JPH07203973A - ヒト神経栄養因子の変異遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒト毛様体神経節細胞栄養因子（ＣＮＴＦ）
の変異遺伝子、その変異蛋白質、ＣＮＴＦの遺伝子型の
判定法及びＣＮＴＦの免疫測定法。 【効果】 このＣＮＴＦ変異遺伝子は、老人性痴呆、筋
萎縮性側索硬化症、運動神経変性症、末梢神経障害など
種々の神経系疾患に深く関与している可能性が高く、こ
の存在を判別し、また変異ＣＮＴＦ量を測定することは
これらの疾患の経過と予後の観察に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒトの毛様体神経節細胞
栄養因子（Ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ
ｆａｃｔｏｒ，以下ＣＮＴＦという）の変異遺伝子、
当該遺伝子がコードする変異蛋白質、ＣＮＴＦ遺伝子型
の判定法、及びＣＮＴＦ量の測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＣＮＴＦは１９８４年にその存在が確認
され〔Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０４，１４３４−１４３６
（１９７９）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４３，１４６
８−１４７８（１９８４）〕、その後１９８９年になっ
て欧米の研究者によりラットとウサギからＣＮＴＦのｃ
ＤＮＡがクローニングされ、その構造が決定された〔Ｎ
ａｔｕｒｅ ３４２，９２０−９２３（１９８９）、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４６，１０２３−１０２５（１９８
９）〕。ＣＮＴＦは末梢では主としてシュワン細胞で発
現、生産されているが、中枢神経でも星状細胞膠細胞な
どで発現していることがわかった〔Ｇｌｉａ ５，２５
−３２（１９９２）、Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６
６，２０９−２１９（１９９２）、Ｎｅｕｒｏｎ ９，
２９５−３０５（１９９２）、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．１１５，４４７−４５９（１９９１）〕。

【０００３】ＣＮＴＦの生理的意義について研究がなさ
れており、ＣＮＴＦは運動神経だけでなく記憶などに関
係する神経の生存に不可欠であることが、数多くの研究
から明らかになりつつある。すなわち、ラットの座骨神
経を切断するとその神経細胞の多くは死滅するが、ＣＮ
ＴＦを神経断端に投与しておくと神経細胞死は防止でき
る〔Ｎａｔｕｒｅ ３４５，４４０−４４１（１９９
０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１，１６１６−１６１８（１
９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．，９０，２２２２−２２２６（１９９３）〕。
また遺伝性ミュータントマウスであるｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｉｖｅ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙにおける運
動神経細胞の変性死もＣＮＴＦによって防ぐことができ
ることも報告された〔Ｎａｔｕｒｅ ３５８，５０２−
５０４（１９９２）〕。さらに培養神経細胞においても
ＣＮＴＦはその生存を著しく高めることができる〔Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉ．ｌｅｔｔ．１０５，３１６−３２０（１
９８９）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １０，３５
０７−３５１５（１９９０）〕。さらに、ＣＮＴＦは、
記憶などの高次の精神機能に関与し痴呆に際して脱落す
ることが知られている脳の海馬のコリン作働性神経の生
存についても不可欠と考えられている〔Ｊ．Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉｅｎｃｅ １１，３１２４−３１３４（１９９
１）、Ｎｅｕｒｏｎ ８，１４５−１５８（１９９
２）〕。さらに、ＣＮＴＦは、その他の神経細胞につい
てその生存を高めたり、分化を促進することが明らかに
なりつつある〔Ｎｅｕｒｏｎ ８，７３７−７４４（１
９９２）、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０８，１８０７
−１８１６（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ ３３５，７０
−７３（１９８８）〕。

【０００４】また、これらＣＮＴＦの生理作用に関する
実験結果から、正常のＣＮＴＦ蛋白質を各種神経疾患の
治療に用いる試みも行われている〔Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈ
ｅｍ．５７，１００３−１０１２（１９９１）、Ｇｅｎ
ｅ １０２，２７１−２７６（１９９１）、Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１，２８９−２９４（１９９
１）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １
０９０，７０−８０（１９９１）〕。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、かかる
ＣＮＴＦについてはその遺伝子変異の存在はもちろん、
遺伝子変異の生理的意義については何の報告もされてい
ない。従って、本発明の目的はＣＮＴＦの変異遺伝子、
その変異遺伝子がコードする変異蛋白質、ＣＮＴＦ遺伝
子型の判定法及びＣＮＴＦ量の測定法を提供することに
ある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らはヒト
の座骨神経のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
し、今まで報告された遺伝子とは異なるｃＤＮＡを見出
し、クローニングするとともにその構造と発現のメカニ
ズムを明らかにし、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は配列番号３で示される
塩基配列を有するヒトＣＮＴＦの変異遺伝子を提供する
ものである。

【０００８】また、本発明は配列番号４で示されるアミ
ノ酸配列を有するヒトＣＮＴＦの変異蛋白質を提供する
ものである。

【０００９】また、本発明は、オリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして遺伝子増幅反応を行い、当該遺伝子増幅
反応生成物より塩基配列GGCCを有する遺伝子及び／又は
塩基配列AGCCを有する変異遺伝子の有無を検出すること
を特徴とするヒトＣＮＴＦの遺伝子型の判定法を提供す
るものである。

