Tris・HCl
（pH7.4）,10mM MgCl2,10mM DTT,1mM ATP］中で、５
ユニットのT4DNAリガーゼと15℃で６時間反応させ環状
化した後、大腸菌HB101を形質転換した。アンピシリン
耐性をマーカーに選択された形質転換株のうち、pSP−6
5−PLのポリリンカ−（polylinker）中HindIII切断認識
部位からSal I切断認識部位までが欠失したDNAを持つ株
を選び、該DNAを常法により分離した。
該プラスミドDNAを制限酵素Sal Iで37℃、２時間消化し
た。この反応液30μｌ［プラスミドDNA2μg,10mM Tris
・HClpH7.5,7mM MgCl2,175mM NaCl,0.2mM EDTA,7mM
２−メルカプトエタノール,0.01％ BSA,Sal I 16ユ
ニット］にdATP,dCTP,dGTP,dTTPの混合液（それぞれ2m
M）を５μｌ加え、クレノー断片を３ユニット加えて、2
0℃、30分反応させた。反応液をフェノール・クロロホ
ルムで抽出し、エタノールでDNAを沈澱させた。
た。この反応液30μｌ［プラスミドDNA2μg,10mM Tris
・HClpH7.5,7mM MgCl2,175mM NaCl,0.2mM EDTA,7mM
２−メルカプトエタノール,0.01％ BSA,Sal I 16ユ
ニット］にdATP,dCTP,dGTP,dTTPの混合液（それぞれ2m
M）を５μｌ加え、クレノー断片を３ユニット加えて、2
0℃、30分反応させた。反応液をフェノール・クロロホ
ルムで抽出し、エタノールでDNAを沈澱させた。
該DNA2μｇと５′末端をリン酸化したHindIIIリンカーD
NA0.45μｇを前記したライゲーション溶液（前記に同
じ）20μｌ中で20ユニットのT4DNAリガーゼを加えて15
℃,20時間反応させた後、大腸菌HB101を形質転換した。
形質転換株のうち、Sal I切断認識部位がなくなり、Hin
dIII切断認識部位が形成されたプラスミドDNAを持つ株
を選択し、該プラスミドDNAを、１の培地で培養した
菌体より、常法により分離した（図−２中のpSP62−K
2）。
NA0.45μｇを前記したライゲーション溶液（前記に同
じ）20μｌ中で20ユニットのT4DNAリガーゼを加えて15
℃,20時間反応させた後、大腸菌HB101を形質転換した。
形質転換株のうち、Sal I切断認識部位がなくなり、Hin
dIII切断認識部位が形成されたプラスミドDNAを持つ株
を選択し、該プラスミドDNAを、１の培地で培養した
菌体より、常法により分離した（図−２中のpSP62−K
2）。
pSP62−K2 100μｇに120ユニットのSac Iを反応液400
μｌ［10mM Tris・HCl pH7.5,7mM MgCl2,7mM2−メル
カプトエタノール］で37℃、1.5時間反応させた後、フ
ェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈澱及びエタ
ノール洗浄を行ってDNAを回収した。
μｌ［10mM Tris・HCl pH7.5,7mM MgCl2,7mM2−メル
カプトエタノール］で37℃、1.5時間反応させた後、フ
ェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈澱及びエタ
ノール洗浄を行ってDNAを回収した。
得られたDNAを反応液［DNA 100μg,140mMカコジル酸ナ
トリウム,30mM Tris・HCl（pH6.8）,1mM CoCl2,0.1mM
DTT,0.1mM GTP（3H−dGTP2μCi含有）,TTase27ユニ
ット］中、37℃で20分間反応させ、平均長14塩基のdG鎖
がSac I断端に付加された時点で0.2MEDTA10μl,10％ S
DS ５μｌを加えて反応を停止し、フェノール・クロロ
ホルム抽出、エタノール沈澱及びエタノール洗浄してDN
