JPH09503918A

JPH09503918A - デュフィー血液型抗原のクローニング

Info

Publication number: JPH09503918A
Application number: JP7512210A
Authority: JP
Inventors: オスカーポゴ，エンジェル; シャウドフリ，アソク
Original assignee: ニューヨークブラッドセンターインコーポレイティド
Priority date: 1993-10-21
Filing date: 1994-10-20
Publication date: 1997-04-22
Also published as: WO1995011040A1; US5683696A; US5578714A; EP0724453A4; CN1133564A; CA2173206A1; EP0724453A1; AU697868B2; AU1040795A; NZ276226A

Abstract

(57)【要約】デュフィー血液抗原型の主要サブユニットである gpDタンパク質が単離された。 gpDタンパク質は、Ｐ．ビバックスが赤血球に入り、マラリアを引き起す、受容体を含有している。 gpDは、ヒトおよびウサギのインターロイキン−８受容体の有意の配列相同性を有し、したがって、 gpDタンパク質は新しい種類の化学誘引物質サイトカイン(cytokines)受容体であるようである。 gpDタンパク質DNAはヒト海馬cDNAクローンHHCMF86 と準全体相同性を有し、したがって gpDタンパク質または相同タンパク質は脳において神経ペプチドとして存在するのかもしれない。 gpDタンパク質はすべての赤血球始原細胞に存在し、細胞増殖および／または細胞分化のための受容体であろう。 gpDタンパク質cDNAはヒト腎臓において、骨髄と同じサイズのmRNAを同定する。腎臓は造血器官ではないし、造血器官となる可能性もないので、この推定化学誘引物質受容体は本質的な腎臓機能を有しているのであろう。 gpDタンパク質はマラリアの予防に、そして赤血球、神経および腎臓の機能の調節に治療上の価値を有し、生理的に受容性の希釈剤と結合してこれらの目的のために適当な治療薬を生産することができる。受容体を含む gpDタンパク質の一部と一致するペプチドも合成された。このようなペプチドは、 gpDタンパク質と同一の治療上の有用性を有している。 gpDタンパク質およびこのようなペプチドは、マラリアの治療にも、必須の赤血球、神経および腎臓の機能の調節にも有用である、治療剤、たとえば抗体、相補ペプチド等の生産にも有用である。

Description

【発明の詳細な説明】デュフィー血液型抗原のクローニング１．発明の背景この発明は、デュフィー血液型抗原の主要サブユニットである、 gpDタンパク質およびマラリアの検出および治療におけるその使用に関する。２．関連する技術の記載マラリアは人類において最も流行している伝染病である。その広範囲の地理的な分布は、その感染の過酷な病状の結果とあいまって、多くの発展途上国にマラリアを医療上および財政上の多大な負担とさせている。いくつかの異なった種類のマラリアがあり、その一つは、感染しやすい個体の赤血球を攻撃する、寄生虫プラスモディウム・ビバックス（Plasmodium vivax、良性三日熱マラリア原虫）が原因となる。Ｐ．ビバックスに関する特に興味ある遺伝特性は、デュフィーと呼ばれる血液型をコードする抗原がないことである(F .B.Livingston「デュフィー血液型、マラリア原虫およびヒト個体群におけるマラリア地区（Duffy Blood Groups，Vivax Malaria and Malaria Section in Hum an Population）：総説」、Human Biol.，56，413(1984))。赤血球がデュフィー遺伝子の生産物を欠いている個体は、デュフィー分子がＰ．ビバックスの受容体として働くという事実のために該寄生虫の侵入を受けにくい。(L.H.Miller，D.F .ClydeおよびM.H.McGinnis、「黒人におけるプラスモディウム・ビバックスへの耐性因子、デュフィー血液遺伝子型（ａ−ｂ−）」、N.Eng.J.Me d.，295，302(1976))。マラリアの寄生虫は、ハマダラカ(Anopheles)属のいくつかの種の雌が血液を吸うことによって、宿主から宿主へと渡される。種虫（sporozoite）の生産をもたらすＰ．ビバックスの生活環の性的な段階は蚊の中で起る。「新しい」宿主へ入った後に、これらの種虫は肝臓の柔組織に住み、無性的に増殖して、最終的には肝臓細胞の破裂および無性型（メロゾイト）（merozoite）の血液流への放出を引き起す。メロゾイトは活発にほとんど一せいに赤血球に侵入し、Ｐ．ビバックスの増殖および細胞分裂の速度は本質的に同じであるから、感染した赤血球は、その段階で赤血球が壊れる寄生虫負荷の段階に同時に達する。これが48時間ごとの典型的なサイクルを作り、それによって三日熱マラリアの名が生じた。Ｐ．ビバックスの感染は、５年間もの間治療なしのままでいることもできる。Ｐ．ビバックスの寄生虫血症は、主に該寄生虫が末梢血管に存在する少数しかない若い赤血球または網状赤血球を好むという理由で、比較的に程度が低い。Ｐ．ビバックスに対する免疫は一般に本質的にほんの部分的であるので、独立して進行する重感染の発生を許容し、より短いサイクルでの熱の出現をもたらす、寄生虫の放出のサイクルの重複の原因となる。別々の単離体からの寄生虫に共通な、Ｐ．ビバックス種虫の抗原成分が存在することが最近に示されたけれども (F.Zavara，A.Masuda，P.M.Graves，V.NussengweigおよびR.Nussengweig．「ヒトマラリア寄生虫の別々の単離体におけるCSタンパク質の反復性エピトープの遍在」、J．Immunol.，135，2790(1985))、他のマラリア病原虫がそうであるようにＰ．ビバックスは相当な抗原の多様性および変化を示す（M.Hommel、「マラリア寄生虫における抗原の変化」Immunology Today，6，28(1985)）。Ｐ．ビバックスの単離体の間の抗原の差異の原因およびワクチン接種に関するそれらの結果という面においては、異なった系統のＰ．ビバックスのメロゾイトが赤血球に侵入するために同じ受容体を共有するということは重要である。それに加えて、他の抗原の分子を変化させる能力にかかわらず、その寄生虫の認識分子、すなわち、デュフィー分子に結合する分子は不変のままでなければならない。なぜなら、赤血球の中へのメロゾイトの侵入を許し、したがって感染の継続を許すのは、該分子と不変の受容体との間の相補性だからである。デュフィー陰性の赤血球の耐性によって示されるように、Ｐ．ビバックスのメロゾイトは生体への侵入のために他のヒト赤血球受容体を利用できないようにみえるので、この分子のリガンド特異性の変化は、寄生虫の感染能力の喪失をもたらす。デュフィー血液型は、Fy^aおよびFy^b対立遺伝子によって生産される二つの主要な抗原Fy^aおよびFy^bからなる。