KR970009936B1 - lgE 수용체 α-서브유니트 또는 그의 단편, 이들을 암호화하는 DNA 및 이 DNA를 포함하는 벡터 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

IgE 수용체 α-서브유니트 또는 그의 단편, 이들을 암호화하는 DNA 및 이 DNA를 포함하는 벡터
고등 척추동물의 결합 조직내에 위치하는 비만 세포(mast cell)는 세포질 과립내에 히스타민, 프로스타글란딘(국소적 화학물질 전달인자) 및 프로테아제를 저장하고 있다. 자극을 받으면(예, 면역학적 반응에 의해서), 이들 과립의 내용물들이 비만 세포로부터 방출된다. 히스타민은 그 근방의 세포들에 대하여서만 작용하며, 방출된 경우 혈관을 확장시켜 혈청 단백질(예, 항체)과 기타 면역계 성분들(예, 백혈구)에 대한 투과성을 증대시킨다. 히스타민은 건초열과 같은 알레르기 반응의 임상적 증상에 대단히 깊게 관여한다[메츠거(Metzger) 등, 1986, Ann. Rev. Immunol. 4 : 419].
면역학적 자극은 IgE 분자들에 의해 중개되며, 상기 IgE는 고등 척추동물내에서 발견되는 5가지 부류의 항체들중 1종이다. IgE분자는 풍부하고 특이적인 비만 세포 표면 수용체에 높은 친화도로 결합한다. 결합된 IgE분자는 특이적인 알레르겐 분자와 결합하게 되며, 2개 이상의 결합된 IgE 분자들과 알레르겐이 교차-결합함으로써 비만 세포 세포질 과립 내용물들의 방출이 유도된다는 사실은 상당한 증거에 의해 뒷받침된다. [메츠거 등, 1986, Ann. Rev. Immunol. 4 : 419; 이시자카(Ishizaka)등, 1977.J.Immunol.119 : 1589; 이세르스키(Isersky)등, 1978.J.Immunol. 121 : 549; 프뢰세(Froese), 1984. Prog.Allergy 34: 142; 루이스 앤드 오스텐(Lewis and Austen), 1981.Nature, 293: 103].
비만 세포 표면 수용체는 3개의 서브유니트, 즉 세포의 외면에 노출되어 있고 IgE-결합 부위를 보유한 50∼60kd의 많이 글리코실화된 α-서브유니트와 각각 약 30kd 및 20kd의 2개의 비-글로코실화된 멤브레인내 성분인 β서브유니트 및 γ 서브유니트로 구성된다[메츠거 등, 1986, Ann. Rev. Immunol. 4 : 419 ; 프뢰세(Froese), 1984. Prog.Allergy 34: 142].
발명의 개요
일반적으로, 본 발명은 인체 비만 세포 IgE 표면 수용체의 α-서브유니트를 암호화하는 cDNA 서열을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 인체 비만 세포 IgE 표면 수용체의 α-서브유니트를 암호화하는 DNA를 함유하는 벡터(플라스미드 또는 비루스)를 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 그외에도, 인체 IgE와 결합할 수 있는, 인체 비만 세포 IgE 표면 수용체의 α-서브유니트의 가용성 단편을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따라 수득되는 인체 IgE 수용체의 α-서브유니트 또는 그의 단편들은 각종 진단 및 치료 용도로 이용할 수 있으며, 이에 관하여서는 이하에서 보다 상세히 기술하기로 한다.
본 발명의 기타 다른 특징 및 잇점들도 또한 이하에 기술하는 바람직한 실시양태 및 특허 청구의 범위에서 보다 상세히 기술하고자 한다.
바람직한 실시양태들의 설명
인체 비만 세포 IgE 표면 수용체의 α-서브유니트를 암호화하는 cDNA 서열은 이하에 기술하는 일반적인 일련의 단계들에 따라 제조되었다. 먼저, 래트 IgE 표면 수용체의 α-서브유니트를 정제하여 단편들을 얻은 후, 트립신분해성, 티드를 수득하였다. 그후 트립신분해성 펩티드들중 1개의 아미노산 서열을 기초로하여 고안된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 래트 cDNA 클론을 분리하였다. 인체 cDNA 라이브러리를 제조한 후, 래트 cDNA 단편들을 사용하여 인체 라이브러리를 선별하였다. 보다 자세히 설명하면, 상술한 공정들은 다음과 같이 수행되었다.
