JPH04505260A

JPH04505260A - ＰＤＧＦα―受容体

Info

Publication number: JPH04505260A
Application number: JP2508532A
Authority: JP
Inventors: ケリー，ジェイムズ　ディー．; マーレイ，マーク　ジェイ．
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
Priority date: 1989-05-22
Filing date: 1990-05-21
Publication date: 1992-09-17
Also published as: ATE109510T1; CA2057854A1; EP0474744B1; CA2057854C; EP0474744A1; DK0474744T3; US5371205A; AU5749690A; DE69011329D1; DE69011329T2; WO1990014425A1; ES2057571T3; US5618678A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】６、前記細胞が培養された哺乳類細胞である請求の範囲第５項記載の細胞。

７、前記細胞が酵母細胞である請求の範囲第５項記載の細胞。

８、試験化合物におけるＰＤＧＦアゴニスト又はアンタゴニスト活性を検出するための方法であって、請求の範囲第１〜４のいずれか１項記載のＤＮＡ分子に操作可能的に結合される転写プロモーターを含んで成るＤＮＡ構成体によりトランスフェクトされ又は形質転換された培養細胞（ここで前記細胞は細胞表面タンパク質としてＰＤＧＦ受容体を発現する）及び試験化合物を、受容体にＰＤＧＦを結合するのに適切な条件下でインキュベートシ；前記試験化合物と共に前記細胞をインキュベートすると同時に又はその後、検出可能なシグナルを提供することができるラベルに結合されるＰＤＧＦの存在下で前記細胞をインキュベートし；そして試験化合物におけるＰＤＧＦアゴニスト又はアンタゴニストの指示体として受容体への前記ラベルされたＰＤＧＦの結合を検出することを含んで成る方法。

９、前記ラベルが放射性同位体である請求の範囲第８項記載の方法。

１０、前記細胞が培養された哺乳類細胞である請求の範囲第８項記載の方法。

１１、前記検出す唸段階に続いて、前記受容体へのＰＤＧＦの結合のために適切な条件下で前記ＤＮＡ構成体によりトランスフェクトされ又は形質転換された細胞の静止培養物に前記試験化合物を添加し；前記細胞にチミジンを添加し；そして細胞中へのチミジンの組込みを測定することをさらに含んで成る請求の範囲第８項記載の方法。

明　細　書ＰＤＧＦα−六 □ 本発明は生物学的受容体及びそれらの使用に関する。より詳しくは、本発明は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）のための新規受容体及びＰＤＧＦアゴニスト及びアンタゴニストを同定するためにその受容体を使用するための方法を提供する。

兄１ｆｆ１月１量高等真核細胞において、リガンド（たとえばホルモン、成長因子及びそれらの相同体）とそれらの受容体との間の相互反応は、種々の細胞外シグナルの伝達及び応答において中枢的に重要なものである。ペプチドホルモン及び成長因子は、標的細胞の血漿膜上の特定の認識部位（受容体）に結合することによってそれらの生物学的機能を誘発することが一般的に受け入れられている。リガンド結合基に基づいて、受容体は、ある細胞工程の活性化又は阻害をもたらす、細胞内応答を引き起こす、配座の変化を受けると思われる。リガンド相同体は次の２種の種類に分けられる：アゴニストと命名される、その対応する天然のりガントの効果を模倣するもの；及びアンタゴニストと命名される、天然のりガントにより誘発される受容体−リガント結合又はその効果を阻止するもの。

血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）とその受容体との相互反応が特に興味の対象である。ＰＤＧＦは、間葉細胞のための血清における主要マイトジェンタンパク譬である。それは、培養された平滑筋細胞、繊維芽細胞及びダリア細胞において細胞増殖又はＤＮＡ合成を誘発し、有力な化学誘引物質であり、そして他の生物学的活性を示す。ＰＤＧＦの生物学は、Ｒｏｓｓなど、　（Ｃｅｌｌ　４６　：　１５５〜１６９．１９８６）により再調査されている。ＰＤＧＦは、創傷−治癒応答に重要な役割を演じることが示されており　（Ｒｏｓｓ　ａｎｄ　Ｇ１ｏｏ＋ｓｅｔ＋　Ｎｅｗ　Ｅｎ　、　Ｊ、　Ｍｅｄ。

２３０、１９０号）、そしてアテローム硬化症の増殖性損傷の進行において原因的な役割を演じると思われる（Ｒｏｓｓ　ａｎｄ　Ｇｌｏｍｓｅｔ。

前記）。これらの活性は、細胞外結合部位、トランスメンプランアンカー及び細胞内チロシンキナーゼドメインを含んで成る膜関与受容体へのＰＤＣ；Ｆの結合により介在される。内因性ＰＤＧＦの作用に対する受容体を阻止するアンタゴニストは、アテローム硬化症の処理において、又はＰＤＧＦ誘発性異常成長パターンを包含する他の状態の阻害において有用である。ＰＤＧＦアゴニストは、創傷の治癒を促進するために有用である。