抗血清抗−Fy^aおよび抗−Fy^bは４つの表現型、Fy （ａ＋ｂ−），Fy（ａ−ｂ＋），Fy（ａ＋ｂ＋）およびFy（ａ−ｂ−）を画定した。W.L.Marsh，Crit．Rev．Clin．Lab．Sci.，5，387(1975)。どの抗血清も、黒人における主な表現型である、Duffy Fy（ａ−ｂ−）細胞を凝集しない。他の表現型、Fy３，Fy４およびFy５を画定する抗血清は非常にまれである。ネズミのモノクローナル抗体、抗−Fy６は、すべてのデュフィー陽性細胞に存在するがFy （ａ−ｂ−）細胞には存在しない新しいデュフィー抗原決定遺伝子を画定した。 M.E.Nichols，P.Rubinstein，J.Barnwell，S.R.de CordobaおよびR.E.Rosenfiel d，J.Exp．Med.，166，776(1987)。Fy（ａ−ｂ−）赤血球をもつ黒人は、Ｐ．ビバックスによって感染させることはできない。これらの細胞は、Fy（ａ＋ｂ−）およびFy（ａ−ｂ−）ヒト赤血球に侵入するサルの寄生虫であるプラスモディウム・クナウレシ（P.Knowlesi ）による試験管内侵入にも耐性である。L.H.Miller，S.J.Mason，J.A.Dvorak，M .H.McGinnissおよびK.I.Rothman，Science，189，561（1985）。だから、これらの寄生虫による赤血球侵入のための受容体はデュフィー血液型に関係がある。定義次のアミノ酸は、この明細書の他の箇所では次の３文字または１文字コードで示される。発明の概要いまや、抗−Fy６モノクローナル抗体を用いて、ヒト赤血球のデュフィー抗原を精製するための手順が開発された。デュフィー抗原は異なったサブユニットからなる多量体の赤血球膜タンパク質であるようにみえる。35−45KDa の分子量の gpDという名の糖タンパク質が、タンパク質複合体の主要なサブユニットであって、そして、抗−Fy^a、抗−Fy^bおよび抗−Fy６抗体によって定義される抗原決定基を有している。この新しいタンパク質の分子レベルでの特徴づけは赤血球膜上でのその機能を見い出すことに、寄生虫−赤血球認識過程の理解することおよび寄生虫の侵入の分子メカニズムを分析するのに重要である。この発明は、 gpDタンパク質をコードするmRNAの単離、配列分析および組織発現に関する。 gpD タンパク質はヒトおよびウサギインターロイキン−８受容体と有意な配列相同性を有しており、したがって、 gpDタンパク質はたぶん新しい種類の化学誘引物質サイトカイン(cytokines)受容体である可能性が高い。また、 gpDタンパク質cDNAは、ヒト海馬cDNAクローンHHCMF86 と準−完全相同性を有しており、したがって、 gpDタンパク質または相同タンパク質はたぶん脳の中の神経ペプチド受容体として存在するであろう。 gpDはすべての赤血球始原細胞に存在し、細胞増殖および／または分化のための受容体として機能する可能性がある。 gpDタンパク質cDNAはヒト腎臓において骨髄と同じサイズのmRNAを同定する。腎臓は造血器官でないし、造血器官となる可能性もないから、たぶんこの推定上の化学誘引物質は本質的な腎臓機能を有しているのであろう。 gpD タンパク質はマラリアの予防並びに必須の赤血球神経および腎臓の機能の調整に治療上の価値を有し、生理的に受容できる希釈剤と組み合わされて、これらの目的のために適当な治療薬を生産することができる。受容体を含有する gpDタンパク質の一部と一致するペプチドも合成されている。このようなペプチドは gpDタンパク質自身と同じ治療上の有用性を有し、合成ペプチドは gpDタンパク質の場合と同様に生理的に受容できる希釈剤と組み合さって、マラリアに対するワクチンまたは必須の赤血球、神経および腎臓の機能を調整するのに有用な治療薬を生産することができる。 gpD タンパク質および gpDタンパク質の一部と一致するペプチドも治療薬たとえば、抗体、相補ペプチド、および gpDタンパク質または合成ペプチドの三次構造にならって作った薬の生産に有用性を有し、それらもまた、マラリアの治療および必須の赤血球、神経および腎臓の機能の調整に治療上の価値を有している。図面の簡単な説明この発明を図面と関連して詳細に説明する。図１ａは、二つの最も長い gpDタンパク質cDNAクローンの図式的な説明および部分制限マップである。図１ｂは gpDタンパク質をコードする結合されたFyｂ71−81クローンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列の図式である。図２ａは gpDタンパク質配列のヒドロパシープロットである。図２ｂは gpDタンパク質の膜方向づけのために提出されたモデルである。図３はFyｂ71またはFyｂ81挿入断片のいずれかをプローブとしたノザンブロット（図３ａ）およびサザンブロット（図３ｂ）である。図４は、Fyｂ81クローンの挿入断片をプローブとしてヒト組織から得られたポリ（Ａ）⁺RNA のノザンブロット分析である。図５は、 gpDタンパク質と海馬cDNAクローンHHCMF86 との間の DNA配列の相同性を示すチャートである。発明の詳細な説明 gpD タンパク質をコードする４つのcDNAクローンである、デュフィー血液型抗原の主要なサブユニットが単離された。これらの４つのcDNAクローンから、 gpD タンパク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列が決定された。該配列は図１に示され、配列番号１という。遺伝コードの縮重により、同一の gpDタンパク質をコードする他の天然の DNA配列が存在するかもしれない。この発明は、したがってこのような他の天然の DNA配列並びに、配列番号１およびこのような他の天然の DNA配列に示されたのと同じDNA配列を有する合成 DNA配列に拡張される。図１も gpDタンパク質のアミノ酸配列を示す。構造遺伝子の DNA配列についての場合のように、この発明は天然源から単離された gpDまたは化学合成によって調製された gpDにも拡張される。化学合成は任意の通常の方法によってなされる。図１では、アミノ酸残基は左側に番号を付し、ヌクレオチドの位置は右側に番号を付してある。予想されたアミノ酸とマッチするペプチドの位置は、一本線で示されている。アスパラギン残基への二つの潜在的炭水化物結合部位は上向き矢印で示されている。第三のグリコシル化部位、すなわち、37位置でのアスパラギンは、アスパラギン酸が続くので、存在しないであろう。R.D.Marshall，Annu.R ev．Biochem.，41，673（1972）参照）。５′末端の二重下線は５′末端へ伸びるプライマーに用いられる配列であり、３′末端のものはコンセンサスポリ（Ａ）付加配列である。 gpD タンパク質は９つの推定トランスメンブランα−らせんをもった高度に疎水性の膜内糖タンパク質である。デュフィー陽性およびデュフィー陰性個体に同種の遺伝子が存在するが、デュフィー陰性の個体の骨髄は gpD特異的mRNAを合成しない。