A［図−２中の（Ｉ）］を回収した。
トリウム,30mM Tris・HCl（pH6.8）,1mM CoCl2,0.1mM
DTT,0.1mM GTP（3H−dGTP2μCi含有）,TTase27ユニ
ット］中、37℃で20分間反応させ、平均長14塩基のdG鎖
がSac I断端に付加された時点で0.2MEDTA10μl,10％ S
DS ５μｌを加えて反応を停止し、フェノール・クロロ
ホルム抽出、エタノール沈澱及びエタノール洗浄してDN
A［図−２中の（Ｉ）］を回収した。
得られたDNAを反応液［10mM Tris・HCl（pH7.5）,7mM
MgCl2,60mM NaCl,HindIII 50ユニット］中、37℃、
２時間反応させた後、1.5％アガロースゲル上で電気泳
動し、小さい方のフラグメント（約500塩基対）をDEAE
−ペーパー法で分取してリンカーDNAを得た。
MgCl2,60mM NaCl,HindIII 50ユニット］中、37℃、
２時間反応させた後、1.5％アガロースゲル上で電気泳
動し、小さい方のフラグメント（約500塩基対）をDEAE
−ペーパー法で分取してリンカーDNAを得た。
（iii）cDNAの合成 実施例２で得たpolyA+RNA ３μｇを、0.7μｇの（ｉ）
で得たベクター・プライマーDNAを用いて、20μｌの反
応液［50mMTris・HCl（pH8.3）,8mMMgCl2,30mM KCl,30
mM DTT,2mM dNTP（dATP,dGTP,dCTP及びdTTPのそれぞ
れ）,10μCiα−32P−dCTP］中で、５ユニットの逆転写
酵素を加えて、32P−dCTPの取込みをモニターしながら
反応させ、前記と同様の後処理（反応の停止，抽出，沈
澱及び洗浄）をしてDNAを回収した。
で得たベクター・プライマーDNAを用いて、20μｌの反
応液［50mMTris・HCl（pH8.3）,8mMMgCl2,30mM KCl,30
mM DTT,2mM dNTP（dATP,dGTP,dCTP及びdTTPのそれぞ
れ）,10μCiα−32P−dCTP］中で、５ユニットの逆転写
酵素を加えて、32P−dCTPの取込みをモニターしながら
反応させ、前記と同様の後処理（反応の停止，抽出，沈
澱及び洗浄）をしてDNAを回収した。
得られたDNAを、dT鎖又はdG鎖の付加のために前記した
と同様にして、平均長14塩基のdC鎖が付加されたDNAを
得た。
と同様にして、平均長14塩基のdC鎖が付加されたDNAを
得た。
得られたDNAを反応液［6mM Tris・HCl（pH7.5）,6mM
MgCl2,6mM ２−メルカプトエタノール,50mMNaCl,0.01
％BSA］中で、５ユニットのHindIIIを加え37℃で１時間
消化し、同様の後処理を行なってDNA［図−２中の（I
I）］を回収した。
MgCl2,6mM ２−メルカプトエタノール,50mMNaCl,0.01
％BSA］中で、５ユニットのHindIIIを加え37℃で１時間
消化し、同様の後処理を行なってDNA［図−２中の（I
I）］を回収した。
得られたDNAと（ii）で得たリンカーDNAとを反応液100
μｌ［20mM Tris・HCl（pH7.5）,4mM MgCl2・10mM（N
H4）2SO4,0.1M KCl,0.1mMβ−NAD,0.01％BSA,0.6μg
E.coliDNAリガーゼ］中、12℃で一夜反応し、得られた
反応液に次の成分を指定の濃度になるように追加した
［dATP,dCTP,dGTP及びdTTPそれぞれ 40μM,0.15mM β
−NAD,0.4ユニットE.coli DNAリガーゼ（追加分）,0.3
ユニットE.coli DNAポリメラーゼI,1ユニットE.coli RN
aseH］。この反応液を12℃で１時間及び25℃で１時間反
応させて、cDNAを持つ目的とするプラスミドDNAを含む
反応液を得た。得られた反応液はそのまま次の操作へ供
した。
μｌ［20mM Tris・HCl（pH7.5）,4mM MgCl2・10mM（N
