JPS6274291A - 遺伝子クロ−ニングの方法 - Google Patents
遺伝子クロ−ニングの方法Info
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- JPS6274291A JPS6274291A JP60214869A JP21486985A JPS6274291A JP S6274291 A JPS6274291 A JP S6274291A JP 60214869 A JP60214869 A JP 60214869A JP 21486985 A JP21486985 A JP 21486985A JP S6274291 A JPS6274291 A JP S6274291A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5406—IL-4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は遺伝子クローニングの方法に関する。
特ｔこ本発明は、生物活性は偲められるが精製が行なわ
れていない微量で活性を有する蛋白質の遺伝子をクロー
ニングするときに有効であり、その上うな蛋白質を産生
又は分泌する細胞から伝令ＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ
ＲＮＡ、 ｍＲＮＡと略記する。）を少量しか分取で
きない場合に極めて有効である。
れていない微量で活性を有する蛋白質の遺伝子をクロー
ニングするときに有効であり、その上うな蛋白質を産生
又は分泌する細胞から伝令ＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ
ＲＮＡ、 ｍＲＮＡと略記する。）を少量しか分取で
きない場合に極めて有効である。
生体機能制御物質には、例えば免疫システムにおけるリ
ンフ才力インのように、微量で強い生理活性を有するも
のがある。それらの働きをより詳細に研究したり、ある
いはそれらを臨床的に応用しようとするとき、まずそれ
らの遺伝子を単離することは非常に有効な手段となる。
ンフ才力インのように、微量で強い生理活性を有するも
のがある。それらの働きをより詳細に研究したり、ある
いはそれらを臨床的に応用しようとするとき、まずそれ
らの遺伝子を単離することは非常に有効な手段となる。
現在よく知られている遺伝子クローニングの方法として
、該蛋白質が精製されでいる場合には。
、該蛋白質が精製されでいる場合には。
蛋白質の一部のアミノ酸配列を決定し、そのアミノ酸配
列に相当するオリゴヌクレオチドを合成して、そのオリ
ゴヌクレオチドとノ・イブリダイズ（ｈｙｂｒｉｄｉｚ
ｅ ）するクローンを相補ＤＮＡ （ｃｏｍｐ−１ｅｍ
ｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ 、 ｃＤＮＡと略記する。）ラ
イブラ’Ｊ （１ｉｂｒａｒｙ ）から選ぶという方
法がある（ Ｐｅｎｎ１ｃａ 、 Ｄ 、 、ら、 Ｎ
ａｔｕｒｅ 、 ３１２ 、７２４ 、１９８４ ）。
列に相当するオリゴヌクレオチドを合成して、そのオリ
ゴヌクレオチドとノ・イブリダイズ（ｈｙｂｒｉｄｉｚ
ｅ ）するクローンを相補ＤＮＡ （ｃｏｍｐ−１ｅｍ
ｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ 、 ｃＤＮＡと略記する。）ラ
イブラ’Ｊ （１ｉｂｒａｒｙ ）から選ぶという方
法がある（ Ｐｅｎｎ１ｃａ 、 Ｄ 、 、ら、 Ｎ
ａｔｕｒｅ 、 ３１２ 、７２４ 、１９８４ ）。
生物活性は認められるが、微量あるいはその他の困難の
ため精製されていない蛋白質の場合には、その活性を指
標としてクローニングを進めなければならない。
ため精製されていない蛋白質の場合には、その活性を指
標としてクローニングを進めなければならない。
例えば、インターロイキン２の遺伝子クローニングの場
合、インターロイキン２５＋泌細胞からｒａＲＮＡを分
離し、蔗糖勾配法で分画したｍ ＲＮ Ａからｃ ＤＮ
Ａライブラリーを炸裂し、このｃ ＤＮＡライブラリー
を用いて。ＲＮＡをバイブリド形成法で選択し、さらに
翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ） Ｌｌたものの活性
を測定することを繰返して、単一のｅ ＤＮＡが分離さ
れている（ Ｔａｎｉｇｕｅｈｉ 、Ｔ、ｔら、 Ｎａ
ｔｕｒｅ 、 ３０２ 。
合、インターロイキン２５＋泌細胞からｒａＲＮＡを分
離し、蔗糖勾配法で分画したｍ ＲＮ Ａからｃ ＤＮ
Ａライブラリーを炸裂し、このｃ ＤＮＡライブラリー
を用いて。ＲＮＡをバイブリド形成法で選択し、さらに
翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ） Ｌｌたものの活性
を測定することを繰返して、単一のｅ ＤＮＡが分離さ
れている（ Ｔａｎｉｇｕｅｈｉ 、Ｔ、ｔら、 Ｎａ
ｔｕｒｅ 、 ３０２ 。
３０５．１９８３ ）。この方法では、少なくとも数百
μ２のｍＲＮＡが必要とされる。
μ２のｍＲＮＡが必要とされる。
一方、動物細胞（Ｃｏｓ細ｌ＠）中で、ｃ ＤＮＡを発
現させるクローニングベクター（Ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅ
ｃｔｏｒ ）システムが開発されている（ Ｑｋａｙａ
ｍａ、Ｈ，、及びＢｅｒｇ、Ｐ、、 Ｍｏ１． Ｃｅ１
ｌ Ｂｉｏｌ、、 ３ 、２８０ 、１９８３ ）。こ
の方法の場合、ベクターＤＮＡを細＠１こ形質導入する
効率が試料ごと（こ変ることや、産生蛋白量が細胞の状
態で大きく変化すること、及び細胞の外へ分泌される分
泌蛋白質は大量の培地で薄められると同時に血清蛋白質
が混入するために、また細胞の外へ分泌されない非分泌
蛋白質はＣｏｓ細胞内の多量の蛋白分解酵素などの阻害
のために、活性の測定が困難である。
現させるクローニングベクター（Ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅ
ｃｔｏｒ ）システムが開発されている（ Ｑｋａｙａ
ｍａ、Ｈ，、及びＢｅｒｇ、Ｐ、、 Ｍｏ１． Ｃｅ１
ｌ Ｂｉｏｌ、、 ３ 、２８０ 、１９８３ ）。こ
の方法の場合、ベクターＤＮＡを細＠１こ形質導入する
効率が試料ごと（こ変ることや、産生蛋白量が細胞の状
態で大きく変化すること、及び細胞の外へ分泌される分
泌蛋白質は大量の培地で薄められると同時に血清蛋白質
が混入するために、また細胞の外へ分泌されない非分泌
蛋白質はＣｏｓ細胞内の多量の蛋白分解酵素などの阻害
のために、活性の測定が困難である。
本発明者は、このような公知の遺伝子クローニングの方
法の欠点を改良して、生物活性は認められるが精製が行
なわれていない微量で活性を有する蛋白質において、目
的とする蛋白質（ターゲット物質と云う。）の遺伝子を
、ターゲット物質％ｉｌ生又は分泌する細胞から得られ
る数百またはそれ以上の種類のｍＲＮＡが数μｍといっ
た少量を材料として、ターゲット物質の有する生物活性
を指標として効率良（クローニングできることを見い出
して本発明を完成した。
法の欠点を改良して、生物活性は認められるが精製が行
なわれていない微量で活性を有する蛋白質において、目
的とする蛋白質（ターゲット物質と云う。）の遺伝子を
、ターゲット物質％ｉｌ生又は分泌する細胞から得られ
る数百またはそれ以上の種類のｍＲＮＡが数μｍといっ
た少量を材料として、ターゲット物質の有する生物活性
を指標として効率良（クローニングできることを見い出
して本発明を完成した。
本発明の遺伝子クローニングの方法は、ａ）良く知られ
た通常の方法（常法と云う、）により分取し分画したタ
ーゲット物質のｍ ＲＮ Ａを含むｍＲＮＡ ｆＰを、 ｂ）公知のプラスミドＤＮＡから得た、ポリリンカー（
ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ ）の上流にデオキシチミジン（
ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ 、 ｄＴと略記する。
た通常の方法（常法と云う、）により分取し分画したタ
ーゲット物質のｍ ＲＮ Ａを含むｍＲＮＡ ｆＰを、 ｂ）公知のプラスミドＤＮＡから得た、ポリリンカー（
ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ ）の上流にデオキシチミジン（
ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ 、 ｄＴと略記する。
）頭を有するベクター−プライ−ｖ −（ｖｅｃｔｏｒ
”ｐｒｉｍｅｒ ） ＤＮＡにハイブリダイズし、 Ｃ）逆転写酵素で単鎖ｃ ＤＮＡを合成したのち、その
末端にデオキシリボヌクレオチド鎖を付加したベクター