成人の腎臓、脾臓および肝臓では、mRNAはgpD mRNAと同じ大きさであるが、脳ではmRNAはそれよりずっと大きい。特徴づけられたクローンは、（１）gpD 遺伝子の構造成分、（ii）ヒトの骨髄または他の組織中での gpD タンパク質の生合性および発現、（iii）他の細胞型に存在し、ケモカイン（che mokine）受容体として機能するかもしれない、この新しい赤血球膜タンパク質の構造−機能および（iv）Ｐ．ビバックスメロゾイトの侵入のための受容体としての gpDタンパク質の役割を研究する成分を提供するだろう。Ｐ．Rubinstein他の米国特許第 5,101,017号は gpDタンパク質特異的モノクローナル抗体（この明細書の下文では「ルービンシュタイン抗体」という）が開示されている。ルービンシュタイン抗体は、Ｐ．ビバックスマラリア寄生虫の標的分子の効果的な阻止によって、ヒト赤血球へのＰ．ビバックスマラリア寄生虫の侵入を妨害する。ルービンシュタイン抗体は、Ｐ．ビバックスのリガンド部位と同じ立体化学である結合部位を有し、該寄生虫と反応する抗−イディオタイプ抗体を引き出す。これらの性質の結果として、ルービンシュタイン抗体は、たとえば、Ｐ．ビバックスの感染の診断に有用であり、上述したように、これらの寄生虫に対して保護する抗−インディオタイプ抗体を誘導するのにおよび直接的に生体内で該寄生虫から赤血球受容体を阻止するのに有用である。ルービンシュタインらの抗体のこれらのまたは他の用途の詳細は、該特許に開示されており、その全内容は引用によってこの明細書に組み入れられる。ルービンシュタイン抗体はG.KohlerおよびC.Milesteinの方法(Nature，256，4 95(1975))によって本質的に調製された。マウスは、Fy（ａ＋ｂ＋）型のヒト赤血球で免疫され脾臓が除去され、Ｐ３／NSO-Ag４− １マウスミエローマ細胞系統（ATCC(メリーランド州のロックビルのAmerican Ty pe Culuie Collection)から入手した）の懸濁液とハイブリダイズされ、ハイブリドーマはヒト赤血球と結合する抗体の分泌について試験された。一つのウェルは、Fy（ａ＋ｂ−）およびFy（ａ−ｂ＋）型の赤血球に結合する抗体を含んでいるが、Fy（ａ−ｂ−）型の赤血球に結合する抗体を含んでいないことが見い出された。該ウェルの細胞性内容物が回収され、希釈され、そしてクローン化された。クローンの一つはルービンシュタイン抗体を分泌することが見い出された。上記したように、ルービンシュタイン抗体は、いまやクロー化された gpDタンパク質に特異的である。よって、この発明の gpDタンパク質もルービンシュタイン抗体と同じ特異性を有するモノクローナル抗体を調製するのに有用である。ヒト赤血球でマウスを免疫する代りに、 gpDタンパク質を用いて免疫する以外はこのような抗体を調製する手順はルービンシュタイン他が用いた手順と本質的に同じである。さらに、 gpDタンパク質のＮ−末端（細胞外）領域は、マラリア寄生虫と赤血球の相互作用に必要であると確認された。この相互作用に必要とされる正確なアミノ酸残基を確認するために合成ペプチドを用いて、研究が目下進行中である。次のペプチドは EEISAアッセイでルービンシュタイン抗体と結合することが見い出された。（１）MASSGYVLQAELSPSTENSSQLDFEDVWNSSYGVNDSFPDGDYDANLEAAAPCHSCNLLDDSAL PF、これを配列番号８という。（２）MASSGYVLQAELSPSTENSSQLDFEDVWNSSYGVNDSFPDGDYD、これを配列番号９という。（３）AELSPSTENSSQLDFEDVWNSSYGVNDSFPDGDYD、これを配列番号10という。次のペプチドは ELISAアッセイでルービンシュタイン抗体に結合しない。（４）DFEDVWNSSYGVNDSFPDGDYD、これを配列番号11という。（５）ANLEAAAPCHSCNLLDDSALPF、これを配列番号12という。（６）AELSPSTENSSQL 、これを配列番号13という。ペプチド（３）がルービンシュタイン抗体と結合するのに対し、ペプチド（４）および（６）が結合しないという事実は、ペプチド（６）のＣ−末端とペプチド（４）のＮ−末端の間との連結が結合に対して重要であることを示唆している。配列番号14と呼ばれるアミノ酸配列、AELSPSTENSSQLDFEDVWNSSは、ルービンシュタイン抗体に対するエピトープを含有するらしい。したがって、この発明は配列番号14と記載するアミノ酸配列を含んでなるペプチドにも及ぶ。配列番号14を含有するペプチドはもちろん、配列番号８、配列番号９、配列番号10および配列番号14と呼ばれるペプチドは、生体内で寄生虫と結合し、したがって、マラリアに対するワクチンにおいて免疫原として用いることができる。結果として、この発明はこのようなワクチンおよび該免疫原の有効量を温血動物に投与することによって、Ｐ．ビバックスによる感染に対して該動物、特にヒトを保護する方法にも向けられている。合成ペプチドは概して弱い抗原であるからペプチドを担体、たとえば、破傷風トキソイド、キーホールリムペットヘモシアニン（keyhole lympet hemocya nin，KLH）などのようなタンパク質担体または R.Neurath他により米国特許第 4 ,847,080号および第 5,204,096号（それらの開示は引用によって、この明細書に組み込まれる）または T.Hoppeにより米国特許第 5,019,388号（その開示は引用によって、この明細書に組み込まれる）によって教示されているような脂質担体に複合させるのが有利である。この発明のペプチドは、天然源から、すなわち、 gpDタンパク質のタンパク質分解切断によって、または化合合成により形成され得る。ペプチドの化学合成およびペプチドの担体への連結の詳細は米国特許第 4,847,080号および第 5,204,0 96号に見い出すことができる。この発明のワクチンでは、この発明のペプチドは普通生理的に受容性の希釈剤（媒体）、たとえばアジュバントを含有するリン酸塩緩衝塩類液とともに存在するだろう。一般に、生理的に受容性の希釈剤中のペプチドの量は１投与当り約１ μｇおよび１mgの間であろう。大抵の適用に対しては、合成ペプチドの使用がより実際的であろうが、 gpDタンパク質を同様の量で同様の希釈剤中で用いて、適当なワクチンを処方することもできる。どちらの場合でも、この発明のワクチンは、皮下注射、静脈注射、皮内注射または筋肉注射によて投与することができる。好ましいルートは、特定のワクチンに依存するだろうが、筋肉注射が一般に適当であろう。投与の頻度はワクチンに依存して変わるであろう。すべてのマラリア病原虫で同定されている結合領域が相同であることは、たとえば、J.H.Adams他の「Proc．Nath．Acad．Sci．USA」89，7085(1992)から、既知である。したがって、 gpDタンパク質およびこの発明のペプチドは赤血球と結合して、すべてのマラリア病原虫が赤血球と結合するのを妨害する。