H4）2SO4,0.1M KCl,0.1mMβ−NAD,0.01％BSA,0.6μg
E.coliDNAリガーゼ］中、12℃で一夜反応し、得られた
反応液に次の成分を指定の濃度になるように追加した
［dATP,dCTP,dGTP及びdTTPそれぞれ 40μM,0.15mM β
−NAD,0.4ユニットE.coli DNAリガーゼ（追加分）,0.3
ユニットE.coli DNAポリメラーゼI,1ユニットE.coli RN
aseH］。この反応液を12℃で１時間及び25℃で１時間反
応させて、cDNAを持つ目的とするプラスミドDNAを含む
反応液を得た。得られた反応液はそのまま次の操作へ供
した。
（iv）cDNAライブラリーの作製 大腸菌HB101のコンピテント細胞を、（iii）で得たcDNA
を持ったプラスミドDNAを用いて常法により形質転換し
てcDNAライブラリーを得た。
を持ったプラスミドDNAを用いて常法により形質転換し
てcDNAライブラリーを得た。
得られたcDNAライブラリーから、それぞれ１グループに
つき250個の独立な形質転換菌から成るグループを16グ
ループ作成した。
つき250個の独立な形質転換菌から成るグループを16グ
ループ作成した。
実施例４ 試験管内転写 （ｉ）鋳型DNAの調整及び制限酵素の選定 SP6ポリメラーゼで転写を行なう時、転写の終末をつく
るために、cDNA部分の下流でDNAを切断する必要があ
る。
るために、cDNA部分の下流でDNAを切断する必要があ
る。
本cDNAクローニングベクターには、この目的のためにcD
NA部分の下流にポリリンカーが挿入してある。このう
ち、目的とするcDNA内に切断部位を持たない制限酵素を
選ばなければならない。
NA部分の下流にポリリンカーが挿入してある。このう
ち、目的とするcDNA内に切断部位を持たない制限酵素を
選ばなければならない。
実施例３の（iv）で得たcDNAライブラリーから前記と同
様の操作をしてプラスミドDNAを分取し、制限酵素Pst
I,Sac I及びSal Iの３種類のそれぞれを用いて消化した
のち、フェノール・クロロホルム抽出，エタノール沈澱
及び乾燥を行って、得られたDNAを試験管内転写の鋳型D
NAとした。
様の操作をしてプラスミドDNAを分取し、制限酵素Pst
I,Sac I及びSal Iの３種類のそれぞれを用いて消化した
のち、フェノール・クロロホルム抽出，エタノール沈澱
及び乾燥を行って、得られたDNAを試験管内転写の鋳型D
NAとした。
得られた３種類の鋳型DNAを用いて後述の試験管内転写
を行ったのち実施例２と同様にしてIgG1誘導活性をスク
リーニングした。その結果を表−１に示す。この実験結
果からPst I及びSac Iは不適当であり、Sal Iが適当な
制限酵素であることがわかった。従ってSal Iを用いて
消化して得られるDNAを試験管内転写の鋳型DNAとして以
後用いた。
を行ったのち実施例２と同様にしてIgG1誘導活性をスク
リーニングした。その結果を表−１に示す。この実験結
果からPst I及びSac Iは不適当であり、Sal Iが適当な
制限酵素であることがわかった。従ってSal Iを用いて
消化して得られるDNAを試験管内転写の鋳型DNAとして以
後用いた。
（ii）試験管内転写 室温で、下記の順番に従って速やかに混合し、40℃で１
時間反応させた。
時間反応させた。
1.2回蒸溜水 19.3μｌ 2.5x転写バッファー 10 3.1M DTT 0.5 4.リボヌクレア−ゼインヒビタ−70ユニット／μｌ 0.7
5.γNTPs ４ 6.10mM m7G（５′）ppp（５′）Ｇ ５ 7.1mg/ml BSA ５ 8.鋳型DNA １μg/μｌ ３ 9.α−32P−GTP10000cpm/μｌ ２ 10.SP6 RNAポリメラーゼ15ユニット／μｌ 0.5 総量 50.0μｌ ただし、5x転写バッファーは［200mMTris・HCl（pH7.
