JP3117206B2 - 免疫グロブリンＥ受容体のαサブユニットまたはその断片を暗号化しているデオキシリボ核酸 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 マスト細胞は、高等脊椎動物の結合組織中に存在し、
ヒスタミン、プロスタグランジン（局所的な化学的媒介
体）、およびプロテアーゼを細胞質の顆粒内に貯蔵して
いる。（例えば、免疫反応による）刺激を受けると、こ
れらの顆粒の内容がマスト細胞から放出される。ヒスタ
ミンは、その近傍の細胞にのみ作用し、放出されると血
管の透過性を高め、これによって、血清蛋白質（例えば
抗体）、および免疫系のその他の構成要素（例えば白血
球）に対する血管の透過性を高める。ヒスタミンは、い
わゆる「アレルギー反応」の臨床的症状、例えば枯草熱
の主たる原因である［メツガー（Metzger）ら：アニュ
アル・レビューズ・オブ・イミュノロジー（Annu.Rev.I
mmunol.）、第４巻（1986年）419ページ］。

免疫刺激は、免疫グロブリンＥ（IgE）の分子に媒介
されるが、IgEは高等脊椎動物に見いだされる５種類の
抗体群中の１群である。IgE分子は、特定のマスト細胞
表面に豊富に存在する受容体に強い親和力で結合する。
次いで、結合したIgE分子は、特定のアレルゲン分子に
結合するが、多数の証拠が示すところによれば、マスト
細胞の細胞質顆粒内容の放出を触発するものは、２分子
またはそれ以上のIgE分子間の、アレルゲンを介した架
橋である［メツガーら（前出）：アニュアル・レビュー
ズ・オブ・イミュノロジー、第４巻（1986年）419ペー
ジ；イシザカ（Ishizaka）ら：ジャーナル・オブ・イミ
ュノロジー（J.Immunol.）、第119巻（1977年）1,589ペ
ージ；イゼルスキー（Isersky）ら：ジャーナル・オブ
・イミュノロジー、第121巻（1978年）549ページ；フレ
ーゼ（Froese）：プログレス・イン・アレルギー（Prog
r.Allergy）、第34巻（1984年）142ページ；ルイス（Le
wis）およびオーステン（Austen）：ネイチャー（Natur
e）、第293巻（1981年）103ページ」。

マスト細胞表面の受容体は、３個のサブユニット、す
なわち、細胞の外表面に露出し、IgE結合部位を保有す
る50〜60キロダルトンの著しくグリコシル化されたαサ
ブユニット１個と、それぞれ約30および20キロダルトン
の、βおよびγサブユニットなる２個のグリコシル化さ
れていない膜内成分とからなる。［メツガーら（前
出）：アニュアル・レビューズ・オブ・イミュノロジ
ー、第４巻（1986年）419ページ；フレーゼ（前出）：
プログレス・イン・アレルギー、第34巻（1984年）142
ページ］。

発明の要約 一般的には、本発明は、ヒトマスト細胞のIgE表面受
容体のαサブユニットを暗号化しているcDNA配列である
ことを特徴とする。

また、本発明は、ヒトのマスト細胞のIgE表面受容体
のαサブユニットを暗号化しているcDNAを含有する（プ
ラスミドまたはウイルスの）ベクターであることをも特
徴とする。

さらに、本発明は、ヒトのマスト細胞のIgE表面受容
体のαサブユニットの断片であって、ヒトIgEに結合可
能な可溶性断片であることも特徴とする。

本発明に従って製造されたヒトIgE受容体のαサブユ
ニット、あるいはその断片は、下記に更に詳述の通り、
各種の診断および治療に対する適用にこれを用いること
ができる。