ＤＮＡを得、 ｄ）公知のプラスミドＤＮＡから得た、ＳＦ３７’ロモ
ーター七その下流にＣ）で付加したデオキシリボヌクレ
オチド鎖と対合できるデオキシリボヌクレオチド鎖を有
するリンカ−ＤＮＡで環状化したのち、ｍＲＮＡ部分ｉ
ＤＮＡに置換して、ｍＲＮＡ群中のそれぞれのｍＲＮ
Ａ ｆこ対応したプラスミドＤＮＡ群を得、 Ｃ）得られたプラスミドＤＮＡ群を用いて宿主を形質転
換し、 ｆ）形質転換した宿主からプラスミドＤＮＡ群を分離し
、何種類かの制限酵素のそれぞれで切断して得られるｃ
ＤＮＡ群を鋳型として、 ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼで
試験管内転写をして合成ｍＲＮＡ群を：−シ、これを翻
訳して得られる蛋白質について、夕−ゲット物質の活性
試験をして、適当な制限酵素を選び、 ｇ） −）で得た形質転換した宿主の数の小さなグル
ープを作成し、それぞれのグループｌこついで、ｆ）で
選ばれた制限酵素を用いてｆ）と同様の操作を行なって
活性を有するグループを選び出し、選ばれたグループの
形質転換した宿主について同様の操作を行ない、最終的
に単一のクローン（ｃｌｏｎｅ）を分離するものである
。
”ｐｒｉｍｅｒ ） ＤＮＡにハイブリダイズし、 Ｃ）逆転写酵素で単鎖ｃ ＤＮＡを合成したのち、その
末端にデオキシリボヌクレオチド鎖を付加したベクター
ＤＮＡを得、 ｄ）公知のプラスミドＤＮＡから得た、ＳＦ３７’ロモ
ーター七その下流にＣ）で付加したデオキシリボヌクレ
オチド鎖と対合できるデオキシリボヌクレオチド鎖を有
するリンカ−ＤＮＡで環状化したのち、ｍＲＮＡ部分ｉ
ＤＮＡに置換して、ｍＲＮＡ群中のそれぞれのｍＲＮ
Ａ ｆこ対応したプラスミドＤＮＡ群を得、 Ｃ）得られたプラスミドＤＮＡ群を用いて宿主を形質転
換し、 ｆ）形質転換した宿主からプラスミドＤＮＡ群を分離し
、何種類かの制限酵素のそれぞれで切断して得られるｃ
ＤＮＡ群を鋳型として、 ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼで
試験管内転写をして合成ｍＲＮＡ群を：−シ、これを翻
訳して得られる蛋白質について、夕−ゲット物質の活性
試験をして、適当な制限酵素を選び、 ｇ） −）で得た形質転換した宿主の数の小さなグル
ープを作成し、それぞれのグループｌこついで、ｆ）で
選ばれた制限酵素を用いてｆ）と同様の操作を行なって
活性を有するグループを選び出し、選ばれたグループの
形質転換した宿主について同様の操作を行ない、最終的
に単一のクローン（ｃｌｏｎｅ）を分離するものである
。
ａ）の操作は、ターゲット物質を産生又は分泌する細胞
から常法によりポリＡ （ｐｏｌｙＡ ） ＲＮＡを
分離し、得られたボＩＪＡＲＮＡを常法、例えば蔗塘勾
配法で分画し、それぞれの分画の一部を常法により、例
えばアフリカッメガエルの卵母細廁に注入し翻訳させて
生じた蛋白質の活性を試験することｌこよって、ターゲ
ット物質のｍ ＲＮ Ａを含む分画（ｍＲＮＡ群）を得
るもので、一般に良（知られた方法である。
から常法によりポリＡ （ｐｏｌｙＡ ） ＲＮＡを
分離し、得られたボＩＪＡＲＮＡを常法、例えば蔗塘勾
配法で分画し、それぞれの分画の一部を常法により、例
えばアフリカッメガエルの卵母細廁に注入し翻訳させて
生じた蛋白質の活性を試験することｌこよって、ターゲ
ット物質のｍ ＲＮ Ａを含む分画（ｍＲＮＡ群）を得
るもので、一般に良（知られた方法である。
ｂ）の操作は、例えばｐｃＤｖｌやｐＵＣ８といった公
知のプラスミドＤＮＡを用いて、それ自身に適当なポリ
リンカーを有している場合にはそのままで、それ自身に
適当なポリリンカーを有しでいない場合には適当なボＩ
Ｊ ＩＪンヵーを挿入して、常法により適当な制限酵素
で切断したのち、ポリリンカーの上流にｄＴ鎖を、好ま
しくはポリリンカーの直前の上流に約５０個のｄＴ鎖を
挿入してベクター・プライマーＤＮＡを得る。挿入する
ポリリンカーとしては何でも良いが、制限酵素による切
断認識部位を多（含むものが好ましい。ポリリンカー及
びｄＴ鎖の挿入は、それぞれ公知のりガーゼ及びターミ
ナルトランスフェラーゼを用いて常法により行なうこと
ができる。次に、得られたベクター・プライマーＤＮＡ
とａ）の操作で得たｍ ＲＮＡ群を公知の方法でハイブ
リダイズするものである。
知のプラスミドＤＮＡを用いて、それ自身に適当なポリ
リンカーを有している場合にはそのままで、それ自身に
適当なポリリンカーを有しでいない場合には適当なボＩ
Ｊ ＩＪンヵーを挿入して、常法により適当な制限酵素
で切断したのち、ポリリンカーの上流にｄＴ鎖を、好ま
しくはポリリンカーの直前の上流に約５０個のｄＴ鎖を
挿入してベクター・プライマーＤＮＡを得る。挿入する
ポリリンカーとしては何でも良いが、制限酵素による切
断認識部位を多（含むものが好ましい。ポリリンカー及
びｄＴ鎖の挿入は、それぞれ公知のりガーゼ及びターミ
ナルトランスフェラーゼを用いて常法により行なうこと
ができる。次に、得られたベクター・プライマーＤＮＡ
とａ）の操作で得たｍ ＲＮＡ群を公知の方法でハイブ
リダイズするものである。
Ｃ）の操作は、公知の逆転写酵素を用いてＲＮＡそ鋳型
としてＤＮＡを合成する公知の方法であり、これによっ
て得られる単鎖ｃ ＤＮＡの末端へ、ｂ）の操作で説明
したと同様にしてデオキシリボヌクレオチド鎖を付加し
てベクターＤＮＡ、を得るものである。付加するデオキ
シリボヌクレオチド鎖としては１０〜１５個のデオキシ
シチジン（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎａ。
としてＤＮＡを合成する公知の方法であり、これによっ
て得られる単鎖ｃ ＤＮＡの末端へ、ｂ）の操作で説明
したと同様にしてデオキシリボヌクレオチド鎖を付加し
てベクターＤＮＡ、を得るものである。付加するデオキ
シリボヌクレオチド鎖としては１０〜１５個のデオキシ
シチジン（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎａ。
ｄＣと略記する。）鎖が好ましい。
ｄ）の操作は、例えばｐｓｉ−６２−ＰＬやｐ Ｓ Ｐ
６４といったＳＰ６プロモーターを有する公知のプラ
スミドＤＮＡを、常法により適当な制限酵素を用いてＳ
Ｐ６プロモーターの下流、好ましくは直後の下流で切断
したのち切断部位へＣ）の操作で付加したデオキシリボ
ヌクレオチド鎖と対合できるデオキシリボヌクレオチド
鎖を付加し、さらにＳＰ６プロモーターの上流で切断し
てリンカ−ＤＮＡを得、このリンカ−ＤＮＡとＣ）の操
作で得たベクターＤＮＡを公知のＤＮＡＩＪガーゼで環
状化したのち、ｍＲＮＡ部分をＤＮＡ ｌこ置換してｍ
ＲＮＡ ＮＦ中のそれぞれのｍＲＮＡに対応したプラス
ミドＤＮＡ＃を得るもので、それぞれの操作は良く知ら
れた方法で行なうことができる。
６４といったＳＰ６プロモーターを有する公知のプラ
スミドＤＮＡを、常法により適当な制限酵素を用いてＳ
Ｐ６プロモーターの下流、好ましくは直後の下流で切断
したのち切断部位へＣ）の操作で付加したデオキシリボ
ヌクレオチド鎖と対合できるデオキシリボヌクレオチド
鎖を付加し、さらにＳＰ６プロモーターの上流で切断し
てリンカ−ＤＮＡを得、このリンカ−ＤＮＡとＣ）の操
作で得たベクターＤＮＡを公知のＤＮＡＩＪガーゼで環
状化したのち、ｍＲＮＡ部分をＤＮＡ ｌこ置換してｍ
ＲＮＡ ＮＦ中のそれぞれのｍＲＮＡに対応したプラス
ミドＤＮＡ＃を得るもので、それぞれの操作は良く知ら
れた方法で行なうことができる。
シ）の操作は、公知の宿主、例えば大腸歯や枯草菌を前
記のプラスミドＤＮＡ群で形質転換して、ｃＤＮＡライ
ブラリーを得るものである。形質転換は公知の方法で行
なうことができる。
記のプラスミドＤＮＡ群で形質転換して、ｃＤＮＡライ
ブラリーを得るものである。形質転換は公知の方法で行
なうことができる。
ｆ）の操作は、本発明に使用することができる酵素、す
なわちターゲット物質のｔｎＲＮＡに由来するｃＤＮＡ
内に切断認識部位がなくボＩＪ ＩＪンヵー内に切断認
識部位がある制限酵素を選ぶために行なうもので、それ
ぞれの操作は公知の方法及び龜）の操作で説明した方法
を用いで行うことができる０ｇ）の操作は、ｅ）で得た
形質転換した宿主群から例えばｌグループに数百例の形
質転換した宿主を含むグループを数十グループ作り、各
グループについて活性の有無を試験して、目的のグルー
プを選び、選ばれたグループの形質転換した宿主につい
て同様の選別操作を行なって、最終的に単一の目的クロ
ーンを得るものである。
なわちターゲット物質のｔｎＲＮＡに由来するｃＤＮＡ
内に切断認識部位がなくボＩＪ ＩＪンヵー内に切断認
識部位がある制限酵素を選ぶために行なうもので、それ
ぞれの操作は公知の方法及び龜）の操作で説明した方法
を用いで行うことができる０ｇ）の操作は、ｅ）で得た