可能性あるアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーンするための現在の方法は、反応性細胞、破壊された細胞の膜画分又は溶解された受容体への放射性ラベルされた化合物の結合をアッセイすることを包含する。他方、化合物は、細胞表面受容体のためのラベルされた既知のガントと競争するそれらの能力についてスクリーンされ得る。たとえムホ、Ｌｅｆｋｏｗｉ　ｔｚ１９７４）＋　Ａｕｒｂａｃｈなど、　（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１８６　；　１２２３〜１２２５．１９７４）４２４８、１９７４）は、β−アドレナリンアゴニスト及びアンタゴニストのための受容体結合アッセイを開示する。これらのアの使用は、典型的には、そのような調製物の変異性により低イブの限定された集団のみが、特定の物質ムこ対して反応性で又は少ない数の受容体を有する。

ＰＤＧＦに対して感受性の最近入手できる細胞タイプは、細胞当たり少数の受容体のみを含み、従って可能性あるＰＤＧＦ相同体はアンタゴニストをアッセイするために多くの数の細胞を必要とする。そのようなアッセイは、労働を要し、そして複雑であり、そしてそれらを容易に自動化しない。

高い親和性でＰＤＧＦ　ＢＢイソフオーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）を特異的に結合するＰＤＧＦ受容体（この後、β−受容体として言及される）は、記載されている　（Ｃ１ａｅｓｓｏｎ−Ｗａｌｓｈなど、。

Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、８　：３４７６〜３４８６．１９８８；　Ｇｒｏｎｗａｌｄなど、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５　：３４３５〜３４３９．１９８８）　、　ＰＤＧＦは３種のイソフオーム（ＡＡ、ＡＢ及びＢＢ又はそれらの混合の形）のいずれかで存在するので、この受容体は、ＰＤＣ；Ｆのすべての形又はその相同体を検出するために使用され得ない。

従って、ＰＤＧＦアゴニスト及びアンタゴニスト活性のための化合物の市販規模のスクリーニングを可能にするアッセイシステムの必要性が当業界において存在する。そのようなアッセイシステムは、急速であり、安価であり、高い処理量のスクリーニングに適合可能であり、そしてすべてのＰＤＧ″Ｆイソフオームの類似体を検出することができる。本発明は、そのようなアッセイシステムを提供し、そしてさらに、他の関連する利点を提供する。

光ユニ皿丞本発明は、第１図に示されるロイシン（アミノ酸番号２０）からロイシン（アミノ酸番号Ｌ　Ｏ８９）までのアミノ酸配列を含んで成るＰＤＧＦ受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子を提供する。１つの態様において、そのＤＮＡ分子は、第１図に示されるメチオニン（アミノ酸番号１）からロイシン（アミノ酸番号１０８９）までのアミノ酸配列をコードする。そのＤＮＡ分子は、第１図に示されるヌクレオチド番号２６２からヌクレオチド番号３４７１までの又はヌクレオチド番号２０５からヌクレオチド番号３４７１までのヌクレオチド配列を含んで成る。

関連する観点において、本発明は、上記のようにＤＮＡ分子に操作可能的に結合される転写プロモーターを含んで成るＤＮＡ構成体によりトランスフェクトされ又は形質転換された細胞を提供する。本発明のある態様において、その細胞は培養された哺乳類細胞又は酵母細胞である。

もう１つの観点において、細胞表面タンパク質としてＦＤＣＦ受容体を発現するトランスフェクトされ又は形質転換された細胞は、試験化合物におけるＰＤＧＦアゴニスト又はアンタゴニスト活性を検出するための方法内に使用される。１つの態様において、その方法は、受容体にＰＤＧＦを結合するために適切な条件下で試験化合物と共にその細胞をインキュベートし；その試験化合物と共に前記細胞をインキュベートすると同時に又はそれに続いて、検出可能なシグナルを提供することができるラベルに結合されるＰＤＧＦの存在下で前記細胞をインキュベートし；そして試験化合物におけるＰＤＧＦアゴニスト又はアンタゴニスト活性の指示体として受容体へのそのラベルされたＰＤＧＦの結合を検出することを包含する。その方法は、さらに、たとえば試験化合物の存在下で細胞によるチミジンの導入を測定することによって、試験化合物におけるＰＤＧＦＩＩマイトジェン活性を検出する段階を包含する。

本発明のこれらの及び他の態様は、次の詳細な説明及び図面から明らかになるであろう。

皿皿勿同惠星反肌第１図は、ＰＤＧＦα−受容体ｃＤＮＡの配列及びそのＣＤＮＡによりコードされるアミノ酸（標準の１文字コードを用いる）を示す。ラインの最後での数字は、ヌクレオチドの位置を示す。配列の下の数字はアミノ酸の位置を示す。

第２図は、ＰＤＧＦα−受容体をコードするｃＤＮＡ分子のアセンブリーを示す。ｃＤＮＡ配列は開かれたボックスとして示される。ベクター配列は線として示される。ｃＤＮＡ挿入体に隣接するベクターの一部のみが示される。