本発明のその他の特徴および利点は、下記の好適実施
例、および請求の範囲において明白となるものと思われ
る。

好適実施例の記載 初めに、図面について説明する。

図面 第１図は、ラットIgE表面受容体αサブユニットのト
リプシン消化断片のHPLC溶出像である。

第２図は、ラットIgE受容体αサブユニットの２種類
のクローンの１対の制限酵素切断地図である。

第３図は、ヒトIgE受容体αサブユニットのクローン
の制限酵素切断地図である。

第４図は、ラットおよびヒトのIgE受容体αサブユニ
ットのcDNAクローンのDNA配列を比較した模式図であ
る。

ヒトのマスト細胞のIgE表面受容体のαサブユニット
を暗号化しているcDNA配列の作成は、下記の一般的な一
連の段階に従ってこれを行った。まず、ラットIgE表面
受容体のαサブユニットを精製し、断片化し、トリプシ
ン消化ペプチドを生成させた。次いで、トリプシン消化
ペプチドのうちの１種類のアミノ酸配列に基づいて設計
したオリゴヌクレオチドを用いて、ラットのcDNAクロー
ンを単離した。次いで、ヒトのcDNAライブラリーを作成
し、ラットのcDNA断片を用いて、ヒトのcDNAライブラリ
ーの選別を行った。上記操作の実行の詳細は下記の通り
である。

ラットIgE受容体蛋白質の精製、トリプシン消化ペプチ
ドの調製、および、配列決定 ラットの好塩基性白血病細胞（RBL−2H3）を可溶化
し、セファロース4Bなるビーズに結合させたモノクロー
ナル抗ラットマスト細胞IgE受容体抗体（mAb3C4）とと
もに４℃にて１晩温置した［バスチアーノ（Basciano）
ら：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem.）、第261巻（1986年）11,823ペー
ジ］。ビーズを洗浄し、５％酢酸を用いて結合蛋白質を
溶出させ、次いで凍結乾燥させた。ドデシル硫酸ナトリ
ウム−PAGE系を用い［レムリ（Laemmli）：ネイチャ
ー、第227巻（1970年）680ページ］、次いで銀染色を施
して［オークリー（Oakley）ら：アナリティカル・バイ
オケミストリー（Anal.Biochem.）、第105巻（1980年）
361ページ］、アリコートを分析した。予期した通り、
受容体のα、β、およびγ鎖に対応する帯域が認められ
た。ドデシル硫酸ナトリウム−PAGE系から溶出させるこ
とによって、これらの異なる受容体成分を更に精製し
た。溶出したαサブユニットの試料は、アミノ末端がブ
ロックされているものと思われることから、アミノ末端
の分析によるアミノ酸配列決定は不適当であった。した
がって、６モルの塩酸グアニジン、100ミリモルのトリ
ス緩衝液（pH8.3）、および1.0ミリモルのEDTAに溶かし
た２ミリモルのジチオトレイトールを用い、N₂の存在下
で37℃にて試料を還元し、次いで、10ミリモルのヨード
酢酸を用いてＳ−カルボキシメチル化を行った。バイダ
ック（Vydac）C₄なるカラムを用いたHPLCによって塩類
を除去した。TPCK（Ｌ−１−トシルアミド−２−フェニ
ルエチルクロロメチルケトン）で処理したトリプシンの
100ミリモルのトリス緩衝液（pH7.2）溶液を用いて脱塩
試料を処理した。得られたトリプシン消化ペプチドをバ
イダックC₄カラムを用いたHPLCによって分離した。その
溶出像を第１図に示す。矢印で示したピーク分画につい
て、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosyste
ms）社の蒸気相アミノ酸配列分析装置を用いてアミノ酸
配列の決定を行った。これらのピーク分画から判明した
ペプチド配列を下記第１表に示す。

第１表 WIHNDSISNXK、および （ピーク１） YSYDSNXISIR ILTGDKVTLIXNG （ピーク２） VIYYK （ピーク３） SVVSLDPPWIR （ピーク４） ラットマスト細胞IgE受容体αサブユニットのcDNAクロ
ーンの分離、およびヌクレオチド配列の決定 ラットIgE受容体αサブユニットのcDNA単離の目的
は、ラットαサブユニット遺伝子に相補的であると予測
されるオリゴヌクレオチドを合成することと、次いで、
これらのオリゴヌクレオチドを用いて、ラットcDNAライ
ブラリーを選別することである。