形質転換した宿主群から例えばｌグループに数百例の形
質転換した宿主を含むグループを数十グループ作り、各
グループについて活性の有無を試験して、目的のグルー
プを選び、選ばれたグループの形質転換した宿主につい
て同様の選別操作を行なって、最終的に単一の目的クロ
ーンを得るものである。
以上に説明した本発明の％鑓のうちその主たる特徴は、
サルモネラチフィムリムファージ（Ｓａｌ−ｍｃｎｅｌ
ｌｓ＋ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍ ｐｂａｇｅ ） Ｓ
Ｐ ６が有するＲＮＡポリメラーゼが、ＳＰ６７アージ
プロモーターに特異的に結合してプロモーターの下流の
い力１なるＤＮＡ塩基配列をも転写させるという性質を
応用して、ターゲット物質由来のｒｎＲＮＡを試験管内
で合成することであり、そのために公知のプラスミドＤ
ＮＡに処理を加えて、ＳＰ６プロモーター。
サルモネラチフィムリムファージ（Ｓａｌ−ｍｃｎｅｌ
ｌｓ＋ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍ ｐｂａｇｅ ） Ｓ
Ｐ ６が有するＲＮＡポリメラーゼが、ＳＰ６７アージ
プロモーターに特異的に結合してプロモーターの下流の
い力１なるＤＮＡ塩基配列をも転写させるという性質を
応用して、ターゲット物質由来のｒｎＲＮＡを試験管内
で合成することであり、そのために公知のプラスミドＤ
ＮＡに処理を加えて、ＳＰ６プロモーター。
その下流にターゲット物質由来のｍ ＲＮ Ａから誘導
したｃ ＤＮＡ、及びその下流に転写の終末をつ（るた
めのポリリンカーを有するプラスミドＤＮＡを得ること
にあると言える。
したｃ ＤＮＡ、及びその下流に転写の終末をつ（るた
めのポリリンカーを有するプラスミドＤＮＡを得ること
にあると言える。
ターゲット物質として、免疫学においてその遺伝子クロ
ーニングが切望されているリンフ才力インの一つである
ＩｇＧ、誘導因子の場合について、その遺伝子クローニ
ングを例として本発明をさらに詳しく説明する。
ーニングが切望されているリンフ才力インの一つである
ＩｇＧ、誘導因子の場合について、その遺伝子クローニ
ングを例として本発明をさらに詳しく説明する。
プラスミドＤＮＡ ｐｃＤＶｌ （Ｏｋａｙｍｍａ、Ｈ
，、Ｂｅｒｇ。
，、Ｂｅｒｇ。
Ｐ、、 Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、、 ３ 、２８
０ 、１９８３ ）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、′
Ｂａ＋ｍＨｌ断端にポリリンカーを挿入したプラスミド
ｐｃＤＶ１−ＰＬを作製し、ｐｃＤＶｌ−ＰＬを制限酵
素Ｋｐｎ Ｉで切断した後、Ｋｐｎ ｌ断端にターミナ
ルトランスフェラーゼで約５０個のｄＴ鎖を付加し、さ
らに制限酵素ＥｃｏＲｌで切断して、大きい方の７ラグ
メントを分取して、ベクター・プライマー（図−１中の
ｐ ＣＤＶ １− ＰＬ ｐｒｉｍｅｒ ）とする。
０ 、１９８３ ）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、′
Ｂａ＋ｍＨｌ断端にポリリンカーを挿入したプラスミド
ｐｃＤＶ１−ＰＬを作製し、ｐｃＤＶｌ−ＰＬを制限酵
素Ｋｐｎ Ｉで切断した後、Ｋｐｎ ｌ断端にターミナ
ルトランスフェラーゼで約５０個のｄＴ鎖を付加し、さ
らに制限酵素ＥｃｏＲｌで切断して、大きい方の７ラグ
メントを分取して、ベクター・プライマー（図−１中の
ｐ ＣＤＶ １− ＰＬ ｐｒｉｍｅｒ ）とする。
プラスミドＤＮＡ ９ＳＰ−６２−ＰＬ （市販品）を
、制御′Ｉｋ酵ＩＪｇＸｂａ［、Ｈｉｎｄｕで切断し、
両端をクレノー断片で処理し、た後、再び環状化し、ｐ
ｓＰ−６２−ＰＬのポリリンカー内のＳａｌ ｌ、 Ｐ
ｓｔ Ｉ及びＨｉｎｄ［切断認識部位をなくしたプラス
ミドをつくる。さらにこのプラスミドの５ａｌＩ切断昭
識部位を１ｉｉｎｄｌ切断認識部位におきかえる（図−
１中のｐｓＰ−６２−に２ ） ０１）ＳＰ−６２−に
２を制限酵素Ｓａｃ Ｉで切断し、Ｓａｃ ｌ断端にタ
ーミナルトランス７エラーゼテ約１５個のｄＧ鎖を付加
する〔図−１中の（■）〕。この後Ｈ３ｓｘｄ Ｉで切
断して、短い方の７ラグメントを分取して、リンカ−Ｄ
ＮＡ （図−１中の目ｎｋｅｒ）とする。
、制御′Ｉｋ酵ＩＪｇＸｂａ［、Ｈｉｎｄｕで切断し、
両端をクレノー断片で処理し、た後、再び環状化し、ｐ
ｓＰ−６２−ＰＬのポリリンカー内のＳａｌ ｌ、 Ｐ
ｓｔ Ｉ及びＨｉｎｄ［切断認識部位をなくしたプラス
ミドをつくる。さらにこのプラスミドの５ａｌＩ切断昭
識部位を１ｉｉｎｄｌ切断認識部位におきかえる（図−
１中のｐｓＰ−６２−に２ ） ０１）ＳＰ−６２−に
２を制限酵素Ｓａｃ Ｉで切断し、Ｓａｃ ｌ断端にタ
ーミナルトランス７エラーゼテ約１５個のｄＧ鎖を付加
する〔図−１中の（■）〕。この後Ｈ３ｓｘｄ Ｉで切
断して、短い方の７ラグメントを分取して、リンカ−Ｄ
ＮＡ （図−１中の目ｎｋｅｒ）とする。
ＩｇＧ、誘導因子を分泌するＴ細胞（Ｂ６． Ｃ−Ｈ−
２ｂ−’２．１９Ｔ ａ胞） 、Ｊ： ’） ｆ）［［
ｉ’Ｌ；ｅ ホ’） Ａ ＲＮｈ２Ｍ糖勾配で分画して
、後述の生物活性測定試験により選んだＩｇＧｍ！！導
因子ｍＲ導因全ｍＲＮＡと、先のベクター・プライマー
をハイブリダイズさせ、ＲＮＡを鋳型ｆこ、逆転写酵素
でＤＮＡを合成する。
２ｂ−’２．１９Ｔ ａ胞） 、Ｊ： ’） ｆ）［［
ｉ’Ｌ；ｅ ホ’） Ａ ＲＮｈ２Ｍ糖勾配で分画して
、後述の生物活性測定試験により選んだＩｇＧｍ！！導
因子ｍＲ導因全ｍＲＮＡと、先のベクター・プライマー
をハイブリダイズさせ、ＲＮＡを鋳型ｆこ、逆転写酵素
でＤＮＡを合成する。
これにターミナルトランスフェラーゼ７１０〜１５個の
ｄＣ鎖を付加し％Ｈｉｎｄ ｌで切断する〔図−１中の
（Ｍ）〕。次に先に得たリンカ−ＤＮＡを加えて、環状
化し、ざらにＲＮＡ部分をＤＮＡに置換する（図−１参
照）。この後、このｃＤＮＡを含んだ−プラスミドＤＮ
Ａを用いて、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換し、ｃ ＤＮ
Ａライブラリーを作製する。
ｄＣ鎖を付加し％Ｈｉｎｄ ｌで切断する〔図−１中の
（Ｍ）〕。次に先に得たリンカ−ＤＮＡを加えて、環状
化し、ざらにＲＮＡ部分をＤＮＡに置換する（図−１参
照）。この後、このｃＤＮＡを含んだ−プラスミドＤＮ
Ａを用いて、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換し、ｃ ＤＮ
Ａライブラリーを作製する。
約４０００個の独立な形質転換菌からなるｃＤＮＡライ
ブラリーより分離したプラスミドＤＮＡを、制限酵素Ｐ
ｓｔ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ ｓ ５ｅｌｌ Ｉの３種類で切
断し、試験管内転写の鋳をとした。ＳＰ６ＲＮＡポリメ
ラーゼを作用させて、試験管内転写を行ってＲＮＡを合
成する。
ブラリーより分離したプラスミドＤＮＡを、制限酵素Ｐ
ｓｔ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ ｓ ５ｅｌｌ Ｉの３種類で切
断し、試験管内転写の鋳をとした。ＳＰ６ＲＮＡポリメ
ラーゼを作用させて、試験管内転写を行ってＲＮＡを合
成する。
この時、基質のＡＴＰ、ＣＴＰ％ＧＴＰ％ＵＴＰに、ｍ
’Ｇ（５’）ｐｐｐ（５′）Ｇ （市販品）を加えてお
くと、真核細胞のｍＲＮＡに特有なキャップ（Ｃａｐ）
構造を持ったＲＮＡが合成される（ Ｋｏｎａｒｓｋａ
、Ｍ、Ｍ、、ら。
’Ｇ（５’）ｐｐｐ（５′）Ｇ （市販品）を加えてお
くと、真核細胞のｍＲＮＡに特有なキャップ（Ｃａｐ）
構造を持ったＲＮＡが合成される（ Ｋｏｎａｒｓｋａ
、Ｍ、Ｍ、、ら。
Ｃｅ１ｌ、３８，７３１．１９８４ ） ｏこの試験管
内合成したｍＲＮＡをアフリカッメガエルの卵母細胞に
注入し、２０℃３６時間培養して培養上清を集め、Ｉｇ
Ｇ、 誘導因子の活性を次のようにして測定する。マ
ウス（Ｃ５７Ｃ５７Ｂ１雌、６週令〜１０週令）の牌細
肩（４Ｘ １０’個／−）を１５１ＦＣ８，２Ｘ１０
Ｍの２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ −１
６４０に懸濁し、５０μｔ／−のりボボリサツカライド
（ＬＰＳ）で刺激して、２４時間後に、ろ過減菌した卵
母細旭培養上清を加え５日間培養する。培養後ＩｇＧｔ
産生細胞数とＩｇＧ、産生細＠数をリバースプラークア
ッセイ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｌｉｑｕｅ ａｓｓａｙ
）（Ｇｒｏｎｏｗｉｅｚ、 Ｅ、、ら、 Ｅａｒ、 Ｊ
、 Ｉｍｍｕｎｏｌ＋、 ６ 、５８８ 。