これは、この発明のワクチンは一般にすべての型のマラリアに対して有用であり、したがって、この発明はいかなるマラリア病原虫によるマラリアに対しても温血動物を保護する方法に及ぶことを意味する。 gpD タンパク質は、赤血球上のインターロイキン−８（IL−８）受容体と有意の相同性を示す。これは、デュフィー血液型抗原および赤血球ケモカイン(chemo kine)受容体が同じタンパク質であることを示唆する最近の報文と矛盾していない。 R.Horuk他「マラリア寄生虫プラスモディウム・ビバックスに対する受容体・赤血球ケモカイン受容体」、Science，261，1182（1993）。赤血球は明らかに好中球上のIL−８受容体、IL−８RA受容体およびIL−８RB受容体とは異なる。赤血球受容体は、IL−８、メラノーマ増殖刺激性活性（MGSA）、単球走化性タンパク質１（MCP−１）並びに活性化によって調節された、通常のＴ発現および分泌（RANTES）タンパク質を含む、走化性および原炎症性の(proinflammatory)溶解性ペプチドの一群である。 gpDタンパク質（またはこの発明の合成ペプチド）の投与は、これらのタンパク質の赤血球受容体への通常の結合を妨げ、したがって、これらのタンパク質の分泌の生理学上の効果を調節するのに有用である。たとえば、赤血球受容体は、IL−８を含む、ある炎症性メディエーターのためのスカベンジャーとして作用するものと仮定されてきた。 gpDタンパク質（またはこの発明の合成ペプチド）の投与は、したがって、IL−８のスカベンジを促進し、それにより、いかなるIL−８誘導炎症をも減少させることを期待されるだろう。この目的で、上記したように、この発明のワクチンは治療薬として適当である。 gpD タンパク質はまたヒト海馬cDNAクローンHHCMF86 に有意の相同性を示し、したがって、 gpDタンパク質または相同性タンパク質は脳の中に神経ペプチド受容体として存在する可能性が高い。 gpDタンパク質cDNAはヒトの腎臓における、骨髄と同じ大きさのmRNAと一致し、したがって、 gpDタンパク質または相同性タンパク質は腎臓の機能の調節にいくらかの役割を演じている。この発明の治療薬は、したがって、これらの神経の機能および腎臓の機能の調節にも用途を見い出すだろう。 gpD タンパク質またはこの発明の合成ペプチドに相補性であるタンパク質、たとえば gpD特異的抗体は天然の受容体を阻止し、したがって、また、上に概要を示した治療上の有用性を持つであろう。このような相補的タンパク質の調製においては、 gpDタンパク質またはこの発明の合成タンパク質の使用は明らかに価値がある。この発明を次の非限定的な例によって更に説明する。例１： gpDタンパク質の部分的アミノ酸配列分析赤血球（Fy（ａ−ｂ＋））を冷リン酸塩−緩衝化塩液(PBS)中で３回洗浄し、同じ溶液中に再懸濁し、充てん赤血球10μｇ／mlの濃度で、４℃で一晩、ルービンシュタイン抗体と共に絶え間なく混合した。（¹²⁵Ｉで標識された抗体で測定された、この濃度は飽和デュフィー抗原部位に必要とされる濃度を超えている。）冷PBS を用いて赤血球を洗浄することによって結合していない抗体を除去した。赤血球ゴーストを、１mMのフッ化フェニルメチルスルホニルおよび１00カリクレイン−不活性化単位／Trasylol(商標)(アプロチニン(aprotinin))のmlを含有する冷５mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)の20容積量で低張細胞溶解によって調製した。次いで、ゴーストを43,000×ｇで30分間遠心分離した。上清をデカントし、50mMのHepes-NaOH，pH.8.0，１mMのフッ化フェニルメチルスルホニル、 1 00カリクレイン不活性化単位／Trasylolのmlでペレット化し、−20℃で凍結した。凍結したゴーストを後で解凍し、30分間43,000×ｇで遠心分離した。ペレットを50mMの Hepes-NaOH，pH8.0，１mMのフッ化フェニルメチルスルホニル、 100カリクレイン−不活性化単位／Trasylolのml中で最初の充てん赤血球の容積の３倍に再懸濁した。トリトンＸ −100(商標)(過酸化物なし)洗剤を最終濃度で１％まで加え、溶液を室温で１時間静かに混合した。殻を43,000×ｇで30分間の遠心分離で除去した。上清を、窒素圧下 PMY10フィルター（Amicon Corp.）を用いてAmicon濃縮機中で４倍に濃縮した。規定の濃度の10倍の 0.1容積の PBS溶液を洗剤抽出物に加えた。洗剤抽出物を次いで、抗−マウス−IgG に連結したセファロース４Ｂ（商標）ビーズと室温で１時間インキュベートした。洗剤抽出物に対するビーズの比は１：100(ｖ／ｖ) であった。抗−マウスIgG−セファロースビーズを遠心分離により除去し、 PBS および 0.5％のトリトンｘ−100を含有する、洗浄溶液に対するビーズの比が１：20（ｖ／ｖ）の溶液中で洗浄した。洗浄を室温で行ない、３回繰り返した。ビーズを62.5mMのトリス−HCl(pH6.8)，0.5％のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含有する、溶離液に対するビーズの比１：２（ｖ／ｖ）の溶液中にインキュベートすることによって溶出を行った。65℃で10分間のインキュベーションを３回繰り返した。溶出された物質を窒素圧下でPMY10（商標）フィルター（Amlcon Corp. ）を用いてAmicon濃縮機で濃縮した。 0.1 ％の SDSの存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）をV.K.Laem mli の「Nature」227，680（1970年）に従って、次のように変更して行なった：アクリルアミド濃度は10％で、重合を一晩行い、酸化剤を分解し、 0.1mMのチオグリコレートを上のチャンバーに加えた。アフィニティ精製された材料の濃縮溶液に次の化学薬品を加えた：尿素を４Ｍ， SDSを２％およびβ−メルカプトエタノールを５％。電気泳動後、ゲルを30分間10％のイソアミルアルコールおよび５％の酢酸中で同定し、標識タンパク質のバンドが見られるまで、 0.002％のクーマシーブリリアントブルーＲ−250 で染色した。36−46KDa の間に相当する領域および 96KDaより大きい領域を切除し、５％酢酸を用いるいくらかの変更によって脱染し、蒸留水で洗浄した。ゲル断片を−20℃で貯蔵するか、すぐに用いた。４×４mm立方体に切断されたゲル断片をElutrap(商標)装置（Schleicher and Schuell）の溶出室に分配し、50mMの重炭酸アンモニウム、 0.1％の SDS溶液中で 100Ｖ（一定）で一晩溶出した。新鮮な50mMの重炭酸アンモニウム、 0.1％の SDS溶液を加えて、電気泳動をさらに６−８時間継続した。溶出された物質をCe ntricon(商標)マイクロ濃縮機（Amicon Corp.）で濃縮した。