第３図はベクターＺＮＢ４の構成を示す。記号は次の通りである：　ＤＨＲＦ、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子：５Ｖ４０ｐ、ＳＶ４０プロモーター、５Ｖ４０ｔ、ＳＶ４０ターミネータ−、ＭＴ−１，マウスメタロチオネイン−１プロモーター；ＭＬＰ、アデノウィルスの２つの主要後期プロモーター；及びＳＳ、スプライシングシグナル。

■を　するだめの　の聰本発明を示す前、この後使用される一定の用語を定義することが有用である：旦Ｎ人盪底生：全体としては、天然において存在しない態様で組合わされ、そして並置されたＤＮＡのセグメントを含むようにヒト介在を通して変性された、− 末鎖又は二本鎖のいずれかのＤＮＡ分子又はそのような分子のクローン。

トランスフェクション　び形　−：クローン化されたＤＮＡの導入により受容体細胞又は微生物の遺伝子型を変更する方法。“トランスフェクション“とは、培養された哺乳類細胞中へのＤＮＡの挿入を言及する。“形質転換゛とは、他の細胞型、たとえば菌類及び細菌中へのＤＮＡの挿入を記載するために使用される。

ＰＤＧＦ：本明細書で使用される場合、用語“’　Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　”とは、源にかかわらず、それぞれ又はいずれか組合わして、血小板由来成長因子のＡＡ、ＡＢおりＢイソフオームを包含する。

１妄生：高い親和性を有する特定のリガンド又はリガンドのグループを結合する細胞タンパク質又は細胞表面タンパク質。その生来の状態において、受容体は、膜関連のものであり、一般的に外部のトランスメンブレン及び細胞質ドメインを含み、そしてシグナル伝達を可能にする。本明細書で使用される場合、用語“’ ＰＤＧＦ受容体゛とは、ＰＤＧＦのいずれか又はすべてのイソフオームを特異的に結合する受容体を言及する。

本発明は、ＰＤＧＦアゴニスト及びアンタゴニスト活性のための化合物をスクリーンするために使用され得る新規のＰＤＧＦ受容体じα−受容体゛°）を提供する。本明細書に記載されるＰＤＧＦα−受容体は、前記ＰＤＧＦα−受容体に化学的にｆｉ（Ｕする。類似する特徴は、ＰＤＧＦ　ＢＢホモダイマーの高い親和性結合、リガンド結合に基づいて有糸分裂誘発を刺激する能力及びリガンド結合に基づいての分子の細胞内部分内のチロシン残基の自動リン酸化を包含する。ｃＤＮＡ配列（第１図）に基づいて予測されるアミノ酸配列の分析は、α−受容体が、ＰＤＧＦβ−受容体、Ｃ３Ｆ−１受容体及びＣ−キット遺伝子生成物のように、スプリットチロシンキナーゼ受容体種のメンバーであることを示す。

ＰＤＧＦα−受容体は、いくつかの性質に基づいて前記ＰＤＧＦβ−受容体から区別する。たとえば、α−受容体は、高い親和性でＰＤＧＦのＡＡ、ＡＢ及びＢＢイソフオームを結合することができる。対照的に、β−受容体は、高い親和性でＢＢイソフオームのみを結合する（ＡＢイソフオームもある程度結合する）。

大きさ的には類似するが、α及びβ−受容体の成熟した細胞表面形は、還元条件下でポリアクリルアミドゲル上で区別され得る。α−受容体は、約１８０．０００ドルトンの見掛の分子量を有し、そしてβ−受容体は約１８５．０００ドルトンの見掛の分子量を有する。これらの２種の受容体はまた、アミノ酸配列により区別され得る。

本発明のＰ　’Ｄ　Ｇ　Ｆα−受容体は、その受容体をコードするＤＮＡ配列を発現するため宿主細胞をトランスフェクトし又は形質転換することによって調製され得る。次に、受容体は、その細胞から単離され、又は細胞自体が、下記のようにＰＤＧＦアゴニスト及びアンタゴニストを検出するためにアッセイ内で使用される。

ヒ）ＰＤＧＦα−受容体をコードするＤＮＡ分子は、ヒトゲノム又はｃＤＮＡ配列のライブラリーから単離される。そのようなライブラリーは、標準の方法、たとえばＧｕｂｌｅｒａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ　（Ｇｅｎｅ　２５　：　２６３〜２６９．１９８３）により開示される方法により調製される。好ましくは、その分子は、ｃＤＮＡがイントロンを欠くので、ｃＤＮＡ分子であり、そして従って、トランスフェクトされた又は形質転換された細胞における操作及び発現に適合化される。ｃＤＮＡライブラリーの調製に使用するためのｍＲＮＡの好ましい源は、ＭＧ−６３ヒト骨肉腫細胞系（寄託番号ＣＲＬ　１４２７としてＡＴＣＣから入手できる）である。ＭＣ，−６３細胞系は、リガンド結合研究により測定されるように、その細胞表面上にほぼ等数のＰＤＧＦα及びβ−受容体を含むことが見出された。”’Ｉ−ＰＤＧＦ　ＢＢ及び”Ｉ−ＰＤＧＦ　ＡＢによる飽和結合実験は、個々の受容体タイプのための約５０．０００結合部位がこれらの細胞の表面上に存在することを示す。他方、他のＰＤＧＦ−感受性細胞タイブ；たとえばヒト二倍体繊維芽細胞が使用され得る。ｍＲＮＡはその細胞から単離され、そしてｃＤＮＡが調製され、そして適切なベクター、たとえばバクテリオファージ−λｇｔ　１０　（ＡＴＣＣ４０１７９；　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＯ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡから市販されている）にクローン化される。この後、詳細に記載されるように、ＭＧ−６３ＲＮＡから８周製されたｃＤＮＡライブラリーは、ＰＤＧＦβ−受容体の細胞質部分をコードする配列を含むｃＤＮＡプローブによりスクリーンされ、そしてそのプロットがしだいに緊縮した条件下で洗浄された。