5）,30mMMgCl2,10mMスペルミジン］であり、γNTPsは
［それぞれ2.5mMのATP,CTP,GTP及びUTP］であり、m7G
（５′）ppp（５′）Ｇは２個のGTPが５′同士で結合
し、さらに一方のグアニンの７位がメチル化されたもの
で、真該生物mRNAのキャップ構造のアナログである［Ｐ
−Ｌバイオケミカルズ（Biochemicals）の製品］。
5.γNTPs ４ 6.10mM m7G（５′）ppp（５′）Ｇ ５ 7.1mg/ml BSA ５ 8.鋳型DNA １μg/μｌ ３ 9.α−32P−GTP10000cpm/μｌ ２ 10.SP6 RNAポリメラーゼ15ユニット／μｌ 0.5 総量 50.0μｌ ただし、5x転写バッファーは［200mMTris・HCl（pH7.
5）,30mMMgCl2,10mMスペルミジン］であり、γNTPsは
［それぞれ2.5mMのATP,CTP,GTP及びUTP］であり、m7G
（５′）ppp（５′）Ｇは２個のGTPが５′同士で結合
し、さらに一方のグアニンの７位がメチル化されたもの
で、真該生物mRNAのキャップ構造のアナログである［Ｐ
−Ｌバイオケミカルズ（Biochemicals）の製品］。
得られた合成mRNAは、次のようにゲルろ過により、基質
のγNTPsから分離した。1mlの使い捨てシリンダに、TE
バッファー［10mMTris・HCl（pH8.0）,1mM EDTA（pH8.
0）］で平衡化した、セファデックスＧ−50［ファーマ
シア（Pharmacia）社製品］を充填する。
のγNTPsから分離した。1mlの使い捨てシリンダに、TE
バッファー［10mMTris・HCl（pH8.0）,1mM EDTA（pH8.
0）］で平衡化した、セファデックスＧ−50［ファーマ
シア（Pharmacia）社製品］を充填する。
このカラムに上記反応液を供して、1300rpmで４分間遠
心して、溶出液中に合成mRNAを回収した。溶出液中の32
Pのカウントを測定し、合成RNA量を見積もった。上記条
件で1.5〜2.5μｇの合成mRNAが回収された。
心して、溶出液中に合成mRNAを回収した。溶出液中の32
Pのカウントを測定し、合成RNA量を見積もった。上記条
件で1.5〜2.5μｇの合成mRNAが回収された。
得られたmRNAをフェノール処理、エタノール沈澱、乾燥
後、蒸溜水に溶かした（0.3μg/μｌ）。
後、蒸溜水に溶かした（0.3μg/μｌ）。
実施例５ IL4cDNAのスクリーニング 実施例３の（iv）で得た16グループ（１グループがそれ
ぞれ独立な約250個の形質転換株を持つ。）からなるcDN
AライブラリーのそれぞれのグループからcDNAを含むプ
ラスミドDNAを採取し、Sal Iで切断して鋳型とし、試験
管内転写を行ってmRNAを合成し、0.3μg/μｌに調整し
た。それぞれの合成mRNAをアフリカツメガエルの卵母細
胞に注入し、培養上清のIgG1誘導活性を調べた。
ぞれ独立な約250個の形質転換株を持つ。）からなるcDN
AライブラリーのそれぞれのグループからcDNAを含むプ
ラスミドDNAを採取し、Sal Iで切断して鋳型とし、試験
管内転写を行ってmRNAを合成し、0.3μg/μｌに調整し
た。それぞれの合成mRNAをアフリカツメガエルの卵母細
胞に注入し、培養上清のIgG1誘導活性を調べた。
活性陽性の３つのグループのうち１つのグループ（No.