精製タンパク質をアルキル化し、臭化シアン（CNBr）で次のように切断した：精製タンパク質を１mMの HClの存在する−20℃の冷アセトンで２時間沈殿した。沈殿物を100％冷アセトンで洗浄し、室温で乾燥状態まで蒸発させ、 0.1Ｍのトリス−HCl，pH8.0＋0.5 ％ SDS中に溶解した。固体 DTTを加えて10mg／mlの最終 DTT濃度の溶液とし、85℃で２時間還元した。１／10容積の2.68Ｍのヨード酢酸アセトアミド（Iodoacetic acetamide）を加え、管に窒素をさっと流し、室温で暗所で30分間インキュベートする。インキュベート後、固体の DTTを10ｍ／mlを加え、 0.1Ｍのトリス−HCl(pH8.0)＋ 0.5％ SDSに対して１晩透析した。上記のようにタンパク質をアセトンで沈殿し、空気乾燥した。沈殿物を96μｌの70％ギ酸および70％ギ酸中の１Ｍ CNBr溶液４μｌに溶解し、室温で48時間暗所でインキュベートした。酸を乾燥状態まで蒸発し、ペレットを水で洗浄、乾燥状態まで乾燥を数回行った。消化されたタンパク質を高性能液体クロマトグラフィー（HP LC）またはポリアクリルアミドゲル分別のいずれかにかけた。 Peｌ（配列番号２）ペプチドを０−フタルアルデヒド遮断剤を用いて非分画化 CNBr消化物を配列決定することによって得た(A.W.Brauer他「Anal．Biochem.」1 37，134(1983))。Pe５（配列番号６）ペプチドは、三層SDS-PAGEシステム(H.Shagger他、「Anal．Biochem.」168，368 （1987）参照)のCNBr消化分離から非常によく分離された唯一のフラグメント(〜４kDa)の部分配列である。分離の後、このペプチドフラグメントをProBlott（商標、Applied Biosystems）上に電気ブロットし、配列を決定した（N.LeGendre他「マイクロ配列決定のためのタンパク質およびペプチドの精製への実践的ガイド (A Practical Guide to Protein and Peptide purefication for Microsequenci ng)」P.T.Matsudaira編、49−69（Academic Press，New York）1989年）。他のアリコートをペプシン（50／１比）で、37℃で１晩消化し、該フラグメントをVy dac Ｃ−18カラムを用いて逆相HPLCにより分離した。逆相HPLCカラムからシングルピークとして溶出され、HPLCによって生産された数少いペプシンペプチドであった、Pe２（配列番号３）、Pe３（配列番号４）、Pe４（配列番号５）およびPe ６（配列番号７）ペプチドを配列決定した。 Applied Biosystems／Peptide Sequence（商標）、Model 470 または477 を製造者のすすめ(recommendations)にしたがって用いた。 100／１比および４℃で3 0分または60分のペプシン消化は、もっと大きいペプチドを生成しなかった。例２：プライマー設計およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR) Pe５（配列番号６）は、 gpDタンパク質クローンの選択のためのプローブを生成するための最も有望なものであった。Pe２（配列番号３）、Pe３（配列番号４）、Pe４（配列番号５）およびPe６（配列番号７）ペプチドは PCR増幅のためには短かすぎるのに対し、Pe１（配列番号２）ペプチドは長いが、３つのはっきりしない残基を有していた。プライマーのヌクレオチド配列（各23単量体単位）をペプチド５（配列番号６）のＮ−末端およびＣ−末端配列から推測した（図１ｂ参照）。Pe５（配列番号６）ペプチドはCNBr切断によって生産されたので、メチオニンはＮ−末端に含まれ、そこから、24残基までペプチドの長さが増大していた。 R.Latheによって、「J.Mol.Biol．」183，111(1985)(その内容は引用によりこの明細書に組み入れられる)に記載されたコドン選択にしたがって、塩基が選ばれた。そして縮重が３′末端に向う以外に３回を超える位置にデオキシイノシン（Ｉ）が導入された。Ｎ−末端（プライマーＡ）のアミノ酸およびＣ−末端（プライマーＢ）のアミノ酸のための二つの生成されたプライマーを化学的に合成し、そしてプールされたFe（ａ−ｂ＋）個体のヒト骨髄mRNAからPe５（配列番号６）ペプチドのコード配列を増幅するために用いた。プライマーＡ（センス）は 245から 252の残基（図１ｂ参照）に特異的であり、12回の縮重５′−ATGAAXATYXTTTGGGCITGGTT(Ｉ＝デオキシイノシン、Ｘ＝ＣまたはＴ、Ｙ＝Ｃ，ＴまたはＡ)から成っていた。プライマーＢ（アンチセンス）は 261から 268残基（図１ｂ参照）に特異的で、32 回の縮重５′−ACIAGMAAMTCIAGICCIAMNAC(Ｉ＝デオキシイノシン、Ｍ＝ＡまたはＧ、Ｎ＝Ｇ，Ａ，ＴまたはＣ)より成っていた。最初のcDNA鎖を、BRL(Bethesda，Maryland)からの予備増幅キットおよびプライマーとしてオリゴdTを用いてFy（ａ−ｂ＋）表現型mRNAから合成した。酵素の増幅のために、プライマーＡ、プライマーＢおよび Taqポリメラーゼ（Stratage ne）をPerkin-Elmer熱 DNAサイクラー（cycler）中でインキュベートした。予期されたサイズ（72bp）の増幅生産物をpBluescript-SKベクター（Stratagene）中でサブクローン化した。挿入断片の推定されたアミノ酸配列はPe５（配列番号６）のペプチド（図１ｂ参照）の配列にあっていた。ペプチドPe５（配列番号６）のWFIFWWPH配列から、オリゴヌクレオチドTGGTTTATTTTCTGGTGGCCTCAT（配列番号16）を化学的に合成し、５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)で³²Ｐ標識し、それをヒト骨髄cDNAライブラリー（下記参照）のスクリーニングのためのプローブとして用いた。アミノ酸251 から 258までのためのコドン語法を有する、24単量体単位のオリゴヌクレオチドプローブが、首尾よく本当の gpDタンパク質cDNAクローンを同定した。例３：ヒトmRNAおよび DNAの単離ポリ（Ａ）⁺RNA を次のように単離した：ヒト骨髄吸引物を洗浄し細胞を５％のβ−メルカプトエタノール＋６Ｍグアニジンチオシアネート、25mMのクエン酸ナトリウム(pH7.0)、50mMのエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）の溶液中に最終グアニジン濃度が５Ｍになるように溶解した。該溶液を DNAをせん断するために25Ｇ皮下注射針を通し、Sarkosylを２％まで加えた。該溶液をSW41ローター中で 32Krpm 20℃で18時間、 5.7Ｍ CsCl，50mM EDTA(pH7.0)クッション(cushio n)上で回転した。ペレットを６Ｍグアニジンヒドロクロリドで洗浄し、最後にドライアイス中で冷却した無水エタノールで洗浄した。