α−受容体配列は、低い緊縮下でこのプローブにハイブリダイズすることが見出されたが、しかしハイブリダイゼーションのための配列の同一性を必要とする、より緊縮した条件下でプローブにハイブリダイズしたまま存続するそれらの無能性によりβ−受容体配列から区別され得ることが見出された。他方、本明細書に開示されるヒ）ＰＤＧＦα−受容体配列は、プローブとして使用され得る。陽性クローンは、制限酵素地図及びヌクレオチド配列分析により分析される。スクリーニング及び分析は、全体の受容体コード配列を示すクローンが得られるまで、くり返される。

完全なりＮＡ配列が得られた後、それは発現ベクター中に挿入される。その発現ベクターは、そのＤＮＡ配列に操作可能的に結合されるプロモーターを含む。他の遺伝子要素はまた、ベクターに包含され、その選択はベクターが使用される特定の宿主細胞に基づかれる。これらの遺伝子要素は、ターミネータ−、エンハンサ−、ポリアデニル化シグナル、ＲＮＡスプライシングシグナル、リーダー及び選択可能マーカーを包含する。発現ベクターはまた、通常、複製の１又は複数の起点を含むであろう。個々の要素の多くの例は、既知であり、そして利用でき、そして要素の適切な組合わせの選択は、当業界の熟練のレベル内である。

上記のような発現ベクターが、真核宿主細胞をトランスフェクトし又は形質転換するために使用される。適切な細胞は、Ｉ素細胞、特に酵素サソカロマイセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ−ｐ　ｃｅｒｅν１ｓｉａｅ）及び培養された哺乳類細胞、たとえば子供のハムスターの腎細胞を包含する。酵素細胞を形質転換するための方法は、Ｂｅｇｇｓ　（Ｎａｔｕｒｅ　２７５　：　１０４〜１０８．１９７８）及びＨｉｎｎｅｎなど、　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　７５　：　１９２９〜１９３３、１９７８）により記載される。哺乳類細胞をトランスフェクトするための方法は、Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　（Ｖｉｒｏｌ、　５２：４５６、１９７３）、　Ｗｉｇｌｅｒなど、μ見■１４　：　７２５．１９７８）及びＮｅｕｍａｎｎなど、（ＥＭＢＯＪ、土：８４１〜８４５．１９８２）により開示される。好ましいは哺乳類細胞系は、子供のハムスターの腎（ＢＨＫ）細胞系、たとえば−ａｅｃｈｔｅｒ　ａｎｄ　Ｂａｓｅｒｇａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９：　１１０６〜１１１０．１９８２）により開示されるｔｋ−ｔｓ１３　ＢＨＫ細胞系（この後、“”Ｂ）ＩＫ５７０”として言及される）を包含する。一般的に、宿主細胞は、内因性ＰＤＧＦβ−受容体を発現せず又はβ−受容体を低レベルでのみ発現することが好ましい。そのような細胞は、 α−受容体を発現するためにトランスフェクトされ又は形質転換される場合、α −受容体リガントについて特異的にアッセイするために使用され得る。しかしながら、高い量のβ−受容体を発現する細胞はまた、α−受容体を発現するためにトランスフェクトされ得、従ってすべての種類のＰＤＧＦ受容体を発現することができる細胞を提供する。

次に、トランスフェクトされ又は形質転換された細胞は、ＰＤＧＦ及び／又は抗 −α−受容体抗体を結合する能力についてスクリーンされる。十分に高い数の細胞表面ＰＤＧＦα−受容体（一般的に、細胞当たり少なくとも４〜５Ｘ１０’個の受容体、好ましくは少なくとも約ｌＸｌ０’個の受容体／細胞）を発現する細胞が、アゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニングのためのアッセイシスムに使用され得る。

ＰＤＧＦα−受容体タンパク質は、膜抽出物を調製するために、適切な界面活性剤（たとえばＴｉｖｅｅｎ”　（ポリオキシエチレンソルビタン〕又はＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、＋　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。