3）のcDNAプラスミドを用いて、大腸菌HB101を形質転換
し、ランダムに400クローンをピックアップし、それぞ
れ30μg/mlのアンピシリンを含むＬ−培地（Luria′s M
edium）0.5ml中に培養した。25のクローンよりそれぞれ
20μｌずつ取り、混合して、１グループ25個のクローン
を含む16のグループを作製した。この16グループについ
て常法により、プラスミドを採取し、250個グループの
時と同様の手順でスクリーニングを続け、16グループ中
２グループにIgG1誘導活性を求めた。
3）のcDNAプラスミドを用いて、大腸菌HB101を形質転換
し、ランダムに400クローンをピックアップし、それぞ
れ30μg/mlのアンピシリンを含むＬ−培地（Luria′s M
edium）0.5ml中に培養した。25のクローンよりそれぞれ
20μｌずつ取り、混合して、１グループ25個のクローン
を含む16のグループを作製した。この16グループについ
て常法により、プラスミドを採取し、250個グループの
時と同様の手順でスクリーニングを続け、16グループ中
２グループにIgG1誘導活性を求めた。
この２グループ（25×２個のクローンよりなる）の全ク
ローンについて、プラスミドDNAを採取し、同様の手順
でスクリーニングし、それぞれのグループに１個ずつIg
G1誘導活性を認めた。
ローンについて、プラスミドDNAを採取し、同様の手順
でスクリーニングし、それぞれのグループに１個ずつIg
G1誘導活性を認めた。
実施例６ IL4DNAの製造 前項で分離したIL4cDNAを持つプラスミドを、それぞれp
SP6K−IIF293,pSP6K−IIF374と命名した。これらプラス
ミドの制限酵素地図は一致していた。そこで、pSP6K−I
IF374を用いて、常法により大腸菌HB101を形質転換し形
質転換菌（あるいは、実施例５におけるIL4cDNAプラス
ミドを持つクローン）をＬ培地中で菌体濃度が８×108/
mlになるまで37℃で振盪培養し、集菌して、常法により
プラスミドpSP6K−IIF374DNAを採取した。
SP6K−IIF293,pSP6K−IIF374と命名した。これらプラス
ミドの制限酵素地図は一致していた。そこで、pSP6K−I
IF374を用いて、常法により大腸菌HB101を形質転換し形
質転換菌（あるいは、実施例５におけるIL4cDNAプラス
ミドを持つクローン）をＬ培地中で菌体濃度が８×108/
mlになるまで37℃で振盪培養し、集菌して、常法により
プラスミドpSP6K−IIF374DNAを採取した。
１の培養液から、2mgのpSP6K−IIF374を得た。
実施例７ IL4cDNAの構造決定 pSP6K−IIF374を、制限酵素BamHIで消化して、電気泳動
後、DEAEペーパー法により、IL4cDNAを含むフラグメン
トを分離した。このBamHIフラグメントの制限酵素地図
を図−３に示した。このBamHIフラグメントを図−３に
示した制限酵素で消化し、各フラグメントM13ファージ
クローニングし、ジデオキシ合成鎖停止法［Sanger,F.,
らProc.Nat.Acad.Sci.USA,74,5463（1977）］により、
各フラグメントの塩基配列を決定した。
後、DEAEペーパー法により、IL4cDNAを含むフラグメン
トを分離した。このBamHIフラグメントの制限酵素地図
を図−３に示した。このBamHIフラグメントを図−３に
示した制限酵素で消化し、各フラグメントM13ファージ
クローニングし、ジデオキシ合成鎖停止法［Sanger,F.,
らProc.Nat.Acad.Sci.USA,74,5463（1977）］により、
各フラグメントの塩基配列を決定した。
シークエンシングの方向と領域は図−３下の矢印に示し
た。
た。
かくして決定されたIL4cDNAの塩基配列と予想される該
因子のアミノ酸配列を図−４に示した。
因子のアミノ酸配列を図−４に示した。
IL4は、分泌タンパク質なので、Ｎ末端側にシグナルペ
プチドを持つと思われる。疎水性度及び従来知られてい
るシグナルペプチドとの類比より推定して、アミノ酸の
１番から15番、あるいは１番から24番までがシグナルペ
プチドであり後で切断される部分と考えられる。
プチドを持つと思われる。疎水性度及び従来知られてい
るシグナルペプチドとの類比より推定して、アミノ酸の
１番から15番、あるいは１番から24番までがシグナルペ
プチドであり後で切断される部分と考えられる。
図−１は16に分画したポリA+RNAの各分画のIgG1誘導活
性（Ａ）と260nmにおける吸光度（Ｂ）を示すグラフで
あり、図中の白棒はIgG1産生細胞数を示し、黒棒はIgG3
産生細胞数を示す。また矢印で示した数字は沈降定数Ｓ
を表わす。さらにR,P,T,M及びＣはそれぞれ以下のもの
を示す； R:2.19T細胞由来の全ポリA+RNAを注入した卵母細胞培養
上清， P:PBS（Phosphate buffer saline）を注入した卵母細胞
培養上清， T:2.19T細胞の培養上清， M:ミエローマTEPC15のポリA+RNA, C:なにも加えない。 図−２はSP6の発現ベクターライブラリー構築のための
図式である。 図−３はpSP6K−IIF374中のcDNAを含むBamHIフラグメン
トの制限酵素地図であり、図中の矢印はシークエンジン
グの方向と範囲を示している。 図−４はマウスIL4のcDNAの塩基配列とアミノ酸配列を
示す。
性（Ａ）と260nmにおける吸光度（Ｂ）を示すグラフで
あり、図中の白棒はIgG1産生細胞数を示し、黒棒はIgG3
産生細胞数を示す。また矢印で示した数字は沈降定数Ｓ
を表わす。さらにR,P,T,M及びＣはそれぞれ以下のもの
を示す； R:2.19T細胞由来の全ポリA+RNAを注入した卵母細胞培養
上清， P:PBS（Phosphate buffer saline）を注入した卵母細胞
培養上清， T:2.19T細胞の培養上清， M:ミエローマTEPC15のポリA+RNA, C:なにも加えない。 図−２はSP6の発現ベクターライブラリー構築のための
図式である。 図−３はpSP6K−IIF374中のcDNAを含むBamHIフラグメン