【００１０】さらに、本発明は上記のヒトＣＮＴＦ変異
蛋白質に対する抗体及び／又は正常ヒトＣＮＴＦに対す
る抗体を用いることを特徴とするヒトＣＮＴＦの免疫測
定法を提供するものである。

【００１１】本発明のＣＮＴＦ変異遺伝子は、ヒト神経
細胞のｃＤＮＡライブラリーより、次の如くして製造す
ることができる。まず、ヒトＣＮＴＦが含有されている
と考えられるヒト組織、例えばヒト座骨神経より全ＲＮ
Ａを分離し、これよりｍＲＮＡを精製し、常法によりｃ
ＤＮＡライブラリーを構築する。次いでこのｃＤＮＡラ
イブラリーより、ヒトのＣＮＴＦのｃＤＮＡを分離し
た。この際プローブとしてはヒトのＣＮＴＦの遺伝子断
片を用いたが、これはヒトの遺伝子ＤＮＡをテンプレー
トとし、ラットのＣＮＴＦの配列から予測される共通配
列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰＣＲ反
応によって増幅した断片である。この方法によって正常
及び変異ＣＮＴＦのｃＤＮＡをクローニングすることが
できる。

【００１２】得られたヒトの変異ＣＮＴＦ遺伝子及びｃ
ＤＮＡの塩基配列の決定はＳａｎｇｅｒらのダイデオキ
シ法によって行った。（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｎｉｃｋｌ
ｅｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４，５４６３−
５４６７，１９７７）。

【００１３】かくして決定されたＣＮＴＦ変異遺伝子の
全塩基配列及びＣＮＴＦの変異蛋白質のアミノ酸配列を
配列番号１に示す。ＣＮＴＦ変異遺伝子と正常ＣＮＴＦ
遺伝子の塩基配列（配列番号２）とを対比すると、イン
トロン部のＧ→Ａの点変異（１３２２番）があるのみで
ある。しかしながら、この点変異によって新たにスプラ
イシングサイトが出現し、ｍＲＮＡの配列が変わるた
め、正常ＣＮＴＦとは全く異なる変異蛋白質ができる。
本発明ＣＮＴＦ変異遺伝子の翻訳領域の塩基配列を配列
番号３に、本発明ＣＮＴＦ変異蛋白質のアミノ酸配列を
配列番号４に示す。このように、正常ＣＮＴＦ遺伝子
は、２００個のアミノ酸をコードしているのに対し、本
発明変異遺伝子は６２個のアミノ酸をコードしており、
そのうちＮ−末端側の３６個のアミノ酸は正常ＣＮＴＦ
と共通であるがＣ−末端側のアミノ酸は全く異なってい
る。

【００１４】本発明のＣＮＴＦ変異蛋白質を大量に生産
するには、遺伝子組換え技術を用いて行うことができ
る。すなわち、配列番号１又は３で示されるＤＮＡ断片
を公知の発現ベクターに結合して適当な宿主細胞に導入
し、当該形質転換細胞を培養することにより生産するこ
とができる。宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵母等が
好ましく、大腸菌が特に好ましい。発現ベクターとして
は、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＧＥＸ−２Ｔ等のほか、バキュ
ロウィルスの発現ベクターｐＢｌｕｅＢａｃなどが挙げ
られる。培養後、培養物から本発明変異蛋白質を採取す
るには、例えば尿素を含む低張バッファーで可溶化した
後液体クロマトグラフィー、抗体カラムなどによって精
製するのが好ましい。また、本発明ＣＮＴＦ変異蛋白質
はペプチド合成機により化学合成することもできる。

【００１５】前記のように正常ＣＮＴＦ遺伝子とＣＮＴ
Ｆ変異遺伝子とは、異なる塩基配列を有するので、この
塩基配列の差異を検出すれば、その検体が正常ＣＮＴＦ
遺伝子のみを有する（正常遺伝子のホモ接合体）ヒトの
ものか、正常ＣＮＴＦ遺伝子と変異遺伝子の両者を有す
る（ヘテロ接合体）ヒトのものか、あるいは変異遺伝子
のみを有する（変異遺伝子のホモ接合体）ヒトのものか
が判定できる。当該判定はＰＣＲ法によるのが簡便であ
る。ＰＣＲ法に用いるプライマーは、変異点の上流の配
列を正方向のプライマーとし、変異点の下流の配列を逆
方向のプライマーとするのが好ましいが、この際翻訳領
域中にあるGGCCに対応する配列をGGCAに変換することに
より制限酵素のＨａｅIII 消化部位をなくすことができ
る。ＰＣＲ反応は常法に従って行われる。