間から入手できるＴｒｉ　ｔｏｎ”）に細胞を溶解することによって組換え細胞から精製され得る。次に、受容体タンパク質は、一般的にカラムの形で、固体支持体に結合される抗−受容体抗体を用いてイムノアフィニティーにより単離される。他方、受容体タンパク質は、抗体が利用できるペプチドとの融合形で生成され得る。次に、その融合タンパク質は抗−ペプチド抗体を用いて単離され、そしてそのペプチドは、たとえばアメリカ特許第４，７０３，００４号及び第４，７８２．１３７号に開示されるように、受容体タンパク質から酵素的に除去される。抗−ペプチド抗体は、Ｉｍｍｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐ、　（Ｓｅａｔｔｌｅ、　ＷＡ）から市販されている。膜タンパク質を単離するために当業界において通常使用される化学的精製方法がまた使用され得る。

本発明により提供されるアッセイシステムは、ＰＤＧＦアゴニスト及びアンタゴニスト活性のための化合物をスクリーンするために使用され得る。手短にいえば、細胞表面ＰＤＧＦα−受容体を発現するトランスフェクトされ、又は形質転換された細胞は、適切な増殖培地中において所望する細胞密度に培養される。次に結合アッセイが、細胞関連α−受容体へのＰＤＧＦの結合のために適切であることを決定する条件下で行われる。適切な条件の決定は、当業者の熟練のレベル以内である。一般的に、アッセイは、血清が生む成長因子による汚染を回避するために血清の不存在下で行われる。トランスフェクトされた哺乳類細胞と共に使用するための好ましいアッセイ培地は、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、　ｐＨ７，４，０，２５％の血清アルブミン及び抗生物質を含むＨａｍ’ｓ　Ｆ　１２　（ＧＩＢＣＯ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、　ＮＹから入手できる）である。次に、試験化合物の結合は、既知の方法、たとえばＨａｒｔなど、Ｕ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２６２　：　１０７８０〜１０７８５．１９８７）の方法を用いてアッセイされる。

細胞は試験化合物と共にインキュベートされ、そして検出可能なシグナルを生成できる放射性同位体又は他のラベルに結合されるＰＤＧＦが続いて添加される。

好ましいラベルは、１２５Ｉ及び他の放射性同位体を包含するが、但し、蛍光ラベル、ビオチン及び当業界において通常使用される酵素がまた使用され得る。他方、試験化合物及びＰＤＧＦは同時に添加される。次に、細胞に結合されるＰＤＧＦの量が測定され、そして対照（試験化合物を含まない）におけるＰＤＧＦ結合に比較される。対照培養物に比較してのＰＤＧＦ結合の低下は、試験化合物が α−受容体を結合することを示す。次に、受容体を結合する化合物は、ＰＤＣ；Ｆ様マイトジェン活性（すなわち、有糸分裂誘発又は受容体のリン酸化）についてアッセイすることによってＰＤＧＦアゴニスト及びアンタゴニストとして区別される。Ｒａ１ｎｅｓ　ａｎｄ　Ｒｏｓｓ　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｎｏｌ。

１０９　：　７４９〜７７３．１９８５）により記載される好ましい有糸分裂誘発アッセイは、マイトジン刺激性細胞による３Ｈ−チミジン組込４−５０５２６０　（５）ンの摂取を測定する。手短に言えば、試験化合物がＰＤＧＦα−受容体を発現するためにトランスフェクトされ又は形質転換された細胞の静止培養物に添加される。次に、試験化合物が除去され、そして３Ｈ−チミジンが添加される。ＤＮＡ中へのラベルされたチミジン組込みは、ＰＤＧＦ又はＰＤＧＦアゴニスト結合を示す。受容体リン酸化は、試験化合物の存在下でＣＴ−”Ｐ）ＡＴＰと共に受容体含有膜抽出物をインキュベートすることによって、Ｈａｒ　ｔなど、　（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０　：１５２９〜１５３１．１９８８）により開示されるようにアッセイされ得る。抽出物は、ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーにより受容体リン酸化について分析される。

上記アッセイは、好ましくは、９６−ウェルのマイクロタイタープレート上で行われる。これらのプレートは、市販されており、そして自動化されたアッセイシステム内で使用され得る。

これらのアッセイにおいて同定されるＰＤＧＦアゴニストは、温血動物において創傷−治癒工程を増強するために治療用組成物内に使用するために適切である。

ＰＤＧＦアゴニストにより処理され得る創傷の例は、熱傷、慢性の非治癒性皮膚潰瘍、表皮性創傷及び裂傷、擦過傷及び手術による創傷を包含する。

治療組成物は、ＰＤＧＦアゴニスト及び適切なキャリヤー並びにアジュバント、希釈剤又は安定剤を混合することによって調製され得る。適切なアジュバントは、コラーゲン又はヒアルロン酸調製物、フィブロネクチン、第Ｘ■因子、ポリエチレンリコール又は活性治療成分を安定化し、又は増強するように企画された他のタンパク質又は＄ｌＩ質を包含する。希釈剤はアルブミン、生理的食塩水、滅菌された水、等を包含する。他の安定剤、酸化防止剤又はプロテアーゼ阻害剤がまた添加され得る。他方、ＰＤＧＦアゴニストは、水溶液として傷用包帯に適用され得る。これらの治療用組成物は、治癒が完結するまで、１〜数日間隔で再適用され得る。