ペレットをジエチルピロカーボネート処理水に再懸濁し、 0.3Ｍ酢酸ナトリウムで調節し、エタノールで沈殿させた。ペレットをプロテイナーゼＫ消化緩衝液中に再懸濁し、37℃で２時間消化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。ペレットを次いで水に溶解し、１×DNアーゼ消化緩衝液で調節し、RNアーゼのないDNアーゼ(BRL)で処理した。ポリＡ＋RNAを製造者の実施要綱にしたがって、Invitrog enのためのFAST TRACK（商標）mRNA単離キットを用いて単離した。白人の成人肝臓、脾臓、肝臓、脳および胎児の肝臓並びに赤白血病細胞Ｋ562 からのmRNAがCL ONTECH LABORATORIES から得られた。全血単位中の赤血球を0. 83％ NH₄Cl pH7.4で溶解し、次に T.Maniatis，E.F.FritschおよびJ.Sambrookの「Molecular Clonig：A Laboratory Manual」（ColdSpring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，N.Y(1982)、参照によって、この全内容が組み入れられる）によって記載された標準 DNA抽出手順によって、 DNAを４つのデュフィー表現型の末梢血白血球から得た。例４：gpDタンパク質cDNAクローンのヌクレオチド配列 Fy（ａ−ｂ＋）個体のプールされたmRNAから構成された、非増幅ヒト骨髄cDNA ライブラリを前記24単量体単位プローブを用いてスクリーニングした。 1.9×10⁶ 組換えλZAP II（商標）ファージから４つの陽性クローンを選択し配列決定した。すべてのクローンは重複する配列を有していたが、gpD cDNAを完全には延長しなかった。最終的５′末端を含む唯一のクローンである、1085bpのFyｂ81およびヌクレオチド位置185 からポリ（Ａ）⁺尾まで伸びた、1083bpのFyｂ71が最も長かった。 989bpのFyｂ31および 726bpのFyｂ82は、ヌクレオチド位置 275および 525から、それぞれポリ（Ａ）尾まで伸びていた。Fyｂ81と他のいずれのクローンを組み合せても、 gpDタンパク質の全長さのcDNAを生成した。図１ａは、二つの最も長いクローンの重複および組み合せを示す。結合したFyｂ71−81クローンは、 339アミノ酸残基のポリペプチドをコードする、位置176 で始まり、位置1192で終るオープンリーディングフレームを予想した（図１ｂ）。 BLAST（商標）ネットワークサービスを用いて、NEBIでのGe nBank(商標)配列調査(放出（release）77)はヒトおよびウサギのインターロイキン−８受容体との有意のタンパク質配列相同性およびヒト海馬cDNAクローンHHCM F86 との準全ヌクレオチド配列相同性を与えた（下記参照）。アンチセンスプライマーの伸長した生産物（位置57から80、図１ｂ）は、Fyｂ81クローンの５′末端（図示せず）で予想されたサイズとまさに合う、80ヌクレオチドの配列をもたらした。位置176-178で、開始コドンは、哺乳類の翻訳開始に最もよく伴われる配列の背景内にはめこまれていない。 M.Kozak「 Nucleic Acids Res.」87，8125（1987）参照。しかしながら、次の理由により、それが本当の開始コドンであると推測される。すなわち、（ｉ）それは５′末端での唯一の ATGコドンであるおよび（ii）最初のメチオニン残基から、結合したクローンによりコードされたポリペプチドは、脱グリコシル化 gpDタンパク質の分子量と同じ分子量を有している。CaudhuriおよびA.O.Pogo（印刷中）「Blood Cell Biochemistry」J.P.Cartron およびP.Rouger編（Plenum Press，New York ）Vol.６参照。３′末端において、クローンFyｂ71−81はコンセンサスポリ（Ａ）付加シグナルAATTAAA を含んでいた（図１ｂ）。いくつかの塩基の置換が６つの異なったアミノ酸の予想をもたらす５′末端以外では、両クローンは完全なヌクレオチド配列一致を有していた。両 DNA鎖は何回か配列決定がされているので、これらの不一致は配列決定の誤りではなかった。cDNAライブラリーがいくつかのFy（ａ−ｂ＋）個体のmRNAから構成されたので、それらはタンパク質不均質の結果であった。 Fyｂ71−81が gpDに特異的なコード配列を有していたことを立証するために、翻訳された配列を６つのペプチドPe１−Pe６から得られた部分アミノ酸配列データと比較した。予想アミノ酸配列の部分がθPA試薬によって配列決定されたPe１（配列番号２）ペプチドと一致し、逆相HPLCによって単離された４つのペプチド（Pe２（配列番号３）、Pe３（配列番号４）、Pe４（配列番号５）およびPe６（配列番号７）のペプチド）と一致し、SDS-PAGEにより単離されたPe５（配列番号６）のペプチドと一致した。しかしながら、全62残基のうち、二つは一致しなかった。すなわち、92および 327の位置の残基はコドン配列分析によればトリプトファンであるが、アミノ酸配列決定では、それぞれ、イソロイシンおよびアルギニンである。トリプトファンは非常に不安定な残基であるから、不一致はアミノ酸配列分析の技術的な問題であるかもしれない。他方では、それらは、 gpDタンパク質の不均質のためなのかもしれない。 Fyｂ71−81が gpDタンパク質をコードするという付加的な証拠はノザンブロットおよび ELISA分析によって提供された。Fyｂ81はデュフィー陰性個体のいかなるmRNAも検出しなかったが、デュフィー陽性個体のgpD mRNAの全長さを表わす〜 1.27キロ塩基（kb）転写物を検出した（図３ａ）。抗−Fy６抗体は、Fyｂ71−81 クローン（示されていない）によって予想された、35単量体単位の合成ペプチド（残基９から44、図１ｂ参照）と反応した。Fy（ａ−ｂ−）表現型に gpDタンパク質特異的mRNAが存在しないことおよび抗−Fy６とgpD cDNAから誘導されたペプチドとの反応は単離されたクローンが本当のデュフィークローンであるという強い兆候である。例５：gpDタンパク質のアミノ酸配列および膜トポロジー Fyｂ71−81クローンの予想された翻訳生産物は、等電点5.65の酸性タンパク質で分子量はMr35,733である。該タンパク質はアミノ末端にアスパラギン残基へのＮ−グリコシル化のためのたった二つの潜在的な標準的配列を担持している。R. D.Marshall「Annu．Rev．Biochem．」41，673(1972)参照。これは、Ｎ−グリコシダーゼＦ消化がSDS-PAGE上での gpD移動性を増加させるという過去の研究と一致し、Ｎ−アセチルグルコサミンの化学的検出とも一致する。A.ChaudhuriおよびA.O.Pogoの上記；M.J.A.Tanner，D.J.Anstee，G.Mallison，K.Ridgwell，P.G. Martin，N.D.AventiおよびS.F.Parsonsの「Carbohydr．