トの制限酵素地図であり、図中の矢印はシークエンジン
グの方向と範囲を示している。 図−４はマウスIL4のcDNAの塩基配列とアミノ酸配列を
示す。
Claims (8)
- 【請求項１】マウスインターロイキン４活性を有するポ
リペプチドであって、次のアミノ酸配列： Cys Asp Lys Asn His Leu Arg Glu Ile Ile Gly Ile Leu Asn Glu Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Cys Thr Glu Met Asp Val Pro Asn Val Leu Thr Ala Thr Lys Asn Thr Thr Glu Ser Glu Leu Val Cys Arg Ala Ser Lys Val Leu Arg Ile Phe Tyr Leu Lys His Gly Lys Thr Pro Cys Leu Lys Lys Asn Ser Ser Val Leu Met Glu Leu Gln Arg Leu Phe Arg Ala Phe Arg Cys Leu Asp Ser Ser Ile Ser Cys Thr Met Asn Glu Ser Lys Ser Thr Ser Leu Lys Asp Phe Leu Glu Ser Leu Lys Ser Ile Met Gln Met Asp Tyr Ser を含むことを特徴とするポリペプチドをコードするDN
A。 - 【請求項２】次のアミノ酸配列： Glu Cys Thr Arg Ser His Ile His Gly Cys Asp Lys Asn His Leu Arg Glu Ile Ile Gly Ile Leu Asn Glu Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Cys Thr Glu Met Asp Val Pro Asn Val Leu Thr Ala Thr Lys Asn Thr Thr Glu Ser Glu Leu Val Cys Arg Ala Ser Lys Val Leu Arg Ile Phe Tyr Leu Lys His Gly Lys Thr Pro Cys Leu Lys Lys Asn Ser Ser Val Leu Met Glu Leu Gln Arg Leu Phe Arg Ala Phe Arg Cys Leu Asp Ser Ser Ile Ser Cys Thr Met Asn Glu Ser Lys Ser Thr Ser Leu Lys Asp Phe Leu Glu Ser Leu Lys Ser Ile Met Gln Met Asp Tyr Ser を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のポ
リペプチドをコードするDNA。 - 【請求項３】次のアミノ酸配列： Met Gly Leu Asn Pro Glu Leu Val Val Ile Leu Leu Phe Phe Leu Glu Cys Thr Arg Ser His Ile His Gly Cys Asp Lys Asn His Leu Arg Glu Ile Ile Gly Ile Leu Asn Glu Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Cys Thr Glu Met Asp Val Pro Asn Val Leu Thr Ala Thr Lys Asn Thr Thr Glu Ser Glu Leu Val Cys Arg Ala Ser Lys Val Leu Arg Ile Phe Tyr Leu Lys His Gly Lys Thr Pro Cys Leu Lys Lys Asn Ser Ser Val Leu Met Glu Leu Gln Arg Leu Phe Arg Ala Phe Arg Cys Leu Asp Ser Ser Ile Ser Cys Thr Met Asn Glu Ser Lys Ser Thr Ser Leu Lys Asp Phe Leu Glu Ser Leu Lys Ser Ile Met Gln Met Asp Tyr Ser を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項または第
２項記載のポリペプチドをコードするDNA。 - 【請求項４】次の塩基配列： TGC GAC AAA AAT CAC TTG AGA GAG ATC ATC GGC ATT TTG AAC GAG GTC ACA GGA GAA GGG ACG CCA TGC ACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC CTC ACA GCA ACG AAG AAC ACC ACA GAG AGT GAG CTC GTC TGT AGG GCT TCC AAG GTG CTT CGC ATA TTT TAT TTA AAA CAT GGG AAA ACT CCA TGC TTG AAG AAG AAC TCT AGT GTT CTC ATG GAG CTG CAG AGA CTC TTT CGG GCT TTT CGA TGC CTG GAT TCA TCG ATA AGC TGC ACC ATG AAT GAG TCC AAG TCC ACA TCA CTG AAA GAC TTC CTG GAA AGC CTA AAG AGC ATC ATG CAA ATG GAT TAC TCG を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のDN