【００１６】このＰＣＲ産物は１３４塩基であるが、正
常ＣＮＴＦ遺伝子をプライマーとして用いた場合の産物
は制限酵素ＨａｅIII 切断部位GGCC配列を有しているの
で、ＨａｅIII を作用させると９４塩基と４０塩基に分
解される。これに対し、本発明変異遺伝子をプライマー
として用いた場合の産物はこのGGCC配列を有していない
のでＨａｅIII を作用させても分解しない。従って、そ
の検体のＣＮＴＦ遺伝子の型を判別することができる。

【００１７】現在までの検索結果によれば、日本人にお
ける遺伝子型の分布は正常遺伝子のホモ接合体が６５
％、ヘテロ接合体が３２％、変異遺伝子のホモ接合体が
３％であった。この変異遺伝子のホモ接合体を有する患
者は、いずれも末梢神経の変性や炎症性の末梢神経炎の
患者であった。従って、ＣＮＴＦの遺伝子の型を判別す
ることは、老人症痴呆、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬ
Ｓ）、運動神経変性症、末梢神経障害などの神経系疾患
の発症素因、経過及び予後を予測する上で重要な検査方
法となる。

【００１８】次に、正常ＣＮＴＦに対する抗体及び／又
は変異ＣＮＴＦ蛋白に対する抗体を利用するＣＮＴＦの
免疫測定法について説明する。まず、これらの抗体とし
てはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれ
も使用することができる。ポリクローナル抗体は、これ
らの蛋白自体、正常ＣＮＴＦに特異的なアミノ酸配列を
有するポリペプチド又は変異ＣＮＴＦに特異的なアミノ
酸配列を有するポリペプチドを抗原として用い、マウ
ス、ウサギ、ウマ等に免疫後抗血清を採取することによ
り調製することができる。一方、モノクローナル抗体
は、同様のポリペプチドを抗原として用い、通常の細胞
融合法により調製することができる。

【００１９】免疫測定法としては、サンドイッチ法、競
合法のいずれも採用でき、さらにＥＩＡ、ＲＩＡのいず
れの系にも適用できる。このうち、ＥＩＡ、特にＥＬＩ
ＳＡが簡便性、精度の面から特に好ましい。

【００２０】従来、ＣＮＴＦの定量は専らバイオアッセ
イ法によっていた。しかし、バイオアッセイは不正確で
あるとともに多くの時間と労力を要するものであった。
これに対し、本発明の免疫測定法によれば簡便な操作で
かつ精度よく、正常ＣＮＴＦ又は変異ＣＮＴＦを同時に
又は区別して定量することができる。

【００２１】次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではな
い。

【００２２】実施例１（ＣＮＴＦ変異遺伝子の解析） （１）ｃＤＮＡライブラリーの構築 ヒトの座骨神経をグアニジンチオシアネート溶液中で破
砕した後に塩化セシウムによる密度勾配遠心法によりＲ
ＮＡを分離した。ついでオリゴｄＴセルローズカラムク
ロマトグラフィーによってｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを精製
した。これを２０マイクログラム用いて逆転写酵素によ
りｃＤＮＡを合成し、ついでＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリ
メラーゼ、ＤＮＡリガーゼを作用させることにより二重
鎖を合成した。このｃＤＮＡをλｇｔ１０ベクターに結
合したのちファージにパッケージングしたうえで大腸菌
に感染させた。この場合約２百万個のファージからなる
ｃＤＮＡライブラリーを得ることができた。

【００２３】（２）ＣＮＴＦ変異遺伝子のクローニング （１）で得たｃＤＮＡライブラリーをプレートに播種
し、ニトロセルローズ膜に移したのちヒトのＣＮＴＦ断
片をプローブとしてスクリーニングした。プローブのラ
ベルにはマルチプライムラベリングキットを用いた。こ
のようにして得られたｃＤＮＡクローンの制限酵素地図
を作製したところ２種類の構造の異なるｃＤＮＡがとれ
た。

【００２４】（３）ＣＮＴＦ変異遺伝子の塩基配列の決
定 ＣＮＴＦのｃＤＮＡの塩基配列の決定はＳａｎｇｅｒら
によって開発されたダイデオキシ法によって行った。そ
の結果、一種のｃＤＮＡは正常のＣＮＴＦをコードした
ものであるのに対し、他のｃＤＮＡは変異したＣＮＴＦ
のｃＤＮＡであることが判った。かくして決定されたＣ
ＮＴＦ変異遺伝子の全塩基配列及びＣＮＴＦ変異蛋白の
アミノ酸配列は配列番号１に示す。配列番号１の塩基配
列のうち、１〜４８は非翻訳領域であり、１６３〜１３
２３はイントロンであり、１３９５〜３０２０は非翻訳
領域である。