Res．」178，203（1988 ）および K.Wasncowaska， P.Erchenberger，F.KugeleおよびT.J.Hadleyの「Biochem．Biophy．Res．Commun ．」192，366（1993）参照。 Engelman他のヒドロパシーマップ（「Ann．Reu．Biophys．Chem.」15，321( 1986)）を用いて配列データからのトランスメンブランらせんの位置の予想および20残基の走査ウインドウはタンパク質の大部分は膜に埋め込まれていることを示している（図２）。９つのトランスメンブランα−らせん、Ｎ−末端での66残基の親水性ドメイン、Ｃ−末端での25残基の親水性ドメインおよび短い突き出ている親水性の連結セグメントが予想された。らせんの対、ＤおよびＥは、非常に密接して配置されているので、それらは対になった反−平行らせんとして配置されるかもしれない。 gpDタンパク質のトポロジーの図形的な説明は図２に示されている。 Hartmann他（「Proc．Natl．Acad．Sci．USA」 86，5786（1989））によって提案された、電荷−差規則はＮ−末端は膜の細胞外側にあり、タンパク質のＣ− 末端は膜の細胞質側にあることを予想している。Ｎ−末端の予想は、二つの潜在的なＮ−グリコシル化部位のＮ−末端上での発見により確認されている。さらに、抗−Fy６とこのドメインから推定された合成ペプチドとの反応は、抗体は赤血球に結合するから、その細胞外の位置を実験的に立証する。膜挿入のためのシグナル−アンカー配列は、たぶん、Ｎ−末端ドメインに続く最初のトランスメンブランα−らせんに存在する。H.P.WesselsおよびM.Spies「Cell」55，61（1988）および G.Blobel「Proc．Natl．Acad．Sci．USA」77，1496（1980）参照。そこから、タンパク質は膜中に深く埋まり、膜の細胞質側上に残基 314で存在する。 α−らせん、親水性連結セグメントおよびＣ−末端フラグメントの位置のトポロジー的な予想は直接的な生化学および免疫化学分析によって実証すべきである。デュフィー gpDタンパク質は、Band３の膜会合フラグメント（D.Jay「Annu．R ev．Biochem」55，511(1986)参照）、ヒト血液型Rhポリペプチド（B.Cherif-Zzh ar他「Proc．Natl．Acad．Sci．USA」87，6243（1990）および N.D.Avent他「Bi ochem．J．」271，821（1990）参照）、バクテリオロドプシン（P．Carlton他「 EMBO J．」4，1593（1985）参照）およびリポフィリン（W．Stoffel他「Hoppe-S eyler’Z．Physiol．Chem．」364，1455（1983）参照）のように膜中に深く埋められている。 gpDタンパク質とインターロイキン−８受容体との有意の相同性は、非常に興味深い。W.E.Holmes他「Science」253，1278（1991）およびP.M.Murp hy他「Science」253，1280(1991)参照。 gpD タンパク質がケモカインと結合し、シグナル形質導入カスケードを活性化する能力を持つなら、これは新しい類の原炎症性メディエーターとしの gpDタンパク質のもとである。赤血球およびその前駆体と反応する、精製され、変性された gpDタンパク質に対するうさぎポリクローナル抗体(抗−gpD)は、どのような白血球とも反応しないから（未発表の結果）、したがって、 gpDタンパク質は白血球には存在しない。例６：RNAブロット分析（ノザン）ポリ（Ａ）⁺RNA をホルムアルデヒド／アガロースゲル上に流し、Hybond（商標）Ｎ⁺ナイロン膜（Amersham Corp.）上に移した。それらを製造者の説明書にしたがって、Quick Hyb(商標、Stratagene)中でハイブリダイズし、洗浄した。ノザンブロット分析で、Fyｂ71またはFyｂ81クローンは三つのデュフィー陽性表現型の骨髄中に〜1.27kb mRNA 種を検出したが、Fy（ａ−ｂ−）表現型の個体中には検出しなかった（図３ａ）。gpDmRNAの不存在は、デュフィー陰性個体の gpDタンパク質の不存在と矛盾しない。抗-gpD抗体は、Fy（ａ−ｂ−）赤血球膜タンパク質のいずれとも反応しなかった（図示せず）。デュフィー陰性の個体は、デュフィー特異的mRNAを合成しないという理由で、 gpDタンパク質を発現しなかった。図３ａでは、レーン１は10μｇのFy（ａ−ｂ−）mRNAを含み、レーン２およびレーン３はそれぞれ、５μｇのFy（ａ＋ｂ−）mRNAおよびFy（ａ−ｂ＋）mRNAを含み、レーン４は、２μｇのFy（ａ＋ｂ＋）mRNAを含んでいた。それらを２％変性アガロースゲル上に溶解し、ブロットし、ハイブリダイズし、−80℃で72時間オートラジオグラフさせた。 RNAサイズマーカーは次のとおり：すなわち、ヒト 28Ｓ(5.1kb)および18Ｓ(2.0kb)γRNA 並びに 1.35kb GIBCOBRLマーカー(LIFE TE CHNOLOGIES)がgpD mRNAのサイズを算出するために用いられた。底部のアクチンプローブは試料負荷の対照として用いられた。例７：DNAブロット分析（サザン）供給者(New England Biolabs)によって提案された条件に従って、すべての制限酵素消化を行った。ノザン分析のために記載のとおり、消化された DNAを0.8 ％アガロースゲル上でサイズ分画し、ブロットした。製造者の説明書に従って、 QuickHyb（商標）溶液中のハイブリダイゼーションを68℃で１時間実行した。サザンブロット分析で、Fyｂ71またはFyｂ81プローブはデュフィー陽性およびデュフィー陰性の個体の DNAとハイブリダイズした（図３ｂ）。それらは、 Bam HI消化 DNA中に 6.5kbの１本のバンド、 EcoRI消化DNA 中に12kbおよび２kbの２本のバンド、および PstＩ消化DNA 中に 3.5kbおよび 1.4kbの２本のバンドを同定した。これらの発見はFyｂ71およびFyｂ81クローンの制限マップと一致し、シングルコピーの遺伝子を示す。デュフィー陽性およびデュフィー陰性の個体の遺伝子の中の構造的な差異の決定は、デュフィー陰性の個体における gpD遺伝子制御のメカニズムを明らかにすべきである。他の系において記載されている機能的な沈黙させる要素が、Fy（ａ−ｂ−）個体の赤血球中で gpD遺伝子の転写を選択的に抑制するのかもしれない。L.Li，T.Suzuki，N.MoriおよびP.Gr eengard「Proc，Nath．Acad．Sci．USA」90，1460（1993）参照。デュフィー型は、ABO型（Ｆ．山本他「Nature」 345，229(1990)）およびmRNAが血液型決定因子を発現しない個体中に発見されたKell型とは異っている。図３ｂでは、各レーンは10μｇの消化された DNAを含んでおりレーン１−４は Fy(ａ−ｂ−)DNAを含み、レーン５−８はFy(ａ＋ｂ−)DNAを含み、そしてレーン９−10はFy(ａ−ｂ＋)DNAを含んでいた。