内合成したｍＲＮＡをアフリカッメガエルの卵母細胞に
注入し、２０℃３６時間培養して培養上清を集め、Ｉｇ
Ｇ、 誘導因子の活性を次のようにして測定する。マ
ウス（Ｃ５７Ｃ５７Ｂ１雌、６週令〜１０週令）の牌細
肩（４Ｘ １０’個／−）を１５１ＦＣ８，２Ｘ１０
Ｍの２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ −１
６４０に懸濁し、５０μｔ／−のりボボリサツカライド
（ＬＰＳ）で刺激して、２４時間後に、ろ過減菌した卵
母細旭培養上清を加え５日間培養する。培養後ＩｇＧｔ
産生細胞数とＩｇＧ、産生細＠数をリバースプラークア
ッセイ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｌｉｑｕｅ ａｓｓａｙ
）（Ｇｒｏｎｏｗｉｅｚ、 Ｅ、、ら、 Ｅａｒ、 Ｊ
、 Ｉｍｍｕｎｏｌ＋、 ６ 、５８８ 。
１９７６ ）で測定し％ＩｇＧ１誘導因子の活性を検出
する。Ｓａｕ Ｉで切断したＤＮＡを鋳ｍζこして合成
したＲＮＡを注入した卵母細胞の培養上清ζこのみ、Ｉ
ｇＧ、誘導因子の活性が認められた（表−１）。
する。Ｓａｕ Ｉで切断したＤＮＡを鋳ｍζこして合成
したＲＮＡを注入した卵母細胞の培養上清ζこのみ、Ｉ
ｇＧ、誘導因子の活性が認められた（表−１）。
ＩｇＧ、誘導因子においては、５ａｉｌ切断が有効であ
った。
った。
次に、含まれる形質転換菌の数の小さなグループを作製
し、グループそれぞれから、ｃＤＮＡを含むプラスミド
ＤＮＡ１分離し％ Ｓａｌ Ｉで切断して、試験管内転
写の鋳梨とし、以下、同様の千須をふんで、ＩｇＧ、ｎ
導因子活性を持つグループを決定する。同様のスクリー
ニングを（り返し、最終的に単一のクローンを分離した
。
し、グループそれぞれから、ｃＤＮＡを含むプラスミド
ＤＮＡ１分離し％ Ｓａｌ Ｉで切断して、試験管内転
写の鋳梨とし、以下、同様の千須をふんで、ＩｇＧ、ｎ
導因子活性を持つグループを決定する。同様のスクリー
ニングを（り返し、最終的に単一のクローンを分離した
。
かくして本発明における方法が、ターゲット物質が有す
る生物活性を測定することだけが、ターゲット物質の同
定法である場合の遺伝子クローニングにおいて非常に有
効な方法である事が実証された。
る生物活性を測定することだけが、ターゲット物質の同
定法である場合の遺伝子クローニングにおいて非常に有
効な方法である事が実証された。
本方法は、もちろんｂ ＩｇＧ＋誘導因子以外の蛋白
質の遺伝子をクローニングする時にも有効であるＯ ＩｇＧ、誘導因子は、卵母細胞の培養上清に回収される
が、培養上清中に分泌されない蛋白質については、卵母
細胞のホモジネート上清を分析すればよい。卵母細胞上
清には通常活性阻害物質が少ない。
質の遺伝子をクローニングする時にも有効であるＯ ＩｇＧ、誘導因子は、卵母細胞の培養上清に回収される
が、培養上清中に分泌されない蛋白質については、卵母
細胞のホモジネート上清を分析すればよい。卵母細胞上
清には通常活性阻害物質が少ない。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが
、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１ ｃＤＮＡライブラリーの作製（ｉ） ベ
クター・プライマーＤＮＡの作製プラスミドＤＮＡ ｐ
ｓＰ６５ （プロメガノくイオテク（Ｐｒｏｍｅｇｍ
Ｂｉｏｔｅｃ ）社製品〕より制限酵素ｇ（ｏＲＬＨｉ
ｎｄ ＩでポリリンカーＤＮＡを切り出し、ポリリンカ
ーＤＮＡをクレノー断片で処理後１両端に５′末端をリ
ン酸化したＢａｍＨＩリンカ−ＤＮＡをＴ、ＤＮＡＩＪ
ガーゼを用いて結合し、その後ＢａｍＨ［で切断してポ
リリンカーＤＮＡを得た。両端にＢｍｍＨ１断端を持つ
ポリリンカーＤＮＡは合成ヌクレオチドを使用してもよ
い。
クター・プライマーＤＮＡの作製プラスミドＤＮＡ ｐ
ｓＰ６５ （プロメガノくイオテク（Ｐｒｏｍｅｇｍ
Ｂｉｏｔｅｃ ）社製品〕より制限酵素ｇ（ｏＲＬＨｉ
ｎｄ ＩでポリリンカーＤＮＡを切り出し、ポリリンカ
ーＤＮＡをクレノー断片で処理後１両端に５′末端をリ
ン酸化したＢａｍＨＩリンカ−ＤＮＡをＴ、ＤＮＡＩＪ
ガーゼを用いて結合し、その後ＢａｍＨ［で切断してポ
リリンカーＤＮＡを得た。両端にＢｍｍＨ１断端を持つ
ポリリンカーＤＮＡは合成ヌクレオチドを使用してもよ
い。
プラスミドＤＮＡ ｐｃＤＶｌ （Ｏｋ＠ｙ＠ｍａ、Ｈ
，、ら、Ｍｏｌ。
，、ら、Ｍｏｌ。
Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、３，２８０．１９８３）に制限
酵素ＢａｍＨ［を３７℃、１時間作用させて、ｐｃＤＶ
ｌを切断した。
酵素ＢａｍＨ［を３７℃、１時間作用させて、ｐｃＤＶ
ｌを切断した。
反応液３０μｔ（２μｆ ｐｃ ＤＶ １ 、１０ ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ＠ＨＣＬ（ｐＩ（８，０）、７ ｍＭ Ｍ
ｇＣ／！、、１００ ｍＭ Ｎａ（Ｊ、 ２ｔｎＭ ２
−メルカプトエタノール、０．０１１ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）、ＢｍｍＨＩ ６ ユニット〕を７１
／ −７Ｌ／ −クロロホルムで抽出後、エタノールで
ＤＮＡを沈澱させた。
Ｍ Ｔｒｉｓ＠ＨＣＬ（ｐＩ（８，０）、７ ｍＭ Ｍ
ｇＣ／！、、１００ ｍＭ Ｎａ（Ｊ、 ２ｔｎＭ ２
−メルカプトエタノール、０．０１１ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）、ＢｍｍＨＩ ６ ユニット〕を７１
／ −７Ｌ／ −クロロホルムで抽出後、エタノールで
ＤＮＡを沈澱させた。
エタノール洗浄後乾燥させ％１００μｔの１０ｍＭ７
ｒ ｉ ｓ ＠ＨＣ６（ｐＨ８，０）に溶かし、０．４
ユニツトのアルカリフォスファターゼを加え、６０℃で
１時間反応させた。反応液をフェノール・クロロホルム
テ抽出後、エタノールでＤＮＡを沈澱させた。得られた
ＤＮＡの１μｔと先に得たポリリンカーＤＮＡ ０．５
μｇを、１０μｔのライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ
）反応液（５０ｍＭ Ｔｒ ＋ｍ＠ＨＣ１（ｐＨ７，
４）、１０ ｍＭ Ｍｇ （／４．１０ｍＭ ＤＴＴ、
１ｍＭ ＡＴＰ 〕中で、５ユニツトのＴ４ＤＮＡ
ＩＪガーゼと、１５℃で６時間反応させてポリリンカー
ＤＮＡが挿入されたＩ）ＣＤＶＩ （９ＣＤＶ１−ＰＬ
）を得た。、得られたｐｃＤＶｌ−ＰＬを用いて大腸菌
ＨＢ１０１を常法（Ｍａｎｄｅｌら、 Ｊ 、 Ｍｏ１
． Ｂｉｏｌ 、、 ５３ ＊ １５４゜１９７０ ）
で形質転換した。形質転換株のうちｐｃＤＶＩ−ＰＬを
持つ株を選択し、該プラスミドＤＮＡを常法により分離
した。
ｒ ｉ ｓ ＠ＨＣ６（ｐＨ８，０）に溶かし、０．４
ユニツトのアルカリフォスファターゼを加え、６０℃で
１時間反応させた。反応液をフェノール・クロロホルム
テ抽出後、エタノールでＤＮＡを沈澱させた。得られた
ＤＮＡの１μｔと先に得たポリリンカーＤＮＡ ０．５
μｇを、１０μｔのライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ
）反応液（５０ｍＭ Ｔｒ ＋ｍ＠ＨＣ１（ｐＨ７，
４）、１０ ｍＭ Ｍｇ （／４．１０ｍＭ ＤＴＴ、
１ｍＭ ＡＴＰ 〕中で、５ユニツトのＴ４ＤＮＡ
ＩＪガーゼと、１５℃で６時間反応させてポリリンカー
ＤＮＡが挿入されたＩ）ＣＤＶＩ （９ＣＤＶ１−ＰＬ
）を得た。、得られたｐｃＤＶｌ−ＰＬを用いて大腸菌
ＨＢ１０１を常法（Ｍａｎｄｅｌら、 Ｊ 、 Ｍｏ１
． Ｂｉｏｌ 、、 ５３ ＊ １５４゜１９７０ ）
で形質転換した。形質転換株のうちｐｃＤＶＩ−ＰＬを
持つ株を選択し、該プラスミドＤＮＡを常法により分離
した。
ｐｃＤＶｌ −ＰＬ ２００μ？に３５０ユニツトの制
限酵素Ｋｐｎｌを反応ｑ ４００ ｌｉｔ （６ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｔ（ｐＨ７，５）、６ｍＭＭｇＣ４，６
ｍＭ ２−メルカプトエタノール。
限酵素Ｋｐｎｌを反応ｑ ４００ ｌｉｔ （６ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｔ（ｐＨ７，５）、６ｍＭＭｇＣ４，６
ｍＭ ２−メルカプトエタノール。
０．０２％ＢＳＡ ］で作用させて、３７℃、５時間反
応させた。反応液をフェノール・クロロホルムで抽出後
、エタノール化ｆＩｌｉ（２回）及び７０幅エタノール
洗浄を行ってＤＮＡを回収した。
応させた。反応液をフェノール・クロロホルムで抽出後
、エタノール化ｆＩｌｉ（２回）及び７０幅エタノール
洗浄を行ってＤＮＡを回収した。