【００２５】実施例２（ヒトＣＮＴＦ遺伝子型の判定） ヒトの血液から白血球を分離したのち、この白血球から
細胞核を分離したのち、これをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナ
トリウム）と蛋白質分解酵素Ｋで処理することにより遺
伝子ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡ １μg を用い、実
施例１で得られたヌクレオチド及び当該ヌクレオチドの
翻訳領域にあるGGCC配列を全てAGCCに置換したヌクレオ
チドをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行った。Ｐ
ＣＲ産物をＨａｅIII で処理した後アガロースゲル電気
泳動に付した。その結果を図１に示す。図１中、Ａレー
ンの検体は１３４塩基のＰＣＲ産物はなく、９４塩基と
４０塩基のバンドのみが検出された。これは、ＰＣＲ産
物のすべてがGGCCのＨａｅIII 切断部位を有しており、
正常ＣＮＴＦ遺伝子のホモ接合体である。Ｂレーンの検
体は１３４塩基の一部が９４塩基と４０塩基に分解し、
三つのバンドが検出された。これはＰＣＲ産物の一部が
GGCCのＨａｅIII 切断部位を有しており、正常ＣＮＴＦ
遺伝子とＣＮＴＦ変異遺伝子のヘテロ接合体である。ま
た、Ｃレーンの検体は１３４塩基のＰＣＲ産物のみが検
出された。これはＰＣＲ産物のすべてがGGCCのＨａｅII
I 切断部位を有さず、ＣＮＴＦ変異遺伝子のホモ接合体
である。

【００２６】現在までに検索した限りでは日本人におけ
る遺伝子型の分布は正常遺伝子のホモ接合体が６５％、
ヘテロ接合体が３２％、変異遺伝子のホモ接合体が３％
であることが判った。変異遺伝子のホモ接合体は２例し
か見つかっていないが、１例はＣｈａｒｃｏｔ−Ｍａｒ
ｉｅ−Ｔｏｏｔｈ症候群という末梢神経の変性を起こす
遺伝性疾患であり、もう１例はＧｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａ
ｒｒｅ症候群の患者であった。後者は炎症性の末梢神経
炎であり数カ月で治癒する疾患であるが、この患者の場
合発症後一年以上経過してもなお症状が軽快しないとい
う異常な経過をたどっている症例であった。

【００２７】実施例３（生体試料中のＣＮＴＦ量の測
定） （１）正常ＣＮＴＦの調製 正常ＣＮＴＦの調製は幾つかの方法により行うことがで
きる。ヒト剖検例から得られた座骨神経を破砕したのち
ゲル濾過、イオン交換樹脂、アフィニティークロマトグ
ラフィーで精製した。さらに、これをアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分離して分子量２３ｋＤａの蛋白質バ
ンドを抽出することによって精製することができる。あ
るいはＣＮＴＦのｃＤＮＡを発現ベクターに結合したの
ち培養動物細胞に導入してＣＮＴＦ蛋白質を発現させ、
その細胞抽出液から上記の方法により正常ＣＮＴＦ蛋白
質を精製することができる。又はＣＮＴＦのｃＤＮＡを
大腸菌の発現ベクターに結合したのち大腸菌に導入しＩ
ＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｔｈｉｏ
−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）で誘導するこ
とによりＣＮＴＦ蛋白質を発現させることができる。こ
の際ベクターとしてｐＧＥＸ−２Ｔを用いればＧＳＴ
（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓ
ｅ）との融合蛋白質として効率よく発現させることがで
きる。この融合蛋白質はｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｓｅ
ｐｈａｒｓｅカラムにより一段階で精製することができ
る。これをｔｈｒｏｍｂｉｎで切断したのちに再びｇｌ
ｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを通せ
ばＧＳＴ部分はカラムに結合するのに対しＣＮＴＦはカ
ラムを通過するので純品のＣＮＴＦ蛋白質を得ることが
できる。

【００２８】（２）正常ＣＮＴＦに対するモノクローナ
ル抗体の調製 上述した方法により精製したＣＮＴＦ蛋白質をフロイン
ドのアジュバンドとともにマウスに注射して免疫を繰り
返したのち血清中の抗体価を測定する。抗体価の高いマ
ウスの脾臓細胞をミエローマ−ＳＰ６細胞と融合したの
ちに増殖してきた細胞について抗ＣＮＴＦ抗体を検出す
る。選択したＣＮＴＦ抗体産生細胞をマウスの腹腔内に
注射したのちその腹水を回収してこれより抗体を精製す
る。

【００２９】（３）変異ＣＮＴＦ抗原の調製 変異ＣＮＴＦに特異的なＣ−末端領域のペプチド、すな
わちｇｌｕ−ａｌａ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｕ
−ｇｌｎ−ｇｌｕ−ｈｉｓ−ｇｌｎ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−
ｌｅｕ−ｃｙｓ−ｇｌｙ−ｔｒｙ−ａｓｐ−ａｌａ−ｓ
ｅｒ−ｇｌｙ−ｌｙｓ−ｈｉｓの２２個のアミノ酸から
なるペプチドを化学的に合成し、これをＫＬＨに結合さ
せた後マウスを免疫して抗血清を採取することにより、
変異ＣＮＴＦに対する特異的抗体を作製した。