酵素消化は次のとおりであった。すなわち、レーン１，５および９は BamHI、レーン２，６および10は EcoRI、レーン３，７および11は HinfI並びにレーン４，８および12はPstIであった。それらを 0.8％アガロースゲル上に溶解し、ブロットし、ハイブリダイズし、そして−80 ℃で７日間オートラジオグラフした。GIBCOBRL DNAマーカーの位置からサイズを算定した。４図に示したように、1.27kbのmRNAの種が成人の脾臓および腎臓、胎児の肝臓に発見されたが、成人の肝臓およびＫ562 赤白血病細胞には発見されなかった。 β−グロビンプローブを用いたハイブリダイゼーションは、骨髄および胎児の肝臓に強いシグナルを示し、成人の脾臓に弱いシグナルを示したが、成人の肝臓、脳および腎臓にはシグナルを示さなかった（図示せず）。胎児の肝臓は造血器官であるから、胎児の肝臓中のgpD mRNAの存在は予期されていた。ヒトの脳には 8 .5kbの強いバンドおよび 2.2kbのかすかなバンドが検出された。これはいくらかのおもしろい可能性を生む。それは脳の中にはデュフィー関連タンパク質があることを示している。このアイディアは、 Fyｂ71−81クローンと、最近同定され、配列番号15と呼ばれる、ヒト海馬cDNAクローンHHCMF86 との間の準全体相同性によってもまた支持される。しかしながら、 8.5kbの脳mRNAが長い５′および３′不翻訳配列をもつデュフィータンパク質をコードすることはありそうもない。脳のmRNAは gpDタンパク質と広範囲にわたる相同性を有しているより大きいタンパク質をコードしている可能性がある。これらのmRNAの種と gpD特異的mRNAとの相同性は、配列分析によって証明されることが残っているが、しかしながら、該発見は gpDタンパク質または同様なタンパク質は、肝臓、非−造血の脾臓細胞および多分、脳において生産されることを強く示している。 gpD タンパク質とヒト海馬cDNAクローンHHCMF86 との間の DNA配列相同性を示すチャートは図５として提示されている。HHCM86 cDNAクローンは２才の白人女性から得られた(Adams他「Nature」355，632(1992))。 HHCMF86にはいくつかの明らかにされていない塩基があり、二つのクローンは gpDタンパク質中の位置62 3 にまで同じ ORFを有している(HHCMF86中の293)。 HHCMF86はこの位置の後で O RF中にフレームシフトを生ずる余分なアデニンを有している。この余分のアデニンはHHCMF86 cDNAの配列エラーであるらしい。図４で、レーン１，３，５および７は、それぞれ、２μｇのFy（ａ−ｂ＋）骨髄、胎児の肝臓、成人の脾臓および赤白血病（Ｋ562）mRNAを含有していた。レーン２，４および６はそれぞれ７μｇの全脳、成人の肝臓および成人の腎臓mRNA を含有していた。それらを 1.5％変性アガロースゲル上に溶解し、−80℃で５日間オートラジオグラフした。例８：cDNAヒト骨髄ライブラリーの構成およびスクリーニングいくつかのFy（ａ−ｂ＋）個体のmRNA，BRL Superscript Choice（商標）およびプライマーとしてのオリゴdTの混合物をcDNAを調製するために用いた。cDNAを λZAP II（商標）ベクターに結合し、Gigapak Gold（商標、Stratagene）抽出物とともに容器に入れた。約 1.9×10⁶の増幅されてないcDNAクローンを上記の³² Ｐ−標識プローブでスクリーニングした。 pBluescript中へのcDNA挿入断片は、製造者の実施要綱に従って、プラスミドレスキュー法によって単離された。両 D NA鎖は、ベクタープライマーを用いて配列決定され、そしてプライマーは、転写物の配列決定された領域から設計された。例９：プライマー伸長コード鎖（図１ｂ）の57から80のヌクレオチドからの³²Ｐ−標識24単量体単位のアンチセンスプライマーをPreamplification Kit(BRL)を用いてFy（ａ−ｂ＋）mRNA上に伸長し、生産物を６％配列決定ゲル上で分離した。Ｍ13配列決定手段（ladder）を用いて生産物のサイズを決定した。この即席の詳細な説明および請求の範囲は説明のために示されているのであって限定のためではないことおよびこの発明の精神および範囲に反することなしに種々の修正および変更をなし得ることがわかるであろう。

Claims

【特許請求の範囲】１．gpD をコードする単離されたまたは合成のDNA 。２．配列番号：１に記載されているヌクレオチドを有する、請求項１に記載の単離されたまたは合成のDNA 。３．単離されたまたは合成の変性されていない gpDタンパク質。４．配列番号：14に記載されているアミノ酸配列を含んでなるペプチド。５．配列番号：８に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のペプチド。６．配列番号：９に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のペプチド。７．配列番号：10に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のポリペプチド。８．配列番号：14に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のポリペプチド。９．請求項３に記載の単離されたまたは合成の gpDタンパク質を有効量で含んでなるマラリア感染に対して温血動物を保護するのに有用なワクチン。 10．生理的に受容性の希釈剤と混合された、請求項４に記載のペプチドを有効量で含んでなるマラリア感染に対して温血動物を保護するのに有用なワクチン。 11．該ペプチドが配列番号：８に記載されているアミノ酸配列を有している、請求項10に記載のワクチン。 12．該ペプチドが配列番号：９に記載されているアミノ酸配列を有している、請求項10に記載のワクチン。 13．該ペプチドが配列番号：10に記載されているアミノ酸配列を有している、請求項10に記載のワクチン。 14．該ペプチドが配列番号：14に記載されているアミノ酸配列を有している、請求項10に記載のワクチン。 15．有効量の請求項３に記載の単離されたまたは合成の gpDタンパク質を温血動物に投与することを含んでなる該動物をマラリアの感染から保護する方法。 16．有効量の請求項４に記載のペプチドを温血動物に投与することを含んでなる該動物をマラリアの感染から保護する方法。 17．該ペプチドが配列番号：８に記載されているアミノ酸配列を有している、請求項16に記載の方法。 18．該ペプチドが配列番号：９に記載されているアミノ酸配列を有している、請求項16に記載の方法。 19．該ペプチドが配列番号：10に記載されているアミノ酸配列を有している、請求項16に記載の方法。 20．該ペプチドが配列番号：14に記載されているアミノ酸配列を有している、請求項16に記載の方法。