これらの治療用組成物はまた、熱傷の治癒を促進することが知られている他の医薬的に活性な成分、たとえばヘパリンを含むことができる。他の成長因子、たとえばＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＦＧＦ、血小板第４因子、インシュリン又はソマトメジン（Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔなど、＋　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ。

刀し２３２３〜２３２９．１９８５）及び脈管形成因子はまた、ＰＤＧＦ相同体と共に相乗的に作用する。抗生物質はまた、感染を受けない創傷を保持するために含まれ得る。

ＰＤＧＦアンタゴニストを含む治療用組成物は、適切なキャリヤー又は希釈剤に配合され得、そしてたとえばアテローム硬化症又は線維症疾患の処理において、内因性ＰＤＧＦの効果を阻止することが所望される場合に投与され得る。

次の詳細な例は、例示的であって、制限するものではない。

■ Ａ−且旦Ｘ人座１店ＲＮＡを、Ｃｈｉｒｇｗｉｎなど、（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　１８　：　５２９４．１９７９）ノ方法により調製し、そしてオリゴｄＴセルロース上で２度精製し、ポリ（Ａ）＝ＲＮＡを生成した。

ｃＤＮＡを、　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）から購入されたキットを用いてλｇｔｌＯファージで調製した。得られるλフアージＤＮＡを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）からの被覆粒子混合物によりパッケージし、Ｅ、コリ株Ｃ６００Ｈｆ１−中に感染せしめ、そして力価を測定した。

Ｂ、ライブラリースクリーニング約１．４Ｘ１０６個のファージ組換え体をプレートし、スクリーニングのためのプラークを生成した。ニトロセルロースフィルターリフトを、標準の方法に従って製造し、そして３２ｐによりラベルされたβ−受容体ＤＮＡフラグメント（Ｇｒｏｎｗａｌｄなど、、前記）にハイブリダイズした。そのプローブフラグメントは、トランスメンブレン及びＰＤＧＦβ−受容体のｃＤＮＡの一部をコードする細胞質ドメインを包含する１、９ｋｂのＦｓｐ　ｌ−Ｈｌｎｄｌ［Ｉセグメントであった。ハイブリダイゼーションは、４０％のホルムアルミド、５×のＳＳＣＰ（２５ｍＭのリン酸緩衝液を含むＳ　Ｓ　Ｃ，ｐＦ［６，５）、２００Ｉｇ／ｌｔｌの変性されたサケ精子ＤＮＡ、３　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ及び１０％の硫酸デキストランを含む混合物中において４２゛Ｃで３６時間行われた。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを、室温で、次に４７〜４８°Ｃで１５分間、２ＸＳＳＣにより広範囲に洗浄した。

Ｘ線フィルムに一晩感光した後、フィルターを徐々に緊縮した洗浄に処理し、次に０．ｌＸ５ＳＣ１６５°Ｃでの最終処理に達するまで、フィルムを記録した。

フィルム分析は、より低い洗浄緊縮でプローブにハイブリダイズされるプラークの“′種類′”が、使用される最高の緊縮で見られなかったことを示した。

Ｃ，？旦二Ｚ分捉初期スクリーニングから得られた２種のλフアージクローンを、ｐＵＣタイプのプラスミドヘクタ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　ＬａＪｏｌｌａ、　Ｃ＾から得られたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ”）のＮｏｔ　Ｉ部位中にサブクローン化し、そして制限地図及び配列分析により分析した。

α１−１と命名されたファージクローンの制限酵素分析は、β−受容体の制限フラグメントパターンとは異なる制限フラグメントパターンを示した（但し、約１６０ｂｐの共通するＢｇｌＩ［−ＢｇｌＩＩバンドを除く）。β−受容体は、第２チロシンキナーゼドメインをコードする領域内の２つの同様に間隔を開けられたＢｇ１１１部位を含む。

α１−１の末端から得られた配列データは、β−受容体遺伝子を有するｃＤＮＡの推定上の配向及び配列を可能にした。

１つの末端での約３００個の塩基から得られた配列は、β−受容体への明確な相同性を示さなかった。この領域は、クローン化されたｃ　ＤＮＡの３′非コ一ド配列であることが理解されるようになる。α１−１の反対端から得られた配列は、読み取り枠を含むことが見出され、この一部はＰＤＧＦβ−受容体に高く相同し、そしてＣ−ｆｍｓ及びＣ−ｋｉｔ遺伝子に対しては前記よりも低い程度、相同した。α１−１読み取り枠及びＰＤＧＦβ−受容体アミノ酸配列の配置は、α ｌ−１がその５′末端で、細胞外ドメイン続いて高い疎水性のトランスメンブレンドメインの約１３個のアミノ酸コドンを含むことを示した。この初期配列の分析は、膜スパン領域と第１チロシンキナーゼドメインとの間の細胞質部分において、ＰＤＧＦβ−受容体アミノ酸配列に対して著しい相同性を示した。この領域（ドメイン）における４６個のアミノ酸のうち、３８個が同一であり、そしてその変化はひじょうに保存的変化である。この８５％のアミノ酸の同一性は、膜スパン領域（４８％）においては低い程度に模倣されるが、しかしαｌ−１に見出される５′のほとんどの配列から推定される少量のタンパク質配列には見出されない。