【００３０】（４）ＥＬＩＳＡによる生体試料中のＣＮ
ＴＦ量の測定 （２）で得られた抗正常ＣＮＴＦモノクローナル抗体を
エライザプレートにコートし、これに検体１００μl を
添加し、室温で一夜放置した後生理食塩水−０．０５％
ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。これにビオチンで標識
した抗正常ＣＮＴＦモノクローナル抗体（先の抗体とは
異なるエピトープを認識するもの）（１μg ／ml）を１
００μl 添加し、室温で２時間放置した後生理食塩水−
０．０５％ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。これに西洋
ワサビペルオキシダーゼで標識したストレプトアビジン
（０．２μg ／ml）を１００μl 加え、室温で１時間放
置した後生理食塩水−０．０５％ｔｗｅｅｎ２０で５回
洗浄した。これにオルオフェニレンジアミン（ＯＰＤ）
（１．５mg／ml）及び０．０１５％過酸化水素の混液を
１００μl 添加し、室温で３０分間放置した後２Ｎ硫酸
５０μl を加え、４９２nmの吸光度を測定した。得られ
た標準曲線を図２に示す。

【００３１】

【発明の効果】本発明のＣＮＴＦ変異遺伝子は、老人性
痴呆、筋萎縮性側索硬化症、運動神経変性症、末梢神経
障害など種々の神経系疾患に深く関与している可能性が
高く、この存在を判別し、また変異ＣＮＴＦ量を測定す
ることはこれらの疾患の経過と予後の観察に有用であ
る。