オリゴヌクレオチドのプローブ ウィスコンシン大学の遺伝学コンピュータ班（Geneti
cs Computer Group）より入手したソフトウェアのバー
ジョン４および５を用いて、トリプシン消化断片のコン
ピュータ支援解析を実行した［デヴェルー（Devereux）
ら：ニュークレイック・アシズ・リサーチ（Nucleic Ac
ids Res.）、第12巻（1984年）7,035ページ］。ペプチ
ド配列のうち、第４ペプチド（第１図のピーク４）がマ
ウスEcγ受容体（IgG）のアミノ末端付近の配列との著
しい相同性を示し［ラヴェッチ（Ravetch）ら：サイエ
ンス（Science）、第234巻（1986年）718ページ］、IgE
受容体サブユニット中に類似の配列が存在することが示
唆された。第４ペプチドの配列からは、最小コドン重複
部分であるAsp−Pro−Pro−Trp−Ileなる配列を選択
し、自動DNA合成装置（前出アプライド・バイオシステ
ムズ社製）モデル380Aおよびモデル380B）を用いて、
５′−ATCCA（A/G/C/T）GG（A/G/C/T）GG（A/G）TC−
３′なる32種類の14量体オリゴヌクレオチドの混合物を
作成した。マニアティス（Maniatis）らの著作「モレキ
ュラー・クローニング（Molecular Cloning）、1982
年］に記載の要領で、³²Pを用いてオリゴヌクレオチド
の標識化を行った。

cDNAライブラリーの構築および選別 ラットRBL−2H3細胞を、前出マニアティスらの著作
［モレキュラー・クロージング、1982年］に記載の要領
で、６モルのイソチアシアン酸グアニジウム中でホモニ
ナイズし、次いでCsClをクッションとしてこれに超遠心
分離を施し、更に、フェノール−クロロホルム−イソア
ミルアルコール混合液（25:24:1）による抽出を行ってR
NAを抽出した。オリゴデオキシチミジン−セルロースの
カラムを用いて、ポリアデニル酸・RNA複合体を調製し
て［アヴィーヴ（Aviv）およびリーダー（Leder）：プ
ロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンセズ・オブ・ザ・ユナイテド・ステー
ツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Sci.U.S.A.）、第69巻
（1972年）1,408ページ］、オカヤマ（Okayama）および
ベルグ（Berg）の論文［モレキュラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジー（Molec.Cell.Biol）、第３巻（1983
年）280ページ］に記載の要領で、ベクターおよびリン
カー断片をわずかに変えて［ノマ（Noma）ら：ネイチャ
ー、第319巻（1986年）640ページ］cDNAライブラリーを
構築した。ポリアデニル酸・RNA複合体５μｇから9x10⁵
の独立したコロニーが得られた。

ハハハン（Hahahan）およびメセルソン（Meselson）
の論文［ジーン（Gene）、第10巻（1980年）63ページ］
に記載の方法により、標識されたオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いて約7x10⁴の独立コロニーを選別し、目的
に適ったクローン３個を同定した。類似の制限酵素消化
パターンを示すこの３クローンのうちの２個のヌクレオ
チド配列を、サンガー（Sanger）らの論文［プロシーデ
ィングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンセズ・オブ・ザ・ユナイテド・ステーツ・オブ
・アメリカ、第74巻（1977年）5,463ページ］に記載の
チェインターミネーター法により、アルカリ変性プラス
ミドDNAを用いて決定した。

第２図および第４図をそれぞれ参照すると、これらの
クローンは、pAS−ｒ−IgER−5A（すなわち5Aクロー
ン）に１カ所の欠失（21塩基対）、およびpAS−ｒ−IgE
R−2A（すなわち2Aクローン）に２カ所の欠失（163塩基
対および８塩基対）が存在する以外は、全く同一の配列
である。2AクローンcDNAの左から1/3を5AクローンcDNA
の右から2/3と組み合わせることによって、完全な長さ
のcDNAクローン（すなわち2A/5Aクローン）を構築し
た。T7ファージRNAポリメラーゼのプロモーター配列が
含まれるプラスミドであるpGEM3において2A/5Aクローン
cDNAから転写された標識化RNAを用いるRNA分解酵素保護
実験［メルトン（Melton）ら：ニュークレイック・アシ
ズ・リサーチ、第12巻（1984年）7,035ページ］によれ
ば、大多数のIgE受容体mRNAには欠失が存在しないこと
が判明した。この知見から、ラットIgE受容体αサブユ
ニットの一次構造を欠失のない配列の735塩基対の読取
り枠から推定することが可能となった（第４図）。この
読取り枠は、アミノ酸配列から決定されていたものと完
全に一致するペプチド配列が含まれる、245アミノ酸の
ペプチドを暗号化していることが判明した。