ＤＮＡのＫｐｎＩｍ端にターミナルトランスフェラーゼ
（ＴＴｍｓｅ）を反応１２００μｔ（１４０ｍＭカコジ
ル酸ナトリウム、３０ ｍＭＴｒｊｓ・ＨＣｔ（ｐＩ（
６，８）、１ ｍＭ ＣｏＣ４，０，１ｍＭジチオスレ
イト−／ｌ／（ＤＴＴ）、０．２ ｍＭ ｄＴＴ （”
Ｈ−ｄＴＴＰ ４μＣｉ含有） 、 ＴＴａｓｅ １０
８ユニツト〕中で作用させて、１０分おきに、３Ｈ−ｄ
ＴＴＰの取りこみを測定して、ｄＴ鎖伸長をモニターし
ながら、平均長４５塩基のｄＴ鎖を付加した。
（ＴＴｍｓｅ）を反応１２００μｔ（１４０ｍＭカコジ
ル酸ナトリウム、３０ ｍＭＴｒｊｓ・ＨＣｔ（ｐＩ（
６，８）、１ ｍＭ ＣｏＣ４，０，１ｍＭジチオスレ
イト−／ｌ／（ＤＴＴ）、０．２ ｍＭ ｄＴＴ （”
Ｈ−ｄＴＴＰ ４μＣｉ含有） 、 ＴＴａｓｅ １０
８ユニツト〕中で作用させて、１０分おきに、３Ｈ−ｄ
ＴＴＰの取りこみを測定して、ｄＴ鎖伸長をモニターし
ながら、平均長４５塩基のｄＴ鎖を付加した。
０．２Ｍ ＥＤＴＡ ２０μｔと１０％ＳＤ５１０μＬ
を加えて反応ヲトめ、フェノール・クロロホルムで抽出
、エタノール沈澱及びエタノール洗浄してＤＮＡを回収
した。
を加えて反応ヲトめ、フェノール・クロロホルムで抽出
、エタノール沈澱及びエタノール洗浄してＤＮＡを回収
した。
次に、このＤＮＡを２００ユニ、ットの制限酵素Ｅｃｏ
Ｒ１で３７℃、５時間消化し、反応液［５０ｍＭＴｒ
ｉｓ −Ｈｃｔ （ｐＨ７，５）、７ ｍＭ Ｍｇ Ｃ
４，１００ｍＭ Ｎａ Ｃｌ、７ｍＭ２−メルカプトエ
タノール、０．０１％ＢＳＡ］、１％アガロースゲル上
で電気泳動し、大きい方の７ラグメントをＤＥＡＥ−ペ
ーパー法（Ｄｒｅｔｚｅｎ ｙＧ、、ら、 Ａ！！ａ１
． Ｂｉｏｃｈｅｍ 、、 １１２ 、２９５．１９８
１ ）で分取した。得られたＤＮＡフラグメントヲ４０
０μｔのＩＭ ＮａＣｔ−１０ｍＭ ＴｒｉｓＯＨＣｔ
（ｐＨ７，４） −１ｍＭ ＫＤＴＡに浴かし、０℃に
冷やした。
Ｒ１で３７℃、５時間消化し、反応液［５０ｍＭＴｒ
ｉｓ −Ｈｃｔ （ｐＨ７，５）、７ ｍＭ Ｍｇ Ｃ
４，１００ｍＭ Ｎａ Ｃｌ、７ｍＭ２−メルカプトエ
タノール、０．０１％ＢＳＡ］、１％アガロースゲル上
で電気泳動し、大きい方の７ラグメントをＤＥＡＥ−ペ
ーパー法（Ｄｒｅｔｚｅｎ ｙＧ、、ら、 Ａ！！ａ１
． Ｂｉｏｃｈｅｍ 、、 １１２ 、２９５．１９８
１ ）で分取した。得られたＤＮＡフラグメントヲ４０
０μｔのＩＭ ＮａＣｔ−１０ｍＭ ＴｒｉｓＯＨＣｔ
（ｐＨ７，４） −１ｍＭ ＫＤＴＡに浴かし、０℃に
冷やした。
ＩＭ Ｎａｃｔ−１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＩＩＨＣｔ（ｐ
Ｈ７，４） −ｌ ｍＭ ＥＤＴＡで＋対比した０、５
７！のオリゴｄＡカラムに吸着させ、ＩＭ ＮａＣｔ−
ＴＥ ｆｆｌ液３０−で洗ツタ後、室温にもどした。
Ｈ７，４） −ｌ ｍＭ ＥＤＴＡで＋対比した０、５
７！のオリゴｄＡカラムに吸着させ、ＩＭ ＮａＣｔ−
ＴＥ ｆｆｌ液３０−で洗ツタ後、室温にもどした。
６５℃の蒸留水で溶出させ、各出液をフェノール、クロ
ロホルムで抽出して、エタノール沈澱を２回（り返し、
エタノール洗浄してベクター・プライマーＤＮＡを得た
。
ロホルムで抽出して、エタノール沈澱を２回（り返し、
エタノール洗浄してベクター・プライマーＤＮＡを得た
。
（１１） リンカ−ＤＮＡの作製
プラスミドＤＮＡ ｐｓｉ−６２−ＰＬ（ＮＥＮ社の製
品）ｌこ、制限酵素ｘｂａｆ及びＨｉｎｄ １ ｆ ２
０μｔの反応液［３Ａｔ ｐｓＰ−６２−ＰＬ 、 １
０ ｍＭ Ｔｒｉｓ １ＩＨＣ６（ｐＨ７，５）、７
ｒａＭ Ｍｇ Ｃ４、１００ｍＭ ＮａＣｔ 、 ７
ｍＭ ２−メルカプ１’ ：ｆ−９／ −７Ｌ／、０．
０１％ＢｓＡ、ｘｂａｒ ４０ ユ＝ ット、Ｈｉｎｄ
［６ユニツト〕中で３７℃、２時間作用させて、ｐｓＰ
６２−ＰＬ ＤＮＡ中のポリリンカ一部分のＸｂ＊ （
及びＨ４ｎｄ厘切断部位を切断した。このあと同反応液
に、ｄＡＴＦ’％ｄＣＴＰ％ｄＧＴＰ、ｄＴＴ′ｉ）の
混合液（それぞれ２ｍＭ）を４μを加え、クレノー断片
を３ユニット加えて、２０℃、３０分反応させた。反応
液をフェノール−クロロホルムでｍ出ｉ、エタノールで
ＤＮＡを沈澱させた。このうち２５０ ｎｇ Ｏ） Ｄ
ＮＡを１０ｔｔＬのライゲーション溶液（５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ” ＨＣｌ（ｐＨ７，４）、１０ｍＭ ＭｇＧ４
１０ ｍＭ’ ＤＴＴ、 ＩｍＭ ＡＴＰ Ｊ中で、５
ユニツトのＴ、ＤＮＡリガーゼ６１５℃で６時間反応さ
せ環状化した後、大＠直ＨＢＩＯＩを形質転換した。ア
ンピシリン耐性をマーカーに選択された形質転換株のう
ち、ｐｓＰ−６２−ＰＬのボＩＪ ＩＪンカー（ｐｏｌ
ｙｌｉｎｋｅｒ ）中Ｈｉｎｄｊ切断認識部位から５ａ
ｌｌ切断認識部位までが欠失したＤＮＡを持つ株を選び
、該ＤＮＡを常法により分離した。
品）ｌこ、制限酵素ｘｂａｆ及びＨｉｎｄ １ ｆ ２
０μｔの反応液［３Ａｔ ｐｓＰ−６２−ＰＬ 、 １
０ ｍＭ Ｔｒｉｓ １ＩＨＣ６（ｐＨ７，５）、７
ｒａＭ Ｍｇ Ｃ４、１００ｍＭ ＮａＣｔ 、 ７
ｍＭ ２−メルカプ１’ ：ｆ−９／ −７Ｌ／、０．
０１％ＢｓＡ、ｘｂａｒ ４０ ユ＝ ット、Ｈｉｎｄ
［６ユニツト〕中で３７℃、２時間作用させて、ｐｓＰ
６２−ＰＬ ＤＮＡ中のポリリンカ一部分のＸｂ＊ （
及びＨ４ｎｄ厘切断部位を切断した。このあと同反応液
に、ｄＡＴＦ’％ｄＣＴＰ％ｄＧＴＰ、ｄＴＴ′ｉ）の
混合液（それぞれ２ｍＭ）を４μを加え、クレノー断片
を３ユニット加えて、２０℃、３０分反応させた。反応
液をフェノール−クロロホルムでｍ出ｉ、エタノールで
ＤＮＡを沈澱させた。このうち２５０ ｎｇ Ｏ） Ｄ
ＮＡを１０ｔｔＬのライゲーション溶液（５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ” ＨＣｌ（ｐＨ７，４）、１０ｍＭ ＭｇＧ４
１０ ｍＭ’ ＤＴＴ、 ＩｍＭ ＡＴＰ Ｊ中で、５
ユニツトのＴ、ＤＮＡリガーゼ６１５℃で６時間反応さ
せ環状化した後、大＠直ＨＢＩＯＩを形質転換した。ア
ンピシリン耐性をマーカーに選択された形質転換株のう
ち、ｐｓＰ−６２−ＰＬのボＩＪ ＩＪンカー（ｐｏｌ
ｙｌｉｎｋｅｒ ）中Ｈｉｎｄｊ切断認識部位から５ａ
ｌｌ切断認識部位までが欠失したＤＮＡを持つ株を選び
、該ＤＮＡを常法により分離した。
該プラスミドＤＮＡを制限酵素Ｓａｌ ［で３７℃、２
時間消化した。反応液３０μｔ〔プラスミドＤＮＡ２μ
？、１０ ｍＭ Ｔｒ ｉ ｓ １ＩＨＣ１ｐＨ７，５
，７ｙｎ Ｍ Ｍｇ Ｃ４，１７５ｍＭ ＮａＣ１％０
．２ｍＭ ＥＤＴＡ、 ７ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ール、０，０１％ＢＳＡ、 ５ｓｉｌ Ｉ １６ ユ
ニット〕。この反応液にｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＧ
ＴＰ、 ｄＴＴＰの混合液（それぞれ２ｍＭ）を５μを
加え、クレノー断片を３ユニット加えて、２０℃、３０
分反応させた。
時間消化した。反応液３０μｔ〔プラスミドＤＮＡ２μ
？、１０ ｍＭ Ｔｒ ｉ ｓ １ＩＨＣ１ｐＨ７，５
，７ｙｎ Ｍ Ｍｇ Ｃ４，１７５ｍＭ ＮａＣ１％０
．２ｍＭ ＥＤＴＡ、 ７ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ール、０，０１％ＢＳＡ、 ５ｓｉｌ Ｉ １６ ユ
ニット〕。この反応液にｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＧ
ＴＰ、 ｄＴＴＰの混合液（それぞれ２ｍＭ）を５μを
加え、クレノー断片を３ユニット加えて、２０℃、３０
分反応させた。
反応液ラフエノール拳りロロホルムで抽出し、エタノー
ルでＤＮＡを沈澱させた。
ルでＤＮＡを沈澱させた。
該ＤＮＡ ２μ？と５′末端をリン酸化したＨｉｎｄｌ
リンカ−ＤＮＡ０．４５μｔを前記したライゲーション
溶液（前記着こ同じ）２０μを中で２０ユニツトのＴ４
ＤＮＡＩＪガーゼを加えて１５℃、 ２００時間反応せ
た後、大ＰＩＪＩ歯ＨＢ １０１を形質転換した。形質
転換株のうち、５ａｌｔ切断認識部位がなくなり、Ｈｉ
ｎｄ ｌ切断認識部位が形成されたプラスミドＤＮＡを
持つ味を選択し、該プラスミドＤＮＡを、ＩＬの培地で
培養した菌体より、常法により分離した（図−１中のｐ
ｓＰ６２−に２ ）。
リンカ−ＤＮＡ０．４５μｔを前記したライゲーション
溶液（前記着こ同じ）２０μを中で２０ユニツトのＴ４
ＤＮＡＩＪガーゼを加えて１５℃、 ２００時間反応せ
た後、大ＰＩＪＩ歯ＨＢ １０１を形質転換した。形質
転換株のうち、５ａｌｔ切断認識部位がなくなり、Ｈｉ