【００３２】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：３０２０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：ホモサピエンス 配列： CAGAAGTAAA CCCAGCTGAC TTGTTTCCTG GGACAGTTGA GTTAAGGG ATG GCT TTC 57 Met Ala Phe ACA GAG CAT TCA CCG CTG ACC CCT CAC CGT CGG GAC CTC TGT AGC CGC 105 Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu Cys Ser Arg 5 10 15 TCT ATC TGG CTA GCA AGG AAG ATT CGT TCA GAC CTG ACT GCT CTT ACG 153 Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr Ala Leu Thr 20 25 30 35 GAA TCC TAT GTAAGTTGCC TATTTTGCTG TTATCTGTTT TCCCTTCATC TTTTTTGAT 211 Glu Ser Tyr CCAGCAACTT ACCATCACGC ATCAGCTCCA TTACCAATTG TGAAAGCTCT AATCATATAG 271 TCATTCATAT AGGTTATTTG ACATGGGCCC TTCCCTTGAG GAAACCCATG TGACTTTATT 331 TTCTTCCTCT GGGCTGTTTA GGAGATGGAG TTACTTGAAT GAGAAAATAT ATATGGAGTT 391 CTAGAAAGGA TTGGTTTATA TGTCTTGGAG GCTATTCCAA ATTTATTGGC ATATATTCTG 451 AATACTACTA GAACAGATTA GCCATGGGCC CTCTGGTTCT TCATAGCCAT TGTTCTGAAT 511 TTTTTAGCTA TGTAAATGAA AGGTTTATGG GATAGGAAGA GTACTATGAA CGTGGGAGGA 571 ATTTGTAAAT CCTACCAATT TCTCCTATAT AGCATTAGCC ACCCACCTTT TAGTATTCTG 631 CATCAAAAGT AGATTGTGTC TAAAGAGAAA GGTAAGCTAT CAAAAGGATC TCCTAGAAGA 691 TTCATTGGAA ACTTGTGGAA GTGTCAAATT CTTGAGCTAA TTCTGGAGTT CCAGATTTGT 751 CTTCTAACAG TAAGGGGATC CCCATCAATT TCCACCTGAG ATATGCTGTG GAAATACTCC 811 AACCCCTGTG GAGAGTTTTG AATTTAGGCT GAGAACTGAT TTATCTTTGT ACAGCCTCAC 871 CAGACAGAAA TCAGACTCTT TGGGAGTGCT CAATGGGGAG AGGGAAGTTA GAGAAATTCT 931 ACAATGGCTA TATTCCAAGT TTTCCTAGTT GTGGCCAGTG TCTTTTACAA GTAGTTTTAA 991 AAATACTTTA ATATGATTAA AATATTCCAG TTAATGAGAG AGTTTGAAGT GAGAAGGAAA 1051 ATTCTTCTAA ATCAGTTTTC AACCTTTAGA ACTCAATAAA ATCTGAACAT TCTTCTAAGA 1111 AAAATCCATA GGTAGTCAAT TTCAGGCAGT ATTGGGTCTT TCTAAAGTCC AGTCATAGAG 1171 CCCAAATTAA GAGTTCCTAC TGTAGACATA TTATTTACTT TACAACTTGG ATCCTTGGCC 1231 AGAGAGATGA GTGAGATTTT GTATGAAATT TAGGGGTGAT TTAAGGACAC TGGGGTGATG 1291 ACAGAAGATG TGGTGTTTTC CTGTATCCT CAG CCA GGT GAA GCA TCA GGG CCT 1344 Pro Gly Glu Ala Ser Gly Pro 40 45 GAA CAA GAA CAT CAA CCT GGA CTC TGC GGA TGG GAT GCC AGT GGC AAG 1392 Glu Gln Glu His Gln Pro Gly Leu Cys Gly Trp Asp Ala Ser Gly Lys 50 55 60 CAC TGATCAGTGG AGTGAGCTGA CCGAGGCAGA GCGACTCCAA GAGAACCTTC AAGCTT 1451 His ATCGTACCTT CCATGTTTTG TTGGCCAGGC TCTTAGAAGA CCAGCAGGTG CATTTTACCC 1511 CAACCGAAGG TGACTTCCAT CAAGCTATAC ATACCCTTCT TCTCCAAGTC GCTGCCTTTG 1571 CATACCAGAT AGAGGAGTTA ATGATACTCC TGGAATACAA GATCCCCCGC AATGAGGCTG 1631 ATGGGATGCC TATTAATGTT GGAGATGGTG GTCTCTTTGA GAAGAAGCTG TGGGGCCTAA 1691 AGGTGCTGCA GGAGCTTTCA CAGTGGACAG TAAGGTCCAT CCATGACCTT CGTTTCATTT 1751 CTTCTCATCA GACTGGGATC CCAGCACGTG GGAGCCATTA TATTGCTAAC AACAAGAAAA 1811 TGTAGCAGTT AGTCCCTTCT CTCTTCCTTG CTTTCTCTTC TAATGGAATA TGCGCAGTTC 1871 CCTGGGGCCT CGCTTTCCCA TCTTAAATTT CTAAAAACAG TTAAGACAAC AGGCATTTTC 1931 TTTCTTTTTT CTCTGACCAC CTGCAGCCTG TTGAAGGACT ACAGGTATTT TCATCAAGTA 1991 GCGTTGGAGA CATACACAAA TGGGCATACA AGTTTAGCCT GGGGGGTGTG ATTTGTGTGC 2051 GTGCTTGCAT GTGCTGCAGG TGTAAGAGAG TGGGAGCAGG CACAACGTCC TTCCACTTCA 2111 GGGTTCTAAC CTTTCTAACC CACTAAGTAA CCTCTACAGG CATTTAACTG CCTTACAGAC 2171 AGAATATACA TATGTTAATT CTAGTCCTGG ATGACTCGGT CTGAGAAGAT TCAATTTAAA 2231 ATCAGACTCT TTAGTTGATT TAAACTCTTA GAGAATAAGA ATAATAATGG CTAACTTTTA 2291 TTATCTTCTA TATTAAGGCA GTATGCAAGG GTCTTTATGT ATATTATGTA CAGCGTTTAC 2351 AACCTTGTGA GCAAGGTGGT GTTACTCCCA TTAGGTAGAT GAGAAAACAG GCTCACAGAG 2411 ATTTGGTTAA GCTCACACAG CTAACAAGTA GCACACTGAG TTTGAACACA GATCATTCTC 2471 CTTGTAAAAG CCTATGTGCC TTTCACTTTA GAGGCTTGAT CATGAATCAC TGCACCTCTT 2531 TGTCACAGGG TGTTGGAAGA TGCATCCATG TAATCTATTC CCATCGCTGG AAAACAGCTG 2591 CTGTTAGATG TCCTCAGAAG TCAGTTGCAA ATTTTAGCGT TAAAGTCAGG ATTTATTGTT 2651 CATACTTGGC GGTGAGGAGG GCAGCTGGAG ATCTTAAGAT TCCATTTTGG AAAATGATTA 2711 GGCCCGCCAA ACTTCTGAAC TTTGGAAGCT GGGGATGTTT AGTAATACAG CCTGGTTTTC 2771 AAGTACTCAC TAAAAGTTCT CAAATATTGG GTTGGGCACG GCTTATACCA GGTTACCTCA 2831 CTTTTAATTA GTGATGCAGG CAGTGTAACC CAAGCATTTG TGGACAATGA GTGGAATACT 2891 AAAGTTAAAA AGTCAAACTT TCACCTCAGA TTTTCTGGAC TTAGTCATGA GGAGAGGGTG 2951 AGGCCCACTC TGTTCCTACT GGAGATACCA GAGACTCTGA AACTATAGAA TAAAGCCTCT 3011 GTGCTGCAC 3020