ヒトマスト細胞IgE受容体αサブユニットのcDNAクロー
ンの単離 ヒトのα鎖cDNAをクローン化するために、大略上記の
要領で、IgE受容体を生成することが知られているヒト
のマスト細胞系（KU812）からcDNAライブラリーを調製
した。ニックトランスレーションで得られたラット2A/5
AクローンcDNAのHpa II（46）−Pvu II（970）断片を用
いて、約9x10⁴のコロニーを選別した。６倍のSSC−50％
ホルムアミド−10％デキストラン硫酸系で42℃にてハイ
ブリッド形成を行い、次いで、フィルターに0.1倍のSSC
−0.1％ドデシル硫酸ナトリウム系で55℃にて15分間の
洗浄を２回施す。目的に適った３コロニーが同定された
ので、最大の挿入断片（pAS−ｈ−IgER−110B）を有す
る１コロニーの特性を更に調べた。ヌクレオチド配列お
よびそれから推定されるアミノ酸配列の双方をラットの
配列と比較した（第４図）。

発現ベクターに対する挿入 本発明のヒトcDNA配列は、慣用の手法を用いてこれを
いかなる各種発現ベクターにも挿入して、本発明のヒト
マスト細胞IgE受容体の組換えαサブユニットを製造す
ることができる。可溶性断片を製造するには、短縮配列
を用いることができる。

ヒトマスト細胞IgEの表面受容体αサブユニットを暗
号化しているcDNAは、例えば、ここに引用することによ
り本発明に組み込まれるリンゴールド（Ringold）の米
国特許第4,656,134号明細書に記載の発現ベクター中に
これを挿入することができる。次いで、このようなプラ
スミドを哺乳類の宿主細胞の形質転換に用いることがで
き、慣用の方法を用いてヒトマスト細胞IgE受容体のα
サブユニットを単離かつ精製することができる。

このポリペプチドは、細菌、例えば大腸菌（E.coli）
を宿主として、そのグリコシル化されていない形態とし
て製造することができる。ヒトマスト細胞IgEの表面受
容体αサブユニットを暗号化しているcDNAは、これを例
えばドベール（DeBoer）らの論文［プロシーディングス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
セズ・オブ・ザ・ユナイテド・ステーツ・オブ・アメリ
カ、第80巻（1983年）21ページ］に記載の発現ベクター
に挿入することができる。このプラスミドは、ハイブリ
ッドtacプロモーターを保有していて、プラスミドを大
腸菌の形質転換に用いることができ、したがって、慣用
の方法に従ってαサブユニットを単離かつ精製すること
ができる。

用途 本発明のヒトマスト細胞IgEの表面受容体αサブユニ
ット、あるいはその断片は、慣用の方法を用いてポリク
ローナルまたはモノクローナルの抗IgE表面受容体抗体
を製造するのに用いることができる。これらの抗体を例
えばELISA法など、いかなる標準的形態の生体外診断検
査法にも用いて、患者から得られた生体試料、例えば血
液または組織試料、特に好塩基球中のIgE受容体の量を
測定するすることができる。試料中に存在するIgE受容
体αサブユニットの量は、患者が接触した物質に対する
患者のアレルギー反応の尺度として利用することができ
る。IgE受容体αサブユニットの量はまた、これを測定
して抗アレルギー療法の効果性を判定し、かつ患者のア
レルギー状態を経時的に監視することもできる。また、
培地から得られたIgE受容体αサブユニットの免疫クロ
マトグラフィーによる精製にも、この抗体を用いること
ができる。

IgE受容体のαサブユニット、あるいはその可溶性の
断片を治療に用いて、アレルギーを発病した患者に処置
を施すことも可能である。IgE受容体のαサブユニッ
ト、あるいはその可溶性の断片がマスト細胞に自然に存
在する受容体と競合する結果、IgEは投与されたペプチ
ドに結合してしまい、マスト細胞に結合してアレルギー
反応を媒介することができなくなる。ペプチド自体を競
争的阻害療法に用いることの代替策として、治療上ペプ
チドと類似の挙動を示す非ペプチド薬剤を開発するのに
ペプチドを用いることができる。ペプチドの、なかんず
くそのIgE結合部位の３次元的構造の解明には、Ｘ線結
晶学が一般的に用いられ、コンピュータによるモデル形
成の手を借りて非ペプチド化合物が合成されて、ペプチ
ドの機能的に重要な領域の模倣が行われている。