ｎｄ ｌ切断認識部位が形成されたプラスミドＤＮＡを
持つ味を選択し、該プラスミドＤＮＡを、ＩＬの培地で
培養した菌体より、常法により分離した（図−１中のｐ
ｓＰ６２−に２ ）。
ｐＳＰ６２−に２１００μｆに１２０ユニツトのＳａｃ
［を反応液４００μｌ （１０ｍＭ Ｔｒｉｓ１１Ｈ
ＣｔｐＨ７，５，７ｍＭＭｇＣ／、、７ｍＭ２−メルカ
プトエタノール〕で３７１：、１．５時間反応させた麦
、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿及び
エタノール洗浄を行なってＤＮＡを回収した。
［を反応液４００μｌ （１０ｍＭ Ｔｒｉｓ１１Ｈ
ＣｔｐＨ７，５，７ｍＭＭｇＣ／、、７ｍＭ２−メルカ
プトエタノール〕で３７１：、１．５時間反応させた麦
、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿及び
エタノール洗浄を行なってＤＮＡを回収した。
得られ７１：ＤＮＡを反応液（ＤＮＡ １００μ？、
１４０ ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭ Ｔｒｉ
ｍ φＨＣ１（ＰＩ（６，８）、１ ｍＭ Ｃｏ （／
４．０．１ ｍＭ ＤＴＴ、 ０．１ ｍＭ ＧＴＰ
（”Ｈ−ｄＧＴＰ２μＣｉ含有）、ＴＴａｓｅ ２７ユ
ニツト〕中、３７℃で２０分間反応させ、平均長１４塩
基のｄＧ鎖がＳａｃ ｌ断端に付加された時点で０．２
Ｍ ＥＤＴＡ ｔ。
１４０ ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭ Ｔｒｉ
ｍ φＨＣ１（ＰＩ（６，８）、１ ｍＭ Ｃｏ （／
４．０．１ ｍＭ ＤＴＴ、 ０．１ ｍＭ ＧＴＰ
（”Ｈ−ｄＧＴＰ２μＣｉ含有）、ＴＴａｓｅ ２７ユ
ニツト〕中、３７℃で２０分間反応させ、平均長１４塩
基のｄＧ鎖がＳａｃ ｌ断端に付加された時点で０．２
Ｍ ＥＤＴＡ ｔ。
μｔ、１０％５Ｄ５５μｔを加えて反応を停止し、フェ
ノール・クロロホルム抽出、エタノール沈澱及びエタノ
ール洗浄してＤＮＡ［図−１中の（Ｄ）ｆ回収した。
ノール・クロロホルム抽出、エタノール沈澱及びエタノ
ール洗浄してＤＮＡ［図−１中の（Ｄ）ｆ回収した。
得られたＤＮＡを反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ 拳ＨＣ
ｔ（ｐＨ７，５） 、 ７ｍＭ ＭｇＣＬｔ、 ６０ｍ
Ｍ ＮａＣ１，Ｈｉｎｄ Ｉ ５０ユニット〕中、３７
℃、２時間反応させた後、１．５係アガロースゲル上で
電気泳動し、小さい方のフラグメント（約５００塩基対
）をＤＥＡＥ−ペーパー法で分取してリンカ−ＤＮＡを
得た。
ｔ（ｐＨ７，５） 、 ７ｍＭ ＭｇＣＬｔ、 ６０ｍ
Ｍ ＮａＣ１，Ｈｉｎｄ Ｉ ５０ユニット〕中、３７
℃、２時間反応させた後、１．５係アガロースゲル上で
電気泳動し、小さい方のフラグメント（約５００塩基対
）をＤＥＡＥ−ペーパー法で分取してリンカ−ＤＮＡを
得た。
（２）） ｅＤＮ＾の合成
りｍ１２
刺激されたＴ細胞（Ｈ６，Ｃ−Ｈ−２２，１９７細胞）
より分離し、蔗塘勾配法で分画したｐｏｌｙＡ”ＲＮＡ
３μ２を、０．７μ？の（１；で得たベクター・プラ
イマーＤＮＡを用いて、２０μｔの反応液（５０ｒｎＭ
Ｔｒ ｉｓ φＨＣ１（ｐＨ８，３）、８ ｍＭ Ｍｇ
Ｃ４，３０ｍＭＫＣｔ。
より分離し、蔗塘勾配法で分画したｐｏｌｙＡ”ＲＮＡ
３μ２を、０．７μ？の（１；で得たベクター・プラ
イマーＤＮＡを用いて、２０μｔの反応液（５０ｒｎＭ
Ｔｒ ｉｓ φＨＣ１（ｐＨ８，３）、８ ｍＭ Ｍｇ
Ｃ４，３０ｍＭＫＣｔ。
０．３ｍＭ ＤＴＴ、 ２ｍＭ ｄＮＴＰ （ｄＡＴＰ
、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰのそれぞれ）％
１０μＣＩ α−”Ｐ −ｄｃＴＰ］中テ、５ユニツ
トの逆転写酵素を加えて、 Ｅ’−ｄＣＴＰ（７）取込
みをモニターしながら反応させ、前記と同様の後処理（
反応の停止、抽出、沈澱及び洗浄）をしてＤＮＡを回収
した。
、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰのそれぞれ）％
１０μＣＩ α−”Ｐ −ｄｃＴＰ］中テ、５ユニツ
トの逆転写酵素を加えて、 Ｅ’−ｄＣＴＰ（７）取込
みをモニターしながら反応させ、前記と同様の後処理（
反応の停止、抽出、沈澱及び洗浄）をしてＤＮＡを回収
した。
得られたＤＮＡを、ｄＴ鎖又はｄＧ鎖の付加のために前
記したと同様にして、平均長１４塩基のｄＣ鎖が付加さ
れたＤＮＡを得た。
記したと同様にして、平均長１４塩基のｄＣ鎖が付加さ
れたＤＮＡを得た。
得られたＤＮＡを反応液［６ｍＭ Ｔｒｉｓ ＠ＨＣＡ
（＋）８７．５）、６ ｍＭ Ｍｇ Ｃ４，６ｍＭ
２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ ＮａＣ６，０，
０１４ＢＳＡ）中で、５ユニツトのＨｉｎｄ Ｉを加え
３７℃で１時間消化し、同様の後処理を行なってＤＮＡ
（図−１中の（■）〕を回収した。
（＋）８７．５）、６ ｍＭ Ｍｇ Ｃ４，６ｍＭ
２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ ＮａＣ６，０，
０１４ＢＳＡ）中で、５ユニツトのＨｉｎｄ Ｉを加え
３７℃で１時間消化し、同様の後処理を行なってＤＮＡ
（図−１中の（■）〕を回収した。
得られたＤＮＡと（１）で得たリンカ−ＤＮＡとを反応
液１００μｔ （２０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＬ （声
７，５）、４ｍＭＭｇＣ４，１０ｍＭ （ＮＨ，）、５
０４．０．Ｉ ＭＫＣ１％ ０．１ ｍＭ、？−Ｎｈｏ
％０．０１壬ＢＳＡ、 ０．６μｔ Ｅ、 ｃｏｌｉ
ＤＮＡリガーゼ〕中、１２℃で一夜反応し、得られた反
応液に矢の成分を指定の濃度になるようζこ追加した（
ｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれ
ぞれ４０μＭ 、 ０．１ ５ ｍＭ ）３
−ＮＡＤ ％ ０．４ μｒ Ｅ、
ｃｏｌｉ ＤＮＡ リ ガーゼ（追加分）
、０．３ μｔ Ｅ、 ｃｏ目ＤＮＡポリメラーゼ１．
ＩＬニットｌｉｄ、ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈ］、）こ
の反応液を１２℃で１時間及び２５℃で１時間反応させ
て％ｃ ＤＮＡを持つ目的とするプラスミドＤＮＡを含
む反応液を得た。得られた反応液はそのまま人の操作へ
供した。
液１００μｔ （２０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＬ （声
７，５）、４ｍＭＭｇＣ４，１０ｍＭ （ＮＨ，）、５
０４．０．Ｉ ＭＫＣ１％ ０．１ ｍＭ、？−Ｎｈｏ
％０．０１壬ＢＳＡ、 ０．６μｔ Ｅ、 ｃｏｌｉ
ＤＮＡリガーゼ〕中、１２℃で一夜反応し、得られた反
応液に矢の成分を指定の濃度になるようζこ追加した（
ｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれ
ぞれ４０μＭ 、 ０．１ ５ ｍＭ ）３
−ＮＡＤ ％ ０．４ μｒ Ｅ、
ｃｏｌｉ ＤＮＡ リ ガーゼ（追加分）
、０．３ μｔ Ｅ、 ｃｏ目ＤＮＡポリメラーゼ１．
ＩＬニットｌｉｄ、ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈ］、）こ
の反応液を１２℃で１時間及び２５℃で１時間反応させ
て％ｃ ＤＮＡを持つ目的とするプラスミドＤＮＡを含
む反応液を得た。得られた反応液はそのまま人の操作へ
供した。
ＱＶ） ｃＤＮＡライブラリーの作製大腸菌ＨＢＩＯ
Ｉのコンビテンよ・細胞Ｅ、Ｇ１１）で得たｃ ＤＮＡ
を持ったプラスミドＤＮＡを用いて常法により形質転換
してｃＤＮＡライブラリーを得た。
Ｉのコンビテンよ・細胞Ｅ、Ｇ１１）で得たｃ ＤＮＡ
を持ったプラスミドＤＮＡを用いて常法により形質転換
してｃＤＮＡライブラリーを得た。
得られたｃＤＮＡライブラリーから、それぞれ１グルー
プにつき２５０個の独立な形質転換菌から成るグループ
を１６グル一プ作成した。
プにつき２５０個の独立な形質転換菌から成るグループ
を１６グル一プ作成した。
実施例２ 試験管内転写
（１）鋳型ＤＮＡの調製及び制限酵素の選定実施例１で
得たｅＤＮＡライブラリーから前記と同様の操作をして
プラスミドＤＮＡを分取し、制限酵素Ｐｓｔ ｒ ｓ
Ｓａｃ Ｉ及びＳａｌ （の３種類のそれぞれを用いて
消化したのち、フェノール・クロロホルム抽出、エタノ
ール沈殿及び乾燥を行なって、得られたＤＮＡを試験管
内転写の＠賊ＤＮＡとした。
得たｅＤＮＡライブラリーから前記と同様の操作をして
プラスミドＤＮＡを分取し、制限酵素Ｐｓｔ ｒ ｓ