第２プラスミドのサブクローン（α１−７と命名される）の制限分析は、クローンα１−１の５′側の約１．２ｋｂのオーバラップ及び５′の方向に拡張する約２．２ｋｂの追加の配列を示した。配列分析は、このクローンがその３′末端で、第２チロシンキナーゼドメインのためのコード配列を有することを示し、前記ドメインは、ＰＤＧＦβ−受容体におけるその対応する領域に類似する配列の領域を含む。クローンα１−７の５′末端は、非受容体配列を含んだ。

２種の追加のα−受容体クローンは、α１−１配列によりプローブすることによって得られた。クローンα１−１をＮｏｔ　Ｉ及びＳｐｅ　Ｉにより消化し、そして２３０ｐｂのフラグメントを回収した。α１−１をまた、Ｂａｍ　ＨＩ及びＮｏｔｌにより消化し、そして５ｓｏｐｂのフラグメントを回収した。２３０ｐｂのプローブにハイブリダイズするクローンを、α５−１と命名した。このクローンは、その受容体のための５′のほとんどのコード配列を含んだ。もう１つのクローン（α６−３と命名される）は、５５０ｐｂのプローブにハイブリダイズし、そして３′コード及び非コード配列（ポリ（Ａ）末端を含む）を含むことが見出された。

クローンα１−１を放射性ラベルしく”Ｐ）、そしてｃＤＮＡライブラリーを調製するために使用されるＭＣ，−６３ポリ（Ａ）”ＲＨＡのノザンブｏ　７ト（Ｔｈｏｍａｓ、　Ｍｅｃｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ。

１００　：　２２５〜２６５．１９８３）をプローブするために使用した。約６．６ｋｂの単一バンドを観察した。

ＰＤＧＦα−受容体タンパク質発現に関する情報が知られているいくつかの他の細胞系からのＲＮＡを、α１−１ｃＤＮＡによるノザン法によりプローブした。

試験された受容体−陽性細胞系は、ヒト繊維芽細胞ＳＫ４、Ｗｌ−３８及び７５７３系；マウス繊維芽細胞系ＤＩ　３Ｔ３　；　Ｕ２−ＯＳヒト骨肉腫細胞系及びヒヒ大動脈平滑筋細胞を包含した。陰性細胞系はＡ４３１（上皮細胞系）及びＶＡ１３　（ＳＶ４０により形質転換されたＷｌ−３８細胞）を包含した。すべての場合において、これらのＲＮＡに検出される６、６ｋｂのバンドの量は、それぞれの細胞表面上に検出されるα−受容体の相対的レベルと十分に相互関係した。６．６　ｋｂのＲＮＡは、これらの細胞タイプ上に検出されるＰＤＧＦα− 受容体タンパク質の欠失と一致して、分析される造血起源のいずれかの細胞系からのＲＮＡ１ｌ製物に検出されなかった。

クローンα１−１及びα１−７を、受容体のトランスメンブラン部分をコードする領域におけるユニークなＰｓｔ１部位で連結した。クローンα１−１をＰｓｔｌ及びＸｂａＩにより消化し、そして受容体配列フラグメントを回収した。クローンα１−７をＰｓｔｌ及びＢａｍＨＩ３こより消化し、そして受容体フラグメントを回収した。これら２つのフラグメントを、Ｘｂａ　ｒ　＋　ＢａｍＨｒ　 −消化ｐ　ｒ　Ｃ１９Ｒ（Ｍａｒｓｈなど、　Ｇｅｎｅ　３２　：４８１〜４８６．１９８４）と連結し、プラスミドρα１７Ｒ（第２図）を構成した。

５′のほとんどのα−受容体配列の残りを、５ｓｔＩ　Ｃ１ｍ１フラグメントとしてクローンα５−１から得た。このフラグメントを、ｐα１７ＲのＥｃｏＲＩ　−Ｓｓｔ　Ｉ受容体フラグメントに連結し、そしてＥ　ｃｏ　ＲＩ　＋　Ｃ１ａ　Ｉ　−消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ”プラスミド中にクローン化し、プラスミドｐα１７Ｂ（第２図）を構成した。

ｐα１７Ｂの構成に使用される３種のｃＤＮＡフラグメントを、ファージベクターＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３＋ｎｐ１９にクローン化した。それらのｃＤＮＡフラグメントを、Ｓａｎｇｅｒなど。

（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４　：　５４６３〜５４７６、１９７７）の方法により配列決定した。そのｃＤＮＡ配列及び推定されるアミノ酸配列は第１図に示される。コード配列は、クローン化されたｃＤＮＡのヌクレオチド２０５で始まる。ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅなど、（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４　：　４６８３〜４６９０．１９８６）のモデルに基づけば、シグナルペプチド切断が、アミノ酸１９（セリン）の後で生じることが予測され、１０７０個のアミノ酸成熟タンパク質がもたらされる。