래트 IgE 수용체 단백질 정제, 트립신분해서 펩티드 제조 및 서열 결정
래트 호염기성 백형병(RBL-2H3) 세포들을 용해시켜 세파로스 4B비이드에 커플링시킨 단일 클론성 항-래트 비만 세포 IgE 수용체 항체(mAb BC4)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다[바싸아노(Basciano)등, 1986,J.B.C., 261권, 11823페이지]. 비이드 들을 세정하여 결합된 단백질을 5% 아세트산으로 용출시킨후, 동결건조시켰다. 분취액을 NaDodSO4-PAGE로 분석한 후[라에몰리(Laemmli), 1970, Nature, 227 : 680]. 실버 염색[오아클리(Oakley)등, 1980, Anal.Biochem, 105 : 361]을 실시했다. 예상대로, 수용체의 α,β및γ쇄에 해당되는 밴드들이 존재하였다. 다른 수용체 성분에 대하여서는 NaDodSO4-PAGE로부터 용출시켜 추가 정제하였다.
N-말단 분석을 실시하여 아미노산 서열을 측정하는 것은, 용출된 α-서브유니트 시료의 N2-말단부가 차단된 것으로 나타나기 때문에 부적절하다. 따라서, 시료를 37℃ 및 N하에서 6M 구아니딘 HCl, 100mM 트리스(pH8.3) 및 1.0mM EDTA중의 2mM 디티오트레이톨로 환원시킨 후, 10mM 요오도아세트산을 사용하여 S-카르복시메틸화시켰다. 바이닥(Vydac)C4컬럼상에서 HPLC를 실시하여 염을 제거하고, 탈염된 시료들을 100mM 트리스(pH7.2)중에서 TPCK(L-1-토실아미도-2-페닐에틸 클로로메틸 케톤) 처리한 트립신으로 처리하였다. 생성된 트립신분해성 펩티드를 바이닥 C4컬럼상에서 HPLC로 분리하였으며, 그 용출 프로필은 제1도에 나타낸 바와 같다. 도면내에서 화살표로 나타낸 피이크들에 대하여 어플 라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 증기상 아미노산 시퀀서를 이용하여 아미노산 서열 분석을 실시하였다. 이들 피이크로부터 수득된 펩티드 서열은 이하의 표 1에 나타내는 바와 같다.
Figure kpo00001
래트 비만 세포 IgE 수용체 α-서브유니트 cDNA 클론의 분리 및 뉴클레오티드 서열 결정
래트 IgE 수용체 α-서브유니트 cDNA를 분리하기 위해 래트 α-서브유니트 유전자에 대하여 상보적인 것으로 추정되는 올리고뉴클레오티드를 합성한 후, 수득된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 래트 cDNA 라이브러리를 선별하였다.
올리고뉴클레오티드 프로브
위스콘신 대학의 유전학 컴퓨터 그룹으로부터의 소프트 웨어 버젼 4와5를 이용하여 트립신부해성 단편의 컴퓨터 분석을 실시하였다[드베록스(Devereux) 등, Nucl. Acids Res. 12 : 7035]. 펩티드 서열들중에서 펩티드 4(제1도, 피크 4)는 IgE 수용체 서브유니트에서 유사한 서열로 추정되는 마우서 Fcγ(IgG) 수용체의 NH-말단부 근방의 서열과 상당한 상동성을 나타냈다(라베취(Ravetch) 등,1986, Science234 : 718] 펩티드 4의 서열로부터 가장 적은 코돈-중복 부위인 Asp-Pro-Pro-Trp-Ile을 선택하여, 자동 DNA합성기(모델 380A 및 B, 어플라이드 바이오시스템즈)를 사용해서 14량체 올리고뉴클레오티드 5'-ATCCA(A/G/C/T)GG(A/G/C/T)GG(A/G)TC-3'의 32-혼합물을 제조하였다. 이들 올리고뉴클레오티드를 문헌 마니아티스(Maniatis)등 1982), Molecular Cloning에 기술된 바와 같이 P로 표지시켰다.