ペプチド、あるいは、ペプチドの構造に基づいて合成
された化合物は、未修飾ペプチドとして、あるいは製剤
上許容し得る塩の形態で、生理的に許容し得る担体、例
えば生理食塩水と混合して投与されるものと思われる。
好適な塩の例としては、治療上許容し得る有機酸、例え
ば、酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、ア
スコルビン酸、コハク酸、安息香酸、サリチル酸、メタ
ンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはパント酸は
もとより、重合酸、例えばタンニン酸、またはカルボキ
シメチルセルロースの塩、および、無機酸、例えば塩
酸、硫酸、またはリン酸との塩がある。組成物は、静脈
内、皮下、経口、または腹腔内投与のためには液体の形
態とし、あるいは、気管支内または経鼻投与のためには
噴霧液の形態とすることができる。

さらに、IgE受容体αサブユニットと結合する能力を
有する可能性がある物質の選別にも、IgE受容体αサブ
ユニットを用いることができる。すなわち、そのような
物質はアレルギーを発病した患者にこれを投与した場合
に、患者のマスト細胞上のIgE受容体αサブユニットと
結合することによってアレルギー反応を緩和し、このよ
うにして、IgEの結合を防ぎ、かつそれによってIgEを介
したアレルギー反応を停止させるのである。このような
IgE受容体のαサブユニット結合物質の選別は、αサブ
ユニットを固定化して、選別すべき物質を（例えば放射
性物質で標識するなどして）標識された形態で固定化サ
ブユニットと接触させ、固定化相から可溶相を分離し、
かつ、結合した標識を結合の指標として検出することに
よって、これを実施することができる。

預託 IgE受容体αサブユニットを暗号化しているcDNAは、1
987年12月１日付けで米国メリーランド州ロックビル所
在の米国模式菌培養コレクション（ATCC）に預託され、
ATCCアクセッション番号が第67566号および第67567号と
して与えられている。出願人の指定代理人の一員である
ハーバード単科大学の学長および評議員はここに、この
培養体がこれに基づいて公布される特許の期限の終了時
点、培養体に対する最後の請求以降５年後、あるいは30
年後のうちいずれか長い方の期間が経過する以前に死滅
した場合に、これを置換する責任、および、そのような
特許が公布され、上記の時点で預託物が無制限に公共的
に入手可能となる旨を受託者に通知する責任を有するこ
とを認める。上記の時点までは、米国連邦法第37章第１
乃至14節、および合衆国法第35章第112節の定めるとこ
ろに基づき、預託物は米国特許庁長官において入手可能
であるものとする。

その他の実施例 その他の実施例は、下記の請求項の範囲内にある。例
えば、本発明の可溶性αサブユニット断片は、天然に存
在する分子の対応する領域に対する完全な相同性を保有
する必要はなく、ヒトIgEと結合するのに充分な相同性
（一般的には少なくとも75％）を保有することのみが必
要である。また、この断片は、IgEと結合するのに充分
なだけ大きくなければならない（一般的には少なくとも
アミノ酸10残基）。可溶性が所望される場合は、天然に
存在する分子の、膜を横断する疎水性部分が断片に含ま
れないことが好ましい。αサブユニットの断片は、分子
全体と同様に、診断および精製の目的に上記の通りに有
用な抗体を増加させるのに用いることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 999999999 アメリカ合衆国 アメリカ合衆国 20852−3804 メリー ランド州ロックビル エグゼクティブ ブールバード 6011 (72)発明者 シラガニアン，ルーベン アメリカ合衆国 20817 メリランド, ベセズダ，メロディ レイン 6600 (72)発明者 清水 章 京都府京都市左京区高野東開町20 アパ ートメント310 (72)発明者 レダー，フィリップ アメリカ合衆国 02167 マサチューセ ッツ，チェスナット ヒル，アストン ロード 25 (72)発明者 ベンファイ，フィリップ アメリカ合衆国 10028 ニューヨーク, ニューヨーク，イースト エイティフォ ース ストリート 325 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ. 26，Ｎｏ．15（1987．Ｊｕｌｙ．28) ｐ．4605−10

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有するヒトマスト細
   胞のIgE表面受容体のαサブユニットまたはそのIgE結合
   性断片を暗号化しているcDNA配列：
2. 【請求項２】下記のアミノ酸配列を有するヒトマスト細
   胞のIgE表面受容体のαサブユニットまたはそのIgE結合
   性断片を暗号化しているDNAを含む組換えベクター：