Ｓａｃ Ｉ及びＳａｌ （の３種類のそれぞれを用いて
消化したのち、フェノール・クロロホルム抽出、エタノ
ール沈殿及び乾燥を行なって、得られたＤＮＡを試験管
内転写の＠賊ＤＮＡとした。
得られた３種類の鋳型ＤＮＡを用いて後述の試験管内転
写及びＩｇＧ、誘導因子ｃＤＮＡのスクＩＪ−ニングを
行なった。その結果を表−１に示す。この実験結果から
Ｐｓｉｌ及びＳａｃ Ｉは不適当であり、５ａｉｌが適
当な制限酵素であることがわかった。
写及びＩｇＧ、誘導因子ｃＤＮＡのスクＩＪ−ニングを
行なった。その結果を表−１に示す。この実験結果から
Ｐｓｉｌ及びＳａｃ Ｉは不適当であり、５ａｉｌが適
当な制限酵素であることがわかった。
従ってＳａｌ Ｉを用いて消化して得られるＤＮＡを試
験管内転写の鋳型ＤＮＡとして以唆用いた。
験管内転写の鋳型ＤＮＡとして以唆用いた。
（１） 試験管内転写
室温で、下記の順番に従って速やかに混合し、４０℃で
１時間反応させた。
１時間反応させた。
１．２回蒸留水 １９．３と２．
５×転写バツフアー １゜３、１ Ｍ Ｄ
ＴＴ ｏ、５Ｉｌ−１７
０ユニツト／μｔ ５、ｒＮＴＰ色 ４６、
１０ｍＭ ｍ’Ｇ （５’）ｐｐｐ（５’） Ｇ
５７、１Ｗ／ｄ ＢＳＡ
５８、鋳型ＤＮＡ １μｍ／μｔ３ ９、α−”Ｐ−ＧＴＰ １１００００ｃｐ／μｔ２１
５ユニツト／μを ４量 ５０μｔ ただし、５×転写バツフアーは［２００ｒｏＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＡ （ｐＨ７，５） 、 ３０ ｍＭ ＭｇＣ
ｌ、、１０ｍＭスペルミジンコであり、ｒＮＴＰｍは〔
それぞれ２．５ｍＭのＡＴＰ。
５×転写バツフアー １゜３、１ Ｍ Ｄ
ＴＴ ｏ、５Ｉｌ−１７
０ユニツト／μｔ ５、ｒＮＴＰ色 ４６、
１０ｍＭ ｍ’Ｇ （５’）ｐｐｐ（５’） Ｇ
５７、１Ｗ／ｄ ＢＳＡ
５８、鋳型ＤＮＡ １μｍ／μｔ３ ９、α−”Ｐ−ＧＴＰ １１００００ｃｐ／μｔ２１
５ユニツト／μを ４量 ５０μｔ ただし、５×転写バツフアーは［２００ｒｏＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＡ （ｐＨ７，５） 、 ３０ ｍＭ ＭｇＣ
ｌ、、１０ｍＭスペルミジンコであり、ｒＮＴＰｍは〔
それぞれ２．５ｍＭのＡＴＰ。
ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰ ）であり、ｍ’ ｃ （５
’） ｐｐｐ（５’）Ｇは２個のＧＴＰが５′同士で結
合し、さらに−万のグアニンの７位がメチル化されたも
ので、真咳生物ｍＲＮＡのキャップ構造のアナログであ
る〔Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｍ ）の現品〕。
’） ｐｐｐ（５’）Ｇは２個のＧＴＰが５′同士で結
合し、さらに−万のグアニンの７位がメチル化されたも
ので、真咳生物ｍＲＮＡのキャップ構造のアナログであ
る〔Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｍ ）の現品〕。
得られた合成ｍＲＮＡは、次のよう１こゲルろ過ｉこよ
り、基質のγＮＴ Ｐｓから分離した。１−の使い捨て
シリンジに、ＴＥバッファー［１０ｒｎＭ Ｔｒｉｓ・
Ｈｃｔ（ｐＨ８，０）、１ ｍＭ Ｅ ＤＴＡ （ｐＨ
ｓ、ｏ ） ］ テ平衡化した。セファデックスＧ−５
０（ファーマシア（ＰｂａｒｍａＣｉａ ）社製品〕を
充填する。このカラムζこ上記反応液を供して、１３０
０ ｒｐｍで４分間遠心して、溶出液中に合成ｍＲＮＡ
を回収した。溶出液中の３２ ｐのカウントを測定し、
合成ＲＮＡｔを見積もった。上記条件で１．５〜２．５
μ？の合成ｍＲＮＡが回収された。
り、基質のγＮＴ Ｐｓから分離した。１−の使い捨て
シリンジに、ＴＥバッファー［１０ｒｎＭ Ｔｒｉｓ・
Ｈｃｔ（ｐＨ８，０）、１ ｍＭ Ｅ ＤＴＡ （ｐＨ
ｓ、ｏ ） ］ テ平衡化した。セファデックスＧ−５
０（ファーマシア（ＰｂａｒｍａＣｉａ ）社製品〕を
充填する。このカラムζこ上記反応液を供して、１３０
０ ｒｐｍで４分間遠心して、溶出液中に合成ｍＲＮＡ
を回収した。溶出液中の３２ ｐのカウントを測定し、
合成ＲＮＡｔを見積もった。上記条件で１．５〜２．５
μ？の合成ｍＲＮＡが回収された。
得られたｍＲＮＡを７エノール処理、エタノール沈澱、
乾燥後、蒸留水に溶かした（０．３μ２／μｔ）。
乾燥後、蒸留水に溶かした（０．３μ２／μｔ）。
実施例３ ＩｇＧ、誘導因子ｃＤＮＡのスクリーニン
グ実施例１の（１ｖ）で得られた１６のグループのそれ
ぞれのグループについて実施例２に従ってｍＲＮＡを合
成し、１６種類のｍＲＮＡ溶液（０，３μｒ／μＺ）を
調製した。
グ実施例１の（１ｖ）で得られた１６のグループのそれ
ぞれのグループについて実施例２に従ってｍＲＮＡを合
成し、１６種類のｍＲＮＡ溶液（０，３μｒ／μＺ）を
調製した。
体長約１０譚の成熟メスのアフリカッメガエル（Ｘａｎ
ｏｐｕｓ Ｉａｅｖｉｓ ）を氷水中につけて麻酔し、
解剖して卵母細胞を取り出し、修正パース（Ｂａｒｔｈ
’ｓ）培養液（Ｃｏｌｍａｎ、Ａ＋、 Ｔｒａｎｓｃｒ
ｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓ−Ｉｍｔ ｉｏｔ＋
ａ ｐｒａｅｔ ｔｅａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ 、編
者Ｈａｎｅｓ 、 Ｂ。
ｏｐｕｓ Ｉａｅｖｉｓ ）を氷水中につけて麻酔し、
解剖して卵母細胞を取り出し、修正パース（Ｂａｒｔｈ
’ｓ）培養液（Ｃｏｌｍａｎ、Ａ＋、 Ｔｒａｎｓｃｒ
ｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓ−Ｉｍｔ ｉｏｔ＋
ａ ｐｒａｅｔ ｔｅａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ 、編
者Ｈａｎｅｓ 、 Ｂ。
Ｄ、、及び”ｇｇ”８ ＋ Ｓ−Ｊ−＊ ９９．２９１
、 Ｉ ＲＬ Ｐｒｅｓｓ。
、 Ｉ ＲＬ Ｐｒｅｓｓ。
１９８４ ）中で、白金線を使用して、卵母細＋＠を１
個ずつに分離した。合成ｍＲＮＡ石液（０，３μ？／μ
ｔ）７Ｏｎｔずつを、個々の卵母細胞にキャピラリーと
、マイクロマニピュレーターを用いて実体顕微鏡下に注
入した。１試料につき２０個の卵母＠胞を使用し、１０
μを修正パース培養液／卯母細胞で２０℃、３６時間培
養した。この後培養上清を、エツペンドルフ遠心機で１
２０００ ｒｐｍ、 ４℃、２０分間遠心して、その上
清を回収し、径０．４５μｍの残置ミリポアフィルタ−
を通してｍ ＲＮ Ａに由来する蛋白質を含む上清液を
碍た。
個ずつに分離した。合成ｍＲＮＡ石液（０，３μ？／μ
ｔ）７Ｏｎｔずつを、個々の卵母細胞にキャピラリーと
、マイクロマニピュレーターを用いて実体顕微鏡下に注
入した。１試料につき２０個の卵母＠胞を使用し、１０
μを修正パース培養液／卯母細胞で２０℃、３６時間培
養した。この後培養上清を、エツペンドルフ遠心機で１
２０００ ｒｐｍ、 ４℃、２０分間遠心して、その上
清を回収し、径０．４５μｍの残置ミリポアフィルタ−
を通してｍ ＲＮ Ａに由来する蛋白質を含む上清液を
碍た。
マウス（Ｃ５７ＢＩ、雌６週令〜１０週令）の牌臓を取
り出し、常法によりリンパ球を分離した。
り出し、常法によりリンパ球を分離した。
ＲＰＭＩ−１６４０−２１Ｆｅ２ ｒ ２回洗浄し、４
Ｘ１０’個／−で培地（ＲＰＭＩ−１６４０，１５％Ｆ
Ｃ５，５Ｘ１０−’Ｍ２−メルカプトエタノール）にけ
んだくしでＬＰＳ ［ディフコ（Ｄｉｒｃｏ ）社製品
〕を５０μＰ／−の濃度で加えた。９６穴のマイクロタ
イタープレートに細胞けんだく液を一穴に２００μＬず
つ入れ、２４時間後に先に得た卵母細胞の培養上清２０
μを及び５０μｔをそれぞれ加え、４〜５日培養した。
Ｘ１０’個／−で培地（ＲＰＭＩ−１６４０，１５％Ｆ
Ｃ５，５Ｘ１０−’Ｍ２−メルカプトエタノール）にけ
んだくしでＬＰＳ ［ディフコ（Ｄｉｒｃｏ ）社製品
〕を５０μＰ／−の濃度で加えた。９６穴のマイクロタ
イタープレートに細胞けんだく液を一穴に２００μＬず
つ入れ、２４時間後に先に得た卵母細胞の培養上清２０
μを及び５０μｔをそれぞれ加え、４〜５日培養した。
培養抜穴ごとに、Ｉｇｃｔ＋ｉ生細、Ｉｉ＠数とＩｇＧ
、産生細胞数をリバースプラークアッセイ（ｒｅｖｅｒ
ｓｅ ｐ、１ａ−ｑｕｅ ａｓｓａｙ ） （Ｇｒｏｎ
ｏｗｉｃｚ、 Ｅ、、 ｅｔａｌ Ｅｕｒ、 Ｊ 。
、産生細胞数をリバースプラークアッセイ（ｒｅｖｅｒ
ｓｅ ｐ、１ａ−ｑｕｅ ａｓｓａｙ ） （Ｇｒｏｎ
ｏｗｉｃｚ、 Ｅ、、 ｅｔａｌ Ｅｕｒ、 Ｊ 。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 ６ 、５８８ 、１９７６ ）で