A。 - 【請求項５】次の塩基配列： GAA TGT ACC AGG AGC CAT ATC CAC GGA TGC GAC AAA AAT CAC TTG AGA GAG ATC ATC GGC ATT TTG AAC GAG GTC ACA GGA GAA GGG ACG CCA TGC ACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC CTC ACA GCA ACG AAG AAC ACC ACA GAG AGT GAG CTC GTC TGT AGG GCT TCC AAG GTG CTT CGC ATA TTT TAT TTA AAA CAT GGG AAA ACT CCA TGC TTG AAG AAG AAC TCT AGT GTT CTC ATG GAG CTG CAG AGA CTC TTT CGG GCT TTT CGA TGC CTG GAT TCA TCG ATA AGC TGC ACC ATG AAT GAG TCC AAG TCC ACA TCA CTG AAA GAC TTC CTG GAA AGC CTA AAG AGC ATC ATG CAA ATG GAT TAC TCG を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項または第
４項記載のDNA。 - 【請求項６】次の塩基配列： ATG GGT CTC AAC CCC CAG CTA GTT GTC ATC CTG CTC TTC TTT CTC GAA TGT ACC AGG AGC CAT ATC CAC GGA TGC GAC AAA AAT CAC TTG AGA GAG ATC ATC GGC ATT TTG AAC GAG GTC ACA GGA GAA GGG ACG CCA TGC ACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC CTC ACA GCA ACG AAG AAC ACC ACA GAG AGT GAG CTC GTC TGT AGG GCT TCC AAG GTG CTT CGC ATA TTT TAT TTA AAA CAT GGG AAA ACT CCA TGC TTG AAG AAG AAC TCT AGT GTT CTC ATG GAG CTG CAG AGA CTC TTT CGG GCT TTT CGA TGC CTG GAT TCA TCG ATA AGC TGC ACC ATG AAT GAG TCC AAG TCC ACA TCA CTG AAA GAC TTC CTG GAA AGC CTA AAG AGC ATC ATG CAA ATG GAT TAC TCG を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項、第４項
または第５項記載のDNA。 - 【請求項７】５′末端にATGを有することを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載のDNA。 - 【請求項８】マウスインターロイキン４活性を有するポ
リペプチドであって、次のアミノ酸配列： Cys Asp Lys Asn His Leu Arg Glu Ile Ile Gly Ile Leu Asn Glu Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Cys Thr Glu Met Asp Val Pro Asn Val Leu Thr Ala Thr Lys Asn Thr Thr Glu Ser Glu Leu Val Cys Arg Ala Ser Lys Val Leu Arg Ile Phe Tyr Leu Lys His Gly Lys Thr Pro Cys Leu Lys Lys Asn Ser Ser Val Leu Met Glu Leu Gln Arg Leu Phe Arg Ala Phe Arg Cys Leu Asp Ser Ser Ile Ser Cys Thr Met Asn Glu Ser Lys Ser Thr Ser Leu Lys Asp Phe Leu Glu Ser Leu Lys Ser Ile Met Gln Met Asp Tyr Ser を含むことを特徴とするポリペプチドを産生するマウス
Ｔ細胞を抗原で刺激して、該ポリペプチドをコードする
mRNAを含む分画を採集し、そのmRNAを鋳型にしてcDNAを
合成し、さらにcDNAライブラリーを作成して、そのcDNA
ライブラリーより該ポリペプチドの遺伝子をクローニン
グすることを特徴とする該ポリペプチドをコードするDN
Aの製法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60214870A JPH0740943B2 (ja) | 1985-09-30 | 1985-09-30 | 新規なポリペプチドをコードするｄｎａ及びその製造方法 |
| EP86307437A EP0218431B1 (en) | 1985-09-30 | 1986-09-29 | Novel polypeptides, dnas that code for the same and method of preparing said polypeptides and dnas |
| AT86307437T ATE79638T1 (de) | 1985-09-30 | 1986-09-29 | Polypeptide, deren kodierende peptide und methode zur herstellung dieser peptide und dnas. |
| DE8686307437T DE3686466T2 (de) | 1985-09-30 | 1986-09-29 | Polypeptide, deren kodierende peptide und methode zur herstellung dieser peptide und dnas. |
| EP19910114890 EP0466204A1 (en) | 1985-09-30 | 1986-09-29 | Novel polypeptides, DNAs that code for the same, and method of preparing said polypeptides and DNAs |