cDNA 라이브러리의 구성 및 선별
래트 RBL-2H3 세포를 6M 구아니디늄 이소티오시아네이트중에서 균질화시킨 후, 문헌 마니아티스등(1982), Molecular Cloning에 기술된 바와 같이, CsCl 쿠션(cushion)에 초원심분리하고, 이어서 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(25:24:1)추출을 실시하여 래트 RBL-2H3 tpvhfhhqnxj RNA를 추출하였다. 올리고(dT) 셀롤로오스 컬럼을 이용하여 폴리(A)+RNAs를 제조한 후[아비브 앤드 래더(Aviv and Leder), 1972, Proc. Nalt. Acad. Sci. 미합중국 69 : 1408]. 약간 변형된 벡터 및 링커 단편[노마(Noma)등, 1986, Nature, 319 : 640]을 사용하여 문헌 오카야마 앤드 베르그(Okayama and Berg), 1983, Molec. Cell. Biol. 3:280에 기술된 바와 같이 cDNA 라이브러리를 구성했다. 폴리(A)+RNA 5㎍으로부터, 9×10 개의 독립된 콜로니들이 수득되었다.
약 7×10 개의 독립된 콜로니들은 문헌 하하한 앤드 메절슨(Hahahan and Meselson), 1980, Gene 10:63에 기술된 방법에 의해 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브로 선별한 결과 3개의 양성 클론들이 확인되었다. 알칼리-변성된 플라스미드 DNA를 이용하여 문헌 생거(Sanger) 등, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. 미합중국, 74:5463에 기재된 디데옥시 쇄 종결법에 의해 유사한 제한 효소 분애 패턴을 보이는 3개의 클론중 2개의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다.
제2도 및 제4도에서 각각 볼 수 있는 바와 같이, 이들 클론들은 pAS-r-IgER-5A(cL5A)내에 하나의 결실(bp21) 및 pAS-r-IgER-2A(cL2A)내에 2곳의 결실(bp 163 및 8)이 존재하는 것을 재외하는 완전히 동일한 서열을 갖는다. cl 2A cDNA의 좌측 1/3과 cl 5A cDNA의 우측 2/3를 결합하여 완전한 길이의 cDNA 클론(cl 2A/5A)을 구성하였다. T7 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터서열을 함유하는 플라스미드인 pGEM3 내의 클론 2A/5A cDNA로부터 전사된, 표지시킨 RNA를 이용한 RNase보호 실험[멜톤(Melton)등, 1984,Nucl.Acidw Res. 12:7035]에서 IgE 수용체 mRNA 대부분은 전혀 결실된 곳이 없는 것으로 나타났다. 따라서, 결실되지 않은 서열의 735bp 개방된 판독틀로부터 래트 IgE 수용체 α-서브유니트의 일차 구조를 추론할 수 있었다(제4도). 상기 개방된 판독틀은 아미노산 서열 분석에 의해 미리 결정된 펩티드 서열과 완전히 매치되는 서열은 함유하는 245개 아미노산 펩티드를 암호화하는 것으로 밝혀졌다.
인체 비만 세포 IgE 수용체 α-서브유니트 cDNA 클론의 분리
인체α-쇄 cDNA를 클로닝하기 위해, IgE 수용체를 생상하는 것으로 공지된 인체 비만 세포주(KU 812)로부터 일반적으로 전술된 바와 같이 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 래트 cDNA 클론 2A/5A의 니크-해독된 Hpall(46)-P펴II(970)단편을 사용하여 약 9×10 개의 콜로니들을 선별하였다. 42℃에서 15시간 동안 6X SSC-50% 포름아미드-10% 덱스트란 설페이트중에서 하이브리도화 처리를 실시한후, 55℃로 15분간 0.1X SSC 및 0.1% NaDodSO중에서 필터를 2회 세정했다. 3개의 양성 콜로니들이 확인되었으며, 이후 그중에서 가장 큰 삽입물(pAS-h-IgER-110B)을 갖는 콜로니에 대하여 특성을 규명하였다. 뉴클레오티드 및 추론된 아미노산 서열 둘다를 래트의 서열(제4도)과 비교하였다.
형질발현 벡터내로의 삽입
통상의 기술을 이용하여, 본 발명에 따른 인체 cDNA 서열을 각종 형질발현벡터들중 임의의 벡터내부에 삽입하여 본 발명의 재조합 인체 비만 세포 IgE 수용체 α-서브유니트를 생산할 수 있다. 가용성 단편들은 생산하는데 있어서는 단축시킨 서열을 사용할 수 있다.