測定し、ＩｇＧ３ｉｔ ’ｉ ｈ ）ｋＬｔ−ｔ Ｉｇ
ｃＴ＋４ ’ＬｌＡｎＬ数を指標に、ＩｇＧ、誘導因子
の活性をスクリーニングした。１６グループのうち３つ
のグループ（＋１、ナ３．す１６ ）に、Ｉ ｇＧ、誘
導因子の活性を認めた。
測定し、ＩｇＧ３ｉｔ ’ｉ ｈ ）ｋＬｔ−ｔ Ｉｇ
ｃＴ＋４ ’ＬｌＡｎＬ数を指標に、ＩｇＧ、誘導因子
の活性をスクリーニングした。１６グループのうち３つ
のグループ（＋１、ナ３．す１６ ）に、Ｉ ｇＧ、誘
導因子の活性を認めた。
活性が認められた３つのグループのうち２つのグループ
（≠１、＋３）のｃＤＮＡプラスミドを用いで、大腸菌
ＨＢＩＯＩを形′成転換した。それぞれから４００クロ
ーンずつをランダムに選別し、それぞれ３０μｍ／−の
アンピシリンを含む、Ｌ−培地（Ｌｕｒｉａ’ｓ Ｍｅ
ｄｉｕｍ ） ０．５−中ｌこ培養した（それぞれ１つ
の形質転換株から成る４００のグループで合表−１マウ
ス牌臓のリンパ球培養による各試料のＩｇＧ、、誘導活
性 計８ｏｏノグループ）。このうち、２５の形質転換床を
１グループとするために、各グループから２０μｔずつ
合計２５グル一プ分を混合して形質転換床２５個のグル
ープを１６ずつ合計３２グループ作製し、。全３２グル
ープ（各グループには２５個の形質転換床を含む）ζこ
ついて前記した１６グループの時と同４７ｅＪこしてス
クリーニングを続けてφ１−４、＋３−１２及びす３−
１５にＩｇＧ、誘導因子の活性を認めた。このうち◆３
−１２．す３−１５の２つのグループ（２５Ｘ２個の形
゛文転換沫）の全形質転換株ζこついて、同様のスクリ
ーニングをして２グループの中にそれぞれ１個ずつＩ
ｇＧ、誘導因子の活性を認めた。
（≠１、＋３）のｃＤＮＡプラスミドを用いで、大腸菌
ＨＢＩＯＩを形′成転換した。それぞれから４００クロ
ーンずつをランダムに選別し、それぞれ３０μｍ／−の
アンピシリンを含む、Ｌ−培地（Ｌｕｒｉａ’ｓ Ｍｅ
ｄｉｕｍ ） ０．５−中ｌこ培養した（それぞれ１つ
の形質転換株から成る４００のグループで合表−１マウ
ス牌臓のリンパ球培養による各試料のＩｇＧ、、誘導活
性 計８ｏｏノグループ）。このうち、２５の形質転換床を
１グループとするために、各グループから２０μｔずつ
合計２５グル一プ分を混合して形質転換床２５個のグル
ープを１６ずつ合計３２グループ作製し、。全３２グル
ープ（各グループには２５個の形質転換床を含む）ζこ
ついて前記した１６グループの時と同４７ｅＪこしてス
クリーニングを続けてφ１−４、＋３−１２及びす３−
１５にＩｇＧ、誘導因子の活性を認めた。このうち◆３
−１２．す３−１５の２つのグループ（２５Ｘ２個の形
゛文転換沫）の全形質転換株ζこついて、同様のスクリ
ーニングをして２グループの中にそれぞれ１個ずつＩ
ｇＧ、誘導因子の活性を認めた。
図−１は本発明の方法においてプラスミドＤＮＡを構築
する例を示す図式である。 代理人弁理±（ｓ１ｏ８）大 家 邦 久 、ＦＷｒ）
７パミ゛テ１；□″−− 李′１−１ 手続補圧雪 昭和６０年１１月７ 日
する例を示す図式である。 代理人弁理±（ｓ１ｏ８）大 家 邦 久 、ＦＷｒ）
７パミ゛テ１；□″−− 李′１−１ 手続補圧雪 昭和６０年１１月７ 日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ａ）常法により分取し分画したターゲット物質のｍ
ＲＮＡを含むｍＲＮＡ群を、 ｂ）公知のプラスミドＤＮＡから得た、ポリリンカーの
上流にｄＴ鎖を有するベクター・プライマーＤＮＡにハ
イブリダイズし、 ｃ）逆転写酵素で単鎖ｃＤＮＡを合成したのち、その末
端にデオキシリボヌクレオチド鎖を付加したベクターＤ
ＮＡを得、 ｄ）公知のプラスミドＤＮＡから得た、ＳＰ６プロモー
ターとその下流にｃ）で付加したデオキシリボヌクレオ
チド鎖と対合できるデオキシリボヌクレオチド鎖を有す
るリンカーＤＮＡで環状化したのち、ｍＲＮＡ部分をＤ
ＮＡに置換して、ｍＲＮＡ群中のそれぞれのｍＲＮＡに
対応したプラスミドＤＮＡ群を得、 ｅ）得られたプラスミドＤＮＡ群を用いて宿主を形質転
換し、 ｆ）形質転換した宿主からプラスミドＤＮＡ群を分離し
、何種類かの制限酵素のそれぞれで切断して得られるｃ
ＤＮＡ群を鋳型として、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼで試
験管内転写をして合成ｍＲＮＡ群を得、これを翻訳して
得られる蛋白質について、ターゲット物質の活性試験を
して適当な制限酵素を選び、 ｇ）ｅ）で得た形質転換した宿主の数の小さなグループ
を作成し、それぞれのグループについて、ｆ）で選ばれ
た制限酵素を用いてｆ）と同様の操作を行なつて活性を
有するグループを選び出し、選ばれたグループの形質転
換した宿主について同様の操作を行なうことを特徴とす
る遺伝子クローニングの方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60214869A JPS6274291A (ja) | 1985-09-30 | 1985-09-30 | 遺伝子クロ−ニングの方法 |
| EP86307438A EP0218432A3 (en) | 1985-09-30 | 1986-09-29 | Methods for cdna cloning, and vector-primer dna, plasmid dna and linker dna, used in the said methods |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60214869A JPS6274291A (ja) | 1985-09-30 | 1985-09-30 | 遺伝子クロ−ニングの方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6274291A true JPS6274291A (ja) | 1987-04-06 |
Family
ID=16662908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60214869A Pending JPS6274291A (ja) | 1985-09-30 | 1985-09-30 | 遺伝子クロ−ニングの方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0218432A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6274291A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0740943B2 (ja) * | 1985-09-30 | 1995-05-10 | 佑 本庶 | 新規なポリペプチドをコードするｄｎａ及びその製造方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56128796A (en) * | 1980-02-15 | 1981-10-08 | Cpc International Inc | Genetically transformed microbe for mass production of amylolytic enzyme and its prescription |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0740943B2 (ja) * | 1985-09-30 | 1995-05-10 | 佑 本庶 | 新規なポリペプチドをコードするｄｎａ及びその製造方法 |
-
1985
- 1985-09-30 JP JP60214869A patent/JPS6274291A/ja active Pending
-
1986
- 1986-09-29 EP EP86307438A patent/EP0218432A3/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56128796A (en) * | 1980-02-15 | 1981-10-08 | Cpc International Inc | Genetically transformed microbe for mass production of amylolytic enzyme and its prescription |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0218432A3 (en) | 1988-11-09 |
| EP0218432A2 (en) | 1987-04-15 |
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