フターを構成した。第３図に示されるＺｅｍ　２２９は、マウスメタロチオネイン−１プロモーターとＳＶ４０転写ターミネータ−との間にクローン化されたＤＮＡの挿入のだめのユニークなりａｍＨ１部位を含むｐＵｃ１８基礎の発現ベクター、及びＳＶ４０初期プロモーター、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子及びＳＶ４０ターミネータ−を含む発現単位である。Ｚｅｍ　２２９が、ＥｃｏＲＩによる部分消化、ＤＮＡポリマラーゼ■　（フレノウフラグメント）及びｄＮＴＰによるプラント化及び再連結によりその２つのＥｃｏＲＴ部位を欠失せしめることによって変性された。Ｂａｍ　ＨＩによる得られるプラスミドの消化、続く線状化されたプラスミドとＢａｍＨＩ　−Ｅｃ。

Ｒ１アダプターとの連結が、ユニークなＥｃｏＲＩクローニング部位をもたらした。その得られたプラスミドを、Ｚｅｍ２２９Ｒと命名した。Ｚｅｍ２２９ＲをＨｉｎｄ　ｍ及びＥｃｏＲＩにより消化し、そしてＳＶ４０及びＭＴ−１プロモーターを含む５２０ｐｂのフラグメントを除去した。次に、Ｚｅｍ２２９Ｒの大きなフラグメントを、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサ−、アデノウィルス主要後期プロモーター及び−組のスプライシングシグナルを含む、ｐ　Ｄ　Ｘ　（Ｈａｇｅｎなど、、アメリカ特許第４，７８４．９５０号）の約１１００ｂｐのＨｉｎｄ　Ｉ［［−ＥｃｏＲＩフラグメントにより連結した。その得られたベクターを、ＺＭＢ４（第３図）と命名した。

ＥｃｏＲＩ部位で挿入された約５ｋｂのｃＤＮＡを含むプラスミドＺＭＢ４　（ｐＭ２９６−１０と命名される）を、寄託番号６７９６０として、八ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｎｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。

Ｒｏｃ、ｋｖｉｌｌｅ、　Ｍｄに寄託した。そのベクターは、ＥｃｏＲＩによる消化及び約４．９ｋｂのフラグメントの再連結によりその寄託されたプラスミドから再生される。

α−受容体配列を、消化によりｐα１７Ｂから除去し、そしてＢａｍ　ＨＩ消化のＺＭＢ４中に挿入した。得られたベクター（α１７／ＺＭＢ４と命名される）を、培養されたＢＨＫ５７０細胞中にトランスフェクトし、そして受容体産生クローンを選択する。

ＦＩＧ。■ 国際調査報告国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＰＤＧＦ受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子であって、前記受容体が第１図のアミノ酸番号２０のロイシンからアミノ酸番号１０８９のロイシンまでのアミノ酸配列を含んで成ることを特徴とするＤＮＡ分子。
２．前記分子が第１図のヌクレオチド番号２６２からヌクレオチド番号３４７１のヌクレオチド配列を含んで成る請求の範囲第１項記載のＤＮＡ分子。
３．前記分子が第１図のヌクレオチド２０５からヌクレオチド３４７１のヌクレオチド配列を含んで成る請求の範囲第１項記載のＤＮＡ分子。
４．前記分子が、第１図のアミノ酸番号１のメチオニンからアミノ酸番号１０８９のロイシンまでのアミノ酸配列をコードする請求の範囲第１項記載のＤＮＡ分子。
５．請求の範囲第１〜４のいずれか１項記載のＤＮＡ分子に操作可能的に結合される転写プロモーターを含んで成るＤＮＡ構成体によりトランスフェクトされ又は形質転換された培養細胞。
６．前記細胞が培養された哺乳類細胞である請求の範囲第５項記載の細胞。
７．前記細胞が酵母細胞である請求の範囲第５項記載の細胞。
８．試験化合物におけるＰＤＧＦアゴニスト又はアンタゴニスト活性を検出するための方法であって、請求の範囲第１〜４のいずれか１項記載のＤＮＡ分子に操作可能的に結合される転写プロモーターを含んで成るＤＮＡ構成体によりトランスフェクトされ又は形質転換された培養細胞（ここで前記細胞は細胞表面タソバク質としてＰＤＧＦ受容体を発現する）及び試験化合物を、受容体にＰＤＧＦを結合するのに適切な条件下でインキュベートし；前記試験化合物と共に前記細胞をインキュベートすると同時に又はその後、検出可能なシグナルを提供することができるラベルに結合されるＰＤＧＦの存在下で前記細胞をインキュベートし；そして試験化合物におけるＰＤＧＦアゴニスト又はアンタゴニストの指示体として受容体への前記ラベルされたＰＤＧＦの結合を検出することを含んで成る方法。
９．前記ラベルが放射性同位体である請求の範囲第８項記載の方法。
１０．前記細胞が培養された哺乳類細胞である請求の範囲第８項記載の方法。
１１．前記検出段階に続いて、前記受容体へのＰＤＧＦの結合のために適切な条件下で前記ＤＮＡ構成体によりトランスフェクトされ又は形質転換された細胞の静止培養物に前記試験化合物を添加し；前記細胞にチミジンを添加し；そして細胞中へのチミジンの組込みを測定することをさらに含んで成る請求の範囲第８項記載の方法。