인체 비만 세포 IgE 표면 수용체 α-서브유니트를 암호화하는 cDNA를 예컨대 본 명세서에 참고로 인용된 문헌인 미합중국 특허 제4,656,134호(Ringold)에 기술된 형질발현 백터내로 삽입할 수 있다. 상기 플라스미드를 이용하여 포유류 숙주세포를 형질전환시킨 후, 통상의 기술에 따라 인체 비만 세포 IgE 수용체 α-서브유니트를 분리하여 정제할 수 있다.
폴리펩티드를 비글리코실화된 형태로 박테리아 숙주, 예컨대 이.콜리내에서 생산할 수 있다. 인체 비만 세포 IgE 표면 수용체 α-서브유니트를 암호화하는 cDNA는 예를 들면 문헌 드보아르(BeBoer) 등,1983, Proc.Nalt.Acad.Sci. 80:21에 기술된 형질발현 벡터내에 삽입할 수 있다. 하이브리드 tac프로모터를 운반하는 상기 플라스미드는 이.콜리를 형질전환시키기 위한 목적으로 사용할 수 있으며, 통상의 방법들에 따라 α-서브유니트를 분리하여 정제할 수 있다.
용도
본 발명에 따른 인체 비만 세포 IgE 수용체 α-서브유니트 또는 그의 단편은 통상의 방법들을 이용하여 항-IgE 표면 수용체 다클론 또는 단일 클론 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 이들 항체들은 표준 포맷의 생체외 진단 분석(예,ELISA)에 사용하여 환자로부터 채취한 생체 시료, 예를 들면 혈액 또는 조직 시료, 특히 호중구내의 IgE 수용체의 농도를 측정할 수 있다. 시료내에 존재하는 IgE 수용체 α-서브유니트의 양은 환자에게 노출된 물질에 대한 환자의 알레르기 반응에 대한 척도로서 제공될 수 있다. IgE 수용체 α-서브유니트 농도는 또한 항-알레르기 치료요법의 효능을 결정하고, 아울러 시간 경과에 따른 환자의 알레르기 상태를 검색하는데 있어서도 측정 수단이 될 수 있다. 상기 항체들은 또한 배양 배지로부터 IgE 수용체 α-서브유니트를 면역크로마토그래픽 방법으로 정제하는 데에도 이용될 수 있다.
IgE 수용체 α-서브유니트 또는 그의 가용성 단편은 또한 알레르기 질환을 앓는 인체 환자를 치료하기 위해 치료용으로 이용될 수도 있다. IgE 수용체 α-서브유니트 또는 그의 단편은 비만 세포상에 원래 존재하는 수용체와 IgE에 대하여 경쟁을 하여 IgE가 투여된 펩티드와 결합하고 알레르기 반응을 중개하는 비만 세포와는 결합할 수 없도록 한다. 경쟁 억제 치료요법에 펩티드 자체를 이용하는 것의 대안으로서, 펩티드와 유사하게 치료제로서 작용하는 비-펩티드 약물을 제조하는데 펩티들를 이용할 수 있다. 일반적으로 X-선 결정법을 이용하여 펩티드, 특히 IgE결합 부위의 3차 구조를 밝혀내고 컴퓨터 모델링의 도움을 빌어 중요한 기능을 발휘하는 펩티드의 부위와 유사한 비-펩티드 화합물을 합성한다.
펩티드 또는 펩티드의 구조를 기초로 하여 합성된 화합물은 변형되지 않은 펩티드 상태 또는 약학적으로 허용되는 염의 형태로 생리학적으로 허용되는 담체, 예컨대 식염수와 혼합하여 투여된다. 바람직한 염의 예로서는 치료학적으로 허용되는 유기산, 예컨대 아세트산, 락트산, 말레산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 숙신산, 벤조산, 살리실산, 메탄설폰산, 톨루엔설폰산, 또는 팜산, 뿐만아니라 탄닌산 또는 카르복시메틸 셀롤로오스와 같은 중합체 산과의 염, 히드로할산, 예컨대 염산, 황산 또는 인산과 같은 무기산과의 염들을 들수 있다. 조성물은 정맥내, 피하, 비경구 또는 복강내 투여 목적의 액체 형태 또는 기관지 또는 비강내 투여 목적의 분무제 형태를 취할 수 있다.