【００３３】

【配列表】配列番号：２ 配列の長さ：３０２０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：ホモサピエンス 配列： CAGAAGTAAA CCCAGCTGAC TTGTTTCCTG GGACAGTTGA GTTAAGGG ATG GCT TTC 57 Met Ala Phe ACA GAG CAT TCA CCG CTG ACC CCT CAC CGT CGG GAC CTC TGT AGC CGC 105 Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu Cys Ser Arg 5 10 15 TCT ATC TGG CTA GCA AGG AAG ATT CGT TCA GAC CTG ACT GCT CTT ACG 153 Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr Ala Leu Thr 20 25 30 35 GAA TCC TAT GTAAGTTGCC TATTTTGCTG TTATCTGTTT TCCCTTCATC TTTTTTGATC 212 Glu Ser Tyr CAGCAACTTA CCATCACGCA TCAGCTCCAT TACCAATTGT GAAAGCTCTA ATCATATAGT 272 CATTCATATA GGTTATTTGA CATGGGCCCT TCCCTTGAGG AAACCCATGT GACTTTATTT 332 TCTTCCTCTG GGCTGTTTAG GAGATGAAGT TACTTGAATG AGAAAATATA TATGGAGTTC 392 TAGAAAGGAT TGGTTTATAT GTCTTGGAGG CTATTCCAAA TTTATTGGCA TATATTCTGA 452 ATACTACTAG AACAGATTAG CCATGGGCCC TCTGGTTCTT CATAGCCATT GTTCTGAATT 512 TTTTAGCTAT GTAAATGAAA GGTTTATGGG ATAGGAAGAG TACTATGAAC GTGGGAGGAA 572 TTTGTAAATC CTACCAATTT CTCCTATATA GCATTAGCCA CCCACCTTTT AGTATTCTGC 632 ATCAAAAGTA GATTGTGTCT AAAGAGAAAG GTAAGCTATC AAAAGGATCT CCTAGAAGAT 692 TCATTGGAAA CTTGTGGAAG TGTCAAATTC TTGAGCTAAT TCTGGAGTTC CAGATTTGTC 752 TTCTAACAGT AAGGGGATCC CCATCAATTT CCACCTGAGA TATGCTGTGG AAATACTCCA 812 ACCCCTGTGG AGAGTTTTGA ATTTAGGCTG AGAACTGATT TATCTTTGTA CAGCCTCACC 872 AGACAGAAAT CAGACTCTTT GGGAGTGCTC AATGGGGAGA GGGAAGTTAG AGAAATTCTA 932 CAATGGCTAT ATTCCAAGTT TTCCTAGTTG TGGCCAGTGT CTTTTACAAG TATGTTTAAA 992 AATACTTTAA TATGATTAAA ATATTCCAGT TAATGAGAGA GTTTGAAGTG AGAAGGAAAA 1052 TTCTTCTAAA TCAGTTTTCA ACCTTTAGAA CTCAATAAAA TCTGAACATT CTTCTAAGA 1112 AAATCCATAG GTAGTCAATT TCAGGCAGTA TTGGGTCTTT CTAAAGTCCA GTCATAGAGC 1172 CCAAATTAAG AGTTCCTACT GTAGACATAT TATTTACTTT ACAACTTGGA TCCTTGGCCA 1232 GAGAGATGAG TGAGATTTTG TATGAAATTT AGGGGTGATT TAAGGACACT GGGGTGATGA 1285 CAGAAGATGT GGTGTTTTCC TGTATCCTCG GCCAG GTG AAG CAT CAG GGC CTG 1333 Val Lys His Gln Gly Leu 40 AAC AAG AAC ATC AAC CTG GAC TCT GCG GAT GGG ATG CCA GTG GCA AGC 1381 Asn Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser 45 50 55 60 ACT GAT CAG TGG AGT GAG CTG ACC GAG GCA GAG CGA CTC CAA GAG AAC 1429 Thr Asp Gln Trp Ser Trp Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn 65 70 75 CTT CAA GCT TAT CGT ACC TTC CAT GTT TTG TTG GCC AGG CTC TTA GAA 1477 Leu Gln Ala Tyr Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu 80 85 90 GAC CAG CAG GTG CAT TTT ACC CCA ACC GAA GGT GAC TTC CAT CAA GCT 1525 Asp Gln Gln Val His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala 95 100 105 ATA CAT ACC CTT CTT CTC CAA GTC GCT GCC TTT GCA TAC CAG ATA GAG 1573 Ile His Thr Leu Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu 110 115 120 GAG TTA ATG ATA CTC CTG GAA TAC AAG ATC CCC CGC AAT GAG GCT GAT 1621 Glu Leu Met Ile Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp 125 130 135 140 GGG ATG CCT ATT AAT GTT GGA GAT GGT GGT CTC TTT GAG AAG AAG CTG 1669 Gly Met Pro Ile Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu 145 150 155 TGG GGC CTA AAG GTG CTG CAG GAG CTT TCA CAG TGG ACA GTA AGG TCC 1717 Trp Gly Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser 160 165 170 ATC CAT GAC CTT CGT TTC ATT TCT TCT CAT CAG ACT GGG ATC CCA GCA 1769 Ile His Asp Leu Arg Phe Ile Ser Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala 175 180 185 CGT GGG AGC CAT TAT ATT GCT AAC AAC AAG AAA ATG TAGCAGTTAG TCCCTT 1829 Arg Gly Ser His Tyr Ile Ala Asn Asn Lys Lys Met 190 195 200 CTCTCTTCCT TGCTTTCTCT TCTAATGGAA TATGCGTAGT TCCCTGGGGC CTCGCTTTCC 1889 CATCTTAAAT TTCTAAAAAC AGTTAAGACA ACAGGCATTT TCTTTCTTTT TTCTCTGACC 1949 ACCTGCAGCC TGTTGAAGGA CTACAGGTAT TTTCATCAAG TAGCGTTGGA GACATACACA 2009 AATGGGCATA CAAGTTTAGC CTGGGGGGTG TGATTTGTGT GCGTGCTTGC ATGTGCTGCA 2069 GGTGTAAGAG AGTGGGAGCA GGGACAACGT CCTTCCACTT CAGGGTTCTA ACCTTTCTAA 2129 CCCACTAAGT AACCTCTACA GGCATTTAAC TGCCTTACAG ACAGAATATA CATATGTTAA 2189 TTCTAGTCCT GGATGACTCG GTCTGAGAAG ATTCAATTTA AAATCAGACT CTTTAGTTGA 2249 TTTAAACTCT TAGAGAATAA GAATAATAAT GGCTAACTTT TATTATCTTC TATATTAAGG 2309 CAGTATGCAA GGGTCTTTAT GTATATTATG TACAGCGTTT ACAACCTTGT GAGCAAGGTG 2369 GTGTTACTCC CATTAGGTAG ATGAGAAAAC AGGCTCACAG AGATTTGGTT AAGCTCACAC 2429 AGCTAACAAG TAGCACACTG AGTTTGAACA CAGATCATTC TCCTTGTAAA AGCCTATGTG 2489 CCTTTCACTT TAGAGGCTTG ATCATGAATC ACTGCACCTC TTTGTCACAG GGTGTTGGAA 2549 GATGCATCCA TGTAATCTAT TCCCATCGCT GGAAAACAGC TGCTGTTAGA TGTCCTCAGA 2609 GATCAGTTGC AAATTTTAGC GTTAAAGTCA GGATTTATTG TTCATACTTG GCGGTGAGGA 2669 GGGCAGCTGG AGATCTTAAG ATTCCATTTT GGAAAATGAT TAGGCCCGCC AAACTTCTGA 2729 ACTTTGGAAG CTGGGGATGT TTAGTAATAC AGCCTGGTTT TCAAGTACTC ACTAAAAGTT 2789 CTCAAATATT GGGTTGGGCA CGGCTTATAC CAGGTTACCT CACTTTTAAT TAGTGATGCA 2849 GGCAGTGTAA CCCAAGCATT TGTGGACAAT GAGTGGAATA CTAAAGTTAA AAAGTCAAAC 2909 TTTCACCTCA GATTTTCTGG ACTTAGTCAT GAGGAGAGGG TGAGGCCCAC TCTGTTCCTA 2969 CTGGAGATAC CAGAGACTCT GAAACTATAG AATAAAGCCT CTGTGCTGCA C 3020