| US06/913,276 US5416201A (en) | 1985-09-30 | 1986-09-30 | DNAs that code for mouse interleuken 4 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60214870A JPH0740943B2 (ja) | 1985-09-30 | 1985-09-30 | 新規なポリペプチドをコードするｄｎａ及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6274298A JPS6274298A (ja) | 1987-04-06 |
| JPH0740943B2 true JPH0740943B2 (ja) | 1995-05-10 |
Family
ID=16662927
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60214870A Expired - Lifetime JPH0740943B2 (ja) | 1985-09-30 | 1985-09-30 | 新規なポリペプチドをコードするｄｎａ及びその製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5416201A (ja) |
| EP (2) | EP0466204A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0740943B2 (ja) |
| AT (1) | ATE79638T1 (ja) |
| DE (1) | DE3686466T2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6274291A (ja) * | 1985-09-30 | 1987-04-06 | Yuu Honshiyo | 遺伝子クロ−ニングの方法 |
| US5656266A (en) * | 1985-11-19 | 1997-08-12 | Schering Corporation | Method of using interleukin-4 |
| US5552304A (en) * | 1985-11-19 | 1996-09-03 | Schering Corporation | CDNA Clones coding for human protein exhibiting a broad cellular activity spectrum (human interleukin-4) |
| US5807996A (en) * | 1985-11-19 | 1998-09-15 | Schering Corporation | Fused polypeptides comprising interleukin-4 polypeptide fragments |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6274291A (ja) * | 1985-09-30 | 1987-04-06 | Yuu Honshiyo | 遺伝子クロ−ニングの方法 |
| PT83761B (pt) * | 1985-11-19 | 1989-06-30 | Schering Biotech Corp | Metodo para a producao de interleuquina-4 de mamifero |
| ZA872781B (en) * | 1986-05-19 | 1987-10-05 | Immunology Ventures | B-cell stimulating factor |
-
1985
- 1985-09-30 JP JP60214870A patent/JPH0740943B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-09-29 EP EP19910114890 patent/EP0466204A1/en not_active Withdrawn
- 1986-09-29 AT AT86307437T patent/ATE79638T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-09-29 EP EP86307437A patent/EP0218431B1/en not_active Expired
- 1986-09-29 DE DE8686307437T patent/DE3686466T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-09-30 US US06/913,276 patent/US5416201A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１５８（１９８３）Ｐ．８２２−８３５ |
| Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１５（１９８５）Ｐ．３３３−３３６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0466204A1 (en) | 1992-01-15 |
| EP0218431A3 (en) | 1988-10-19 |
| DE3686466D1 (de) | 1992-09-24 |
| ATE79638T1 (de) | 1992-09-15 |
| EP0218431A2 (en) | 1987-04-15 |
| JPS6274298A (ja) | 1987-04-06 |
| US5416201A (en) | 1995-05-16 |
| EP0218431B1 (en) | 1992-08-19 |
| DE3686466T2 (de) | 1993-01-21 |
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