IgE 수용체 α-서브유니트 또한 IgE 수용체 α-서브유니트와 결합할 수 있는 잠재적인 능력을 갖는 물질들을 선별하는 데에도 이용될 수 있으며, 상기 물질들은 알레르기 질환을 앓는 환자에게 치료 목적으로 투여할 경우 환자의 비만 세포상에 존재하는 IgE 수용체 α-서브유니트에 결합하여 IgE가 결합하는 것을 방해하고, 그로부터 IgE 중개된 알레르기 반응을 억제함으로써 알레르기 반응을 완화시킬 수 있다. 이들 IgE 수용체 α-서브유니트 결합 물질의 선별 공정은 α-서브유니트를 고정시키고, 선별하고자 하는 물질을 표지시킨(예. 방사선표지) 형태로, 상기 고정시킨 서브유니트와 접촉시킨후, 고정된 상들로부터 가용성 물질을 분리해내고, 결합의 표시로서 결합된 표지물을 검출함으로서 수행될 수 있다.
기탁 관계
IgE 수용체 α-서브유니트를 암호화하는 cDNA는 미합중국 메릴랜드 록크빌에 소재하는 미합중국 무식균 배양 수집소 (American Type Culture Collection :ATCC)에 1987년 12월 1일자로 기탁되어 각각 ATCC 수탁번호 제67566호(에스케리키아 콜리 pGEM-3-110B-1), 제67567호(에스케리키아 콜리 pGEM-32A/5A-1)를 지정받았다. 따라서, 본원의 양수인중 하나인 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지(President and Follows of Harvard College)는 특허존속 기간 만료이전, 배양물에 대한 최후 요청후 5년 이내, 또는 30년 이내의 기간에 있어서는 어느 때라도 이들 배양물이 사멸할 경우 교환해줄 책임을 지니며, 또한 특허가 허여될 경우, 기탁 사실을 공표하여 어느 때라도 상기 기탁물을 대중이 사용할 수 있도록 하는 책임을 가진다는 것을 밝혀두는 바이다. 그때까지 37 CFR 색션 1-14 및 35 USC 섹션 112하에 특허 청장의 권한에 따라 이들 기탁물들을 이용할 수 있다.
기타 다른 실시양태
기타 다른 실시양태들은 이하의 특허 청구의 범위에 포함된다. 예컨대, 본 발명에 따른 가용성 α-서브유니트 단편은 천연 분자의 상응하는 부분과 완전한 상동성을 지닐 필요가 없고, 단지 인체 IgE와 결합하기에 충분한 상동성(일반적으로, 적어도 75%)만을 필요로한다. 상기 단편은 또한 IgE와 결합하기에 충분히 큰(일반적으로, 적어도 10개의 아미노산 크기)것이어야 한다. 가용성이 요구되는 경우에 있어서는, 단편이 천연 분자의 소수성 트랜스멤브레인 부위를 전혀 함유하지 않는 것이 바람직하다. α-서브유니트의 단편 뿐만 아니라, 분자 전체를 이용하여 전술한 바와 같이 진단용 및 정제용으로 유용한 항체를 생산할 수 있다.
제1도는 래트 IgE 표면 수용체 α-서브유니트 트립신분해성 단편들의 HPLC 용출 프로필.
제2도는 2개의 래트 IgE 수용체 α-서브유니트 클론에 대한 한쌍의 제한지도.
제3도는 인체 IgE 수용체 α-서브유니트 클론에 대한 제한 지도.
제4도는 래트 및 인체 IgE 수용체 -cDNA 클론들의 DNA 서열을 도식적으로 비교한 도면이다.
본 발명은 인체 비만 세포 IgE 표면 수용체의 α-서브유니트를 암호화하는 DNA 서열 및 이를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

Claims (4)

  1. 제4도에 도시한 아미노산 서열을 가진 인체 비만 세포 IgE 표면 수용체의 α-서브유니트 또는 그의 IgE 결합 단편을 암호화하는 cDNA 서열.
  2. 제1항의 cDNA 서열에서 유래한 DNA를 함유한 벡터.
  3. 제1항의 cDNA 서열로부터 암호화되고 인체 IgE와 결합할 수 있는, 인체 비만 세포 IgE 표면 수용체의 α-서브유니트의 가용성 단편.
  4. 제1항의 cDNA 서열로부터 암호화된 인체 비만 세포 IgE 표면 수용체의 재조합 α-서브유니트.
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