【００３４】

【配列表】配列番号：３ 配列の長さ：１８６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：ホモサピエンス 配列： ATGGCTTTCA CAGAGCATTC ACCGCTGACC CCTCACCGTC GGGACCTCTG TAGCCGCTCT 60 ATCTGGCTAG CAAGGAAGAT TCGTTCAGAC CTGACTGCTC TTACGGAATC CTATCCAGGT 120 GAAGCATCAG GGCCTGAACA AGAACATCAA CCTGGACTCT GCGGATGGGA TGCCAGTGGC 180 AAGCAC 186

【００３５】

【配列表】配列番号：４ 配列の長さ：６２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Ala Pha Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu 5 10 15 Cys Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr 20 25 30 Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Pro Gly Glu Ala Ser Gly Pro Glu Gun Glu 35 40 45 His Gln Pro Gly Leu Cys Gly Trp Asp Ala Ser Gly Lys His 50 55 60

【図面の簡単な説明】

【図１】白血球由来ＤＮＡのＰＣＲ産物をＨａｅIII処
理した生成物のアガロースゲル電気泳動結果を示す図で
ある。

【図２】正常ＣＮＴＦ量と吸光度との関係を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ (72)発明者 大附 裕子 東京都渋谷区千駄ヶ谷５−21−３ 株式会 社ビー・エム・エル内 (72)発明者 高橋 良輔 東京都府中市武蔵台２−６ 財団法人東京 都神経科学総合研究所内 (72)発明者 出口 武夫 東京都渋谷区千駄ヶ谷５−21−３ 株式会 社ビー・エム・エル内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号３で示される塩基配列を有する
   ヒト毛様体神経節細胞栄養因子の変異遺伝子。
2. 【請求項２】 配列番号４で示されるアミノ酸配列を有
   するヒト毛様体神経節細胞栄養因子の変異蛋白質。
3. 【請求項３】 オリゴヌクレオチドをプライマーとして
   遺伝子増幅反応を行い、当該遺伝子増幅反応生成物より
   塩基配列GGCCを有する遺伝子及び／又は塩基配列AGCCを
   有する変異遺伝子の有無を検出することを特徴とするヒ
   ト毛様体神経節細胞栄養因子の遺伝子型の判定法。
4. 【請求項４】 請求項２記載の変異蛋白質に対する抗体
   及び／又は正常ヒト毛様体神経節細胞栄養因子に対する
   抗体を用いることを特徴とするヒト毛様体神経節細胞栄
   養因子の免疫測定法。